DE69432589T2

DE69432589T2 - Substrate für die übertragung von fluoreszenzenergie

Info

Publication number: DE69432589T2
Application number: DE69432589T
Authority: DE
Inventors: Andrew John Ashton GARMAN
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: Q Futures Ltd Chester Cheshire Gb
Priority date: 1993-05-27
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2014-05-28
Also published as: DE69432589D1; GB9410737D0; GB2278356A; GB9310978D0; JP3645566B2; JPH09504778A; EP0700447B1; US6291201B1; WO1994028166A1; EP0700447A1; AU6801794A

Description

Das Konzept des Fluoreszenzenergietransfer-(FRET-)Substrats für hydrolytische Enzyme wurde erstmals von Carmel et al. (FEBS Lett., 30, 11–14(1973)) vorgeschlagen; darin wurde ein Trypsinsubstrat beschrieben, wobei als Donor Naphthyl und als Akzeptor Anthracen verwendet wurde. Seither sind mehrere Proteasesubstrate beschrieben worden, bei denen dieses Prinzip angewendet wurde. Bei diesem Ansatz werden die Donorfluorophor- und Akzeptormoleküle auf beiden Seiten der zu spaltenden Bindung plaziert, wobei sie hinreichend nahe beieinander liegen, so daß ein großer Teil der Fluoreszenz des Donorfluorophors durch strahlungslosen Energietransfer auf den Akzeptor gequencht wird. Durch die Spaltung wird der Abstand zwischen Donor und Akzeptor stark vergrößert, was sich in einem Fluoreszenzanstieg äußert. Der Akzeptorteil braucht hierbei kein Fluorophor zu sein; die entscheidende Voraussetzung besteht darin, daß das Absorptionsmaximum identisch oder nahezu identisch mit dem Emissionsmaximum des Donorfluorophors ist. Gegebenenfalls kann es sich bei dem Akzeptor selbst um einen Fluorophor handeln, wobei in diesem Fall nach der enzymatischen Reaktion eine Abnahme der Energietransferfluoreszenz des Akzeptorfluorophors erfolgen kann. Verschiedene Donoren und Akzeptoren wurden verwendet, wobei ein bekanntes Paar aus einem "in sequence"-Tryptophan als Donor und Dansyl als Akzeptor besteht. Energietransfersubstrate sind besonders geeignet für Proteasen, die im nativen Substrat sich C-terminal von der Spaltstelle befindende Aminosäuren in signifikanter Weise erkennen können; andere Proteasen, die solche Erkennungsstellen nicht besitzen, werden zweckmäßigerweise unter Verwendung von Peptiden mit fluorgenen oder chromogenen Abgangsgruppen gemessen.
Derzeitige FRET-Substrate sind auf Fluorophore beschränkt, bei denen eine Anregung mit W-Licht erforderlich ist. Dadurch wird ihre Verwendung insbesondere in Screening-Verfahren für Verbindungen eingeschränkt. Weiterhin werden die Donor- und/oder Akzeptorspezies während der Synthese des Peptidsubstrats gebunden. Dies erfordert im allgemeinen spezielle Reagentien sowie ein "know-how" hinsichtlich ihrer Verwendung. Dementsprechend lassen sich bei einem gegebenen Substrat eine Reihe von Donor- und Akzeptorspezies nicht leicht beurteilen.
Von Wang et al. (Tet. Lett., 1990, 13, 6493-6496) wird ein Verfahren zur Herstellung fluorgener HIV-Proteasensubstrate beschrieben, bei dem eine Addition von Donor- und Akzeptorspezies an die N- und C-Termini eines Peptidsubstrats erfolgt. Doch sind, wie von den Autoren eingestanden wird, die dabei befolgten Verfahrensweisen, zu denen die Bindung des Fluorophors an den C-Terminus gehört, nicht einfach. Insgesamt wird in dieser Veröffentlichung kein allgemein anwendbarer Ansatz offenbart.
Von Maggiora et al. (J. Med. Chem. 1992, 35, 3727–3730) wird ein Verfahren zur Synthese von FRET-Substraten beschrieben, bei dem ein mit EDANS markiertes (Donor-)Glutaminsäurederivat eingesetzt wird, das während der Peptidsynthese eingeführt wird. Der Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, daß, falls beispielsweise aufgrund einer schwachen Aktivität das EDANS-Derivat kein geeignetes Substrat ergibt, ein anderes Aminosäurederivat hergestellt und das Peptid erneut synthetisiert werden muß. Den optimalen Donor auszuwählen, ist daher nicht einfach.
Aus der WO 91/16336 ist ebenfalls eine Klasse von intramolekular gequenchten FRET-Substraten bekannt, wobei die getrennten Donor- und Akzeptorteile durch Festphasen-Peptidsynthese direkt in das synthetisierte Peptid eingebaut werden.
Es wurde nun von uns ein neues und vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von FRET-Proteasesubstraten gefunden, wobei nach Synthese des Polypeptidsubstrats ein Donor oder Akzeptor über die Seitenkette einer in dem Polypeptid enthaltenen Aminosäure gebunden wird. Dadurch lassen sich viele verschiedene Donor- und Akzeptorpaare, von denen ein großer Teil kommerziell erhältlich ist, an die Peptidstruktur binden. Dementsprechend können wünschenswerte Donor- und Akzeptorkombinationen leicht ausgewählt werden.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids als Fluoreszenzenergietransfer-(FRET-)Substrat für die proteolytische Spaltung, das einander entsprechende reaktive Fluoreszenzdonor- und -akzeptorspezies auf entgegengesetzten Seiten einer proteolytischen Spaltstelle aufweist, bereitgestellt, wobei in dem Verfahren eine geeignete reaktive Donor- oder Akzeptorspezies mit einem zuvor synthetisierten Polypeptidsubstrat, bei dem eine reaktive Seitenkette einer Aminosäure oder eine reaktive Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure auf der zu der einer gebundenen, entsprechenden Donor- oder Akzeptorspezies jeweils entgegengesetzten Seite einer proteolytischen Spaltstelle liegt, so daß die Bindung des reaktiven Donors oder Akzeptors an die Aminosäure erfolgen kann, in Kontakt gebracht wird und die Lage der gebundenen Donor- oder Akzeptorspezies auf dem Polypeptid so gewählt wird, daß die Spaltung des hergestellten FRET-Substrats an der Spaltstelle ermöglicht wird, wodurch die Trennung der Donor- oder Akzeptorspezies erfolgt. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der reaktiven Seitenkette der Aminosäure um eine Thiolgruppe.
Mit dem obigen Verfahren können FRET-Proteasesubstrate, die geeignete Donor- und Akzeptorspezies auf entgegengesetzten Seiten einer proteolytischen Spaltstelle aufweisen, hergestellt werden. Dies wird entweder durch eine vorausgehende oder eine nachfolgende Reaktion des Polypeptidsubstrats mit der entsprechenden reaktiven Donor- oder Akzeptorspezies erreicht. Unter "entsprechend" ist zu verstehen, daß, falls zunächst ein Donor gebunden wird, dann danach ein geeigneter Energietransferakzeptor gebunden wird, oder umgekehrt. Falls gewünscht, können sowohl Donor- als auch Akzeptorspezies über die Seitenketten von darin vorhandenen Aminosäuren gebunden werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids als Fluoreszenzenergietransfer-(FRET-)Substrat für die proteolytische Spaltung, das einander entsprechende Fluoreszenzdonor- und -akzeptorspezies auf entgegengesetzten Seiten einer proteolytischen Spaltstelle aufweist, bereitgestellt, wobei in dem Verfahren eine sich jeweils entsprechende reaktive Donor- und Akzeptorspezies unabhängig voneinander mit einem zuvor synthetisierten Polypeptid, bei dem Aminosäuren mit einer reaktiven Amino- und einer reaktiven Thiolbindungsstelle auf beiden Seiten einer proteolytischen Spaltstelle liegen, so daß die Bindung des reaktiven Donors und Akzeptors zu beiden Seiten der proteolytischen Spaltstelle erfolgen kann, in Kontakt gebracht wird und die Lage der gebundenen Donor- und Akzeptorspezies auf dem auf diese Weise hergestellten FRET-Substrat so gewählt wird, daß die Spaltung an der Spaltstelle ermöglicht wird, wodurch die Trennung der Donor- und Akzeptorspezies erfolgt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids als Fluoreszenzenergietransfer-(FRET-)Substrat für die proteolytische Spaltung, das einander entsprechende Fluoreszenzdonor- und -akzeptorspezies auf entgegengesetzten Seiten einer proteolytischen Spaltstelle aufweist, bereitgestellt, wobei in dem Verfahren ein Polypeptid, das eine freie Aminogruppe auf der einen Seite und eine freie Thiolgruppe auf der anderen Seite einer proteolytischen Spaltstellt enthält, synthetisiert wird; eine thiolreaktive Donor- oder Akzeptorspezies mit dem Polypeptid in Kontakt gebracht wird, um die Donor- bzw. Akzeptorspezies an das Polypeptid zu binden; ein entsprechender aminoreaktiver Donor oder Akzeptor mit dem Polypeptid in Kontakt gebracht wird, um die entsprechende Donor- bzw. Akzeptorspezies an das Polypeptid zu binden; wobei die Lage der gebundenen Donor- und Akzeptorspezies auf dem Polypeptid so gewählt wird, daß die Spaltung des hergestellten FRET-Substrats an der Spaltstelle ermöglicht wird, wodurch die Trennung der Donor- und Akzeptorspezies erfolgt.
Das Polypeptidsubstrat wird zweckmäßigerweise durch direkte Synthese hergestellt, wie beispielsweise zusammenfassend dargestellt in Solid Phase Peptide Synthesis, E Atherton und R C Sheppard, IRL Press, 1989. Das Polypeptidsubstrat kann natürliche oder nicht natürliche (z. B. D-)Aminosäuren, die durch natürliche oder modifizierte Peptidverknüpfungen verbunden sind, bzw. eine beliebige Kombination daraus enthalten.
Die Bindungsstellen auf dem Polypeptidsubstrat für die reaktiven Donor- und Akzeptorspezies werden zweckmäßigerweise von Amino- und Thiolgruppen bereitgestellt. Besonders zweckmäßigerweise sind diese Gruppen im N-Terminus bzw. der Seitenkette eines Cysteinrests enthalten. Ist natürlicherweise keine geeignete Gruppe in der Sequenz vorhanden, so kann diese an einer günstigen Stelle eingefügt werden, vorzugsweise indem ein nicht kritischer Rest ersetzt wird. Beispielsweise läßt sich die Thiolgruppe einführen, indem ein nicht kritischer Rest durch Cystein ersetzt wird. Es versteht sich, daß der Begriff "an die Reaktion angepaßt" sowohl Aminosäuren, die von Natur aus an die Reaktion angepaßt sind, als auch chemisch modifizierte Aminosäuren einschließt.
Andererseits lassen sich die Stellen auf dem Polypeptidsubstrat auch durch Einführung chemisch modifizierter Reste während der Peptidsynthese bereitstellen. Der Ausdruck "Bindung über die Seitenkette einer Aminosäure" umfaßt daher die Bindung über eine Seitenkette einer beliebigen Aminosäure, gleichgültig ob modifiziert oder durch eine geeignete chemische Verknüpfung ersetzt. Eine Bindung über eine beliebige geeignete Verknüpfung, durch die das Wasserstoffatom am α-Kohlenstoff des Aminosäurerests ersetzt wird, ist dabei nicht ausgeschlossen.
Es ist ersichtlich, daß die Donor- und Akzeptorspezies sowie die Art und Weise ihrer Bindung so ausgewählt werden, daß sie keine signifikante Auswirkung auf die proteolytische Spaltung des Substrats haben.
Im allgemeinen wird der N-Terminus des ausgewählten Peptids so gewählt, daß er einen ausreichenden Abstand zu der proteolytischen Spaltstelle aufweist, so daß seine Modifikation keine signifikante Auswirkung auf die Aktivität hat. Dies variiert jedoch von Enzym zu Enzym, so daß als Beispiel der N-Terminus zweckmäßigerweise wenigstens 3 Aminosäuren und in besonders zweckmäßiger Weise mehr als 5 Aminosäuren von der Spaltstelle entfernt ist. Ebenso wird der Bindungsort des Donor/Akzeptors auf der Seitenkette so ausgewählt, daß dies keine signifikante Auswirkung auf die Aktivität hat. Dies variiert ebenfalls entsprechend dem Enzym, doch sollte er, als Beispiel, wenigstens 3, vorzugsweise 5 Aminosäuren, von der proteolytischen Spaltstelle entfernt sein. Der Gesamtabstand zwischen den Bindungsstellen muß so groß sein, daß eine sinnvolle Menge an Energietransfer stattfinden kann. Zwar möchten wir nicht an theoretische Betrachtungen gebunden sein, doch hängt dies von der vom Peptid in Lösung angenommenen 3-dimensionalen Konformation ab. Für den schlimmsten vorhersehbaren Fall wird angenommen, daß sowohl eine lineare Struktur vorliegt als auch daß jede Aminosäure zu 3,8 Angström berechnet wird. Daher sollte bei 50% Energietransfer und Annahme einer günstigen Dipolanordnung die Anzahl an Aminosäuren, die den Donor vom Akzeptor trennen, weniger als Ro/3,8 betragen, wobei Ro derjenige Abstand ist, der zu 50% Transfer führt. Für eine ausführlichere Erläuterung, siehe beispielsweise J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum, 1983. Geeignete Experimente zur Bestimmung der optimalen Positionen für die Bindung der Donor- und Akzeptorspezies sind dem Durchschnittswissenschaftler bekannt.
Zu den für die Umsetzung an Thiolgruppen geeigneten Reagentien gehören mit Maleimid- oder Halogenacetylgruppen derivatisierte Donoren/Akzeptoren. Diese können typischerweise bei neutralem oder mäßig alkalischem pH-Wert und zweckmäßigerweise in stöchiometrischen Mengen umgesetzt werden. Die Reinigung des Peptidderivats von überschüssigem Reagens, falls vorhanden, läßt sich zweckmäßigerweise durch z. B. Gelfiltration oder Reverse-Phase-HPLC erreichen. Andere Verfahren, beispielsweise Extraktion, können eingesetzt werden.
Zu den für die Umsetzung an Aminogruppen geeigneten Reagentien gehören mit Isothiocyanaten, aktiven Carbonsäureestern, wie beispielsweise Carbonsäuresuccinimidylestern, oder Sulfonylhalogeniden derivatisierte Donoren/Akzeptoren. Diese werden im allgemeinen bei mäßig alkalischem pH in einem Überschuß gegenüber dem Peptid umgesetzt. Die Reinigung läßt sich beispielsweise durch Gelfiltration oder Reverse-Phase-HPLC erreichen. Andere Verfahren, beispielsweise Extraktion, können vom Durchschnittsfachmann eingesetzt werden.
Zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Donor- und Akzeptorreagentien sind dem Durchschnittschemiker bekannt. Zu solchen Spezies gehören die in "Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals" – Richard P. Haughland – Molecular Probes Inc. offenbarten. Falls ein gewünschtes Reagens kommerziell nicht erhältlich ist, so ist seine Synthese dem obenerwähnten Durchschnittschemiker geläufig. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Donor- bzw. Akzeptorspezies um einen Fluorophor im sichtbaren Bereich.
Falls gewünscht, ist nur eine Art von Gruppe notwendig, um die Bindung von Donor- und Akzeptorspezies durchzuführen. So werden beispielshalber nur Amino- oder Thiolgruppen, zweckmäßigerweise Thiolgrup pen, benötigt. Durch Zugabe von ungefähr äquimolaren Mengen an entsprechenden Donor- und Akzeptorreagentien ergibt sich ein Reaktionsgemisch, das etwa 50% des gewünschten Substrats enthält.
Die obigen Verfahren lassen sich auf jedes zur proteolytischen Spaltung geeignete Substrat anwenden. Ein besonderes Substrat ist Big-Endothelin. Es ist ersichtlich, daß jeder geeignete Teil einer Substratsequenz verwendet werden kann, vorausgesetzt daß die Erkennungsstelle(n) und die proteolytische Spaltstelle vorhanden sind. Als geeignetes Beispiel dient Big-Endothelin [16–38].
Die obigen Verfahren lassen sich auf die Synthese von Substraten für geeignete Proteasen, beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin, Elastase, Thrombin, Endothelin umsetzendes Enzym, Angiotensin umsetzendes Enzym, HIV-Protease, Matrix abbauende Proteasen, Kollagenasen, Pro-Hormone verarbeitende Enzyme, Pro-Zytokin 1, Wachstumsfaktor verarbeitende Enzyme und Signalpeptidasen, anwenden.
Es versteht sich, daß mehr als eine Donor- und Akzeptorspezies auf der FRET-Protease vorgesehen sein kann, obwohl in der Praxis mehr als zwei Paare weniger zweckmäßig sind.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein FRET-Proteasesubstrat bereitgestellt, wenn dieses mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde.
Aus dem oben Gesagten wird deutlich, daß die folgende Erfindung die Bindung vieler verschiedener Donor- und Akzeptorpaare an die Peptidstruktur in einfacher Weise ermöglicht, so daß das am besten geeignete Paar ausgewählt werden kann. Zu den Faktoren, die bei dieser Auswahl zu berücksichtigen sind, gehören das erzielte Aktivitätsniveau, das Ausmaß des Energietransfers (durch das das Anfangsniveau der Substratfluoreszenz bestimmt wird) sowie die Exzitations- und Emissionswellenlängen des Donors bzw. Akzeptors.
Eine besondere Verwendung der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung von FRET-Proteasesubstraten für das Screening von Verbindungen, beispielsweise auf den Gebieten der Pharmazie und Agrochemie ebenso wie in der allgemeineren Forschung. Bei diesen Verfahren werden die Absorptionswellenlängen der Mehrzahl der Testverbindungen vorzugsweise umgangen.
Es ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen FRET-Proteasesubstrate in verschiedenen homogenen und heterogenen Assays zum Austesten von Verbindungen einzeln oder als Gemische verwendet werden können.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein FRET-Proteasesubstrat, das einen Fluorophor im sichtbaren Bereich enthält, bereitgestellt. Der Fluorophor wird vorzugsweise nach Synthese der Polypeptidkette des Proteasesubstrats gebunden. Der Fluorophor im sichtbaren Bereich wird besonders bevorzugt über eine Seitenkette einer in der Polypeptidkette enthaltenen Aminosäure gebunden. Als Fluorophor im sichtbaren Bereich (Exzitationsmaximum des Donors über etwa 350 nm) sind Fluorescein, Lucifer-Yellow, Acridinorange, Rhodamin und seine Derivate, beispielsweise Tetramethylrhodamin und Texas-Rot, sowie Fluoreszenzchelate bzw. -cryptate von Europium. Ein bevorzugter Fluorophor ist Fluorescein.
Geeignete Energietransferpaare finden sich in der Literatur, beispielsweise in Applications of Fluorescence in immunoassays (I. A. Hemmila, Wiley Interscience, 1991), oder können vom Durchschnittsfachmann gemäß den Prinzipien des Energietransfers, wie sie beispielsweise in J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum, 1983 zusammengefaßt sind, eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nun unter Bezugnahme auf das folgende, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, erläutert:

1. Es wird eine gewünschte Peptidsequenz ausgewählt, die die proteolytische Spaltungsstelle umfaßt.
2. Es wird eine sich C-terminal von der Spaltstelle befindende Position ausgewählt, die zu Cystein mutiert und als Bindungsstelle ohne Verlust der Substrataktivität verwendet werden kann.
3. Das obige Peptid wird mit:
(a) einem freien N-Terminus (der C-Terminus kann je nach Bedarf frei oder aminiert sein) synthetisiert;
(b) alle sich C-terminal von der proteolytischen Spaltstelle befindenden Lysine oder Lysine, die bezüglich der Enzymaktivität als nicht tolerant gelten, werden entweder zu einem nichtreaktiven Analog (z. B. Arginin oder Dimethyllysin) "mutiert" oder reversibel geschützt;
(c) alle sich N-terminal von der proteolytischen Spaltstelle befindenden Lysine können wie oben behandelt, oder, falls sie als tolerant gegenüber der Konjugation eingestuft werden, an Ort und Stelle belassen werden (wobei hier, falls gewünscht, der N-Terminus modifiziert werden kann).

Das Peptid weist nun eine oder mehrere Aminogruppen auf einer Seite der Spaltstelle sowie ein einziges Thiol auf der anderen Seite auf. Viele verschiedene thiolreaktive und aminoreaktive Derivate von Fluorophoren und Akzeptormolekülen sind kommerziell erhältlich, einschließlich vieler Moleküle, die im sichtbaren Bereich des Spektrums arbeiten. Mit dem obigen Peptid ist es daher möglich, eine Reihe von geeigneten Energietransfersubstraten mit unterschiedlichen Paaren und unterschiedlichen Orientierungen zu synthetisieren.
Wird Big-Endothelin [16–38] als das FRET-Proteasesubstrat verwendet, gelten die obigen Komplikationen nicht, da keine Lysine vorhanden sind. Wir haben Hinweise darauf erhalten, daß die Wahl des Donor-Akzeptor-Paars bei diesem Substrat einen signifikanten Effekt auf die Aktivität hat und es daher sehr nützlich ist, ein Screening von unterschiedlichen Paaren und Orientierungen durchführen zu können.
Es ist unwahrscheinlich, daß Peptide mit freien Cysteinen häufig vorkommen, doch es wird erwartet, daß diesen in einer zu dem oben für Lysin beschriebenen Ansatz analogen Weise Rechnung getragen werden kann.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Figuren erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
In 1 ist der Verlauf von zwei Reaktionen gezeigt, wie sie bezüglich Zeit (x-Achse) und Fluoreszenzeinheiten (y-Achse) gemessen wurden. In der ersten Reaktion wird nur das Substrat A zu dem Reaktionsansatz gegeben, während in der zweiten Reaktion sowohl Substrat A als auch Enzym zugegeben werden. Zum Stoppen dieser zweiten, enzymkatalysierten Reaktion wird Phosphoramidon zugegeben.
In 2 ist der im Zeitverlauf erhaltene Fluoreszenzanstieg unter Verwendung des Substrats D als Substrat für die Staphylokokkus-V8-Protease gezeigt (vgl. Beispiel 2). Die Reaktion pendelt sich auf einem Niveau ein, das ca. 6,3fach höher als das Startniveau liegt. Unter der Annahme, daß das Substrat während der Inkubation vollständig umgesetzt wurde, deutet dies darauf hin, daß das Substrat D zu ca. 84% gequencht wurde.
Beispiel 1
Herstellung des Ausgangspeptids
Die ausgewählte Peptidsequenz wurde von der des menschlichen Big-Endothelin-1, 16–37, abgeleitet, wobei Glu-26 zu Cys geändert wurde:
Dieses Peptid (Peptid I) wurde auf einem Polyamidträger mittels herkömmlicher Fmoc-Chemie synthetisiert, wie in Solid Phase Peptide Synthesis, E Atherton und R C Sheppard, IRL Press, 1989 beschrieben.
Herstellung von ([Cys-26]Fluoresceinyl) – Peptid I
Zu einer Lösung von Peptid I in Wasser (2 mg/ml) wurde eine äquimolare Menge 5-Maleimidofluorescein (Molecular Probes, zugegeben als 5 mM-Lösung in DMSO) zugegeben. Nach 10 Minuten wurden 0,3 Volumen 0,1 M NaHCO3, 0,9% NaCl-Puffer, pH 8,5 zugegeben. Nach weiteren 10 Minuten wurde die Probe auf ihren Thiolgehalt mit Ellmans-Reagens getestet. Es stellte sich heraus, daß der Thiolgehalt gleich null war, was auf eine vollständige Kopplung hindeutet.
Herstellung von Tetramethyrhodaminyl ([Cys-26]Fluoresceinyl)-Peptid (Substrat A)
Zu ([Cys-26]Fluoresceinyl)-Peptid I wurde 20 mM Tetramethylrhodaminisothiocyanat (Molecular Probes, R-oder G-Isomer oder Gemisch davon) in DMSO mit einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht im Dunkeln inkubiert. Das Gemisch wurde auf einer Säule mit in Wasser äquilibriertem Sephadex G15 entsalzt. Das W-/sichtbare Spektrum zeigte Peaks von ähnlicher Größe bei 495 nm und 553 nm, was auf die Anwesenheit ungefähr äquimolarer Mengen von sowohl Fluorescein als auch Tetramethylrhodaminanteilen im Peptid hindeutet.
Herstellung von Dimethoxyfluorescein ([Cys-26]Fluoresceinyl)-Peptid (Substrat B)
Zu ([Cys-26]Fluoresceinyl)-Peptid I (0,58 ml) wurden 0,116 ml 50 mM Dimethoxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester (hergestellt nach dem in Anal. Biochem. 108, 156–161 beschriebenen Verfahren) in DMSO zugegeben. Nach 2 Stunden wurden 0,5 ml DM zugegeben, um das teilweise ausgefallene Material wieder aufzulösen, wonach weitere 2,0 mg des Dimethoxyfluoresceinreagens in DMSO (0,15 ml) zugegeben wurden. Nach weiteren 2 Stunden wurde das Produkt isoliert, indem es durch eine Sephadex-Gl5-Säule (ca. 10 ml), die mit 0,2M Tris-HCl-Puffer, pH 7,2: DMSO, 4 : 1, äquilibriert worden war, geleitet wurde. Zusätzlich zu einer Fluoresceinabsorption bei 495 nm war in dem W-Spektrum eine Absorption bei 518 nm zu sehen, was mit ca. 1 Mol/Mol Dimethoxyfluorescein übereinstimmt.
Herstellung von [Cys-26]Eosinyl)-Peptid I
Zu einer Lösung von Peptid I in Wasser (2 mg/ml) wurden 1,1 Äquivalente 5-Maleimidoeosin (Molecular Probes, zugegeben als 5 mM-Lösung in DMSO) zugegeben. Nach 15 Minuten wurden 0,3 Volumen 0,1 M NaHCO3, 0,9% NaCl-Puffer, pH B.5 zugegeben. Nach weiteren 15 Minuten wurde eine Probe auf ihren Thiolgehalt mit Ellmans-Reagens getestet. Da etwas freies Thiol nachgewiesen wurde, wurden weitere 0,16 Äquivalente 5-Maleimidoeosin zugegeben. Nach einer weiteren Reaktionszeit von ungefähr 0,5 Stunden stellte sich heraus, daß der Thiolgehalt gleich null war, was auf die vollständige Kupplung hindeutet.
Herstellung von Fluoresceinyl [Cys-26]Eosinyl)-Peptid I (Substrat C)
Zu ([Cys-26]Eosinyl)-Peptid I wurde Fluorescein-5-isothiocyanat (Molecular Probes) in DMSO mit einer Endkonzentration von 2,5 mg/ml gegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht im Dunkeln inkubiert. Das Gemisch wurde auf einer in 0,2M Tris-HCl-Puffer, pH 7,2, äquilibrierten Sephadex-Gl5-Säule entsalzt. Das UV-/sichtbare Spektrum zeigte Peaks von ähnlicher Größe bei 495 nm und 553 nm, was auf die Anwesenheit ungefähr äquimolarer Mengen von sowohl Fluorescein als auch Tetramethylrhodaminanteilen im Peptid hindeutet.
Substratauswertung
Proben von Endothelin-umsetzendem Enzym (Endothelin converting enzyme, ECE) wurden nach dem Verfahren von Okada et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 3, 1192–1198 erhalten. Eine höher gereinigte Probe, die zur Auswertung des Substrats C verwendet wurde, war ein Geschenk von M Abbott (Zeneca).
Substrate wurden bei ca. 10μM in 0,2M Tris-HCl-Puffer, pH 7,2, inkubiert und mit ECE bei 37 Grad C in den Vertiefungen von schwarzen Mikrotiterplatten (Labsystems) inkubiert. Die Fluoresceinfluoreszenz wurde in verschiedenen Zeitabständen auf einem Labsystems-Fluoroskan-Fluoreszenzplatten-Ablesegerät mit auf 490 bzw. 535 nm eingestellten Exzitations- bzw. Emissionsfiltern gemessen. Nach einer ersten Inkubation von ca. 0,5 Stunden (um, so wird vermutet, die Bildung eines stabilen Meniskus zu gestatten) wurde ein linearer Fluoreszenzanstieg erhalten. Dies ist für Substrat A in 1 dargestellt. Ebenfalls gezeigt ist hier eine Kontrolle, in der kein Enzym vorhanden war. Und ebenso die Auswirkung der Zugabe von Phosphoramidon, einem bekannten Inhibitor von ECE, mit einer Endkonzentration von 0,3 mM.
Die Umsetzung in Prozent pro Zeiteinheit wurde für jedes Substrat berechnet, und die Ergebnisse wurden mit der Umsetzung dieser ECE-Präparation von Big-ET verglichen, die typischerweise eine Umsetzung von ca. 25% pro Stunde ergab, wie mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (High Pressure Liquid Chromatography – HPLC) geschätzt wurde. Die Aktivitäten der drei Substrate ergaben sich dadurch wie folgt:
Die drei Substrate zeigen sehr unterschiedliche Aktivitätsniveaus. Das deutet darauf hin, daß das erfindungsgemäße Verfahren leicht zur Untersuchung der Aktivität von FRET-Proteasesubstraten, bei denen unterschiedliche Fluorophore und Akzeptoren eingesetzt werden, verwendet werden können.
Beispiel 2
Herstellung von Ausgangspeptiden
Die ausgewählten Peptidsequenzen waren wie folgt

1. Für das Endothelin-umsetzende Enzym, menschliches Big-Endothelin-1, mit Änderung von Glu-26 zu Cys:
2. Für die Staphylokokkus-V8-Protease:

Die obigen Peptide I und II wurden auf Polyamidträgern mit herkömmlicher Fmoc-Chemie syntheti siert, wie in Solid Phase Peptide Synthesis, E Atherton und R C Sheppard, IRL Press, 1989 beschrieben.
Herstellung von [Cys-13]Fluoresceinyl – Peptid II
Zu einer Lösung von Peptid II in Wasser (2,5 mg/ml) wurde eine äquimolare Menge 5-Maleimidofluorescein (Molecular Probes, zugegeben als 13,3 mM-Lösung in DMSO) zugegeben. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden 0,3 Volumen 0,1M NaHCO₃, pH 8,5, zugegeben und die Lösung weitere 15 Minuten inkubiert. Es wurde eine Probe auf ihren Thiolgehalt unter Verwendung von Ellmans-Reagentien getestet: Dies ergab einen 98%igen Verlust an Thiol, was auf eine im wesentlichen vollständige Kupplung hindeutet.
Herstellung von Tetramethylrhodaminyl [Cys-13]Fluoresceinyl-Peptid II (Substrat D)
Zu [Cys-13]Fluoresceinyl-Peptid II wurde 40 mM Tetramethylrhodaminisothiocyanat (Molecular Probes, G-Isomer) in DMSO unter Erhalt einer Endkonzentration von 4,3 mM gegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur über Nacht im Dunkeln inkubiert. Das Gemisch wurde dann auf einer in Wasser äquilibrierten Sephadex-G15-Säule entsalzt. Das W-/sichtbare Spektrum zeigte Peaks von ähnlicher Größe bei 495 nm und 553 nm, was auf die Anwesenheit ungefähr äquimolarer Mengen von sowohl Fluorescein als auch Tetramethylrhodaminanteilen im Peptid hindeutet.
Auswertung der Substrate für Endothelin-umsetzendes Enzym (Substrate A, B und C)
Dies wurde gemäß der in Beispiel 1 dargelegten Vorschrift ausgeführt.
Auswertung des Substrats für Staphylokokkus-V8-Protease (Substrat D)
Die Staphylokokkus-V8-Protease wurde von Pierce Chemicals Co. bezogen.
Zu einer Lösung von Substrat D (ca. 0,5 mikromolar in 0,2M Tris-HCl-Puffer, pH 7,2, 0,6 ml) in einer Fluoreszenzküvette wurde V8-Protease (0,04 ml, 300 Einheiten) gegeben und der Fluoreszenzanstieg in einem Spex-Fluoromax-Fluorimeter mit einer Exzitation bei 495 nm und einer Emission bei 515 nm sowie mit einem Graufilter von OD 1,0 und Spaltbreiten von 5 nm verfolgt. Die Inkubation wurde bei Umgebungstemperatur durchgeführt.
In 2 ist der erhaltene Fluoreszenzanstieg gezeigt. Die Reaktion pendelt sich bei einem Niveau ein, das ca. 6,3fach höher als das Ausgangsniveau ist. Unter der Annahme, daß das Substrat während der Inkubation vollständig umgesetzt wurde, deutet dies darauf hin, daß das Substrat D zu ca. 84% gequencht wurde.
Dies zeigt, daß es sich bei dem Substrat D um ein zur Einschätzung der Staphylokokkus-V8-Protease geeignetes Substrat handelt.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids als Fluoreszenzenergietransfer-(FRET-)Substrat für die proteolytische Spaltung, das einander entsprechende Fluoreszenzdonor- und -akzeptorspezies auf entgegengesetzten Seiten einer proteolytischen Spaltstelle aufweist, wobei in dem Verfahren eine geeignete reaktive Donor- oder Akzeptorspezies mit einem zuvor synthetisierten Polypeptidsubstrat, bei dem eine reaktive Seitenkette einer Aminosäure oder eine reaktive Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure auf der zu der einer gebundenen, entsprechenden Donor- oder Akzeptorspezies jeweils entgegengesetzten Seite einer proteolytischen Spaltstelle liegt, so daß die Bindung des reaktiven Donors oder Akzeptors an die Aminosäure erfolgen kann, in Kontakt gebracht wird und die Lage der gebundenen Donor- und Akzeptorspezies auf dem Polypeptid so gewählt wird, daß die Spaltung des hergestellten FRET-Substrats an der Spaltstelle ermöglicht wird, wodurch die Trennung der Donor- und Akzeptorspezies erfolgt.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids als Fluoreszenzenergietransfer-(FRET-)Substrat für proteolytische Spaltung, das einander entsprechende Fluoreszenzdonor- und -akzeptorspezies auf entgegengesetzten Seiten einer proteolytischen Spaltstelle aufweist, wobei in dem Verfahren eine sich jeweils entsprechende reaktive Donor- und Akzeptorspezies unabhängig voneinander mit einem zuvor synthetisierten Polypeptid, bei dem Aminosäuren mit einer reaktiven Amino- und einer reaktiven Thiolbindungsstelle auf beiden Seiten einer proteolytischen Spaltstelle liegen, so daß die Bindung des reaktiven Donors und Akzeptors zu beiden Seiten der proteolytischen Spaltstelle erfolgen kann, in Kontakt gebracht wird und die Lage der gebundenen Donor- und Akzeptorspezies auf dem auf diese Weise hergestellten FRET-Substrat so gewählt wird, daß die Spaltung an der Spaltstelle ermöglicht wird, wodurch die Trennung der Donor- und Akzeptorspezies erfolgt.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids als Fluoreszenzenergietransfer-(FRET-)Substrat für proteolytische Spaltung, das einander entsprechende Fluoreszenzdonor- und -akzeptorspezies auf entgegengesetzten Seiten einer proteolytischen Spaltstelle aufweist, wobei in dem Verfahren ein Polypeptid, das eine freie Aminogruppe auf der einen Seite und eine freie Thiolgruppe auf der anderen Seite einer proteolytischen Spaltstelle enthält, synthetisiert wird; eine thiolreaktive Donor- oder Akzeptorspezies mit dem Polypeptid in Kontakt gebracht wird, um die Donor- bzw. Akzeptorspezies an das Polypeptid zu binden; ein entsprechender aminoreaktiver Donor oder Akzeptor mit dem Polypeptid in Kontakt gebracht wird, um die entsprechende Donor- bzw. Akzeptorspezies an das Polypeptid zu binden; wobei die Lage der gebundenen Donor- und Akzeptorspezies auf dem Polypeptid so gewählt wird, daß die Spaltung des hergestellten FRET-Substrats an der Spaltstelle ermöglicht wird, wodurch die Trennung der Donor- und Akzeptorspezies erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei zunächst ein thiolreaktiver Donor oder Akzeptor an die reaktive Thiolgruppe auf dem Polypeptid gebunden und danach die entsprechende aminoreaktive Donoroder Akzeptorspezies an die reaktive Aminogruppe auf dem Polypeptid gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der reaktiven Seitenkette auf der Aminosäure um eine Thiolgruppe handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei es sich bei der reaktiven Aminogruppe um die von der N-terminalen Aminosäure bereitgestellte reaktive Aminogruppe handelt.
Verfahren nach Anspruch 2, 3, 4 oder 5, wobei es sich bei der (den) thiolhaltigen Aminosäure(n) um Cystein handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Donor- bzw. Akzeptorspezies um einen Fluorophor im sichtbaren Bereich handelt.