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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung eines Targetproteins/von
Targetproteinen unter Verwendung eines peptidimmobilisierten Substrats.
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Stand der Technik
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Analysen
von Proteinfunktionen, die im Körper
vorhanden sind, sind Aufgaben, denen eine große Bedeutung zukommt. Verfahren
zur Identifikation und Quantifizierung dieser exprimierten Proteine
entsprechen den weitreichenden sozialen Anforderungen, die von der
Klärung
von Zellfunktionen auf dem Gebiet der Forschung bis hin zu Diagnosestellungen
und Therapien auf dem Gebiet der Medizin reichen. Als Mittel zur
Identifikation und Quantifizierung von Proteinen sind Verfahren
bekannt, die Antikörper
und verschiedene Biosensor-Systeme unter Verwendung von Anordnungen
spezifischer Proteine verwenden.
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Das
Konzept zur Entwicklung der herkömmlichen
Proteinchips basiert auf der Immobilisierung von Proteinen oder
Fragmenten davon, deren Strukturen bekannt sind. Die Immobilisierung
von Antikörper-Molekülen basiert
ebenfalls auf diesem Konzept. Mit diesem Verfahren ist die Quantifizierung
der Beladungsmenge problematisch, und eine einheitliche Immobilisierung
ist schwierig. Insbesondere da die Ausbeute der Immobilisierung
(Beladungsmenge) allgemein gering ist und von den Eigenschaften
der Peptidfragmente abhängt, fehlt
dem Verfahren die Verlässlichkeit,
wodurch seine Verwendung auf breiter Ebene verhindert wird. Weiters sind
in Fällen,
in denen Proteinfragmente verwendet werden, die Spaltstellen aufgrund
von Spezifitäten
der Spaltung (falls die Proteine ohne Spezifitäten gespalten werden, sind
die Resultate zufällig
erzeugte Fragmente, wodurch die auf den Chips immobilisierten Moleküle nicht
identifiziert werden können)
eingeschränkt,
daher kann kein freies Erschaffen erreicht werden. Ebenfalls ist
anzumerken, dass die so immobilisierten Proteine Strukturen aufweisen,
die sich von jenen im Körper
unterscheiden, und dass sie unter Umständen jene Strukturen, die zum
Erzielen der gewünschten
Erkennungen un erlässlich
sind, nicht aufweisen. Dies sind Probleme bei der praktischen Durchführung.
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Verfahren
zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Peptiden und Proteinen
in Lösungen
unter Verwendung eines Fluorometers oder dergleichen sind bekannt.
Für diese
Verfahren ist jedoch eine beträchtliche
Menge an Proben erforderlich, so dass zur Probenherstellung viel
Zeit benötigt
wird. Seit kurzem werden Verfahren, wie z. B. Oberflächenplasmonen
oder dergleichen, verwendet. Die Vorrichtungen sind jedoch teuer, die
Empfindlichkeit ist allgemein gering, und einfache Messungen an
lokalen Orten können
nicht erhalten werden. Daher ist die Behandlung zahlreicher Proben
mit den herkömmlichen
Verfahren schwierig.
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Reineke
et al., Current Opinion in Biotechnology, Band 12, Nr. 1, 59–64 (02/2001),
zeigen eine Rezension, die verschiedene Entwicklungen hinsichtlich
Peptidanordnungen beschreibt, die unter Verwendung von SPOT-Syntheseverfahren
hergestellt werden. Genauer gesagt wird ein Test beschrieben, der
zur Messung der Proteaseaktivität
verwendet wird. Der Test verwendet immobilisierte oder gebundene
Peptide mit einem fluoreszierenden Farbstoff, der an den freien
Aminoterminus gebunden ist. Die Protease spaltet die Peptide irgendwo
an ihrer Länge,
wodurch ein Peptidfragment freigesetzt wird, das den fluoreszierenden
Farbstoff in sich trägt.
Die freigesetzten Fragmente werden gesammelt und quantifiziert und
mit der Proteaseaktivität
korreliert.
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Cotton
et al., Chemistry & Biology,
Band 7, Nr. 4, 253–261
(04/2000), beschreiben eine Extension des semisynthetischen Verfahrens,
das als „Ligation
exprimierter Proteine" bekannt
ist, das verwendet wird, um mehrere verschiedene chemische Sonden
spezifisch in eine Targetsequenz einzuführen. Dieses neue Verfahren
wird als „Festphasenligation
exprimierter Proteine" (SPPL)
bezeichnet. Große
semisynthetische Proteine werden auf einem festen Träger durch
die kontrollierte sequenzielle Ligation einer Reihe rekombinanter
und synthetischer Polypeptid-Bausteine angeordnet. Dieses Verfahren
wurde zur Dualmarkierung der Amino- und Carboxyl-Termini des Crk-II-Adapter-Proteins
mit dem FREI-Paar Tetramethylrhodamin und Fluorescein verwendet.
Die dualmarkierte Version von Crk-II wurde aus drei Fragmenten hergestellt:
aus rekombinantem Crk-II voller Länge (hergestellt durch ein
gentechnologisches Verfahren) und aus zwei kleinen synthetischen Polypeptiden.
Anschließend
wurde eine native chemische Ligation verwendet, um die Polypeptide
schrittweise aneinander zu befestigen (siehe jenen Absatz, der die
linke und die rechte Spalte auf Seite 257 überspannt).
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Offenbarung der Erfindung
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Hierin
beschrieben ist ein Verfahren, das ein peptidimmobilisiertes Substrat
umfasst, zum Messen eines Targetproteins/von Targetproteinen, mit
dem das Peptid eine Struktur aufweisen kann, die erforderlich ist, um
vom Targetprotein erkannt zu werden, mit dem die genaue Beladungsmenge
des Peptids erzielt werden kann und durch das (eine) Spurenmenge(n)
von Targetprotein(en) auf genaue und einfache Art und Weise gemessen
werden kann/können.
Die Erfindung wird in den im Anhang befindlichen Ansprüchen definiert.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung gingen ausführlichen Studien nach, um festzustellen,
dass das oben stehend beschriebene peptidimmobilisierte Substrat
durch ein peptidimmobilisiertes Substrat zum Messen eines Targetproteins
erhalten werden kann, das ein chemisch synthetisiertes Peptid mit
einer erwarteten Raumstruktur oder mit einer Bindungsfähigkeit
mit dem Targetprotein umfasst, welches das Peptid mit den Targetproteinen
binden kann und das auf dem Substrat immobilisiert ist, wie in den
im Anhang befindlichen Ansprüchen
definiert ist. Weiters ließ sich
von den Erfindern der vorliegenden Erfindung ableiten, dass ein
Protein in einer Testprobe leicht und einfach gemessen werden kann
oder dass ein Protein, das in einer unbekannten Testprobe enthalten
ist, durch Immobilisieren einer Vielzahl chemisch synthetisierter
Peptide auf einem Substrat; Umsetzen der Peptide mit einer Testprobe,
die das Targetprotein umfassen kann; Zuordnen eines sichtbaren physischen
Werts zu dem für
jedes der Peptide gemessenen Signal; sowie durch das Darstellen sichtbarer
Daten der Peptide in einer Anordnung, wie in den im Anhang befindlichen
Ansprüchen
definiert, identifiziert oder beschrieben werden kann.
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Hierin
wird ein peptidimmobilisiertes Substrat zum Messen eines Targetproteins/von
Targetproteinen beschrieben, umfassend (ein) chemisch synthetisierte(s)
Peptid(e) mit (einer) erwarteten Raumstruktur(en) oder mit (einer)
Bindungsfähigkeit(en)
mit dem/den Targetprotein(en), wobei das/die Peptid(e) mit dem/den Targetprotein(en)
binden kann/können
und auf dem Substrat immobilisiert ist/sind. Die vorliegende Erfindung stellt
ein Verfahren zum Messen eines Targetproteins/von Targetproteinen
bereit, umfassend das Kontaktieren des peptidimmobilisierten Substrats
gemäß der vorliegenden
Erfindung mit dem/den Targetprotein(en); sowie das Messen des/der
Targetproteins/Targetproteine, das/die an das/die Peptid(e) gebunden
ist/sind, und zwar basierend auf der Veränderung des/der Signals/Signale,
wie in den im Anhang befindlichen Ansprüchen definiert wird. Die vorliegende
Erfindung stellt weiters ein Verfahren zum Messen eines Proteins/von
Proteinen in einer Testprobe bereit, umfassend die Schritte des
Kontaktierens einer Vielzahl chemisch synthetisierter Peptide, von
denen jedes eine erwartete Raumstruktur oder eine Bindungsfähigkeit
mit dem Targetprotein besitzt, die an das Targetprotein binden kann
oder könnte,
mit der Testprobe, die das/die Targetprotein(e) enthalten kann,
wobei die Vielzahl an Peptiden auf demselben oder anderen Substraten
immobilisiert ist; des Messens der sich nach der Bindung zwischen
den Peptiden und dem/den Targetprotein(en) verändernden Signale; des Umwandelns
eines jeden der für
jedes Peptid gemessenen Werte in Daten, mit denen Unterschiede zwischen gemessenen
Werten mit bloßem
Auge erkannt werden können,
sowie des schlussendlichen Darstellens sichtbarer Daten der Peptide
in einer Anordnung, wie in den im Anhang befindlichen Ansprüchen definiert
wird. Die vorliegende Erfindung stellt weiters ein Verfahren zur
Identifikation oder Beschreibung eines Proteins/von Proteinen in
einer Testprobe bereit, umfassend das Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung für
verschiedene Testproben; das Sammeln der erhaltenen gemessenen Werte,
um eine Datenbank zu erstellen; sowie das Vergleichen der gemessenen
Daten einer unbekannten Testprobe mit den gemessenen Daten in der
Datenbank, wodurch die unbekannte Testprobe identifiziert oder charakterisiert
wird, wie in den im Anhang befindlichen Ansprüchen definiert wird.
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Durch
die vorliegende Erfindung wurde ein neues Verfahren, das ein peptidimmobilisiertes
Substrat umfasst, zum Messen eines Targetproteins bereitgestellt,
durch das eine Spurenmenge eines Targetproteins genau und einfach
gemessen werden kann. In dem peptidimmobilisierten Substrat ist
jedes der Peptide ein chemisch synthetisiertes Peptid und kann auf
dem Substrat unter jenen Bedingungen immobilisiert werden, bei denen
die funktionellen Gruppen in den Seitenketten der Aminosäuren geschützt oder
ungeschützt
sind. Das heißt,
das Peptid kann auf dem Substrat an einer bestimmten Stelle immobilisiert
werden, und die wirksame Immobilisierungsmenge kann beliebig gesteuert
werden. Weiters kann das Peptid frei kreiert werden, so dass eine
beliebige Markierung oder eine funktionelle Molekülgruppe
an eine beliebige Stelle gebunden werden kann, oder es kann ein
Peptid, enthaltend eine Aminosäure,
die in natürlichen
Proteinen nicht vorkommt, verwendet werden. Das Peptid ist gemäß den im
Anhang befindlichen Ansprüchen
markiert. Ebenso kann mittels Fingerprint-Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung die Identifikation oder Charakterisierung des Proteins,
das in der Testprobe enthalten ist, leicht und schnell erzielt werden,
und es kann eine Reihe an Testproben oder unbekannten Testproben
gemessen werden.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine schematische Darstellung des Konzepts des peptidimmobilisierten
Substrats gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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2 ist
eine schematische Darstellung einer linearen Struktur des Peptids,
das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
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3 ist
eine schematische Darstellung der in Beispiel 1 der vorliegenden
Erfindung durchgeführten Messung.
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4 ist
eine schematische Darstellung der in Beispiel 2 der vorliegenden
Erfindung durchgeführten Messung.
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Bester Modus zur Durchführung der
Erfindung
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In
der vorliegenden Erfindung ist das auf dem Substrat zu immobilisierende
Peptid ein chemisch synthetisiertes Peptid, wie in den Ansprüchen definiert.
Die meisten der natürlich
auftretenden Proteine besitzen die Eigenschaften, die Oligopeptide
mit bestimmten Raumstrukturen molekular zu erkennen und an diese
zu binden (Verweis: W. E. Stites, Protein-Protein Interactions:
Interface structure, binding thermodynamics and mutational analysis,
Chem. Rev. 97, 1233–1250
(1997); D. P. Fairlie et al., Toward Protein surface mimetics, Curr.
Medicinal Chem. 5, 29–62
(1998); sowie A. G. Cochran, Agonist of Protein-Protein interactions,
Chem. & Biol.
7, R85–R94
(2000)). Es ist vorherbestimmt, welches Protein mit welchem Oligopeptid
mit welcher Raumstruktur bindet. Der erste Kandidat des in der vorliegenden
Erfindung verwendeten Peptids ist solch ein Peptid mit einer spezifischen
Raumstruktur. Die Raumstrukturen des Oligopeptids, die an Proteine
binden, umfassen verschiedene Raumstrukturen, wie z. B. α-Helix, α-Schleife-α, β-Schleife, β-Schleife-β sowie β-Strang.
Als das auf dem Substrat zu immobilisierende Peptid werden Peptide
mit solch einer spezifischen Raumstruktur als Beispiel angeführt. Diese
Raumstrukturen sind jene, die das Peptid aufweisen kann, wenn das
Peptid mit dem Targetprotein gebunden ist, und das Peptid besitzt
diese Raumstrukturen nicht notwendigerweise, wenn es auf dem Substrat
lediglich immobilisiert ist. In der vorliegenden Erfindung bedeutet
der Ausdruck „mit
einer erwarteten Raumstruktur",
dass das Peptid die erwartete Raumstruktur aufweist, wenn es mit
dem Targetprotein gebunden ist. Es ist anzumerken, dass das gesamte
Peptid nicht notwendigerweise die erwartete Raumstruktur aufweist,
solange der größte Teil
des Peptids (vorzugsweise nicht weniger als 60%, noch bevorzugter
nicht weniger als 70%, bezüglich
der Anzahl der Aminosäuren)
die erwartete Raumstruktur aufweist. Daher kann/können die
hierin unten stehend beschriebene(n) Markierung(en) an eine oder
beide terminale(n) Region(en) des Peptids gebunden werden, und die
Region(en) kann/können
möglicherweise
nicht zur Bildung der erwarteten Raumstruktur beitragen. Es wird
vielmehr bevorzugt, die Region(en) (im Folgenden hierin auch als „Bindungsregion" bezeichnet), an
die das Peptid auf dem Substrat immobilisiert ist oder an die die
Markierung(en) gebunden ist/sind, und die der Bindung mit dem Targetprotein
zu unterziehende Region zu trennen. Es wird hierin bevorzugt, dass
die Region (im Folgenden hierin auch als „Kernregion" bezeichnet), die
der Bindung mit dem Targetprotein unterzogen werden soll, jene Raumstruktur
aufweist, die für
die Bindung optimal ist. In diesem Fall wird/werden die Bindungsregion(en)
vorzugsweise an einen oder beide Termini der Kernregion gebunden. Das
Peptid mit der oben genannten Raumstruktur kann eine zirkuläre Struktur
aufweisen. In manchen Fällen kann
die Bindungsaffinität
mit dem Protein durch Herstellung des Peptids in einer zirkulären Form
stark erhöht werden.
Obwohl ein Peptidantigen chemisch synthetisiert werden kann und
als Peptid zur Messung eines Antikörpers verwendet werden kann,
ist die Bindung zwischen dem Peptid und dem Targetprotein nicht
notwendigerweise überhaupt
eine Antigen-Antikörper-Reaktion.
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Als
Proteine, die eine Bindung mit den Oligopeptiden mit den oben stehend
beschriebenen Raumstrukturen eingehen, werden die folgenden Proteine
als Beispiele angeführt.
Für jene
Proteine, die an ein Oligopeptid mit einer α-Helix-Struktur binden, werden
Calmodulin und gp41 von HIV als Beispiele angeführt. Für jene Proteine, die an ein
Oligopeptid mit einer β-Schleifen-Struktur
binden, wird Amylase als Beispiel angeführt. Für jene Proteine, die an ein β-Strang-Peptid
binden, werden MHC-Proteine, Asparaginsäure-Proteasen, HIV-1-Protease,
Cystein-Proteasen, Metalloproteasen und Serin-Proteasen als Beispiele
angeführt.
Für jene Proteine,
die an ein β-Schleife-β- oder β-Schleife-Peptid
binden, werden Fibronectin, LH-RH-Rezeptoren, Substanz-P-Rezeptoren,
Somatostatin-Rezeptoren und dergleichen als Beispiele angeführt. Die
Proteine sind jedoch nicht darauf beschränkt.
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Zusätzlich zu
den oben stehend beschriebenen Peptiden mit den erwarteten Raumstrukturen
können auch
Peptid-Derivate mit Bindungsfähigkeiten
mit den Targetproteinen, wie z. B. jene, bei denen eine organische
Molekülgruppe
(funktionelle Molekülgruppe),
von der bekannt ist, dass sie eine Wechselwirkung mit einem Protein
aufweist, an eine bestimmte Stelle gebunden wird, als Peptid verwendet
werden. Beispiele solcher funktioneller Molekülgruppen umfassen Porphyrin-Derivate
(Häm),
Flavin-Derivate, Alkyl-Gruppen, wie z. B. Retinal- und Palmityl-Gruppen,
Nucleinsäu rebasen
und Peptid-Nucleinsäuren,
die funktionellen Molekülgruppen
sind jedoch nicht darauf beschränkt.
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Für jene Proteine,
die diese funktionellen Molekülgruppen
binden, werden die folgenden Proteine als Beispiele angeführt. Für jene Proteine,
die Porphyrin-Derivat (Häm)
enthaltende Peptide binden, werden Apo-Häm-Proteine als Beispiele angeführt. Für jene Proteine,
die Flavin-Derivat enthaltende Peptide binden, werden Apo-Flavin-Proteine als
Beispiele angeführt.
Für jene
Proteine, die Peptide binden, die Alkylgruppen, wie z. B. Retinal-
und Palmityl-Gruppen, enthalten, werden Lipocalin-Proteine als Beispiele
angeführt.
Für jene Proteine,
die Nucleinsäure-Basen
enthaltende Peptide binden, werden DNasen, RNasen, verschiedene
genfunktionssteuernde Proteine und RNA-bindende Proteine als Beispiele
angeführt.
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Das
Konzept des peptidimmobilisierten Substrats, umfassend ein chemisch
synthetisiertes Peptid mit einer erwarteten Raumstruktur oder mit
einer Bindungsfähigkeit
mit dem Targetprotein, wobei das Peptid auf dem Substrat immobilisiert
ist, wird schematisch in 1 dargestellt.
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Mit
der momentan vorhandenen Technologie kann jene Aminosäuresequenz,
die zum Erzielen einer bestimmten Raumstruktur erforderlich ist,
unter Verwendung eines Computers leicht bestimmt werden. Computer-Software-Programme
zur Durchführung
solch eines molekularen Designs sind im Handel erhältlich,
und die Sequenz des Peptids mit der erwarteten Raumstruktur kann
unter Verwendung der Computer-Software-Programme
leicht bestimmt werden. Die Anzahl der Aminosäuren im Peptid liegt zwischen
5 und 20.
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Das
mit dem auf dem Substrat immobilisierten Peptid gebundene Targetprotein
wird durch ein Verfahren gemessen, bei dem das zu immobilisierende
Peptid mit (einer) Markierung(en) markiert wird, dessen/deren Signal
sich nach der Bindung des Peptids mit dem Targetprotein verändert/verändern, und
das Targetprotein wird basierend auf der Veränderung der Markierung(en)
gemessen.
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Das
in der vorliegenden Erfindung verwendete Peptid wird mit (einer)
Markierung(en) markiert, die das Signal nach der Bindung des Peptids
mit dem Targetprotein verändert/verändern, wie
in den im Anhang befindlichen Ansprüchen definiert wird.
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Beispiele
fluoreszierender Markierungen umfassen Fluorescein und Derivate
davon mit der Fluorescein-Struktur, wie z. B. Carboxyfluorescein;
die Dansyl-Gruppe und Derivate davon mit der Struktur der Dansyl-Gruppe,
wie z. B. die Ethyldansyl-Gruppe; Cumarin-Derivate; Pyren-Derivate;
sowie Naphthalin-Derivate, die fluoreszierenden Markierungen sind
jedoch nicht darauf beschränkt.
Diese fluoreszierenden Markierungsreagenzien sind per se bekannt,
und viele von ihnen sind im Handel erhältlich. Weiters sind die Verfahren
zur Markierung einer Aminosäure
durch Bindung eines im Handel erhältlichen fluoreszierenden Farbstoffs
mit (einer) funktionellen Gruppe(n) in der Aminosäure, wie
z. B. einer Aminogruppe, per se bekannt. Die Markierung kann z.
B. leicht durch Bindung der Markierung an die Seitenkette von Lysin,
Glutaminsäure
oder Cystein oder an den Aminoterminus oder den Carboxylterminus
des Peptids eingeführt
werden, und zwar durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren.
Da verschiedene fluoreszenzmarkierte Bausteine, die für die Synthese
verwendet werden, im Handel bei Molecular Probe, U. S., etc. erhältlich sind,
können
diese im Handel erhältlichen Bausteine
so, wie sie sind, verwendet werden.
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Als
bevorzugte Beispiele fluoreszierender Markierungen werden die chemischen
Strukturen von Tetramethylrhodamin und Carboxyfluorescein in den
unten stehenden Formeln [I] bzw. [II] dargestellt.
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Die
von den oben stehend beschriebenen Markierungen emittierten Signale
verändern
sich nach der Bindung des Peptids mit dem Targetprotein. Obwohl
das Signal sogar in jenen Fällen,
in denen eine einzige Markierung an das Peptid gebunden ist, verändert wird,
so wird es bevorzugt, wenn eine Vielzahl verschiedener Markierungen
an verschiedene Stellen im Peptid gebunden wird, da die Veränderung
der Signale empfindlicher detektiert werden kann und dadurch die
Detektionsempfindlichkeit weiter gefördert werden kann. In dem besonders
bevorzugten Modus sind zwei Arten fluoreszierender Pigmente, deren
Fluoreszenz-Wellenlängen sich
voneinander unterscheiden, an verschiedene Stellen im Peptid gebunden.
Dadurch kann eine empfindliche Detektion unter Verwendung des Fluoreszenzresonanz-Energietransfer(FRET-)Systems
erzielt werden. Beispiele der Kombinationen der fluoreszierenden
Markierungen, die zum Erzielen des FREI bevorzugt werden, umfassen
Kombinationen eines Fluorescein-Derivats und eines Rhodamin-Derivats;
eines Dansyl-Derivats
und eines Fluorescein-Derivats; sowie eines Pyren-Derivats und eines
Fluorescein-Derivats, die Kombinationen sind jedoch nicht darauf
beschränkt.
Beispiele der Kombinationen der fluoreszierenden Markierungen, die
für das
fluoreszenzquenchende System unter Verwendung desselben Mechanismus
wie FREI bevorzugt werden, umfassen Kombinationen eines Dansyl-Derivats
und eines Dabsyl-Derivats; sowie eines Pyren-Derivats und eines
Nitrobenzol-Derivats, die Kombinationen sind jedoch nicht darauf
beschränkt.
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Die
Stelle(n), an der/denen die Markierung(en) gebunden ist/sind, ist/sind
vorzugsweise eine oder beide Termini des Peptids. Es wird eine Bindung
verschiedener Markierungen, vorzugsweise zwei Typen fluoreszierender
Markierungen, deren Fluoreszienz-Wellenlängen sich voneinander unterscheiden,
an beide End-Regionen des Peptids bevorzugt.
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Es
wird ebenfalls die Verwendung eines Peptids bevorzugt, von dem ein
Ende Cystein zur Bindung des Peptids an das Substrat ist.
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Daher
werden als Beispiele bevorzugter Peptide jene mit den Strukturen,
die in 2 angeführt
werden, als Beispiele aufgezählt.
In 2 bezeichnen A und B Aminosäurereste, deren Seitenketten
mit den fluoreszierenden Markierungen gebunden sind. In diesen Fällen ist
jede der Peptidketten durch die Sulfhydrylgruppe in der Seitenkette
des Cys-Rests an das Substrat gebunden.
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Unter
den in 2 angeführten
Peptiden sind bevorzugte Beispiele jene, in denen B ein Lys-Rest
ist, dessen ε-Position
mit Tetramethylrhodamin gebunden ist, und A ein Lys-Rest ist, dessen ε-Position
mit Fluorescein gebunden ist. Durch Anwendung solch einer Struktur
ist das Peptid ein markiertes Peptid mit zwei Arten verschiedener
fluoreszierender Gruppen an beiden Termini, und es kann eine Messung
unter Verwendung von FREI erzielt werden. Es ist anzumerken, dass
die Aminosäurereste
A und B nicht auf Lys beschränkt
sind, sondern dass beliebige Verbindungen mit funktionellen Gruppen
verwendet werden können,
die relativ hochgradig reaktiv sind, so können z. B. Orn (Ornithin),
Glu (Glutaminsäure)
und Cystein verwendet werden. Durch Einführung von Gruppen zur Markierung
unter Verwendung der hochgradig reaktiven funktionellen Gruppen können Bausteine
hergestellt werden. In Fällen,
in denen ähnliche
reaktive funktionelle Gruppen in Seitenketten nicht im Peptid mit
der erwarteten Raumstruktur existieren, können die Markierungsgruppen
ortsspezifisch nach der Synthese des Peptids (Anordnung von Aminosäureresten)
eingeführt
werden. Diese Syntheseverfahren sind auf dem Gebiet der Peptidsynthese-Chemie
wohlbekannt. Eine der funktionellen Gruppen in jeder Kombination,
angeführt
unten stehend in Tabelle 1, kann verwendet werden, daher ist die
Aminosäure
nicht auf Cys beschränkt.
Daher kann das Peptid ortsspezifisch immobilisiert werden, falls ähnliche
reaktive funktionelle Gruppen in den Seitenketten in dem Peptid
mit der erwarteten Raumstruktur nicht existieren. Der Rest, wie
z. B. Cys, der zur Immobilisierung verwendet wird, kann nach dem
C-Terminal angeordnet werden (nach B in der oben angeführten Zeichnung).
D. h. es kann unter den zwei in 2 angeführten Strukturen
die Struktur verwendet werden, die in der unteren Position zu sehen
ist. In 2 ist der Abschnitt, der als „Peptidkette mit
der erwarteten Raumstruktur" bezeichnet
ist, die oben genannte Kernregion.
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Die
Peptide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind
jene, die chemisch synthetisiert wurden. Durch die Verwendung eines
chemisch synthetisierten Peptids kann das Peptid synthetisiert werden, während die
funktionellen Gruppen in den Seitenketten der Aminosäuren geschützt werden,
und das synthetisierte Peptid kann ortsspezifisch an das Substrat
gebunden werden. In jenen Fällen,
in denen das zu immobilisierende Peptid ein geschütztes Peptid
ist, wird es nach der Immobilisierung des Peptids entschützt. Es
ist auch möglich,
ein freies (ungeschütztes)
Peptid zu immobilisieren. Durch Anordnung des Cys-Rests am Terminus
oder durch An ordnung von entweder Avidin oder Biotin kann z. B.
eine ortsspezifische Bindung leicht erzielt werden, sogar wenn das
Peptid ungeschützt
ist (siehe unten stehende Tabelle 1). Dadurch kann das Peptid an
einer vorgeschriebenen Stelle an das Substrat gebunden werden, und
die Beladungsmenge des wirksamen Peptids (d. h. des Peptids, das
die erwartete Raumstruktur aufweisen kann) kann beliebig gesteuert werden.
Die geschützten
funktionellen Gruppen werden normalerweise entschützt, nachdem
das Peptid an das Substrat gebunden ist. Daher kann die Bindung
des Peptids an das Substrat an einer Stelle, mit der die erwartete
Raumstruktur nicht erzielt werden kann, wenn es auf das Protein
trifft, das mit dem Peptid in Wechselwirkung steht, mit Sicherheit
verhindert werden. Weiters kann das Peptid durch chemische Synthese
des Peptids leicht gereinigt und getestet werden, so dass die Beladungsmenge
auf das Substrat mit Sicherheit gesteuert werden kann. Ebenso können die
oben stehend beschriebenen funktionellen Molekülgruppen oder die Markierungen
leicht in die Aminosäuren
eingeführt
werden und dann wiederum leicht an das Peptid gebunden werden. Weiters
ist anzumerken, dass in Fällen,
in denen die Verwendung einer Aminosäure bevorzugt wird, die nicht
natürlich
auftritt, solch eine Aminosäure
leicht in das Peptid eingeführt
werden kann. Daher können die
Peptide, in denen alle oder ein Teil der Aminosäurereste, welche die Peptidkette
darstellen, D-Aminosäuren sind,
die nicht natürlich
auftreten, und die Peptide mit anderen funktionellen Gruppen als
Aminosäuren,
wie z. B. Häm-,
Flavin- und Alkylketten und dergleichen, ebenfalls als das zu immobilisierende
Peptid verwendet werden, so dass die Flexibilität der Messung in großem Ausmaß erhöht wird.
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Die
chemische Synthese des Peptids per se kann unter Verwendung wohlbekannter
Verfahren durchgeführt
werden und kann leicht unter Verwendung eines im Handel erhältlichen
Peptid-Synthesegeräts
durchgeführt
werden. In diesem Fall wird es bevorzugt, die Synthese durchzuführen, während die
funktionellen Gruppen der Aminosäuren
geschützt
sind. Die Verfahren zum Schützen
der funktionellen Gruppen in den Seitenketten von Aminosäuren sind
per se wohlbekannt und werden z. B. in Kiyoshi Nokihara, Highly
Efficient Peptide Synthesis: Simultaneous and Automatic Synthesis
of Multiple Peptides and Peptide Library, Journal of Synthetic Organic
Chemistry Japan 52, 347–358
(1994); Kiyoshi Nokihara und Yoshio Yokomizo, Cleaving Off of Synthetic
Peptides by Fmoc-tBu Strategy, Shimadzu Review 52, 1–8 (1995);
Kiyoshi Nokihara, Reagents for Highly Efficient Solid Phase Synthesis
of Peptides, Shimadzu Review 50, 13–24 (1993); Kiyoshi Nokihara,
Fundamental of Peptide Chemical Synthesis, Shimadzu Review 50, 3–12 (1993);
Kiyoshi Nokihara, Rintaro Yamamoto, Hajime Hazama, Shin Nakamura,
Development of Practical Simultaneous Multiple Solid Phase Peptide Synthesizer
PSSM-8, Shimadzu Review 50, 33–43
(1993); sowie K. Nokihara, R. Yamamoto, M. Hazama, O. Wakizawa,
S. Nakamura und M. Yamaguchi, Development and Applications of a
Novel and Practical Simultaneous Multiple Solid Phase Peptide Synthesizer,
Peptide Chemistry 1991, 203–208,
A. Suzuki (Hrsg.), Protein Research Foundation, Osaka (1992); W.
C. Chan, P. D. White, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical
Approach, 41–76,
Oxford University Press, New York (2000), beschrieben.
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Das
chemisch synthetisierte Peptid wird anschließend auf dem Substrat immobilisiert.
Dies kann vorzugsweise durch Umsetzen der Aminogruppe, Carboxylgruppe
oder dergleichen des Peptids mit der Aminogruppe, Carboxylgruppe
oder dergleichen auf dem Substrat erzielt werden, wodurch das Peptid
mittels kovalenter Bindung an das Substrat gebunden wird. Alternativ
dazu wird Biotin oder Avidin an das Peptid gebunden (dies kann durch
die funktionelle Gruppe in der Seitenkette einer gewünschten
Aminosäure
durch ein herkömmliches
Verfahren durchgeführt
werden), und das Biotin oder Avidin kann an das auf dem Substrat
fixierte Avidin oder Biotin gebunden werden. Beispiele der Kombination
der funktionellen Gruppe (oder Substanz) und der funktionellen Gruppe
(oder Substanz) auf dem Peptid sind in Tabelle 1 angeführt. Die
Verfahren zur Immobilisierung des Peptids auf dem Substrat durch
die Reaktion zwischen den funktionellen Gruppen (oder Substanzen),
angeführt
in Tabelle 1, sind per se wohlbekannt. Die Verfahren zur Herstellung
des Substrats mit den funktionellen Gruppen (oder Substanzen), angeführt in Tabelle
1, sind ebenso wohlbekannt, und solche Substrate sind im Handel
erhältlich.
Die im Handel erhältlichen
Substrate können
bevorzugt verwendet werden. Tabelle 1
| Substrat | Peptid | Reagens
zur Immobilisierung |
| Aminogruppe | Aminogruppe | Glutaraldehyd |
| Aminogruppe | Carboxylgruppe | Carbodiimid |
| Carboxylgruppe | Aminogruppe | Carbodiimid |
| Sulfhydrylgruppe | Bromacetylgruppe | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Bromacetylgruppe | Sulfhydrylgruppe | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Biotin | Avidin | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Avidin | Biotin | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Sulfhydrylgruppe | Sulfhydrylgruppe | Oxidation
(unter alkalischem pH) |
| Aldehydgruppe | Aminogruppe | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Aminogruppe | Aldehydgruppe | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Aldehydgruppe | Hydroxylaminogruppe | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Hydroxyaminogruppe | Aldehydgruppe | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Aldehydgruppe | Hydrazingruppe | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Hydrazingruppe | Aldehydgruppe | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Aldehydgruppe | Sulfhydrylgruppe | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Sulfhydrylgruppe | Aldehydgruppe | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Aktive
Estergruppe | Aminogruppe | Reagiert
spontan beim Mischen |
| Aminogruppe | Aktive
Estergruppe | Reagiert
spontan beim Mischen |
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Die
Menge eines jeden auf dem Substrat zu immobilisierenden Peptids
ist überhaupt
nicht eingeschränkt
und kann in geeignetem Ausmaß in
Abhängigkeit
von der Konzentration des Targetproteins in der Testprobe, der Reaktivität zwischen
dem Peptid und dem Targetprotein und dergleichen selektiert werden.
Sie beträgt
z. B. etwa 1 fmol (1 Femtomol) bis 1000 nmol, vorzugsweise etwa
0,01 pmol bis 1000 pmol.
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Die
Bindung des Peptids an das Substrat kann auch durch physikalische
Adsorption durchgeführt
werden. In diesem Fall kann die Immobilisierung des Peptids durch
Kontaktieren einer Lösung
des Peptids in einem Puffer mit dem Substrat erzielt werden. In
diesem Fall kann die Immobilisierungsreaktion z. B. bei Raumtemperatur
für eine
Zeitspanne von etwa 15 Minuten bis 2 Stunden durchgeführt werden
oder bei 4°C über Nacht,
wie in den herkömmlichen
Verfahren. Die Konzentration der Peptidlösung, die für die Immobilisierung verwendet
wird, kann auf geeignete Art und Weise in Abhängigkeit von der Art des Peptids
und der Art und der Konzentration der in der Testprobe zu messenden
Substanz ausgewählt
werden. Sie kann z. B. etwa 1 ng/ml bis 100 μg/ml betragen.
-
Nach
der Bindung des Peptids an das Substrat werden die funktionellen
Gruppen der Seitenketten der Aminosäuren entschützt. Die Verfahren zum Entschützen sind
ebenfalls wohlbekannt und werden z. B. in Kiyoshi Nokihara, Highly
Efficient Peptide Synthesis: Simultaneous and Automatic Synthesis
of Multiple Peptides and Peptide Library, Journal of Synthetic Organic
Chemistry Japan 52, 347–358
(1994); Kiyoshi Nokihara und Yoshio Yokomizo, Cleaving Off of Synthetic
Peptides by Fmoc-tBu Strategy, Shimadzu Review 52, 1–8 (1995); Kiyoshi
Nokihara, Rintaro Yamamoto, Hajime Hazama, Shin Nakamura, Development
of Practical Simultaneous Multiple Solid Phase Peptide Synthesizer
PSSM-8, Shimadzu Review 50, 33–43
(1993); sowie K. Nokihara, R. Yamamoto, M. Hazama, O. Wakizawa,
S. Nakamura und M. Yamaguchi, Development and Applications of a
Novel and Practical Simultaneous Multiple Solid Phase Peptide Synthesizer,
Peptide Chemistry 1991, 203–208,
A. Suzuki (Hrsg.), Protein Research Foundation, Osaka (1992); W.
C. Chan, P. D. White, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical
Approach, 41–76,
Oxford University Press, New York (2000), beschrieben. Allgemein
können
die in der Festphasensynthese verwendeten Verfahren zur Spaltung
(die Verfahren zur Spaltung von Peptiden von einem Harz sowie zur
gleichzeitigen Entschützung
von Seitenketten) so verwendet werden, wie sie sind. Unter den Reaktionsbedingungen
zur Durchführung
der Spaltung wird das auf dem Substrat immobilisierte Peptid nicht
vom Substrat gespalten.
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In
dem peptidimmobilisierten Substrat wird es bevorzugt, eine Vielzahl
an Peptidarten auf einem einzelnen Substrat an spezifizierten Regionen
zu immobilisieren. Dadurch kann eine Vielzahl an Targetproteinen gleichzeitig
gemessen werden. Die Anzahl der Peptidarten ist nicht eingeschränkt, und
normalerweise wird es bevorzugt, 100 bis 10.000 Arten, noch bevorzugter
etwa 1000 bis 3000 Arten, an Peptiden auf einem einzelnen Substrat
zu immobilisieren. Als Substrat kann ohne Einschränkung ein
beliebiges Substrat, das die chemisch synthetisierten Peptide binden
kann, verwendet werden, und es können
auch Glassubstrate, wie z. B. Objektträger-Glas, ver wendet werden,
wie bei den herkömmlichen
DNA-Chips. Substrate mit kleinen Vertiefungen oder Rillen können verwendet
werden, Mikroplatten-Wells können
auch als Substrate verwendet werden. In jenen Fällen, in denen die Wells einer
Mikroplatte als Substrate verwendet werden, stellt die innere Wand
eines jeden Wells das peptidimmobilisierte Substrat dar. In Fällen, in
denen die Peptide mittels physikalischer Adsorption immobilisiert
werden, wird die Verwendung von Wells einer Mikroplatte, oder von
Rillen oder Vertiefungen, die in einem Chip, wie z. B. Objektträgerglas,
gebildet werden, als Substrat bevorzugt, so dass die Peptidlösung gegossen
werden kann. Durch die Verwendung einer Vertiefung als Substrat
bei der Immobilisierung der Peptide mittels physikalischer Adsorption
kann die Messung problemlos durchgeführt werden, sogar wenn ein
Teil der Peptide während
der Reaktion mit den Targetproteinen in die Lösung eluiert wird.
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Das
peptidimmobilisierte Substrat kann zur Messung des/der Targetproteins/Targetproteine
verwendet werde. Der Ausdruck „Messung" umfasst hierin sowohl
die Detektion als auch die Quantifizierung.
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Die
Messung des/der Targetproteins/Targetproteine kann durch Hinzufügen einer
Probe, die das/die Targetprotein(e) enthalten kann, auf das peptidimmobilisierte
Substrat, Ermöglichen
der Reaktion, anschließendes
Waschen des Chips sowie durch Messen des Signals durchgeführt werden.
Die Reaktion mit der Probe kann normalerweise bei 4°C bis 40°C für eine Zeitspanne
von etwa 1 Minute bis 3 Stunden durchgeführt werden, vorzugsweise bei
Raumtemperatur für
etwa 1 Minute bis 15 Minuten, die Reaktionsbedingungen sind jedoch
nicht darauf beschränkt.
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Bei
der Probe gibt es überhaupt
keine Einschränkungen.
Beispiele der Probe umfassen Homogenste von Tierzellen, Pflanzenzellen,
bakteriellen Zellen und Viren sowie Fraktionen davon; Körperflüssigkeiten,
wie z. B. Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Gewebeflüssigkeit
und Rückenmarksflüssigkeit;
sowie verschiedene Nahrungsmittel und Getränke, die Proben sind jedoch
nicht darauf beschränkt.
-
Unter
Verwendung des peptidimmobilisierten Substrats kann/können das/die
Targetprotein(e) genau und einfach gemessen werden.
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Das
peptidimmobilisierte Substrat kann nicht nur zur Messung des/der
gewünschten
Targetproteins/Targetproteine verwendet werden, sondern auch für das Screening
von unbekanntem/unbekannten Targetprotein(en). D. h. die Anzahl
der Typen der Basal-Oligopeptide, welche die spezifischen Raumstrukturen
aufweisen können,
wird mit etwa 10 angenommen. Basierend auf diesen Oligopeptiden
wird die Anzahl der Basal-Peptide mit etwa 3000 angenommen, wenn
die Kombinationen der Größen, Aziditäten, Basizitäten, Aromatizitäten, Aliphatizitäten und
dergleichen berücksichtigt
werden. Daher werden nach der chemischen Synthese dieser 3000 Arten
an Peptiden und der Herstellung des peptidimmobilisierten Substrats
gemäß der vorliegenden
Erfindung unter Verwendung der Peptide verschiedene Proteine mit
dem Substrat umgesetzt. Dadurch kann untersucht werden, welches
Protein mit welchem Peptid mit welcher Raumstruktur reagiert. Durch Sammeln
der Ergebnisse zur Erstellung einer Datenbank kann eine große Anzahl
an Proteinen gemessen werden, was einen großen Beitrag zur Diagnose verschiedener
Erkrankungen und zur Entwicklung neuer Arzneimittel darstellt. In
Anbetracht der Verschiedenheit aufgrund der Inkorporierung nicht
natürlich
auftretender Aminosäuren übersteigt
die Anzahl der Arten an Oligopeptiden 1.000.000. Durch diese zahlreichen
Peptide kann die Art der Erkennung ausführlicher klassifiziert werden,
so dass angenommen wird, die Genauigkeit der Diagnose würde gefördert werden,
wenn das Substrat zur Diagnose verwendet wird.
-
Durch
die Durchführung
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung auf einer Vielzahl chemisch
synthetisierter Peptide, das Umwandeln des gemessenen Werts für jedes
Peptid in Daten, mit denen Unterschiede zwischen gemessenen Werten
mit bloßem
Auge erkannt werden können,
sowie das schlussendliche Darstellen sichtbarer Daten der Peptide
in einer Anordnung kann/können
das/die Protein(e) in der Testprobe leicht und einfach gemessen
werden und das/die in einer unbekannten Probe enthaltene(n) Protein(e)
identifiziert oder beschrieben werden.
-
Bevorzugte
Beispiele der Daten, die mit bloßem Auge erkannt werden, umfassen
physikalische Werte, welche die Farbe betreffen, wie z. B. Farbe,
Helligkeit und/oder Chromatizität,
und es wird bevorzugt, dass der Farbunterschied in Abhängigkeit
des für
jedes Peptid gemessenen Werts mit bloßem Auge erkannt werden kann.
Dadurch können
die gemessenen Werte mit bloßem
Auge unterschieden werden und werden anschließend in einer Anordnung dargestellt.
Dadurch bilden die für
die Peptide gemessenen Werte ein farbiges Muster. Durch eine Erhöhung der
Anzahl der chemisch synthetisierten Peptide wird dieses Farbmuster
für jede Testprobe
einzigartig, so dass es als Fingerabdruck dient (das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung, bei dem die gemessenen Werte in Daten umgewandelt werden,
die mit bloßem
Auge erkannt werden können, kann
als Gründen
der Einfachheit als „Fingerprint-Verfahren" bezeichnet werden).
-
Die
Umwandlung der Unterschiede verschiedener Werte in sichtbare Daten
kann unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Computer-Software-Programms
leicht durchgeführt
werden. D. h. es sind im Handel Datenverarbeitungs-Software-Programme
erhältlich,
die eine Sichtbarmachung der Unterschiede zwischen Werten ermöglichen.
Ein Beispiel dafür
ist Igor Pro Ver. 4.04 (im Handel bei WaveMetrics, Inc., erhältlich).
Durch die Verwendung solch eines Datenverarbeitungs-Software-Programms,
z. B. durch Eingabe der Veränderungsrate
der Fluoreszenzintensitäten
vor und nach der Reaktion mit den immobilisierten, chemisch synthetisierten
Peptiden als gemessene Werte in die Software, ist die Darstellung
von Farben möglich,
so dass z. B. gesagt werden kann, dass je größer die Veränderungsrate ist, desto gelblicher
die Farbe ist (diese Farbe kann in der Software ausgewählt werden).
Weiters werden die Farben, die den gemessenen Werten entsprechen,
in einer Anordnung dargestellt. Daher wird für jede Testprobe ein gefärbtes Streifenmuster
gebildet. Da das gefärbte
Streifenmuster in Abhängigkeit
von der Art und der Menge des in der Testprobe enthaltenen Proteins
einzigartig ist, kann es als Fingerabdruck verwendet werden, der
die Identifikation und Charakterisierung (Beurteilung der Merkmale
oder Eigenschaften, Identifikation oder Abschätzung des Gehalts) des in einer
unbekannten Probe enthaltenen Proteins ermöglicht.
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Bei
diesem Verfahren kann eine Vielzahl an Targetproteinen in der Testprobe
enthalten sein. Sogar wenn eine Vielzahl an Targetproteinen enthalten
ist, da ein einzigartiges farbiges Muster in Abhängigkeit von den Arten und
Mengen der Targetproteine dargestellt wird, kann es als Fingerabdruck
der Probe verwendet werden. In diesem Fall wird die Immobilisierung
der chemisch synthetisierten Peptide, die mit jedem der Targetproteine
eine Bindung eingehen, auf dem Substrat bevorzugt. Sogar wenn es
keine chemisch synthetisierten Peptide gibt, die mit einem oder
mehreren der Vielzahl an Targetproteinen eine Bindung eingehen,
wird dennoch ein farbiges Streifenmuster gebildet, das diem entspricht,
so dass das Fehlen der chemisch synthetisierten Peptide, die an
ein oder mehrere Targetprotein(e) binden, nicht notwendigerweise
problematisch ist.
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Beim
Fingerprint-Verfahren können
auch jene chemisch synthetisierten Peptide auf dem Substrat immobilisiert
werden, die Möglichkeiten
besitzen, mit dem/den Targetprotein(en) eine Bindung einzugehen
(d. h. die ebenfalls Möglichkeiten
besitzen, nicht an das/die Targetprotein(e) zu binden). Wie in den
unten stehenden Beispielen beschrieben wird, können z. B. chemisch synthetisierte
Peptide, von denen jede eine Zufallsregion darin aufweist, immobilisiert
werden. In solch einem Fall ist unbekannt, welches Peptid eine Bindung
mit welchem Targetprotein eingeht. Da jedoch in Abhängigkeit
von der/den Art(en) und Menge(n) des/der Targetproteins/Targetproteine
ein einzigartig gefärbtes
Muster dargestellt wird, kann es als Fingerabdruck der Probe verwendet
werden.
-
Durch
die Durchführung
von Messungen durch das Fingerprint-Verfahren unter Verwendung desselben
Substrats, auf dem chemisch synthetisierte Peptide immobilisiert
sind, das Sammeln der gemessenen Werte zur Erstellung einer Datenbank
und durch Vergleichen der gemessenen Daten einer unbekannten Probe mit
den gemessenen Daten, die in der Datenbank gesammelt wurden, können unbekannte
Testproben identifiziert oder charakterisiert werden.
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Da
das Fingerprint-Verfahren auch eine der Arten des Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung ist, welches das oben stehend beschriebene, peptidimmobilisierte Substrat
verwendet, sind die oben stehend beschriebenen Erklärungen über die
chemisch synthetisierten Peptide, ihre Markierungen, Bindungsverfahren,
Testproben und Reaktionsbedingungen auf das Fingerprint-Verfahren
anwendbar.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen ausführlicher
beschrieben. Es ist jedoch anzumerken, dass die vorliegende Erfindung
nicht auf die unten stehenden Beispiele beschränkt ist.
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Beispiel 1
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Wie
in 3 schematisch dargestellt, wurde Calmodulin unter
Verwendung eines Peptidchips gemessen, bei dem Peptide mit einer α-Helix-Struktur,
von denen jeder der beiden Termini mit unterschiedlichen fluoreszierenden
Markierungen markiert wurde, auf einem Substrat immobilisiert wurden.
Die Verfahren wurden folgendermaßen durchgeführt:
Die
Sequenz der Kernregion der Peptide, die eine α-Helix-Struktur bildet, wurde
mittels molekularer Modellierung unter Verwendung eines Computers
(Molekülmodellierung
unter Verwendung von Insight II/Discover, Molecular Simulation,
U. S.) basierend auf der Aminosäuresequenz
des in einem Verweis (K. T. O'Neil
und W. F. De-Grado,
Trend Biochem. Sci. 15, 59–64
(1990)) beschriebenen Peptids kreiert. Als Resultat wurde die Aminosäuresequenz
Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu als Aminosäuresequenz
der Kernregion verwendet. Zu dieser Sequenz wurden ein Cys-Rest
als Anker zur Immobilisierung und Glu(Rf1), Lys(Rf2) und Lys(Rf3)
als Reste, die mit fluoreszierenden Markierungen markiert sind,
hinzugefügt,
um Cys-Glu(Rf1)-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys(Rf2)-NH2, Glu(Rf1)-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys(Rf2)-Cys-NH2 und Lys(Rf3)-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Cys-NH2 zu synthetisieren. Rf1, Rf2 und Rf3 waren
fluoreszierende Gruppen, d. h. eine Ethyldansyl-Gruppe, eine Dabsyl-Gruppe
bzw. eine Carboxyfluorescein-Gruppe. Fluoreszierende Aminosäure-Derivate,
in denen die fluoreszierenden Gruppen (A und B in 3)
in die Seitenketten von Glutaminsäure und Lysin eingeführt wurden,
wurden synthetisiert und als Bausteine verwendet. Die Carbonsäure, an
die eine Dabsylgruppe gebunden war, wurde unter Verwendung von Diisopropylcarbodiimid
in aktiviertes N-Hydroxysuccinimid-Ester-Derivat überführt. Die
Aminogruppe in der Seitenkette von Fmoc-Lys-OH (Produkt-Nr. 04-12-1042,
Novabiochem, Schweiz) sowie der oben stehend beschriebene aktivierte
Ester wurden über
Nacht bei Raumtemperatur in Dimethylformamid gemäß einem herkömmlichen
Verfahren gerührt.
Danach wurde das Reaktionsgemisch eingeengt und mit Ether präzipitiert,
um Fmoc-Lys(Rf2)-OH zu erhalten, markiert mit einer fluoreszierenden
Markierung (B in 3). Ausbeute: 80%. (Fmoc: Fluorenylmethyloxycarbonyl.)
Weiters wurde fluoreszierendes Aminosäure-Fmoc-Glu(Rf1)-OH, erhalten
durch Einführung
einer fluoreszierenden Gruppe (A in 3, Ethyldansylgruppe)
in die Seitenkette von Glutaminsäure-Fmoc-Glu-OBut
(tert-Butylester) (Produkt-Nr. 04-12-1075, Novabiochem, Schweiz),
synthetisiert. D. h. die Carbonsäure
in der Seitenkette von Fmoc-Glu-OBut
und Ethyldansyl wurden mittels wasserlöslichem Carbodiimid in Dioxan-Wasser (3:1) kondensiert,
und tert-Butylester wurde mittels Trifluoressigsäure entfernt, wodurch Fmoc-Glutaminethyldansyl
synthetisiert wurde. Ausbeute 60%. Weiters wurde Carboxyfluorescein
unter Verwendung von Diisopropylcarbodiimid in aktiviertes N-Hydroxysuccinimid-Ester-Derivat überführt. Die
Aminogruppe in der Seitenkette von Fmoc-Lys-OH (Produkt-Nr. 04-12-1042,
Novabiochem, Schweiz) sowie der oben stehend beschriebene aktivierte
Ester wurden über
Nacht bei Raumtemperatur in Dimethylformamid gemäß einem herkömmlichen
Verfahren gerührt.
Danach wurde das Reaktionsgemisch eingeengt und mit Ether präzipitiert,
um Fmoc-Lys(Rf3)-OH zu erhalten, markiert mit einer fluoreszierenden
Markierung. Ausbeute: 85%.
-
Unter
Verwendung dieser Produkte als Bausteine wurden die mit den Markierungen
A und B in der Zeichnung markierten Peptide in Mengen von jeweils
15 μmol
synthetisiert, und zwar durch die Festphasen-Peptidsynthese gemäß dem wohlbekannten
Fmoc-Verfahren. D. h. unter Verwendung von TentaGel SRAM, Produkt-Nr.
S30-023 (Rink-Amid-Harz mit Polyethylenglycolkette) von Rapp Polymere,
Deutschland, als festem Träger
wurden Fmoc-Aminosäure-Derivate
sequentiell kondensiert. Dies wurde unter Verwendung des im
Japanischen Patent Nr. 2007165 mit
dem Titel Multiple Simultaneous Chemical Reaction Apparatus beschriebenen
Verfahrens sowie unter Verwendung des Multiple Simultaneous Peptide
Synthesizer Model PSSM-8, im Handel bei Shimadzu Corporation erhältlich,
durchgeführt.
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Das
Substrat wurde durch Bromacetylierung eines Aminopropylglases (Produkt-Nr.
2550, Corning, U. S.) erhalten. D. h. Bromessigsäure wurde in Dimethylformamid
aufgelöst
und wasserlöslichliches
Carbodiimid (1,05 Äquivalente)
wurde dazu unter Rühren
hinzugefügt,
während
das Gemisch auf Eis gekühlt
wurde. Zwanzig Minuten später
wurde eine Aminopropyl-Glasplatte darin eingetaucht, und das Gemisch
wurde durch leichtes Schütteln
des gesamten Gemisches bei Raumtemperatur für eine Zeitspanne von 2 Stunden
gerührt.
Anschließend
wurde die Glasplatte entfernt und mit 50 % wässriger Dimethylformamidlösung und
Tetrahydrofuran gewaschen, gefolgt vom Trocknen bei reduziertem
Druck in einem Exsikkator.
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Jedes
der synthetischen Peptide (Konzentration 0,1 bis 10 μM) wurde
immobilisiert, indem es mit den Bromgruppen auf dem Substrat bei
Raumtemperatur für
eine Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt wurde. Mit dem System,
in dem die Kombination von Ethyldansyl-Dabsyl-Gruppen verwendet
wurde, wurde die Messung der Fluoreszenz unter Verwendung einer
Anregungs-Wellenlänge
von 340 nm und einer Detektionswellenlänge von 480 nm durchgeführt. Durch
Hinzufügen
einer Calmodulin-Lösung (Tris-Puffer,
pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2, Calmodulinkonzentration:
1,0 μM)
wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzplatten-Lesegeräts eine
etwa fünffache
Erhöhung
der Fluoreszenzintensität
gemessen. Daher konnte das Protein detektiert und quantifiziert
werden. Mit dem System unter Verwendung des Peptids, das Carboxylfluorescein enthielt,
wurde die Messung der Fluoreszenz unter Verwendung einer Anregungs-Wellenlänge von
490 nm und einer Detektionswellenlänge von 520 nm durchgeführt. In
Gegenwart des Proteins wurde eine etwa zehnfache Erhöhung der
Fluoreszenzintensität
gemessen, so dass das Protein detektiert und quantifiziert werden konnte.
Die Calmodulin-Lösung
und der Peptidchip wurden für
eine Zeitspanne von 5 Minuten bei 25°C umgesetzt.
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Beispiel 2
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Wie
in 4 schematisch dargestellt, wurde Amylase unter
Verwendung eines Peptidchips gemessen, bei dem ein Peptid, von dem
ein Terminus mit einer fluoreszierenden Markierung markiert war,
wobei das Peptid eine β-Schleifen-Struktur
aufweist, auf einem Substrat immobilisiert wurde. Die Verfahren
wurden folgendermaßen
durchgeführt:
Wie
in Beispiel 1, wie schematisch in 4 dargestellt,
wurde ein Peptid, das eine β-Schleifen-Struktur
bildet, durch molekulare Modellierung unter Verwendung eines Computers
basierend auf der Aminosäuresequenz des
in einem Verweis (F. J. Blanco et al., Eur. J. Biochem. 200, 345–351 (1991);
S. Ono et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1621–1623 (1998))
beschriebenen Peptids kreiert. Als Resultat wurde die Sequenz Tyr-Gin-Ser-Trp-Arg-Tyr-Ser-Gln-Ala
als Aminosäuresequenz
der Kernregion verwendet. Das Peptid mit dieser Sequenz, zu dem
ein Cys-Rest als Anker zur Immobilisierung zu einem Terminus hinzugefügt wurde
und zu dem ein Lys-Rest mit einer fluoreszierenden Gruppe Rf (fluoreszierende
Gruppe, wie z. B. Carboxyfluorescein in 4) zu einem
anderen Terminus hinzugefügt
wurde, wurde synthetisiert. Daher war die Sequenz Lys(Rf)-Tyr-Gin-Ser-Trp-Arg-Tyr-Ser-Gln-Ala-Cys-NH2. Wie in Beispiel 1 wurden die Peptide unter
Verwendung des fluoreszierenden Aminosäure-Derivats mit einer fluoreszierenden
Gruppe (wie z. B. Carboxyfluorescein) auf der Seitenkette der Aminosäure als
Baustein durch das Festphasen-Peptidsynthese-Verfahren unter Verwendung des Fmoc-Verfahrens
in einer Menge von etwa jeweils 15 μmol synthetisiert. Jedes Peptid
(Konzentration: 0,1 bis 10 μM)
in Tris-Puffer, pH 8,0, wurde auf der Platte durch eine Thioetherbindung
immobilisiert, wie in Beispiel 1 angeführt. Wurde eine Carboxyfluorescein-Gruppe
verwendet, so wurde die Fluoreszenzmessung unter Verwendung einer
Anregungs-Wellenlänge
von 490 nm und einer Detektionswellenlänge von 520 nm durchgeführt. Durch
Hinzufügen
einer Amyla se-Lösung
(Tris-Puffer, pH 7,4, 150 mM NaCl, Amylasekonzentration: 1,0 μM) wurde
eine etwa zehnfache Erhöhung
der Fluoreszenzintensität
gemessen, so dass die Amylase detektiert und quantifiziert werden
konnte. Die Amylase-Lösung
und der Peptidchip wurden für
eine Zeitspanne von 5 Minuten bei 25°C umgesetzt.
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Beispiel 3: Fingerprint-Verfahren
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Durch
das unten stehend ausführlich
beschriebene Verfahren wurden 126 Peptidarten mit den Sequenzen
Ac-Cys-Glu-Thr-Ile-Thr-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Thr-Tyr-Lys(F)-Lys-NH2 (worin „Ac" eine Acetylgruppe
darstellt und (F) eine fluoreszierende Markierung darstellt) synthetisiert,
und jedes der Peptide wurde auf einem Well in einer Mikroplatte
immobilisiert. Jedes der Peptide wurde mit 1) α-Amylase, 2) Rinderserum-Albumin
(BSA), 3) β-Glucosidase,
4) β-Galactosidase,
5) Lysozym, 6) Cellulase, 7) β-Lactoglobulin,
8) entfettetem Mandelpulver (Proteingemisch), 9) Gemisch aus 1)
bis 7) oder 10) Zelllysat aus E. coli umgesetzt, und die Fluoreszenzintensitäten vor
und nach der Reaktion wurden gemessen. Die Veränderungsrate der Fluoreszenzintensitäten wurde
in Igor Pro Ver. 4.04 eingegeben (im Handel bei Wave-Metrics, Inc., erhältlich),
und die den Werten entsprechenden Farben (je höher der Wert, desto stärker die
Gelbfärbung)
wurden schlussendlich in einer Anordnung dargestellt.
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Als
Resultat wurden gefärbte
Streifenmuster erhalten, die für
jede der Testproben charakteristisch waren. Die Peptidanzahl wurde
entlang der Abszisse gezählt,
so dass eine laterale Breite pro Peptid 1,5 mm ergab (daher betrug
die Gesamtbreite, die alle der 126 Peptide abdeckte, 1,5 × 126 =
189 mm) und die Länge für jedes
Peptid etwa 5 mm betrug, so dass die gesamte Fläche des Musters eine querformatiges
Rechteck ergab. Die Region für
jedes Peptid (Rechteck mit einer Breite von 1,5 mm und einer Länge von
5 mm) wurde mit einer Farbe bemalt, die der Veränderungsrate der Fluoreszenzintensität entspricht,
und die Regionen für jedes
Peptid sind daneben angeordnet, wodurch ein gefärbtes Streifenmuster ganz gebildet
wird.
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Die
konkreten Aminosäuresequenzen
der Region, die durch -Xaa-Xaa-Xaa-Xaa- in der oben stehend beschriebenen
Sequenz dargestellt sind, sind unten stehend in Tabelle 2 angeführt. Tabelle 2
| Peptid-Nr. | Sequenz | Peptid-Nr. | Sequenz | Peptid-Nr. | Sequenz | Peptid-Nr. | Sequenz |
| 1 | LHGE | 33 | YHRG | 65 | YWGP | 97 | GLRS |
| 2 | LPGE | 34 | RHWG | 66 | YLHP | 98 | GWRS |
| 3 | RPHE | 35 | SYWG | 67 | LRHP | 99 | REYS |
| 4 | YGLE | 36 | WEYG | 68 | HGLP | 100 | RLYS |
| 5 | WRLE | 37 | EHYG | 69 | LERP | 101 | GRYS |
| 6 | WYLE | 38 | ERYG | 70 | GLRP | 102 | HWYS |
| 7 | HOPE | 39 | LRYG | 71 | LYRP | 103 | GLEW |
| 8 | LHPE | 40 | ESYG | 72 | GESP | 104 | YHGW |
| 9 | HSPE | 41 | RGEH | 73 | ELSP | 105 | RLGW |
| 10 | YSPE | 42 | LYEH | 74 | ERSP | 106 | SLGW |
| 11 | YWPE | 43 | WRLH | 75 | LRSP | 107 | LEHW |
| 12 | LYPE | 44 | GWLH | 76 | GLYP | 108 | YRHW |
| 13 | LOSE | 45 | GRPH | 77 | SWYP | 109 | PSHW |
| 14 | WHSE | 46 | RSPH | 78 | PWER | 110 | EYHW |
| 15 | YHSE | 47 | LWPH | 79 | WEGR | 111 | YGLW |
| 16 | PWSE | 48 | LSRH | 80 | HLGR | 112 | EHRW |
| 17 | PHWE | 49 | LWSH | 81 | YHLR | 113 | PYRW |
| 18 | GPWE | 50 | LYSH | 82 | SGPR | 114 | LESW |
| 19 | PGYE | 51 | GEWH | 83 | WHPR | 115 | EYSW |
| 20 | RPYE | 52 | SGYH | 84 | WSPR | 116 | TPYW |
| 21 | SHEG | 53 | RYEL | 85 | WESR | 117 | RHEY |
| 22 | PREG | 54 | WPGL | 86 | HWSR | 118 | HPEY |
| 23 | WSEG | 55 | SGHL | 87 | SPYR | 119 | WLHY |
| 24 | SPHG | 56 | HSPL | 88 | GWVR | 120 | RPHY |
| 25 | WSHG | 57 | EHRL | 89 | GRES | 121 | SPHY |
| 26 | YSLG | 58 | HESL | 90 | PWGS | 122 | SRHY |
| 27 | WHPG | 59 | YPSL | 91 | PYGS | 123 | WSLY |
| 28 | YHPG | 60 | RWSL | 92 | RGHS | 124 | PWLY |
| 29 | WRPG | 61 | PEWL | 93 | WPLS | 125 | WERY |
| 30 | LSPG | 62 | PRWL | 94 | ERLS | 126 | RSWY |
| 31 | RYPG | 63 | GHYL | 95 | EYLS | | |
| 32 | LERG | 64 | RWYL | 96 | EHRS | | |
-
Ausführliche
Verfahren in Beispiel 3
-
Reagenzien und Vorrichtungen
-
Alle
Chemikalien und Lösungsmittel
waren analysenrein oder HPLC-rein und wurden ohne weitere Reinigung
verwendet. Dimethylformamid (DMF) als Lösungsmittel für die Peptidsynthese
wurde über
Nacht mit einem Molekularsieb mit 0,4 nm behandelt. Fmoc-geschützte Aminosäure-Derivate
wurden von Watanabe Chemical Co., Novabiochem oder Shimadzu Scientific
Research Inc. zugekauft. Der Seitenkettenschutz war Folgender:
Acetamidomethyl
(Acm) oder Triphenylmethyl (Trt) bei Cys;
t-Butyl (tBu) bei
Asp, Glu, Thr, Tyr, Ser; Trt bei Asn, Gln, His;
t-Butyloxycarbonyl
(Boc) oder 4-Methyltrityl (Mtt) bei Lys;
2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
(Pbf) bei Arg.
-
Peptide
wurden durch das Festphasen-Verfahren mittels Fmoc-Chemie synthetisiert.
-
Eine
HPLC wurde auf einem System durchgeführt, das aus einem Hitachi-D7500-Chromato-Integrator,
einem L7400-UV-VIS-Detektor unter Verwendung eines Wakosil 5C18
(4,6 × 150
mm) zur Analyse oder einem YMC ODS A323 (10 × 250 mm) zur Reinigung bestand,
oder auf einem Shimadzu-LC2010C-System unter Verwendung einer Cadenza-CD-C18-Säule (4,6 × 50 mm)
mit einem linearen Gradienten aus Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure (TFA)
bei einer Durchflussrate von 1,0 mlmin–1.
-
MALDI-TOF-MS
wurde auf einem Shimadzu-KOMPACT-MALDI-III-Massenspektrometer mit
3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure
(SA) oder α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA)
als Matrize durchgeführt.
Aminosäureanalysen
wurden unter Verwendung einer Wakopak-WS-PTC-Säule (4,0 × 200 mm, Wako Pure Chemical
Industries) nach einer Hydrolyse in 6 M HCl bei 110°C für eine Zeitspanne
von 24 Stunden in einem verschlossenen Röhrchen und Markierung durch
Phenylisocyanat (PITC) durchgeführt.
-
Synthese von Peptiden mit 15–23 Sequenzen
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Anordnung der Peptidkette:
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Die
Peptide wurden auf NovaSyn-TGR-Harz angeordnet (Novabiochem, 0,15
mmol/g). Fmoc-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Trp-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Ala-Cys(Acm)-Harz (Fmoc(15-23)Acm-Harz)
und Fmoc-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Trp-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Ala-Cys(Trt)-Harz (Fmoc(15-23)Trt-Harz)
und Fmoc-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Trp-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Ala-Lys(Mtt)-Harz (Fmoc(15-23)Mtt-Harz)
wurden auf einem Advanced-ChemTech-Model-348-MPS-Peptide-Synthesegerät synthetisiert.
Fmoc-Aminosäuren (6 Äqu.) (Äquivalent
kann hierin im Folgenden als „Äqu." bezeichnet werden), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat
(HBTU, 6 Äqu.),
HOBtH2O (6 Äqu.) und DIEA (12 Äqu.) in
NMP wurden zur Bindung von Aminosäuren (für eine Zeitspanne von 30 Minuten,
zwei Mal) verwendet, und 25 Piperidin in NMP wurde zur Fmoc-Entfernung
verwendet. DMF wurde als Lösungsmittel
für ein
anderes Verfahren, wie z. B. Waschschritte, verwendet.
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Peptide, die durch eine Fluorescein-Gruppierung
markiert sind, F(15-23)Acm und F(15-23)SH:
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Fmoc(15-23)Acm-Harz
oder Fmoc(15-23)Trt-Harz wurde mit 20 Vol.-% Piperidin/NMP behandelt,
um eine Fmoc-Gruppe zu entfernen. Anschließend wurde 5(6)-Carboxyfluorescein
(5(6)-FAM, Molecular Probes, Inc.) unter Verwendung von 5(6)-FAM (1,5 Äqu.), HBTU
(1,5 Äqu.),
HOBtH2O (1,5 Äqu.) und DIEA (3 Äqu.) in DMF
für eine
Zeitspanne von 1,5 h (× 2)
oder 2,5 h (× 1)
an den N-Terminus von Peptiden gebunden. Das Harz und die Schutzgruppen
außer
Acm wurden durch 1 h Behandlung mit TFA/m-Kresol/Ethandithiol/Thioanisol (40/1/3/3,
Vol./Vol.) bei Raumtemperatur entfernt. Die Peptide wurden durch
RP-HPLC gereinigt und durch MALDI-TOF-MS charakterisiert: F(15-23)Acm
m/z 1721,4 ([M+H]+ berechnet: 1721,8); F(15-23)SH
1649,4 (1649,7).
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Peptide, die durch eine Dansyl-Gruppierung
markiert sind, D(15-23)Acm und D(15-23)SH:
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Fmoc(15-23)Acm-Harz
oder Fmoc(15-23)Trt-Harz wurde mit 20 Vol.-% Piperidin/NMP behandelt,
um eine Fmoc-Gruppe zu entfernen. Eine Dansyl-Gruppierung wurde
in den N-Terminus der Peptide unter Verwendung von 5-Dimethylaminonaphthalin-1-sulfonylchlorid
(Dansyl-Cl, 3–6 Äqu.) in
DMF für
eine Zeitspanne von 2–3
Stunden eingeführt.
Das Peptid wurde vom Harz gespalten, und alle Schutzgruppen außer Acm
wurden gemäß demselben
Verfahren wie bei fluoresceinmarkierten Peptiden entfernt. Die Peptide
wurden durch RP-HPLC gereinigt und durch MALDI-TOF-MS charakterisiert:
D(15-23)Acm m/z 1596,3 ([M+H]+ berechnet: 1596,8);
D(15-23)SH 1525,9
(1525,7).
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Peptide, die durch Fluorescein- und EDANS-Gruppierungen
markiert sind, F(15-23)ED:
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Fmoc(15-23)Trt-Harz
wurde mit 20 Vol.-% Piperidin/NMP behandelt, um eine Fmoc-Gruppe zu entfernen.
Eine Fluorescein-Gruppierung wurde in den N-Terminus der Peptide
unter Verwendung von 5(6)-Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (5(6)-FAM,
SE, Molecular Probes, Inc., 1,2 Äqu.)
und DIEA (2 Äqu.)
in DMF für eine
Zeitspanne von 7 Stunden eingeführt.
Das Peptid wurde vom Harz gespalten, und alle Schutzgruppen wurden
gemäß demselben
Verfahren wie bei fluoresceinmarkierten Peptiden entfernt und mittels
RP-HPLC gereinigt. Das erhaltene Peptid wurde in 100 mM Tris-HCl
(pH 7,4) aufgelöst,
und N-(Iodacetaminoethyl)-1-naphthylamin-5'-Sulfonsäure (IAEDANS, Research Organics,
3 Äqu.),
aufgelöst
in DMF, wurde hinzugefügt.
Nach 1 h wurde der Reaktant mittels RP-HPLC gereinigt. Das Peptid
wurde durch MALDI-TOF-MS charakterisiert: F(15-23)ED m/z 1959,2
([M+H]+ berechnet 1956,0).
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Peptide, die durch eine Cumarin-Gruppierung,
H(15-23)C, oder Cumarin- und Fluorescein-Gruppierungen markiert
sind, F(15-23)C:
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Fmoc(15-23)Mtt-Harz
wurde mit CHCl3 (vier Mal) und DCM (ein
Mal) gewaschen und anschließend
mit DCM/TIS/TFA = 94/5/1 (4- bis 6-mal für jeweils 2 Minuten) behandelt,
um eine Mtt-Gruppe zu entfernen. Nach dem Waschen des Harzes mit
CHCl3 (fünf
Mal) und NMP (fünf
Mal) wurde eine Cumarin-Gruppierung unter Verwendung von 7-Diethylaminocumarin-3-carbonsäure (Fluka,
2 Äqu.),
HBTU (2 Äqu.),
HOBt·H2O (2 Äqu.) und
DIEA (4 Äqu.)
in NMP für
eine Zeitspanne von 30 Minuten (× 2) in die Seitenketten-Aminogruppe
des Lys-Rests eingeführt.
Anschließend
wurde die Fmoc-Gruppe des Peptids durch die Behandlung mit 20 Vol.-% Piperidin/NMP
entfernt, und die Fluorescein-Gruppierung wurde gemäß demselben
Verfahren wie bei fluoresceinmarkierten Peptiden in den N-Terminus
von Peptiden eingeführt.
Das Peptid wurde vom Harz gespalten, und alle Schutzgruppen wurden
gemäß demselben
Verfahren, wie es oben stehend beschrieben wurde, entfernt. Die
Peptide wurden mittels RP-HPLC gereinigt und durch MALDI-TOF-MS
charakterisiert: H(15-23)C m/z 1559,7 ([M+H]+ berechnet
1559,7); F(15-23)C 1919,3 (1918,0).
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Synthese von Peptiden mit
kreierter Schleifensequenz
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Die
Peptide wurden auf Rink-Amid-SS-Harz (Advanced ChemTech, 0,6 mmol/g)
angeordnet. Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Ile-Thr(tBu)-Val-Ser(tBu)-Trp-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Lys(Mtt)-Lys(Boc)-Harz
(Fmoc-Schleife 1(Mtt)-Harz)
wurde auf einem Advanced-ChemTech-Model-348-MPS-Peptide-Synthesegerät synthetisiert,
und zwar nach demselben Verfahren, wie es oben stehend beschrieben
wird. Jedes der Peptid-Harze wurde mit CHCl3 (vier
Mal) und DCM (ein Mal) gewaschen und anschließend mit DCM/TIS/TFA = 94/5/1
(4- bis 6-mal für
jeweils 2 Minuten) behandelt, um eine Mtt-Gruppe zu entfernen. Nach
dem Waschen des Harzes mit CHCl3 (fünf Mal)
und DMF (fünf
Mal) wurde 5(6)-FAM, SE unter Verwendung von 5(6)-FAM, SE (3 Äqu.) und
DIEA (1,5 Äqu.) über Nacht
an die Seitenketten-Aminogruppe des Lys-Rests gebunden. Das Peptid
wurde vom Harz gespalten, und alle Schutzgruppen wurden gemäß demselben
Verfahren, wie es oben ste hend beschrieben wurde, entfernt. Die
Peptide wurden mittels RP-HPLC gereinigt und durch MALDI-TOF-MS
charakterisiert: Schleife 1 m/z 2306,9 ([M+H]+ berechnet
2306,6).
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Fluoreszenz-Spektroskopie
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Fluoreszenz-Spektren
wurden auf einem Hitachi-Fluoreszenz-Spektrophotometer 850 mit einem Thermo-Regulator
unter Verwendung einer Quarz-Zelle mit einer Weglänge von
10 mm aufgenommen. Alle Messungen wurden bei 25°C in 20 mM Tris-HCl (pH 7,4)
oder 20 mM Tris-HCl, enthaltend 150 mM NaCl (pH 7,4), durchgeführt.
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Zirkulardichroismus-Spektroskopie
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Es
wurde eine Zirkulardichroismus-Spektroskopie auf einem Jasco-J-720WI-Spektropolarimeter
mit einem Thermo-Regulator unter Verwendung einer Quarz-Zelle mit
einer Weglänge
von 1 mm durchgeführt. Alle
Messungen wurden bei 25°C
in 20 mM Tris-HCl, enthaltend 150 mM NaCl (pH 7,4), durchgeführt.
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Konstruktion einer Peptidbibliothek
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Die
kreierten Bibliotheken wurden auf einem Modul zur mehrfachen simultanen
Synthese SRM96 (Shimadzu Scientific Research Inc.) synthetisiert.
Die Synthese wurde basierend auf den Anweisungen des Herstellers
und dem folgenden Verweis durchgeführt:
Verweis: Tadashi
Yasuhara, Kiyoshi Nokihara, Tadasu Furusho und Eiko Kataoka, Nogaku
Shohu (Journal of Tokyo University of Agriculture) 43, 260–267, Tokyo
University of Agriculture (1999).
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Die
Peptidbibliothek, bestehend aus 63 Bibliothekspeptiden und dem Peptid
mit der nativen Sequenz (SWRY), d. h. insgesamt 64 Peptidarten,
wurden gleichzeitig synthetisiert.
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Die
Peptidkette wurde auf einem 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidnorleusyl-MBHA-Harz
(Rink-Amid-MBHA-Harz) angeordnet. Die gemeinsame Sequenz der Reste
am C-Terminus wurde angeordnet in ihrer Gesamtheit unter Verwendung
einer Big-LibraRöhre
Rt20 (Shimadzu Scientific Research Inc.) gebunden. Anschließend wurde
das getrocknete Harz in das Reaktionsröhrchen eines SRM96 abgegeben,
und die folgenden Reste wurden unter Verwendung von HBTU (10 Äqu.), HOBtH2O (10 Äqu.)
und DIEA (12 Äqu.)
an ein SRM gebunden. Geschützte
Aminosäure
(10 Äqu.)
wurde als Acylkomponente umgesetzt. Nach der Anordnung der gesamten
Peptidkette wurde eine Mtt-Gruppe in der Seitenkette (ε-Position) des geschützten Peptidharzes
von Interesse durch die Behandlung mit der Lösung aus DCM/TIS/TFA = 94/5/1 (für eine Zeitspanne
von 20 Minuten) entfernt, und die Fluorescein-Gruppierung wurde
durch die Verwendung von 5(6)-FAM (6 Äqu.) mit HBTU (6 Äqu.), HOBt·H2O (6 Äqu.)
und DIEA (9 Äqu.)
oder 5(6)-FAM (5 Äqu.)
und O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat
(HATU, 5 Äqu.)
und DIEA (6 Äqu.) eingeführt. Die
Tatsache, dass die Reaktion sehr spezifisch zu Ende gebracht wurde,
wurde durch die Charakterisierung der gespaltenen Peptide bewiesen.
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Peptidketten
wurden aus dem Harz freigesetzt. Dieses Verfahren wird auf diesem
Gebiet als Spaltung bezeichnet. Für die Spaltung von Peptiden
von Harz sowie zur Seitenketten-Entschützung wurde das Gemisch aus
TFA/m-Kresol/Ethandithiol/Thioanisol (40/1/3/3, Vol./Vol.) als Spaltcocktail
verwendet. Für
64 Peptide wurden ca. 20 ml Lösung
hergestellt. Um die Filtrate zu sammeln, wurde eine 96-Well-Glas-Titer-Platte unter einem
Röhrchenhalter
angebracht. Der Spaltcocktail wurde zu den Harzen in Reaktionsröhrchen tropfenweise über eine
Zeitspanne von 30 Minuten hinzugefügt, anschließend wurde
eine Standzeit von 1 h eingehalten. Anschließend wurden die Harze mit kleinen
Mengen Spaltcocktail gewaschen. Jene Filtrate, die Peptide enthielten,
wurden durch N2-Einleiten eingeengt, und
anschließend
wurde Diethy- lether
hinzugefügt,
um die Peptide zu präzipitieren.
Die Lösung
mit Niederschlägen
wurde in 1,5-ml-Polypropylen-Röhrchen
transferiert und zentrifugiert, um Niederschläge zu sammeln. Die Niederschläge wurden
mit frischem Ether fünf
Mal gewaschen und in einem Zentrifugalverdampfer getrocknet.
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Die
Rohpeptide wurden mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) unter
Verwendung eines SRM96 gereinigt, wobei die Röhrchen mit Sephadex G-10 (Pharmacia),
gequollen mit 10 Vol.-% wässriger AcOH
(ca. 100 μl
pro Röhrchen),
gefüllt
waren. Da die mit der fluoreszierenden Markierung markierten Peptide gefärbt waren,
war die gewünschte.
Fraktion durch visuelle Beobachtung leicht zu erhalten. Die Lösung wurde durch
einen Zentrifugalverdampfer bis zur Trockene eingedampft. Die verbleibende
Essigsäure
wurde durch Gefriertrocknen mit dem Zusatz von Wasser entfernt.
Die resultierenden Peptide wurden in 200 μl MeOH aufgelöst und mit
dicht verschlossenem Deckel bei 4°C
gelagert.
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Absorptionsmessungen in einer 96-Well-Platte
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Um
die Konzentrationen der oben genannten Stammlösungen der Peptide abzuschätzen, wurde
die Absorption der Lösungen
der hergestellten Peptide bei 490 nm unter Verwendung eines Benchmark-Multiplate-Lesegeräts (Bio-Rad
Laborstories) mit einem 490-nm-Filter unter Verwendung einer Mikrotiter-Platte
(Testplatte, Asahi Techno Glas) gemessen. Stammlösungen von Peptiden (in MeOH)
wurden durch 20 mM Tris-HCl, enthaltend 150 mM NaCl (pH 7,4), verdünnt. Die
Konzentrationen der Stammlösungen
wurden durch den Vergleich der Extinktion eines jeden Peptids mit
jener eines Standard-Peptids abgeschätzt, dessen Peptidgehalt durch
Aminosäure-Analyse bestimmt
wurde.
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Fluoreszenz-Messungen in einer 96-Well-Platte
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Die
Fluoreszenz-Intensitäten
der fluoreszenzmarkierten Peptide in Mikrotiter-Platten (Testplatte,
Asahi Techno Glas) als Lösungen
oder an die Substrate immobilisiert wurden auf einem PerSeptive-Biosystems-CytoFluorTM-4000TR-Multiwelt-Platten-Lesegerät bei 30°C gemessen.
Verwendete Anregungs- und Emissionsfilter waren 485/20 bzw. 530/10
(bei fluoreszenzmarkierten Peptiden), 360/20 bzw. 515/10 (bei einem
dansylmarkierten Peptid), 450/50 bzw. 530/10 (bei einem cumarin-
und einem fluoresceinmarkierten Peptid).
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Peptidimmobilisierung an 96-Well-Polystyrol-Platten
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Synthese von tresylaktiviertem Dextran
(TAD):
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Dextran
(100,0 mg, durchschnittliches MG 64.000–76.000, Sigma D4751) wurde
von Wasser (ca. 20 ml) gefriergetrocknet. Getrocknetes Dextran wurde
in Hexamethylphosphortriamid (10 ml) bei 115°C in einem 50-ml-Einhalsrundkolben,
der mit einem Calciumchlorid-Röhrchen
verbunden war, aufgelöst.
Die Lösung
wurde auf Raumtemperatur gebracht, und 2,2,2-Trifluorethansutfonylchlorid
(Tresylchlorid, 220 μl,
2 mmol, Aldrich 32.478-7) wurde tropfenweise unter Magnetrühren über eine
Zeitspanne von 1 Minute hinzugefügt.
Nach 15 Minuten wurde trockenes Pyridin (440 μl, 5,4 mmol) über eine
Zeitspanne von 1 Minute tropfenweise hinzugefügt. Das Produkt wurde aus kaltem
Ethanol (ca. 20 ml) präzipitiert.
Das Peptid wurde mittels Zentrifugierung gesammelt und zwei Mal
mit frischem Ethanol gewaschen. Schließlich wurde das Produkt in
wässriger
Essigsäure
(1 Vol.-% in Wasser, ca. 10 ml) aufgelöst, gefriergetrocknet und bei –20°C gelagert.
Ausbeute: 120,2 mg. Diese Ausbeute entsprach 7,4% der Hydroxylgruppen
im Dextranmolekül
(eine von 4,5 Glucose-Einheiten), die
tresyliert waren, und dieses Resultat stand in Einklang mit den
im Verweis beschriebenen Resultaten. Verweis: K. Gregorius, S. Mouritsen,
H. I. Elsner, J. Immunol. Meth. 181, 65–73 (1995).
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Herstellung BrAc-modifizierter Mikrotiter-Platten:
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Eine
Lösung
von Poly-L-Lysin (MG 70.000–150.000,
Sigma P1274, 0,01 mg/ml) in Carbonatpuffer (0,1 M, pH 9,6) wurde
zu jedem Well von zwei Polystyrol-Mikrotiter- Platten (Testplatte, Asahi Techno Glas,
150 μl pro
Well) hinzugefügt,
und die Platten wurden für
eine Zeitspanne von 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht
bei 4°C
inkubiert. Die Poly-L-Lysin-beschichteten Platten wurden vier Mal
mit Waschpuffer (10 mM Phosphat, 2,7 mM KCl, 500 mM NaCl, 1 Vol.-%
Triton X-100, pH 7,2) und drei Mal mit Wasser gewaschen und mit
N2 getrocknet. Anschließend wurde das oben genannte
TAD (s. o.) (0,5 mg/ml) in Phosphatpuffer (10 mM Phosphat, 150 mM
NaCl, pH 7,2) zu den Poly-L-Lysin-beschichteten Platten (150 μl pro Well)
hinzugefügt
und für
eine Zeitspanne von 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen
mit Wasser und dem Trocknen wurde 1,4-Diaminobutan (10 mM, verdünnt aus
1 M Stammlösung
in DMF) im Carbonatpuffer zu den TAD-modifizierten Platten (100 μl/Well) hinzugefügt und für eine Zeitspanne
von 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem Waschschritt
mit Wasser wurde Blockierlösung
(0,1 M 2-Aminoethanol
in Wasser, pH 8,0, angepasst durch HCl) hinzugefügt (200 μl/Well) und für eine Zeitspanne
von 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die aminofunktionalisierten
Platten wurden anschließend
drei Mal mit dem Waschpuffer (s. o.) und drei Mal mit Wasser gewaschen
und mit N2 getrocknet.
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Bromessigsäure wurde
unter Verwendung ihres Anhydrids in die aminofunktionalisierten
Platten eingeführt.
Bromessigsäure-Anhydrid
wurde in situ durch Mischen von BrAcOH (0,6 M) und DIC (0,3 M) in
DMF oder NMP über
eine Zeitspanne von 60 Minuten hergestellt. Es wurde mit Wasser
auf 10 mM verdünnt
und zu der Platte (100 μl/Well)
hinzugefügt
und für
eine Zeitspanne von 5 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht
bei 4°C
inkubiert. Die Platten wurden drei Mal mit Wasser gewaschen und
weiterverarbeitet, wie unten stehend beschrieben.
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Herstellung peptidgebundener Mikrotiter-Platten:
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Die
Peptide mit einer freien SH-Gruppe wurden in MeOH als Stammlösungen (ca.
1 mM) aufgelöst. Die
Peptidlösungen
wurden mit 100 mM Tris-Puffer (pH 8,0) auf 10 μM verdünnt und sofort zu der bromessigsäuremodifizierten
Platte (100 μl/Well)
hinzugefügt.
Die Platte wurde für
eine Zeitspanne von 10 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und
anschließend
mit Waschpuffer über
Nacht bei 4°C
gewaschen. Nach dem Waschen mit Wasser und dem Trocknen mit N2 wurde die Platte bei 4°C gehalten.
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Proteindetektionstest unter
Verwendung immobilisierter Peptide
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Alle
Messungen wurden in 20 mM Tris-HCl, enthaltend 150 mM NaCl (pH 7,4),
durchgeführt.
Gereinigte und partiell gereinigte Proteine wurden von Sigma-Aldrich
Japan zugekauft (1. α-Amylase
aus Aspergillus oryzae: A6211, 2. Albumin aus Rinderserum (BSA):
A6793, 3. β-Glucosidase
aus Mandeln: G0395, 4. β-Galactosidase
aus Aspergillus oryzae: G5160, 5. Lysozym aus Hühnereiweiß: 16876, 6. Cellulase aus
Aspergillus niger: C1184, 7. β-Lactoglobulin
aus Rindermilch: L3908, 8. Mandelmehl (Proteingemisch): A3265).
Zusätzlich dazu
wurde auch Zelllysat von E. coli verwendet.
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Die
Proteinlösungen
(0,5 mg/ml) wurden zu der peptidimmobilisierten Platte (100 μl/Well) hinzugefügt, und
die Platte wurde bei 4°C
für eine
Zeitspanne von 24 Stunden inkubiert. Die Fluoreszenz-Intensitäten (I) wurden
unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts (CytoFluorTM)
bei 30°C
gemessen. Nach dem Waschen mit Wasser wurde der Puffer zu den Platten
(100 μl/Well)
hinzugefügt,
und die Fluoreszenz-Intensitäten (I0) wurden unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts (CytoFluorTM) bei 30°C
erneut gemessen. Die Experimente wurden zwei Mal pro Protein wiederholt,
und die Durchschnittswerte von I/I0 wurden
festgehalten.
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Herstellung von E.-coli-Zelllysat
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E.
coli JA221 (F-, hsdR, DtrpES, leuB6, lacY, recAl) wurde auf ca.
5 ml flüssiges
Medium geimpft, das aus 1% Trypton, 0,5 % Hefeextrakt und 1 % (Gew./Vol.)
NaCl bestand, und bei 37°C über Nacht
vorinkubiert. Anschließend
wurde die gesamte Kultur in 400 ml desselben Mediums geimpft und
bei 37°C über Nacht
unter heftigem Schütteln
inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet, und
die Zellpel lets wurden im Puffer (100 mM Kaliumphosphat, pH 6,5)
suspendiert, gefolgt von einem Waschschritt. Die gewaschenen Zellen
wurden erneut in 16 ml des Puffers suspendiert und durch Beschallung
unter Verwendung eines Ultraschall-Desintegrators in einem Eisbad
aufgeschlossen. Zelltrümmer
und größere Partikel
wurden durch Zentrifugierung bei 12.000 U/min für eine Zeitspanne von 20 Minuten
entfernt, und der Überstand
wurde gesammelt. Die Gesamtproteinkonzentration des erhaltenen Überstands
wurde unter Verwendung eines Bio-Rad-DC-Protein-Test-Sets auf 30
mg/ml geschätzt.
Die Lösung
wurde mit 10 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 5 mM EDTA auf eine
Konzentration von 0,86 mg/ml verdünnt und durch die peptidimmobilisierte
Platte analysiert.
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Verarbeitung fingerprintartiger
Fluroeszenz-Daten anhand des Computers
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Die
Fluoreszenz-Daten für
jedes Protein, die durch die auf der Platte immobilisierte Peptidbibliothek erhalten
wurden, wurden in eine Graphik wie ein Fingerabdruck umgewandelt.
Nun wird beispielsweise der durch die Verwendung eines Igor-Pro-Software-Programms
Ver. 4.04 (WaveMetrics, Inc.) durchgeführte Fall beschrieben. Zuerst
wurden die Peptide (1–126)
entlang der x-Achse angeordnet. Die Linie von y = 1 wurde als Strichdiagramm
für alle
Proteine (10 Linien) dargestellt (1. α-Amylase aus Aspergillus oryzae,
2. Albumin aus Rinderserum (BSA), 3. β-Glucosidase aus Mandeln, 4. β-Galactosidase
aus Aspergillus oryzae, 5. Lysozym aus Hühnereiweiß, 6. Cellulase aus Aspergillus
niger, 7. β-Lactoglobulin
aus Rindermilch, 8. Mandelmehl (Proteingemisch), 9. Gemisch aus
1–7, 10.
lösliche
E.-coli-Proteine (ZelI-Homogenat)). Anschließend wurden diese Linien nach
dem Verschieben der y-Achse dargestellt, und der Fluoreszenz-Antwort-Wert
(I/I0) für
jedes Protein wurde jeder Linie als der Wert der z-Achse zugewiesen.
Abs Farbabstufung wurde yello-hot aus den in der Software inkludierten
Mustern ausgewählt.
Als Resultat wurde das charakteristische Fluoreszenz-Antwort-Muster
(Protein-Fingerabdruck) in Abhängigkeit
von den Aminosäuresequenzen
der Peptide für
jedes Protein erhalten, und die Proteine konnten aus den Mustern
mit hoher Reproduzierbarkeit charakterisiert werden.
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