DE3781185T2 - Peptid-derivate und methode zur messung der wirksamkeit von physiologisch aktiven verbindungen, die dieselben als substraten benuetzen. - Google Patents

Peptid-derivate und methode zur messung der wirksamkeit von physiologisch aktiven verbindungen, die dieselben als substraten benuetzen.

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DE3781185T2 DE8787104767T DE3781185T DE3781185T2 DE 3781185 T2 DE3781185 T2 DE 3781185T2 DE 8787104767 T DE8787104767 T DE 8787104767T DE 3781185 T DE3781185 T DE 3781185T DE 3781185 T2 DE3781185 T2 DE 3781185T2
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Description

  • Die Erfindung betrifft verfahren zum Messen der Aktivität physiologisch wirksamer Substanzen unter Verwendung von Peptidderivaten als Substrat.
  • Substanzen, die hauptsächlich aus Aminosäuren bestehen, wie zum Beispiel Peptidhormone, Enzyme und dergleichen, erfüllen verschiedene wichtige physiologische Funktionen in lebenden Organismen. Wenn diese physiologischen Funktionen auftreten, kommt es in lebenden Organismen bekanntermaßen zu spezifischen Modifikationen von Peptiden, beispielsweise zur Spaltung von Peptidbindungen, zur Anlagerung von Zuckern, Phosphorsäuregruppen, Sulfonsäuregruppen, Schwefelsäuregruppen, etc. an Peptide, und auch zu spezifischen Abspaltungsreaktionen einiger Gruppen. Beispielsweise ist konkret die Aktivierung von Polypeptidhormonen durch begrenzte Proteolyse, die Steuerung biologischer Aktivitäten von Proteinen durch Phosphorylierung, die Spaltung von Leader-Peptiden, die Anlagerung oder Abspaltung von Zuckerketten an Proteinen, etc. bekannt. Die Erforschung dieser Modifikationen ist medizinisch und physiologisch von großer Bedeutung. Es wurden daher verschiedene Untersuchungen durchgeführt bezüglich physiologisch wirksamer Substanzen, die solche Reaktionen hervorrufen.
  • Bei Messungen der Aktivität physiologisch wirksamer Substanzen, die auf Peptide, Proteine, etc. einwirken, ist es im allgemeinen durchaus üblich, die durch die verschiedenen Einflüsse physiologisch wirksamer Substanzen hervorgerufenen Änderungen der Substrate, beispielsweise die Modifikation, Abspaltung und Zersetzung, unter Verwendung von Peptiden oder Proteinen als Substrat zu messen. Wenn beispielsweise die Aktivität der Protease oder der Peptidase gemessen wird, werden synthetisierte Substrate verwendet, bei denen eine chromogene Gruppe in die Peptide oder Aminosäuren eingeführt ist. Als chromogene Gruppe kann Kumarin, Naphthylamin, Nitroanilin, Hippursäure und Derivate dieser Verbindungen verwendet werden. Die Aktivität kann bestimmt werden durch Messen der Fluoreszenzintensität oder der Änderung der Extinktion (Absorptionskurve) der chromogenen Gruppe, die freigesetzt wurde durch Hydrolyse der Bindung zwischen der chromogenen Gruppe und der Aminosäure, oder durch Messen der Extinktion eines Farbmittels, das erhalten wurde durch eine farberzeugende Umsetzung der freigesetzten chromogenen Gruppe und eines Kopplers. Wie oben erwähnt, ist das Verfahren, bei dem die Bindung direkt durch die physiologisch wirksame Substanz hydrolisiert wird und die freigesetzte chromogene Gruppe gemessen wird, einfach und bequem durchzuführen. Nachdem jedoch der hydrolisierte Teil die Bindung zwischen der Aminosäure und der chromogenen Gruppe ist, eignet sich ein solches Verfahren nicht zum Messen einer physiologisch wirksamen Substanz mit hoher Spezifität. Ferner sind die Anwendungsmöglichkeiten dieses Verfahrens zahlenmäßig begrenzt, da das Verfahren nicht auf die physiologisch wirksamen Substanzen anwendbar ist, deren Aktivität nicht mit der Spaltung von Peptiden verbunden ist. Gemäß einem Verfahren, bei dem ein Peptidanteil eines Substrates durch die entsprechende physiologisch wirksame Substanz hydrolisiert wird, und bei dem die chromogene Gruppe ferner durch gekoppelte Exopeptidase, etc. freigesetzt wird, ist außerdem die Einwirkung anderer physiologisch wirksamer Verunreinigungssubstanzen störend, da die hydrolisierte Substanz nicht direkt gemessen wird.
  • Andererseits ist im Journal of Biochemistry 98, 1293-1299 (1985) ein Verfahren offenbart, bei dem ein Peptid als Substrat verwendet wird, eine durch Hydrolyse erzeugte Aminogruppe mit Fluoreszamin umgesetzt wird, und die erzeugte Fluoreszenz gemessen wird. Dieses Verfahren ist gut, was die Empfindlichkeit angeht, aber es ist insoweit unzureichend, als die jeweilige Aminogruppe nicht korrekt bestimmt werden kann, wenn andere Teile des Peptids durch andere physiologisch wirksame Verunreinigungssubstanzen hydrolisiert werden. In einem solchen Fall wird befürchtet, daß ein großer Fehler entsteht, da der Meßwert die zusätzlichen Aminogruppen umfaßt. Gemäß der obengenannten Veröffentlichung wird ferner offenbart, daß es möglich ist, den hydrolysierten Teil zu spezifizieren und zu quantifizieren, indem die Reaktionsprodukte mit Hilfe von Hochleistungs-Flüssigkeits- Chromatographie abgetrennt und gemessen werden. Nachdem aber die Absorption der Peptidbindung bei fast 220 nm gemessen wird, ist das Verfahren insoweit unzureichend, als die Empfindlichkeit gering ist und viele Verunreinigungsstoffe die UV-Absorption oft stören.
  • Als Verfahren zum Messen von Enzymen, die Funktionen zur Anlagerung oder Abspaltung spezifizierter funktioneller Gruppen (z. B. Phosphorsäuregruppen, Sulfonsäuregruppen, Schwefelsäuregruppen, Acylgruppen, etc.) besitzen, wird nur über Verfahren berichtet, bei denen Radioisotopen verwendet werden, wie es beispielsweise in Biochemistry 15, 1958-1967 (1976) offenbart ist. Gemäß dem obengenannten Artikel in Biochemistry wird unter Verwendung eines Proteins, wie zum Beispiel Histon, Casein oder dergleichen, und Adenosintriphosphat, welches mit einem Isotop ³²p markiert ist, ein Enzym gemessen, welches ein Protein phosphoryliert. Dieses Verfahren besitzt eine hohe Empfindlichkeit, aber es ist insoweit unzureichend, als nicht festgestellt werden kann, welcher Teil des Proteins phosphoryliert ist, und durch die Verwendung des Radioisotops ist eine besondere Vorrichtung und ein vorsichtiger Umgang erforderlich.
  • Das US-Patent 4 557 862 (Mangel), das US-Patent 4 505 852 (Rasnick) und die DE-3 202 289 offenbaren die fluorometrische Bestimmung bestimmter Peptidreste, aber die fluorometrischen Bestimmungen werden eher mit abgespaltenen endständigen Gruppen durchgeführt als mit den in der vorliegenden Erfindung verwendeten nicht-endständigen abgespaltenen Gruppen.
  • In Chemical Abstracts, Bd. 101, Nr. 19, 5. November 1984, Seite 743, Abstract Nr. 171702p, ist die Herstellung von 2- Methoxy-6-chloracridin-9-yl-aminosäuren durch Kondensieren der geeigneten Aminosäure mit 2-Methoxy-6,9-dichloracridin offenbart.
  • In Chemical Abstracts, Bd. 101, Nr. 19, 5. November 1984, Seiten 746 und 747, Abstract Nr. 171738e, ist die Anlagerung von fluoreszierenden 2-Methoxy-6-chloracridin-Gruppen an bestimmte Di- oder Tripeptide durch Zugabe von Dichloracridin zu den jeweiligen Peptiden oder ihren lysingeschützten Derivaten offenbart.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben, mit dem die Aktivität einer physiologisch wirksamen Substanz, die auf Peptide, Proteine und dergleichen einwirkt, leicht und spezifisch mit einer hohen Empfindlichkeit gemessen werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren an zum Messen der Aktivität einer physiologisch wirksamen Substanz, in dem die physiologisch wirksame Substanz mit einem Substrat umgesetzt wird, das ein Peptidderivat mit 2 bis 15 Aminosäureeinheiten ist, das durch die Formel I oder die Formel II dargestellt ist:
  • R¹-A¹-A-A²-R² (I)
  • R¹-A¹-A²-R² (II)
  • wobei A ein Aminosäurerest oder ein Peptidrest ist mit 2 bis 13 Aminosäureeinheiten; A¹ ein Aminosäurerest ist, in dem das endständige N mit einem Substituenten R¹ verbunden ist; A² ein Aminosäurerest ist, in dem das endständige C mit einem Substituenten R² verbunden ist; R¹ ein Substituent ist, der ausgewählt ist aus Wasserstoff, einer Aminoschutzgruppe, und einer Gruppe, die fluoresziert, wenn sie mit einer -NH-- Gruppe kombiniert ist; und R² ein Substituent ist, der ausgewählt ist aus Hydroxyl, einer Carboxylschutzgruppe, und Gruppen der Formel III:
  • -NH-Y-R³ (III)
  • wobei Y ein geradkettiges oder verzweigtkettiges C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylen oder ein Phenylen ist; und R³ ein Substituent ist, der ausgewählt ist aus 2-Pyridylamino, 3-Pyridylamino, Anilino und mit mindestens einer C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, Sulfonyl- und Halogengruppe substituiert sein kann und Fluoreszenz emittieren kann; mit der Maßgabe, daß:
  • (a) wenn R¹ Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe ist, R²-NH-Y-R³ ist, und
  • (b) wenn R² Hydroxyl oder eine Carboxylschutzgruppe ist, R¹ weder Wasserstoff noch eine Aminoschutzgruppe ist;
  • eine fluoreszierende Aminosäure oder ein fluoreszierendes Peptid, die bzw. das durch die Wirkung der physiologisch wirksamen Substanz erzeugt worden ist, abgetrennt wird und die Menge des Reaktionsproduktes gemessen wird.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
  • Fig. 1(a) und 1(b) zeigen Diagramme einer in Beispiel 6 durchgeführten Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie, wobei Fig. 1(a) ein Diagramm eines Blindversuchs ist, und Fig. 1(b) ein Diagramm ist, welches 2 Stunden nach Beginn der Umsetzung erstellt wurde.
  • Fig. 2 ist ein Diagramm, welches eine Beziehung zwischen der Elastaseaktivität und der verstrichenen Zeit darstellt.
  • Fig. 3(a) und 3(b) zeigen Diagramme einer in Beispiel 8 durchgeführten Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie, wobei Fig. 3(a) ein Diagramm eines Blindversuches ist, und Fig. 3(b) ein Diagramm zeigt, das mit einer 1:2 verdünnten Probe erhalten wurde.
  • Fig. 4 ist ein Diagramm, welches eine Beziehung zwischen der Produktkonzentration und dem Verdünnungsverhältnis der in Beispiel 8 verwendeten Probe darstellt.
    • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Wie bereits angegeben, wird das Peptidderivat, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Substrat verwendet wird und 2 bis 15 Aminosäureeinheiten besitzt, durch die folgende Formel dargestellt:
  • R¹-A¹-A-A²-R² (I) oder
  • R¹-A¹-A²-R² (II)
  • In der Formel (I) oder (11) ist R¹ ein Substituent, der ausgewählt ist aus Wasserstoff, einer Aminoschutzgruppe und einer Gruppe, die fluoresziert, wenn sie mit einer -NH--Gruppe kombiniert ist, beispielsweise einer 2-Pyridyl-Gruppe, einer 3-Pyridyl-Gruppe, einer Phenylgruppe, oder einer substituierten Phenylgruppe. Als Substituentengruppe in der substituierten Phenylgruppe kann eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen verwendet werden, wie zum Beispiel eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine Propylgruppe, eine Butylgruppe, etc., eine niedere Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel eine Methoxygruppe, eine Ethoxygruppe, eine Propoxygruppe, etc., eine Hydroxylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine Sulfonsäuregruppe, ein Halogenatom, wie zum Beispiel Chlor, Brom oder Iod. Als Aminoschutzgruppe kann eine herkömmlicherweise verwendete Gruppe verwendet werden, wie zum Beispiel eine Carbobenzoxygruppe, eine Succinylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen.
  • In der Formel (I) oder (II) ist R² ein Substituent, der ausgewählt ist aus einer Hydroxylgruppe, einer Carboxylschutzgruppe, und einer Gruppe der Formel: -NH-Y-R³. Als Carboxylschutzgruppe können herkömmlicherweise verwendete Gruppen verwendet werden, wie zum Beispiel eine Aralkyloxygruppe, z. B. eine Benzyloxygruppe, eine Phenethyloxygruppe, etc. In der Formel: -NH-Y-R³ ist R³ ein Substituent, der ausgewählt ist aus einer Fluoreszenz emittierenden Gruppe, wie zum Beispiel einer 2-Pyridyl-Gruppe, einer 3-Pyridyl-Gruppe, einer Anilinogruppe, einer substituierten Anilinogruppe, wobei die Substituentengruppe eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, wie zum Beispiel eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine Propylgruppe, eine Butylgruppe, etc., eine niedere Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel eine Methoxygruppe, eine Ethoxygruppe, eine Propoxygruppe, etc., eine Hydroxylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine Sulfonsäuregruppe, ein Halogenatom, wie zum Beispiel Chlor, Brom, Iod, etc.; und Y ist eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylengruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder eine Phenylengruppe.
  • In der Formel (I) oder (II), sollte dann, wenn R¹ Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe ist, R²-NH-Y-R³ sein, und wenn R² eine Hydroxylgruppe oder eine Carboxylschutzgruppe ist, sollte R¹ eine Gruppe sein, die Fluoreszenz emittieren kann, wie zum Beispiel eine 2-Pyridyl-Gruppe, eine 3-Pyridyl-Gruppe, eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe.
  • In der Formel (I) ist A ein Aminosäurerest oder ein Peptidrest mit 2 bis 13 Aminosäureeinheiten. Beispiele für Aminosäurereste sind nachfolgend angegeben:
  • Aminosäurerest Abkürzung
  • Alanyl Ala
  • Arginyl Arg
  • Asparaginyl Asn
  • Aspartyl Asp
  • Cysteinyl Cys
  • Cystyl
  • Glutaminyl Gln
  • Glutamyl Glu
  • Glycyl Gly
  • Histidyl His
  • Hydroxylysyl Hyl
  • Hydroxyprolyl Hyp
  • Isoleucyl Ile
  • Leucyl Leu
  • Lysyl Lys
  • Methionyl Met
  • Phenylalanyl Phe
  • Prolyl Pro
  • Seryl Ser
  • Threonyl Thr
  • Tryptophanyl Trp
  • Tyrosyl Tyr
  • Valyl Val
  • In der Formel (I) und (II) ist A¹ ein Aminosäurerest, in dem das endständige N mit dem Substituenten R¹ verbunden ist, und A² ist ein Aminosäurerest, in dem das endständige C mit dem Substituenten R² verbunden ist. Die Aminosäurereste, die je nach der zu messenden Substanz ausgewählt werden können&sub1; unterliegen keiner besonderen Einschränkung.
  • Das Peptidderivat der Formel (I) oder (II) sollte eine Gruppe enthalten, die Fluoreszenz emittieren kann, beispielsweise eine 2-Pyridylaminogruppe, eine 3-Pyridylaminogruppe; eine Gruppe, die ultraviolette Strahlung absorbieren kann, wie zum Beispiel eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe entweder auf der Seite des endständigen N-Atoms oder auf der Seite des endständigen C-Atoms des Peptids, oder beides. Wenn eine dieser Gruppen nur auf der Seite des endständigen N-Atoms oder auf der Seite des endständigen C-Atoms des Peptids existiert, kann das andere Ende des Peptids eine nichtmodifizierte Aminosäureeinheit sein.
  • Wenn befürchtet wird, daß das Substrat durch die Wirkung der in einer Probe verunreinigten Exopeptidase hydrolysiert wird, kann die endständige Aminosäureeinheit modifiziert werden. Als Modifikationsmittel können jene verwendet werden, die die Wirkung der in der Probe verunreinigten Exopeptidase herabsetzen können. Beispiele für solche Modifikationsmittel sind herkömmlicherweise verwendete Aminoschutzgruppen und herkömmlicherweise verwendete Carboxylschutzgruppen.
  • Aminosäuren, wie zum Beispiel β-, γ-, δ-Aminosäuren und dergleichen, beispielsweise β-Alanin, β-Aminobuttersäure, γ- Aminobuttersäure, δ-Amino-n-Valeriansäure, etc., können als A¹, A² oder R¹ oder R² verwendet werden, da diese Aminosäuren als Aminosäureeinheiten und als Modifikationsmittel wirken.
  • Wenn nun A¹ von einer N-substituierten Aminosäure, wie zum Beispiel der N-Methylaminosäure, hergeleitet ist, ist es nicht notwendig, eine solche Aminosäuregruppe mit endständigem H zu modifizieren.
  • Die Peptidkette kann nach einem herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden, beispielsweise nach einem Stufenverfahren, einem Fragmentverfahren, einem Festphaseverfahren, einem Flüssigphaseverfahren, oder dergleichen. Das Einführen von endständigen Gruppen kann nach einem herkömmlichen Verfahren erfolgen.
  • Die Peptidderivate der Formel (I) und (II) können beispielsweise wie folgt synthetisiert werden.
  • Das Einführen einer Pyridylaminogruppe in die Aminosäure mit endständigem N kann nach einem Verfahren durchgeführt werden, das in Bull, Chem. Soc. Japan, 33, 1392-1394 (1960) beschrieben ist. Das heißt, nachdem eine wäßrige Lösung von Formaldehyd und Natriumbisulfit für einige zig Minuten bis mehrere Stunden unter Rückfluß erhitzt wurde, wird 2-Aminopyridin zugegeben, und anschließend wird etwa 1 Stunde unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird Natriumcyanid zugegeben, und die Umsetzung wird bei etwa 90ºC für mehrere Stunden fortgesetzt. Nach dem Umsetzen wird die Reaktionslösung gefiltert, und das Filtrat wird mit Chloroform oder dergleichen extrahiert. Das Extrakt wird unter vermindertem Druck konzentriert, und man erhält Kristalle von 2-Pyridylaminoacetonitril. Anschließend wird mit Ether gewaschen. Das so erhaltene 2-Pyridylaminoacetonitril wird mit Salzsäure hydrolysiert und unter vermindertem Druck konzentriert, und man erhält die Kristalle von 2-Pyridylglycin·Hydrochlorid.
  • Die Synthese einer Peptidbindungsreaktion aus 2-Pyridylglycin·Hydrochlorid und Glycin kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: N-2-pyridylglycin wird mit Dichlormethan, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und Glycinethylester versetzt. Nach mehrstündigem Rühren bei Zimmertemperatur wird die Reaktionslösung gefiltert. Das Filtrat wird beispielsweise mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie gereinigt zu Pyr-Gly-Gly-OEt.
  • Das Einführen einer Pyridylaminogruppe in die Aminosäure mit endständigem C kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden. 2-Chlorpyridin und Ethylendiamin werden mehrere Stunden auf einem Ölbad unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die Lösung unter vermindertem Druck konzentriert bei anschließender Zugabe von Salzsäure und Methanol, so daß N-(2-pyridyl)ethandiamin·Hydrochlorid auskristallisiert, was dann abgetrennt wird. Dann werden Dimethylformamid, Triethylamin und Carbobenzoxyalanyl-p-nitrophenylester zugegeben und bei Zimmertemperatur 10 bis 30 Stunden gerührt. Nach dem Filtern wird das Filtrat beispielsweise mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie gereinigt, so daß man Z- Ala-NH-CH&sub2;CH&sub2;-NH-Pyr erhält.
  • Die Peptidderivate der Formel (I) oder (II) besitzen eine hohe Löslichkeit in Wasser und eine ausgezeichnete Stabilität, so daß sie als Substrat für die Bestimmung der Aktivität physiologisch wirksamer Substanzen verwendet werden könne!,, die mit einer hohen Spezifität und einer hohen Empfindlichkeit bei Peptiden und Proteinen verschiedene Wirkungen zeigen, wie zum Beispiel Anlagerung, Abspaltung, Zerfall etc.
  • Das heißt, durch Verwendung der Peptidderivate der Formel (I) oder (II) als Substrat für eine physiologisch wirksame Substanz, die für Peptide und Proteine wirksam ist, kann ein durch die Wirkung der physiologisch wirksamen Substanz erzeugtes Produkt abgetrennt und gemessen werden, um die Aktivität der physiologisch wirksamen Substanz wirksam zu ermitteln.
  • Beispiele für physiologisch wirksame Substanzen mit Wirksamkeit für Peptide und Proteine sind Peptidasen oder Proteasen, wie zum Beispiel Elastase, Trypsin, Serinproteasen, Säureproteasen und Metalloendopeptidase, die Peptidbindungen hydrolysieren; Transferasen, die eine Übertragung auf Peptide oder Aminosäuren bewirken; Proteinkinasen, die die Phosphorylierung des Seryl-, Tyrosyl- oder Threonylrestes in einem Peptid oder Protein bewirken, wie zum Beispiel Caseinkinase, Proteinkinase A, Proteinkinase C und Tyrosinkinase; Phosphatasen, die die Abspaltung von in den Proteinen oder Peptiden enthaltenen Phosphorsäuregruppen bewirken; Enzyme, die an die Asparaginylreste in Proteinen oder Peptiden Zuckerketten anlagern; Glycosyltransferasen oder Glucohydrolasen, die auf Zuckerketten einwirken, um die Ketten zu verlängern oder zu spalten; andere Enzyme, die eine Anlagerung oder Abtrennung einer Sulfonsäuregruppe, einer Schwefelsäuregruppe, einer Methylgruppe, einer Acylgruppe, oder dergleichen bei Proteinen oder Peptiden bewirken; und dergleichen.
  • Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Substrate können verschiedene physiologisch wirksame Substanzen wie folgt gemessen werden:
    • (i) Messung von Protease und Elastase:
  • Substrate:
  • (1) Pyr-Gly(oder Ala)-Gly-Glu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Gluβ-Ala
  • Pyr = 2-Pyridyl oder 3-Pyridyl
  • Das Zeichen ↓ in den Aminosäuresequenzen kennzeichnet die Stelle der Spaltung durch Elastase.
  • Das heißt, wenn Elastase auf das obengenannte Substrat einwirkt, wird das Peptid an der durch das Zeichen ↓ gekennzeichneten Stelle gespalten, so daß zwei Arten von Peptiden neu gebildet werden, die an einem Ende die Pyridylaminogruppe aufweisen. Somit werden diese zwei Peptide abgetrennt, um die Elastaseaktivität zu messen.
    • (ii) Messung von Proteinkinasen:
  • Substrate:
  • (1) Pyr-Gly(oder Ala)-Glu-Asp-Glu-Tyr-Ala-Ala-Arg-Arg-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (2) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-Lys-Glu-Ser-Thr-Ser-Val-NH- (CH&sub2;)&sub2;-HH-Pyr
  • (3) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-Lys-Arg-Ser-Arg-Lys-NH-(CH&sub2;)&sub2;- NH-Pyr
  • (4) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-Lys-Asp-Thr-Pro-Ala-Leu-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (5) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-Lys-Val-Ser-Ser-Ala-Glu-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (6) Pyr-Gly(oder Ala)-Gly-Pro-Arg-Thr-Thr-Arg-Ala-Gln NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (7) Pyr-Gly(oder Ala)-Gly-Glu-Ser-Ser-Glu-Glu-Asp-β-Ala
  • (8) Pyr-Gly(oder Ala)-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro- NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (9) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-Lys-Ala-Ser-Gly-Pro-NH(CH&sub2;)&sub2;- NH-Pyr
  • (10) Pyr-Gly(oder Ala)-Ser-Gly-Ser-Phe-Lys-Leu-NH(CH&sub2;)&sub2; NH-Pyr
  • (11) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-(oder Lys)-Lys-Ser-Pro-Lys-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (12) N-Acetyl-Ser-Gly-Arg-Gly-NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (13) Pyr-Gly(oder Ala)-Thr-Arg-Ser-Ser-Arg-Ala
  • (14) Pyr-Gly(oder Ala)-Lys-Lys-Gly-Ser-Lys-Ala
  • (15) Pyr-Gly(oder Ala)-Pro-Ala- -Ser-Ala-Pro-Lys-
  • (16) N-Acetyl-Ser-Gly-Arg-Gly-Lys-NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (17) Pyr-Gly(oder Ala)-Lys(oder Arg)-Gln-Ile-Ser-Val(oder Ile)-Arg-Gly-NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (18) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg(oder Lys)-Glu-Ile-Ser-Val-Arg- NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (19) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-His-Gly-Ser-Lys-Tyr-Leu-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (20) Pyr-Gly-Arg-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-Arg-NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (21) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-Gly-Ser-Gly-Lys-Asp-Gly-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (22) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-Leu-Ser-Ile-Ser-Thr-Glu-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (23) Pyr-Gly(oder Ala)-Gln-Ser-Gly-Ser-Val(oder Ile)-Try- Pro-NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (24) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-Ala-Ile-Thr-Ala-Arg-Arg-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (25) Pyr-Gly(oder Ala)-Val-Lysser-Ser-Lys-Glu-NH-(CH&sub2;)&sub2;- NH-Pyr
  • (26) Pyr-Gly(oder Ala)-Val-Arg-Met-Ser-Ala-Asx-NH-(CH&sub7;)&sub7;- NH-Pyr
  • (27) Pyr-Gly(oder Ala)-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-HH-(CH&sub2;)&sub2;- NH-Pyr
  • (28) Pyr-Gly(oder Ala)-(Arg)-Arg-ser-Ser-Ser-Arg-(Pro)- NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (29) Pyr-Gly(oder Ala)-(Arg)-Val-serArg-(Arg)-NH-(CH&sub2;)&sub2;- NH-Pyr
  • (30) Pyr-Gly(oder Ala)-(Arg)-Ala-ser-Arg-(Arg)-NH-(CH&sub2;)&sub2;- NH-Pyr
  • (31) Pyr-Gly(oder Ala)-(Arg)-Arg-Ser-Ser-Arg-(Arg)-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • Das Zeichen * in einer Aminosäuresequenz kennzeichnet einen Teil, an dem eine Phosphorsäuregruppe durch eine Proteinkinase angelagert wird. Das heißt, wenn eine Proteinkinase auf das obengenannte Substrat einwirkt, wird eine Phosphorsäuregruppe an den mit * gekennzeichneten Teil angelagert und erzeugt eine von dem Substrat verschiedene Verbindung. Auf diese Weise wird die Verbindung abgetrennt, um die Aktivität der Proteinkinase zu messen.
    • (iii) Messung von Phosphatasen
  • Alle Substrate, die oben in Punkt (ii) genannt sind und Phosphorsäuregruppen an die mit * gekennzeichneten Teile anlagern, können als Substrate für Phosphatasen verwendet werden. Die Phosphatasen sind Enzyme, die genau entgegengesetzt zu den Proteinkinasen wirken und die in Proteinen oder Peptiden enthaltenen Phosphorsäuregruppen abspalten. Die Phosphorsäuregruppen aufweisenden Peptide dienen also als Substrate, und die durch Freisetzen der Phosphorsäuregruppen erhaltenen Peptide sind Produkte, die durch die Wirkung physiologisch wirksamer Substanzen entstanden sind.
    • (iv) Messung von Renin oder Angiotensintransferase (ACE-I)
  • Substrate:
  • (1) Pyr-Gly(oder Ala)-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe- His-Leu-Leu-Val-Tyr-Ser-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (2) Pyr-Gly(oder Ala)-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (3) Pyr-Gly(oder Ala)-His-Pro-Phe His-Leu
  • (4) Pyr-Gly(oder Ala)-His-Pro-Phe His-Leu-NH-(CH&sub2;)&sub2;- NH-Pyr
  • Das Zeichen ↓ in den Aminosäuresequenzen kennzeichnet die Stellen der Spaltung durch jedes Enzym. Das heißt, wenn jedes Enzym auf die obengenannten Substrate einwirkt, werden die Peptide gespalten, um zwei Arten von Peptiden neu zu bilden. Diese Produkte werden also getrennt, um die Aktivität jedes Enzyms zu messen.
    • (v) Messung verschiedener hormonregulierender Enzyme
  • (V-1) Messung des Post-Prolin spaltenden Enzyms Substrate:
  • (1) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-NH-(CH&sub2;)&sub2;- NH-Pyr (Hydrolyse von Bradykinin)
  • (2) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-Pro-Gly-NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr (Hydrolyse von L-HRH)
  • (3) -Tyr-Ile-Gln-Asn- -Pro-Leu-Gly-NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH- Pyr (Hydrolyse von Oxytocin)
  • (V-2) Messung von Pyroglutamatpeptidase Substrate:
  • (1) Pyroglutaminsäure-Gly-Pro-NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (2) Pyroglutaminsäure-Gly-Lys-NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (3) Pyroglutaminsäure-His-Pro-NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (4) Pyroglutaminsäure-His-Trp-NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr
  • (V-3) Messung anderer Enzyme Substrate:
  • (1) Pyr-Gly(oder Ala)-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe- Gly-Leu-Met-NH-(CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr (Substanz P)
  • (2) Pyr-Gly(oder Ala)-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr (Gastrin)
  • (3) Pyr-Gly(oder Ala)-Asp-Arg-Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-NH- (CH&sub2;)&sub2;-NH-Pyr (Cholecrystokinin)
  • Das Zeichen ↓ in den Aminosäuresequenzen kennzeichnet die Stellen der Spaltung durch die zu messenden Enzyme, und das Zeichen # kennzeichnet Stellen, an die Sulfonsäuregruppen durch die zu messenden Enzyme angelagert werden. Im ersteren Fall werden die durch die Spaltung neu gebildeten Peptide oder Aminosäuren abgetrennt, und im letzteren Fall werden die Peptide, an die Sulfonsäuregruppen angelagert sind, abgetrennt, um jeweils die Enzymaktivitäten zu messen.
  • Die Aktivität physiologisch wirksamer Substanzen kann unter den folgenden Bedingungen gemessen werden. Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders begrenzt, beträgt aber vorzugsweise etwa 20 bis 40ºC. Die Reaktionszeit wird dem Zweck entsprechend gewählt. Der pH-Wert der Reaktion wird dem Zweck entsprechend gewählt. Als Puffer zur Aufrechterhaltung des entsprechenden pH-Wertes für die Reaktion kann ein Phosphatpuffer verwendet werden, ein Tris(hydroxymethyl)amin- HCl-Puffer, ein Glycin-NaOH-Puffer, ein Good-Puffer, ein Acetatpuffer, oder dergleichen.
  • Substanzen, die durch die Wirkung der physiologisch wirksamen Substanzen entstanden sind, beispielsweise durch eine Anlagerungs-Abspaltungs-Reaktion, durch eine Hydrolysereaktion, durch Übertragung, etc., können wie folgt abgetrennt und gemessen werden. Wenn die Produkte in Abhängigkeit vom Grad der Änderung hydrophiler Eigenschaften oder hydrophober Eigenschaften abgetrennt werden, kann mit Normalphasenchromatographie oder mit Umkehrphasenchromatographie gearbeitet werden. Wenn sich das Molekulargewicht stark ändert, kann mit Gelchromatographie gearbeitet werden. Wenn es zu einer Modifikation ionischer Gruppen oder zu einer Demodifikation kommt, kann mit Ionenaustauschchromatographie gearbeitet werden. Wenn die Zuckerkette angelagert oder freigesetzt wird, oder wenn sich die spezielle Peptidstruktur ändert, kann das Prinzip der Affinitätschromatographie, etc. angewandt werden. Insbesondere wenn die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) zum Abtrennen und Messen verwendet wird, können die Ergebnisse in bemerkenswert vorteilhafter Weise in sehr kurzer Zeit erhalten werden.
  • Ein Beispiel der Bedingungen für die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie ist nachfolgend angegeben. Vorzugsweise wird ein chemisch gebundenes Kieselgel verwendet, in das eine Octadecylsilan-, Octylsilan-, Amino-, Phenyl-, Trimethylsilan-Gruppe oder eine ähnliche Gruppe eingeleitet wird. Als Elutionsmittel, entweder als isokratisches Elutionsmittel oder als Gradientenelutionsmittel, kann vorzugsweise Acetonitril, 1-Butanol, Methanol oder ein anderes Lösungsmittel verwendet werden, das mit einer Ammoniumacetat- Pufferlösung, einer Trifluoracetat-Pufferlösung oder einer anderen Pufferlösung versetzt ist und einen pH-Wert von 2,0 bis 6,0 besitzt. Es ist überflüssig zu sagen, daß das Elutionsmittel nicht darauf begrenzt ist. Die Fließgeschwindigkeit kann frei gewählt werden je nach der Säulengröße und der Trennleistung, sollte aber vorzugsweise 0,5 bis 2,0 ml/min betragen.
  • Die quantitative Bestimmung (oder der quantitative Nachweis) wird im allgemeinen mit einem Fluoreszenzverfahren durchgeführt. Die 2-Pyridylamino-Gruppe beispielsweise, die in dem für den Nachweise zu verwendenden Peptidderivat enthalten ist, ist geeignet, Fluoreszenz zu emittieren. Diese Verbindungen werden normalerweise gemessen unter Verwendung einer Wellenlänge des Anregungslichtes von 300 bis 330 nm und einer Wellenlänge des fluoreszierenden Lichtes von 350 bis 410 nm, wenn fluoreszierendes Licht verwendet wird.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Aktivität der physiologisch wirksamen Substanzen, die auf Peptide, Proteine, etc. einwirken, mit einer Spezifität und extrem hohen Empfindlichkeit gemessen werden (ein Reaktionsprodukt kann in mehreren Pikomol nachgewiesen werden), und ferner mit einer hohen Selektivität für die jeweilige Reaktion.
  • Die gemäß der Erfindung zu messenden physiologisch wirksamen Substanzen sind von Natur aus in lebenden Organismen vorhanden, so daß es sehr gut möglich ist, daß verschiedene Substanzen zum Zeitpunkt der Messung nebeneinander vorhanden sind. Wenn solche nebeneinander vorhandenen Substanzen die Messung der physiologisch wirksamen Substanzen nicht beeinflussen, gibt es kein besonderes Problem. Nachdem in der vorliegenden Erfindung aber Peptidderivate als Substrate für die Messung verwendet werden, wird dann, wenn Enzyme wie zum Beispiel Proteasen, Peptidasen, Phosphatasen, Elastase und dergleichen (nachfolgend bezeichnet als "störende Enzyme") nebeneinander vorhanden sind, die Messung unvermeidlich durch diese störenden Enzyme beeinflußt. Nachdem aber gemäß der Erfindung verschiedene Peptidderivate synthetisiert werden können, kann das Problem dadurch gelöst werden, daß man die Peptidderivate synthetisiert, indem man Aminosäuren entsprechend auswählt, die die Peptide bilden und kaum von den störenden Enzymen beeinflußt werden können. Manchmal kann es aber schwierig sein, solche Aminosäuren enthaltenden Peptidderivate zu verwenden, die sich je nach den zu messenden Substanzen für diese Bedingungen eignen. In einem solchen Fall wird die Verwendung eines Hemmstoffes für die störenden Enzyme ein derartiges Problem lösen. Als Hemmstoffe können jene verwendet werden, die die Enzymaktivität eines zu messenden Enzyms nicht hemmen, aber die daneben vorhandenen störenden Enzyme wirksam beeinflussen. Beispiele für solche Hemmstoffe sind Pepstatin, Phosphoramidon, Leupeptin, Antipain, Chymostatin, Elastatinal, Diisopropylfluorophosphat (DFP), N-Tosyl-L-phenylalanin-chlormethyl-keton (TPCK), N-α-p-Tosyl-L-lysin-chlormethyl-keton (TLCK), Antikörper für Enzymproteine, Sojabohnentrypsin-Hemmstoff, KaI- likrein-Hemmstoff, α&sub2;-Makroglobulin, etc. für Proteasen; Bestatin, Amastatin, etc. für Peptidasen; Forphenicin, etc., für Phosphatasen; und Esterastin für Esterasen.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert, in denen die folgenden Abkürzungen verwendet werden:
  • Pyr = Pyridyl Ser = Seryl
  • Gly = Glycyl Asp = Aspartyl
  • Ala = Alanyl Leu = Leucyl
  • Glu = Glutamyl Gln = Glutaminyl
  • Lys = Lysyl Phe = Phenylalanyl
  • Boc = t-Butoxycarbonyl Bzl = Benzyl
  • Cl-Z = Chloriertes Carbobenzoxy
  • DCC = N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
  • DCHA = Dicyclohexylamin TBA = t-Butylamin
    • Beispiel 1 Synthese von 2-Pyridylglycin
  • Eine 37%ige Formaldehydlösung in einer Menge von 8,2 g wurde zu einer wäßrigen Lösung von Natriumbisulfit in einer Menge von 10,8 g/16 ml H&sub2;O gegeben und 30 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Dann wurden dazu 9,4 g 2-Aminopyridin gegeben und eine weitere Stunde unter Rückfluß erhitzt. Dann wurde dazu eine wäßrige Lösung von Natriumcyanid in einer Menge von 10 g/50 ml H&sub2;O gegeben, um die Umsetzung bei 90ºC 4 Stunden unter Rühren durchzuführen. Die Reaktionslösung wurde gefiltert, und das Filtrat wurde 6 mal mit etwa 50 ml Chloroform extrahiert. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wurde die Chloroformschicht konzentriert und auskristallisiert. Die Kristalle wurden gefiltert und mit Ether gewaschen (Ausbeute etwa 7,2 g). Nach dem Auskristallisieren aus Chloroform erhielt man 2-Pyridylaminoacetonitril in einer Menge von 5,9 g (Ausbeute 44%). Die Hydrolyse von 2-Pyridylaminoacetonitril wurde 3 Stunden in 100 ml von 6N HCl durchgeführt, wobei unter Rückfluß erhitzt wurde, und anschließend wurde zum Auskristallisieren konzentriert. Die Kristalle wurden gefiltert, mit Ether gewaschen und aus Wasser auskristallisiert, so daß man 7,5 g 2-Pyridylglycin·Hydrochlorid erhielt (Ausbeute 90,1%).
  • ¹H-NMR (100 MHz, D&sub2;O): δ 4,3 (s, 2H, -CH&sub2;-), 6,8-7,0 (m, 2H, Pyridin H), 7,7-8,0 ppm (m, 2H, Pyridin H).
  • Elementaranalyse [Hydrochlorid] (als C&sub7;H&sub9;O&sub2;N&sub2;Cl)
  • C(%) H(%) N(%) Cl(%)
  • Gefunden 44,40 4,83 14,70 18,56
  • Errechnet 44,58 4,81 14,85 18,80
  • Maximale Wellenlänge der absorbierten UV-Strahlung:
  • γmax = 238, 310 nm
  • Anregungswellenlänge: Exmax = 318 nm
  • Maximale Emissionswellenlänge: Em.max = 360 nm
    • Beispiel 2 Synthese von 2-Pyridyl DL-Alanin
  • Einer wäßrigen Lösung von Natriumbisulfit in einer Menge von 10,5 g/20 ml H&sub2;O wurde eine 44%ige Acetaldehydlösung in einer Menge von 10 g zugegeben und 1 Stunde unter Rückfluß erhitzt. Dann wurden 9,4 g 2-Aminopyridin zugegeben, und es wurde weitere 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Eine wäßrige Lösung von Natriumcyanid wurde in einer Menge von 7 g/10 ml H&sub2;O zugegeben und bei 90ºC 2 Stunden umgesetzt. Die Ölschicht wurde abgetrennt und unter Abkühlen auskristallisiert (Ausbeute 11,6 g). Die Kristalle wurden aus Ethylacetat auskristallisiert zu α-(2-Pyridylamino)propionitril in einer Menge von 9 g (Ausbeute 67%).
  • Nach der Hydrolyse von 3 g des α-(2-Pyridylamino)propionitril in 50 ml von 6N HCl, wobei 5 Stunden unter Rückfluß erhitzt wurde, wurde die Reaktionslösung konzentriert, während die abgeschiedenen Kristalle (NH&sub4;Cl) entfernt wurden. Die konzentrierte Lösung wurde auf einem Ionenaustauschharz adsorbiert [Adsorptionsmittel: Dowex 50 H&spplus;, Säule: 1,6·12 cm]. Nachdem die Substanz gründlich mit Wasser gewaschen wurde, wurde sie mit einer 0,2 M Ammoniumacetatlösung eluiert, und gelbe Fraktionen wurden gesammelt und zur Trockene konzentriert. Um das Ammoniumacetat zu entfernen, wird Wasser zugegeben, und es wird wieder zur Trockene konzentriert. Nach Zugabe von konzentrierter Salzsäure wurde aus Wasser auskristallisiert, so daß man etwa 2 g Kristalle von 2-Pyridyl DL-Alanin·Hydrochlorid erhielt, einem Vorläufer des erfindungsgemäßen Substrates (Ausbeute 60%).
  • ¹H-NMR (100 MHz, D&sub2;O): δ 1,44, 1,52 (d, 3H, -CH&sub3;), 4,0-4,2 (q, 1H, - -), 6,8-7,0 (m, 2H, Pyridin H), 7,7-8,0 ppm (m, 2H, Pyridin H).
    • Elementaranalyse [Hydiochlolid] (als C&sub8;H&sub1;&sub1;O&sub2;N&sub2;Cl]
  • c(%) 14(96) H(%) Cl(%)
  • Gefunden 47,29 5,46; 13,69 17,48
  • Errechnet 47,42 5,47 13,83 17,50
  • Maximale Wellenlänge der absorbierten Uv-Strahlung:
  • γmax = 238, 310 nm
  • Anregungswellenlänge: Ex.max = 290 nm
  • Maximale Emissionswellenlänge: Em.max = 370 nm
    • Beispiel 3 Synthese von Pyr-Gly-Gly-OEt
  • Zu 9,4 mg (50 umol) von 2-Pyridylglycin·Hydrochlorid wurden 1 ml Dichlormethan, 50 umol DCC und
  • H&sub2;N-CH&sub2;- -OC&sub2;H&sub5;
  • in einer Menge von 70 umol/200 ul CHICl&sub3; zugegeben und bei Zimmertemperatur 3 Stunden umgesetzt. Die Farbe der Reaktionslösung änderte sich von Gelb in Dunkelblau. Nach dem Filtern der Reaktionslösung wurde das gewünschte Produkt durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) mit einer Ausbeute von 38% dispergiert.
  • HPLC [Säule: Füllstoff ODS - 120T (ein Handelsname, hergestellt von Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.), 7·250 mm); Elutionsmittel 25% CH&sub3;CN- 0,01M NH&sub4;OAc (pH = 5,6); Fließgeschwindigkeit 3ml/min]
    • Eluierungszeit: 6,2 Min.
  • ¹H-NMR (100 MHZ, CDCl&sub3;): δ 1,20-1,34 (t, 3H, -CH&sub3;), 2,9 (breites S., 1H, -C- - ), 4,0-4,3 (m, 6H, -CH&sub2;-), 5,25 (breites S., 1H, Pyr- -C-), 6,4-6,8 (m, 2H, Pyridin H), 7,4-7,6 ppm (m, 2H, Pyridin H).
    • Beispiel 4 Synthese von Leu-NH-CH&sub2;CH&sub2;-NH-Pyr
  • Eine Mischung aus 12 g (10 ml) 2-Chlorpyridin und 100 ml Ethylendiamin wurde 5 Stunden unter Rückfluß erhitzt, und dann wurde nichtumgesetztes Ethylendiamin unter vermindertem Druck abdestilliert. Nachdem der Rückstand in 1H NaOH gelöst wurde, wurde die entstandene Lösung mehrmals mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wurde konzentriert. Es wurde Salzsäure zugegeben aus einem Hydrochlorid, und anschließend wurde zum Auskristallisieren Methanol zugegeben, so daß man 11 g N-(2-Pyridyl)-1,2-ethandiamin·Hydrochlorid erhielt (Ausbeute 91%).
  • ¹H-NMR (100 MHz, D&sub2;O): δ 3,4-3,5 (t, 2H, -CH&sub2;-C &sub2;-NH-Pyr), 3,8-3,9 (t, 2H, NH&sub2;-C &sub2;-CH&sub2;-), 7,0-7,3 (m, 2H, Pyridin H), 7,9-8,2 ppm (m, 2H, Pyridin H).
  • Dann wurden 250 mg Boc-LeuOH·H&sub2;O mit Benzol versetzt. Nachdem das Kristallwasser durch einen Verdampfer abgezogen wurde, wurde der Rückstand in 5 ml Chloroform gelöst, und anschließend wurden 206 mg DCC unter Rühren zugesetzt. Nach 20 Minuten wurde eine Chloroformlösung des zuvor synthetisierten N-(2-Pyridyl)ethandiamin in einer Menge von 206 mg/5 ml zugegeben, und anschließend wurde dies über Nacht umgesetzt. Nach dem Filtern der Reaktionslösung zum Entfernen einer Ausfällung wurde das Lösungsmittel durch Destillieren entfernt. Der Rückstand wurde in Chloroform gelöst und mit einer 2,5%igen wäßrigen Na&sub2;CO&sub3;-Lösung und mit Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Chloroformschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und konzentriert zu Boc-Leu-NH- CH&sub2;CH&sub2;-NH-Pyr.
  • Dies wurde mit 0,1 ml Anisol und 0,5 ml Trifluoressigsäure (TFA) unter Kühlen versetzt und bei 0ºC 2 Stunden umgesetzt, um die Boc-Gruppe abzuspalten. Nach Zugabe von Ether wurden ungelöste Substanzen gesammelt und in einem Exsikkator gut getrocknet, der KOH enthielt, so daß man Leu-NH-CH&sub2;CH&sub2;-NH- Pyr erhielt, einem Vorläufer des erfindungsgemäßen Substrates (Ausbeute etwa 70%).
  • ¹H-HMR (100 MHz, D&sub2;O): &delta; 0,85 (2, 6H -C(C &sub3;)&sub2;), 1,4-1,6 (m, 3H, -CH-C &sub2;C < ), 3,3-3,6 (m, 4H, -NH-C &sub2;-C &sub2;-NH-Pyr), 3,8-4,0 (t, 1H, NH&sub2;- -CO-), 6,7-7,0 (m, 2H, Pyridin H)&sub1; 7,6-7,9 ppm (m, 2H, Pyridin H).
    • Beispiel 5 Synthese von Pyr-Gly-Glu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Glu&beta;-Ala
  • Die Synthese erfolgte nach einem Festphaseverfahren, Wie es in J. Am. Chem. Soc., 95, 1310-1315 (1973) beschrieben ist.
  • Das heißt, mit 1 g Chlormethylpolystyrolharz [Divinylbenzol 2%, 100-200 mesh, Cl: 0,93 mmol/g] (hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurde 1/2 Äquivalentgewicht Boc-&beta;-Alanin nach einem herkömmlichen Verfahren eingeleitet, und dann wurde die Boc-Gruppe durch TFA abgespalten. Dann wurde jedes 3-fache Aquivalentgewicht von Boc-Aminosäure nach einem DCC-Verfahren in der folgenden Reihenfolge eingeleitet: Boc-Glu (OBzl), Boc-Phe·DCHA, Boc-Lys(Cl-Z)·TBA, Boc-Leu·H&sub2;O, Boc-Leu·H&sub2;O, Boc-Lys(Cl-Z)·TBA, Boc-Lys(Cl- Z)·TBA, Boc-Glu(OBzl) und das in Beispiel 1 erhaltene Pyr- Gly. Bei den obengenannten Boc-Phe·DCHA und Boc-Glu wurde die Kopplungsreaktion zweimal durchgeführt. Nachdem das Peptid von dem Harz durch HF-Behandlung abgetrennt wurde, und nachdem Bzl, Z und einzelne Schutzgruppen gespalten wurden, erhielt man Pyr-Gly-Gln-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Glu-&beta;-Ala durch Gelfiltration unter Verwendung von Toyo Pearl HW 40 (ein Handelsname, hergestellt von Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.). Dieses Produkt wurde durch eine Hochleistungs- Flüssigkeits-Chromatographie gereinigt (Ausbeute 55%).
  • Durch ein Massenspektrum der Verbindung nach der HF-Behandlung war es möglich, den Spitzenwert des Molekulargewichts gut auf den errechneten Wert von 1329 abzustimmen.
  • Analysewerte der Aminosäure: Glu 2,1, Leu 2,0, Phe 1,0, Lys 3,0 und &beta;-Ala 1,2.
    • Beispiel 6 Messung von Elastase unter Verwendung von Pyr-Gly-Glu-Lys- Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Glu-&beta;-Ala als Substrat [Herstellung von Reagenslösungen] (1) Substratlösung
  • Eine Substratlösung wurde hergestellt durch Lösen von 1,2 mg Pyr-Gly-Glu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Glu-&beta;-Ala, das in Beispiel 5 hergestellt wurde, in 50 ml von 0,01 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Pufferlösung (pH = 8,0).
    • (2) Enzymlösung
  • Eine Enzymlösung wurde hergestellt durch Lösen von 3,6 mg Elastase (gewonnen aus Schweinepankreas, hergestellt von Sigma Chemical Co.) in 100 ul von 0,01 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Pufferlösung (pH = 8,0).
    • [Meßverfahren]
  • 200 ul der Substratlösung wurden mit 5 ul der Enzymlösung versetzt und bei 37ºC in einem Bad mit konstanter Temperatur stehengelassen.
  • Nach jeweils 20, 40, 60, 120 und 180 Minuten wurden 10 ul der Reaktionslösung entnommen und mittels Hochleistungs- Flüssigkeits-Chromatographie analysiert.
    • < Analysebedingungen,
  • Säule: für Umkehrphasenchromatographie, an Octadecylsilylgruppen gebunden, DDS-120 T (hergestellt von Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.), 4·150 mm
  • Eluierungsbedingungen:
  • Flüssigkeit A: Eine 6%ige wäßrige Acetonitrillösung mit 0,05% Trifluoressigsäure
  • Flüssigkeit B: Eine 24%ige wäßrige Acetonitrillösung mit 0,05% Trifluoressigsäure
  • Es wurde eine lineare Gradientenelution der Flüssigkeit A und der Flüssigkeit B bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min von 0 Minuten bis 15 Minuten durchgeführt.
  • Nachweis:
  • Fluoreszierendes Licht: Anregungswellenlänge 310 nm Emissionswellenlänge 370 nm
    • [Meßergebnisse]
  • Fig. 1 zeigt die Ergebnisse, die bei einer Hochleistungs- Flüssigkeits-Chromatographie gemessen wurden. Fig. 1(a) zeigt ein Diagramm eines Blindversuchs und Fig. 1(b) zeigt ein Diagramm 2 Stunden nach Beginn der Umsetzung.
  • Wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, werden durch die Umsetzung zwei Spitzen (A) und (B) erzeugt. Aus den Ergebnissen der Aminosäureanalyse gehen diese Spitzen als (A) = Pyr-Gly-Gln- Lys-Lys-Leu und als (B) = Pyr-Gly-Gln-Lys-Lys-Leu-Leu hervor. Daraus wird ersichtlich, daß Elasterase das Substrat an zwei Stellen hydrolysiert.
  • Aufgrund der quantitativen Bestimmung von (A) zeigte sich ferner, daß der zeitliche Verlauf linear war im Bereich von 40 Pikomol oder weniger. Dieser zeitliche Verlauf ist in Fig. 2 dargestellt.
    • Beispiel 7 Synthese von Pyr-Gly-Gly-Glu-Ser-Ser-Glu-Glu-Asp-&beta;-Ala
  • Die Synthese erfolgte nach dem in J. Am. Chem. Soc., 95, 1310-1315 (1973) offenbarten Festphaseverfahren in der gleichen Weise wie in Beispiel 5.
  • Das heißt, unter Verwendung von 1 g Chlormethylpolystyrolharz [Divinylbenzol 2%, 100 bis 200 mesh, Cl: 0,93 mmol/g, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.], wurde 1/2 Äquivalentgewicht Boc-&beta;-Alanin nach einem herkömmlichen Verfahren eingeleitet, und anschließend wurde die Boc-Gruppe durch TFA abgespalten. Dann wurden 3-fache Äquivalentgewichte von Boc-Aminosäuren nach dem DCC-Verfahren in der folgenden Reihenfolge eingeleitet: Boc-Asp(OBzl), Boc- Glu(OBzl), Boc-Glu(OBzl), Boc-Ser (OBzl)&sub1; Boc-Ser (OBzl), Boc-Glu(OBzl), Boc-Gly und Pyr-Gly. Davon wurde die Kopplungsreaktion für Boc-Glu(OBzl) zweimal durchgeführt. Nachdem das Peptid durch HF-Behandlung von dem Harz abgespalten wurde, und nachdem Bzl, Z und einzelne Schutzgruppen gespalten wurden, erhielt man Pyr-Gly-Gly-Glu-Ser-Ser-Glu-Glu-Asp&beta;-Ala durch Gelfiltration mit Toyo Pearl HW 40 (ein Handelsname, hergestellt von Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.). Diese Substanz wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeits- Chromatographie gereinigt (Ausbeute 58%).
  • Analyse der Aminosäuren:
  • Glu 3,0, Ser 1,8, Asp 1,1 und &beta;-Ala 1,2, Gly 1,0.
    • Beispiel 8
  • Messung der Aktivität von Proteinkinase unter Verwendung von Pyr-Gly-Gly-Glu-Ser-Ser-Glu-Glu-Asp-&beta;-Ala als Substrat
    • [Herstellung von Reagenslösungen] (1) Pufferlösung
  • Eine Pufferlösung wurde hergestellt, indem in 80 ml Wasser 272 mg Imidazol, 142 mg Magnesiumchlorid, 1,1 g Kaliumchlorid, 76 mg Glycoletherdiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure und 12 mg Adenosin-3-phosphorsäure gelöst wurden, anschließend HCl zugegeben wurde, um den pH-Wert auf 7,5 einzustellen, und eine Gesamtmenge von 100 ml hergestellt wurde.
    • (2) Substratlösung
  • Eine Substratlösung wurde hergestellt durch Lösen von 2,7 mg Pyr-Gly-Gly-Glu-Ser-Ser-Glu-Glu-Asp-&beta;-Ala in 3 ml Wasser.
    • (3) Probe
  • Eine Probe wurde hergestellt, indem gereinigte Proteinkinase, die aus menschlichen roten Blutkörperchen gewonnen wurde, in ausreichender Menge in der Pufferlösung nach Boivin et al: B.B.R.C. Bd. 89 (1), 7-16 (1979) gelöst wurde. Die entstehende Probe wurde unter Verwendung der Pufferlösung weiter verdünnt auf die Verdünnungsverhältnisse von 1/4, 2/4, 3/4 und 4/4.
    • [Meßverfahren]
  • Nach Zugabe von 10 ul der Substratlösung zu 20 ul der Pufferlösung wurden jeweils 10 ul der Probe zugegeben und bei 30ºC 1 Stunde umgesetzt. Dann wurden jeweils 4 ul als Probe entnommen und mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert.
    • [Analysebedingungen]
  • Säule: Füllstoff, für Umkehrphasenchromatographie mit einer gebundenen Octadecylsylylgruppe, ODS, S-5, hergestellt von Yamamura Kagaku K.K., 4·150 mm
  • Eluierungsbedingungen:
  • Elutionsmittel: eine wäßrige Lösung von 0,05%iger Trifluoressigsäure mit 10% Acetonitril
  • Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
  • Nachweis:
  • Fluoreszierendes Licht: Anregungswellenlänge 320 nm
  • Emissionswellenlänge 410 nm
    • [Meßergebnisse]
  • Die Fig. 3(a) und 3(b) zeigen die Ergebnisse, die mit Hilfe der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie gemessen wurden. Fig. 3(a) zeigt ein Diagramm eines Blindversuchs, und Fig. 3(b) zeigt ein Diagramm bei Verwendung der 1:2 verdünnten Probe. Wie aus Fig. 3 ersichtlich ist, entsteht durch die Umsetzung eine Spitze (A). Die quantitative Analyse von Phosphor ergab, daß die Spitze (A) durch die Phosphoroxidation des Substrates entsteht. Die entstandene Spitze (A) (Produktkonzentration) wurde gemessen im Hinblick auf das Verdünnungsverhältnis der Proben. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, erhält man eine lineare Beziehung.
  • Wie oben erwähnt, kann dann, wenn das Peptidderivat der Formel (I) oder (II) als Substrat zum Messen der Aktivität einer physiologisch wirksamen Substanz verwendet wird, die Aktivität der auf Peptide, Proteine, etc. einwirkenden physiologisch wirksamen Substanz mit einer Spezifität und einer extrem hohen Empfindlichkeit gemessen werden (das Reaktionsprodukt kann in der Größenordnung von mehreren Pikomol nachgewiesen werden), und ferner unter Auswahl der reagierenden Teile der physiologisch wirksamen Substanz.

Claims (8)

1. Verfahren zum Messen der Aktivität einer physiologisch wirksamen Substanz, in dem die physiologisch wirksame Substanz mit einem Substrat umgesetzt wird, die ein Pentidderivat mit 2 bis 15 Aminosäureeinheiten und durch die Formel 1 oder die Formel 11 dargestellt ist:
R¹-A¹-A-A²-R² (I)
R¹-A¹-A²-R² (II)
ist, in der A ein Aminosäurerest oder ein Peptidrest mit 2 bis 13 Aminosäureeinheiten ist; A¹ ein Aminosäurerest ist, in dem endständige N mit einem Substituenten R¹ vorbunden ist; R¹ ein Substituent ist, der aus Wasserstoff, einer Aminoschutzgruppe und einer Gruppe ausgewählt ist, die fluoresziert, wenn sie mit einer -NH--Gruppe kombiniert ist; und R² ein Substituent ist, der aus Hydroxyl, einer Carboxylschutzgruppe und Gruppen mit der Formel III:
-NH-Y-R³ (III)
ausgewählt ist, in der Y ein gerad- oder verzweigtkettiges C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylen oder ein Phenylen ist und R³ ein Substituent ist, der aus Pyridylamino, 3-Pyridylamino und Anilino ausgewählt ist, und der mit mindestens einer C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, Sulfonyl- oder Halogengruppe substituiert sein kann und Fluoreszenz emittieren kann, mit der Maßgabe, daß
(a) wenn R¹ Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe ist, R²-NH-Y-R³ ist und
(b) wenn R² Hydroxyl oder eine Carbonylschutzgruppe ist, R¹ weder Wasserstoff noch eine Aminoschutzgruppe ist; eine fluoreszierende Aminosäure oder ein fluoreszierendes Peptid, die bzw. das durch die Wirkung der physiologisch wirksamen Substanz erzeugt worden ist, abgetrennt wird und die Menge des Reaktionsprodukts gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe, die fluoresziert, wenn sie in R¹ mit einer -NH--Gruppe kombiniert ist, aus 2-Pyridyl und 3-Pyridyl ausgewählt ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ aus 2-Pyridylamino und 3-Pyridylamino ausgewählt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptidderivat aus 2-Pyridyl-Gly-Gly-OEt, 3-Pyridyl-Gly-Gly-OEt, 2-Pyridyl-Gly-Glu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys- Glu-p-Ala, 3-Pyridyl-Gly-Glu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Glu-B- Ala, 2-Pyridyl-Gly-Gln-Ser-Ser-Gln-Gln-Asp-B-Ala und 3-Pyridyl-Gly-Gln-Ser-Ser-Gln-Gln-Asp-B-Ala ausgewählt ist.
5. Verfahren noch einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Abtrennen und Messen durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatograhie durchgeführt werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die physiologisch wirksame Substanz eine Peptidase oder Protease ist, die Peptidbindungen hydrolysiert, oder eine Transferase, die bei Peptiden oder Aminosäuren eine Übertragungsreaktion bewirkt, oder eine Phosphatase, die eine Abspaltung von in Proteinen oder Peptiden enthaltenen Phosphorsäuregruppen bewirkt, oder ein Enzym, das zu in Proteinen oder Peptiden enthaltenen Asparaginylresten Zuckerketten hinzufügt, oder ein Enzym, auf in Proteinen oder Peptiden zugesetzten Zuckerketten im Sinne einer Beschleunigung der Reaktion oder Vergrößerung der Zuckerketten einwirkt, oder ein Enzym, das eine Modifikation oder Demodifikation einer Sulfonsäuregruppe, Schwefelsäuregruppe, Methylgruppe oder Acylgruppe für Proteine oder Peptide bewirkt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die physiologisch wirksame Substanz Elastase ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die physiologisch wirksame Substanz Proteinkinase ist.
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