DE2747853C2

DE2747853C2 - Verfahren zum quantitativen Messen von angiotensinumwandelnder Enzymaktivität

Info

Publication number: DE2747853C2
Application number: DE2747853A
Authority: DE
Inventors: Alfred Miami Fla. Chung; James Walter Ryan
Original assignee: VENTREX LABORATORIES Inc PORTLAND ME US
Current assignee: VENTREX LABORATORIES Inc PORTLAND ME US
Priority date: 1977-05-10
Filing date: 1977-10-26
Publication date: 1986-11-13
Also published as: DE2760343C2; US4115374A; DE2760343A1; DE2760342A1; DE2747853A1; DE2760342C2; CA1129847A; GB1555832A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum quantitativen Messen von angiotensinumwandelnder Enzymaktivität nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Angiotensinumwandelndes Enzym (Peptidyldipeptidhydrolase, nachstehend als ACE bezeichnet) ist befähigt, das Decapeptid, Angiotensin I, mit der Sequenz
50

AspArgValTyrllcHisProPheHisLeu |

in ein Octapeptid, Angiotensin II, durch Abspaltung des Dipeptids HisLeu vom C-terminalen Ende umzuwun- ||

dein. Die im vorliegenden verwendeten Symbole für verschiedene chemische Bezeichnungen werden in nachstehender Tabelle wiedergegeben:

Tabelle I
60

Ala	= L-Alanin
Arg	- L-Arginin
Asp	= L-Asparaginsäure
Gin	= L-Glutamin
<Glu	= Pyro-L-glutaminsäure
GIy	= Glycin
Hip	= Hippursäure (Benzoylglycin)
His	= L-Histidin
He	= L-Isoleiicin
Leu	= L-Leucin

l-'ortsetzung

Lys - L-Lysin

Pile = L-Phenylalanin

Pro - L-Prolin

Scr = L-Serin

Trp = L-Tryptophan

% Tyr = L-Tyrosin

VaI- L-Valin

ACE = angioten^inumwandelndes Enzym ίο

J Bicine = N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin

EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure

Hepes = N-2-Hydroxyetbylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure

HPP = p-Hydroxyphenylpropionyl

ACE katalysiert außerdem die Hydrolyse der vorletzten Peptidbindung am endständigen C einer Vielzahl von

acylieren Tripeptiden und größeren Polypeptiden mit einer nichtblockierten Carboxylgruppe. Die Peptidhy-

?! drolyse kann schemalisch folgendermaßen dargestellt werden:

Ii --Λ,— A, + H,O * R-OH + H —A,— A,

worin A, eine Aminosäure an der endständigen Carboxylgruppe des Peptids, Ai eine durch eine Peptidbindung mit Λ ι verknüpfte Aminosäure und R eine durch eine Peptidbindung mit A_: verknüpfte N-substituierte Aminosäure bedeuten. Die Wirkung von ACE resultiert in einer hydrolytischen Spaltung der vorletzten Peptidbindung von der endständigen Carboxylgruppe und ergibt als Reaktionsp.odukte ein Dipeptid, HAjA₁, und einen kleinen Rest oder eine Spur R-OfI. Die Reaktivität des Enzyms schwankt merklich in Abhängigkeit vom Substrat. Mindestens eine Art von Peptidbindung, die das Stickstoff vom Prolin bekommt, wird überhaupt nicht hydrolysiert. Die scheinbare Michaelis-Konstante (Km) schwankt von Substrat zu Substrat über mehrere Größenordnungen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ei η genaueres Verfahren zum Messen vonangiotensinumwandeln- ■. der f.n/ymüktivität bereitzustellen.

♦ Diese Aufgabe wird bei einem gattungsgemäßen Verfahren durch die kennzeichnenden Merkmale des ^{< Anspruchs I gelöst.

h rfindungsgemäß werden neue Substrate für angiotensinumwandelndes Enzym (ACE) eingesetzt, die es zum ersten Mal möglich machen, das Enzym zu bestimmen, indem man die Radioaktivität des Rest-oder Spurenproduktcs mißt, das aus der enzy matischen Hydrolyse der vorletzten Peptidbindung an der endständigen Carboxygruppe des Peptidsubstrats entsteht. Diese Substrate sind so beschaffen, daß das Restprodukt fast quantitativ aus

• dem Serum durch ein aprotisches organisches Lösungsmittel extrahiert wird, während das -lichthydrolysierte Substrat n' r gering, wenn überhaupt extrahiert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der

beschriebenen Substrate ist für die Verwendung in klinischen -ind Forschungslaboratorien bestimmt. Derartige Bestimmungen können auf unfraktionierten biologischen Materialien, die ACE enthalten, wie Serum, durchge-■ führt werden. Sie sind empfindlich, quantitativ, leicht durchzuführen und reproduzierbar.

Bei dem Bestimmungsverfahren werden Proben von biologischem Material, worin der ACE-Gehalt m messen ist, mit einem Reaktionspuffer verdünnt, wobei optimale ionische und pH-Bedingungen für Jas jewe.lige verwendete Substrat geschaffen wc;den. Dem Gemisch wird ein radioaktives Substrat mit einer zuvor gemessenen spezifischen Aktivität zugesetzt, das dann eine angemessene Zeit und bei einer angemessenen Temperatur inkubiert wird. Die Reaktion wird dann durch Zugabo eines geeigneten Inhibitors gestoppt und das Reaktionsgemisch mit einem abgemessenen Volumen eines aprotischen organischen Lösungsmittels extrahiert. Eine aliquote Menge des Losu.igsmittels, die alles radioaktive Spurenreaktionsprodukt, das durch die Wirkung des Enzyms erhalten wurde, enthält, wird direkt in eine Scintillationsphiole zum Messen der Radioaktivität gegeben Die .'inzymaktivität kann aus der Kenntnis der Gesamtradioaktivität und der Menge des Substrats in der I'robe, der Menge der Radioaktivität in dem aliquoten organischen Lösungsmitte! und der Inkubationszeit berechnet werden, nachdem entsprechende Korrekturen für die radioaktive Zählleistung, die Hintergrundszählungen einschließlich der Zählungen, die Tür durch das Lösungsmittel extrahiertes hydrolysiertes Substrat veianiwortlich sind, und Größe der aliquoten Menge durchgeführt wurden. Das Ergebnis kann in Nanomol des « hydrolysieren Substrates je Minute je Milliliter des biologischen Materials ausgedrückt werden.

/u den erfindungsgemäß verwendbaren Substraten gehören Peptide, worin die markierte Spur ¹⁴C oder Tritium, d. h. /(-Strahlung emittierende Isotope, enthält und Peptide, die mit ^ι:Ί .narkiert sind, ein y-emittierendes Isotop. Das Messen der Radioaktivität kann somit mit praktisch jeder Art von Zähleinrichtung durchgeführt werden, die eine feststehende Geometrie hat und die sich zum quantitativen Zählen eignet.

Die mit der Probenherstellung und der Aufarbeitung verbundenen Handhabungen lassen sich iei.jht durchführen. Wenn eine lstündige Inkubationszeit angewandt wird, lassen sich Ergebnisse nach insgesamt 1,5 Stunden erzielen. Mit der Methode ist es möglich, nur 8 Einheiten Enzym je ml unter Anwendung der Bestimmungsbedingungen des Beispiels 1 mit Ή-HipGlyGly als Substrat zu messen. Größere Empfindlichkeit kann erzielt werden durch längere Inkubationszeit oder die Verwendung eines Substrats, wie ³H-BenzoylProPheArg, mit einem niedrigerem Krr.. Der Ausdruck »Enzymeinheit«, wie er im vorliegenden verwendet wird, bezeichnet die Menge an Aktivität, die die Umwandlung eines Nanomols Substrat je Minute je Milliliter katalysiert. Seine Bedeutung wird weiterhin durch die Tatsache offensichtlich, daß normales Humanserum etwa 85 bis 120 Ein-

heiten je ml unter Verwendung von HipGlyGly als Substrat enthält.

Zu den Vorteilen der vorliegenden Methode gehören: Vereinfachung des Verfahrens, Verringerung der zur Durchführung der Bestimmung erforderlichen Zeit, der Wegfall von umständlichen und zeitraubenden Trennstufen, keine Abhängigkeit von nachfolgenden Reaktionen mit einem Reaktionsteilnehmer, keine Störung § durch andere im zu bestimmenden Gemisch vorliegende Materialien, verbesserte Gewinnung aufgrund einer | Reduktion der Fluidtransferstufen, hohe Empfindlichkeit durch Radioisotopenmessungen und direkte Auswertung, ohne sich mit Standardkurven zur Interpretation der Ergebnisse aufhalten zu müssen.

Die erfindungsgemäß verwendbaren Substrate besitzen die Eigenschaft, von ihrem ACE katalysierten Hydrolyseprodukt durch Extraktion mit einem aprotischen organischen Lösungsmittel abtrennbar zu sein. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat weitestgehend im Extraktionslösungsmittel unlöslich, und das Spurenreaktionsprodukt ist im wesentlichen quantitativ extrahierbar. Jedoch könnte die Erfindung auch auf andere Weise durchgeführt werden, wie beispielsweise unter der Voraussetzung, daß das Dipeptidreaktionsprodukt extrahierbar wäre, so daß ein markiertes Dipeptid nach der Extraktion gemessen werden könnte. Ferner könnte das Substrat lösungsmittelextrahierbar sein, während das markierte Produkt dies nicht ist, so daß die Reaktion durch Beobachtung des Verschwindens des Substrates gemessen werden könnte. Andere Ausführungsformen innerhalb der vorliegenden Erfindung, die voraussichtlich unter Anwendung zur Zeit bekannter Verfahren entwickelt werden könnten, könnten beispielsweise in einer radioaktiven Markierung in einem Teil des Substrates, das dazu bestimmt ist, eines der enzymatischen Spaltprodukte zu werden, bestehen und in einem von dessen enzymatischen Spaltprodukten abtrennbaren Substrat.

Nichtradioaktive erfindungsgemäß verwendbare Substrate können ebenfalls zum Messen der ACF.-Aktivilät verwendet werden. Beispielsweise könnte die extrahierte Komponente die Fähigkeit besitzen, mil einem Reagens unter Bildung einer Farbe oder einer Fluoreszenz zu reagieren.

Die bevorzugt einzusetzenden Substrate der Erfindung besitzen folgende Eigenschaften:

(a) Sie lassen sich mit dem Enzym verknüpfen unter Bildung eines reversiblen Enzym-Substrat-Komplexes §

mit einer genügend niedrigen Dissoziationskonstante, um sicberzustellen, daß die Enzymreaktion in einer |

annehmbaren Geschwindigkeit erfolgt; |

(b) sie sind durch das Enzym hydrolysierbar, wobei sie vorzugsweise nur eine empfindliche Pep tidbindung auf- |

weisen; ζ

(c) sie enthalten radioaktive Markierung, die vollständig an der endständigen N-Stelle der empfindlichen Pep- |

tidbindung eingearbeitet isi; *'

(d) sie sind weitestgehend in dem zum Extrahieren des Spurenproduktes verwendeten organischen Lösungs- |' mittels unlöslich und |

(e) sie liefern ein Spurenprodukt, das in das organische Lösungsmittel im wesentlichen quantitativ hinein- | extrahiert werden kann. J

Diese Kriterien werden erfüllt durch gewisse Derivate von iri- una letrapeptiaen, uie rauioanuv luümeue _s

aromatische Suostituenten an der endständigen Aminogruppe aufweisen. Drei solcher erfindungsgemäß verwendbarer Substrate sind:

■H-Hippurylglycylglycinf'H-HipGlyGly),

-I-p-Hydroxyphenylpropionylglycylglycylglycinf'-^I-HPPGlyGlyGlyJund 'H-Benzoylprolylphenylalanylarginin (³H-BenzoylProPheArg):

OH OH OH O

C-N-CHj-C-N-CH₂-C-N-CH₂-C-OH

( H-i-iipiiiyuiy)

OH OH OH O

Il I Il I I I Il

^V-CH₂CH₂-C-N-CH₂-C-N-CH₂-C-N-CH₂-C-Oh

ho'

(''⁵I-HPPGIyGIyGIy)

	27	H ι	47	853
O Il	-Ν —CH- I	0 Μ	H 0 I Il
Il C-	I CH₂	Il C —	N — CH- C — OH I
	(O)		(CH₂)₃
	Il	NH C / V .N NH

I'll-Ben/oylProPheArg)

Im Prin/ip lassen sich erfindungsgemäß alle radioaktiv markierten Peptid-Derivate einsetzen, Jie die vorstehend genannten generellen Kriterien erfüllen. Andere Aminosäuresequenzen können geeignet sein. Andere Radioisotopen, wie '^S und ¹¹I, können verwendet werden. Die Art des Substituenten am endständigen Stick-

terien weiterhin erfüllt bleiben.

Die die vorstehend beschriebenen Substrate verwendende Bestimmungsmethode kann im Prinzip bei jedem biologischen Material, das ACE enthält, durchgeführt werden, einschließlich durchtränktes Gewebe, Gewebehomogenate. Extrakte usw. Die Methode eignet sich besonders zur Bestimmung von ACE in Proben von klinischem Material, Serum, Urin und ähnlichem. Detaillierte Methoden wurden für die Analyse von Serum entwikkclt. Wenn die Scintillationszählung zum Messen der Radioaktivität angewandt werden soll, ist es erforderlich, nichthämolysiertes Blut zu erhalten, weil die Gegenwart von Hämoglobin im Serum die Wirksamkeit der Seintilliitionszählung auf eine Weise reduziert, die schwierig zu kompensieren ist.

Die für die Durchführung einer ACE-katalysierten Hydrolyse eines erfindungsgemäß verwendbaren Substrates optimalen Reaktionsbedingungen sind die gleichen, wie bisher für bekannte Substrate beschrieben wurden. Detaillierte Studien von optimalen Bedingungen unter Verwendung von HpGIyGIy als Substrat wurden von Do· -r et al., Biochim. Biphys. Acta 429,220 (1976) berichtet. Das pH-Optimum beträgt etwa 8,0, obgleich mehr als 50%ige maximale Aktivität im pH-Bereich von 7,0 und 9,0 in Gegenwart von 1 Mol NaCl erzielt wird. Wenn HipGIyGly oder I-HPPGlyGlyGly als Substrate verwendet werden, braucht das Enzym Chloridionen, obgleich diese Forderung teilweise durch das Vorliegen einer hohen lonenstärke erfüllt wird. Die Beziehung zwischen dem Chloridbedarf und dem Bedarf an Ionenstärke wurde bis jetzt noch nicht voll charakterisiert. Pufferzusammcnsetzungen beeinflussen die Enzymaktivität bedeutend. Phosphat wirkt inhibierend. Hepes, Bicine und Barbilalpuffcr sind geeignet, jedoch wird Hepes bevorzugt, weil es maximale Aktivität liefert. Bevorzugte Bedingungen von Pufferzusammensetzung, lonenstärke, pH-Wert und Temperatur werden im Beispiel 1 beschrieben. Wenn das Substrat Benzoyl-ProPheArg ist, beeinflussen Chloridionen und eine hohe Gesamtionenstärke die Geschwindigkeit der ACE-katalysierten Hydrolyse nicht besonders und können gegebenenfalls weggelassen werden. Der pH-Wert für eine brauchbare Enzymaktivität beträgt von 6,5 bis 8,7, wobei ein breites Plateau von maximaler Aktivität in einem Bereich zwischen 7,2 bis 8,5 liegt. Die optimale Substratkonzentration hängt von der scheinbaren Km für das Substrat, verglichen mit dem Km von möglicherweise konkurrierenden Substanzen in der Probe ab. Ein Substrat mit einem relativ niedrigen Km, wie'H-BenzoylProPheArg (Km 2 x 10~⁴ M), könnte geeigneterweise bei einer Konzentration, die unter seinem Km liegt, verwendet werden. Ein Substrat mit einem höheren Km könnte besser bei einer Konzentration größer als sein Km verwendet werden. Die bevorzugle Substratkonzentration für eine Standard-Serumbestimmung unter Verwendung von Ή-HipGlyGly als Substrat beträgt 8 x IO ' molar, etwa das l,3fache Km (vgl. Beispiel 1). ³H-HipGlyGly und ^i:5I-HPPGlyGlyGly sind bevorzugte Substrate zum Messen der ACE-Aktivität in Serum, weil sie unempfindlich sind gegenüber |

Serum-Carboxypeptidase, die andernfalls die Reaktion stören und anomale Ergebnisse liefern könnte. Weil sein |

Km das niedrigste von allen erfindungsgemäß verwendbaren Substraten ist, isi ³H-BenzoyIProPheArg das am meisten bevorzugte Substrat für Bestimmungen, in denen ACE-Aktivität niedrig ist und maximale Empfindlichkeit gewünscht wird. Außer, daß dieses Substrat gegenübe? konkurrierender Inhibierung weniger empfindlich ist, sind die mit diesem Substrat durchgeführten Bestimmungen potentieüerweise in der Lage, niedrigere ACE-Mengcn zu messen als die anderen hier beschriebenen Substrate. Außerdem ist sein Trennverhalten in einem aprotischen organischen Lösungsmittel außergewöhnlich günstig: nur etwa 3% gelangten in einem vorher durchgeführten Extraktionsversuch in Ethylacetat. Das Spurenprodukt Benzoylprolin war zu etwa 90% extrahiert.

Die Wirkung der Temperatur auf die ACE-katalysierte Reaktion ist ähnlich den allgemeinen enzymkatalysierten Reaktionen.

Eine etwa 2fach verringerte Reaktionsgeschwindigkeit kann für je 10⁰C Temperaturabfall erwartet werden. Eine obere Temperaturgrenze wird durch die Temperatur der Hitzeinaktivierung bestimmt. Grundsätzlich könnten die Bestimmungen bei Temperaturen zwischen etwa 20 bis 50⁰C durchgeführt werden. Eine Bestimmungstemperatur von 37°C wird bevorzugt, weil diese Temperatur den physiologischen Bedingungen entspricht und weil Daten, die bei 37°C erhalten werden, direkt mit Daten verglichen werden können, die von anderen auf diesem Gebiet arbeitenden berichtet wurden.

Die Reaktion kann durch jede geeignete Maßnahme, die in der Technik zur Beendigung von enzymkatalysierten Reaktion bekannt ist, beendet werden, solange derartige Maßnahmen die anschließende Extraktion des Spurenproduktes nicht stören. Die im vorliegenden bevorzugte Methode zur Beendigung der Reaktion ist die

Zugabe eines lOfachen Volumenüberschusses von O,1M Salzsäure.

Das Spurenreaktionsprodukt kann aus dem Reaktionsgemisch durch jedes aprotische organische Lösungsmittel extrahiert werden, das eine annehmbare quantitative Abtrennung des Produktes vom Substrat sicherstellt. Die Verwendung von Lösungsmitteln, die das Zählverfahren stören, ist zu vermeiden. Ethylacetat wird bevorzugt. Etwa 91% ³H-Hippursäure wird in Ethylacetat extrahiert. Die Extraktion kann mit Hilfe jeder geeigneten, dem Fachmann geläufigen Maßnahme durchgeführt werden, wie Schütteln, Rühren, Mischen usw. Die Phasentrennung erfolst zweckmäßigerweise durch Zentrifugieren. lOminütiges Zentrifugieren bei 1000 X G wird bevorzugt, entweder bei Raumtemperatur oder in einer gekühlten Zentrifuge. In einigen Fällen bildet sich eine Emulsion, die durch eine längere Zentrifugierungsstufe abgetrennt werden kann.

Eine geeignete Teilmenge der organischen Phase wird dann zum Zählen der Radioaktivität entnommen. Die Radioaktivität kann durch jede geeignete Maßnahme gezählt werden, die zur Erzielung quantitativer Ergebnisse bekannt ist. Scintillationszählen wird bevorzugt, jedoch lassen sich auch andere Techniken anwenden, wie Plattchenzählung (planchet counting), Streifenabtastung (strip scanning) und Autoradiographie. Die Wahl der Za'hlmethode wird bestimmt durch die Bedürfnisse des einzelnen Forschers oder Arztes und die verfügbaren Kinrichtungen.

Mögliche Störfaktoren sind Produktinhibierung und mögliche ACE-Inhibitoren im Serum. Es wurde beobachtet, daß Produktinhibierung in der Standardbestimmung (Beispiel 1) erfolgt, wenn das Produkt Dipepiid GIyGIy sich soweit angesammelt hat, daß etwa 20% oder mehr des Substrates hydrolysiert worden sind. Mit normalem Serum erfolgt eine derartig hohe Hydrolyse in einer 60minütigen Standardinkubation nicht. Jedoch wurde Produktinhibierung gelegentlich mit hochaktiven Sr Oidserumproben beobachtet, wobei man falsche, zu niedrige Werte erhielt. Die Fehler können dadurch korrig.ert werden, daß man die Bestimmung wiederholt unter Verwendung eines Serums, das zwei- oder mehrfach gegenüber der Standardverdünnung verdünnt wurde (vgl. Beispiel 1). Mögliche Störung durch ACE-Inhibitoren im Serum kann außerdem durch Verwendung einer Serumprobe erfolgen, die eine größere Verdünnung hat als die Standardprobe. Als allgemeine Vorsichtsmaßrcgel sollte jede Probe, die eine größere Aktivität als normal zeigt, mit einer verdünnteren Scrumprobe nochmals best Timt werden.
Na. hstehende Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Die nachstehende Probe veranschaulicht die bevorzugte Bestimmungsmethode, die Empfindlichkeit der Probe und die Km für³H-HipGlyGly. Der Reaktionspuffer enthielt 0,05 Mol Hepes,0,l Mol Natriumchlorid und 0,6 Mol Natriumsulfat bei einem pH-Wert von 8,0 (Hepes ist N^-Hydroxyethylpiperazin-N'^-ethansulfonsäure). Das Substrat, Ή-HipGlyGly, wurde im Reaktionspuffer bei einer Konzentration von 16 raM und einer spezifischen Radioaktivität von etwa 0,15 Millicuries/Millimol gelöst. Das Serum war aus frischem Vollblut nach Standardtechniken hergestellt worden. Die Zugabe von EDTA wurde vermieden, da EDTA ein potenter Inhibitor von ACE ist. Hämoiysierie Proben wurden bei dieser Bestimmung nicht verwendet. Serumproben konnten mindestens 1 Woche bei 2 bis 8°C oder mindestens 8 Wochen im gefrorenen Zustand vor der Bestimmung aufbewahrt werden. Für die Bestimmung wurden 50 al des Serums mit 200 al Reaktionspuffer verdünnt.

Alle Reaktionen wurden in Glasrohren wegen der möglichen destruktiven Wirkung von Ethylacetat auf Plastik durchgeführt.

Das Reaktionsgemisch bestand aus 50 al verdünntem Serum, einer geeigneten Menge einer Substratlösung je nach gewünschter Endsubstratkonzentration und einem Reaktionspuffer, der ausreichte, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 100 _:xl zu schaffen. Alle Reaktionsrohre wurden 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert. DU· Reaktionen wurden durch Zugabe von 1,0 ml 0,1 N Salzsäure beendet. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 1,0 ml Ethylacetat extrahiert, indem man 4 bis 5 Sekunden auf rotierende Weise rührte. Die Phasen wurden durch Zentrifugierung bei 1000 x G 10 Minuten lang getrennt. Eine 0,5 ml Probe der oberen Ethylacelatschichl wurde entnommen und in eine Scintillationsphiole, die 10 ml Scintillationsflüssigkeit (Riafluor, Handelsmarke New England Nuclear Corp., Boston, Mass.) enthielt, getan.

Eine Kontrollbestimmung der Hintergrundradioaktivität wurde angestellt unter Verwendung von 50 al des Reaktionspuffers anstelle des verdünnten Serums im Reaktionsgemisch. Der Zweck dieser Kontrolle bestand darin, die Anzahl an Gesamtzählungen, die fur die Hintergrundstrahlung verantwortlich sind, die nicht-spezifische Freigabe von Hippursäure und die Gegenwart von nicht-umgesetztem Substrat in der Ethylacetatphasc zu bestimmen. Weniger als 7% des ⁵H-HipGlyGly gelangte in die organische Phase. Die Gesamtradioaktivitäl wurde bestimmt durch Zählen einer Substratmenge, die derjenigen entsprach, die im Reaktionsgemisch direkt im Scintillationszähler verwendet worden war.

Die Reaktionsgeschwindigkeit, ausgedrückt als Nanomol des sich bildenden Produktesje Minute je Milliliter Serum wurde nach folgender Formel berechnet:

., _I/w. , , 800 nMol (cpm in der Probe - cpm in der Biindprobe) „ -

nMoI/Min./ml = - ττγγγ- τγτγ,—τ ^x ^

(Gesamt-cpm) (60 Mm.) (0,01 ml)

In dieser Formel bedeutet »nMol« Nanomol, »Min.« Minuten, »ml« Milliliter und »cpm« Radioaktivitätsziih-

lungen je Minute. Der Faktor 2 ist eine Korrektur für die Größe der Teilmenge. In dem Fall, in dem eine bedeutende Fraktion des Substrats hydrolysiert worden ist, und das Substrat ein solches ist, das in der organischen

Phase löslicher ist wie beispielsweise ^l:5I-HPPvJlyGlyGly wird eine modifizierte Formel angewandt, um der sich bei fortschreitender Reaktion verringernden Menge an extrahiertem Substrat Rechnung zu tragen:

iiMoI/Min./ml = 2 x

... .... · j η u -jr.·! u , /ι cpm in der BlindprobeN

800 nMol (cpm in der Probe - cpm in der Bindprobe) 1 - ——^ -

_ \ Gesamt-cpm /

(Gesamt-cpm) (60 Min.) (0,01 ml)

Die Ergebnisse werden in nachstehender Tabelle wiedergegeben: Tabelle II

•.Mol/Probe	[S] mM	1	Geschwindigkeit	1
		IS]	InMo!)	V
			(Min./ml)
0,909/0,1 ml	9,09	0,11	54,63	0,0183
0,727/0,1 m!	7,27	0,14	52,48	0,0191
0,545/0,1 ml	5,45	0,18	46,76	0,0214
0,364/0,1 ml	3,64	0,27	34,65	0,0289
3,1818/0,1 ml	1,82	0,55	19,83	0,0504
0,0909/0,1 ml	0,91	1,10	12,35	0,0810

Die reziproken Werte der anfänglichen Substratkonzentration, und der Reaktionsgeschwindigkeit wurden berechnet und gemäß der Lineweaver and Burke-Methode wie in der Figur geneigt, aufgetragen. Man erhielt eine gerade Linie, die die Ordinate bei einem Wert schnitt, der dem reziproken Wert der maximalen Geschwindigkeit der Enzymreaktion entsprach und die Abzisse bei einem Wert schnitt, der dem negativen reziproken Wert der scheinbaren Michaelis-Konstante entsprach. Der durch diese Methode berechnete Km-Wert für das Substrat HipGlyGly betrug 6,25 x 10 ' M. Dieser Wert stimmt generell mit dem von Dorer et al., vorstehend zitiert, angegebenen Km-Wert überein, der ein Km für HipGlyGly von 2,6 x 10 ^J M unter ähnlichen Reaktionsbedingungen unter Verwendung eines von Schweinelunge stammenden Enzvms berichtete. Daraus ist ersichtlich, daß Reaktionsgeschwindigkeiten von nur 12 Nanomol des hydrolysierten Substrates je Minute je Milliliter Serum leicht gemessen werden können.

Beispiel 2

Eine weitere Demonstration, daß die mit der vorliegenden Bestimmungsmethode im menschlichen Serum beobachtete Aktivität identisch mit derjenigen von ACE ist, erfolgte durch Beobachtung der Wirkungen von bekannten spezifischen Inhibitoren auf ACE. In dieser Reihe von Reaktionen verfuhr man nach Beispie! 1 mit dem Unterschied, daß die Substratkonzentration durchweg 8 mM betrug und die spezifischen Inhibitorsubstanzen der angegebenen Endkonzentration zugesetzt wurden. Bradykinin, Angiotensin I, BBP_5a und EDTA sind vorstehend beschrieben worden. BPP.,,, (SQ20881) ist ein Nonapeptid von Schlangengift mit der Seqiwnz <GluTryProArgProGlnIleProPro. Die Ergebnisse werden in Tabelle III gezeigt.

Tabelle III

Inhibierung des Serum-angiotensinumwandelnden Enzyms durch verschiedene Verbindungen*)

Verbindung

Kontrollprobe Bradykinin Bradykinin Bradykinin

Angiotensin I Angiotensin I Angiotensin I

BPP,„ (SQ20475) BPP_V (SQ20475) BPP... (SQ20475)

Endkonzentration	zlCPM	ACE-Aktivität
(M)	(Zählungen	als V der
	je Minute)**)	Kontrollgruppe
	3800	100
2,7 x 10"⁷	3267	86
2,7 x 10"	3165	83
2,7 X 10 ⁵	1553	41
9 X IC""	3057	81
9 X 10"	2557	67
4,5 x 10~⁵		34
9 x IO"⁸	3519	93
9 x I0"⁷	2440	64
4.5 x 10"	830	22

Fortsetzung	27 47 853	4CPM (Zählungen je Minute)**)	ACE-Aktivität als % der Kontrollgruppe
Verbindung	Endkonzentration (M)	2200 1410	58 37
BPP,_C (SQ 20881) BPPo„(SQ20881)	2,8 X 10~⁹ 9 X 10"^s

EDTA

9 X 10"

1178

31

*) Es wurden die im Beispiel 1 beschriebenen Standardbestimmungsbedingungen angewandt.
**) A CPM = (CPM der Verbindung - CPM der Blindprobe).

Die Ergebnisse stimmen überein mit früheren Ergebnissen von spezifischer Inhibierung von ACE durch die Verbindungen der Tabelle £11 und demonstrieren somit weiterhin, daß die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Methode gemessene Aktivität ACE ist Nebenbei bemerkt darf darauf hingewiesen werden, daß, nachdem Angiotensin I und Bradykinin als natürliche Substrate für ACE anzusehen sind, sie sich als konkurrierende Inhibitoren der ACE-katalysierten Hydrolyse des erfindungsgemäßen Substrats verhalten.

Beispiel 3

Dieser Versuch demonstriert die Präzision der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode. Wiederholungen von Serumproben von normalen Individuen mit ACE-Konzentrationen im niedrigen und mittleren Bereich von einem Patienten mit aktiver Sarcoidosis und von Meerschweinchenserum wurden unter Anwendung des in Beispiel 1 angewandten Standardbestimmungsverfahrens hergestellt. Die Ergebnisse mit einem 8-mM-Substntl von Wiederholungen innerhalb des gleichen Tages und von Tag zu Tag sind in Tabelle IV wiedergegeben.

Tabelle IV

Präzisionsdaten für die Bestimmung des angiotensinumwandelnden Enzyms

Mittlere
NanoMol/Min./ml

1 Standard Abweichung

Prozentualer

Verändcrungs-

koeffizient

Innerhalb eines Tages	19
Kontrollversuch mit Meerschweinchen	20
Unter Normal	20
Normal
Von Tag zu Tag	12
Meerschweinchenkontroi lversuch	12
Unter Normal	12
Positiv Sarcoid	20
Blindprobe

60	4,2
4,9	10,3
3,7	4,3
74,8	4,8
3,6	7,9
6,6	3,6
0,33	5,9

1448
48,3
86,2

1552
45
184
(5,5)

Die beobachtete Veränderlichkeit liegt innerhalb des erwarteten Bereiches Tür mikrochemische Analysen, zu denen volumetrische Übertragungen mit Pipetten gehören. Diese Ergebnisse bestätigen veröffentlichte Berichte, daß Serum ACE-Konzentrationen von Patienten mit aktiver Sarcoidosis höher sind als normale Konzentrationen. Normale Werte für ACE-Aktivität bei Erwachsenen im Alterzwischen 18 und 55 Jahrcr. betragen von 85 Einheiten/Milliliter bis 120 Einheiten/Milliliter. Jedoch können solche Normalwerte sich mit dem Aller verändern.

Beispiel 4

Die Synthese von ^i:<I-HPPGlyG!yGly erfolgte durch Mischen von 100 al einer Lösung, die 1,892 ηιμ GIyGIyGIy und 1,682 mg Natriumbiearbonat in Wasser enthielt, mit einer Lösung, die 2,723 x 10⁷ Zahlungen je Minute (gezählt bei30%Zählwirksamkeit) eines Bolton-Hunter-Reagens(¹²⁵Iod-p-hydroxyphenylpropionyl-N-hydroxysuccinimid von New England Nuclear Corp., Boston, Mass.) in 100 ul Tetrahydrofuran enthielt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Kühlschranktemperatur (etwa 4⁰C) inkubiert. Eine kleine Menge Benzol, die ausreichte, um das Gemisch homogen zu machen, wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde durch Dünnschichlchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemischs aus 9 Volumenteilen Benzol, I Teil Wasser und 9 Teilen Essigsäure getrennt. Die Radioaktivität fand man in einem großen Fleck an der Lösumjsmittcllront, wobei diese den radioaktiven Reaktionstcünehmer und ein wahrscheinliches Abbauprodukt davon darstellt, und einen kleineren Fleck fand man in der Nähe der Mitte des Chromatogramms, der das Produkt '-"¹I-

Tabelle V	cpm in der Ethylacetatphase	Netto-cpm im Produkt
Inkubationszeit (Min.!	27 205 40000 59182 69577	0 17 808 43 804 58044
0 15 30 60

I IPPGIyGIyCiIy darstellt. Der Produktfleck, wurde mit Methanol vom Chromatogramm eluiert und im gleichen Lösungsmittel aufbewahrt. Obgleich man annimmt, daß das radioaktive Produkt vorwiegend monosubstituiert in Bezug auf Iod ist, besteht die Möglichkeit, daß auch etwa 2 bis 3% des Diiodderivats vorliegen können.

Beispiel 5 S

Der nachstehende Versuch demonstriert die Einfachheit der Verwendung von '-'⁵I-HPPGIyGIyGIy als ein ACE-Substrat im erfindungsgemäSen Verfahren. Es wurden die in Beispiel 1 beschriebenen Standardbestimmungsbedingungen angewandt mit dem Unterschied, daß die ACE-Quelle Meerschweinchenserum war und die zugesetzte Substratmenge diejenige Menge war, die erforderlich ist, um 101,436 Gesamtzählungen pro Minute zu ergeben. Ausgedrückt als Masse liegt diese Menge gut unter dem Km für das Substrat. Proben wurden 15,30 und 60 Minuten inkubiert und eine nicht-umgesetzte Probe (0-Zeit) wurde verwendet, um die in das Ethylacetat extrahierte Substratmenge zu bestimmen. Nettozahlungen wurden berechnet auf der Basis, daß 27,2% des nichthydrolysierten Substrates in der Ethylacetatphase enthalten waren. Die Ergebnisse werden in nachstehender Tabelle V gezeigt.

Daraus ist ersichtlich, daß trotz eines bedeutenden Hintergrunds, der durch die Tatsache verursacht wird, daß 27,2% des nicht-hydrolysierten Substrats durch Ethylacetat extrahiert worden waren, bedeutende Substratumwandlung bei einer oOminütigen Inkubation unter Standard-ACE-Reaktionsbedingungen vorhanden ist.

Beispiel 6

IodbenzoylProPheArg wurde hergestellt, indem man zuerst 390 mg Propylphenylalanylnitroargininbenzylesler zusammen mit 98 mg 1-Hydroxybenzotriazol in Dimethylformamid vermischte und das Gemisch mit N-Ethylmorphoün bei 0⁰C neutralisierte. 200 g einer kalten Lösung von p-Iodbenzoesäure-N-succinimidylester wurden zugesetzt. Die Reaktionsteilnehmer wurden 1 Stunde lang in einem Eisbad gerührt und dann auf Raumtemperatur gebracht und über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatphase wurde einer Reihe von Waschungen in folgender Reihenfolge unterworfen: Wasser, 0,2 N HCI, gesättigtes NaCl, gesättigtes NaHCO₃,gesättigtes NaCI. Die Elhylacetatlösung wurde dann über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels blieb ein gummiartiges Material zurück, das mit einem o-Toüdin/Cl·.-Reagens reagierte, mit Ninhydrin nicht reagierte und als ein einzelner Fleck bei der Papierelektrophorese bei einem pH-Wert von 2,0 migrierte. Diese Eigenschaften zeigten an, daß das Material im wesentlichen das erwartete Produkt, nämlich p-Iodbenzoylpropylphenylalanylnitroargininbenzylester, war.

Das vorstehende Produkt wurde dann mit HF in Gegenwart von Anisol zur Entfernung der Schutzgruppen behandelt. Das dabei entstehende Peptid, p-Iodbenzoylpropylphenylalanylarginin, wurde durch Chromatographie an Sephadex G-10 (Sephadex, Handelsbezeichnung Pharmacia, Uppsala, Schweden) unter Verwendung von I5%igcr (V/V) wäßriger Essigsäure als Eluierungsmittel gereinigt. Der Peptid-Peak wurde durch Überwachen der Extinktion bei 280 nm nachgewiesen. Die Homogenität wurde durch Papierelektrophorese bei pH 2,0 und pi I 5,0 und durch Dünnschichtchromatographie in sieben verschiedenen Lösungsmittelsystemen bestätigt.

Das Peptid, p-Iodbenzoylpropylphenylalanylarginin, wurde der New England Nuclear Corp., Boston, Mass. übersandt zur Tritierung du^ch ein katalytisches Dehydrohalogenierungsverfahren in Gegenwart von Tritiumgas.

Das radioaktive Produkt wurde charakterisiert durch Chromatographie an Bio-Gel P2 (Bio-Gel, Handelsbezeichnung, Bio Red Laboratories, Richmond, Californien), Papierelektrophorese und Dünnschichtchromatographie. Eine Bio-Gel-P2-Säule mit 110 ml Säulenvolumen und 50 bis 55 ml Hohlvolumen wurde mit einer Probe des 'll-BenzoylProPheArg beschickt und mit einem Pyridin/Essigsäurepuffer, OJ Mol, pH 5,0, eluiert. Cileiche 2-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Ein Radioaktivitätspeak bei Rohr 43 wurde beobachtet, was einem Eluierungsvolumen von 86 ml entspricht. Keine anderen radioaktiven Peaks wurden beobachtet.

Eine Probe des³H-BenzoylProPheArg wurde auf einer Dünnschichtsilicagelplatte in einem Lösungsmittelsystem Chromatographien, das aus 150 Volumenteilcn n-Butanol, 26 Teilen Essigsäure und 24 Teilen Wasser bestand.' I I-BenzoylProPheArg besaß ein Rf von 0,32. Eine Vergleichsprobe von Benzoylprolin besaß ein R₁-VOn 0,55 im gleichen Lösungsmittelsystem.

Papicreleklrophorese wurde auf Whatman 3 MM Papier bei 1100 Volt und 10 bis 20 Milliampere je Stunde bei pH 2,0 und pH 5,0 durchgeführt. Der pH 2,0 Puffer enthielt 100 ml Diethylenglykol, 120 ml Essigsäure, 20 ml Ameisensäure und 760 ml Wasser. Der pH 5,0 Puffer enthielt 27,8 ml Eisessig. 32,2 ml Pyridin und Wasser zum Auffüllen auf 4 I Endvolumen. Bei pH 2,0 migrierte ³H-BenzoylProPheArg 6,6 cm relativ zum Arginin, das

Kontrollverbindung

EDTA 1 x ΙΟ"³

BPP,_ff(SQ20881) 3,3 x ΙΟ"⁵

Bradykinin 8,2 X 10"⁵

20 Angiotensin I 7,1 x 10"⁵

Die hier beschriebenen erfindungsgemäß verwendbaren Substrate machen es möglich, Bestimmungen der angiotensinumwandelnden Enzymaktivität mit größerer Geschwindigkeit und auf bequemere Weise durchzuführen, als dies bisher möglich war. Die Möglichkeit, derartige Bestimmungen durchzuführen ist von großer kli-25 nischer Nützlichkeit und von Interesse für Forschungsarbeiten. Zwei der erfindungsgemäß verwendbaren Substrate sind neue Verbindungen.

18 cm wanderte. Bei pH 5,0 migrierte ³H-BenzoylProPhe Arg 2,5 cm, verglichen mit 16,5 cm für Arginin.

Die Hydrolyse von 1,25 uM ³H-BenzoylProPheArg unter Anwendung des Standardreaktionsverfahrens des Beispiels 1 mit normalem Humanserum als ACE-Quelle wurde in Abwesenheit und in Gegenwart von konkurrierendem Substrat und eines Inhibitors gemessen. Die Ergebnisse werden in nachstehenderTabelle VI gezeigt. 5

Tabelle VI

Hydrolyse von ³H-BenzoyIProPheArg durch Normalhumanserurn: Wirkung auf verschiedene Verbindungen

Verbindung	Endkon-	Prozentuale ACE-
	zen'.ration	Aktivität bezogen
		auf Kontroll
		verbindung

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

10

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum quantitativen Messen von angiotensinumwandelnder Enzymaktivität in biologischem Maisnal mit Hilfe eines Substrats für das Enzym aus einem acylierten Peptid, das reversibel durch das Enzym gebunden wird, eine freie Carboxylendgruppe und eine Peptidbindung aufweist, die auf enzymkatalysierte Hydrolyse anspricht, wobei die Hydrolyse zur Bildung eines Peptidreaktionsproduktes und eines Spurenproduktes führt, wobei man das Substrat mit dem biologischen Material unter Bedingungen vermischt, unter denen das angiotensinumwandelnde Enzym katalytisch aktiv ist, das Gemisch aus biologischem Material und Substrat eine abgemessene Zeit lang inkubiert, das Spurenreaktionsprodukt abtrennt und mißt, dadurchgekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des Substrats ein radioaktives Isotop enthält, das ausschließlich in den Teil des Substrats eingearbeitet ist, der nach der enzymkatalysierten Hydrolyse zum Spurenprodukt wird und man die Radioaktivität des Spurenproduktes mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Substrat verwendet, das im wesentlichen in einem aprotischen organischen Lösungsmittel unlöslich ist, wobei das Spurenhydrolyseprodukt im wesentlichen von dem biologischen Material durch das aprotische organische Lösungsmittel quantitativ extrahierbar ist, daß man die Abtrennung durch Extrahieren des Gemischs mit dem aprotischen organischen Lösungsmittel durchführt und die Radioaktivität des Spurenproduktes in einem Aliquot des Lösungsmittelextraktes mißt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als aprotisches Lösungsmittel Ethylacetat verwefctit.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zu messende angiotensinumwandelnde Enzymaktivität die angiotensinumwandelnde Aktivität eines Peptidyldipeptidhydrolaseenzyms ist, daß man das Enzym mit dem radioisotop-markierten Substrat in einem optimale Bedingungen für die Enzymwirkung liefernden Reaktionsmedium vermischt, als Substrat-Peptid ein Peptid der allgemeinen Formel R-A₂-Ai verwendet, das im wesentlichen in einem aprotischen Lösungsmittel unlöslich ist, und durch die peptidyldipepüdhydrolase-katalysierte Reaktion unter Bildung von R-OH und H-A₂A, hydrolysiert zu werden vermag, wobei R-OH in einem aprotischen organischen Lösungsmittel löslich ist und mindestens ein Teil der R-Moleküle ein Radioisotop enthält, nach erfolgter Hydrolyse von R-A₂A, zu R-OH und H-A₂A, das R-OH-Produkt vom Reaktionsgemisch durch Extrahieren des Gemischs mit einem aprotischen organischen Lösungsmittel abtrennt und die Menge au extrahiertem radioaktivem R-OH mißt.

5. Verfahren nach einem d ~ vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Substrat-Peptid verwendet, worin R Hippuryl, A, Glycin und A₂ Giycyi bedeuten und als Radioisotop Tritium verwendet.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Substrat-Pcpiid verwendet, worin R Hippuryi, A, Glycin und A₂ Giycyi bedeuten und ais Radioisotop ^{! !}C verwendet.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Substral-

Peptid verwendet, worin R Iod-p-hydroxyphenylpropionylglycyl, A, Glycin und A₂ Giycyi bedeuten und als

Radioisotop ^I2'I verwendet.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Substral-Peptid verwendet, worin R Benzoylprolyl, A, Arginin und A₂ Phenylalanyl bedeuten und als Radioisotop Tritium verwendet.