DE2760342C2 - - Google Patents

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Description

Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen beschriebene Iod-p-hydroxyphenylpropionylglycylglycylglycin der Formel
Vorzugsweise enthält die Iod-p-hydroxyphenylpropionylgruppe ein radioaktives Isotop oder ist mindestens ein Teil der Iodatome ein radioaktives Iodisotop.
F. E. Dorer et al., Biochim. Biophys. Acta, 1976, 429 (1), 220-8 (CA 84, 148 861, 1976), beschreiben die Beeinflussung der Aktivität des angiotensinumwandelnden Enzyms aus Schweinelunge durch den pH-Wert und die Ionenstärke, wobei die Detektion unter Verwendung von Hippurylglycylglycin erfolgt.
A. T. Chin et al., Biochem. J., 1975, 149 (1), 297-300 (CA 83, 128 408, 1975), beschreiben die Aktivität der Schweinelungenkinase II unter Verwendung von ¹²⁵I-markiertem 8-Tyrosin-bradykinin.
Das erfindungsgemäße, radioaktiv markierte Peptidderivat kann als Substrat in einem Verfahren zum quantitativen Messen von angiotensinumwandelnder Enzymaktivität in biologischem Material eingesetzt werden, welches in der DE-PS 27 47 853 beschrieben ist. Das erfindungsgemäße, radioaktiv markierte Peptidderivat ermöglicht es zum ersten Mal, das angiotensinumwandelnde Enzym (ACE) zu bestimmen, indem man die Radioaktivität des Rest- oder Spurenproduktes mißt, das aus der enzymatischen Hydrolyse der vorletzten Peptidbindung vor der endständigen Carboxylgruppe des Peptidsubstrats entsteht. Dieses Substrat ist so beschaffen, daß das Restprodukt fast quantitativ aus dem Serum durch ein aprotisches organisches Lösungsmittel extrahiert wird, während das nichthydrolysierte Substrat nur gering, wenn überhaupt, extrahiert wird. Die Bestimmungsmethode unter Verwendung des erfindungsgemäßen, radioaktiv markierten Peptidderivates ist für die Anwendung in klinischen und Forschungslaboratorien bestimmt. Derartige Bestimmungen können auf unfraktionierten biologischen Materialien, die ACE enthalten, wie Serum, durchgeführt werden. Sie sind empfindlich, quantitativ, leicht durchzuführen und reproduzierbar.
Zu den Vorteilen derartiger Bestimmungen gehören weiterhin: Vereinfachung des Verfahrens, Verringerung der zur Durchführung der Bestimmung erforderlichen Zeit, der Wegfall von umständlichen und zeitraubenden Trennstufen, keine Abhängigkeit von nachfolgenden Reaktionen mit einem Reaktionsteilnehmer, keine Störung durch andere im zu bestimmenden Gemisch vorliegende Materialien, verbesserte Gewinnung aufgrund einer Reduktion der Fluidtransferstufen, hohe Empfindlichkeit durch Radioisotopenmessungen und direkte Auswertung, ohne sich mit Standardkurven zur Interpretation der Ergebnisse aufhalten zu müssen.
Das erfindungsgemäße Iod-p-hydroxyphenylpropionylglycylglycylglycin kann als radioaktives Isotop von Iod ¹²⁵I oder ¹³¹I enthalten. Das bevorzugte Isotop ist das γ-Strahlen emittierende ¹²⁵I.
Das erfindungsgemäße Substrat besitzt folgende Eigenschaften:
  • (a) Es läßt sich mit dem Enzym verknüpfen unter Bildung eines reversiblen Enzym-Substrat-Komplexes mit einer genügend niedrigen Dissoziationskonstante, um sicherzustellen, daß die Enzymreaktion in einer annehmbaren Geschwindigkeit erfolgt;
  • (b) es ist durch das Enzym hydrolysierbar, wobei es vorzugsweise nur eine empfindliche Peptidbindung aufweist;
  • (c) es enthält radioaktive Markierung, die vollständig an der entständigen N-Stelle der empfindlichen Peptidbindung eingearbeitet ist;
  • (d) es ist weitestgehend in dem zum Extrahieren des Spurenproduktes verwendeten organischen Lösungsmittels unlöslich und
  • (e) es liefert ein Spurenprodukt, das in das organische Lösungsmittel im wesentlichen quantitativ hineinextrahiert werden kann.
Das erfindungsgemäße Iod-p-hydroxyphenylpropionylglycylglycylglycin kann abgekürzt auch als
I-HPPGlyGlyGly
bezeichnet werden, worin HPP den p-Hydroxyphenylpropionylrest und Gly Glycin bzw. den Glycylrest bedeuten. Das bevorzugte erfindungsgemäße, radioaktiv markierte Peptidderivat ist
¹²⁵I-HPPGlyGlyGly
In dem Verfahren der DE-PS 27 47 853 ist ¹²⁵I-HPPGlyGlyGly ein bevorzugtes Substrat zum Messen der ACE-Aktivität in Serum, weil es unempfindlich gegenüber Serum-Carboxypeptidase ist, die andernfalls die Reaktion stören und anomale Ergebnisse liefern könnte.
Das erfindungsgemäße I-HPPGlyGlyGly kann durch Inkubation eines Gemisches von Lösungen von Glycylglycylglycin (GlyGlyGly) und Natriumbicarbonat in Wasser und Iod-p-hydroxyphenylpropionyl- N-hydroxysuccinimid in Tetrahydrofuran bei etwa 4°C und anschließende Trennung durch Dünnschichtchromatographie erhalten werden.
Das nachstehende Beispiel erläutert die Erfindung.
Beispiel
Die Synthese von ¹²⁵I-HPPGlyGlyGly erfolgte durch Mischen von 100 µl einer Lösung, die 1,892 mg GlyGlyGly und 1,682 mg Natriumbicarbonat in Wasser enthielt, mit einer Lösung, die 2,723×10⁷ Zählungen je Minute (gezählt bei 30% Zählwirksamkeit) eines Bolton-Hunter-Reagens (¹²⁵Iod-p-hydroxyphenylpropionyl-N- hydroxysuccinimid von New England Nuclear Corp., Boston, Mass.) in 100 µl Tetrahydrofuran enthielt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Kühlschranktemperatur (etwa 4°C) inkubiert. Eine kleine Menge Benzol, die ausreichte, um das Gemisch homogen zu machen, wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemischs aus 9 Volumeteilen Benzol, 1 Teil Wasser und 9 Teilen Essigsäure getrennt. Die Radioaktivität fand man in einem großen Fleck an der Lösungsmittelfront, wobei diese den radioaktiven Reaktionsteilnehmer und ein wahrscheinliches Abbauprodukt davon darstellt, und einen kleineren Fleck fand man in der Nähe der Mitte des Chromatogramms, der das Produkt ¹²⁵I-HPPGlyGlyGly darstellt. Der Produktfleck wurde mit Methanol vom Chromatogramm eluiert und im gleichen Lösungsmittel aufbewahrt. Obgleich man annimmt, daß das radioaktive Produkt vorwiegend monosubstituiert in bezug auf Iod ist, besteht die Möglichkeit, daß auch etwa 2 bis 3% des Diiodderivats vorliegen können.

Claims (3)

1. Iod-p-hydroxyphenylpropionylglycylglycylglycin der Formel
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil der Iod-p-hydroxyphenylpropionylgruppe ein radioaktives Isotop enthält.
3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil der Iodatome ein radioaktives Iodisotop ist.
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