CH642457A5 - Immunverfahren zur bestimmung von beta-endorphin. - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Immunverfahren nigtes ß-Endorphin in bekannter Weise behandelt, z.B. dem zur Bestimmung des kürzlich gefundenen wirksamen Opi- von Aubert et al., in Acta Endocrinology 77,460 (1974) be-
umagonists und Analgetikums ß-Endorphin. ß-Endorphin schriebene Lactoperoxidaseverfahren unterwirft.
wurde mit sehr hoher Reinheit aus Hypophysen von Kamelen l4C-ß-Endorphin kann hergestellt werden, indem man bei
(Li and Chung, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 73 1145; 1976), 50 der Synthese dieser Verbindung eine oder mehrere mit 14C
von Schweinen (Bradbury et al. Nature, London, 260,165; markierte Aminosäuren aus der ß-Endorphinsequenz
1976) und von Menschen (Li et al, Biochem. Biophys, Res. umsetzt.
Commun, 72,1542; 1976) isoliert. Die entsprechenden Struk- Eine geeignete Methode zur Herstellung von 3H-ß-Endor-
turen sind wie folgt: phin besteht darin, dass man in der Synthese Prolin durch
Kamel-ß-Endorphin (ßc-Endorphin oder ßc-EP) = H-Tyr- 55 3,4-Dehydroprolin ersetzt und das erhaltene Analogon in Ge-
Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu- genwart eines Palladiumoxidkatalysator mit Tritium be-
Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Asn-Ala-His-Lys- handelt.
Lys-Gly-Gln-OH Das Radioimmunverfahren wird durchgeführt, indem
Menschliches ß-Endorphin (ßh-Endorphin oder ßh- man das markierte ß-Endorphin, die Probe mit einem unbe-
EP) = H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln- 60 kannten Gehalt an ß-Endorphin und das Antiserum während
Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys- ungefähr 16 bis 20 Stunden in gepufferter Lösung inkubiert.
Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu-OH Das freie und das gebundene ß-Endorphin werden auf be-
Die Strukturen wurden durch Festphasesynthese [Li et al., kannter Weise getrennt, wie z.B. durch Zusatz von Aktiv-
Biochem. Biophys. Res. Commun., 71,19 (1976); siehe auch kohle und Dextran. Die Radioaktivität kann in der überste-
US Patentschrift Nr. 4 038 222] bestätigt. 65 henden Lösung oder im Niederschlag gemessen werden. Der
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Immunverfahren Gehalt an ß-Endorphin in der Probe kann bestimmt werden,
zur Bestimmung von ß-Endorphin oder von Fragmenten da- indem man die gezählten Impulse mit denjenigen einer Stan-
von, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, dadurch ge- dardkurve, welche durch Hinzufügen von verschiedenen be-
kannten Mengen an ß-Endorphin zu bestimmten Mengen an markierter Substanz und Antiserum sowie Aufzeichnung der Impulse für jede bekannte Menge an ß-Endorphin erhalten worden ist, vergleicht.
Mit dem erfindungsgemässen Verfahren wurden Versuche zum Vergleich der Aktivitäten von verschiedenen mit ß-En-dorphin verwandten Peptiden durchgeführt. Diese Studien zeigten, dass ß-Endorphin vom Mensch und vom Kamel völlig parallele und praktisch identische Inhibitionskurven ergeben. Ein verwandtes Fragment, ßc-EP-(6-31), ergab ebenfalls eine parallele Inhibitionskurve, aber besass eine Immunreaktivität von 40% im Vergleich zur vollständigen Sequenz von Kamel - ß-Endorphin (ßc-EP). Andererseits zeigte das synthetische Fragment ß-EP-(l-5)-(16-31) eine sehr geringe Kreuzreaktion. Weiter zeigten ßc-EP-(20-31) und ßc-EP(l-5) (Met-Enkephalin) überhaupt keine Kreuzreaktion. Schliesslich wurde gefunden, dass das Prohormon, menschliches ß-Lipo-tropin (ßh-LPH), welches die gesamte Aminosäuresequenz von ßh-EP enthält, mit den ßh-EP-Antisera nur eine 10-prozentige Immunoreaktivität aufweist. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Antigendeterminante von ß-EP sich in dem Fragment 6-15 befindet. Da ß-EP von Kamel und Mensch eine identische Sequenz in diesem Teil ihrer Strukturen aufweisen, ist es klar, dass die Antisera durch Antigene, die eine dieser Verbindungen oder ein Fragment mit der Antigendeterminante erhalten, erzeugt wurden. Weiter kann das erfindungs-gemässe Verfahren zur Bestimmung von allen Analogen und Fragmenten von ß-Endorphin, welche die ß-Endorphin (6-15) Teilsequenz enthalten, verwendet werden.
Obwohl im erfindungsgemässen Verfahren vorzugsweise radioaktiv markiertes ß-Endorphin oder ein Fragment davon, welches die (6—15) Teilsequenz enthält, verwendet werden, liegt es im Vermögen des Fachmannes auch ß-Endorphin oder ein Fragment davon, welches die (6-15) Teilsequenz enthält, mit anderen spezifischen und bestimmbaren Markierungssubstanzen, wie z.B. Elektronenspinresonanzgruppen, zu markieren. Die Verwendung von verschiedenen mit Elektronenspinresonanzgruppen markierten Molekülen in biologischen Tests wird beispielsweise in den US Patentschriften nos 3453228,3481952 und 3507876 beschrieben. Als Markierungssubstanzen eignen sich auch Chromophore, Fluoro-phore, Enzyme, rote Blutzellen, Latexteilchen usw.
Die nachstehenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung:
Beispiel 1
ßH-EP wurde durch das oben beschriebene Verfahren von Goodfriend et al an menschliches y-Globulin gebunden. Hasen und Meerschweinchen wurden mit dem erhaltenen Kon-jugat nach der Methode von Vaitukaitis et al, J. Clin. Endo-crinol. Metabol. 33,988 (1971) immunisiert. Das Antigen wurde in 0.01 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7.5 gelöst und mit vollständigem Freund's Hilfsstoff emulgiert. Die Emulsion wurde an mehreren Stellen in das Hinterteil der Tiere, welche zwei Tage vor der Antigenbeimpfung mit 0.5 ml Pertussis Impfstoff beimpft wurden, eingespritzt. Jedes Tier erhält über eine Periode von fünf Wochen 1 mg Antigen. Anschliessend wurde, für die Hasen aus den Ohradern und für die Meerschweinchen aus dem Herzen, jedem Tier Blut entnommen.
3 642 457
Von den drei Hasen und den fünf Meerschweinchen, die immunisiert wurden, reagierten ein Hase und zwei Meerschweinchen durch Antikörperbildung. Es wurde jedoch bemerkt, dass im allgemeinen der Titer des Meerschweinchen-5 Antiserums höher war als derjenige des Hasenantiserums. Antiserum vom Meerschweinchen 2 mit einer Verdünnung von 1:3000 wurde für die Weiterverwendung ausgewählt.
Die Anwesenheit von Antikörpern im Serum wurde kontrolliert, indem man die Bindungsfähigkeit für I125-ßh-EP, io welches durch die erwähnte von Aubert et al beschriebene Lactoperoxidase-Methode hergestellt wurde, überprüfte. Die spezifische Aktivität des iodierten Hormons war 85 mci/mg. Die Trennung des freien Iods vom iodierten Hormon erfolgte durch Chromatographie an Sephadex G-25 äquilibriert mit isO.l N Essigsäure.
Die Reinigung von 125I-ßh-EP über Sephadex G-25 äquilibriert mit 0.1 N Essigsäure, ergab drei Fraktionen:
Wie durch Bindungstests festgestellt, entsprachen die zwei ersten Fraktionen dem radioaktiven ßh-EP. Die dritte Frak-20 tion entsprach dem freien Iod. Nur die zweite Fraktion war für ein Radioimmunverfahren geeignet. Sie ergab niedrige Leerwerte (2%) während mit der ersten Fraktion Leerwerte von mehr als 25% erhalten wurden.
25 Beispiel 2
Zur Durchführung eines Radioimmunverfahrens wurden eine 0.1 ml-Lösung von 125I-ßh-EP (etwa 7000-8000 Impulse/ Minute) und eine 0.1 ml-Lösung, enthaltend verschiedene Mengen an unmarkiertem ßh-EP oder an analogen Peptiden, so während 16-20 Stunden in der Kälte bei 4 °C mit 0.1 ml ß-EP-Antiserum inkubiert. Alle Verdünnungen wurden mit einem 0.01 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7.5, enthaltend 0.15 MNaCl, 1% Rinderserumalbumin und 0.33% EDTA, in Glasteströhrchen (12 x 75 mm) durchgeführt. Die 35 Trennung des gebundenen vom freien Hormon erfolgte durch Zusatz von 0.5 ml Phosphatpuffer vom pH-Wert 7.5 enthaltend 20 mg Norit und 10 mg Dextran T-70 per ml. Die Test-röhrchen wurden während zehn Minuten in der Kälte stehengelassen und anschliessend während 30 Minuten in der Kälte 40 bei 5000 Upm zentrifugiert. 0.5 ml der klaren überstehenden Lösung wurden mit 5 ml Szintillationsflüssigkeit (PCS) gemischt und die Radioaktivität wurde in einem Packard Betazähler gemessen. Das verwendete spektrophotometrische Verfahren zur Zählung der Gammastrahlung unter Verwendung 45 einer Szintillationsflüssigkeit war im wesentlichen dasjenige, welches durch Herscowitz und McKillip in J. Immunological Methods 4; 253 (1974) beschrieben wurde.
Es wurde festgestellt, dass die Empfindlichkeit des erfindungsgemässen Verfahrens zur Bestimmung von ßh-EP im 50 Bereich von 0.1-10 mg lag. ßc-EP-(6-31) wies eine parallele Inhibitionskurve auf, besass jedoch eine 40-prozentige Immunreaktivität im Vergleich zu ßc-EP. Andererseits ergab ßh-EP-(l-5)-(16-31) eine sehr geringe Kreuzreaktion. Es wurde ebenfalls beobachtet, dass ßh-LPH, welches die vollständige 55 Aminosäuresequenz von ßh-EP enthält, nur eine 10-prozen-tige Immunoreaktivität aufwies. ßc-EP-(20-31) und Met-En-kephalin [ßc-EP-(l—5)] zeigten überhaupt keine Kreuzreaktion. Folglich stellt die Teilsequenz 6-15 von ßc-EP die Antigendeterminante von ß-EP dar.
60
C
Claims (9)
- 642 457 2PATENTANSPRÜCHE kennzeichnet, dass man eine Mischung aus der Probe, enthal-1. Immunverfahren zur Bestimmung von ß-Endorphin tend unbekannte Mengen an ß-Endorphin oder an Fragmen-oder von Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz ten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, aus mar-- enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mischung kiertem ß-Endorphin oder Fragmenten davon, welche die aus der Probe enthaltend unbekannte Mengen an ß-Endor- 5 (6-15) Teilsequenz enthalten und aus einem Antikörper, der phin oder an Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilse- ß-Endorphin oder Fragmente davon, welche die (6-15) Teil-quenz enthalten, aus markiertem ß-Endorphin oder Frag- sequenz enthalten, spezifisch bindet, inkubiert; das freie und menten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten und das gebundene ß-Endorphin oder die Fragmente davon, wel-aus einem Antikörper der ß-Endorphin oder Fragmente da- che die (6-15) Teilsequenz enthalten, trennt; die Menge an von, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, spezifisch bin- i0 markiertem ß-Endorphin oder an Fragmenten davon, welche det, inkubiert; das freie und das gebundene ß-Endorphin oder die (6-15) Teilsequenz enthalten, in dem freien oder in dem die Fragmente davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthal- gebundenen ß-Endorphin oder den Fragmenten davon, weiten, trennt; die Menge an markiertem ß-Endorphin oder an che die (6-15) Teilsequenz enthalten, misst; und den Gehalt Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten an ß-Endorphin oder an den Fragmenten davon, welche die in dem freien oder in dem gebundenen ß-Endorphin oder den 15 (6-15) Teilsequenz enthalten, in der Probe durch Vergleich Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, mit einer Standardkurve bestimmt.misst; und den Gehalt an ß-Endorphin oder an den Fragmen- Das erfindungsgemässe Verfahren verwendet einen für ß-ten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, in der Endorphin spezifischen Antikörper. Zur Herstellung solcherProbe durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt. Antikörper wird ein Antigen benützt, das durch kovalente
- 2. Immunverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 20 Bindung von ß-Endorphin an ein immunogenes Trägermate-zeichnet, dass das markierte ß-Endorphin radioaktiv markier- rial erhalten wurde. Diese Bindung kann auf bekannte Art, tes ß-Endorphin ist und die Menge an markiertem ß-Endor- vorzugsweise wie durch Goodfriend et al, in Science 144,1344 phin durch Messung der Radioaktivität des freien oder des (1976) beschrieben, erfolgen.gebundenen ß-Edorphins bestimmt wird. Die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeigneten
- 3. Immunverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- 25 immunogenen Trägermaterialien sind an sich bekannt. So zeichnet, dass das radioaktiv markierte ß-Endorphin 125I-ßh- können z.B. Säugetier-Serumproteine wie Gammaglobuline Endorphin ist. oder Albumine aus Menschen, Ziegen, Hasen, Pferden, Meer-
- 4. Immunverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, da- schweinchen oder anderen Säugetieren verwendet werden. Es durch gekennzeichnet, dass die Inkubierung während 16 bis können auch synthetische Polypeptide wie Polylysin als im-20 Stunden bei 4 °C durchgeführt wird. 30 munogene Trägermaterialien benützt werden.
- 5. Immunverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, da- Das erhaltene Antigen wird anschliessend in ein geeigne-durch gekennzeichnet, dass die Probe ßh-Endorphin enthält. tes Wirtstier injiziert bis die für ß-Endorphin spezifische Anti-
- 6. Markiertes ß-Endorphin als Mittel zur Durchführung körper im Blut des Tieres induziert werden. Geeignete Wirts-des Bestimmungsverfahrens gemäss Anspruch 1. tiere zur Antikörpergewinnung, wie z.B. Hasen, Meer-
- 7. Markiertes ß-Endorphin nach Anspruch 6, dadurch ge- 35 schweinchen, Ziegen, Schafe und dergleichen, sind bekannt, kennzeichnet, dass es 125I-ß-Endorphin ist. Den Tieren wird periodisch Blut entnommen und der Anti-
- 8. Verbindung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, körpertiter wird verfolgt, bis er die gewünschte Höhe erreicht dass sie 125I-ßh-Endorphin ist. hat. Anschliessend kann dann durch Blutentnahme ß-Endor-
- 9. Antikörper mit der Eigenschaft ß-Endorphin oder phinantiserum erhalten werden.Fragmente davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, 40 Als markierte Verbindung kann im erfindungsgemässen spezifisch zu binden, als Mittel zur Durchführung des Bestim- Verfahren radioaktiv markiertes ß-Endorphin eingesetzt wer-mungsverfahrens gemäss Anspruch 1. den. Vorzugsweise wird ß-Endorphin mit 14C, 3H oder I25I radioaktiv markiert. Ein für die Zwecke der vorliegenden Erfin-dung ganz bevorzugtes radioaktiv markiertes ß-Endorphin45 nämlich I25I-ß-Endorphin, wird erhalten, indem man gerei-
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