DE2811003A1 - Immunverfahren zur bestimmung von beta-endorphin sowie antigen und antikoerper hierfuer - Google Patents

Immunverfahren zur bestimmung von beta-endorphin sowie antigen und antikoerper hierfuer

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DE2811003A1 DE19782811003 DE2811003A DE2811003A1 DE 2811003 A1 DE2811003 A1 DE 2811003A1 DE 19782811003 DE19782811003 DE 19782811003 DE 2811003 A DE2811003 A DE 2811003A DE 2811003 A1 DE2811003 A1 DE 2811003A1
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Description

Γτ. nanz L--. .-r
i.-SfiQ '.. ' - '/'' O
RAN 4093/26
F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz
Immunverfahren zur Bestimmung von ß-Endorphin sowie Antigen und Antikörper hierfür
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Immunverfahren zur Bestimmung des kürzlich gefundenen wirksamen Opiumagonists und Analgetikums ß-Endorphin. ß-Endorphxn wurde mit sehr hoher Reinheit aus Hypophysen von Kamelen (Li and Chunq, Proc. Natl, ." Acad. Sei. USA, 71 1145; 1976), von Schweinen (Bradbury et al. Nature, London, 260, 165; 1976) und von Menschen (Li et al, Biochem. Biöphys, Res. CommunV 12_, 1542; 1976) isoliert. Die entsprechenden Strukturen sind wie folgt:
Kamel-ß-Endorphin (ß -Endornhin oder β -EP)=
"C- C
H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Sor-Gln-
Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Z^n-Ala-His-Lys-Lys-Gly-Gln-CK
Menschliches ß-Endorphin (ßh-Endorphin oder a-EP) = H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Het-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asa-Ala-
T.. , . 7r 809839/078S
BAD ORIGINAL
Die Strukturen wurden durch Festphasesynthese [Li et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., TL^, 19 (1976); siehe auch US Patentschrift Nr. 4038222] bestätigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Immunverfahren zur Bestimmung von ß-Endorphin oder von Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mischung aus der Probe, enthaltend unbekannte Mengen an ß-Endorphin oder an Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, aus markiertem ß-Endorphin oder Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten und aus einem Antikörper, der ß-Endorphin oder Fragmente davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, spezifisch bindet, inkubiert; das freie und das gebundene ß-Endorphin oder die Fragmente davon,
■J5 welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, trennt; die Menge an markiertem ß-Endorphin oder an Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, in dem freien oder in dem gebundenen ß-Endorphin oder den Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, misst; und den Gehalt an ß-Endorphin oder an den Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, in der Probe durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt.
Das erfindungsgemässe Verfahren verwendet einen für ß-Endorphin spezifischen Antikörper. Zur Herstellung solcher Antikörper wird ein Antigen benützt, das durch kovalente Bindung von ß-Endorphin an ein immunogenes Trägermaterial erhalten wurde. Diese Bindung kann auf bekannte Art, vorzugsweise wie durch Goodfriend et al, in Science 144, 1344 (1976) beschrieben, erfolgen.
Die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeigneten immunogenen Trägermaterialien sind an sich bekannt. So können z.B. Säugetier-.Serumproteine wie Gammaglobuline oder Albumine aus Menschen, Ziegen, Hasen, Pferden, Meerschweinschen oder anderen Säugetieren verwendet werden. Es können auch synthetische Polypeptide wie Polylysin als immunogene Träger-
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materialien benützt werden.
Das erhaltene Antigen wird anschliessend in ein geeignetes Wirtstier injiziert bis die für ß-Endorphin spezifische Antikörper im Blut des Tieres induziert werden. Geeignete Wirtstiere zur Antikörpergewinnung, wie z.B. Hasen, Meerschweinchen, Ziegen, Schafe und dergleichen, sind bekannt. Den Tieren wird periodisch Blut entnommen und der Antikörpertiter wird verfolgt, bis er die gewünschte Höhe erreicht hat.
Anschliessend kann dann durch Blutentnahme ß-Endorphinantiserum erhalten werden.
Als markierte Verbindung kann im erfindungsgemässen Verfahren radioaktiv markiertes ß-Endorphin eingesetzt werden. Vorzugsweise wird /3-Endorphin mit C, H oder I radioaktiv markiert. Ein für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ganz
125 bevorzugtes radioaktiv markiertes /3-Endorphin, nämlich I-ß-Endorphin, wird erhalten, indem man gereinigtes ß-Endorphin in bekannter Weise behandelt, z.B. dem von Aubert et al., in Acta Endocrinology TT_, 460 (1974) beschriebene Lactoperoxidaseverfahren unterwirft.
14
C-ß-Endorphin kann hergestellt werden, indem man bei
14 der Synthese dieser Verbindung eine oder mehrere mit C markierte Aminosäuren aus der ß-Endorphinsequenz umsetzt.
Eine geeignete Methode zur Herstellung von H-)3-Endorphin besteht darin, dass man in der Synthese Prolin durch 3,4-Dehydroprolin ersetzt und das erhaltene Analogon in Gegenwart eines Palladiumoxidkatalysator mit Tritium behandelt.
Das Radioimmunverfahren wird durchgeführt, indem man das markierte ß-Endorphin, die Probe mit einem unbekannten Gehalt an ß-Endorphin und das Antiserum während ungefähr 16 bis 20 Stunden in gepufferter Lösung inkubiert. Das freie und das gebundene ß-Endorphin werden auf bekannter Weise getrennt, wie z.B. durch Zusatz von Aktivkohle und Dextran. Die Radioaktivität kann in
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der überstehenden Lösung oder im Niederschlag gemessen werden. Der Gehalt an 3-Endorphin in der Probe kann bestimmt werden, indem man die gezählten Impulse mit denjenigen einer Standardkurve, welche durch Hinzufügen von verschiedenen bekannten Mengen an /3-Endorphin zu bestimmten Mengen an markierter Substanz und Antiserum sowie Aufzeichnung der Impulse für jede bekannte Menge an 3-Endorphin erhalten worden ist, vergleicht.
Mit dem erfindungsgemässen Verfahren wurden Versuche zum Vergleich der Aktivitäten von verschiedenen mit 3-Endorphin verwandten Peptiden durchgeführt. Diese Studien zeigten, dass 3-Endorphin vom Mensch und vom Kamel völlig parallele und praktisch identische Inhibitionskurven ergeben. Ein verwandtes Fragment, 0 -EP-(6-31), ergab ebenfalls eine parallele Inhibitionskurve aber besass eine Immunreaktivität von 40% im Vergleich zur vollständigen Sequenz von Kamel-3-Endorphin (3 -EP). Andererseits zeigte das synthetische Fragment 3-EP- (1-5) - (16-31) eine sehr geringe Kreuzreaktion. Weiter zeigten 3 -EP-(20-31) und 3 -EP (1-5) (Met-Enkephalin) überhaupt keine Kreuzreaktion.
Schliesslich wurde gefunden, dass das Prohormon, menschliches 3-Lipotropin (/3,-LPH) , welches die gesamte Aminosäuresequenz von 3, -EP enthält, mit den 3 -EP-Antisera nur eine 10-prozentige Immunoreaktivität aufweist. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Antigendeterminante von 3-EP sich in dem Fragment 6-15 befindet. Da 3-EP von Kamel und Mensch eine identische Sequenz in diesem Teil ihrer Strukturen aufweisen, ist es klar, dass die Antisera durch Antigene, die eine dieser Verbindungen oder ein Fragment mit der Antigendeterminante erhalten, erzeugt wurden. Weiter kann das erfindungsgemässe Verfahren zur Be-Stimmung von allen Analogen und Fragmenten von 3-Endorphin, welche die 3-Endorphin (6-15) Teilsequenz enthalten, verwendet werden.
Obwohl im erfindunwsaemässen Verfahren vorzugsweise radioaktiv markiertes 3-Endorphin oder ein Fragment davon, welches die (6-15) Teilsequenz enthält, verwendet werden, liegt es im Vermögen des Fachmannes auch 3-Endorphin oder ein Fragment
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davon, welches die (6-15) Teilsequenz enthält, mit anderen spezifischen und bestimmbaren Markierungssubstanzen, wie z.B. Elektronenspinresonanzgruppen, zu markieren. Die Verwendung von verschiedenen mit Elektronenspinresonanzgruppen markierten Molekülen in biologischen Tests wird beispielsweise in den US Patentschriften nos 3453228, 3481952 und 3507876 beschrieben. Als Markierungssubstanzen eignen sich auch Chromophore, Fluorophore, Enzyme, rote Blutzellen, Latexteilchen usw.
Die nachstehenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung:
Beispiel 1 ' β -EP wurde durch das oben beschriebene Verfahren von
Goodfriend et al an menschliches y-Globulin gebunden. Hasen und Meerschweinchen wurden mit dem erhaltenen Konjugat nach der Methode von Vaitukaitis et al, J. Clin. Endocrinol.Metabol. 33, 988 (1971) immunisiert. Das Antigen wurde in 0.01 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7.5 gelöst und mit vollständigem Freund's Hilfsstoff emulgiert. Die Emulsion wurde an mehreren Stellen in das Hinterteil der Tiere, welche zwei Tage vor der Antigenbeimpfung mit 0.5 ml Petrussis Impfstoff beimpft wurden, eingespritzt. Jedes Tier erhält über eine Periode von fünf Wochen 1 mg Antigen. Anschliessend wurde, für die Hasen aus den Ohradern und für die Meerschweinchen aus dem Herzen, jedem Tier Blut entnommen.
Von den drei Hasen und den fünf Meerschweinchen, die immunisiert wurden, reagierten ein Hase und zwei Meerschweinchen durch Antikörperbildung. Es wurde jedoch bemerkt, dass im allgemeinen der Titer des Meerschweinchen-Antiserums höher war als derjenige des Hasenantiserums. Antiserum vom Meerschweinchen 2 mit einer Verdünnung von 1:3000 wurde für die Weiterverwendung ausgewählt.
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Die Anwesenheit von Antikörpern im Serum wurde kontrol-
125 liert, indem man die Bindungsfähigkeit für I -/3.-EP, welches durch die erwähnte von Aubert et al beschriebene Lactoperoxidase-Methode hergestellt wurde, überprüfte. Die spezifische Aktivität des iodierten Hormons war 85 mci/πκτ. Die Trennung des freien Iods vom iodierten Hormon erfolgte durch Chromatographie an Sephadex G-25 aequilibriert mit 0.1 N Essigsäure.
125
Die Reinigung von I-/3, -EP über Sephadex G-25 aequilibriert mit 0.1 N Essigsäure, ergab drei Fraktionen:
Wie durch Bindungstests festgestellt, entsprachen die
zwei ersten Fraktionen dem radioaktiven ß, -EP. Die dritte Frak-
tion entsprach dem freien Iod. Nur die zweite Fraktion war für ein Radioimmunverfahren geeignet. Sie ergab niedrige Leerwerte ( 2%) während mit der ersten Fraktion Leerwerte von mehr als 25% erhalten wurden.
Beispiel 2
20
Zur Durchführung eines Radioimmunverfahrens wurden eine
125
0.1 ml-Lösung von I-ßh-EP (etwa 7000-8000 Impulse/Minute)
und eine 0.1 ml-Lösung,enthaltend verschiedene Mengen an unmarkiertem 01-.-EP oder an analogen Peptiden,während 16-20 Stun-
den in der Kälte bei 4°C mit 0.1 ml ß-EP-Antiserum inkubiert.
Alle Verdünnungen wurden mit einem 0.01 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7.5,enthaltend 0.15 M NaCl, 1% Rinderserumalbumin und 0.33% FDTA, in Glasteströhrchen (12x75 mm) durchgeführt. Die Trennung des gebundenen vom freien Hormon erfolgte durch Zusatz von 0.5 ml Phosphatpuffer vom pH-Wert 7.5 enthaltend 20 mg Norit und 10 mg Dextran T-70 per ml. Die Teströhrchen wurden während zehn Minuten in der Kälte stehengelassen und anschliessend während 30 Minuten in der Kälte bei 5000 Upm zentrifuaiert. 0.5 ml der klaren überstehenden Lösung wurden mit 5 ml Szintillationsflüssigkeit (PCS) gemischt und die Radioaktivität wurde in einem Packard Betazähler gemessen. Das verwendete spektrophotometrische Verfahren zur Zählung der Gammastrahlung unter
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Verwendung einer Szintillationsflüssigkeit war im wesentlichen dasjenige, welches durch Herscowitz und McKiIlip in J. Immunological Methods A_; 253 (1974) beschrieben wurde.
Es wurde festgestellt, dass die Empfindlichkeit des erfindungsgemässen Verfahrens zur Bestimmung von 0h~EP im Bereich von 0.1-10 mg lag. 0 -EP-(6-31) wies eine parallele Inhibitionskurve auf, besass jedoch eine 40-prozentige Immunreaktivität im Vergleich zu 0 -EP. Andererseits ergab 0, -EP-(1-5)-(16-31) eine sehr geringe Kreuzreaktion. Es wurde ebenfalls beobachtet, dass 0,-LPH, welches die vollständige Aminosäuresequenz von 0^-EP enthält, nur eine 10-prozentige Immunoreaktivität aufwies, β -EP-(20-31) und Met-Enkephalin [0 -EP-
C C
(1-5)] zeigten überhaupt keine Kreuzreaktion. Folglich stellt die Teilsequenz 6-15 von 0 -EP die Antigendeterminante von 0-EP dar..
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Claims (12)

Patentansprüche
1. Antigen bestehend aus ß-Endorphin, welches kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden ist.
2. Antigen gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das ß-Endorphin (3, -Endorphin ist.
3. Antigen gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das ß-Endorphin ß -Endorphin ist.
4. Antigen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Trägermaterial menschliches Gammaglobulin ist.
5. I-ß-Endorphin. 15
6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass 125
sie I-ß,~Endorphin ist.
7. Antikörper mit der Eigenschaft ß-Endorphin oder Fragmente davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, spezifisch zu binden.
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8. Iitimunverfahren zur Bestimmung von ß-Endorohin oder von Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mischung aus der Probe enthaltend unbekannte Mengen an ß-Endorphin oder an Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, aus markiertem /3-Endorphin oder Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten und aus einem Antikörper der ß-Endorphin oder Fragmente davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, spezifisch bindet, inkubiert; das freie und das gebundene j3-Endorphin oder die Fragmente davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, trennt; die Menge an markiertem /3-Endorphin oder an Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten in dem freien oder in dem gebundenen 3-Endorphin oder den Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, misst; und den Gehalt an j3-Endorphin oder an den Fragmenten davon, welche die (6-15) Teilsequenz enthalten, in der Probe durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt.
9. Immunverfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte ß-Endorphin radioaktiv markiertes ß-Endorohin ist und die Menge an markiertem ß-Endorphin durch Messung der Radioaktivität des freien oder des gebundenen ß-Endorphins bestimmt wird.
10. Immunverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
125 dass das radioaktiv markierte ß-Endorphin I-ß,-Endorphin ist.
11. Immunverfahren nach einen der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubierung während 16 bis 20
Stunden bei 4°C durchgeführt wird.
12. Immunverfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe j3, -Endorphin enthält.
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