DE2733561C3 - Spezifisches Reagens für den Immuntest für Thymopoietin - Google Patents

Description

Thymopoietin ist ein Polypeptidhormon des Thymus, das die Differenzierung von Prothymozyten zu Thymozyten auslöst und ferner Nebenwirkungen auf dte neuromuskuläre Transmission hat. Zwei Formen von Rinderthymopoietin, als Thymopoietin I und II bezeichnet, wurden isoliert und wurden immunologisch kreuzreaktiv nachgewiesen. (Thymopoietin ist die neue Bezeichnung, die dem ursprünglichen Namen Thymin vorgezogen wird.) Siehe G. Goldstein, Nature 247 (1974) 11.

Zwar kann Thymopoietin im biologischen Versuch unter Ausnutzung entweder seiner Wirkungen auf T-Zellendifferenzierung oder die neuromuskuläre Transmission nachgewiesen werden, jedoch sind diese Versuche kompliziert, zeitraubend und schwierig zu standardisieren. Ferner lassen sich biologische Versuche im Gegensatz zum Immuntest, insbesondere zum Radioimmuntest, nicht leicht automatisieren, so daß sie durch klinische Laboratorien oder andere Untersuchungsstellen nicht routinemäßig angewandt werden könnten, um große Zahlen von Proben in wirtschaftlicher Weise zu untersuchen.

Der Gegenstand der Erfindung ist durch die vorstehenden Ansprüche 1 bis 3 gekennzeichnet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform können Empfindlichkeiten bis hinab zu etwa 0,1 ng/ml des Hormons in Proben von biologischen Flüssigkeiten, z. B. Plasma oder Serum, nachgewiesen werden. Der Test gemäß der Erfindung kann somit als diagnostischer Test für Krankheitszustande angewendet werden, bei denen entweder erhöhte (Myasthenia gravis) oder verminderte (Alterung, mangelnde Immunität oder immunologisch ausgelöste Krankheiten, Krebs, Unterernährung, Infektionen u. dgl.) Konzentrationen von Thymopoietin vorliegen. Die beiden Formen von Thymopoietin sind bei Immuntestmethoden nicht unterscheidbar.

Das zur Erzeugung des Antikörpers für den Test gemäß der Erfindung verwendete Antigen wird leicht erhalten, indem Thymopoietin in an sich bekannter Weise an ein immunogeties Trägermaterial gebunden wird. Diese Bindung wird vorzugsweise durch Vef-Wendung einer geeigneten bifunktionellen verbindenden Gruppe erreicht. Bevorzugt als bifunktionelle verbindende Gruppe für diesen Zweck wird ein C,-C₇-Dialkanal, z. B. Glutaraldehyd.

Der hier gebrauchte Ausdruck »immunogenes Trägermaterial« bezeichnet Stoffe, die die Fähigkeit haben, unabhängig von immunogene Antwort in einem Wirtstier hervorzurufen, und die an Thymopoietin gekuppelt werden können. Als Trägermaterialen eignen sich beispielsweise Proteine, natürliche oder synthetische polymere Verbindungen, beispielsweise Polypeptide, z. B. Polylysin oder Copolymerisate von Aminosäuren und Polysaccharide. Besonders bevorzugt als Trägermaterialien werden Proteine und Polypeptide, insbesondere Proteine.

Die Art des für die Herstellung eines Antigens verendeten Proteinmaterials ist nicht enfc-Jieidend wichtig. Als Beispiele von Proteinen, die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, sind Serumproteine von Säugetieren, z. B. menschliches y-GIobulin, menschliches Serumaibumin, Rinderserumaibumin, methyliertes Rinderserumaibumin, Kaninchenserumalbumin, Rinder-y-globulin und Pferde-y-globulin zu nennen. Weitere geeignete Proteine sind für den Fachmann naheliegend. Im allgemeinen werden nicht unbedingt Proteine verwendet, die für die Wirtstiere, in denen das erhaltene Antigen verwendet wird, fremd sind.

Die Kupplung von Thymopoietin in das immunogene Trägermaterial kann in bekannter Weise durchgeführt werden. Bevorzugt werden Verfahren, bei denen die kovalente Bindung oder die physikalische Bindung, z. B. die elektrostatische Bindung, angewendet wird. Wenn K ispielsweise die Kupplung durchgeführt wird, um eine kovalente Bindung zu erreichen, kann eine bifunktionelle Bindungsgruppe, z. B. Glutaraldehyd, unter den von S. Avrameas in Immunochemistry 6 (1969) 43 beschriebenen Bedingungen verwendet werden.

Die Verwendung einer bifunktionellen Bindungsgruppe ist die bevorzugte Art, die kovalente Bindung von Thymopoietin an das immunogene Trägermaterial zu erreichen, jedoch können auch andere Bindungsverfahren angewendet werden. Bei einer dieser Methoden kann die Carbodiimidtechnik, die beispielsweise in »Science«, Band 14 vom 12. 6. 1964, Seite 1344-1346, beschrieben wird, angewendet werden In dieser Veröffentlichung wird festgestellt, daß Carbodiimide verwendet werden könr-n, um Materialien, die viele Arten von funktionellen Gruppen enthalten, einschließlich Carbonsäuren und Amine zu kuppeln. Hei diespr alternativen Methode verläuft die Kupplung unter Bildung von kovalenten Bindungen durch Kupplung von Thymopoietin an das Protein über eine Amidbindung in der in dieser Veröffentlichung in »Science« beschriebenen Weise. Eine weitere geeignete Methode der kovalenten Bindung, bei der Cyanate verwendet werden, wird in der US-PS 37X8948 beschrieben.

Die Bindung von Thymopmctin an den !'rager kann auch auf physikalischem Wege, z, B. durch elektrostatische Bindung, nach bekannten Methoden erreicht werden. Bei diesem Verfahren wird ein Komplex zwischen dem Träger und Thymopoietin gebildet. Es kann durchgeführt werden, wie in »Methods in Immunology und lmffiuriochemistry«i liefausgegeben von Curtis A. Williams, Band I, Academic Press 1967, beschrieben. Weitere Verfahren Werden in der US-PS

3 853987 beschrieben.

Natürlich können auch andere bekannte Verfahren angewandt werden, um das Thymopoietin an den Träger zu binden.

Die Antigene werden verwendet, um nach bekannten Methoden die Bildung von Antikörpern, die für Thymopoietin spezifisch sind, in Wirtstieren durch Injektion des Antigens bei diesen Wirtstieren vorzugsweise unter Verwendung eines Adjuvans, z.B. Freundschem Adjuvans, auszulösen. Verbesserte Titer können durch wiederholte Injektionen über einen gewissen Zeitraum erzielt werden. Als Wirtstiere eignen sich für diesen Zweck beispielsweise Säugetiere wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten, Kühe und Schafe. Die erhaltenen Antiseren enthalten Antikörper, die, wie vorstehend beschrieben, selektiv Komplexe mit Thymopoietin oder einem daraus hergestellten Antigen bilden.

Die gemäß der Erfindung hergestellten spezifischen Antikörper für Tfcymopoietin sind wertvoll als Reagentien im immuntest für Thymopoietin.

Bei einer Ausführungsform wird mit einem geeigneten Puffer verdünntes Antiserum, z. B. 5%iges Rinder-v-globulin in normaler Kochsalzlösung, die mit O.lmolarem Phosphat bei pH 7,4 gepuffert wird (BGG-Puffer), mit einer Standardpiobe oder Testprobe und auch einer bekannten Menge von radioaktiv markiertem Thymopoietin, die beide im BGG-Puffer gelöst sind, gemischt.

Verschiedene Methoden können dann angewandt werden, um die in de. Testprobe vorhandene Thymopoietinmenge zu bestimmen. Bei e'ner ersten Methode wird nach dem Mischen dpr vorstehend genannten Komponenten und nach Ste¹ anlassen des Gemisches für einige Stunden bei Raumtemperatur der Antikörper-Antigen-Komplex unter Verwendung von kaltem 30%igem Polyäthylenglykol ausgefällt. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgesaugt und die Radioaktivität im Sediment gemessen. Der Thymopoietingehalt der Probe kann dann durch Vergleich der beobachteten Starke der Radioaktivität in einer Standardkurve in an sich bekannter Weise bestimmt werden. Eine geeignete Standardkurve kann erhalten werden, indem bekannte Mengen Thymopoietin mit bestimmten Mengen von markiertem Thymopoietin und dem für Thymopoietin spezifischen Antikörper gemischt werden und der Grad der Bindung für jede bekannte Menge bestimmt wird.

Die Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexcs kann auch mit Hilfe anderer Trennsysteme erfolgen. Diese alternativen Systeme werden sogar dem vorstehend beschriebenen Polyäthylenglykolsystem vorgezogen, da mit ihnen eine höhere Fmpfindlichkeit für den Test erzielt wird.

Bei einem dieser Systeme wird eine doppelte Antikorpermefhode angewandt. Nach dem Bebrüten des aus drei Komponenten bestehenden Testreaktionsgemisches in der oben beschriebenen Weise wird ein Antikörper, der in einer anderen Säugetierspe/ies gegen den Antikörper des primären Tests erzeugt wor= den ist, zugesetzt. Die Komponenten werden ge* mischt, und nach Stehenlassen füf 5 bis 120 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch zentrifugiert. Nachdem Absaugendes Übefstandes wird die Radioaktivität der Fällung gemessen und die Thymopoietinkonzentration in der Probe aus einer Standardkurve in der oben beschriebenen Weise bestimmt.

Bei dem anderen alternativen System wird mit

Dextran umhüllte Holzkohle verwendet, um die Abtrennung des Antikörper-Antigen-Komplexes zu beschleunigen. Bei dieser Methode wird mit Dextran umhüllte Holzkohle dem Testreaktionssystem nach dem Bebrüten zugesetzt. Eine verminderte Temperatur von etwa 4° C wird angewandt. Nachdem das Gemisch etwa 30 Minuten bei etwa 4° C stehengelassen worden ist, wird es zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das Sediment wird auf Radioaktivität untersucht, die bei dieser Methode »ungebundenes« Thymopoietin darstellt.

Bei den Ausführungsformen des Testsystems kann die normale Kochsalzlösung, die im BGG-Puffersystem verwendet wird, durch 4molares KCI ersetzt werden. Dieser Ersatz verringert die nicht-spezifische Bindung beim Test ohne gleichzeitigen Verlust an Empfindlichkeit.

Als radioaktiv markierte Thymopoietine eignen sich für den Immuntest gemäß der Erfindung beispielsweise mit Radioisotopen markierte Thymopoietine, insbesondere die mit Tritium (³H), Konlenstoff-14 (¹⁴C), Jod-125 ('"J) der mit Jod-131 ("¹J) markierten Thymopoietine. Für andere Ausführungsformen des Immuntests gemäß der Erfindung können ι Thymopoietine verwendet werden, die mit anderen einmaligen und nachweisbaren Markierungen, z. B. Chromophoren, Fluorophoren, Enzymen, roten Blutkörperchen, Latexteilchen oder Elektronenspinnr;-sonanzgruppen. versehen sind.

Vorteilhaft ist das '"J-Thymopoietin. Die Einführung der ¹²⁵J-Markierung in Thymopoietin kann nach bekannten Methoden erfolgen, z. B. nach der Chloramin-T-Methode oder vorzugsweise unter Verwendung des Bolton-Hunter-Reagens (mit ^I2\J jodierte p-Hydroxyphenylpropionsäure, N-Hydroxysuccinimidester), wie in Biochem. J. 133 (1973) 529 beschrieben. Diese Bevorzugung beruht darauf, daß durch direkte Jodierung der Thyiosyikomponenten von Thymopoietin ein gewisser Verlust an Immunoreaktivität eintritt. Da jedoch das Bolton-Hunter-Reagens mit freien Aminogruppen kondensiert, beeinträchtigt es nicht die immunodeterminanten Tyrosylbereiche.

Die übrigen vorstehend genannten markierten Thymopoietine werden nach bekannten Methoden hergestellt. Beispielsweise können mit Enzymen markierte Thymopoietine in der in der US-PS 3654090 beschriebenen Weise hergestellt werden. Ferner beschreibt die US-PS 3853987 Verfahren zur Verwendung von Tracermaterialien, z. B. fluoreszierenden Verbindungen und Latexsystemen, für die Markierung. Diese Markierungsmethoden sind somit in der Literatur ausführlich beschrieben. Die erfindungsgemäß verwendeten markierten Thymopoietine umfassen demgemäß die mit Radioisotopen markierten sowie die mit den anderen genannten Materialien markierten Thymopoietine.

Durch Testen mit verschiedenen Kontrollpolypeptiden und Beobachtung, daß keine Verschiebung des Komplexes aus Antikörper und markiertem Antigen stattfand, wurde nachgewiesen, daß der Immuntest gemäß der Erfindung spezifisch für Thymopoietin ist. Insbesondere wurde keine Kretizreaktiön mit Ubichitin, einem in Geweben weit verbreiteten Material, und mit Historien, die aus Rinderthymus extrahiert werden, festgestellt. Ein synthetisches Tridecapeptid auf Basis von Resten 29-41 von Thymopoietin, das die biologischen Aktivitäten von Thymopoietin hat,

zeigte keine Kreuzreaktion. Offensichtlich fehlte es in diesem Bereich entweder an den Resten und/oder der tertiären Struktur, die zur Rekonstitution der antigenen Stellen, die von den Antithymopoietin-Antikörpern im Antiserum erkannt werden, erforderlich sind.

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1
Antigen- und AntLkörperherstellung

Thymopoietin wurde auf die von Goldstein in Nature 247 (1974) 11 beschriebene Weise isoliert. Zur Immunisierung wurde es an eine gleiche Gewichtsmenge Pferde-y-globulin mit Glutaraldehyd als Kupplungsreagens nach der Methode von Avrameas (Immunochemistry 6 [1969] 43) gekuppelt. Das erhaltene Antigen wurde dann für die Bildung von Thymopoietin-Antikörper verwendet.

Drei weibliche San-Juan-Kaninchen viurden mit je 400 μg Thymopoietin-Antigen immunisiert, da in Freundschem vollständigem Adjuvans ernulgiert war und intradermal an mehreren Stellen injiziert wurde. Die Immunisierung wurde viermal in Abständen von 2 Wochen wiederholt. Eine Woche nach den letzten Injektionen wurden die Tiere ausgeblutet.

Beispiel 2
Radioaktive Markierung von Thymopoietin

a) Chloramin-T-Methode

Thymopoietin wurde an Carboxymethyl-Sephadex^e(CM-Sephadex) (Säule von 0,6 x 30 cm), das in 0,2mo!arem Ammoniumacetat ins Gleichgewicht gebracht worden war und einen pH-Wert von 4,5 hatte, weiter gereinigt, wobei mit einem linearen Gradienten bis 0,5molar, pH 4,5, entwickelt wurde. Das Thymopoietin erschien dicht hinter dem Zwischenraumvolumen. Diese Fraktionen wurden gefriergetrocknet und an »Sepnadex G-25«¹⁵ entsalzt. Die Reinheit wurde durch Elektrophorese an Polyacrylamidgel bei pH 4,3 und pH 8,9 ermittelt.

10 μg des hochreinen Thymopoietin wurden nach der Chloraminmethode von Hunter und Greenwood (Nature 194 [1962] 495 mit 2 mCi trägerfreiem ²'J radioaktiv markiert. Das '^J-Thymopoietin wurde von den nicht umgesetzten Radionucliden an Sephadex G-25^R (Säule von 0.6 x 30 cm) in 0,05molarem Phosphat, pH 7,5, abgetrennt. Die Säule wurde mit 0,25 %iger Gelatine in Phosphatpuffer vorgewaschen. Die Radioaktivität einer Probe von 1 μΐ aus jeder Fraktion wurde in einem automatischen /-Spektrometer bestimmt. Die Fraktion, die dem Zwischenraumvolumen entsprach, wurde in aliquote Teile von 0,1 ml geteilt und für den Gebrauch innerhalb von 3 Wochen bei -20° C aufbewahrt.

b) Bolton-Hunter-Methode

2 mCi von mit ^I2'J jodiertem p-Hydroxyphenylpropionsäure-N-hydroxysuccinimidester (Bolton-Hunter-Reagens - 1500 Ci/mMol), der in Benzol gelöst war, wurden zur Jodierung von Thymopoietin bei 4° C nach der von B öl to η und Hu nt er in Biochem, J. 133 (1973) 529 beschriebenen Methode verwendet. Das Bolton-Hünter-Reagens wurde unter einem Abzug getrocknet, indem ein Sti.ckstoffstrom über die Mündung des Kolbens geleitet wurde. 10 μΐ Thymopoietin (0,5 mg/ml ΪΛ O.lmolarem Natriumborat, pH 8,5) wurden zugesetzt, worauf 45 Minuten bei 4" C gehalten wurde. Dann wurden 0,5 ml 0,2molares Gly

cin in O.lmolarem Natriumborat, pH 8,5, zur Reaktion mit nicht umgesetztem Reagens zugesetzt. Nach 15 Minuten wurde ^l25J-Thymopoietin von den anderen markierten Produkten der Konjugation nach der vorstehend in Abschnitt (a) beschriebenen Methode abgetrennt.

Nur 5% des nach der Chloramin-T-Methode radiojodierten Thymopoietins wurden in Gegenwart von überschüssigem Antikörper gebunden. Diese Bindung

wurde bei Verdünnungen von mehr als 10~³ schwächer. Im Gegensatz hierzu wurden nach der Bolton-Hunter-Methode 45% des mit radioaktivem Jod markierten Thymopoietin in Gegenwart von überschüssigem Antikörper gebunden. Diese Bindung wurde

'"' ebenfalls bei Antikörperverdünnungen von mehr als 10"³ schwächer.

Beispiel 3

a) Radioimmuntest - Abtrennung mit Polyäthylengiykol

Bebrütungen wurden dreifach in Kunststoff röhrchen von 12 x 75 mm durchgeführt. Zu 0,5 ml Antiserum, das mit 5%igem Rinder-oj-globulin in mit 0,01 molarem Phosphat gepufferter 0,15mo!arer NaCl-Lösung (BGG-Puffer) verdünnt war, wurden 0,2 ml Probe und 0,3 ml ¹²⁵J-Thyrnopo:etin (=50000 cpm in BGG-Puffer) gegeben. Wenn Serumproben getestet werden sollen, werden sie durch Molekularsieb-Chromatographie an G-50-Sephadex in O.lmolarem Ammoniumdicarbonat, pH 8,0, hergestellt. Die Fraktionen hinter dem ausgeschlossenen Volumen ( Vo) und vor dem eingeschlossenen Volumen ( Vi) wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wurde im Puffer für Thymopoietin aufgenommen. Diese Herstellung dient dazu, Moleküle mit Molekulargewichten, die höher oder niedriger als das Molekulargewicht von Thymopoietin sind, von der Bestimmung auszuschließen.

Die Teströhrchen werden auf einem Wirbelmischer Dewegt und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann werden 0,5 ml kaltes 30%iges Polyäthylenglykol jedem Röhrchen zugesetzt, das auf einem Wirbelmischer bewegt und bei 2000 UpM 30 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert wird. Der Überstand wird abgesaugt und die Radioaktivität im Sediment in einen automatischen y-Spektrometer bestimmt. Ausgefälltes ¹²\J-Thymopoietin (%) wird nach der Formel a-c(b-c) x 100 berechnet, worin a = mit dem Antikörper sedimentiertes cpm, b = insgesamt zugesetztes cpm und c = nicht spezifisch mit normalem Kaninchenserum oder mit Antikörper U! J überschüssigem nicht markiertem Thymopoietin sedimentiertes cpm (dies macht gewöhnlich etwa 109f des gesamten cpm aus) bedeuten. Für die Standardkurve der Bindungshemmung wurde das gebundene Thymopoietin als Prozentsatz der maximalen Thymopoietinbindung mit Antikörper bei 10" ' berechnet. Eine Antikörperverdünnung von 1:3000 wurde für die Standardkurve der Bindungshemmung benutzt.

b) Radioimmuntest - doppelte Ant.ikörpertrennung

Der vorstehend unter (a) beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch 4molare/ KCl-BGG-Puffer verwendet wurde und nach der 2stündigen Inkubationszeit insgesamt 0,1 ml Ziegen-Antikaninchen-Antikörper und 0,02 ml normales Kaninchenserum zugesetzt, die Komponenten auf dem Wirbelniischer gemischt wurden und das erhaltene

Gemisch 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde abgesaugt und die Radioaktivität des Sediments wie beim Versuch (a) gemessen.

c) Radioimmuntest - Trennung mit Hilfe von mit Dextran umhüllter Holzkohle

Mit Dextran umhüllte Holzkohle wird hergestellt durch Mischen gleicher Volumina von (a) 5 g Holzkohle »Norit A«® pro 100 ml Phosphatpuffer, der 2 MoI KGI und Rinder-^globulin enthält, und (b) 0,5 g Dextran 110 pro 100 ml Phosphatpuffer, der 1 Mol KGl und Rinder-y-giobüiin enthält.

insgesamt 0,5 ml der mit Dextran umhüllten Holzkohle werden bei 4° G nach der 2stündigen Inkubation wie beim Versuch (b) in das Reagenzröhrchen gegeben, worauf das Gemisch 30 Minuten bei 4° C stehengelassen wird; Die Röhrchen ^w?-rden zentrifugiert, worauf der Überstand abgesaugt wird. Die Radioaktivität der Pellets, die bei dieser Bestimmung »ungebundenes« Thymopoietin darstellt, Wird gemessen.

Die Bindungs-Hemmungs-Standardkurve für nicht markiertes Thymopoietin bei der Bestimmung unter Anwendung der Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexes mit Polyäthylenglykol zeigte eine Empfindlichkeit für Thymopoietinkonzentrationen von mehr als 5 rig/ml. Keine starke Verschiebung wird durch Kontrollpolypeptide, nämlich Insulin, ot-Bungarotoxin, Ubichitin, Histon und ein synthetisches Tridecapeptidfragment von Thymopoietin (Reste 29-41) bei Konzentrationen von 10-1000 ng/ml hervorgerufen.

Die Bindungs-Hemmungs-Kurven für nicht markiertes Thymopoietin bei den Bestimmungen unter Anwendung der doppelten Antikörpertrennung und der Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexes mit Hilfe Von mit Dextran umhüllter Holzkohle zeigen beide Empfindlichkeiten für Thymopoeitinkonzentrationen bis hinab zu 0,1 ng Thymoppietin/mi. Die beiden letztgenannten Methoden sind somit für die Messung von Thymopoietinkonzentrationen in Serumproben besonders gut geeignet.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Antikörper, bestehend aus einem Antigen, das Thymopoietin gebunden an ein immunigenes Trägermaterial enthält und das durch Impfen eines Wirtstieres mit den Antigen aus dem Serum des Wirtstieres isoliert worden ist, als spezifisches Reagens für den Immuntest für Thymopoietin.

2. Verfahren zum Bestimmen von Thymopoietin in einer Testlösung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Testlösung mit einer bekannten Menge markierten Thymopoietin und den Antikörper nach Anspruch 1 mischt, den hierbei selektiv gebildeten Antikörper-Antigen-Komplex vom Überstand abtrennt und das gebundene markierte Thymopoietin an Standardkurven mißt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Radioimmuntest anwendet und radioaktiv markiertes Thymopoietin verwendet.