DE2733561B2 - Spezifisches Reagens für den Immuntest für Thymopoietin - Google Patents
Spezifisches Reagens für den Immuntest für ThymopoietinInfo
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Description
Thymopoietin ist ein Polypeptidhormon des Thymus, das die Differenzierung von Prothymozyten zu
Thymozyten auslöst und ferner Nebenwirkungen auf die neuromuskuläre Transmission hat. Zwei Formen
von Rinderthymopoietin, als Thymopoietin I und II bezeichnet, wurden isoliert und wurden immunologisch
kreuzreaktiv nachgewiesen. (Thymopoietin ist die neue Bezeichnung, die dem ursprünglichen Namen
Thymin vorgezogen wird.) Siehe G. Goldstein, Nature 247 (1974) 11.
Zwar kann Thymopoietin im biologischen Versuch unter Ausnutzung entweder seiner Wirkungen auf T-Zellendifferenzierung
oder die neuromuskuläre Transmission nachgewiesen werden, jedoch 3ind diese Versuche kompliziert, zeitraubend und schwierig zu
standardisieren. Ferner lassen sich biologische Versuche im Gegensatz zum Immuntest, insbesondere zum
Radioimmuntest, nicht leicht automatisieren, so daß sie durch klinische Laboratorien oder andere Untersuchungsstellen
nicht routinemäßig angewandt werden könnten, um große Zahlen von Proben in wirtschaftlicher
Weise zu untersuchen.
Der Gegenstand der Erfindung ist durch die vorstehenden Ansprüche 1 bis 3 gekennzeichnet. Bei einer
bevorzugten Ausführungsform können Empfindlichkeiten bis hinab zu etwa 0,1 ng/ml des Hormons in
Proben von biologischen Flüssigkeiten, z. B. Plasma oder Serum, nachgewiesen werden. Der Test gemäß
der Erfindung kann somit als diagnostischer Test für Krankheitszustände angewendet werden, bei denen
entweder erhöhte (Myasthenia gravis) oder verminderte (Alterung, mangelnde Immunität oder immunologisch
ausgelöste Krankheiten, Krebs, Unterernährung, Infektionen u. dgl.) Konzentrationen von
Thymopoietin vorliegen. Die beiden Formen von Thymopoietin sind bei Immuntestmethoden nicht unterscheidbar.
Das zur Erzeugung des Antikörpers für den Test gemäß der Erfindung verwendete Antigen wird leicht
erhalten, indem Thymopoietin in an sich bekannter Weise an ein immunogenes Trägermaterial gebunden
wird. Diese Bindung wird vorzugsweise durch Ver-
wendung einer geeigneten bif unktionellen verbindenden Gruppe erreicht. Bevorzugt als bifunktionelle
verbindende Gruppe für diesen Zweck wird ein C2-Ο,-Dialkanal,
z. B. Glutaraldehyd.
Der hier gebrauchte Ausdruck »immunogenes Trägermaterial«
bezeichnet Stoffe, die die Fähigkeit haben, unabhängig von immunogene Antwort in einem
Wirtstier hervorzurufen, und die an Thymopoietin gekuppelt
werden können. Als Trägermaterialen eignen sich beispielsweise Proteine, natürliche oder synthetische
polymere Verbindungen, beispielsweise Polypeptide, z. B. Polylysin oder Copolymerisate von
Aminosäuren und Polysaccharide. Besonders bevorzugt als Trägermaterialien werden Proteine und PoIypeptide,
insbesondere Proteine.
Die Art des für die Herstellung eines Antigens verwendeten Proteinmaterials ist nicht entscheidend
wichtig. Als Beispiele von Proteinen, die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, sind Serumproteine
von Säugetieren, z. B. menschliches /-Globulin, menschliches Serumalbumin, Rinderserumalbumin,
methyliertes Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin, Rinder-y-globulin und Pferde-y-globulin zu
nennen. Weitere geeignete Proteine sind für den Fachmann naheliegend. Im allgemeinen werden nicht
unbedingt Proteine verwendet, die für die Wirtstiere, in denen das erhaltene Antigen verwendet wird, fremd
sind.
Die Kupplung von Thymopoietin in das immunogene Trägermaterial kann in bekannter Weise durchgeführt
werden. Bevorzugt werden Verfahren, bei denen die kovalente Bindung oder die physikalische
Bindung, z. B. die elektrostatische Bindung, angewendet wird. Wenn beispielsweise die Kupplung
durchgeführt wird, um eine kovalente Bindung zu erreichen, kann eine bifunktionelle Bindungsgruppe,
z. B. Glutaraldehyd, unter den von S. Avrameas in Immunochemistry 6 (1969) 43 beschriebenen Bedingungen
verwendet werden.
Die Verwendung einer bifunktionellen Bindungsgruppe ist die bevorzugte Art, die kovalente Bindung
von Thymopoietin an das immunogene Trägermaterial zu erreichen, jedoch können auch andere Bindungsverfahren
angewendet werden. Bei einer dieser Methoden kann die Carbodiimidtechnik, die beispielsweise
in »Science«, Band 14 vom 12. 6. 1964, Seite 1344—1346, beschrieben wird, angewendet werden.
In dieser Veröffentlichung wird festgestellt, daß Carbodiimide verwendet werden können, um Materialien,
die viele Arten von funktionellen Gruppen enthalten, einschließlich Carbonsäuren und Amine zu
kuppeln. Bei dieser alternativen Methode verläuft die Kupplung unter Bildung von kovalenten Bindungen
durch Kupplung von Thymopoietin an das Protein über eine Amidbindung in der in dieser Veröffentlichung
in »Science« beschriebenen Weise. Eine weitere geeignete Methode der kovalenten Bindung, bei
der Cyanate verwendet werden, wird in der US-PS 3788948 beschrieben.
Die Bindung von Thymopoietin an den Träger kann auch auf physikalischem Wege, z. B. durch elektrostatische
Bindung, nach bekannten Methoden erreicht werden. Bei diesem Verfahren wird ein Komplex zwischen
dem Träger und Thymopoietin gebildet. Es kann durchgeführt werden, wie in »Methods in Immunology
und Immunochemistry«, herausgegeben von Curtis A.Williams, Band I, Academic Press 1967,
beschrieben. Weitere Verfahren werden in der US-PS
3853987 beschrieben.
Natürlich können auch andere bekannte Verfahren angewandt werden, um das Thymopoietin an den Träger
zu binden.
Die Antigene werden verwendet, um nach bekannten Methoden die Bildung von Antikörpern, die für
Thymopoietin spezifisch sind, in Wirtstieren durch Injektion des Antigens bei diesen Wirtstieren vorzugsweise
unter Verwendung eines Adjuvans, z. B. Freundschem Adjuvans, auszulösen. Verbesserte Titer
können durch wiederholte Injektionen über einen gewissen Zeitraum erzielt werden. Als Wirtstiere eignen
sich für diesen Zweck beispielsweise Säugetiere wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweinchen,
Ratten, Kühe und Schafe. Die erhaltenen Antiseren enthalten Antikörper, die, wie vorstehend beschrieben,
selektiv Komplexe mit Thymopoietin oder einem daraus hergestellten Antigen bilden.
Die gemäß der Erfindung hergestellten spezifischen
Antikörper für Thymopoietin sind wertvoll als Reagentien im Immuntest für Thymopoietin.
Bei einer Ausführungsform wird mit einem geeigneten Puffer verdünntes Antiserum, z. B. 5%iges
Rinder- y-globulin in normaler Kochsalzlösung, die mit 0,1 molarem Phosphat bei pH 7,4 gepuffert wird
(BGG-Puffer), mit einer Standardprobe oder Testprobe und auch einer bekannten Menge von radioaktiv
markiertem Thymopoietin, die beide im BGG-Puffer gelöst sind, gemischt.
Verschiedene Methoden können dann angewandt werden, um die in der Testprobe vorhandene Thymopoietinmenge
zu bestimmen. Bei einer ersten Methode wird nachdem Mischen der vorstehend genannten
Komponenten und nach Stehenlassen des Gemisches für einige Stunden bei Raumtemperatur
der Antikörper- Antigen-Komplex unter Verwendung von kaltem 30%igem Polyäthylenglykol ausgefällt.
Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgesaugt und die Radioaktivität im Sediment gemessen.
Der Thymopoietingehalt der Probe kann dann durch Vergleich der beobachteten Stärke der Radioaktivität
in einer Standardkurve in an sich bekannter Weise bestimmt werden. Eine geeignete Standardkurve kann
erhalten werden, indem bekannte Mengen Thymopoietin mit bestimmten Mengen von markiertem Thymopoietin
und dem für Thymopoietin spezifischen Antikörper gemischt werden und der Grad der Bindung
für jede bekannte Menge bestimmt wird.
Die Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexes kann auch mit Hilfe anderer Trennsysteme erfolgen.
Diese alternativen Systeme werden sogar dem vorstehend beschriebenen Polyäthylenglykolsystem
vorgezogen, da mit ihnen eine höhere Empfindlichkeit
für den Test erzielt wird.
Bei einem dieser Systeme wird eine doppelte Antikörpermethode angewandt. Nach dem Bebrüten des
aus drei Komponenten bestehenden Testreaktionsgemisches in der oben beschriebenen Weise wird ein
Antikörper, der in einer anderen Säugetierspezies gegen den Antikörper des primären Tests erzeugt worden
ist, zugesetzt. Die Komponenten werden gemischt, und nach Stehenlassen für S bis 120 Minuten
bei Raumtemperatur wird das Gemisch zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Überstandes wird die Radioaktivität
der Fällung gemessen und die Thymopoietinkonzentration in der Probe aus einer Standardkurve
in der oben beschriebenen Weise bestimmt.
Bei dem anderen alternativen System wird mit Dextran umhüllte Holzkohle verwendet, um die Abtrennung
des Antikörper-Antigen-Komplexes zu beschleunigen. Bei dieser Methode wird mit Dextran
umhüllte Holzkohle dem Testreaktionssystem nach dem Bebrüten zugesetzt. Eine verminderte Temperatur
von etwa 4° C wird angewandt Nachdem das Gemisch etwa 30 Minuten bei etwa 4° C stehengelassen
worden ist, wird es zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das Sediment wird auf Radioaktivität untersucht,
die bei dieser Methode »ungebundenes« Thymopoietin darstellt.
Bei den Ausführungsformen des Testsystems kann die normale Kochsalzlösung, die im BGG-Puffersystem
verwendet wird, durch 4molares KCl ersetzt
1) werden. Dieser Ersatz verringert die nicht-spezifische
Bindung beim Test ohne gleichzeitigen Verlust an Empfindlichkeit.
Als radioaktiv markierte Thymopoietine eignen sich für den Immuntest gemäß der Erfindung beispielsweise
mit Radioisotopen markierte Thymopoietine, insbesondere die mit Tritium (3H), Kohlenstoff-14
(14C), Jod-125 (125J) der mit Jod-131 (131J)
markierten Thymopoietine. Für andere Ausführungsformen des Immuntests gemäß der Erfindung können
Thymopoietine verwendet werden, die mit anderen einmaligen und nachweisbaren Markierungen, z. B.
Chromophoren, Fluorophoren, Enzymen, roten Blutkörperchen, Latexteilchen oder Elektronenspinnresonanzgruppen,
versehen sind.
jo Vorteilhaft ist das 125J-Thymopoietin. Die Einführung
der 125J-Markierung in Thymopoietin kann nach
bekannten Methoden erfolgen, z. B. nach der Chloramin-T-Methode oder vorzugsweise unter Verwendung
des Bolton-Hunter-Reagens (mit 125J jodierte
ij p-Hydroxyphenylpropionsäure, N-Hydroxysuccinimidester),
wie in Biochem. J. 133 (1973) 529 beschrieben. Diese Bevorzugung beruht darauf, daß
durch direkte Jodierung der Thyrosylkomponenten von Thymopoietin ein gewisser Verlust an Immunoreaktivität
eintritt. Da jedoch das Bolton-Hunter-Reagens mit freien Aminogruppen kondensiert, beeinträchtigt
es nicht die immunodeterminanten Tyrosylbereiche.
Die übrigen vorstehend genannten markierten Thymopoietine werden nach bekannten Methoden
hergestellt. Beispielsweise können mit Enzymen markierte Thymopoietine in der in der US-PS 3654090
beschriebenen Weise hergestellt werden. Ferner beschreibt die US-PS 3853987 Verfahren zur Verwen-
-,o dung von Tracermaterialien, z. B. fluoreszierenden
Verbindungen und Latexsystemen, für die Markierung. Diese Markierungsmethoden sind somit in der
Literatur ausführlich beschrieben. Die erfindungsgemäß verwendeten markierten Thymopoietine umfas-
Y, sen demgemäß die mit Radioisotopen markierten sowie
die mit den anderen genannten Materialien markierten Thymopoietine.
Durch Testen mit verschiedenen Kontrollpolypeptiden und Beobachtung, daß keine Verschiebung des
bo Komplexes aus Antikörper und markiertem Antigen
stattfand, wurde nachgewiesen, daß der Immuntest gemäß der Erfindung spezifisch für Thymopoietin ist.
Insbesondere wurde keine Kreuzreaktion mit Ubichitin, einem in Geweben weit verbreiteten Material, und
h5 mit Histonen, die aus Rinderthymus extrahiert werden,
festgestellt. Ein synthetisches Tridecapeptid auf Basis von Resten 29-41 von Thymopoietin, das die
biologischen Aktivitäten von Thymopoietin hat,
zeigte keine Kreuzreaktion. Offensichtlich fehlte es in diesem Bereich entweder an den Resten und/oder
der tertiären Struktur, die zur Rekonstitution der äntigenen Stellen, die von den Antithymopoietin-Antikörpern
im Antiserum erkannt weiden, erforderlich sind.
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1
Antigen- und Antikörperherstellung
Antigen- und Antikörperherstellung
Thymopoietin wurde auf die von Goldstein in Nature 247 (1974) 11 beschriebene Weise isoliert.
Zur Immunisierung wurde es an eine gleiche Gewichtsmenge Pferde-y-globulin mit Glutaraldehyd als
Kupplungsreagens nach der Methode von Avrameas
(Immunochemistry 6 [1969] 43) gekuppelt. Das erhaltene Antigen wurde dann für die Bildung
von Thymopoietin-Antikörper verwendet.
Drei weibliche San-Juan-Kaninchen wurden mit je 400 μg Thymopoietin-Antigen immunisiert, da in
Freundschem vollständigem Adjuvans emulgiert war und intradermal an mehreren Stellen injiziert wurde.
Die Immunisierung wurde viermal in Abständen von 2 Wochen wiederholt. Eine Woche nach den letzten
Injektionen wurden die Tiere ausgeblutet.
Beispiel 2
Radioaktive Markierung von Thymopoietin
Radioaktive Markierung von Thymopoietin
a) Chloramin-T-Methode
Thymopoietin wurde an Carboxymethyl-Sephadex®
(CM-Sephadex) (Säule von 0,6 X 30 cm), das in 0,2molarem Ammoniumacetat ins Gleichgewicht gebracht
worden war und einen pH-Wert von 4,5 hatte, weiter gereinigt, wobei mit einem linearen Gradienten
bis 0,5molar, pH 4,5, entwickelt wurde. Das Thymopoietin erschien dicht hinter dem Zwischenraumvolumen.
Diese Fraktionen wurden gefriergetrocknet und an »Sephadex G-25«® entsalzt. Die Reinheit wurde
durch Elektrophorese an Polyacrylamidgel bei pH 4,3 und pH 8,9 ermittelt.
10 μg des hochreinen Thymopoietin wurden nach der Chloraminmethode von Hunter und Greenwood
(Nature 194 [1962] 495 mit 2 mCi trägerfreiem 125J radioaktiv markiert. Das 125J-Thymopoietin
wurde von den nicht umgesetzten Radionucliden an Sephadex G-25® (Säule von 0,6 X 30 cm) in
0,05molarem Phosphat, pH 7,5, abgetrennt. Die Säule wurde mit 0,25 %iger Gelatine in Phosphatpuffer vorgewaschen.
Die Radioaktivität einer Probe von 1 μΐ aus jeder Fraktion wurde in einem automatischen
y-Spektrometer bestimmt. Die Fraktion, die dem Zwischenraumvolumen entsprach, wurde in aliquote
Teile von 0,1 ml geteilt und für den Gebrauch innerhalb von 3 Wochen bei -20° C aufbewahrt.
b) Bolton-Hunter-Methode
2 mCi von mit 125J jodiertem p-Hydroxyphenylpropionsäure-N-hydroxysuccinimidester
(Bolton-Hunter-Reagens - 1500 Ci/mMol), der in Benzol gelöst
war, wurden zur Jodierung von Thymopoietin bei 4° CnachdervonBolton und Hunter in Biochem.
J. 133 (1973) 529 beschriebenen Methode verwendet. Das Bolton-Hunter-Reagens wurde unter einem Abzug
getrocknet, indem ein Stickstoffstrom über die Mündung des Kolbens geleitet wurde. 10 μΐ Thymopoietin
(0,5 mg/ml in O.lmolarem Natriumborat, pH 8,5) wurden zugesetzt, worauf 45 Minuten bei 4° C
gehalten wurde. Dann wurden 0,5 ml 0,2molares GIy-
ein in O.lmolarem Natriumborat, pH 8,5, zur Reaktion
mit nicht umgesetztem Reagens zugesetzt. Nach 15 Minuten wurde l25J-Thymopoietin von den anderen
markierten Produkten der Konjugation nach der vorstehend in Abschnitt (a) beschriebenen Methode
abgetrennt.
Nur 5 % des nach der Chloramin-T-Methode radiojodierten Thymopoietins wurden in Gegenwart von
überschüssigem Antikörper gebunden. Diese Bindung
ίο wurde bei Verdünnungen von mehr als 10~3 schwächer.
Im Gegensatz hierzu wurden nach der Bolton-Hunter-Methode 45% des mit radioaktivem Jod markierten
Thymopoietin in Gegenwart von überschüssigem Antikörper gebunden. Diese Bindung wurde
ebenfalls bei Antikörperverdünnungen von mehr als 10~3 schwächer.
a) Radioimmuntest — Abtrennung mit Polyäthylenglykol
Bebrütungen wurden dreifach in Kunststoffröhrchen von 12 X 75 mm durchgeführt. Zu 0,5 ml Antiserum,
das mit 5%igem Rinder-ω-globulin in mit 0,01 molarem Phosphat gepufferter 0,15molarer
NaCl-Lösung (BGG-Puffer) verdünnt war, wurden 0,2 ml Probe und 0,3 ml 125J-Thymopoietin
(«50000 cpm in BGG-Puffer) gegeben. Wenn Serumproben getestet werden sollen, werden sie durch
Molekularsieb-Chromatographie an G-50-Sephadex in0,lmolarem Ammoniumdicarbonat, pH 8,0, hergestellt.
Die Fraktionen hinter dem ausgeschlossenen Volumen (Vo) und vor dem eingeschlossenen Volumen
(Vi) wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wurde im Puffer für Thymopoietin
aufgenommen. Diese Herstellung dient dazu, Moleküle mit Molekulargewichten, die höher oder niedriger
als das Molekulargewicht von Thymopoietin sind, von dei Bestimmung auszuschließen.
Die Teströhrchen werden auf einem Wirbelmischer bewegt und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
Dann werden 0,5 ml kaltes 30%iges Polyäthylenglykol jedem Röhrchen zugesetzt, das auf einem
Wirbelmischer bewegt und bei 2000 UpM 30 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert wird. Der
Überstand wird abgesaugt und die Radioaktivität im Sediment in einen automatischen y-Spektrometer bestimmt.
Ausgefälltes 12SJ-Thymopoietin (%) wird
nach der Formel a-c(b-c) X 100 berechnet, worin
a = mit dem Antikörper sedimentiertes cpm, b = insgesamt zugesetztes cpm und c = nicht spezifisch
mit normalem Kaninchenserum oder mit Antikörper und überschüssigem nicht markiertem Thymopoietin
sedimentiertes cpm (dies macht gewöhnlich etwa 10% des gesamten cpm aus) bedeuten. Für die Standardkurve
der Bindungshemmung wurde das gebundene Thymopoietin als Prozentsatz der maximalen Thymopoietinbindung
mit Antikörper bei 10"1 berechnet. Eine Antikörperverdünnung von 1:3000 wurde für
die Standardkurve der Bindungshemmung benutzt.
b) Radioimmuntest - doppelte Antikörpertrennung
Der vorstehend unter (a) beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch 4molarer KCl-BGG-Puffer
verwendet wurde und nach der 2stündigen Inkubationszeit insgesamt 0,1 ml Ziegen-Antikaninchen-Antikörper
und 0,02 ml normales Kaninchenserum zugesetzt, die Komponenten auf dem Wirbelmischer gemischt wurden und das erhaltene
Gemisch 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann zentrifugiert wurde. Der Überstand
wurde abgesaugt und die Radioaktivität des Sediments wie beim Versuch (a) gemessen.
c) Radioimmuntest - Trennung mit Hilfe von mit Dextran umhüllter Holzkohle
Mit Dextran umhüllte Holzkohle wird hergestellt durch Mischen gleicher Volumina von (a) 5 g Holzkohle
»Norit A«® pro 100 ml Phosphatpuffer, der 2 Mol KCl und Rinder-y-globulin enthält, und (b)
0,5 g Dextran 110 pro 100 ml Phosphatpuffer, der 1 Mol KCl und Rinder-y-globulin enthält.
Insgesamt 0,5 ml der mit Dextran umhüllten Holzkohle werden bei 4° C nach der 2stündigen Inkubation
wie beim Versuch (b) in das Reagenzröhrchen gegeben, worauf das Gemisch 30 Minuten bei 40C
stehengelassen wird. Die Röhrchen werden zentrifugiert, worauf der Überstand abgesaugt wird. Die Radioaktivität
der Pellets, die bei dieser Bestimmung »ungebundenes« Thymopoietin darstellt, wird gemessen.
Die Bindungs-Hemmungs-Standardkurve für nicht markiertes Thymopoietin bei der Bestimmung unter
Anwendung der Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexes mit Polyäthylenglykol zeigte eine
Empfindlichkeit für Thymopoietinkonzentrationen von mehr als 5 ng/ml. Keine starke Verschiebung wird
durch Kontrollpolypeptide, nämlich Insulin, a-Bungarotoxin, Ubichitin, Histon und ein synthetisches
Tridecapeptidfragment von Thymopoietin (Reste
ι« 29-41) bei Konzentrationen von 10-1000 ng/ml hervorgerufen.
Die Bindungs-Hemmungs-Kurven für nicht markiertes Thymopoietin bei den Bestimmungen unter
Anwendung der doppelten Antikörpertrennung und
ι > der Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexes
mit Hilfe von mit Dextran umhüiiter Hoizkohie zeigen beide Empfindlichkeiten für Thymopoeitinkonzentrationen
bis hinab zu 0,1 ng Thymopoietin/ml. Die beiden letztgenannten Methoden sind somit für die
-'<> Messung von Thymopoietinkonzentrationen in Serumproben
besonders gut geeignet.
Claims (3)
1. Antikörper, bestehend aus einem Antigen, das Thymopoietin gebunden an ein immunigenes
Trägermaterial enthä't und das durch Impfen eines
Wirtstieres mit den Antigen aus dem Serum des Wirtstieres isoliert worden ist, als spezifisches
Reagens für den Immuntest für Thymopoietin.
2. Verfahren zum Bestimmen von Thymopoietin in einer Testlösung, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Testlösung mit einer bekannten Menge markierten Thymopoietin und den Antikörper
nach Anspruch 1 mischt, den hierbei selektiv gebildeten Antikörper-Antigen-Komplex
vom Überstand abtrennt und das gebundene markierte Thymopoietin an Standardkurven mißt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Radioimmuntest
anwendet und radioaktiv markiertes Thymopoietin verwendet.
ι ο
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