DE2760343C2

DE2760343C2 -

Info

Publication number: DE2760343C2
Application number: DE2760343A
Authority: DE
Inventors: James Walter Ryan; Alfred Miami Fla. Us Chung
Original assignee: VENTREX LABORATORIES Inc PORTLAND ME US
Current assignee: VENTREX LABORATORIES Inc PORTLAND ME US
Priority date: 1977-05-10
Filing date: 1977-10-26
Publication date: 1990-06-28
Anticipated expiration: 1997-10-27
Also published as: DE2760342A1; GB1555832A; DE2747853C2; DE2747853A1; CA1129847A; US4115374A; DE2760342C2; DE2760343A1

Description

Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen beschrie bene Benzoylprolylphenylalanylarginin.

Das erfindungsgemäße Benzoylprolylphenylalanylarginin hat die Formel

Vorzugsweise enthält mindestens ein Teil der mit dem Prolin verknüpften Benzoylgruppe ein Radioisotop, wobei insbesondere mindestens ein Teil des Wasserstoffs der mit dem Prolin ver knüpften Benzoylgruppe Tritium ist.

A.T. Chin et al, Biochem. J. 1975, 149(1), 297-300 (CA 83, 128408, 1975) beschreiben die Bestimmung der Aktivität der Schweinelungenkinase II unter Verwendung von ¹²⁵I-markiertem Tyrosin-Bradykinin, wobei das Hydrolyse produkt ¹²⁵I-Tyr-Arg über Kationenaustauscher quantitativ gewonnen wird.

In Am.J.Clin.Pathol. 1976, 66(2), 416-24 beschreiben J. Friedland und E. Silverstein eine Methode zur Bestimmung für angiotensin-umwandelndes Enzym in unbehandeltem Serum, wobei das Hydrolyseprodukt aus Hippuryl-L-histidyl-L-leucin spektrofluorimetrisch durch Bildung eines Fluoreszenz- Adduktes mit o-Phthaldialdehyd bestimmt wird.

Das erfindungsgemäße, radioaktiv markierte Peptidderivat kann als Substrat in einem Verfahren zum quantitativen Messen von angiotensinumwandelnder Enzymaktivität in biologischem Material eingesetzt werden, welches in der gleichlaufenden DE-PS 27 47 853 beschrieben ist. Das erfindungsgemäße, radioaktiv markierte Peptidderivat ermöglicht es zum ersten Mal, das angiotrensin umwandelnde Enzym zu bestimmen, indem man die Radio aktivität des Rest- oder Spurenproduktes mißt, das aus der enzymatischen Hydrolyse der vorletzten Peptidbindung vor der endständigen Carboxygruppe des Peptidsubstrats entsteht. Dieses Substrat ist so beschaffen, daß das Restprodukt fast quantitativ aus dem Serum durch ein aprotisches organisches Lösungsmittel extrahiert wird, während das nichthydrolysier te Substrat nur gering, wenn überhaupt, extrahiert wird. Die Bestimmungsmethode unter Verwendung des erfindungsgemäßen, radioaktiv markierten Peptidderivates ist für die Anwendung in klinischen und Forschungslaboratorien bestimmt. Derartige Bestimmungen können auf unfraktionierten biologischen Materialien, die ACE enthalten, wie Serum, durchgeführt werden. Sie sind empfindlich, quantitativ, leicht durchzuführen und reprodu zierbar.

Zu den Vorteilen dieser Bestimmung gehören weiterhin:
Vereinfachung des Verfahrens, Verringerung der zur Durch führung der Bestimmung erforderlichen Zeit, der Wegfall von umständlichen und zeitraubenden Trennstufen, keine Ab hängigkeit von nachfolgenden Reaktionen mit einem Reak tionsteilnehmer, keine Störung durch andere im zu bestimmen den Gemisch vorliegende Materialien, verbesserte Gewinnung aufgrund einer Reduktion der Fluidtransferstufen, hohe Empfindlichkeit durch Radioisotopenmessungen und direkte Auswertung, ohne sich mit Standartkurven zur Interpretation der Ergebnisse aufhalten zu müssen.

Das erfindungsgemäße Benzoylprolylphenylalanylarginin kann abgekürzt auch als

BenzoylProPheArg

bezeichnet werden, wobei Pro den L-Prolinrest, Phe den L-Phenyl alaninrest und Arg L-Arginin bedeutet. Das bevorzugte erfin dungsgemäße, radioaktiv markierte Peptidderivat kann entsprechend als

³H-BenzyolProPheArg

bezeichnet werden.

Das bevorzugte Substrat besitzt folgende Eigenschaften:

(a) Es läßt sich mit den Enzym verknüpfen unter Bildung eines reversiblen Enzym-Substrat-Komplexes mit einer genügend niedrigen Dissoziationskonstante, um sicherzu stellen, daß die Enzymreaktion in einer annehmbaren Geschwindigkeit erfolgt;
(b) es ist durch das Enzym hydrolysierbar, wobei es vor zugsweise nur eine empfindliche Peptidbindung aufweist;
(c) es enthält radioaktive Markierung, die vollständig an der endständigen N-Stelle der empfindlichen Peptid bindung eingearbeitet ist;
(d) es ist weitestgehend in dem zum Extrahieren des Spuren produktes verwendeten organischen Lösungsmittel unlöslich und
(e) es Liefert ein Spurenprodukt, das in das organische Lösungsmittel im wesentlichen quantitativ hineinextra hiert werden kann.

Ein derart durch β-Strahlen emittieren de Tritium radioaktiv markiertes Peptidderivat gemäß vor liegender Erfindung kann auch durch die folgende Formel darge stellt werden:

³H-BenzoylProPheArg hat eine relativ niedrige scheinbare Michaelis-Konstante (Km) von 2 × 10^-4 M und könnte geeigneter weise in dem Verfahren der DE-PS 27 47 853 in einer Konzentration, die unter seiner Km liegt, eingesetzt werden. Wegen seiner besonders niedrigen Km ist ³H-BenzyolProPheArg das am meisten bevorzugte Substrat für Bestimmungen, in denen die ACE- Aktivität niedrig ist und maximale Empfindlichkeit gewünscht wird. Außer, daß dieses Substrat gegenüber konkurrierender Inhibierung weniger empfindlich ist, sind die mit diesem Sub strat durchgeführten Bestimmungen potentiellerweise in der Lage, niedrigere ACE-Mengen zu messen als andere Substrate. Außerdem ist sein Trennverhalten in einem aprotischen orga nischen Lösungsmittel außergewöhnlich günstig: nur etwa 3% gelangten in einem vorher durchgeführten Extraktionsversuch in Ethylacetat. Das Restprodukt Benzoylprolin war zu etwa 90% extrahiert.

Das erfindungsgemäße BenzoylProPheArg kann hergestellt werden, indem man zunächst durch Umsetzung von Prolylphenylalanylnitro argininbenzylester mit p-Iod-benzoesäure-N-succinimidylester den p-Iodbenzoylprolylphenylalanylnitroargininbenzylester herstellt, aus diesem die Schutzgruppen entfernt und schließlich das so erhalten p-Iodbenzoylprolylphenylalanylarginin einer katalytischen Dehydrohalogenierung unter Hydrydierungsbedingungen unterwirft. Wenn die katalytischen Dehydrohalogenierung in Gegenwart von Tritiumgas durchgeführt wird, erhält man das radioaktiv markierte ³H-BenzoylProPheArg.

Das nachfolgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

IodbenzoylProPheArg wurde hergestellt, indem man zuerst 390 mg Prolyphenylalanylnitroargininbenzylester zusammen mit 98 mg 1-Hydroxybenzotriazol in Dimethylformamid vermischte und das Gemisch mit N-Ethylmorpholin bei 0°C neutralisierte. 200 g einer kalten Lösung von p-Iodbenzoesäure-N-succinimidylester wurden zugesetzt. Die Reaktionsteilnehmer wurden 1 Stunde lang in einem Eisbad gerührt und dann auf Raumtemperatur gebracht über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatphase wurde einer Reihe von Waschungen in folgender Reihenfolge unterworfen: Wasser, O, 2N HCL, gesättigtes NaCl, gesättigtes NaHCO₃, gesättigtes NaCl. Die Ethylacetatlösung wurde dann über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels blieb ein gummiartiges Material zurück, das mit einem o-Trolidin/Cl₂-Reagens reagierte, mit Ninhydrin nicht reagierte und als ein einzelner Fleck bei der Papierelektro phorese bei einem pH-Wert von 2,0 migrierte. Diese Eigenschaften zeigten an, daß das Material im wesentlichen das erwartete Produkt, nämlich p-Iodbenzyolprolylphenylalanylnitroargininbenzylester, war.

Das vorstehende Produkt wurde dann mit HF in gegenwart von Anisol zur Entfernung der Schutzgruppen behandelt. Das dabei entstehende Peptid, p-Iodbenzyolprolylphenylalanylarginin, wurde durch Chromato graphie an Sephadex ® G-10 (Sephadex, Handelsbezeichnung Pharmacia, Uppsala, Schweden) unter Verwendung von 15%iger (V/V) wäßriger Essigsäure als Eluierungsmittel gereinigt. Der Peptid-Peak wurde durch Überwachen der Extinktion bei 280 nm nachgewiesen. Die Homogenität wurde durch Papierelektrophorese bei pH 2,0 und pH 5,0 und durch Dünnschichtchromatographie in 7 verschiedenen Lösungsmittelsystemen bestätigt.

Das Peptid, p-Iodbenzyolprolyphenylalanylarginin, wurde der New England Nuclear Corp., Boston, Mass. übersandt zur Triti ierung durch ein katalytisches Dehydrohalogenierungsverfahren in Gegenwart von Tritiumgas.

Das radioaktive Produkt wurde charakterisiert durch Chromato graphie an Bio-Ges ® P2 (Bio-Gel, Handelsbezeichnung, Bio Rad Laboratories, Richmond, Californien), Papierelektrophorese und Dünnschichtchromatographie. Eine Bio-Gel P2-Säule mit 110 ml Säulenvolumen und 50 bis 55 ml Hohlvolumen wurde mit einer Probe des ³H-BenzoylProPheArg beschickt und mit einem Pyridin/Essigsäurepuffer, 0,1 Mol, pH 5,0, eluiert. Gleiche 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Ein Radioaktivitätspeak bei Rohr 43 wurde beobachtet, was einem Eluierungsvolumen von 86 ml entspricht. Keine anderen radioaktiven Peaks wurden beobachtet.

Eine Probe des ³H-BenzoylProPheArg wurde auf einer Dünnschicht silicagelplatte in einem Lösungsmittelsystem chromatographiert, das aus 150 Volumenteilen n-Butanol, 26 Teilen Essigsäure und 24 Teilen Wasser bestand. ³H-BenzoylProPheArg besaß ein R_f von 0,32. Eine Vergleichsprobe von Benzoylprolin besaß ein R_f von 0,55 im gleichen Lösungsmittelsystem.

Papierelektrophores wurde auf Whatman 3 MM Papier bei 1100 Volt und 10 bis 20 Milliampere je Stunde bei pH 2,0 und 5,0 durch geführt. Der pH 2,0 Puffer enthielt 100 ml Diethylenglykol, 120 ml Essigsäure, 20 ml Ameisensäure und 760 ml Wasser. Der pH 5,0 Puffer enthielt 27,8 ml Eisessig, 32,2 ml Pyridin und Wasser zum Auffüllen auf 4 l Endvolumen. Bei pH 2,0 migrierte ³H-BenzoylProPheArg 6,6 cm relativ zum Arginin, das 18 cm wandert. Bei pH 5,0 migrinierte ³H-BenzoylProPheArg 2,5 cm, verglichen mit 16,5 cm für Arginin.

Claims

1. Benzoylprolylphenylalanylarginin der Formel

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil der mit dem Prolin verknüpften Benzoyl gruppe ein Radioisotop enthält.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des Wasserstoffs der mit dem Prolin verknüpften Benzoylgruppe Tritium ist.