DE69733349T2 - Verfahren zur Bestimmung der Sequenz von Aminosäuren von Proteinen oder Peptiden, beginnend mit dem Carboxylende - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung der Sequenz von Aminosäuren von Proteinen oder Peptiden, beginnend mit dem Carboxylende Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse der Primärstruktur eines Proteins oder eines Peptids und insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids beginnend mit dessen Carboxylende.
  • Um eine Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids, beginnend mit dessen Carboxylende (im Folgenden hierin manchmal als ein C-Terminus bezeichnet) zu bestimmen, wurde ein Verfahren wie in 3 gezeigt verwendet, welches umfasst, es einem Protein oder einem Peptid zu ermöglichen, mit Carboxypeptidase zu reagieren, Sammeln von Anteilen der Reaktionsmischung im Zeitverlauf, Analysieren der Reaktionsmischung mittels eines Aminosäureanalysierers und Bestimmen der freigesetzten Aminosäure (Seikagakjikkenkouza Vol. 1, Tanpakushitunokagaku II, edited b; Nihonseikagakukai, S. 203–211, 1976).
  • Ein Verfahren zur Analyse der Masse eines C-terminal verkürzten Proteins oder eines C-terminal verkürzten Peptids durch Analysieren der Reaktionsmischung unter Verwendung eines Massenspektrometers ist bekannt (A. Tsugita, R. Van den Broek, M. Pyzybylski, FEBS. Lett. 137, 19 (1982)). Außerdem wird als ein Beispiel für die chemischen Verfahren ein Verfahren zur Analyse einer Sequenz berichtet, welches das Wiederholen einer Abfolge von Vorgängen umfasst, die aus dem Aktivieren des C-Terminus mit Essigsäureanhydrid, Binden von Trimethylsilylisothiocyanat und Spalten mit Chlorwasserstoffsäure besteht, wie in 4 gezeigt (D. H. Hawke, H. W. Lahm, J. F. Shively, C. W. Todd, Anal. Biochem. 166, 298 (1987)).
  • Das herkömmliche Verfahren unter Verwendung von Carboxypeptidase ist durch die Spaltung an unerwünschten Peptidbindungen, die auf die Vielfältigkeit der Substratspezifität und die Abhängigkeit der Aktivität des Enzyms von der C-terminalen Aminosäure oder einer zu dieser benachbarten Aminosäure und auf die Verunreinigung der anderen Protease zurückzuführen ist, bei der exakten Bestimmung problematisch. Außerdem ist dieses Verfahren nicht zur Mikroanalyse geeignet, da die Verunreinigung durch die enthaltene Mischung aus Aminosäure und Peptid dadurch auftritt, dass das Enzym eine autoprotolytische Eigenschaft aufweist und manchmal unzureichend gereinigt ist.
  • Ferner ist das andere chemische Verfahren nicht ausreichend auf eine praktische Verwendung ausgerichtet.
  • Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein chemisches Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids beginnend mit dessen Carboxylende, ohne Verwendung von Enzymen bereitzustellen.
  • Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein chemisches Verfahren bereitzustellen, das zur Mikroanalyse der Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids geeignet ist.
  • Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids beginnend mit dessen Carboxylende bereitgestellt, umfassend: Wiederholen einer kombinierten Vorgehensweise, die ein Verfahren des Freisetzens einer carboxyterminalen Aminosäure eines Proteins oder eines Peptids und einen Vorgang des Isolierens und Identifizierens der erhaltenen Aminosäure oder des erhaltenen Aminosäurederivats beinhaltet, wobei die kombinierte Vorgehensweise umfasst: eine erstes Verfahren, in welchen ermöglicht wird, dass das Protein oder das Peptid mit einem Säureanhydrid reagiert und in welchem das Carboxylende modifiziert wird, um Oxazolon zu bilden, einschließlich Schützen des Aminoendes während des ersten Verfahrens; und ein zweites Verfahren, in welchem ermöglicht wird, dass das gebildete Protein oder Peptid, dessen Carboxylende Oxazolon ist, mit a) Säure und Alkohol, b) einer Lösung, die Säure und Alkohol enthält, oder c) einem Ester reagiert, um die carboxyterminale Aminosäure freizusetzen und einen Vorgang des Isolierens und Identifizierens der in dem zweiten Verfahren erhaltenen Aminosäure.
  • Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids beginnend mit dessen Carboxylende bereitgestellt, welches gekennzeichnet ist durch ein wiederholtes Durchführen einer kombinierten Vorgehensweise aus einer Abfolge von Vorgängen, umfassend ein erstes Verfahren, in welchem ermöglicht wird, dass ein Protein oder ein Peptid mit einem Säureanhydrid reagiert, Schützen einer Aminogruppe davon und Modifizieren des Carboxylendes, um Oxazolon zu bilden, wenn die carboxyterminale Aminosäure nicht Asparaginsäure (Aspartamsäure) ist, oder um ein intramolekulares Säureanhydrid zu bilden, wenn sie Asparaginsäure ist, ein zweites Verfahren des Umsetzens mit einem Alkohol in Gegenwart von Säure, um die carboxyterminale Aminosäure freizusetzen, wenn das Carboxylende Oxazolon ist, oder Ringöffnung des intramolekularen Säureanhydrids durch Alkoholyse, wenn es ein intramolekulares Säureanhydrid ist, ein drittes Verfahren des Umsetzens mit einem Säureanhydrid um Oxazolon an dem Carboxyterminus zu bilden, ein viertes Verfahren des Umsetzens mit einem Alkohol, um die carboxyterminale Aminosäure als einen Ester der Aminosäure freizusetzen, und ein fünftes Verfahren des Umsetzens mit einem Amin, um den Ester zu hydrolysieren, und einen Vorgang des Isolierens und Identifizierens a) der in dem zweiten und/oder dem fünften Verfahren erhaltenen Aminosäure oder b) des in dem dritten, vierten oder fünften Verfahren erhaltenen Aminosäurederivats.
  • Die Erfindung wird nun exemplarisch mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
  • 1 ein erstes Flussdiagramm zeigt, welches ein Verfahren zur Analyse der Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung darstellt;
  • 2 zeigt ein Reaktionschema, welches eine experimentelle Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
  • 3 zeigt ein Flussdiagramm, welches ein herkömmliches Bestimmungsverfahren unter Verwendung von Carboxypeptidase darstellt;
  • 4 zeigt ein Flussdiagramm, welches ein herkömmliches Bestimmungsverfahren unter Verwendung von Trimethylsilylisothiocyanat darstellt;
  • 5 zeigt eine Zeichnung, die ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Retentionszeit von Alanyltryptophan zu bestätigen;
  • 6 zeigt eine Zeichnung, die ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Retentionszeit von N-Acetylalanyltryptophan zu bestätigen;
  • 7 zeigt eine Zeichnung, die ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Retentionszeit von N-Acetylalanyltryptophanylmethionylarginylphenylalanin zu bestätigen;
  • 8 zeigt eine Zeichnung, die ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Retentionszeit von N-Acetylalanyltryptophanylmethionylarginylphenylalanylalanin zu bestätigen;
  • 9 zeigt eine Zeichnung, die ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Bildung von Oxazolon zu bestätigen;
  • 10 zeigt eine Zeichnung, die ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Spaltung des Oxazolonrings zu bestätigen;
  • 11 zeigt ein zweites Flussdiagramm, welches ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Analyse der Aminosäuresequenz darstellt;
  • 12 zeigt ein Reaktionschema, welches eine andere experimentelle Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
  • 13 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Retentionszeit von Tryptophan zu bestätigen;
  • 14 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Retentionszeit von Alanyltryptophan zu bestätigen;
  • 15 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Retentionszeit von N-Acetylalanyltryptophan zu bestätigen;
  • 16 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Retentionszeit des Ethylesters von N-Acetylalanyltryptophan zu bestätigen;
  • 17 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Bildung von Oxazolon zu bestätigen;
  • 18 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Spaltung des Oxazolonrings zu bestätigen;
  • 19 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um Hydrolyse zu bestätigen;
  • 20 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 8 erhaltenen Probe zeigt;
  • 21 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 9 erhaltenen Probe zeigt;
  • 22 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 10 erhaltenen Probe zeigt;
  • 23 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 11 erhaltenen Probe zeigt;
  • 24 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 12 erhaltenen Probe zeigt;
  • 25 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 13 erhaltenen Probe zeigt;
  • 26 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 14 erhaltenen Probe zeigt;
  • 27 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 15 erhaltenen Probe zeigt;
  • 28 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 16 erhaltenen Probe zeigt;
  • 29 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 17 erhaltenen Probe zeigt;
  • 30 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 18 erhaltenen Probe zeigt;
  • 31 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 19 erhaltenen Probe zeigt;
  • 32 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 20 erhaltenen Probe zeigt;
  • 33 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 21 erhaltenen Probe zeigt;
  • 34 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 22 erhaltenen Probe zeigt;
  • 35 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in Beispiel 23 erhaltenen Probe zeigt;
  • 36 zeigt ein drittes Flussdiagramm, welches ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Analyse der Aminosäuresequenz darstellt;
  • 37 zeigt ein Reaktionschema, welches eine andere experimentelle Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
  • 38 zeigt eine Zeichnung, welche eine andere experimentelle Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
  • 39 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse zeigt, um die Bildung von Oxazolon zu bestätigen;
  • 40 zeigt eine Zeichnung, die ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse zeigt, um die Spaltung des Oxazolonrings zu bestätigen;
  • 41 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der HPLC-Analyse zeigt, um die Spaltung des Oxazolonrings zu bestätigen;
  • 42 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse zeigt, um die Spaltung des Oxazolonrings des durch HPLC abgetrennten Produkts zu bestätigen;
  • 43 zeigt eine Zeichnung, die ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse zeigt, um die Spaltung des Oxazolonrings des durch HPLC abgetrennten Produkts zu bestätigen;
  • 44 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse zeigt, um die Spaltung des Oxazolonrings des durch HPLC abgetrennten Produkts zu bestätigen; und
  • 45 zeigt eine Zeichnung, welche ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse zeigt, um Hydrolyse zu bestätigen.
  • Als eine Vorgehensweise zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wird eine Kombination wiederholt, die einen Vorgang, der aus einem ersten und einem zweiten Verfahren besteht, die im Folgenden beschrieben werden, und einen Vorgang des Isolierens und Identifizierens der hergestellten Aminosäure umfasst.
  • Erstes Verfahren
  • Ein Protein oder ein Peptid wird mit einem Säureanhydrid umgesetzt, ein Aminoterminus des Proteins oder des Peptids wird geschützt, und ein Aminosäurerest an einem C-Terminus wird modifiziert, um Oxazolon zu bilden.
  • Zweites Verfahren
  • Ein gebildetes Protein oder Peptid, dessen Carboxylende Oxazolon ist, wird mit einer Säure und Alkohol umgesetzt, um die carboxyterminale Aminosäure freizusetzen.
  • Als ein anderes Beispiel der Vorgehensweise wird, um die oben beschriebenen Probleme zu bewältigen und um nacheinander eine Aminosäure beginnend mit dem C-Terminus zu bestimmen, eine Kombination wiederholt, die eine Abfolge von Vorgängen umfasst, bestehend aus den jeweiligen Verfahren des ersten und zweiten Verfahrens, die oben beschrieben wurden, wobei Essigsäure in dem ersten Verfahren hinzugefügt wird, und einem Vorgang des Isolierens und Identifizierens der erhaltenen Aminosäure.
  • Als weitere Vorgehensweise zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wird eine Kombination wiederholt, die eine Abfolge von Vorgängen umfasst, bestehend aus den jeweiligen Verfahren von einem ersten Verfahren bis zu einem dritten Verfahren, die unten beschrieben werden, und einem Vorgang des Isolierens und Identifizierens einer gebildeten Aminosäure.
  • Erstes Verfahren
  • Ein Protein oder ein Peptid wird mit einem Säureanhydrid umgesetzt, eine Aminogruppe des Proteins oder des Peptids wird geschützt und ein Aminosäurerest an einem C-Terminus davon wird modifiziert, um Oxazolon zu bilden.
  • Zweites Verfahren
  • Das Reaktionsprodukt aus dem ersten Verfahren wird in Gegenwart von Säure mit einem Alkohol umgesetzt, das darin enthaltene Oxazolon wird einer Alkoholyse (Veresterung) unterzogen und die carboxyterminale Aminosäure wird freigesetzt.
  • Drittes Verfahren
  • Das Reaktionsprodukt aus dem zweiten Verfahren wird mit einem Amin umgesetzt, der darin enthaltene Ester wird hydrolysiert.
  • Als noch ein weiteres Beispiel der Vorgehensweise wird eine Kombination wiederholt, die eine Abfolge von Vorgängen umfasst, bestehend aus den jeweiligen Verfahren des ersten Verfahrens bis zu dem dritten Verfahren, die oben beschrieben wurden, wobei in dem ersten Verfahren Essigsäure hinzugefügt wird und einem Vorgang des Isolierens und Identifizierens der gebildeten Aminosäure.
  • Als noch eine weitere Vorgehensweise zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wird eine Kombination wiederholt, umfassend einen Vorgang, der aus einem ersten Verfahren bis zu einem fünften Verfahren besteht, die im Folgenden beschrieben werden, und einen Vorgang des Isolierens und Identifizierens der gebildeten Aminosäure oder des gebildeten Aminosäurederivats.
  • Erstes Verfahren
  • Ein Protein oder ein Peptid wird mit einem Säureanhydrid umgesetzt, ein Aminoende des Proteins oder des Peptids wird geschützt und ein Aminosäurerest an einem C-Terminus davon wird modifiziert, um Oxazolon oder intramolekulares Säureanhydrid (wenn die C-terminale Aminosäure Asparaginsäure ist) zu bilden.
  • Zweites Verfahren
  • Das Reaktionsprodukt aus dem ersten Verfahren wird mit einem Alkohol in Gegenwart von Säure umgesetzt, das darin enthaltene Oxazolon wird Alkoholyse unterzogen (Veresterung) und die carboxyterminale Aminosäure wird freigesetzt oder der Ring des intramolekularen Säureanhydrids wird geöffnet durch Alkoholyse.
  • Drittes Verfahren
  • Das Reaktionsprodukt aus dem zweiten Verfahren wird mit einem Säureanhydrid umgesetzt, der Aminosäurerest an dem C-Terminus des Proteins oder des Peptids, dessen C-Terminus nicht verestert ist, der darin enthalten ist, wird modifiziert, um Oxazolon zu bilden.
  • Viertes Verfahren
  • Das Reaktionsprodukt aus dem dritten Verfahren wird mit einem Alkohol in Gegenwart von Säure umgesetzt, das darin enthaltene Oxazolon wird Alkoholyse unterzogen (Veresterung) und die carboxyterminale Aminosäure wird freigesetzt.
  • Fünftes Verfahren
  • Das Reaktionsprodukt aus dem vierten Verfahren wird mit einem Amin umgesetzt und der darin enthaltene Ester wird hydrolysiert.
  • Als noch ein weiteres Beispiel der obigen Vorgehensweise wird eine Kombination wiederholt, welche eine Abfolge von Vorgängen umfasst, bestehend aus den jeweiligen Verfahren des ersten bis dritten Verfahrens, die oben beschrieben wurden, wobei das zweite und vierte Verfahren, in denen eine Umsetzung mit einem Alkohol erfolgt, in Gegenwart von Säure durchgeführt werden und einem Vorgang, in dem die gebildete Aminosäure oder das gebildete Aminosäurederivat isoliert und identifiziert wird.
  • Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf die vorliegenden Beispiele ausführlicher beschrieben.
  • Beispiel 1
  • 1 zeigt ein Flussdiagramm, welches die vorliegende Erfindung veranschaulicht.
  • Erstes Verfahren
  • Ein Protein oder ein Peptid wird mit einem Anhydrid einer organischen Säure, wiedergegeben durch die allgemeine Formel: CH3-(CH2)m-CO-O-CO-(CH2)n-CH3 (m und n sind jeweils eine ganze Zahl von 0 oder größer) umgesetzt, um ein Protein oder ein Peptid zu ergeben, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure in Oxazolon umgewandelt ist.
  • Zweites Verfahren
  • Anschließend wird das Protein oder das Peptid, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure in Oxazolon umgewandelt ist, mit einer Säure und Alkohol umgesetzt, um eine Mischung eines Proteins oder eines Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und bei dem ein Aminosäurerest an dem C-Terminus fehlt und der ursprünglichen C-terminalen Aminosäure zu ergeben.
  • Die dabei erhaltene Aminosäure wird isoliert und identifiziert, um die C-terminale Aminosäure des Proteins oder des Peptids zu bestimmen.
  • Anschließend werden die Vorgänge des ersten und zweiten Verfahrens unter Verwendung des Proteins oder des Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und bei dem ein Aminosäurerest an dem C-Terminus fehlt, und der Vorgang, in dem die erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird, wiederholt durchgeführt, um die Aminosäuresequenz des Proteins oder des Peptids beginnend mit dem C-Terminus zu analysieren.
  • Beispiel 2
  • Hier wird ein Beispiel der Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung beschrieben, wobei die Aminosäuresequenz eines Proteins oder Peptids beginnend mit dessen C-Terminus, analysiert wird, indem die Vorgänge des ersten und zweiten Verfahrens unter Verwendung eines Proteins oder eines Peptids und ein Vorgang, in dem die Aminosäure aus der Mischung, die in dem zweiten Verfahren erhalten wurde, isoliert und identifiziert wird, wiederholt werden.
  • 2 zeigt ein Reaktionschema, welches die experimentelle Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
  • Erstes Verfahren
  • Eine Probe wird mit Essigsäureanhydrid umgesetzt. Die Reaktionsbedingungen sind wie folgt: Reaktionsbedingungen
    Konzentration an Essigsäureanhydrid: 20% (Acetonitrillösung, Essigsäure zugegeben, um auf 1% der Konzentration einzustellen)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Nach dieser Reaktion wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingedampft, um das Reagenz und Lösungsmittel zu entfernen.
  • Zweites Verfahren
  • Die Probe wird mit Pentafluorpropionsäure (PFPA) und Methanol umgesetzt. Die Reaktionsbedingungen sind wie folgt: Reaktionsbedingungen
    Konzentration an PFPA: 50% (Methanollösung)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Unter diesen Bedingungen wird durch die Reaktion von PFPA mit Methanol ein Ester, Methylpentafluorpropionat gebildet.
  • Anschließend wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingedampft, um das Reagenz und Lösungsmittel zu entfernen.
  • Nach dem zweiten Verfahren wird die Aminosäure aus der erhaltenen Probe isoliert und identifiziert.
  • Anschließend wird eine Kombination der Vorgänge, bestehend aus dem ersten und dem zweiten Verfahren unter Verwendung des Proteins oder Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und bei dem ein Aminosäurerest an dem C-Terminus fehlt, und der Vorgang, in dem die in dem zweiten Verfahren erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird, wiederholt durchgeführt, um die Aminosäuresequenz des Proteins oder des Peptids beginnend mit dem C-Terminus, zu analysieren.
  • Beispiel 3
  • Hier werden die Bedingungen zur Analyse durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (im Folgenden hierin als HPLC bezeichnet), welche die vorliegende Erfindung beschreiben und die Ergebnisse von Standardverbindungen durch HPLC beschrieben.
  • Die Bedingungen für die HPLC-Analyse sind wie folgt: Analysebedingungen
    Säule: Shiseido C18 MICROBORE
    Elution: Gradienten Elution mit den folgenden Lösungen A und B
    Lösung A: 0,1% wässrige TFA-Lösung
    Lösung B: 80% wässrige Acetonitril-Lösung, welche 01% TFA enthält
    Tabelle 1
    Figure 00130001
    Detektion: Absorption bei 280 nm
  • Die unter diesen Bedingungen analysierten Standardverbindungen sind wie unten beschrieben. Die Ergebnisse der Analyse werden jeweils wie folgt in den Figuren gezeigt. 5 zeigt ein Ergebnis der HPLC-Analyse von Alanyltryptophan (Ala-Trp). In der Figur zeigt Nummer 1 einen Peak, welcher Alanyltryptophan entspricht. 6 zeigt ein Ergebnis der HPLC-Analyse von N-Acetylalanyltryptophan (Ac-Ala-Trp). In der Figur zeigt Nummer 2 einen Peak, der N-Acetylalanyltryptophan entspricht. 7 zeigt ein Ergebnis der HPLC-Analyse von N-Acetylalanyltryptophanyl-methionyl-arginyl-phenylalanin (Ac-Ala-Trp-Met-Arg-Phe). In der Figur zeigt Nummer 3 einen Peak, welcher N-Acetylalanyltryptophanylmethionylarginylphenylalanin entspricht und Nummer 4 zeigt einen Peak, welcher N-Acetylalanyltryptophanylmethionylarginyl-phenylalanin entspricht. 8 zeigt ein Ergebnis der HPLC-Analyse von N-Acetylalanyl-tryptophanyl-methionyl-arginyl-phenylalanylalanin (Ac-Ala-Trp-Met-Arg-Phe-Ala). In der Figur zeigt Nummer 5 einen Peak, welcher N-Acetylalanyltryptophanylmethionylarginyl-phenylalanylalanin entspricht.
  • In 7 werden zwei Peaks, welche N-Acetylalanyltryptophanylmethionylarginyl-phenylalanin entsprechen, bestimmt. Es sind Isomere.
  • Beispiel 4
  • Hier wird die Bildung von Oxazolon unter den Bedingungen für den Vorgang des ersten Verfahrens beschrieben. Als Probe wurde Alanyltryptophan (Ala-Trp) verwendet. Das Oxazolon wurde unter Verwendung der leicht durch Wasser hervorgerufenen Spaltungsreaktion detektiert. Die Detektion wurde durch HPLC-Analyse durchgeführt. 9 zeigt ein Ergebnis der HPLC-Analyse des Reaktionsprodukts, welches erhalten wurde, indem die in dem ersten Verfahren erhaltene Probe mit Wasser umgesetzt wurde. Die Bedingungen für die HPLC-Analyse sind wie in Beispiel 3 beschrieben.
  • Die Vorgehensweise der Herstellung der Probe für die HPLC-Analyse ist wie folgt.
    • (1) Verdampfen der Probe unter vermindertem Druck bis zur Trockene.
    • (2) Lösen des Rückstandes in 0,1%iger Trifluoressigsäure (als TFA bezeichnet).
  • Im Vergleich zu 7 wurde N-Acetylalanyltryptophan (Ac-Ala-Trp) 6 in 9 detektiert, dies zeigt die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren. Hier wurde das als Probe verwendete Alanyltryptophan nicht detektiert.
  • Beispiel 5
  • Hier wird die Spaltung von Oxazolon unter den Bedingungen für den Vorgang des zweiten Verfahrens beschrieben. Als Probe wurde N-Acetylalanyltryptophanylmethionylarginylphenylalanylalanin (Ac-Ala-Trp-Met-Arg-Phe-Ala) verwendet. Die Detektion wurde durch HPLC-Analyse unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 4 durchgeführt. Der Vorgang der Herstellung der Probe für die HPLC-Analyse war wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • 10 zeigt ein Ergebnis der Analyse des in dem in Beispiel 2 beschriebenen zweiten Verfahren erhaltenen Reaktionsproduktes. Im Vergleich zu 7 wurde in 10 N-Acetylalanyltryptophanylmethionylarginylphenylalanin (Ac-Ala-Trp-Met-Arg-Phe), angezeigt durch Referenznummern 7 und 8, detektiert, bei dem es sich um ein Produkt handelt, welchem die C-terminale Aminosäure, Alanin, von N-Acetylalanyltryptophanylmethionylarginylphenylalanylalanin (Ac-Ala-Trp-Met-Arg-Phe-Ala), welches als Probe verwendet wurde, fehlt. Dies zeigt die Spaltung des Oxazolonrings unter den Bedingungen für das zweite Verfahren, Freisetzung der C-terminalen Aminosäure und Bildung des Peptids, welchem die C-terminale Aminosäure (mit acetylertem Aminoterminus) fehlt. Diese C-terminale Aminosäure wird identifiziert, um den C-Terminus des Peptids zu identifizieren.
  • Anschließend wird eine Kombination der Vorgänge, bestehend aus dem ersten und zweiten Verfahren unter Verwendung des Peptids, welchem die C-terminale Aminosäure fehlt (welches einen acetylierten Aminoterminus aufweist), und dem Vorgang, in welchem die erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird, wiederholt ausgeführt, um die Aminosäuresequenz des verwendeten Proteins oder Peptids, beginnend mit dem C-Terminus, zu analysieren.
  • Die entsprechenden Ergebnisse von Beispiel 1 bis 5 sind wie folgt zusammengefasst.
  • In der vorliegenden Erfindung wurde, um die Aminosäuresequenz, beginnend mit dem C-Terminus, zu analysieren, eine Kombination der Vorgänge, bestehend aus den folgenden ersten und zweiten Verfahren und dem Vorgang, in welchem die erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird, wiederholt durchgeführt.
  • Erstes Verfahren
  • Ein Protein oder ein Peptid wird mit einem Säureanhydrid umgesetzt, der Aminoterminus des Proteins oder des Peptids wird geschützt und der Aminosäurerest an dem C-Terminus wird modifiziert, um Oxazolon zu bilden.
  • Zweites Verfahren
  • Das gebildete Protein oder Peptid, dessen Carboxyterminus Oxazolon ist, wird mit einer Säure und Alkohol umgesetzt, um die carboxyterminale Aminosäure freizusetzen.
  • Im Folgenden wird hierin ein weiteres Verfahren zur Durchführung der vorliegenden Erfindung genauer beschrieben.
  • Beispiel 6
  • 11 zeigt ein Flussdiagramm, welches die vorliegende Erfindung veranschaulicht.
  • Erstes Verfahren
  • Ein Protein oder ein Peptid wird mit einem Anhydrid einer organischen Säure, welche durch die allgemeine Formel wiedergegeben ist: CH3-(CH2)m-CO-O-CO-(CH2)n-CH3 (m und n sind jeweils eine ganze Zahl von 0 oder größer) umgesetzt, um ein Protein oder ein Peptid zu ergeben, dessen Aminogruppe modifiziert ist und bei dem die C-terminale Aminosäure in Oxazolon umgewandelt ist.
  • Zweites Verfahren
  • Anschließend wird das Protein oder das Peptid, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure in Oxazolon umgewandelt ist, mit einem Alkohol in Gegenwart von Säure umgesetzt, um eine Mischung eines neu erzeugten Proteins oder Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist, dessen C-terminale Aminosäure fehlt und dessen Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure verestert ist und der ursprünglichen C-terminalen Aminosäure zu ergeben.
  • Drittes Verfahren
  • Die Mischung des neu erzeugten Proteins oder Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist, dessen C-terminale Aminosäure fehlt und bei dem die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure verestert ist, und der Aminosäure werden umgesetzt mit einer wässrigen Lösung eines Amins, beispielsweise eines durch allgemeine Formel NR1R2R3 wiedergegebenen Amins, um eine Mischung eines Proteins oder eines Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt, und der Aminosäure zu ergeben.
  • Die in dem ersten bis dritten Verfahren, welche oben beschrieben wurden, erhaltene Aminosäure wird isoliert und identifiziert, um die C-terminale Aminosäure des Proteins oder des Peptids zu bestimmen.
  • Anschließend wird eine Abfolge von Vorgängen des ersten bis dritten Verfahrens unter Verwendung des Proteins oder des Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt, und der Vorgang, in dem die erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird, wiederholt durchgeführt, um die Aminosäuresequenz des Proteins oder des Peptids, beginnend mit dem C-Terminus, zu analysieren.
  • Beispiel 7
  • Hier wird ein Beispiel der Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung beschrieben, durch welche eine Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids, beginnend mit dessen C-Terminus, analysiert wird, indem eine Abfolge von Vorgängen des ersten bis dritten Verfahrens unter Verwendung eines Proteins oder eines Peptids und ein Vorgang, in welchem die aus der Mischung in dem zweiten Verfahren erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird, wiederholt werden.
  • 12 zeigt ein Beispiel eines Reaktionsschemas, welches eine experimentelle Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
  • Erstes Verfahren
  • Eine Probe wird mit Essigsäureanhydrid umgesetzt. Ein Beispiel der Reaktionsbedingungen ist wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an Essigsäureanhydrid: 20% (Acetonitrillösung, Essigsäure zugegeben, um auf 1% der Konzentration einzustellen)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Nach dieser Reaktion wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingedampft, um das Reagenz und Lösungsmittel zu entfernen.
  • Zweites Verfahren
  • Die dabei erhaltene Probe wird mit Methanol in Gegenwart von Pentafluorpropionsäure (CF3-CF2-COOH: im Folgenden hierin als PFPA bezeichnet) umgesetzt. Ein Beispiel der Reaktionsbedingungen ist wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an PFPA: 10% (Methanollösung)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Nach dieser Reaktion wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingedampft, um das Reagenz und Lösungsmittel zu entfernen.
  • Drittes Verfahren
  • Die dabei erhaltene Probe wird mit 2-Dimethylaminoethanol (im Folgenden hierin als DMAE bezeichnet) umgesetzt. Die Reaktionsbedingungen sind wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an DMAE: 10% (wässrige Lösung)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • In einer Abfolge dieser Vorgänge wird nach dem zweiten Verfahren die Aminosäure aus der erhaltenen Probe isoliert und identifiziert.
  • Anschließend wird die Kombination aus einer Abfolge der Vorgänge des ersten bis dritten Verfahrens unter Verwendung des Proteins oder des Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt, und der Vorgang, in welchem die in dem zweiten Verfahren erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird, wiederholt durchgeführt, um die Aminosäuresequenz des Proteins oder des Peptids, beginnend mit dem C-Terminus, zu analysieren.
  • Beispiel 8
  • Hier wird ein Beispiel der Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung beschrieben, durch welche eine Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids, beginnend mit dem C-Terminus, analysiert wird, indem eine Kombination einer Abfolge der Vorgänge des ersten bis dritten Verfahrens unter Verwendung eines Proteins oder eines Peptids, und ein Vorgang, in welchem die Aminosäure aus der in dem dritten Verfahren erhaltenen Mischung isoliert und identifiziert wird, wiederholt werden.
  • Eine Abfolge der Vorgänge des ersten bis dritten Verfahrens ist dieselbe, wie in Beispiel 7 beschrieben. In einer Abfolge dieser Vorgänge wird nach dem dritten Verfahren die Aminosäure aus der erhaltenen Probe isoliert und identifiziert.
  • Anschließend wird eine Abfolge der Vorgänge des ersten bis dritten Verfahrens unter Verwendung des Proteins oder des Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt, und der Vorgang, in welchem die in dem dritten Verfahren erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird, wiederholt durchgeführt, um die Aminosäuresequenz des Proteins oder des Peptids, beginnend mit dem C- Terminus, zu analysieren.
  • Beispiel 9
  • Hier werden die Bedingungen für die HPLC-Analyse, welche die vorliegende Erfindung beschreiben und die Ergebnisse der Analyse von Standardverbindungen durch HPLC beschrieben.
  • Die Bedingungen für die HPLC-Analyse waren wie folgt. Analysebedingungen
    Säule: Shiseido C18 MICROBORE
    Elution: Gradienten-Elution mit den folgenden Lösungen A und B
    Lösung A: 0,1%ige wässrige TFA Lösung
    Lösung B: 80%ige wässrige Acetonitrillösung, welche 0,1% TFA enthält.
    Tabelle 2
    Figure 00200001
    Detektion: Absorption bei 280 nm
  • Die unter diesen Bedingungen analysierten Standardverbindungen sind wie im Folgenden beschrieben. Die Ergebnisse der Analyse werden in den jeweiligen Figuren wie folgt gezeigt. 13 zeigt das Ergebnis der HPLC-Analyse von Tryptophan (Trp). In der Figur zeigt Nummer 9 einen Peak, welcher Tryptophan entspricht. 14 zeigt die Analyse von Alanyltryptophan (Ala-Trp). In der Figur zeigt Nummer 10 einen Peak, welcher Alanyltryptophan entspricht. 15 zeigt die Analyse von N-Acetylalanyltryptophan (Ac-Ala-Trp). In der Figur zeigt Nummer 11 einen Peak, welcher N-Acetylalanyltryptophan entspricht. 16 zeigt die Analyse des Ethylesters von N-Acetylalanyltryptophan (Ac-Ala-Trp-OEt). In der Figur zeigt Nummer 12 einen Peak, welcher dem Ethylester von N-Acetylalanyltryptophan entspricht.
  • Beispiel 10
  • Hier wird die Bildung von Oxazolon unter den Bedingungen des Vorgangs des ersten Verfahrens beschrieben. Als Probe wurde Alanyltryptophan (Ala-Trp) verwendet. Das Oxazolon wurde unter Verwendung der leicht durch Wasser hervorgerufenen Spaltungsreaktion detektiert. Die Detektion wurde durch HPLC-Analyse durchgeführt. 9 zeigt das Ergebnis der HPLC-Analyse des Reaktionsproduktes welches dadurch erhaltenen wurde, dass die in dem ersten Verfahren erhaltene Probe mit Wasser umgesetzt wurde. Die Bedingungen der HPLC-Analyse sind wie in Beispiel 9 beschrieben.
  • Die Vorgehensweise der Herstellung der Probe für die HPLC-Analyse ist wie folgt.
    • (1) Verdampfen der Probe unter vermindertem Druck bis zur Trockene.
    • (2) Lösen des Rückstandes in 0,1% TFA
  • Im Vergleich zu 15 wurde in 17 das mit Referenznummer 13 bezeichnete N-Acetylalanyltryptophan (Ac-Ala-Trp) detektiert, dies zeigt die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren. Hier wurde das als Probe verwendete Alanyltryptophan nicht detektiert.
  • Beispiel 11
  • Hier wird die Spaltung von Oxazolon unter den Bedingungen des Vorgangs des zweiten Verfahrens beschrieben. Als Probe wurde Alanyltryptophan auf dieselbe Weise wie in Beispiel 10 verwendet. Die Detektion wurde durch HPLC-Analyse unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 9 durchgeführt. Die Vorgehensweise zur Herstellung der Probe für die HPLC-Analyse war wie in Beispiel 5 beschrieben.
  • 10 zeigt das Ergebnis der Analyse des in dem ersten und zweiten Verfahren, welche in Beispiel 7 beschrieben wurden, erhaltenen Reaktionsproduktes. Im Vergleich zu 13 wurde in 18 Tryptophan (Referenznummer 14) detektiert, was die Spaltung des Oxazolonrings unter den Bedingungen in dem zweiten Verfahren und die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure zeigt.
  • Beispiel 12
  • In Beispiel 11 wurde das Oxazolon mit einer alkoholischen Lösung von PFPA umgesetzt, um die carboxyterminale Aminosäure freizusetzen. Durch die Wirkung dieses Alkohols (Alkoholyse) erfolgt in Konkurrenz zur Freisetzung der Aminosäure eine Veresterung der neu gebildeten Carboxylgruppe am C-Terminus. Um die Aminosäuresequenzierung des Proteins oder des Peptids, beginnend mit dem C-Terminus fortzusetzen, muss der Ester hydrolysiert werden, um eine Carboxylgruppe zu ergeben.
  • Hier wird die Hydrolyse des Esters unter den Bedingungen in dem Vorgang des dritten Verfahrens beschrieben. Als Probe wurde der Ethylester von N-Acetylalanyltryptophan (Ac-Ala-Trp-OEt) verwendet. Die Detektion wurde durch HPLC-Analyse unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 9 durchgeführt.
  • Die Vorgehensweise zur Herstellung der Probe für die HPLC-Analyse war wie in Beispiel 5 beschrieben.
  • 11 zeigt das Ergebnis der Analyse des in dem dritten Verfahren, welches in Beispiel 7 beschrieben wurde, erhaltenen Reaktionsprodukts. Im Vergleich zu 15 wurde in 19 N-Acetylalanyltryptophan (Ac-Ala-Trp) (Referenznummer 15) detektiert, was die Hydrolyse des Esters durch die Wirkung der wässrigen Amin-Lösung unter den Bedingungen des dritten Verfahrens von Beispiel 7 zeigt.
  • Beispiel 13
  • In den folgenden Beispielen wird die vorliegende Erfindung unter Verwendung von Massenspektrometrie beschrieben.
  • Dieses Beispiel zeigt die Bedingungen der massenspektrometrischen Analyse und die Vorgehensweise für die Probenherstellung. Bedingungen für die massenspektrometrische Analyse
    Analysator: Doppelfokus-Massenspektrometer HX-110 (Nihon Denshi)
    Analysebedingungen: Beschleunigungspotenzial 10 kV
    Auflösung: 1000
    Ionenquelle: FAB (fast-atom bombardment Verfahren)
    Ionisierungsgas: Xe
    Ionenmodus: kationisch
    FAB-Gun-Beschleunigungspotenzial: 6 kV
    Detektor: MULTIPLIER
    Ladungspotenzial: –20 kV
    Datenverarbeitungssystem: DA5000
    Matrix: Glyzerin:Thioglycerin:m-Nitrobenzylalkohol = 1:1:1
  • Vorgehensweise für die Probenherstellung
    • (1) Verdampfen einer Probe unter vermindertem Druck bis zur Trockene.
    • (2) Auflösen des Rückstandes in 67%iger wässriger Essigsäure (oder Dimethylformamid) Lösung.
    • (3) Anbringen von 1 μl der Matrix auf dem Ziel.
    • (4) Anbringen von 1 μl der Probenlösung auf dem Ziel und deren Mischung ermöglichen.
    • (5) Einbringen des Gemischs in die Ionenquelle.
  • Beispiel 14
  • Hier wird eine Untersuchung der Reaktionsbedingungen für die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren unter Verwendung von Massenspektrometrie beschrieben. Als Probe wurde ein Pentapeptid der Sequenz Nr. 1, Leucyltryptophanylmethionylarginyl-phenylalanin (Leu-Trp-MetArg-Phe) verwendet. In diesem Beispiel wurde das zweite Verfahren im Anschluss an das erste Verfahren durchgeführt.
  • Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren sind dieselben wie in Beispiel 2 wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an Essigsäureanhydrid: 20% (Acetonitrillösung, Essigsäure zugegeben, um auf 1% der Konzentration einzustellen)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren waren wie folgt:
    Heptafluorbutansäure (CF3-CF2-CF2-COOH; in Folgenden hierin als HFBA bezeichnet) und Ethanol wurden als die Säure bzw. der Alkohol verwendet. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (ethanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • 20 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Hier wurde ein Molekülion (Referenznummer 16), welches dem Reaktionsprodukt, dessen Aminoterminus acetyliert war, dessen C-terminale Aminosäure fehlte und dessen Carboxylgruppe an dem C-Terminus mit einer Ethylgruppe verestert war (der Ethylester von Acetylleucyltryptophanylmethionylarginin Molekulargewicht von 675; im Folgenden hierin als Ac-LWMR-OEt bezeichnet) detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren und Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweiten Verfahren zeigte.
  • Beispiel 15
  • Hier wird ein weiteres Beispiel der Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren beschrieben. Als Probe wurde das Pentapeptid der Sequenz Nr. 1 auf dieselbe Weise wie in Beispiel 14 verwendet. Die Vorgehensweisen sind dieselben wie in Beispiel 14. Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren waren wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an Essigsäureanhydrid: 20% (Acetonitrillösung, ohne Zugabe von Essigsäure)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren sind dieselben wie in Beispiel 13.
  • 21 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde ebenfalls das Ac-LWMR-OEt entsprechende Molekülion detektiert (Referenznummer 17), was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren anzeigt. Gleichzeitig wurden Molekülionen mit einem Molekulargewicht von 718 und 761 detektiert (Referenznummern 18 bzw. 19), was die Bildung von chemischen Substanzen anzeigt, bei denen es sich um weitere Acetylierungsreaktionsprodukte handelt, deren Aminoterminus acetyliert war, deren C-terminale Aminosäure fehlte und deren Carboxylgruppe an dem C-Terminus mit einer Ethylgruppe verestert war.
  • Beispiel 16
  • Hier wird ein weiteres Beispiel der Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren beschrieben. Als Probe wurde das Pentapeptid der Sequenz Nr. 1 auf dieselbe Weise wie in Beispiel 9 verwendet. Die Vorgehensweisen folgten Beispiel 14. Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren waren wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an Essigsäureanhydrid: 20% (Acetonitrillösung, Essigsäure zugegeben,um auf 2% der Konzentration einzustellen)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren waren dieselben wie in Beispiel 16.
  • 22 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde auch ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OEt (Referenznummer 20) entspricht, detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 17
  • Hier wird ein weiteres Beispiel der Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren beschrieben. Als Probe wurde das Pentapeptid der Sequenz Nr. 1 auf dieselbe Weise wie in Beispiel 9 verwendet. Die Vorgehensweisen folgten Beispiel 14. Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren waren wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an Essigsäureanhydrid: 5% (Acetonitrillösung, Essigsäure zugegeben, um auf 1% der Konzentration einzustellen)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren sind dieselben wie in Beispiel 14.
  • 23 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde auch ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OEt entspricht (Referenznummer 21) detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 18
  • Hier wird eine Untersuchung der Reaktionsbedingungen für die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweiten Verfahren beschrieben. Als Probe wurde ein Pentapeptid der Sequenz Nr. 1 verwendet. In den folgenden Beispielen wurde jeweils das zweite Verfahren im Anschluss an das erste Verfahren ausgeführt.
  • Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren sind dieselben wie in Beispiel 14 wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an Essigsäureanhydrid: 20% (Acetonitrillösung, Essigsäure zugegeben, um auf 1% der Konzentration einzustellen)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren wurden wie folgt geändert. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 2% (ethanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • 34 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Hier wurde ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OEt (Referenznummer 22) entspricht, detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren und die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweiten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 19
  • Hier wurden die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren wie folgt geändert. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (ethanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 10 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren folgten Beispiel 9.
  • 25 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde auch ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OEt (Referenznummer 23) entspricht, detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren und die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweiten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 20
  • Hier wurden die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren wie folgt geändert. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (ethanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: Raumtemperatur
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren waren dieselben wie in Beispiel 14.
  • 26 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde auch ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OEt (Referenznummer 24) entspricht, detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren und die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweiten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 21
  • Hier wurden die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren wie folgt geändert. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (ethanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 5°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren sind dieselben wie in Beispiel 14.
  • 27 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde auch ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OEt (Referenznummer 25) entspricht, detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren und die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweiten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 22
  • Hier wurden die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren wie folgt geändert. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (ethanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 100°C
    Reaktionszeitraum: 15 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren folgten Beispiel 14.
  • 28 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde auch ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OEt (Referenznummer 26) entspricht, detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren und die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweiten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 23
  • Hier wurden die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren wie folgt geändert. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (methanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren sind dieselben wie in Beispiel 14.
  • 29 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde ein Molekülion (entsprechend dem Reaktionsprodukt, dessen Aminoterminus acetyliert war, dessen C-terminale Aminosäure fehlte und dessen Carboxylgruppe am C-Terminus mit einer Methylgruppe verestert war (der Methylester von Acetylleucyltryptophanylmethionylarginin, Molekulargewicht von 661; im folgenden hierin als Ac-LWMR-OMe bezeichnet) (Referenznummer 27) detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren und die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweiten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 24
  • Hier wurden die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren wie folgt geändert. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (methanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 5°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren sind dieselben wie in Beispiel 14.
  • 30 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde auch ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OMe (Referenznummer 28) entspricht, detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren und die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweiten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 25
  • Hier wurden die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren wie folgt geändert. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an PFPA: 5% (ethanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren sind dieselben wie in Beispiel 14.
  • 31 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OEt (Referenznummer 29) entspricht, detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren und die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweiten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 26
  • Hier wurden die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren wie folgt geändert. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an PFPA: 20% (ethanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren sind dieselben wie in Beispiel 14.
  • 32 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde auch ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OEt (Referenznummer 30) entspricht, detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren und die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweiten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 27
  • Hier waren die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an Essigsäureanhydrid: 20% (Acetonitrillösung, Essigsäure zugegeben, um auf 1% der Konzentration einzustellen)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 10 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren waren wie folgt: Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (methanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: Raumtemperatur
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • 33 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde auch ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OMe (Referenznummer 31) entspricht, detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 28
  • Hier waren die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an Essigsäureanhydrid: 20% (Acetonitrillösung, Essigsäurezugegeben, um auf 1% der Konzentration einzustellen)
    Reaktionstemperatur: 90°C
    Reaktionszeitraum: 10 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren waren wie folgt: Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (methanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: Raumtemperatur
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • 34 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde auch ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OMe (Referenznummer 32) entspricht, detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren und die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweiten Verfahren zeigt.
  • Beispiel 29
  • Hier waren die Reaktionsbedingungen in dem ersten Verfahren wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an Essigsäureanhydrid: 20% (Acetonitrillösung, Essigsäurezugegeben, um auf 1% der Konzentration einzustellen)
    Reaktionstemperatur: Raumtemperatur
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Reaktionsbedingungen in dem zweiten Verfahren wurden wie folgt geändert. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (methanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • 35 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der erhaltenen Probe. Unter diesen Bedingungen wurde auch ein Molekülion, welches Ac-LWMR-OMe (Referenznummer 33) entspricht, detektiert, was die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren und die Freisetzung der C-terminalen Aminosäure in dem zweitem Verfahren zeigt.
  • Die jeweiligen Ergebnisse der Beispiele 6 bis 29 sind wie folgt zusammengefasst.
  • In der vorliegenden Erfindung wird, um die Aminosäuresequenz beginnend mit dem C-Terminus zu analysieren, eine Kombination aus einer Abfolge der Vorgänge, bestehend aus den folgenden ersten bis dritten Verfahren und dem Vorgang, in dem die erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird, wiederholt durchgeführt.
  • Erstes Verfahren
  • Ein Protein oder ein Peptid wird mit einem Säureanhydrid umgesetzt, die Aminogruppe des Proteins oder des Peptids wird geschützt und der Aminosäurerest an dem C-Terminus wird modifiziert, um Oxazolon zu bilden.
  • Zweites Verfahren
  • Das Reaktionsprodukt des ersten Verfahrens wird mit einem Alkohol in Gegenwart von Säure umgesetzt, das darin enthaltene Oxazolon wird Alkoholyse (Veresterung) unterzogen und die carboxyterminale Aminosäure wird freigesetzt.
  • Drittes Verfahren
  • Das Reaktionsprodukt aus dem zweiten Verfahren wird mit einem Amin umgesetzt, der darin enthaltene Ester wird hydrolysiert.
  • Im Folgenden wird hierin eine weitere Vorgehensweise zur Durchführung der vorliegenden Erfindung ausführlicher beschrieben.
  • Beispiel 30
  • 36 zeigt ein Flussdiagramm, welches die vorliegende Erfindung veranschaulicht.
  • Erstes Verfahren
  • Ein Protein oder ein Peptid wird mit einem Anhydrid einer organischen Säure umgesetzt, welches durch die allgemeine Formel wiedergegeben wird: CH3-(CH2)m-CO-O-CO-(CH2)n-CH3 (m und n sind jeweils eine ganze Zahl von 0 oder größer), um ein Protein oder ein Peptid zu ergeben, bei dem die Aminogruppe modifiziert ist und die C-terminale Aminosäure in Oxazolon umgewandelt ist, oder um ein Protein oder ein Peptid zu ergeben, dessen Aminogruppe acetyliert ist und bei dem die Asparaginsäure an dem C-Terminus in ein intramolekulares Säureanhydrid umgewandelt ist, wenn die C-terminale Aminosäure Asparaginsäure ist.
  • Zweites Verfahren
  • Anschließend wird das Protein oder Peptid, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure in Oxazolon umgewandelt ist, oder das Protein oder das Peptid, dessen Aminogruppe acetyliert ist und bei dem die Asparaginsäure an dem C-Terminus in ein intramolekulares Säureanhydrid umgewandelt ist, mit einem Alkohol in Gegenwart von Säure umgesetzt, um eine Mischung eines neu gebildeten Proteins oder Peptids, dessen Aminogruppe acetyliert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt und bei dem die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure verestert ist, und der ursprünglichen C-terminalen Aminosäure zu ergeben. Zu diesem Zeitpunkt wird das Protein oder das Peptid dessen Aminogruppe acetyliert ist und bei dem die Asparaginsäure an dem C-Terminus in ein intramolekulares Säureanhydrid umgewandelt ist, in ein Protein oder ein Peptid umgewandelt, dessen Aminogruppe acetyliert ist, und bei dem die B-Carboxylgruppe der Asparaginsäure an dem C-Terminus verestert ist.
  • Drittes Verfahren
  • Das Gemisch aus einem neu erzeugten Proteins oder Peptids, dessen Aminogruppe acetyliert ist, dessen C-terminale Aminosäure fehlt und bei dem die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure verestert ist, und der ursprünglichen C-terminalen Aminosäure oder dem Protein oder Peptid, dessen Aminogruppe acetyliert ist und bei dem die β-Carboxylgruppe der Asparaginsäure an dem C-Terminus verestert ist wird mit einem Anhydrid einer organischen Säure, welche wiedergegeben ist durch die allgemeine Formel: CH3-(CH2)m-CO-O-CO-(CH2)n-CH3 (m und n sind jeweils eine ganze Zahl von 0 oder größer) umgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt wird das neu gebildete Protein oder Peptid dessen Aminogruppe modifiziert ist, bei dem die C-terminale Aminosäure fehlt und bei dem die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure verestert ist, überhaupt nicht beeinflusst. Die ursprüngliche C-terminale Aminosäure wird in ein acetyliertes Aminosäurederivat umgewandelt. Andererseits wird das Protein oder Peptid, dessen Aminogruppe acetyliert ist und bei dem die β-Carboxylgruppe der Asparaginsäure an dem C-Terminus verestert ist, in ein Protein oder Peptid umgewandelt, dessen Aminogruppe acetyliert ist, bei dem die α-Carboxylgruppe der Asparaginsäure an dem C-Terminus in Oxazolon umgewandelt ist und dessen β-Carboxylgruppe verestert ist.
  • Viertes Verfahren
  • Weiter wird das Gemisch eines neu erzeugten Proteins oder Peptids, dessen Aminogruppe acetyliert ist, dessen C-terminale Aminosäure fehlt und bei dem die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure verestert ist und des Aminosäurederivates oder das Protein oder Peptid, dessen Aminogruppe acetyliert ist, bei dem die α-Carboxylgruppe der Asparaginsäure an dem C-Terminus in Oxazolon umgewandelt ist und die β-Carboxylgruppe verestert ist, mit einem Alkohol in Gegenwart von Säure umgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt werden das neu erzeugte Protein oder Peptid, dessen Aminogruppe modifiziert ist, dessen C-terminale Aminosäure fehlt und bei dem die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure verestert ist und das Aminosäurederivat überhaupt nicht beeinflusst. Andererseits wird das Protein oder das Peptid, dessen Aminogruppe modifiziert ist, bei dem die α-Carboxylgruppe der Asparaginsäure an dem C-Terminus in Oxazolon umgewandelt ist und die β-Carboxylgruppe verestert ist, in ein Gemisch des neu erzeugten Proteins oder Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist, bei dem die C-terminale Aminosäure fehlt und die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure verestert ist und einer Asparaginsäure, deren β-Carboxylgruppe verestert ist, umgewandelt.
  • Fünftes Verfahren
  • Anschließend wird das Gemisch des neu erzeugten Proteins oder Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist, dessen C-terminale Aminosäure fehlt und bei dem die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure verestert ist und des Aminosäurederivates oder das Gemisch des neu erzeugten Proteins oder Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist, dessen C-terminale Aminosäure fehlt und bei dem die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure verestert ist und der Asparaginsäure, deren β-Carboxylgruppe verestert ist, mit einem Amin, beispielsweise einem Amin, welches wiedergegeben ist durch die allgemeine Formel NR1R2R3 umgesetzt, um ein Gemisch eines Proteins oder eines Peptids, dessen Aminosäure modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt, und des Aminosäurederivats oder ein Gemisch aus einem Protein oder Peptid, dessen Aminosäure modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt und Asparaginsäure, zu ergeben. Diese Asparaginsäure ist die ursprüngliche C-terminale Aminosäure.
  • Die in dem ersten bis fünften Verfahren, welche oben beschrieben wurden, erhaltene Aminosäure oder das erhaltene Aminosäurederivat wird isoliert und identifiziert, um die C-terminale Aminosäure des Proteins oder des Peptids zu bestimmen.
  • Anschließend wird eine Abfolge der Vorgänge von dem ersten bis fünften Verfahren unter Verwendung des Proteins oder Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt und der Vorgang, in welchem die erhaltene Aminosäure oder das erhaltene Aminosäurederivat isoliert und identifiziert wird, wiederholt durchgeführt, um die Aminosäuresequenz des Proteins oder des Peptids, beginnend mit dem C-Terminus, zu analysieren.
  • Beispiel 31
  • Hier wird ein Beispiel der Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung beschrieben, wodurch eine Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids, beginnend mit dessen C-Terminus, analysiert wird, indem eine Abfolge der Vorgänge von dem ersten bis fünften Verfahren unter Verwendung eines Proteins oder eines Peptids, ein Vorgang, in welchem die Aminosäure aus der in dem zweiten Verfahren erhaltenen Mischung isoliert und identifiziert wird, und ein Vorgang, in welchem die Aminosäure aus der in dem fünften Verfahren erhaltenen Mischung isoliert und identifiziert wird, wiederholt durchgeführt werden. 37 zeigt ein Reaktionsschema, welches die experimentelle Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. 38 zeigt ein experimentelles Verfahren der vorliegenden Erfindung.
  • Erstes Verfahren
  • Eine Probe wird mit Essigsäureanhydrid umgesetzt. Zunächst wird eine Probelösung, welche eine Protein- oder eine Peptidprobe enthält, in ein kleines Testgefäß 34 gegeben und getrocknet. Andererseits wird eine Lösung eines Reaktionsreagenzes (hier eine Lösung von Essigsäureanhydrid in Acetonitril) 36 in ein Testgefäß 35 gegeben. Das kleine Testgefäß 34, welches die Probe 37 enthält, wird in das Testgefäß 35 gegeben. Dieses Testgefäß 35 wird unter vermindertem Druck mit einer Vakuumpumpe verschlossen und die Reaktion läuft ab.
  • Die Reaktionsbedingungen sind wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an Essigsäureanhydrid: 20% (Acetonitrillösung)
    Reaktionstemperatur: 60°C
    Reaktionszeitraum: 10 Minuten
  • Nach dieser Reaktion wird die Oberseite des Testgefäßes 35 geöffnet und das kleine Testgefäß 34 wird herausgenommen. Anschließend wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck bis zu Trockene eingedampft, um das Reagenz und Lösungsmittel zu entfernen.
  • Zweites Verfahren
  • Die dabei erhaltene Probe wird mit Methanol in Gegenwart von HFBA umgesetzt. Die experimentelle Vorgehensweise und die für die Reaktion verwendeten Geräte sind dieselben wie im ersten Verfahren.
  • Die Reaktionsbedingungen sind wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (methanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 5°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Nach dieser Reaktion wird die Oberseite des Testgefäßes geöffnet und das kleine Testgefäß wird herausgenommen. Anschließend wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck bis zu Trockene eingedampft, um das Reagenz und Lösungsmittel zu entfernen.
  • Drittes Verfahren
  • Die dabei erhaltene Probe wird mit Essigsäureanhydrid umgesetzt. Die experimentelle Vorgehensweise und die für die Reaktion verwendeten Geräte sind dieselben wie im ersten Verfahren.
  • Viertes Verfahren
  • Die dabei erhaltene Probe wird mit Methanol in Gegenwart von HFBA umgesetzt. Die experimentelle Vorgehensweise und die für die Reaktion verwendeten Geräte sind dieselben wie in dem zweiten Verfahren.
  • Fünftes Verfahren
  • Die dabei erhaltene Probe wird mit DMAE umgesetzt. Die experimentelle Vorgehensweise und die für die Reaktion verwendeten Geräte entsprechen dem ersten Verfahren. Die in das Testgefäß gegebene Lösung ist eine wässrige Lösung von DMAE.
  • Die Reaktionsbedingungen sind wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an DMAE: 50% (wässrige Lösung)
    Reaktionstemperatur: 50°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • In einer Abfolge dieser Vorgänge wird nach dem zweiten Verfahren die Aminosäure aus der erhaltenen Probe isoliert und identifiziert. Weiterhin wird nach dem fünften Verfahren die Aminosäure aus der erhaltenen Probe isoliert und identifiziert.
  • Anschließend wird eine Abfolge der Vorgehensweisen des ersten bis fünften Verfahrens unter Verwendung des Proteins oder des Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt, der Vorgang, in welchem die in dem zweiten Verfahren erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird, der Vorgang in dem die in dem fünften Verfahren erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird und ein Vorgang, in dem die restliche Aminosäure und das restliche Aminosäurederivat entfernt werden, wiederholt durchgeführt, um die Aminosäuresequenz des Proteins oder des Peptids, beginnend mit dem C-Terminus, zu analysieren.
  • Beispiel 32
  • Hier wird ein Beispiel der Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung beschrieben, wodurch eine Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids, beginnend mit dessen C-Terminus, analysiert wird, indem eine Abfolge der Vorgänge von dem ersten bis fünften Verfahren unter Verwendung eines Proteins oder eines Peptids und ein Vorgang, in dem die Aminosäure aus der in dem zweiten Verfahren erhaltenen Mischung isoliert und identifiziert wird, wiederholt durchgeführt werden.
  • Eine Abfolge der Vorgänge von dem ersten bis fünften Verfahren ist dieselbe wie in Beispiel 31. In einer Abfolge dieser Vorgänge wird nach dem zweiten Verfahren die Aminosäure aus der erhaltenen Probe isoliert und identifiziert. Ferner wird nach dem fünften Verfahren die restliche Aminosäure und das restliche Aminosäurederivat entfernt. Anschließend wird eine Abfolge der Vorgehensweisen des ersten bis fünften Verfahrens unter Verwendung des Proteins oder des Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt, der Vorgang in dem die in dem zweiten Verfahren erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird und der Vorgang, in dem die restliche Aminosäure und das restliche Aminosäurederivat entfernt werden, wiederholt durchgeführt, um die Aminosäuresequenz des Proteins oder des Peptids, beginnend mit dem C-Terminus, zu analysieren.
  • Beispiel 33
  • Hier wird ein Beispiel der Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung beschrieben, wodurch eine Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids, beginnend mit dessen C-Terminus, analysiert wird, indem eine Abfolge der Vorgänge von dem ersten bis fünften Verfahren unter Verwendung eines Proteins oder eines Peptids und ein Vorgang, in dem das Aminosäurederivat aus der in dem dritten Verfahren erhaltenen Mischung isoliert und identifiziert wird, wiederholt werden.
  • Eine Abfolge der Vorgänge von dem ersten bis fünften Verfahren ist dieselbe wie in Beispiel 31. In einer Abfolge dieser Vorgänge wird nach dem dritten Verfahren das Aminosäurederivat aus der erhaltenen Probe isoliert und identifiziert. Weiter werden nach dem fünften Verfahren die restliche Aminosäure und das restliche Aminosäurederivat entfernt. Anschließend wird eine Abfolge der Vorgehensweisen des ersten bis fünften Verfahrens unter Verwendung des Proteins oder des Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt, der Vorgang in dem das in dem dritten Verfahren erhaltene Aminosäurederivat isoliert und identifiziert wird und der Vorgang, in dem die restliche Aminosäure und das restliche Aminosäurederivat entfernt werden, wiederholt durchgeführt, um die Aminosäuresequenz des Proteins oder des Peptids, beginnend mit dem C-Terminus, zu analysieren.
  • Beispiel 34
  • Hier wird ein Beispiel der Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung beschrieben, wodurch eine Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids, beginnend mit dessen C-Terminus, analysiert wird, indem eine Abfolge der Vorgänge des ersten bis fünften Verfahrens unter Verwendung eines Proteins oder eines Peptids und ein Vorgang, in dem das Aminosäurederivat aus der in dem vierten Verfahren erhaltenen Mischung isoliert und identifiziert wird, wiederholt werden.
  • Eine Abfolge der Vorgänge des ersten bis fünften Verfahrens ist dieselbe wie in Beispiel 31. In einer Abfolge dieser Vorgänge wird nach dem vierten Verfahren das Aminosäurederivat aus der erhaltenen Probe isoliert und identifiziert. Weiter werden nach dem fünften Verfahren die restliche Aminosäure und das restliche Aminosäurederivat entfernt. Anschließend wird eine Abfolge der Vorgehensweisen des ersten bis fünften Verfahrens unter Verwendung des Proteins oder des Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt, der Vorgang in dem das in dem vierten Verfahren erhaltene Aminosäurederivat isoliert und identifiziert wird und der Vorgang, in dem die restliche Aminosäure und das restliche Aminosäurederivat entfernt werden, wiederholt durchgeführt, um die Aminosäuresequenz des Proteins oder des Peptids, beginnend mit dem C-Terminus, zu analysieren.
  • Beispiel 35
  • Hier wird ein Beispiel der Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung beschrieben, wodurch eine Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids, beginnend mit dessen C-Terminus, analysiert wird, indem eine Abfolge der Vorgänge des ersten bis fünften Verfahrens unter Verwendung eines Proteins oder eines Peptids und ein Vorgang, in dem das Aminosäurederivat aus der in dem fünften Verfahren erhaltenen Mischung isoliert und identifiziert wird, wiederholt werden.
  • Eine Abfolge der Vorgänge des ersten bis fünften Verfahrens ist dieselbe wie in Beispiel 31. In einer Abfolge dieser Vorgänge werden nach dem fünften Verfahren die Aminosäure und das Aminosäurederivat aus der erhaltenen Probe isoliert und identifiziert. Anschließend wird eine Abfolge der Vorgehensweisen des ersten bis fünften Verfahrens unter Verwendung des Proteins oder des Peptids, dessen Aminogruppe modifiziert ist und dessen C-terminale Aminosäure fehlt und der Vorgang, in dem die in dem fünften Verfahren erhaltene Aminosäure und das Aminosäurederivat isoliert und identifiziert werden, wiederholt durchgeführt, um die Aminosäuresequenz des Proteins oder des Peptids, beginnend mit dem C-Terminus, zu analysieren.
  • Beispiel 36
  • Hier wird die Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren beschrieben. Als Probe wurde ein Pentapeptid der Sequenz Nr. 1 Leucyltryptophanylmethionylarginylphenylalanin (Leu-Trp-Met-Arg-Phe) verwendet.
  • Das Oxazolon wurde unter Verwendung der leicht durch Alkohol hervorgerufenen Spaltungsreaktion detektiert.
  • Die in dem ersten Verfahren, welches in Beispiel 31 beschrieben wurde, erhaltene Probe wurde mit Methanol umgesetzt.
  • 39 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der Probe. Die Bedingungen der massenspektrometrischen Analyse waren wie folgt. Bedingungen der massenspektrometrischen Analyse
    Analysator: Doppelfokus-Massenspektrometer HX-110 (Nihon Denshi)
    Analysebedingungen: Beschleunigungspotenzial 10 kV
    Auflösung: 1000
    Ionenquelle: FAB (fast-atom bombardment Verfahren)
    Ionisierungsgas: Xe
    Ionenmodus: kationisch
    FAB-Gun Beschleunigungspotenzial: 6 kV
    Detektor: MULTIPLIER
    Ladungspotenzial: –20 kV
    Datenverarbeitungssystem DA5000
    Matrix Glycerin:Thioglycerin:m-Nitrobenzylalkohol = 1:1:1
  • Vorgehensweise zur Probenherstellung
    • (1) Verdampfen der Probe unter vermindertem Druck bis zur Trockene.
    • (2) Auflösen des Rückstands in 67%iger wässriger Essigsäure (oder Dimethylformamid) Lösung.
    • (3) Anbringen von 1 μl der Matrix auf dem Ziel.
    • (4) Anbrungen von 1 μl der Probelösung auf dem Ziel und deren Mischung ermöglichen.
    • (5) Einbringen des Gemischs in die Ionenquelle.
  • Hier wurde ein Molekülion (Referenznummer 38), welches dem Reaktionsprodukt entspricht, dessen Aminoterminus acetyliert ist und bei dem die Carboxylgruppe an dem C-Terminus mit einer Methylgruppe verestert ist (der Methylester von Acetylleucyltryptophanylmethionylarginylphenylalanin, Molekulargewicht von 808; im Folgenden hierin als Ac-LWMRF-OMe bezeichnet) detektiert, was die Existenz von Oxazolon in der in dem ersten Verfahren von Beispiel 31 erhaltenen Probe zeigt.
  • Beispiel 37
  • Hier wird die Spaltung des Oxazolonrings in dem zweiten Verfahren beschrieben. Als Probe wurde ein Pentapeptid der Sequenz Nr. 1, Leucyltryptophanylmethionylarginylphenylalanin (Leu-Trp-Met-Arg-Phe) auf dieselbe Weise wie in Beispiel 35 verwendet.
  • 40 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der Probe, die in dem ersten und zweiten Verfahren, welche in Beispiel 31 beschrieben wurden, erhalten wurde. Hier wurde als zweites Verfahren die in dem ersten Verfahren erhaltene Probe mit Methanol in Gegenwart von HFBA umgesetzt. Die experimentelle Vorgehensweise und die für die Reaktion verwendeten Geräte entsprechen dem ersten Verfahren.
  • Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (methanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 25°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Bedingungen für die massenspektrometrische Analyse sind dieselben wie in Beispiel 36.
  • Ein Molekülion (Referenznummer 39) wurde detektiert, welches dem neu erzeugten Reaktionsprodukt entspricht, dessen Aminoterminus acetyliert ist, bei dem Phenylalanin, der C-terminale Rest, entfernt ist, und bei dem die Carboxylgruppe an dem C-Terminus mit einer Methylgruppe verestert ist (Ac-LWMR-OMe, Molekulargewicht von 661); im Folgenden hierin als Ac-LWMRF-OMe bezeichnet), was die Spaltung des Oxazolonrings in dem zweiten Verfahren, welches in Beispiel 2 beschrieben wurde, zeigt.
  • Beispiel 38
  • Hier wird die Spaltung des Oxazolonrings in dem zweiten Verfahren unter Verwendung einer Kombination von HPLC und Massenspektrometrie beschrieben. 41 zeigt ein Ergebnis der HPLC-Analyse des in dem ersten und zweiten Verfahren, welche in Beispiel 31 beschrieben wurden, erhaltenen Reaktionsprodukts. Hier wurde als zweites Verfahren die in dem ersten Verfahren erhaltene Probe mit Ethanol in Gegenwart von HFBA umgesetzt. Die experimentelle Vorgehensweise und die für die Reaktion verwendeten Geräte entsprachen dem ersten Verfahren.
  • Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt. Reaktionsbedingungen
    Konzentration an HFBA: 5% (ethanolische Lösung)
    Reaktionstemperatur: 25°C
    Reaktionszeitraum: 30 Minuten
  • Die Bedingungen für die HPLC-Analyse und die Vorgehensweise zur Herstellung der Probe waren wie folgt.. Bedingungen der HPLC-Analyse Analysebedingungen
    Säule: C18 MICROBORE (Shiseido)
    Elutionsbedingungen: Gradienten-Elution mit den folgenden Lösungen A und B.
    Lösung A: 0,1% TEA wässrig
    Lösung B: 80% Acetonitril wässrig, welches 0,1% TEA enthält
    Retentionszeit Zusammensetzung des Eluenten
    0–5 mm Lösung A, 80%
    5–25 mm Lösung A, 80→40% (linearer Gradient)
    25–30 mm Lösung A, 40%
  • Vorgehensweise zur Probenherstellung
    • (1) Verdampfen der Probe unter vermindertem Druck bis zur Trockene.
    • (2) Auflösen des Rückstandes in 0,1% TEA
  • Jeder Peak wurde wie folgt den jeweiligen Produkten zugeordnet. Die Fraktionen 1 bis 3 (entsprechend den Referenznummern 40 bis 42) in 41 wurden durch Massenspektrometrie analysiert. Die Bedingungen für die massenspektrometrische Analyse waren wie in Beispiel 36 beschrieben.
  • In der Figur zeigt Nummer 40 eine Fraktion 1, die durch HPLC aus dem in dem ersten und zweiten Verfahren von Beispiel 2 erhaltenen Reaktionsprodukt abgetrennt wurde. Nummer 41 zeigt eine Fraktion 2, die durch HPLC aus dem in dem ersten und zweiten Verfahren von Beispiel 2 erhaltenen Reaktionsprodukt abgetrennt wurde. Nummer 42 zeigt eine Fraktion 3, die durch HPLC aus dem in dem ersten und zweiten Verfahren von Beispiel 2 erhaltenen Reaktionsprodukt abgetrennt wurde. Nummer 43 zeigt einen Peak, der dem neu gebildeten Reaktionsprodukt aus dem Pentapeptid der Sequenz Nr. 1 entspricht, bei dem die C-terminale Aminosäure acetyliert ist und das Phenylalanin, der C-terminale Rest, eliminiert ist und bei dem die Carboxylgruppe an dem C-Terminus mit einer Ethylgruppe verestert ist (Molekulargewicht von 675). Nummer 44 zeigt einen Peak, der dem Reaktionsprodukt des Pentapeptids der Sequenz Nr. 1 entspricht, bei dem die aminoterminale Aminosäure acetyliert ist (Molekulargewicht von 794). Nummer 45 zeigt einen Peak, der dem Reaktionsprodukt des Pentapeptids der Sequenz Nr. 1, bei dem die aminoterminale Aminosäure acetyliert ist, entspricht (Molekulargewicht von 794).
  • 42 zeigt das Ergebnis von Fraktion 1 (Referenznummer 40). Hier wurde ein Signal 46 detektiert von einem Molekülion, welches dem neu gebildeten Reaktionsprodukt entspricht, dessen Aminoterminus acetyliert ist, bei dem Phenylalanin, der C-terminale Rest, eliminiert ist und bei dem die Carboxylgruppe an dem C-Terminus mit einer Ethylgruppe verestert ist (Ac-LWMR-OEt, Molekulargewicht von 675). Dieses Ergebnis zeigt auch die Spaltung des Oxazolonrings in dem zweiten Verfahren von Beispiel 31.
  • 43 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse von Fraktion 2 (Referenznummer 41). 44 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse von Fraktion 3 (Referenznummer 42). Bestimmung dieser Fraktionen: Signale 47 und 48 von Molekülionen des Pentapeptids der Sequenz Nr. 1, dessen Aminoterminus acetyliert ist (Acetylleucyltryptophanylmethionylarginylphenylalanin, Molekulargewicht von 794; im Folgenden hierin als Ac-LWMRF-OH bezeichnet) wurden in jeder Fraktion bestimmt. Dies scheint eine Racemisierung bei der Bildung von Oxazolon in dem ersten Verfahren anzuzeigen. Diese Ergebnisse zeigen auch die Bildung eines Oxazolonrings in dem ersten Verfahren und die Spaltung des Oxazolonrings in dem zweiten Verfahren.
  • Beispiel 39
  • Hier wird die Hydrolyse des Esters in dem fünften Verfahren beschrieben. Als Probe wurde ein Pentapeptid der Sequenz Nr. 1, Leucyltryptophanylmethionylarginylphenylalanin (Leu-Trp-Met-Arg-Phe) auf dieselbe Weise wie in Beispiel 36 verwendet.
  • 45 zeigt ein Ergebnis der massenspektrometrischen Analyse der in einer Abfolge der Vorgänge des ersten bis fünften Verfahrens, welche in Beispiel 31 beschrieben wurden, erhaltenen Probe. Die Bedingungen für die massenspektrometrische Analyse waren dieselben wie in Beispiel 36. Hier wurde ein Molekülion (Referenznummer 49) detektiert, welches dem neu gebildeten Reaktionsprodukt entspricht, dessen Aminoterminus acetyliert ist, bei dem das Phenylalanin, der C-terminale Rest, eliminiert ist und bei dem der Methylester der Carboxylgruppe an dem C-Terminus in eine freie Carboxylgruppe umgewandelt ist (Acetylleucyltryptophanylmethionylarginin; Molekulargewicht von 647; im Folgenden hierin als Ac-LWMR-OH bezeichnet), was die Hydrolyse des Esters in dem fünften Verfahren von Beispiel 2 zeigt.
  • Die entsprechenden Ergebnisse der Beispiele 30 bis 39 werden wie folgt zusammengefasst. Erfindungsgemäß wird, um die Aminosäuresequenz beginnend mit dem C-Terminus zu analysieren, eine Kombination einer Abfolge der Vorgänge, bestehend aus den folgenden ersten bis fünften Verfahren, und dem Vorgang, in dem die erhaltene Aminosäure oder das erhaltene Aminosäurederivat isoliert und identifiziert wird, wiederholt durchgeführt.
  • Erstes Verfahren
  • Ein Protein oder ein Peptid wird mit einem Säureanhydrid umgesetzt, der Aminoterminus des Proteins oder des Peptids wird geschützt und der Aminosäurerest an dem C-Terminus wird modifiziert, um Oxazolon oder ein intramolekulares Säureanhydrid (wenn die C-terminale Aminosäure Asparaginsäure ist) zu bilden.
  • Zweites Verfahren
  • Das Reaktionsprodukt aus dem ersten Verfahren wird mit einem Alkohol in Gegenwart von Säure umgesetzt, das darin enthaltene Oxazolon wird Alkoholyse (Veresterung) unterzogen und die carboxyterminale Aminosäure wird freigesetzt oder der Ring des intramolekularen Säureanhydrids wird geöffnet durch Alkoholyse.
  • Drittes Verfahren
  • Das Reaktionsprodukt des zweiten Verfahrens wird mit einem Säureanhydrid umgesetzt, der Aminosäurerest an dem C-Terminus des darin enthaltenen Proteins oder Peptids, dessen C-Terminus nicht blockiert ist, wird modifiziert, um Oxazolon zu bilden.
  • Viertes Verfahren
  • Das Reaktionsprodukt des dritten Verfahrens wird mit einem Alkohol in Gegenwart von Säure umgesetzt, das darin enthaltene Oxazolon wird Alkoholyse (Veresterung) unterzogen und die carboxyterminale Aminosäure wird freigesetzt.
  • Fünftes Verfahren
  • Das Reaktionsprodukt des vierten Verfahrens wird mit einem Amin umgesetzt und der darin enthaltene Ester wird hydrolysiert.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Analyse einer Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids, beginnend mit dessen C-Terminus, ohne Verwendung von Enzymen, indem eine Kombination einer Abfolge von Vorgängen, bestehend aus den oben beschriebenen Verfahren, und ein Vorgang, in dem die erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird, wiederholt werden, so dass eine Verunreinigung durch Aminosäuren und Peptide davon durch Verwendung von Enzymen verhindert wird und stellt eine sequenzielle Bestimmung bereit, die für Mikroanalysen geeignet ist. Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die gewünschte Spaltung von Peptidbindungen und eine exakte Sequenzanalyse.
  • [Sequenzprotokoll]
    Figure 00490001

Claims (5)

  1. Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids, beginnend mit dessen Carboxylende, umfassend: Wiederholen einer kombinierten Vorgehensweise, die ein Verfahren, in dem eine carboxyterminale Aminosäure eines Proteins oder eines Peptids freigesetzt wird und einen Vorgang, in dem die erhaltene Aminosäure oder das erhaltene Aminosäurederivat isoliert und identifiziert wird beinhaltet, wobei die kombinierte Vorgehensweise umfasst: ein erstes Verfahren, in welchem ermöglicht wird, dass das Protein oder das Peptid mit einem Säureanhydrid reagiert und in welchem das Carboxylende modifiziert wird um Oxazolon zu bilden, einschließlich Schützen des Aminoendes während des ersten Verfahrens; und ein zweites Verfahren, in welchem ermöglicht wird, dass das gebildete Protein oder Peptid dessen Carboxylende Oxazolon ist, mit a) Säure und Alkohol, b) einer Lösung die Säure und Alkohol enthält oder c) einem Ester reagiert, um die carboxyterminale Aminosäure freizusetzen; und einen Vorgang, in dem die in dem zweiten Verfahren erhaltene Aminosäure isoliert und identifiziert wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin das wiederholte Ausführen einer kombinierten Vorgehensweise aus einer Reihe von Vorgängen umfasst, umfassend: das erste Verfahren, ein zweites Verfahren, in dem eine Umsetzung mit einem Alkohol in Gegenwart von Säure erfolgt, um die carboxyterminale Aminosäure freizusetzen und ein drittes Verfahren, in dem eine Umsetzung mit einem Amin oder einer wässrigen Lösung davon erfolgt, um einen Ester zu hydrolysieren und einen Vorgang, in dem die a) in dem zweiten Verfahren oder b) nach dem dritten Verfahren erhaltene Aminosäure identifiziert und isoliert wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das erste Verfahren in Gegenwart einer Essigsäure durchgeführt wird.
  4. Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Peptids, beginnend mit dessen Carboxylende, gekennzeichnet durch das wiederholte Durchführen einer kombinierten Vorgehensweise aus einer Reihe von Vorgängen, umfassend: ein erstes Verfahren, in dem es einem Protein oder einem Peptid ermöglicht wird, mit einem Säureanhydrid zu reagieren, Schützen einer Aminogruppe davon und Modifizieren des Carboxylendes um Oxazolon zu bilden, wenn die carboxyterminale Aminosäure nicht Aspartamsäure ist oder um ein intramolekulares Säureanhydrid zu bilden, wenn sie Aspartamsäure ist, ein zweites Verfahren in dem eine Umsetzung mit einem Alkohol in Gegenwart von Säure erfolgt, um die carboxyterminale Aminosäure freizusetzen, wenn das Carboxylende Oxazolon ist oder um eine Ringöffnung des intramolekularen Säureanhydrids durch Alkoholyse zu bewirken, wenn es ein intramolekulares Säureanhydrid ist, ein drittes Verfahren, in dem eine Umsetzung mit einem Säureanhydrid erfolgt, um Oxazolon an dem Carboxylende zu bilden, ein viertes Verfahren in dem eine Umsetzung mit einem Alkohol erfolgt, um die carboxyterminale Aminosäure als einen Ester der Aminosäure freizusetzen und ein fünftes Verfahren in dem eine Umsetzung mit einem Amin erfolgt, um den Ester zu hydrolysieren, und einen Vorgang, in dem a) die in dem zweiten und/oder dem fünften Verfahren erhaltene Aminosäure oder b) das in dem in dem dritten, vierten oder fünften Verfahren erhaltene Aminosäurederivat identifiziert und isoliert wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das vierte Verfahren, in dem eine Umsetzung mit einem Alkohol erfolgt, um die carboxyterminale Aminosäure als einen Ester der Aminosäure freizusetzen, in Gegenwart einer Säure durchgeführt wird.
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