JP3175859B2 - タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法 - Google Patents
タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質あるいはペ
プチドの１次構造解析法に関する。
プチドの１次構造解析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、タンパク質あるいはペプチドのカ
ルボキシ末端（Ｃ末端）からのアミノ酸配列を決定する
ためには、図２に示すようにタンパク質あるいはペプチ
ドにカルボキシペプチダーゼを反応させ、反応液を経時
的に１部ずつ採取し、その反応液をアミノ酸分析装置で
分析して遊離されたアミノ酸を定量する方法が用いられ
てきた。（日本生化学会編、生化学実験講座第Ｉ巻、タ
ンパク質の化学II、２０３−２１１ページ、１９７６年
発行） また、その反応液を質量分析装置にかけてＣ末端側のア
ミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチドの質量を測
定する方法も報告されている。（A. Tsugita,R. van de
n Broek, M. Pyzybylski, FEBS. Lett. 137, 19(198
2)） さらに、図３に示すようにＣ末端を無水酢酸で活性化
し、トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ−Ｉ
ＴＣ）を結合させ、塩酸で切断するという一連の操作を
繰り返すことを利用した配列分析法も報告されている。
（D. H. Hawke,H-. W. Lahm, J. E. Shively, C. W. To
dd, Anal. Biochem. 166, 298(1987))
ルボキシ末端（Ｃ末端）からのアミノ酸配列を決定する
ためには、図２に示すようにタンパク質あるいはペプチ
ドにカルボキシペプチダーゼを反応させ、反応液を経時
的に１部ずつ採取し、その反応液をアミノ酸分析装置で
分析して遊離されたアミノ酸を定量する方法が用いられ
てきた。（日本生化学会編、生化学実験講座第Ｉ巻、タ
ンパク質の化学II、２０３−２１１ページ、１９７６年
発行） また、その反応液を質量分析装置にかけてＣ末端側のア
ミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチドの質量を測
定する方法も報告されている。（A. Tsugita,R. van de
n Broek, M. Pyzybylski, FEBS. Lett. 137, 19(198
2)） さらに、図３に示すようにＣ末端を無水酢酸で活性化
し、トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ−Ｉ
ＴＣ）を結合させ、塩酸で切断するという一連の操作を
繰り返すことを利用した配列分析法も報告されている。
（D. H. Hawke,H-. W. Lahm, J. E. Shively, C. W. To
dd, Anal. Biochem. 166, 298(1987))
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来のカルボキシペプ
チダーゼを用いる方法は、酵素の基質特異性や活性がＣ
末端アミノ酸あるいはそれに隣接するアミノ酸によって
さまざまであること、そして他の酵素の混在があること
から求めている以外のペプチド結合の切断が起き、正確
な分析が困難になることがあった。またこの方法は酵素
の自己消化性によってアミノ酸が遊離されるため高感度
分析には適していない。
チダーゼを用いる方法は、酵素の基質特異性や活性がＣ
末端アミノ酸あるいはそれに隣接するアミノ酸によって
さまざまであること、そして他の酵素の混在があること
から求めている以外のペプチド結合の切断が起き、正確
な分析が困難になることがあった。またこの方法は酵素
の自己消化性によってアミノ酸が遊離されるため高感度
分析には適していない。
【０００４】また、ＴＭＳ−ＩＴＣを用いる方法は反応
収率が悪いため実用化されていない。そこで本発明は、
酵素を用いることなく、タンパク質あるいはペプチドの
Ｃ末端からのアミノ酸配列を決定する方法を提供しよう
とするものである。
収率が悪いため実用化されていない。そこで本発明は、
酵素を用いることなく、タンパク質あるいはペプチドの
Ｃ末端からのアミノ酸配列を決定する方法を提供しよう
とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明においては、上記
の欠点を克服しＣ末端からのアミノ酸の配列分析を実行
するために、第１段階として、カルボキシ末端がオキサ
ゾロン誘導体であるアセチル化されたタンパク質あるい
はペプチドに、一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸の蒸気を作用させて、カルボキシ末端
のアミノ酸を遊離させた後、第２段階として、そのアミ
ノ酸とカルボキシ末端のアミノ酸を失ったアセチル化さ
れたタンパク質あるいはペプチドとの混合物に無水酢酸
の蒸気を作用させて、そのアミノ酸をアセチル化し、ア
セチル化されたアミノ酸とカルボキシ末端のアミノ酸を
失ったアセチル化されたタンパク質あるいはペプチドと
の混合物とし、第３段階として、この混合物にさらに無
水酢酸の蒸気を作用させて、アセチル化されたカルボキ
シ末端アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体と、新たに生
成されたカルボキシ末端がオキサゾロン誘導体であるア
セチル化されたタンパク質あるいはペプチドとの混合物
とし、この混合物からアセチル化されたカルボキシ末端
アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体を有機溶媒で抽出し
て同定する、という一連の操作を繰り返した。
の欠点を克服しＣ末端からのアミノ酸の配列分析を実行
するために、第１段階として、カルボキシ末端がオキサ
ゾロン誘導体であるアセチル化されたタンパク質あるい
はペプチドに、一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸の蒸気を作用させて、カルボキシ末端
のアミノ酸を遊離させた後、第２段階として、そのアミ
ノ酸とカルボキシ末端のアミノ酸を失ったアセチル化さ
れたタンパク質あるいはペプチドとの混合物に無水酢酸
の蒸気を作用させて、そのアミノ酸をアセチル化し、ア
セチル化されたアミノ酸とカルボキシ末端のアミノ酸を
失ったアセチル化されたタンパク質あるいはペプチドと
の混合物とし、第３段階として、この混合物にさらに無
水酢酸の蒸気を作用させて、アセチル化されたカルボキ
シ末端アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体と、新たに生
成されたカルボキシ末端がオキサゾロン誘導体であるア
セチル化されたタンパク質あるいはペプチドとの混合物
とし、この混合物からアセチル化されたカルボキシ末端
アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体を有機溶媒で抽出し
て同定する、という一連の操作を繰り返した。
【０００６】
【作用】上記手段により、酵素を用いることなく、タン
パク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を
決定することが可能になった。
パク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を
決定することが可能になった。
【０００７】
【実施例】以下実施例に基づいて本発明を詳細に説明す
る。 （実施例１）ここでは実験方法の詳細を述べる。
る。 （実施例１）ここでは実験方法の詳細を述べる。
【０００８】図１は本発明の分析方法を示す工程図であ
る。まず、タンパク質あるいはペプチドに無水酢酸の蒸
気を作用させ、アセチル化されたタンパク質あるいはペ
プチドとする。そしてアセチル化されたタンパク質ある
いはペプチドに、さらに無水酢酸の蒸気を作用させオキ
サゾロン誘導体を生成させる。
る。まず、タンパク質あるいはペプチドに無水酢酸の蒸
気を作用させ、アセチル化されたタンパク質あるいはペ
プチドとする。そしてアセチル化されたタンパク質ある
いはペプチドに、さらに無水酢酸の蒸気を作用させオキ
サゾロン誘導体を生成させる。
【０００９】この、アセチル化されたタンパク質あるい
はペプチドのオキサゾロン誘導体に一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸の蒸気、すなわちペンタフルオロプロ
ピオン酸（ＰＦＰＡ、ｎ＝１）の蒸気あるいはヘプタフ
ルオロ酪酸（ＨＦＢＡ、ｎ＝２）の蒸気を作用させＣ末
端のアミノ酸を遊離させる。このアミノ酸に無水酢酸を
作用させてアセチル化する。このアセチル化されたアミ
ノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタン
パク質あるいはペプチドとの反応混合物にさらに無水酢
酸を作用させ、アセチル化されたアミノ酸由来のオキサ
ゾロン誘導体と新たに生成されたＣ末端がオキサゾロン
誘導体であるアセチル化されたタンパク質あるいはペプ
チドとの混合物とする。
はペプチドのオキサゾロン誘導体に一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸の蒸気、すなわちペンタフルオロプロ
ピオン酸（ＰＦＰＡ、ｎ＝１）の蒸気あるいはヘプタフ
ルオロ酪酸（ＨＦＢＡ、ｎ＝２）の蒸気を作用させＣ末
端のアミノ酸を遊離させる。このアミノ酸に無水酢酸を
作用させてアセチル化する。このアセチル化されたアミ
ノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタン
パク質あるいはペプチドとの反応混合物にさらに無水酢
酸を作用させ、アセチル化されたアミノ酸由来のオキサ
ゾロン誘導体と新たに生成されたＣ末端がオキサゾロン
誘導体であるアセチル化されたタンパク質あるいはペプ
チドとの混合物とする。
【００１０】この混合物から、アセチル化されたＣ末端
アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体を抽出する。この抽
出されたアセチル化されたＣ末端アミノ酸由来のオキサ
ゾロン誘導体に、アルコールの蒸気、例えば１、１、
１、３、３、３−ヘキサフルオロ−２−プルピルアルコ
ール（ＨＦＰと略記する）の蒸気、あるいはアミンの蒸
気、例えば１、１、１−トリフルオロ−２−アミノエタ
ン（ＨＦＡＥと略記する）の蒸気を作用させて、アセチ
ル化されたアミノ酸のエステルあるいはアセチル化され
たアミノ酸のアミドとして同定する。
アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体を抽出する。この抽
出されたアセチル化されたＣ末端アミノ酸由来のオキサ
ゾロン誘導体に、アルコールの蒸気、例えば１、１、
１、３、３、３−ヘキサフルオロ−２−プルピルアルコ
ール（ＨＦＰと略記する）の蒸気、あるいはアミンの蒸
気、例えば１、１、１−トリフルオロ−２−アミノエタ
ン（ＨＦＡＥと略記する）の蒸気を作用させて、アセチ
ル化されたアミノ酸のエステルあるいはアセチル化され
たアミノ酸のアミドとして同定する。
【００１１】以降、前段落に述べた工程を繰り返すこと
により、タンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのア
ミノ酸配列を決定することが出来る。本発明のアミノ酸
配列分析の手順は以下のとおりである。まずタンパク質
あるいはペプチド試料を含む試料溶液を小型の試験管に
入れた後乾燥させる。ここで、試験管に３０％の無水酢
酸と１％のピリジンを含む酢酸溶液を入れておく。この
試験管に先ほどの試料を入れた小型の試験管を入れる。
この試験管内を真空ポンプで減圧下に封管し、３０℃に
１０分間保つ（図４参照）。
により、タンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのア
ミノ酸配列を決定することが出来る。本発明のアミノ酸
配列分析の手順は以下のとおりである。まずタンパク質
あるいはペプチド試料を含む試料溶液を小型の試験管に
入れた後乾燥させる。ここで、試験管に３０％の無水酢
酸と１％のピリジンを含む酢酸溶液を入れておく。この
試験管に先ほどの試料を入れた小型の試験管を入れる。
この試験管内を真空ポンプで減圧下に封管し、３０℃に
１０分間保つ（図４参照）。
【００１２】ここで、タンパク質あるいはペプチドは無
水酢酸の作用によって、アセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチドとなる。この反応後、この試験管の上部
を開管し、小型の試験管内を取り出す。ここにアセトニ
トリルあるいはピリジンを加えて減圧乾固し、用いた試
薬と溶媒とを除去する。
水酢酸の作用によって、アセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチドとなる。この反応後、この試験管の上部
を開管し、小型の試験管内を取り出す。ここにアセトニ
トリルあるいはピリジンを加えて減圧乾固し、用いた試
薬と溶媒とを除去する。
【００１３】こうして得られた試料に、無水のアセトニ
トリルを溶媒とした０、１％のピリジンを含む３０％の
無水酢酸を用いて、３０℃において１０分間無水酢酸の
蒸気を作用させた後、溶媒と無水酢酸を除去する。ここ
で、アセチル化されたタンパク質あるいはペプチドはオ
キサゾロン誘導体となる。このための手順は、この段落
で述べた反応条件を除いて前段落に述べた工程と同じで
ある。
トリルを溶媒とした０、１％のピリジンを含む３０％の
無水酢酸を用いて、３０℃において１０分間無水酢酸の
蒸気を作用させた後、溶媒と無水酢酸を除去する。ここ
で、アセチル化されたタンパク質あるいはペプチドはオ
キサゾロン誘導体となる。このための手順は、この段落
で述べた反応条件を除いて前段落に述べた工程と同じで
ある。
【００１４】このアセチル化されたタンパク質あるいは
ペプチドのオキサゾロン誘導体にペンタフルオロプロピ
オン酸（ＰＦＰＡ）の蒸気あるいはヘプタフルオロ酪酸
（ＨＦＢＡ）の蒸気を９０℃で１０分間加熱して作用さ
せる。ここで、Ｃ末端のアミノ酸が遊離され、そのアミ
ノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタン
パク質あるいはペプチドとの混合物となる。この手順も
前段落に述べた工程と同じである。この後、封管をあけ
て内側の試験管を取り出して乾燥させる。
ペプチドのオキサゾロン誘導体にペンタフルオロプロピ
オン酸（ＰＦＰＡ）の蒸気あるいはヘプタフルオロ酪酸
（ＨＦＢＡ）の蒸気を９０℃で１０分間加熱して作用さ
せる。ここで、Ｃ末端のアミノ酸が遊離され、そのアミ
ノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタン
パク質あるいはペプチドとの混合物となる。この手順も
前段落に述べた工程と同じである。この後、封管をあけ
て内側の試験管を取り出して乾燥させる。
【００１５】次に、この混合物に無水酢酸の蒸気を作用
させる。この手順は初めに試料をアセチル化したものと
同一である。ここで、Ｃ末端アミノ酸が無水酢酸の作用
によってアセチル化され、アセチル化されたＣ末端アミ
ノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタン
パク質あるいはペプチドとの混合物を得ることができ
る。
させる。この手順は初めに試料をアセチル化したものと
同一である。ここで、Ｃ末端アミノ酸が無水酢酸の作用
によってアセチル化され、アセチル化されたＣ末端アミ
ノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタン
パク質あるいはペプチドとの混合物を得ることができ
る。
【００１６】さらに、この混合物に無水酢酸の蒸気を作
用させる。このための手順はオキサゾロン誘導体を得る
ための既に述べたものと同一である。ここで、アセチル
化されたＣ末端アミノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったア
セチル化されたタンパク質あるいはペプチドは、それぞ
れアセチル化されたＣ末端アミノ酸由来のオキサゾロン
誘導体と新たに生成されたＣ末端がオキサゾロン誘導体
であるアセチル化されたタンパク質あるいはペプチドと
なる。
用させる。このための手順はオキサゾロン誘導体を得る
ための既に述べたものと同一である。ここで、アセチル
化されたＣ末端アミノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったア
セチル化されたタンパク質あるいはペプチドは、それぞ
れアセチル化されたＣ末端アミノ酸由来のオキサゾロン
誘導体と新たに生成されたＣ末端がオキサゾロン誘導体
であるアセチル化されたタンパク質あるいはペプチドと
なる。
【００１７】次いで、これらの混合物から、ブチルクロ
ライド、クロロホルム、あるいはジイソプロピルエーテ
ルを用いて、アセチル化されたＣ末端アミノ酸由来のオ
キサゾロン誘導体を抽出する。このアセチル化されたＣ
末端アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体に、１、１、
１、３、３、３−ヘキサフルオロ−２−プロピルアルコ
ールの蒸気を５０℃において１０分間作用させて、アセ
チル化されたアミノ酸のエステルとして検出する。作用
させる手順は、用いた試薬と反応条件を除いて、前述の
アセチル化あるいはオキサゾロン化のそれと同じであ
る。
ライド、クロロホルム、あるいはジイソプロピルエーテ
ルを用いて、アセチル化されたＣ末端アミノ酸由来のオ
キサゾロン誘導体を抽出する。このアセチル化されたＣ
末端アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体に、１、１、
１、３、３、３−ヘキサフルオロ−２−プロピルアルコ
ールの蒸気を５０℃において１０分間作用させて、アセ
チル化されたアミノ酸のエステルとして検出する。作用
させる手順は、用いた試薬と反応条件を除いて、前述の
アセチル化あるいはオキサゾロン化のそれと同じであ
る。
【００１８】この最後の手順においては、Ｃ末端アミノ
酸由来のオキサゾロン誘導体に、１、１、１−トリフル
オロ−２−アミノエタンの蒸気を５０℃において１０分
間作用させて、アセチル化されたアミノ酸のアミドとし
て検出することもできる。以下、Ｃ末端のアミノ酸を失
い、新たに生成されたＣ末端がオキサゾロン誘導体であ
るアセチル化されたタンパク質あるいはペプチドに、Ｐ
ＦＰＡの蒸気あるいはＨＦＢＡの蒸気を作用させる操作
以降の手順を繰り返すことによって、タンパク質あるい
はペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定すること
ができる。
酸由来のオキサゾロン誘導体に、１、１、１−トリフル
オロ−２−アミノエタンの蒸気を５０℃において１０分
間作用させて、アセチル化されたアミノ酸のアミドとし
て検出することもできる。以下、Ｃ末端のアミノ酸を失
い、新たに生成されたＣ末端がオキサゾロン誘導体であ
るアセチル化されたタンパク質あるいはペプチドに、Ｐ
ＦＰＡの蒸気あるいはＨＦＢＡの蒸気を作用させる操作
以降の手順を繰り返すことによって、タンパク質あるい
はペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定すること
ができる。
【００１９】（実施例２）以降、配列番号１のジペプチ
ド、Val-Phe 、を試料とした実験結果を用いて前述の工
程を説明する。ここでは、ファーストアトムボンバード
メント−質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）法を用いて、生成物
の質量を測定した。測定に用いた装置及びその測定条件
は以下の通りである。
ド、Val-Phe 、を試料とした実験結果を用いて前述の工
程を説明する。ここでは、ファーストアトムボンバード
メント−質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）法を用いて、生成物
の質量を測定した。測定に用いた装置及びその測定条件
は以下の通りである。
【００２０】装置本体：日本電子製 ＨＸ１１０型 イオン化法：ＦＡＢ（ポジティブ） イオン化ガス：キセノン 加速電圧：１０ｋＶ マトリックス：グリセロール 図５は、Val-Phe そのものの質量スペクトルを示したも
のである。図６は、このジペプチドに、３０％の無水酢
酸と１％のピリジンを含む酢酸溶液を用いて、無水酢酸
の蒸気を３０℃において１０分間作用させて得られた反
応生成物の質量スペクトルである。
のである。図６は、このジペプチドに、３０％の無水酢
酸と１％のピリジンを含む酢酸溶液を用いて、無水酢酸
の蒸気を３０℃において１０分間作用させて得られた反
応生成物の質量スペクトルである。
【００２１】図５において示したジペプチド由来の分子
イオンが消失し、新たにアセチル化されたジペプチドの
分子イオンが検出された。質量スペクトル中ではアセチ
ル化された化学種をAc-Xと表現する。例えば、Ac-Val-P
heはアセチル化されたVal-Phe のことである。このこと
から、ここで述べた反応条件においてアセチル化が定量
的に進行したことがわかる。この条件は、アミノ酸とＣ
末端のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチドと
の混合物に無水酢酸を作用させてアセチル化する条件と
同一である。
イオンが消失し、新たにアセチル化されたジペプチドの
分子イオンが検出された。質量スペクトル中ではアセチ
ル化された化学種をAc-Xと表現する。例えば、Ac-Val-P
heはアセチル化されたVal-Phe のことである。このこと
から、ここで述べた反応条件においてアセチル化が定量
的に進行したことがわかる。この条件は、アミノ酸とＣ
末端のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチドと
の混合物に無水酢酸を作用させてアセチル化する条件と
同一である。
【００２２】図７は、このアセチル化されたジペプチド
に、無水のアセトニトリルを溶媒とした０．１％のピリ
ジンを含む３０％の無水酢酸を用いて、３０℃において
１０分間無水酢酸の蒸気を作用させて得られた反応生成
物の質量スペクトルである。図６において示したアセチ
ル化されたジペプチド由来の分子イオンが消失し、新た
にアセチル化されたジペプチドのオキサゾロン誘導体の
分子イオンが検出された。このことから、ここで述べた
反応条件においてオキサゾロン化が定量的に進行したこ
とがわかる。この条件は、アセチル化されたＣ末端アミ
ノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタン
パク質あるいはペプチドとの混合物に無水酢酸の蒸気を
作用させてオキサゾロン誘導体を得る条件と同一であ
る。
に、無水のアセトニトリルを溶媒とした０．１％のピリ
ジンを含む３０％の無水酢酸を用いて、３０℃において
１０分間無水酢酸の蒸気を作用させて得られた反応生成
物の質量スペクトルである。図６において示したアセチ
ル化されたジペプチド由来の分子イオンが消失し、新た
にアセチル化されたジペプチドのオキサゾロン誘導体の
分子イオンが検出された。このことから、ここで述べた
反応条件においてオキサゾロン化が定量的に進行したこ
とがわかる。この条件は、アセチル化されたＣ末端アミ
ノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタン
パク質あるいはペプチドとの混合物に無水酢酸の蒸気を
作用させてオキサゾロン誘導体を得る条件と同一であ
る。
【００２３】図８は、このアセチル化されたジペプチド
のオキサゾロン誘導体に、９０℃で１０分間加熱して、
１００％のＰＦＰＡの蒸気を作用させて得られた反応生
成物の質量スペクトルである。図７において示したアセ
チル化されたジペプチドのオキサゾロン誘導体由来の分
子イオンが消失し、新たにアセチル化されたバリンと、
フェニルアラニンの分子イオンが検出された。このこと
から、ここで述べた反応条件においてカルボキシ末端の
アミノ酸が遊離される反応が定量的に進行したことがわ
かる。また、１００％のＨＦＢＡの蒸気を作用させて得
られた反応生成物を分析したところは、図８とほぼ同一
の質量スペクトルが得られた。
のオキサゾロン誘導体に、９０℃で１０分間加熱して、
１００％のＰＦＰＡの蒸気を作用させて得られた反応生
成物の質量スペクトルである。図７において示したアセ
チル化されたジペプチドのオキサゾロン誘導体由来の分
子イオンが消失し、新たにアセチル化されたバリンと、
フェニルアラニンの分子イオンが検出された。このこと
から、ここで述べた反応条件においてカルボキシ末端の
アミノ酸が遊離される反応が定量的に進行したことがわ
かる。また、１００％のＨＦＢＡの蒸気を作用させて得
られた反応生成物を分析したところは、図８とほぼ同一
の質量スペクトルが得られた。
【００２４】ここで述べたことは、図１に示した工程を
実行することによって逐次的にＣ末端のアミノ酸を得る
ことが可能なことを示している。 （実施例３）ここでは、アセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸
気を作用させる際の有機酸の濃度と反応効率との関係を
示す。
実行することによって逐次的にＣ末端のアミノ酸を得る
ことが可能なことを示している。 （実施例３）ここでは、アセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸
気を作用させる際の有機酸の濃度と反応効率との関係を
示す。
【００２５】実施例２において述べたように、アセチル
化されたジペプチドのオキサゾロン誘導体に、９０℃で
１０分間加熱して、１００％のＰＦＰＡの蒸気を作用さ
せた場合に定量的に反応が進むことが、図７と図８との
比較から確かめられた。この有機酸の濃度を９０％（ア
セトニトリル溶液）とした場合の蒸気を作用させた結果
を示したものが図９である。この場合には、アセチル化
されたバリンの分子イオンと共に、アセチル化されたジ
ペプチド及びそのオキサゾロン誘導体の分子イオンも検
出されている。
化されたジペプチドのオキサゾロン誘導体に、９０℃で
１０分間加熱して、１００％のＰＦＰＡの蒸気を作用さ
せた場合に定量的に反応が進むことが、図７と図８との
比較から確かめられた。この有機酸の濃度を９０％（ア
セトニトリル溶液）とした場合の蒸気を作用させた結果
を示したものが図９である。この場合には、アセチル化
されたバリンの分子イオンと共に、アセチル化されたジ
ペプチド及びそのオキサゾロン誘導体の分子イオンも検
出されている。
【００２６】図１０はさらに有機酸の濃度を８０％とし
た場合の蒸気を作用させた結果を示したものである。こ
の場合にも、アセチル化されたバリンの分子イオンと共
に、アセチル化されたジペプチド及びそのオキサゾロン
誘導体の分子イオンが検出されている。そしてこの場
合、アセチル化されたバリンの分子イオンの相対的な強
度は、アセチル化されたジペプチド及びそのオキサゾロ
ン誘導体の分子イオンの強度と比較して、図９に示した
有機酸の濃度を９０％とした場合よりも小さくなってい
ることがわかる。
た場合の蒸気を作用させた結果を示したものである。こ
の場合にも、アセチル化されたバリンの分子イオンと共
に、アセチル化されたジペプチド及びそのオキサゾロン
誘導体の分子イオンが検出されている。そしてこの場
合、アセチル化されたバリンの分子イオンの相対的な強
度は、アセチル化されたジペプチド及びそのオキサゾロ
ン誘導体の分子イオンの強度と比較して、図９に示した
有機酸の濃度を９０％とした場合よりも小さくなってい
ることがわかる。
【００２７】図１１はさらに有機酸の濃度を８０％とし
た場合の結果を示したものである。この場合にも、アセ
チル化されたバリンの分子イオンと共に、アセチル化さ
れたジペプチド及びそのオキサゾロン誘導体の分子イオ
ンが検出されている。そしてこの場合の結果は、８０％
とした場合とほぼ同一であった。
た場合の結果を示したものである。この場合にも、アセ
チル化されたバリンの分子イオンと共に、アセチル化さ
れたジペプチド及びそのオキサゾロン誘導体の分子イオ
ンが検出されている。そしてこの場合の結果は、８０％
とした場合とほぼ同一であった。
【００２８】これらのことから、有機酸の濃度は７０％
を越える必要があることがわかる。 （実施例４）ここでは、アセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸
気を作用させる際の温度と反応効率との関係を示す。
を越える必要があることがわかる。 （実施例４）ここでは、アセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸
気を作用させる際の温度と反応効率との関係を示す。
【００２９】図１２、１３、１４、１５は、それぞれ作
用させる温度を９０℃、８０℃、７０℃、６０℃とした
場合の結果を示したものである。図からわかるように、
検討した各温度において、アセチル化されたジペプチド
のオキサゾロン誘導体が有機酸の蒸気の作用を受けて生
成したアセチル化されたバリン由来の分子イオンが検出
されている。そして、温度が高くなるにつれてこの反応
の反応効率は高くなり、９０℃において定量的に進行す
る事がわかる。但しこの場合、生成物をメタノールで抽
出し、アセチル化されたバリンのメチルエステルとして
検出した。
用させる温度を９０℃、８０℃、７０℃、６０℃とした
場合の結果を示したものである。図からわかるように、
検討した各温度において、アセチル化されたジペプチド
のオキサゾロン誘導体が有機酸の蒸気の作用を受けて生
成したアセチル化されたバリン由来の分子イオンが検出
されている。そして、温度が高くなるにつれてこの反応
の反応効率は高くなり、９０℃において定量的に進行す
る事がわかる。但しこの場合、生成物をメタノールで抽
出し、アセチル化されたバリンのメチルエステルとして
検出した。
【００３０】（実施例５）ここでは、アセチル化された
タンパク質あるいはペプチドのオキサゾロン誘導体に、
ＰＦＰＡの蒸気を作用させる際の反応時間と反応効率と
の関係を示す。図１６、１７、１８は、それぞれ作用さ
せる時間を、１０分間、５分間、２分間とした場合の結
果を示したものである。図からわかるように、検討した
各時間アセチル化されたジペプチドのオキサゾロン誘導
体に有機酸の蒸気を作用させた際、生成したアセチル化
されたバリン由来の分子イオンが検出されている。そし
て、時間が長くなるにつれてこの反応の反応効率は高く
なる事がわかる。作用させる時間を２分間とした場合の
反応効率は低かった。
タンパク質あるいはペプチドのオキサゾロン誘導体に、
ＰＦＰＡの蒸気を作用させる際の反応時間と反応効率と
の関係を示す。図１６、１７、１８は、それぞれ作用さ
せる時間を、１０分間、５分間、２分間とした場合の結
果を示したものである。図からわかるように、検討した
各時間アセチル化されたジペプチドのオキサゾロン誘導
体に有機酸の蒸気を作用させた際、生成したアセチル化
されたバリン由来の分子イオンが検出されている。そし
て、時間が長くなるにつれてこの反応の反応効率は高く
なる事がわかる。作用させる時間を２分間とした場合の
反応効率は低かった。
【００３１】（実施例６）ここでは、アセチル化された
タンパク質あるいはペプチドをオキサゾロン誘導体化す
る際に、ピリジンの添加によって反応効率が向上するこ
とを示す。実施例２において説明したように、図７はア
セチル化されたジペプチドに、無水のアセトニトリルを
溶媒とした０．１％のピリジンを含む３０％の無水酢酸
を用いて、３０℃において１０分間無水酢酸の蒸気を作
用させて得られた反応生成物の質量スペクトルを示した
ものである。この条件からピリジンを除いた場合に得ら
れた結果が図１９である。オキサゾロン誘導体の分子イ
オンと共にアセチル化されたジペプチドの分子イオンも
検出されている。
タンパク質あるいはペプチドをオキサゾロン誘導体化す
る際に、ピリジンの添加によって反応効率が向上するこ
とを示す。実施例２において説明したように、図７はア
セチル化されたジペプチドに、無水のアセトニトリルを
溶媒とした０．１％のピリジンを含む３０％の無水酢酸
を用いて、３０℃において１０分間無水酢酸の蒸気を作
用させて得られた反応生成物の質量スペクトルを示した
ものである。この条件からピリジンを除いた場合に得ら
れた結果が図１９である。オキサゾロン誘導体の分子イ
オンと共にアセチル化されたジペプチドの分子イオンも
検出されている。
【００３２】また、ピリジンの濃度を１％とした場合に
得られた結果が図２０である。この場合には、図７に示
した結果と同様に、アセチル化されたジペプチドの分子
イオンは検出されなかった。これらのことから、アセチ
ル化されたタンパク質あるいはペプチドをオキサゾロン
誘導体化する際に、ピリジンの添加により反応効率が向
上することがわかる。
得られた結果が図２０である。この場合には、図７に示
した結果と同様に、アセチル化されたジペプチドの分子
イオンは検出されなかった。これらのことから、アセチ
ル化されたタンパク質あるいはペプチドをオキサゾロン
誘導体化する際に、ピリジンの添加により反応効率が向
上することがわかる。
【００３３】（実施例７）ここでは、遊離されたアミノ
酸が無水酢酸の蒸気の作用でアセチル化され、さらに無
水酢酸の蒸気の作用でアセチル化されたアミノ酸が、ア
セチル化されたアミノ酸のオキサゾロン誘導体となる事
を示す。反応条件は実施例２で述べたものと同一であ
る。
酸が無水酢酸の蒸気の作用でアセチル化され、さらに無
水酢酸の蒸気の作用でアセチル化されたアミノ酸が、ア
セチル化されたアミノ酸のオキサゾロン誘導体となる事
を示す。反応条件は実施例２で述べたものと同一であ
る。
【００３４】図２１に、得られたアセチル化されたフェ
ニルアラニンの質量スペクトルを示す。そして図２２
に、得られたアセチル化されたフェニルアラニンのオキ
サゾロン誘導体の分子イオンを示す。 （実施例８）ここでは、アセチル化されたアミノ酸由来
のオキサゾロン誘導体にアルコールの蒸気を作用させ
て、アセチル化されたアミノ酸のエステルとする工程を
示す。前述の実施例にしたがって得られたアセチル化さ
れたフェニルアラニンのオキサゾロン誘導体に、１、
１、１、３、３、３−ヘキサフルオロ−２−プロピルア
ルコールの蒸気を５０℃において１０分間作用させた。
ニルアラニンの質量スペクトルを示す。そして図２２
に、得られたアセチル化されたフェニルアラニンのオキ
サゾロン誘導体の分子イオンを示す。 （実施例８）ここでは、アセチル化されたアミノ酸由来
のオキサゾロン誘導体にアルコールの蒸気を作用させ
て、アセチル化されたアミノ酸のエステルとする工程を
示す。前述の実施例にしたがって得られたアセチル化さ
れたフェニルアラニンのオキサゾロン誘導体に、１、
１、１、３、３、３−ヘキサフルオロ−２−プロピルア
ルコールの蒸気を５０℃において１０分間作用させた。
【００３５】図２３は、ここで得られた化合物の質量ス
ペクトルである。明瞭なアセチル化されたフェニルアラ
ニンの１、１、１、３、３、３−ヘキサフルオロ−２−
プロピルエステルの質量に相当する分子イオンが検出さ
れている。このことから、アセチル化されたアミノ酸の
エステルが得られることがわかる。
ペクトルである。明瞭なアセチル化されたフェニルアラ
ニンの１、１、１、３、３、３−ヘキサフルオロ−２−
プロピルエステルの質量に相当する分子イオンが検出さ
れている。このことから、アセチル化されたアミノ酸の
エステルが得られることがわかる。
【００３６】（実施例９）ここでは、アセチル化された
アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体にアミンの蒸気を作
用させて、アセチル化されたアミノ酸のアミドとする工
程を示す。前述の実施例にしたがって得られたアセチル
化されたフェニルアラニンのオキサゾロン誘導体に、
１、１、１−トリフルオロ−２−アミノエタンの蒸気を
５０℃において１０分間作用させた。図２４は、ここで
得られた化合物の質量スペクトルである。アセチル化さ
れたフェニルアラニンの１、１、１−トリフルオロエチ
ルアミドの質量に相当する分子イオンが検出されてい
る。このことから、アセチル化されたアミノ酸のアミド
が得られることがわかる。
アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体にアミンの蒸気を作
用させて、アセチル化されたアミノ酸のアミドとする工
程を示す。前述の実施例にしたがって得られたアセチル
化されたフェニルアラニンのオキサゾロン誘導体に、
１、１、１−トリフルオロ−２−アミノエタンの蒸気を
５０℃において１０分間作用させた。図２４は、ここで
得られた化合物の質量スペクトルである。アセチル化さ
れたフェニルアラニンの１、１、１−トリフルオロエチ
ルアミドの質量に相当する分子イオンが検出されてい
る。このことから、アセチル化されたアミノ酸のアミド
が得られることがわかる。
【００３７】以上述べてきた結果をまとめると次のよう
になる。第１段階として、Ｃ末端がオキサゾロン誘導体
であるアセチル化されたタンパク質あるいはペプチド
に、一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸の蒸気を作用させて、Ｃ末端のアミノ
酸を遊離させた後、第２段階として、そのアミノ酸とＣ
末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチドとの混合物に無水酢酸の蒸気を作用させ
て、そのアミノ酸をアセチル化し、アセチル化されたア
ミノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタ
ンパク質あるいはペプチドとの混合物とし、第３段階と
して、この混合物にさらに無水酢酸の蒸気を作用させ
て、アセチル化されたＣ末端アミノ酸由来のオキサゾロ
ン誘導体と新たに生成されたＣ末端がオキサゾロン誘導
体であるアセチル化されたタンパク質あるいはペプチド
との混合物とし、この混合物からアセチル化されたＣ末
端アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体を有機溶媒で抽出
して同定する、という一連の操作を繰り返すことによ
り、試料としたタンパク質あるいはペプチドのＣ末端か
らのアミノ酸配列を決定することができる。
になる。第１段階として、Ｃ末端がオキサゾロン誘導体
であるアセチル化されたタンパク質あるいはペプチド
に、一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸の蒸気を作用させて、Ｃ末端のアミノ
酸を遊離させた後、第２段階として、そのアミノ酸とＣ
末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチドとの混合物に無水酢酸の蒸気を作用させ
て、そのアミノ酸をアセチル化し、アセチル化されたア
ミノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタ
ンパク質あるいはペプチドとの混合物とし、第３段階と
して、この混合物にさらに無水酢酸の蒸気を作用させ
て、アセチル化されたＣ末端アミノ酸由来のオキサゾロ
ン誘導体と新たに生成されたＣ末端がオキサゾロン誘導
体であるアセチル化されたタンパク質あるいはペプチド
との混合物とし、この混合物からアセチル化されたＣ末
端アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体を有機溶媒で抽出
して同定する、という一連の操作を繰り返すことによ
り、試料としたタンパク質あるいはペプチドのＣ末端か
らのアミノ酸配列を決定することができる。
【００３８】上記の、Ｃ末端がオキサゾロン誘導体であ
るタンパク質あるいはペプチドは、タンパク質あるいは
ペプチドに無水酢酸の蒸気を作用させてアセチル化され
たタンパク質あるいはペプチドとした後に、さらに無水
酢酸の蒸気を作用させて得たものである。
るタンパク質あるいはペプチドは、タンパク質あるいは
ペプチドに無水酢酸の蒸気を作用させてアセチル化され
たタンパク質あるいはペプチドとした後に、さらに無水
酢酸の蒸気を作用させて得たものである。
【００３９】
【発明の効果】本発明の重要な点は、第１段階として、
Ｃ末端がオキサゾロン誘導体であるアセチル化されたタ
ンパク質あるいはペプチドに、一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸の蒸気を作用させて、Ｃ末端のアミノ
酸を遊離させた後、第２段階として、そのアミノ酸とＣ
末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチドとの混合物に無水酢酸の蒸気を作用させ
て、そのアミノ酸をアセチル化し、アセチル化されたア
ミノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタ
ンパク質あるいはペプチドとの混合物とし、第３段階と
して、この混合物にさらに無水酢酸の蒸気を作用させ
て、アセチル化されたＣ末端アミノ酸由来のオキサゾロ
ン誘導体と新たに生成されたＣ末端がオキサゾロン誘導
体であるアセチル化されたタンパク質あるいはペプチド
との混合物とし、この混合物からアセチル化されたＣ末
端アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体を有機溶媒で抽出
して同定する、という一連の操作を繰り返すことによっ
て、酵素を用いることなくタンパク質あるいはペプチド
のＣ末端からのアミノ酸配列を順次決定することが可能
になったことである。
Ｃ末端がオキサゾロン誘導体であるアセチル化されたタ
ンパク質あるいはペプチドに、一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸の蒸気を作用させて、Ｃ末端のアミノ
酸を遊離させた後、第２段階として、そのアミノ酸とＣ
末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチドとの混合物に無水酢酸の蒸気を作用させ
て、そのアミノ酸をアセチル化し、アセチル化されたア
ミノ酸とＣ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタ
ンパク質あるいはペプチドとの混合物とし、第３段階と
して、この混合物にさらに無水酢酸の蒸気を作用させ
て、アセチル化されたＣ末端アミノ酸由来のオキサゾロ
ン誘導体と新たに生成されたＣ末端がオキサゾロン誘導
体であるアセチル化されたタンパク質あるいはペプチド
との混合物とし、この混合物からアセチル化されたＣ末
端アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体を有機溶媒で抽出
して同定する、という一連の操作を繰り返すことによっ
て、酵素を用いることなくタンパク質あるいはペプチド
のＣ末端からのアミノ酸配列を順次決定することが可能
になったことである。
【００４０】よって、本発明によるタンパク質あるいは
ペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定する方法は
その工業的価値が大である。 （配列表） 配列番号：１ 配列の長さ：２ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val-Phe 1
ペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定する方法は
その工業的価値が大である。 （配列表） 配列番号：１ 配列の長さ：２ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val-Phe 1
【図１】本発明の分析方法を示す工程図である。
【図２】カルボキシペプチダーゼを用いた場合の従来の
分析方法を示す工程図である。
分析方法を示す工程図である。
【図３】トリメチルシリルイソチオシアナートを用いた
場合の従来の分析方法である。
場合の従来の分析方法である。
【図４】本発明の分析方法における操作を示す図であ
る。
る。
【図５】Val-Phe の質量スペクトルを示したものであ
る。
る。
【図６】Val-Phe に３０％の無水酢酸と１％のピリジン
を含む酢酸溶液を用いて無水酢酸の蒸気を３０℃におい
て１０分間作用させて得られた生成物の質量スペクトル
である。
を含む酢酸溶液を用いて無水酢酸の蒸気を３０℃におい
て１０分間作用させて得られた生成物の質量スペクトル
である。
【図７】アセチル化されたVal-Phe に無水のアセトニト
リルを溶媒とした０．１％のピリジンを含む３０％の無
水酢酸を用いて３０℃において１０分間無水酢酸の蒸気
を作用させて得られた生成物の質量スペクトルである。
リルを溶媒とした０．１％のピリジンを含む３０％の無
水酢酸を用いて３０℃において１０分間無水酢酸の蒸気
を作用させて得られた生成物の質量スペクトルである。
【図８】アセチル化されたVal-Phe のオキサゾロン誘導
体に、９０℃で１０分間加熱して、１００％のＰＦＰＡ
から作られた蒸気を作用させて得られた生成物の質量ス
ペクトルである。
体に、９０℃で１０分間加熱して、１００％のＰＦＰＡ
から作られた蒸気を作用させて得られた生成物の質量ス
ペクトルである。
【図９】アセチル化されたVal-Phe のオキサゾロン誘導
体に、９０℃で１０分間加熱して、９０％のＰＦＰＡか
ら作られた蒸気を作用させて得られた生成物の質量スペ
クトルである。
体に、９０℃で１０分間加熱して、９０％のＰＦＰＡか
ら作られた蒸気を作用させて得られた生成物の質量スペ
クトルである。
【図１０】アセチル化されたVal-Phe のオキサゾロン誘
導体に、９０℃で１０分間加熱して、８０％のＰＦＰＡ
から作られた蒸気を作用させて得られた生成物の質量ス
ペクトルである。
導体に、９０℃で１０分間加熱して、８０％のＰＦＰＡ
から作られた蒸気を作用させて得られた生成物の質量ス
ペクトルである。
【図１１】アセチル化されたVal-Phe のオキサゾロン誘
導体に、９０℃で１０分間加熱して、７０％のＰＦＰＡ
から作られた蒸気を作用させて得られた生成物の質量ス
ペクトルである。
導体に、９０℃で１０分間加熱して、７０％のＰＦＰＡ
から作られた蒸気を作用させて得られた生成物の質量ス
ペクトルである。
【図１２】アセチル化されたタンパク質あるいはペプチ
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る温度を９０℃とした場合の結果を示したものである。
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る温度を９０℃とした場合の結果を示したものである。
【図１３】アセチル化されたタンパク質あるいはペプチ
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る温度を８０℃とした場合の結果を示したものである。
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る温度を８０℃とした場合の結果を示したものである。
【図１４】アセチル化されたタンパク質あるいはペプチ
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る温度を７０℃とした場合の結果を示したものである。
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る温度を７０℃とした場合の結果を示したものである。
【図１５】アセチル化されたタンパク質あるいはペプチ
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る温度を６０℃とした場合の結果を示したものである。
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る温度を６０℃とした場合の結果を示したものである。
【図１６】アセチル化されたタンパク質あるいはペプチ
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る時間を１０分間とした場合の結果を示したものであ
る。
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る時間を１０分間とした場合の結果を示したものであ
る。
【図１７】アセチル化されたタンパク質あるいはペプチ
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る時間を５分間とした場合の結果を示したものである。
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る時間を５分間とした場合の結果を示したものである。
【図１８】アセチル化されたタンパク質あるいはペプチ
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る時間を２分間とした場合の結果を示したものである。
ドのオキサゾロン誘導体に、ＰＦＰＡの蒸気を作用させ
る時間を２分間とした場合の結果を示したものである。
【図１９】アセチル化されたVal-Phe に無水のアセトニ
トリルを溶媒とした３０％の無水酢酸を用いて３０℃に
おいて１０分間無水酢酸の蒸気を作用させて得られた生
成物の質量スペクトルである。
トリルを溶媒とした３０％の無水酢酸を用いて３０℃に
おいて１０分間無水酢酸の蒸気を作用させて得られた生
成物の質量スペクトルである。
【図２０】アセチル化されたVal-Phe に無水のアセトニ
トリルを溶媒とした１％のピリジンを含む３０％の無水
酢酸を用いて３０℃において１０分間無水酢酸の蒸気を
作用させて得られた生成物の質量スペクトルである。
トリルを溶媒とした１％のピリジンを含む３０％の無水
酢酸を用いて３０℃において１０分間無水酢酸の蒸気を
作用させて得られた生成物の質量スペクトルである。
【図２１】アセチル化されたフェニルアラニンの質量ス
ペクトルである。
ペクトルである。
【図２２】アセチル化されたフェニルアラニンのオキサ
ゾロン誘導体の質量スペクトルである。
ゾロン誘導体の質量スペクトルである。
【図２３】アセチル化されたフェニルアラニンのオキサ
ゾロン誘導体に、１、１、１、３、３、３−ヘキサフル
オロ−２−プロピルアルコールの蒸気を５０℃において
１０分間作用させて得られた化合物の質量スペクトルで
ある。
ゾロン誘導体に、１、１、１、３、３、３−ヘキサフル
オロ−２−プロピルアルコールの蒸気を５０℃において
１０分間作用させて得られた化合物の質量スペクトルで
ある。
【図２４】アセチル化されたフェニルアラニンのオキサ
ゾロン誘導体に、１、１、１−トリフルオロ−２−アミ
ノエタンの蒸気を５０℃において１０分間作用させて得
られた化合物の質量スペクトルである。
ゾロン誘導体に、１、１、１−トリフルオロ−２−アミ
ノエタンの蒸気を５０℃において１０分間作用させて得
られた化合物の質量スペクトルである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐野 満 大阪府寝屋川市下木田町14番５号 倉敷 紡績株式会社 技術研究所内 (56)参考文献 特開 平１−250863（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−235600（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (12)
- 【請求項１】 第１段階として、カルボキシ末端がオキ
サゾロン誘導体であるアセチル化されたタンパク質ある
いはペプチドに、一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸の蒸気を作用させて、カルボキシ末端
のアミノ酸を遊離させた後、第２段階として、そのアミ
ノ酸とカルボキシ末端のアミノ酸を失ったアセチル化さ
れたタンパク質あるいはペプチドとの混合物に無水酢酸
の蒸気を作用させて、そのアミノ酸をアセチル化し、ア
セチル化されたアミノ酸とカルボキシ末端のアミノ酸を
失ったアセチル化されたタンパク質あるいはペプチドと
の混合物とし、第３段階として、この混合物にさらに無
水酢酸の蒸気を作用させて、アセチル化されたカルボキ
シ末端アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体と、新たに生
成されたカルボキシ末端がオキサゾロン誘導体であるア
セチル化されたタンパク質あるいはペプチドとの混合物
とし、この混合物からアセチル化されたカルボキシ末端
アミノ酸由来のオキサゾロン誘導体を有機溶媒で抽出し
て同定する、という一連の操作を繰り返すことを特徴と
した、タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端か
らのアミノ酸配列を決定する方法。 - 【請求項２】 上記、カルボキシ末端がオキサゾロン誘
導体であるアセチル化されたタンパク質あるいはペプチ
ドは、タンパク質あるいはペプチドに無水酢酸の蒸気を
作用させてアセチル化されたタンパク質あるいはペプチ
ドとした後に、さらに無水酢酸の蒸気を作用させて得る
ことを特徴とした、請求項１記載のタンパク質あるいは
ペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定す
る方法。 - 【請求項３】 上記、一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸の蒸気を作用させる際の有機酸溶液の
濃度は７０％以上であることを特徴とした、請求項１記
載のタンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端から
のアミノ酸配列を決定する方法。 - 【請求項４】 上記、一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸の蒸気を作用させる温度は６０から９
０℃であることを特徴とした、請求項１記載のタンパク
質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配
列を決定する方法。 - 【請求項５】 上記、一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸の蒸気を作用させる時間は５分間以上
であることを特徴とした、請求項１記載のタンパク質あ
るいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を
決定する方法。 - 【請求項６】 上記、一般式、 ＣＦ3 −（ＣＦ2 ）n −ＣＯＯＨ（ｎは１あるいは２） で表される有機酸を作用させた後、アセトニトリルある
いはピリジンを加えて減圧し、用いた溶媒と試薬とを除
去することを特徴とした、請求項１記載のタンパク質あ
るいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を
決定する方法。 - 【請求項７】 上記、有機酸の蒸気を作用させた反応混
合物に無水酢酸の蒸気を作用させることを特徴とした、
請求項１記載のタンパク質あるいはペプチドのカルボキ
シ末端からのアミノ酸配列を決定する方法。 - 【請求項８】 上記、アセチル化されたアミノ酸とカル
ボキシ末端のアミノ酸を失ったアセチル化されたタンパ
ク質あるいはペプチドとの混合物に作用させる無水酢酸
の蒸気は、ピリジンを含む有機溶媒溶液から作られるも
のであることを特徴とした、請求項１記載のタンパク質
あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列
を決定する方法。 - 【請求項９】 上記、アセチル化されたアミノ酸由来の
オキサゾロン誘導体に、フッ素を含むアルコールの蒸気
またはアミンの蒸気を作用させて、アセチル化されたア
ミノ酸のエステルまたはアセチル化されたアミノ酸のア
ミドとして検出することを特徴とした、請求項１記載の
タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのア
ミノ酸配列を決定する方法。 - 【請求項１０】 上記、タンパク質あるいはペプチドに
無水酢酸を含む溶液から作られる蒸気を作用させること
を特徴とした、請求項２記載のタンパク質あるいはペプ
チドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方
法。 - 【請求項１１】 上記、アセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチドに作用させる無水酢酸の蒸気は、ピリジ
ンを含む有機溶媒溶液から作られたものであることを特
徴とした、請求項２記載のタンパク質あるいはペプチド
のカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法。 - 【請求項１２】 上記、アセチル化されたタンパク質あ
るいはペプチドに無水酢酸の蒸気を作用させた後、アセ
トニトリルあるいはピリジンを加えて減圧し、用いた溶
媒と試薬とを除去することを特徴とした、請求項２記載
のタンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からの
アミノ酸配列を決定する方法。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP18118392A JP3175859B2 (ja) | 1992-07-08 | 1992-07-08 | タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法 |
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|---|---|
| JPH0627113A JPH0627113A (ja) | 1994-02-04 |
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