JP2732377B2 - ペプチド、蛋白質のｄ／ｌ−アミノ酸配列分析法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ／Ｌ−アミノ酸
を含有するペプチド類のアミノ酸配列及び／又は立体配
置を決定するための分析方法に関するものであり、更に
詳しくは、一般的なエドマン試薬であるフェニルイソチ
オシアナート（ＰＩＴＣ）によるペプチド類のＮ−末端
アミノ酸の誘導体化反応を利用し、引続く酸処理による
開裂／環化の後、遊離した２−アニリノ−５−チアゾリ
ノン（ＡＴＺ）誘導体を更に酸処理又は加水分解して、
生成した最終的な分解物でより安定なエドマン生成物で
あるフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体又はフ
ェニルチオカルバミン酸（ＰＴＣ）誘導体をその立体配
置を保持したままキラルな固定相上で分離する方法を採
用することにより、従来、困難とされていたペプチド類
のアミノ酸配列及び／又は立体配置を分析することを可
能とする、Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド類のア
ミノ酸配列及び／又は立体配置の新規な分析方法に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、アミン、アミノ酸、ペプチド、タ
ンパク質を検出、定量するための方法、あるいは、ペプ
チド、タンパク質のアミノ酸配列を分析するための方法
としては、フェニルイソチオシアナートを試薬として使
用する方法が知られており、これまで、この方法が汎用
されてきた〔Ｐ．Ｅｄｍａｎ，Ａｃｔａ Ｃｈｉｍ．Ｓ
ｃａｎｄ．，４，２８３（１９５０）；Ｐ．Ｅｄｍａ
ｎ，Ａｃｔａ Ｃｈｉｍ．Ｓｃａｎｄ．，１０，７６１
（１９５６）；Ｐ．Ｅｄｍａｎ，Ｇ．Ｂｅｇｇ，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１，８０（１９６
７）．〕。しかしながら、当該試薬を用いる方法は、吸
光度を検出をしなければならないために感度が悪いとい
う難点があり、更に高感度な検出、定量試薬の開発が望
まれていた。

【０００３】一方、高感度な検出を目指して、これまで
に種々の蛍光試薬が開発されており、例えば、フルオレ
セインイソチオシアナート〔Ｈ．Ｍａｅｄａ，Ｈ．Ｋａ
ｗａｕｃｈｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１，１８８（１９６８）〕、４
−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノナフチルイソチオシアナート
〔Ｈ．Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｔ．Ｔａｎｉｍｕｒａ，Ｔ．
Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｚ．Ｔａｍｕｒａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈ
ａｒｍ．Ｂｕｌｌ，１８，１４９８（１９７０）．〕、
Ｎ−ダンシルアニリノフェニルイソチオシアナート
〔Ｓ．−Ｗ．Ｊｉｎ，Ｇ．−Ｘ．Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｐａｌ
ａｃｚ，Ｂ．Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄ，ＦＥ
ＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８，１５０（１９８６）；
Ｈ． Ｈｉｒａｎｏ，Ｂ．Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉｅｂ
ｏｌｄ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅ
ｒ，３６７，１２５９（１９８６）〕などの蛍光試薬が
開発されている。しかしながら、これらの試薬について
も、反応性、試薬の安定性などの点で各々難点があり、
また、試薬自体が蛍光を有しているなどの欠点があり広
く使われるには到っていないのが実情である。

【０００４】このような状況の中で、本発明者は、高感
度な検出、定量の可能な化合物及び分析試薬を開発する
ことを目標に鋭意研究を積み重ねた結果、本発明者が長
年にわたり携わり、創製してきたベンゾフラザン骨格を
有する蛍光試薬〔ＡＢＤ−Ｆ，Ｔ．Ｔｏｙｏ’ｏｋａ，
Ｋ．Ｉｍａｉ，５６，２４６１（１９８４）；ＤＢＤ−
Ｆ，Ｔ．Ｔｏｙｏ’ｏｋａ，Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．Ｓ
ａｉｔｏ，Ｓ．Ｕｚｕ，Ｋ．Ｉｍａｉ，Ａｎａｌｙｓ
ｔ，１１４，４１３（１９８３）．〕の４位又は７位を
チオカルバミル基で置換することにより得られる新規化
合物の７−置換−４−（２，１，３−ベンゾオキサジア
ゾリル）イソチオシアナート又はその塩が、アミン、ア
ミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ基に対し、著し
く高い反応性を有し、従って、極微量のアミン、アミノ
酸、ペプチド、タンパク質が定量できることを見出すと
共に、更にペプチド、タンパク質のアミノ酸配列の分析
試薬としても有用であることを見出した（特公平６−９
４４６１号公報）。

【０００５】上記知見に基づいて、前報〔Ｉｍａｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，
９，１５２（１９９５）〕において、本発明者は、蛍光
性のエドマン試薬７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニ
ル−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル）−イ
ソチオシアナート（ＤＢＤ−ＮＣＳ）〔Ｉｍａｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，
７，５６（１９９３）〕を用いる、Ｄ／Ｌ−アミノ酸を
含有するペプチド類のアミノ酸シークエンス及び立体配
置の決定のための新しい簡便な方法を報告した。

【０００６】この方法では、ペプチド（例えば、Ｔｙｒ
−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｅｕ）は、上記
の蛍光性試薬で標識され、次いで、トリフルオロ酢酸で
５０℃、１分間処理されて開裂と環化が行われた。その
反応サイクルにおける初期生成物であり、もとの立体配
置を保持していると考えられている反応生成物であるチ
アゾリノンアミノ酸誘導体はキラル固定相（フェニルカ
ルバミル化シクロデキストリンカラム）上で分離され感
度よく検出された。このようにして、そのペプチドのア
ミノ酸シークエンスと立体配置が簡単に決定された。

【０００７】以前の本発明者の報告では、ＤＢＤ−標識
ペプチドを開裂／環化するためにトリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）と５０℃で処理すると、得られるＤＢＤ−ＴＺ−
Ｄ−あるいはＬ−アミノ酸はその立体配置を約２０％の
収率で保持しただけであった。これに反して、フェニル
イソチオシアナート（ＰＩＴＣ）から誘導された２−ア
ニリノ−５−チアゾリノン−ロイシン誘導体（ＡＴＺ−
Ｌｅｕ）のラセミ化は４％以下であった（ＡＴＺ−Ｌｅ
ｕ，５０℃，５分間）。このことは、以前、エドマン
が、最も一般的なエドマン試薬であるフェニルイソチオ
シアナート（ＰＩＴＣ）によって標識化されたペプチド
から誘導された２−アニリノ−５−チアゾリノン（ＡＴ
Ｚ）−アミノ酸は、単離や同定の操作に対して充分な安
定性がないと報告している〔Ｅｄｍａｎ，Ｐ．，Ａｃｔ
ａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．１０，７６１（１９５
６）〕ことと矛盾している。

【０００８】しかしながら、更に検討を重ねた結果、Ａ
ＴＺ−Ｌｅｕ以外の一部のＡＴＺ−アミノ酸はキラル固
定相で分離する間に、対応するフェニルチオヒダントイ
ン誘導体（ＰＴＨ−アミノ酸）に変換されてしまうこと
が判明し、エドマンの報告を確認した。従って、ＡＴＺ
−アミノ酸はペプチド類のシークエンスと立体配置の決
定には不充分であることが判明した。そこで、本発明者
は、ＡＴＺ誘導体を直ちに加水分解してフェニルチオカ
ルバミン酸（ＰＴＣ）誘導体として立体配置の保持を図
ること、ならびに最終生成物のフェニルチオヒダントイ
ン（ＰＴＨ）−アミノ酸の立体配置の保持力について検
討した。

【０００９】今回、本発明者は、ＡＴＺ−アミノ酸が加
水分解した後フェニルチオカルバミン酸（ＰＴＣ）誘導
体になっても元の立体配置を保持していること、また、
ＡＴＺ−アミノ酸がトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液
により処理して変換反応を行ったにもかかわらず、最終
的でより安定なエドマン生成物であるフェニルチオヒダ
ントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸が、最初の立体配置を保
持していることを確認した。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者は、
Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド類のアミノ酸シー
クエンスと立体配置の決定方法として、フェニルイソチ
オシアナート（ＰＩＴＣ）を利用し、フェニルチオカル
バミル（ＰＴＣ）−アミノ酸又はフェニルチオヒダント
イン（ＰＴＨ）−アミノ酸をキラルカラムで分離する方
法を確立することに成功して、本発明を完成するに至っ
た。

【００１１】すなわち、本発明は、Ｄ／Ｌ−アミノ酸を
含有するペプチド類のアミノ酸配列及び／又は立体配置
の分析方法を提供することを目的とするものである。

【００１２】また、本発明は、フェニルイソチオシアナ
ート（ＰＩＴＣ）を利用し、ＡＴＺ−アミノ酸の加水分
解物であるフェニルチオカルバミル（ＰＴＣ）−アミノ
酸、あるいは最終的でより安定なエドマン生成物である
フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸を使用
することにより、Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド
類のアミノ酸配列及び／又は立体配置を分析する方法を
提供することを目的とするものである。

【００１３】更に、本発明は、Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有
するペプチド類を連続的に分析することを可能とする当
該ペプチド類のアミノ酸配列及び／又は立体配置の分析
方法及びその装置を提供することを目的とするものであ
る。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
の本発明は、フェニルイソチオシアナート（ＰＩＴＣ）
をＤ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド類を含む試料検
体に加えて反応させ、次いで、酸処理して、遊離した２
−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体を更に酸処理又は
加水分解して、生成したフェニルチオヒダントイン（Ｐ
ＴＨ）誘導体又はフェニルチオカルバミン酸（ＰＴＣ）
誘導体をその立体配置を保持したままキラルな固定相上
で分離することを特徴とするＤ／Ｌ−アミノ酸を含有す
るペプチド類のアミノ酸配列及び／又は立体配置の分析
方法、に係るものである。また、本発明は、上記の反応
サイクル及び分離方法を繰り返すことにより、Ｄ／Ｌ−
アミノ酸を含有するペプチド類のアミノ酸配列及び／又
は立体配置をそのＮ−末端アミノ酸残基から連続的に分
析することを特徴とするＤ／Ｌ−アミノ酸を含有するペ
プチド類のアミノ酸配列及び／又は立体配置の分析方
法、に係るものである。 更に、本発明は、フェニルイ
ソチオシアナート（ＰＩＴＣ）によるＤ／Ｌ−アミノ酸
を含有するペプチド類のＮ−末端アミノ酸の誘導体化反
応、次いで、酸処理又は加水分解して２−アニリノ−５
−チアゾリノン誘導体とする開裂／環化反応、更に酸処
理してフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体又は
フェニルチオカルバミン酸（ＰＴＣ）誘導体とする変換
反応、の連続反応槽とキラルな固定相とを組み合わせた
ことを特徴とする上記のＤ／Ｌ−アミノ酸を含有するペ
プチド類のアミノ酸配列及び／又は立体配置の分析方法
に使用する分析装置、に係るものである。

【００１５】本発明において、上記Ｄ／Ｌ−アミノ酸を
含有するペプチド類とは、具体的には、ペプチド、蛋白
質を含む広い意味でのペプチド及びその関連物質を含む
ものを意味するものとして定義される。本発明は、前記
したように、フェニルイソチオシアナート（ＰＩＴＣ）
をＤ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド類を含む試料検
体に加えて、ペプチド類のＮ−末端アミノ酸の誘導体化
反応を行うが、この方法は、ＰＩＴＣと試料検体の添加
順序は特に限定されるものではなく、また、例えば、反
応は、通常５〜９０℃の範囲に加熱して行われる。反応
に要する時間は、反応温度、反応に供せられる試料検
体、溶媒等によって異なるが、例えば、通常は、１〜６
０分間の範囲で適宜選択される。また、この反応に使用
される溶媒としては、例えば、エタノール、ジメチルア
リルアミン、ピリジン等の塩基含有溶媒が好適なものと
して挙げられるが、これらと同効のものであれば適宜使
用し得ることは云うまでもない。

【００１６】反応終了後、反応混合物にベンゼンを加え
攪拌した後、遠心にて分離後、上層のベンゼン層を捨て
る。残った水層を減圧又は窒素ガスにて溶媒を揮散さ
せ、次いで、残渣に、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）などの強酸又は三フッ化ホウ素・ジエチルエーテル
などのルイス酸を加え、酸処理による開裂／環化の後
に、遊離される２−アニリノ−５−チアゾリノン−アミ
ノ酸誘導体（ＡＴＺ−アミノ酸）を更に含水有機溶媒、
例えば、２０％アセトニトリル−水にて加水分解するこ
とによってフェニルチオカルバミン酸（ＰＴＣ）誘導体
に導く。一方、ＡＴＺ−アミノ酸をトリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）水溶液により処理して変換反応を行い、最終
的でより安定なエドマン生成物であるフェニルチオヒダ
ントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸誘導体を生成させる。

【００１７】フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−ア
ミノ酸はキラルな固定相（光学活性固定相）上で分離、
分析することにより、Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプ
チド類のＮ−末端アミノ酸を高感度に検出、定量するこ
とができる。

【００１８】上記反応の結果生じたアミノ酸が一個欠け
たペプチド類のアミノ酸残基は、更に、ＰＩＴＣと反応
結合し、これは上記酸処理による開裂／環化の後に遊離
のＡＴＺ−アミノ酸を生成し、これを更に加水分解又は
酸処理することにより、より安定なＰＴＣ−アミノ酸又
はＰＴＨ−アミノ酸が生成される。本発明者が検討した
ところによれば、このようにして生成されたフェニルチ
オカルバミル−アミノ酸及びＰＴＨ−アミノ酸のＤ／Ｌ
−対掌体は、その立体配置を保持したままキラルな固定
相上で分離することができるので、当該ＰＴＣ−アミノ
酸又はＰＴＨ−アミノ酸は、Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有す
るペプチド類のアミノ酸配列及び／又は立体配置の決定
に好適に使用することが可能である。

【００１９】当該アミノ酸の配列分析を行う際の、良好
な開裂／環化の反応を期待するための好ましい条件は、
無水トリフルオロ酢酸などの強酸又は三フッ化ホウ素・
ジエチルエーテルなどのルイス酸などを用いること、具
体的には、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＢＦ
₃ ・Ｅｔ₂ Ｏ／アセトニトリル／１，２−ジロロエタン
などを用いること、反応時間は、１分〜１時間、好まし
くは１〜２０分であること、である。更に、良好な変換
反応を行う際の好ましい条件は、１０〜８０％ＴＦＡ水
溶液を用いること、反応温度は１０〜８０℃、１〜９０
分であること、である。尚、これらの条件は、反応目
的、反応に供せられる試料検体等によって好適な条件を
適宜変更し、設定し得るものであることは云うまでもな
い。

【００２０】上記反応サイクルにより、得られたＰＴＣ
−アミノ酸及びフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−
アミノ酸は、キラル（ｃｈｉｒａｌ）な固定相、例え
ば、デキストリンカラム、フェニルカルバミル化シクロ
デキストリンカラム、アセチルセルロースカラム、パー
クル型カラム、蛋白結合型カラム等のキラルカラムを利
用して、その立体配置を保持したまま分離することが可
能であり、また、上記ペプチド類の残りのシークエンス
と立体配置も、それぞれ相当するＰＴＣ−アミノ酸なら
びにＰＴＨ−アミノ酸のキラルカラム上での分離によっ
て決定することができる。

【００２１】このように、上記の反応サイクル及び分離
方法を繰り返すことにより、Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有す
るペプチド類のアミノ酸配列及び／又は立体配置をその
Ｎ−末端アミノ酸残基から連続的に分析することが可能
である。また、上記Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチ
ド類のアミノ酸配列及び／又は立体配置の分析方法で使
用する分析装置としては、フェニルイソチオシアナート
（ＰＩＴＣ）によるＤ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチ
ド類のＮ−末端アミノ酸の誘導体化反応、次いで、酸処
理して２−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体とする開
裂／環化反応、更に酸処理又は加水分解してフェニルチ
オヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体又はフェニルチオカル
バミン酸（ＰＴＣ）誘導体とする変換反応、の連続反応
槽とキラルな固定相とを組み合わせてなる分析装置が好
適なものとして挙げられる。ここで、上記連続反応槽
は、上記各反応を実施し得るものであれば如何なるもの
であってもよく、また、キラルな固定相は、前記したも
のを適宜選択して使用すればよい。更に、キラルな固定
相は、連続的又は非連続的な形態を含め、上記連続反応
槽に適宜連結して使用すればよく、その種類及び組み合
わせ方法は特に限定されるものではない。

【００２２】本発明は多くの特徴を有するが、列記する
と次の如くである。 （１）本発明方法の一工程のＰＩＴＣによる配列分析法
は、世界中で汎用されている方法であり、自動配列分析
法にも組み込まれている方法であることから、本発明
は、特に、自動解析装置に好適に利用可能である。 （２）ＰＩＴＣ−アミノ酸誘導体を酸処理して開裂／環
化させて得られるＡＴＺ−アミノ酸を更に加水分解して
得られるフェニルチオカルバミル−アミノ酸又は酸処理
して得られる最終生成物のフェニルチオヒダントイン
（ＰＴＨ）−アミノ酸はＡＴＺ誘導体よりも安定性が高
い。 （３）ＰＴＣ−アミノ酸又はＰＴＨ−アミノ酸は、元の
アミノ酸の立体配置を保持したまま単離され、キラルな
固定相上でＤ／Ｌ−対掌体に分離することができる。 （４）Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド類のアミノ
酸配列及び／又は立体配置を高収率、高効率に分析する
ことができる。

【００２３】本発明方法によれば、最も一般的なエドマ
ン試薬であるフェニルイソチオシアナート（ＰＩＴＣ）
の有用性が、Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド類の
アミノ酸のシークエンス及び立体配置の分析について提
示される。すなわち、後述する実施例において具体的に
示したように、Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド類
として、エンケファリンの一類縁体である〔Ｄ−Ａｌａ
²，Ｄ−Ｌｅｕ⁵ 〕−エンケファリンのＮ−末端アミノ
酸（Ｌ−Ｔｙｒ）のＰＩＴＣによる誘導体化反応、及び
引続くトリフルオロ酢酸による５０℃、５分間の処理に
よる開裂／環化の後に、遊離された２−アニリノ−５−
チアゾリノン−Ｌ−チロシン（ＡＴＺ−Ｌ−Ｔｙｒ）を
更に２０％トリフルオロ酢酸で５０℃、１０分間処理し
た。一方、上記ＡＴＺ−Ｌ−Ｔｒｙを更に５０％アセト
ニトリルー水にて処理し、室温放置した。次いで、生成
したフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−Ｌ−チロシ
ンならびにＰＴＣ−Ｌ−チロシンをその立体配置を保持
したままキラルな固定相（フェニルカルバミル化シクロ
デキストリンのカラム）上で分離した。このペプチドの
残りのシークエンスと立体配置（Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−
Ｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｅｕ）も、それぞれ相当するＰＴＨ
−Ｄ／Ｌ−アミノ酸ならびにＰＴＣ−Ｄ／Ｌ−アミノ酸
のキラルカラム上での分離によって決定された。この方
法は、上記エンケファリンの場合と同様にして、Ｄ／Ｌ
−アミノ酸を含有するペプチド類の立体配置を決定する
ための方法として、使用することが可能であり、特に、
自動エドマンシークエンス解析装置に利用可能である。

【００２４】本発明方法で用いる上記ＰＴＨ−アミノ酸
又はＰＴＣ−アミノ酸は、前述の特性から１０^-10 ない
し１０^-8ＭのＤ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド、タ
ンパク質のアミノ酸配列及び／又は立体配置の分析に応
用できるばかりでなく、各種の試料検体中のペプチド、
タンパク質のアミノ酸配列及び／又は立体配置の高感度
の分析を基礎とした生体代謝産物の分析、臨床分析、そ
れらの自動化等、生化学、分子遺伝学、生理学及び基
礎、臨床にわたる医学的研究、ヒュ−マンゲノム解析な
ど非常に広範囲の応用が可能である。

【００２５】

【実施例】次に、本発明について、実施例をあげて更に
具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって何
ら限定されるものではない。

【００２６】実施例 （１）フェニルイソチオシアナート（ＰＩＴＣ）による
誘導体化反応 ５０ｐｍｏｌの〔Ｄ−Ａｌａ² ，Ｄ−Ｌｅｕ⁵ 〕−エン
ケファリン（Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅ
ｕ）（蛋白質研究所，大阪，日本）の１０μＬとＰＩＴ
Ｃ溶液（ＰＩＴＣ／エタノール／ピリジン（１：４：
２，ｖ／ｖ））の３５μＬをよく攪拌し、１０分間５０
℃に加熱した。反応終了後、反応混合物を遠心エバポレ
ーター（ＳＰＥ−２００，島津製作所，京都，日本）で
５分間５０℃で乾燥した。残渣に水（１０μＬ）を加
え、ｎ−ヘプタン／ジクロロメタン（９：１，ｖ／ｖ）
１００μＬずつで３回洗浄して過剰な試薬を除去した。
水層を遠心エバポレーターで１５分間５０℃で乾燥し
た。

【００２７】（２）酸処理による開裂／環化 残渣にＴＦＡ又はＢＦ₃ 溶液（ＢＦ₃ ・Ｅｔ₂ Ｏ／アセ
トニトリル／１，２−ジクロロエタン（１：１０：９
０，ｖ／ｖ）３０μＬを加え５分間５０℃に加熱した。
次いで、窒素ガスの気流下で乾燥した。残渣を蒸留水
（２０μＬ）及び抽出溶媒（ｎ−ヘプタン／ジクロロメ
タン（７：３，ｖ／ｖ，１００μＬ））と混合し、次い
で、５分間１０００×ｇで遠心分離した。この抽出操作
を３回繰り返し、有機層をまとめて、窒素ガスの気流下
で乾燥した。

【００２８】（３）フェニルチオヒダントイン（ＰＴ
Ｈ）又はフェニルチオカルバミン酸（ＰＴＣ）誘導体の
調製 その残渣に２０％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ水溶液（２０μ
Ｌ）又は２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液（５０
μｌ）を加え、前者の場合は、１０分間５０℃に加熱し
た。反応終了後、得られた溶液を窒素気流下で乾燥し、
次いで、ＨＰＬＣ分析用の展開液に溶解した。後者の場
合は、そのままＨＰＬＣ分析に供した。残ったペプチド
を含有している水層は遠心エバポレーターで乾燥した
後、次の反応サイクルに用いた。使用したＨＰＬＣ装置
は以下の通りであった；インテリジェントポンプ（日立
Ｌ−６２００，日立製作所，東京，日本）、ＵＶ−ＶＩ
Ｓ検出器（日立 Ｌ−４２００，日立製作所）及びイン
テグレイター（日立 Ｄ−２５００，日立製作所）。流
速及びＵＶ−検出は、それぞれ、０．７ｍＬ／ｍｉｎ及
び２６９ｎｍであった。

【００２９】（４）ＰＴＨ誘導体又はＰＴＣ誘導体の対
掌体の分離 Ｄ／Ｌ−Ｔｙｒあるいは、Ｄ／Ｌ−ＡｌａのＰＴＨ誘導
体の対掌体の分離には、フェニルカルバミル化したβ−
シクロデキストリンのカラム（ＥＳ−１／２ｐｈＣＤ，
１５０×６．０ｍｍ ｉ．ｄ．，５μｍ）を用いた。こ
のカラムはフェニルカルバミル基による修飾度が約５０
％に限定されているβ−シクロデキストリン（信和化工
株式会社，京都，日本）からなっていた。展開は、１０
ｍＭの蟻酸を含むメタノール／水（１：３，ｖ／ｖ）で
行った。Ｄ／Ｌ−ＰｈｅあるいはＤ／Ｌ−Ｌｅｕの場合
は、別のフェニルカルバミル化β−シクロデキストリン
のカラム（Ｕｌｔｒｏｎ ＥＳ−ｐｈＣＤ，１５０×
６．０ｍｍ ｉ．ｄ．，５μｍ，信和化工株式会社）を
用い、１０ｍＭの蟻酸を含むメタノール／水／アセトニ
トリル（９：９：２，ｖ／ｖ）を展開溶媒として用い
て、分離を行った。ＰＴＣ誘導体の対掌体の分離には、
パークル型カラム（スミキラルＯＡ−２５００Ｓ，１５
０×６．０ｍｍｉ．ｄ．，５μｍ、住化分析センター株
式会社）２本を用いた。展開溶媒は１ｍＭクエン酸を含
むメタノールを用いた。

【００３０】（５）分析結果 図１は、上記ＨＰＬＣによる５００ｐｍｏｌの〔Ｄ−Ａ
ｌａ² ，Ｄ−Ｌｅｕ⁵〕−エンケファリンの配列分析の
結果を示しており、ＰＴＨ−Ｌ−Ｔｙｒ（サイクル
１），ＰＴＨ−Ｄ−Ａｌａ（サイクル２），ＰＴＨ−Ｇ
ｌｙ（サイクル３），ＰＴＨ−Ｌ−Ｐｈｅ（サイクル
４）及びＰＴＨ−Ｄ−Ｌｅｕ（サイクル５）を生成し
た。各誘導体は、各ＰＴＨ−アミノ酸の標準品との比較
によって同定した。各ＰＴＨ−アミノ酸のラセミ化の割
合は、それぞれ、１１％（Ｌ−Ｔｙｒ）、１１％（Ｄ−
Ａｌａ）、３％（Ｌ−Ｐｈｅ）及び１１％（Ｄ−Ｌｅ
ｕ）であり、平均値９％であった。開裂／環化にＢＦ₃
を用いたときはサイクル１で６％、サイクル２で４％の
ラセミ化率であり、ＴＦＡを用いたときよりラセミ化率
は低かった。図２は、同様にして得たＰＴＣ−Ｌ−Ｔｙ
ｒ（サイクル１）、ＰＴＣ−Ｄ−Ａｌａ（サイクル２）
のクロマトグラムである。ラセミ化率はそれぞれ６％
（Ｌ−Ｔｙｒ）、４％（Ｄ−Ａｌａ）であった。

【００３１】ＰＴＨ−ＴｙｒあるいはＰＴＨ−Ａｌａの
Ｄ／Ｌ−対掌体の分離にはＥＳ−１／２ｐｈＣＤカラム
が適していた。ＥＳ−ｐｈＣＤカラムではこれらのアミ
ノ酸誘導体はより強く吸着され、分離は良くなかった。
しかしながら、ＰＴＨ−ＰｈｅあるいはＰＴＨ−Ｌｅｕ
の場合は、ＥＳ−１／２ｐｈＣＤカラム（低疎水性）で
はそれらのＤ／Ｌ−対掌体は分離されずＥＳ−ｐｈＣＤ
カラム（高疎水性）では分離された。

【００３２】上記の分析結果から明らかなように、本発
明によれば、ＰＴＨ誘導体又はＰＴＣ誘導体のＤ／Ｌ−
対掌体をキラルな固定相上で元の立体配置を保持したま
ま効率良く分離、検出できることが判明した。尚、他の
Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド類について同様に
試験したところ、ほぼ同様の結果が得られた。

【００３３】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明は、フェニ
ルイソチオシアナート（ＰＩＴＣ）をＤ／Ｌ−アミノ酸
を含有するペプチド類を含む試料検体に加えて反応さ
せ、次いで、酸処理して、遊離した２−アニリノ−５−
チアゾリノン誘導体を更に酸処理又は加水分解して、生
成したフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体又は
フェニルチオカルバミン酸（ＰＴＣ）誘導体をその立体
配置を保持したままキラルな固定相上で分離することを
特徴とするＤ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド類のア
ミノ酸配列及び／又は立体配置の分析方法に係るもので
あり、本発明によれば、Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有するペ
プチド類のアミノ酸配列及び／又は立体配置を効率良く
分析することができる。また、上記反応により生成した
フェニルチオヒダントイン誘導体又はフェニルチオカル
バミン酸誘導体は、ＡＴＺ誘導体よりも安定であり、そ
の立体配置を保持したままキラルな固定相上で分離する
ことができる。更に、ここで提案した方法は、Ｄ／Ｌ−
アミノ酸残基を含有するペプチド類の配列の決定のため
の自動シークエンス解析装置に利用して配列決定及び／
又は立体配置の解析ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＴＦＡを用いて〔Ｄ−Ａｌａ² ，Ｄ−Ｌｅ
ｕ⁵ 〕−エンケファリン（Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｅｕ）をＰＴＨ誘導体として配列分析を行った
結果を示す。

【図２】ＴＦＡを用いて〔Ｄ−Ａｌａ² ，Ｄ−Ｌｅ
ｕ⁵ 〕−エンケファリン（Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｅｕ）をＰＴＣ誘導体としてサイクル２までの
配列分析を行った結果を示す。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フェニルイソチオシアナート（ＰＩＴ
   Ｃ）をＤ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド類を含む試
   料検体に加えて反応させ、次いで、酸処理して、遊離し
   た２−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体を更に酸処理
   又は加水分解して、生成したフェニルチオヒダントイン
   （ＰＴＨ）誘導体又はフェニルチオカルバミン酸（ＰＴ
   Ｃ）誘導体をその立体配置を保持したままキラルな固定
   相上で分離することを特徴とするＤ／Ｌ−アミノ酸を含
   有するペプチド類のアミノ酸配列及び／又は立体配置の
   分析方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の反応サイクル及び分離方
   法を繰り返すことにより、Ｄ／Ｌ−アミノ酸を含有する
   ペプチド類のアミノ酸配列及び／又は立体配置をそのＮ
   −末端アミノ酸残基から連続的に分析することを特徴と
   するＤ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド類のアミノ酸
   配列及び／又は立体配置の分析方法。
3. 【請求項３】 フェニルイソチオシアナート（ＰＩＴ
   Ｃ）によるＤ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチド類のＮ
   −末端アミノ酸の誘導体化反応、次いで、酸処理して２
   −アニリノ−５−チアゾリノン誘導体とする開裂／環化
   反応、更に酸処理又は加水分解してフェニルチオヒダン
   トイン（ＰＴＨ）誘導体又はフェニルチオカルバミン酸
   （ＰＴＣ）誘導体とする変換反応、の連続反応槽とキラ
   ルな固定相とを組み合わせたことを特徴とする請求項１
   又は請求項２記載のＤ／Ｌ−アミノ酸を含有するペプチ
   ド類のアミノ酸配列及び／又は立体配置の分析方法に使
   用する分析装置。