JPH07213298A - 末端残基を順次除去するポリマーの分解及び配列決定のための方法及び装置 - Google Patents
末端残基を順次除去するポリマーの分解及び配列決定のための方法及び装置Info
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- JPH07213298A JPH07213298A JP6215243A JP21524394A JPH07213298A JP H07213298 A JPH07213298 A JP H07213298A JP 6215243 A JP6215243 A JP 6215243A JP 21524394 A JP21524394 A JP 21524394A JP H07213298 A JPH07213298 A JP H07213298A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ポリマーの主鎖の反復単位の少なくとも一部
を順次的に分解する方法を提供すること。 【構成】 ポリマーの主鎖の反復単位の少なくとも一部
を順次的に分解する方法であって、該ポリマーが求核試
薬及び該求核試薬から離れた主鎖カルボニル炭素からな
る末端反復単位を有し、下記の工程を含む当該方法: (a)該求核試薬の該主鎖カルボニル炭素への攻撃を、
エネルギーレベルを上げて該求核試薬を該攻撃のために
活性化することによって開始し、(b)該末端反復単位
を含む環を形成し、それにより同時に該環を遊離し且つ
該主鎖カルボニル炭素への求核攻撃が可能な末端反復単
位を有する短くなったポリマーを生成し、そして、
(c)所望のポリマー部分が分解するまで工程a及びb
を反復するために必要な反応条件を維持する。
を順次的に分解する方法を提供すること。 【構成】 ポリマーの主鎖の反復単位の少なくとも一部
を順次的に分解する方法であって、該ポリマーが求核試
薬及び該求核試薬から離れた主鎖カルボニル炭素からな
る末端反復単位を有し、下記の工程を含む当該方法: (a)該求核試薬の該主鎖カルボニル炭素への攻撃を、
エネルギーレベルを上げて該求核試薬を該攻撃のために
活性化することによって開始し、(b)該末端反復単位
を含む環を形成し、それにより同時に該環を遊離し且つ
該主鎖カルボニル炭素への求核攻撃が可能な末端反復単
位を有する短くなったポリマーを生成し、そして、
(c)所望のポリマー部分が分解するまで工程a及びb
を反復するために必要な反応条件を維持する。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】この発明は、一般に、ポリマー及
び合成核酸化学の分野に関係する。特に、この発明は、
末端残基を順次除去するポリマー特にペプチド核酸(P
NA)の分解及び配列決定に関係する。
び合成核酸化学の分野に関係する。特に、この発明は、
末端残基を順次除去するポリマー特にペプチド核酸(P
NA)の分解及び配列決定に関係する。
【0002】
【発明の背景】ペプチド核酸(PNA)は、DNA発現
の配列特異的な制御及び遺伝子をターゲットとする薬物
の調製のための有望な候補である最近発見された合成ポ
リアミドである。欧州特許出願EP92/01219及
び92/01220号を参照されたい。PNAは、DN
Aのヌクレオチド塩基が結合したペプチド様の主鎖を有
するバイオポリマーハイブリッドである。特に、PNA
は、アデニン、シトシン、グアニン及びチミンがメチレ
ンカルボニル基を介して結合したアミノ酸、2−アミノ
エチルグリシンの反復単位からなる合成ポリアミドであ
る。PNAの相補的配列は、DNAに高い特異性で結合
して二重及び三重のらせん形の両者を与える。驚くべき
ことに、PNA−DNAハイブリッドは、天然の二重ら
せんDNAより一層安定である。それ故に、PNAは、
DNA操作の多面的分野に応用するための有望な候補で
ある。Nielsen, Peter E等、 Science 254:1497-1500 (1
991)を参照されたい。現在、一度合成されたPNAを配
列決定するための公知の技術は存在しない。
の配列特異的な制御及び遺伝子をターゲットとする薬物
の調製のための有望な候補である最近発見された合成ポ
リアミドである。欧州特許出願EP92/01219及
び92/01220号を参照されたい。PNAは、DN
Aのヌクレオチド塩基が結合したペプチド様の主鎖を有
するバイオポリマーハイブリッドである。特に、PNA
は、アデニン、シトシン、グアニン及びチミンがメチレ
ンカルボニル基を介して結合したアミノ酸、2−アミノ
エチルグリシンの反復単位からなる合成ポリアミドであ
る。PNAの相補的配列は、DNAに高い特異性で結合
して二重及び三重のらせん形の両者を与える。驚くべき
ことに、PNA−DNAハイブリッドは、天然の二重ら
せんDNAより一層安定である。それ故に、PNAは、
DNA操作の多面的分野に応用するための有望な候補で
ある。Nielsen, Peter E等、 Science 254:1497-1500 (1
991)を参照されたい。現在、一度合成されたPNAを配
列決定するための公知の技術は存在しない。
【0003】DNA、ポリペプチド及び蛋白質は、周知
の方法によって常例的に配列決定し得る天然に存在する
バイオポリマーである。PNAは核酸及びポリペプチド
様構造の両者を有するハイブリッドバイオポリマーであ
るので、DNA及び蛋白質の配列決定法をPNAの配列
決定に応用することを検討することは論理的である。
の方法によって常例的に配列決定し得る天然に存在する
バイオポリマーである。PNAは核酸及びポリペプチド
様構造の両者を有するハイブリッドバイオポリマーであ
るので、DNA及び蛋白質の配列決定法をPNAの配列
決定に応用することを検討することは論理的である。
【0004】DNAは、マクサム・ギルバート法又はサ
ンガー法の何れかによって配列決定することが出来る。
Stryer, L 著、 Biochemistry, W.H.Freeman and Co., S
an Francisco (1981) 591-93頁を参照されたい。更に、
短いDNAオリゴマーは、モビリティー−シフト(ワン
ダリング・スポット)法によって配列決定された。Gai
t, M.J.著、 Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, N
Y (1990) 135-36頁を参照されたい。ポリペプチド及び
蛋白質は、エドマン分解によりそれらのアミン末端から
配列決定される。Stryer, L 著、 Biochemistry, W.H.Fr
eeman and Co., San Francisco (1981) 24-27 頁を参照
されたい。更に、ポリペプチドのカルボキシ末端配列決
定のための幾つかの新規な方法が記載された。Inglis,
A.S., Anal. Biochem. 195:183-96 (1991)を参照された
い。更に、ポリペプチドの配列決定は又、後で質量分析
されるネストした断片の(配列規定)セットを生成する
ことによっても記載された。Chait, Brian, T.等、 Scie
nce 257:1885-94 (1992)を参照されたい。しかしなが
ら、下記に一層詳細に検討するように、これらの技術
は、PNAが天然に存在しないポリアミド主鎖を含んで
いるハイブリッドバイオポリマーであるために、PNA
を配列決定するために用いることは出来ない。
ンガー法の何れかによって配列決定することが出来る。
Stryer, L 著、 Biochemistry, W.H.Freeman and Co., S
an Francisco (1981) 591-93頁を参照されたい。更に、
短いDNAオリゴマーは、モビリティー−シフト(ワン
ダリング・スポット)法によって配列決定された。Gai
t, M.J.著、 Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, N
Y (1990) 135-36頁を参照されたい。ポリペプチド及び
蛋白質は、エドマン分解によりそれらのアミン末端から
配列決定される。Stryer, L 著、 Biochemistry, W.H.Fr
eeman and Co., San Francisco (1981) 24-27 頁を参照
されたい。更に、ポリペプチドのカルボキシ末端配列決
定のための幾つかの新規な方法が記載された。Inglis,
A.S., Anal. Biochem. 195:183-96 (1991)を参照された
い。更に、ポリペプチドの配列決定は又、後で質量分析
されるネストした断片の(配列規定)セットを生成する
ことによっても記載された。Chait, Brian, T.等、 Scie
nce 257:1885-94 (1992)を参照されたい。しかしなが
ら、下記に一層詳細に検討するように、これらの技術
は、PNAが天然に存在しないポリアミド主鎖を含んで
いるハイブリッドバイオポリマーであるために、PNA
を配列決定するために用いることは出来ない。
【0005】DNAは、アデニン、シトシン、グアニン
及びチミンが結合したデオキシリボースリン酸エステル
主鎖からなるバイオポリマーである。マクサム・ギルバ
ート法及びサンガー法は、分離し及び分析して配列を決
定すべきポリマー断片のネストしたセットの生成を必要
とする。しかしながら、デオキシリボースリン酸エステ
ル主鎖は、如何なる公知の化学的方法によっても順次的
に分解されない。それ故に、ポリマー断片のネストした
セットは、別の方法によって生成される。
及びチミンが結合したデオキシリボースリン酸エステル
主鎖からなるバイオポリマーである。マクサム・ギルバ
ート法及びサンガー法は、分離し及び分析して配列を決
定すべきポリマー断片のネストしたセットの生成を必要
とする。しかしながら、デオキシリボースリン酸エステ
ル主鎖は、如何なる公知の化学的方法によっても順次的
に分解されない。それ故に、ポリマー断片のネストした
セットは、別の方法によって生成される。
【0006】「ネストしたセット」は、ポリマー配列を
決定するために用いるポリマーを部分的に分解/合成し
た試料を定義するために配列決定の分野で用いられる用
語である。理想的には、このネストしたセットは、測定
可能な量の分解/合成工程により生成した各断片を含
み、それにより、断片のセットの分析が配列を規定す
る。それ故、すべての断片は共通の一端を有するが、他
端は主鎖の開裂点又は合成停止点によって決定される。
従って、すべての短くしたポリマーの長さ/質量の相対
的差異は、主鎖の開裂点又は合成停止点に依存してい
る。
決定するために用いるポリマーを部分的に分解/合成し
た試料を定義するために配列決定の分野で用いられる用
語である。理想的には、このネストしたセットは、測定
可能な量の分解/合成工程により生成した各断片を含
み、それにより、断片のセットの分析が配列を規定す
る。それ故、すべての断片は共通の一端を有するが、他
端は主鎖の開裂点又は合成停止点によって決定される。
従って、すべての短くしたポリマーの長さ/質量の相対
的差異は、主鎖の開裂点又は合成停止点に依存してい
る。
【0007】マクサム・ギルバート法は、化学試薬を用
いてデオキシリボースリン酸エステル主鎖を開裂させ、
それにより、断片のネストしたセットを生成する。或
は、サンガー法は、酵素的方法を用いてネストしたセッ
トを合成する。配列決定すべきDNAをテンプレートと
して用いて、プライマーをアニールさせ及びポリメラー
ゼ反応を4つの別々の容器内で進める。各容器は、取り
込んだ際に鎖延長を停止させそれによりネストしたポリ
マー断片のセットを生成する異なるジデオキシヌクレオ
チドを含む。最後に、DNA配列決定のためのモビリテ
ィー−シフト(ワンダリング・スポット)法は、デオキ
シリボースリン酸エステル主鎖をランダムに開裂させそ
れによりネストしたポリマー断片のセットを生成するホ
スホジエステラーゼ酵素の利用を含む。
いてデオキシリボースリン酸エステル主鎖を開裂させ、
それにより、断片のネストしたセットを生成する。或
は、サンガー法は、酵素的方法を用いてネストしたセッ
トを合成する。配列決定すべきDNAをテンプレートと
して用いて、プライマーをアニールさせ及びポリメラー
ゼ反応を4つの別々の容器内で進める。各容器は、取り
込んだ際に鎖延長を停止させそれによりネストしたポリ
マー断片のセットを生成する異なるジデオキシヌクレオ
チドを含む。最後に、DNA配列決定のためのモビリテ
ィー−シフト(ワンダリング・スポット)法は、デオキ
シリボースリン酸エステル主鎖をランダムに開裂させそ
れによりネストしたポリマー断片のセットを生成するホ
スホジエステラーゼ酵素の利用を含む。
【0008】これらの方法は、PNAの配列決定に適合
させることが出来ない。PNAはポリアミド主鎖からな
っているので、マクサム・ギルバートにより記載された
化学的処理はPNAを開裂させない。同様に、PNA
は、酵素DNAポリメラーゼの基質でないので、サンガ
ー法に従順でない。更に、PNAは、モビリティー−シ
フト(ワンダリング・スポット)分析のためにDNAを
分解するのに用いるホスホジエステラーゼ酵素の基質で
ない。従って、何れの公知のDNA配列決定法も、分離
及び分析に適したPNA断片のネストしたセットを生成
しない。
させることが出来ない。PNAはポリアミド主鎖からな
っているので、マクサム・ギルバートにより記載された
化学的処理はPNAを開裂させない。同様に、PNA
は、酵素DNAポリメラーゼの基質でないので、サンガ
ー法に従順でない。更に、PNAは、モビリティー−シ
フト(ワンダリング・スポット)分析のためにDNAを
分解するのに用いるホスホジエステラーゼ酵素の基質で
ない。従って、何れの公知のDNA配列決定法も、分離
及び分析に適したPNA断片のネストしたセットを生成
しない。
【0009】蛋白質配列決定の関連技術も又、PNAを
配列決定することを試みるのに助けとならない。蛋白質
及びポリペプチドは、20種類の天然に存在するアミノ
酸から形成されるポリアミドである。その配列は、アミ
ノ又はカルボキシ末端配列決定法を用いて決定され得
る。蛋白質配列決定は、一般に、化学的に誘導される順
次的除去及び末端アミノ酸残基の同定を含む。ポリマー
断片のネストしたセットが生成されることを必要としな
いので、典型的な蛋白質配列決定法は、DNA配列決定
技術と実質的に異なっている。
配列決定することを試みるのに助けとならない。蛋白質
及びポリペプチドは、20種類の天然に存在するアミノ
酸から形成されるポリアミドである。その配列は、アミ
ノ又はカルボキシ末端配列決定法を用いて決定され得
る。蛋白質配列決定は、一般に、化学的に誘導される順
次的除去及び末端アミノ酸残基の同定を含む。ポリマー
断片のネストしたセットが生成されることを必要としな
いので、典型的な蛋白質配列決定法は、DNA配列決定
技術と実質的に異なっている。
【0010】エドマン分解は、ポリアミドがイソチオシ
アネートと反応する遊離のアミノ基を有することを必要
とする。Stryer, L 著、 Biochemistry, W.H.Freeman an
d Co., San Francisco (1981) 24-27 頁を参照された
い。イソチオシアネートは、典型的には、フェニルイソ
チオシアネートである。付加物は、分子内で、最も近い
ポリマー主鎖アミド基と反応し、それにより、5員環を
形成する。この付加物を転移し、次いで、末端アミノ酸
残基を強酸を用いて開裂させる。遊離されたアミノ酸の
フェニルチオヒダントイン(PTH)を同定し、及び短
くなったポリマーを分解及び分析の反復サイクルにかけ
ることが出来る。
アネートと反応する遊離のアミノ基を有することを必要
とする。Stryer, L 著、 Biochemistry, W.H.Freeman an
d Co., San Francisco (1981) 24-27 頁を参照された
い。イソチオシアネートは、典型的には、フェニルイソ
チオシアネートである。付加物は、分子内で、最も近い
ポリマー主鎖アミド基と反応し、それにより、5員環を
形成する。この付加物を転移し、次いで、末端アミノ酸
残基を強酸を用いて開裂させる。遊離されたアミノ酸の
フェニルチオヒダントイン(PTH)を同定し、及び短
くなったポリマーを分解及び分析の反復サイクルにかけ
ることが出来る。
【0011】カルボキシ末端配列決定法は、エドマン分
解を真似ているが、ポリマーの反対の末端からの順次的
分解を含んでいる。Inglis, A.S., Anal. Biochem. 19
5:183-96 (1991)を参照されたい。エドマン分解と同様
に、カルボキシ末端配列決定法は、化学的に誘導する順
次的除去及び末端アミノ酸残基の同定を含む。
解を真似ているが、ポリマーの反対の末端からの順次的
分解を含んでいる。Inglis, A.S., Anal. Biochem. 19
5:183-96 (1991)を参照されたい。エドマン分解と同様
に、カルボキシ末端配列決定法は、化学的に誘導する順
次的除去及び末端アミノ酸残基の同定を含む。
【0012】PNAはポリアミド主鎖を含んでいるが、
蛋白質配列決定の化学は、このポリマーを分解するとは
期待されないであろう。PNA主鎖は天然に存在しない
ものであり、その反復単位は実質的にポリペプチド主鎖
と異なる。従って、蛋白質分解及び配列決定に用いられ
た化学的方法は、PNAを分解せず又はPNAを配列決
定するのに有用ではないであろう。
蛋白質配列決定の化学は、このポリマーを分解するとは
期待されないであろう。PNA主鎖は天然に存在しない
ものであり、その反復単位は実質的にポリペプチド主鎖
と異なる。従って、蛋白質分解及び配列決定に用いられ
た化学的方法は、PNAを分解せず又はPNAを配列決
定するのに有用ではないであろう。
【0013】もっと最近になって、ポリマー断片のネス
トしたセット(配列規定セット)を調製し、その後質量
分析を行なうことによるポリペプチド配列決定法が記載
された。Chait,B.T.等、 Science 257:1885-94 (1992)を
参照されたい。公知のアミノ酸残基の質量を有する断片
間の相対質量差を比較することによって配列を決定す
る。ポリマー断片のネストした(配列規定)セットの形
成がDNA配列決定に必要であるが、この方法は、各残
基の順次的除去及び同定からなる従来の蛋白質配列決定
法とは実質的に異なっている。それにもかかわらず、エ
ドマン化学が、やはり、ネストしたセットの形成に必要
である。それ故、PNAは、エドマン分解によっては順
次的に分解されないので、この方法によって配列決定す
ることは出来ない。
トしたセット(配列規定セット)を調製し、その後質量
分析を行なうことによるポリペプチド配列決定法が記載
された。Chait,B.T.等、 Science 257:1885-94 (1992)を
参照されたい。公知のアミノ酸残基の質量を有する断片
間の相対質量差を比較することによって配列を決定す
る。ポリマー断片のネストした(配列規定)セットの形
成がDNA配列決定に必要であるが、この方法は、各残
基の順次的除去及び同定からなる従来の蛋白質配列決定
法とは実質的に異なっている。それにもかかわらず、エ
ドマン化学が、やはり、ネストしたセットの形成に必要
である。それ故、PNAは、エドマン分解によっては順
次的に分解されないので、この方法によって配列決定す
ることは出来ない。
【0014】合成ポリマーは又、解重合(「脱増殖(de
propagation )」「鎖開き(chain unzipping) 」として
も知られる)によっても分解される。Rempp 等、 Polyme
r Synthesis, Huthig and Wepf Verlag, New York, (19
91) 202 頁を参照されたい。その過程は、フリーラジカ
ル機構による重合に共通している。解重合は、重合反応
の自発的逆転によってモノマーを再生する。解重合はポ
リマーの段階的分解であるが、それは配列分析のために
制御し又は操作するには速過ぎるランダムな平衡過程で
ある。更に、特にPNAはフリーラジカル重合によって
は組み立てられず又、この機構によって分解されること
は示されていない。
propagation )」「鎖開き(chain unzipping) 」として
も知られる)によっても分解される。Rempp 等、 Polyme
r Synthesis, Huthig and Wepf Verlag, New York, (19
91) 202 頁を参照されたい。その過程は、フリーラジカ
ル機構による重合に共通している。解重合は、重合反応
の自発的逆転によってモノマーを再生する。解重合はポ
リマーの段階的分解であるが、それは配列分析のために
制御し又は操作するには速過ぎるランダムな平衡過程で
ある。更に、特にPNAはフリーラジカル重合によって
は組み立てられず又、この機構によって分解されること
は示されていない。
【0015】合成ポリマーは、「バックバイティング
(backbiting)」として知られる分子内反応を受ける
が、これらの過程はこのポリマーを分解しない。Bovey
等、 Macromolecules; an introduction to polymer sci
ence, Academic Press, New York, (1979), 48-49 頁及
び238-41頁を参照されたい。フリーラジカル重合の間
に、伸長中のポリマー鎖の末端から中間の原子へのフリ
ーラジカルの分子内転移によってバックバイティングが
起きる。鎖増殖がこの点から続き且つポリマーが分枝す
る。それにもかかわらず、PNAはフリーラジカル重合
によっては組み立てられないので、それらはこの機構に
よって分解されない。
(backbiting)」として知られる分子内反応を受ける
が、これらの過程はこのポリマーを分解しない。Bovey
等、 Macromolecules; an introduction to polymer sci
ence, Academic Press, New York, (1979), 48-49 頁及
び238-41頁を参照されたい。フリーラジカル重合の間
に、伸長中のポリマー鎖の末端から中間の原子へのフリ
ーラジカルの分子内転移によってバックバイティングが
起きる。鎖増殖がこの点から続き且つポリマーが分枝す
る。それにもかかわらず、PNAはフリーラジカル重合
によっては組み立てられないので、それらはこの機構に
よって分解されない。
【0016】他のバックバイティング過程によって形成
されたポリマーの改造(reshuffling )が起こり得る。
Rempp 等、 Polymer Synthesis, Huthig and Wepf Verla
g, New York, (1991) 51頁を参照されたい。ヒドロキシ
ル末端を有するポリエステルは、分子内で、ポリマー主
鎖のエステル基を攻撃する。更に、アミノ末端を有する
ポリアミドは、ポリマー主鎖のアミド基を攻撃する。こ
れらの条件下でのバックバイティングは、ポリマーの改
造を生じる。断片が消失する訳ではないので、ポリマー
の質量は変わらない。更に、バックバイティングがPN
A中で認められた。PNAの末端アミノ基の側鎖アミド
基への分子内攻撃が記載された。Christensen, L等、 Op
timized Solid-Phase Synthesis of PNA Oligomers, 第
13回アメリカンペプチドシンポジウム、ポスター No.
7, 1993 年6月20〜23日、カナダ国、Edmontonを参
照されたい。この出願の図1、攻撃1をも参照された
い。この結果は、N−アシルシフトとして公知の再配列
である。PNAはバックバイティングを通して再配列す
るが、この方法は、ポリマーの質量が変わらないので、
配列決定法を与えないであろう。
されたポリマーの改造(reshuffling )が起こり得る。
Rempp 等、 Polymer Synthesis, Huthig and Wepf Verla
g, New York, (1991) 51頁を参照されたい。ヒドロキシ
ル末端を有するポリエステルは、分子内で、ポリマー主
鎖のエステル基を攻撃する。更に、アミノ末端を有する
ポリアミドは、ポリマー主鎖のアミド基を攻撃する。こ
れらの条件下でのバックバイティングは、ポリマーの改
造を生じる。断片が消失する訳ではないので、ポリマー
の質量は変わらない。更に、バックバイティングがPN
A中で認められた。PNAの末端アミノ基の側鎖アミド
基への分子内攻撃が記載された。Christensen, L等、 Op
timized Solid-Phase Synthesis of PNA Oligomers, 第
13回アメリカンペプチドシンポジウム、ポスター No.
7, 1993 年6月20〜23日、カナダ国、Edmontonを参
照されたい。この出願の図1、攻撃1をも参照された
い。この結果は、N−アシルシフトとして公知の再配列
である。PNAはバックバイティングを通して再配列す
るが、この方法は、ポリマーの質量が変わらないので、
配列決定法を与えないであろう。
【0017】現在、PNAについての配列情報は、実際
の合成手順から得られるだけである。PNAモノマーの
合成のための方法は記載されている。前述の欧州特許出
願EP92/01219及び92/01220号を参照
されたい。ペプチド合成のための従来のboc/ベンジ
ル保護化学を用いて、伸長中のアミノ末端と次のモノマ
ーのカルボキシル末端との順次的反応によってポリマー
を組み立てる。Gross,Erhard 等、 The Peptide, Academ
ic Press, NY (1980) 100-118頁を参照されたい。完全
に組み立てられたポリマーを脱保護し、粗試料を分析す
る。分析は、典型的には、分離ステップとその後の単離
した断片の質量分光分析とからなる。分離分析(例え
ば、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、キャ
ピラリー液体クロマトグラフィー又はキャピラリー電気
泳動)は、多くの成分及び各々の相対量を与える。もっ
と短いオリゴマーについては、これらの技術を用いてポ
リマーの長さ(反復モノマー単位の数)を決定すること
が出来る。しかしながら、配列情報は生じない。それ
故、もしこのポリマーを適当な長さではあるが組立の順
序が不正確であるように不適当に組み立てたならば、分
離分析はこの異常を検出することは出来ない。更に、分
離分析は、絶対に、単離されたポリマーを同定すること
は出来ない。
の合成手順から得られるだけである。PNAモノマーの
合成のための方法は記載されている。前述の欧州特許出
願EP92/01219及び92/01220号を参照
されたい。ペプチド合成のための従来のboc/ベンジ
ル保護化学を用いて、伸長中のアミノ末端と次のモノマ
ーのカルボキシル末端との順次的反応によってポリマー
を組み立てる。Gross,Erhard 等、 The Peptide, Academ
ic Press, NY (1980) 100-118頁を参照されたい。完全
に組み立てられたポリマーを脱保護し、粗試料を分析す
る。分析は、典型的には、分離ステップとその後の単離
した断片の質量分光分析とからなる。分離分析(例え
ば、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、キャ
ピラリー液体クロマトグラフィー又はキャピラリー電気
泳動)は、多くの成分及び各々の相対量を与える。もっ
と短いオリゴマーについては、これらの技術を用いてポ
リマーの長さ(反復モノマー単位の数)を決定すること
が出来る。しかしながら、配列情報は生じない。それ
故、もしこのポリマーを適当な長さではあるが組立の順
序が不正確であるように不適当に組み立てたならば、分
離分析はこの異常を検出することは出来ない。更に、分
離分析は、絶対に、単離されたポリマーを同定すること
は出来ない。
【0018】質量分光分析は、分離工程から単離された
PNAを分析するために用いる場合、精製されたポリマ
ーの正確な質量を与えるので非常に有効である。所望の
生成物は、他の化合物がその予想される質量から異なっ
た質量を有しているので同定される。しかしながら、正
しいモノマー組成を有するが配列が異なるポリマーは、
それらが所望の生成物と同じ質量を有するので区別する
ことが出来ない。この状況は、組立の順序を間違ったと
きに起こるであろう。このように、質量分光分析のみを
用いては、PNAの配列を確かめることは不可能であ
る。
PNAを分析するために用いる場合、精製されたポリマ
ーの正確な質量を与えるので非常に有効である。所望の
生成物は、他の化合物がその予想される質量から異なっ
た質量を有しているので同定される。しかしながら、正
しいモノマー組成を有するが配列が異なるポリマーは、
それらが所望の生成物と同じ質量を有するので区別する
ことが出来ない。この状況は、組立の順序を間違ったと
きに起こるであろう。このように、質量分光分析のみを
用いては、PNAの配列を確かめることは不可能であ
る。
【0019】PNAの配列が確実に知れることは重要で
ある(さもなければ、実験結果が誤解を生じ得る)。研
究は、単一塩基対のミスマッチがPNA−DNA結合に
影響を与えることを示している。Egholm, M.等、 J. Am.
Chem. Soc. 114:9677-78 (1992)を参照されたい。エラ
ーは、ポリマーの化学的組み立ての間に起こり得るの
で、組み立てられたPNAの配列の絶対的確認に適した
方法が望ましい。更に、治療剤の場合は、PNAは、ヒ
トにおいての使用を受ける前に十分確立されなくてはな
らない。それ故、配列決定は一次ポリアミド構造の絶対
的確認を与えるので、PNAについての配列決定法が必
要とされている。
ある(さもなければ、実験結果が誤解を生じ得る)。研
究は、単一塩基対のミスマッチがPNA−DNA結合に
影響を与えることを示している。Egholm, M.等、 J. Am.
Chem. Soc. 114:9677-78 (1992)を参照されたい。エラ
ーは、ポリマーの化学的組み立ての間に起こり得るの
で、組み立てられたPNAの配列の絶対的確認に適した
方法が望ましい。更に、治療剤の場合は、PNAは、ヒ
トにおいての使用を受ける前に十分確立されなくてはな
らない。それ故、配列決定は一次ポリアミド構造の絶対
的確認を与えるので、PNAについての配列決定法が必
要とされている。
【0020】
【発明の要約】この発明は、末端反復単位(残基)を順
次的に遊離するポリマーの分解のための新規な方法及び
装置を含む。一般に、この発明の方法によって分解し得
るポリマーはPNA、ポリアミド、ポリエステル及びポ
リチオエステルである。詳細には、これらのポリマーは
末端反復単位及び主鎖反復単位の両者からなる。少なく
とも1つの末端反復単位は、末端求核試薬(アミノ、ヒ
ドロキシル又はチオール基)及びその末端求核試薬から
離れた主鎖カルボニル炭素を含む。好ましくは、これら
の末端反復単位は、2−アミノエチルグリシン、2−ヒ
ドロキシエチルグリシン又は2−チオエチルグリシンの
誘導体である。
次的に遊離するポリマーの分解のための新規な方法及び
装置を含む。一般に、この発明の方法によって分解し得
るポリマーはPNA、ポリアミド、ポリエステル及びポ
リチオエステルである。詳細には、これらのポリマーは
末端反復単位及び主鎖反復単位の両者からなる。少なく
とも1つの末端反復単位は、末端求核試薬(アミノ、ヒ
ドロキシル又はチオール基)及びその末端求核試薬から
離れた主鎖カルボニル炭素を含む。好ましくは、これら
の末端反復単位は、2−アミノエチルグリシン、2−ヒ
ドロキシエチルグリシン又は2−チオエチルグリシンの
誘導体である。
【0021】この発明の方法により、このポリマーは、
その末端反復単位(末端残基)の反復遊離によって分解
する。分解は、このポリマーの末端求核試薬がその求核
試薬から少なくとも4原子離れた主鎖カルボニル炭素へ
の分子内攻撃を開始することを含む。末端求核試薬の攻
撃の開始は、系のエネルギーレベルを高めることを必要
とする。この末端反復単位は、同時にポリマーから遊離
して安定な環状構造を形成し、それにより、求核試薬
(アミノ、ヒドロキシ又はチオール官能基)及び主鎖カ
ルボニル炭素からなる末端反復単位を有する短くなった
ポリマーを生成する。反応条件を維持すれば、短くなっ
たポリマーは必要な官能基をすべて含んでいるので、こ
のサイクルは、短くなったポリマー上で、所望の部分が
分解するか又は試料が分解反応の活性化エネルギーより
低く置かれるまで反復する。
その末端反復単位(末端残基)の反復遊離によって分解
する。分解は、このポリマーの末端求核試薬がその求核
試薬から少なくとも4原子離れた主鎖カルボニル炭素へ
の分子内攻撃を開始することを含む。末端求核試薬の攻
撃の開始は、系のエネルギーレベルを高めることを必要
とする。この末端反復単位は、同時にポリマーから遊離
して安定な環状構造を形成し、それにより、求核試薬
(アミノ、ヒドロキシ又はチオール官能基)及び主鎖カ
ルボニル炭素からなる末端反復単位を有する短くなった
ポリマーを生成する。反応条件を維持すれば、短くなっ
たポリマーは必要な官能基をすべて含んでいるので、こ
のサイクルは、短くなったポリマー上で、所望の部分が
分解するか又は試料が分解反応の活性化エネルギーより
低く置かれるまで反復する。
【0022】この発明は、ポリマーを順次的に分解する
ための方法を含んでいるが、それは又、ポリマーを配列
決定する方法をも提供する。この発明の方法を用いてポ
リマー試料を部分的に分解し、それにより、ポリマー断
片のネストしたセットを生成することが出来る。このポ
リマー断片のネストしたセットを、次いで、分析にかけ
る。一般に、分析は、質量分光法により得られる質量分
析からなる。好ましくは、質量分析は、マトリックス援
助されたレーザー脱着飛行時間(maLD-TOF)質量分光法
による。遊離して各々の順次的に分解されたポリマー断
片を生成する末端反復単位を、次いで、ポリマー断片間
の質量差の比較によって同定する。このデータの分析に
よって、このポリマーの配列が決定される。
ための方法を含んでいるが、それは又、ポリマーを配列
決定する方法をも提供する。この発明の方法を用いてポ
リマー試料を部分的に分解し、それにより、ポリマー断
片のネストしたセットを生成することが出来る。このポ
リマー断片のネストしたセットを、次いで、分析にかけ
る。一般に、分析は、質量分光法により得られる質量分
析からなる。好ましくは、質量分析は、マトリックス援
助されたレーザー脱着飛行時間(maLD-TOF)質量分光法
による。遊離して各々の順次的に分解されたポリマー断
片を生成する末端反復単位を、次いで、ポリマー断片間
の質量差の比較によって同定する。このデータの分析に
よって、このポリマーの配列が決定される。
【0023】ペプチド核酸(PNA)、ポリアミド、ポ
リエステル及びポリチオエステルを順次的に分解するこ
とはこの発明の1つの目的である。PNA、ポリアミ
ド、ポリエステル及びポリチオエステルの配列を決定す
ることはこの発明の他の目的である。PNA、ポリアミ
ド、ポリエステル及びポリチオエステルの配列を決定す
るための装置を提供することはこの発明の更なる目的で
ある。
リエステル及びポリチオエステルを順次的に分解するこ
とはこの発明の1つの目的である。PNA、ポリアミ
ド、ポリエステル及びポリチオエステルの配列を決定す
ることはこの発明の他の目的である。PNA、ポリアミ
ド、ポリエステル及びポリチオエステルの配列を決定す
るための装置を提供することはこの発明の更なる目的で
ある。
【0024】
【発明の詳細な解説】出願人は、ある制御された状況下
において、PNA、ポリアミド、ポリエステル及びポリ
チオエステルがそのポリマーの末端反復単位の反復遊離
によって順次的分解を受けることを発見した。これは、
この型の合成ポリマーを分解するための方法が知られて
いなかったことを考えると、驚くべき結果であった。こ
の方法の1つの具体例においては、ポリマー断片のネス
トしたセットが生成し、その質量分析を通してそのポリ
マーを配列決定する。他の具体例において、PNAライ
ブラリーから単離したPNAの配列は、スクリーニング
アッセイ中に関心ある分子に対する結合を示すので、そ
の配列を決定することが出来る。更に他の具体例におい
ては、このポリマーは、ポリマーの分解速度によって決
定される制御された様式で化学薬剤を遊離するバイオエ
ラダブル(bioerrodable)マトリックスを形成すること
が出来る。この化学薬剤は、このポリマーマトリックス
によってトラップされ得るか又はポリマーの分解生成物
である。更なる具体例において、これらのポリマーを、
一度それらの有用性が使い尽くされたならば、この発明
の方法によって部分的に若しくは完全に分解される生物
分解性材料として用いることが出来る。例えば、PN
A、ポリアミド、ポリエステル又はポリチオエステルか
ら製造される用いられる材料は、この発明の方法によっ
て処分のために分解されよう。
において、PNA、ポリアミド、ポリエステル及びポリ
チオエステルがそのポリマーの末端反復単位の反復遊離
によって順次的分解を受けることを発見した。これは、
この型の合成ポリマーを分解するための方法が知られて
いなかったことを考えると、驚くべき結果であった。こ
の方法の1つの具体例においては、ポリマー断片のネス
トしたセットが生成し、その質量分析を通してそのポリ
マーを配列決定する。他の具体例において、PNAライ
ブラリーから単離したPNAの配列は、スクリーニング
アッセイ中に関心ある分子に対する結合を示すので、そ
の配列を決定することが出来る。更に他の具体例におい
ては、このポリマーは、ポリマーの分解速度によって決
定される制御された様式で化学薬剤を遊離するバイオエ
ラダブル(bioerrodable)マトリックスを形成すること
が出来る。この化学薬剤は、このポリマーマトリックス
によってトラップされ得るか又はポリマーの分解生成物
である。更なる具体例において、これらのポリマーを、
一度それらの有用性が使い尽くされたならば、この発明
の方法によって部分的に若しくは完全に分解される生物
分解性材料として用いることが出来る。例えば、PN
A、ポリアミド、ポリエステル又はポリチオエステルか
ら製造される用いられる材料は、この発明の方法によっ
て処分のために分解されよう。
【0025】この発明は、ポリマーの順次的分解のため
の方法である。この発明の方法によって分解するポリマ
ーは、2つの末端反復単位及びp個の主鎖反復単位から
なる(ここに、pは、1〜1,000,000の整数で
ある)。すべての反復単位は、機能的結合によって一緒
に繋がれ、それにより、ポリマー主鎖を形成している。
これらの機能的結合は、アミド、エステル及びチオエス
テルからなる群より選択する。用語「主鎖」、「反復単
位」及び「機能的結合」は、高分子化学の分野における
それらの通常の意味を有する。これらのポリマーは、主
鎖の組成において不均一であってよく、それにより、ア
ミド、エステル及びチオエステル機能的結合の任意の可
能な組合せを含むことが出来る。好適具体例において、
これらのポリマーは、主鎖の組成において均一であり、
ポリアミド、ポリエステル又はポリチオエステルであ
る。最も好適な具体例において、このポリマーはペプチ
ド核酸(PNA)である。
の方法である。この発明の方法によって分解するポリマ
ーは、2つの末端反復単位及びp個の主鎖反復単位から
なる(ここに、pは、1〜1,000,000の整数で
ある)。すべての反復単位は、機能的結合によって一緒
に繋がれ、それにより、ポリマー主鎖を形成している。
これらの機能的結合は、アミド、エステル及びチオエス
テルからなる群より選択する。用語「主鎖」、「反復単
位」及び「機能的結合」は、高分子化学の分野における
それらの通常の意味を有する。これらのポリマーは、主
鎖の組成において不均一であってよく、それにより、ア
ミド、エステル及びチオエステル機能的結合の任意の可
能な組合せを含むことが出来る。好適具体例において、
これらのポリマーは、主鎖の組成において均一であり、
ポリアミド、ポリエステル又はポリチオエステルであ
る。最も好適な具体例において、このポリマーはペプチ
ド核酸(PNA)である。
【0026】これらの末端反復単位は、同一であるか又
は異なっており、少なくとも1つの末端反復単位は、末
端求核試薬及びその求核試薬から少なくとも4原子離れ
た主鎖カルボニル炭素を含む。この末端求核試薬は、ア
ミノ、ヒドロキシル又はチオール基である。p個の主鎖
反復単位があり、PNA中でこれらすべては6原子の長
さである。すべての反復単位は、1つの末端にヘテロ原
子又はアルキル化ヘテロ原子を有し、他端にカルボニル
炭素を有する。好適反復単位は、2−アミノエチルグリ
シン、2−ヒドロキシエチルグリシン及び2−チオエチ
ルグリシンである。これらの反復単位は、適宜、結合さ
れた側鎖を有して良い。側鎖は、式−A−Lで表される
(ここに、A及びLは以下に定義するものである)。
「側鎖」は、高分子化学の分野において普通に解釈され
ているように用いる。
は異なっており、少なくとも1つの末端反復単位は、末
端求核試薬及びその求核試薬から少なくとも4原子離れ
た主鎖カルボニル炭素を含む。この末端求核試薬は、ア
ミノ、ヒドロキシル又はチオール基である。p個の主鎖
反復単位があり、PNA中でこれらすべては6原子の長
さである。すべての反復単位は、1つの末端にヘテロ原
子又はアルキル化ヘテロ原子を有し、他端にカルボニル
炭素を有する。好適反復単位は、2−アミノエチルグリ
シン、2−ヒドロキシエチルグリシン及び2−チオエチ
ルグリシンである。これらの反復単位は、適宜、結合さ
れた側鎖を有して良い。側鎖は、式−A−Lで表される
(ここに、A及びLは以下に定義するものである)。
「側鎖」は、高分子化学の分野において普通に解釈され
ているように用いる。
【0027】この発明の方法によって分解されるポリマ
ーは、下記の一般式のPNA、ポリアミド、ポリエステ
ル及びポリチオエステルである:
ーは、下記の一般式のPNA、ポリアミド、ポリエステ
ル及びポリチオエステルである:
【化7】 末端求核試薬はVで表されており、Vは、独立に、O
H、SH、NH2 及びNHRからなる群より選択する。
原子又は基Wは、同一であるか又は異なっており、H、
R、OR、SR、NHR、NR2 、F、Cl、Br及び
Iからなる群より選択する。ヘテロ原子又はアルキル化
ヘテロ原子はYで表されており、各Y1 〜Yq-1 は同一
であるか又は異なっており、O、S、NH及びNRから
なる群より独立に選択する。末端原子又は基はZで表さ
れており、各Zは独立に、H、OH、OR、NH2 、N
HR、NR2 、SH、SR、20種類の天然アミノ酸の
内の任意のアミノ酸、ポリペプチド、蛋白質、DNAオ
リゴマー、RNAオリゴマー、ビオチン及びフルオレセ
インからなる群より選択する。アミノ酸は、アミド又は
遊離の酸として存在して良く、a−アミノ基を介してポ
リマーに結合しており、それにより、ポリマーに対する
アミド結合を形成している。同様に、ポリペプチド及び
蛋白質が、a−アミノ基末端を介してこれらのポリマー
に結合され、それによりアミド結合を形成する。DNA
オリゴマーは、それらの5’又は3’ヒドロキシル基に
よりこれらのポリマーに結合され得るが、それにより、
エステル結合を形成する。RNAオリゴマーは、それら
の5’、3’又は2’ヒドロキシル基によりこのポリマ
ーに結合され得るが、それにより、エステル結合を形成
する。或は、末端5’、3’又は2’アミノ基を有する
DNA又はRNAオリゴマーは、該アミノ基によりポリ
マーに結合することが出来、それにより、アミド結合を
形成する。各Rは、1〜6炭素原子を有し適宜ヘテロ原
子を含むアルキル基又は置換された若しくは置換されて
いないアリール基を表す。1つの具体例において、Rは
グリカン、炭水化物又は糖部分であって良い。結合基A
は、リガンドLを各主鎖反復単位に結合する。各A1 〜
Aq は、単結合、下記式の基;
H、SH、NH2 及びNHRからなる群より選択する。
原子又は基Wは、同一であるか又は異なっており、H、
R、OR、SR、NHR、NR2 、F、Cl、Br及び
Iからなる群より選択する。ヘテロ原子又はアルキル化
ヘテロ原子はYで表されており、各Y1 〜Yq-1 は同一
であるか又は異なっており、O、S、NH及びNRから
なる群より独立に選択する。末端原子又は基はZで表さ
れており、各Zは独立に、H、OH、OR、NH2 、N
HR、NR2 、SH、SR、20種類の天然アミノ酸の
内の任意のアミノ酸、ポリペプチド、蛋白質、DNAオ
リゴマー、RNAオリゴマー、ビオチン及びフルオレセ
インからなる群より選択する。アミノ酸は、アミド又は
遊離の酸として存在して良く、a−アミノ基を介してポ
リマーに結合しており、それにより、ポリマーに対する
アミド結合を形成している。同様に、ポリペプチド及び
蛋白質が、a−アミノ基末端を介してこれらのポリマー
に結合され、それによりアミド結合を形成する。DNA
オリゴマーは、それらの5’又は3’ヒドロキシル基に
よりこれらのポリマーに結合され得るが、それにより、
エステル結合を形成する。RNAオリゴマーは、それら
の5’、3’又は2’ヒドロキシル基によりこのポリマ
ーに結合され得るが、それにより、エステル結合を形成
する。或は、末端5’、3’又は2’アミノ基を有する
DNA又はRNAオリゴマーは、該アミノ基によりポリ
マーに結合することが出来、それにより、アミド結合を
形成する。各Rは、1〜6炭素原子を有し適宜ヘテロ原
子を含むアルキル基又は置換された若しくは置換されて
いないアリール基を表す。1つの具体例において、Rは
グリカン、炭水化物又は糖部分であって良い。結合基A
は、リガンドLを各主鎖反復単位に結合する。各A1 〜
Aq は、単結合、下記式の基;
【化8】 又は下記式の基である;
【化9】 (式中、Wは上で定義してあり、各sは1〜5の整数で
ある)。リガンドはLで表され、各L1 〜Lq は、同一
であるか又は異なり、独立に、W、アデニン、シトシ
ン、グアニン、チミン、ウリジン、5−メチルシトシ
ン、2−アミノプリン、2−アミノ−6−クロロプリ
ン、2,6−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、他の天
然に存在する若しくは天然に存在しないヌクレオ塩基、
置換された及び置換されていない芳香族部分、ビオチン
及びフルオレセインからなる群より選択する。ヌクレオ
塩基は、プリンアナログについては主として9位にて結
合し、ピリミジンアナログについては1位にて結合す
る。Lで表される天然に存在する又は天然に存在しない
ヌクレオ塩基の例は、図2に描かれている。各m及びn
は、整数1又は2である(但し、mはnに等しくな
い)。この具体例において、主鎖反復単位は、分解が6
員環形成により最適化されるので、6原子の長さであ
る。
ある)。リガンドはLで表され、各L1 〜Lq は、同一
であるか又は異なり、独立に、W、アデニン、シトシ
ン、グアニン、チミン、ウリジン、5−メチルシトシ
ン、2−アミノプリン、2−アミノ−6−クロロプリ
ン、2,6−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、他の天
然に存在する若しくは天然に存在しないヌクレオ塩基、
置換された及び置換されていない芳香族部分、ビオチン
及びフルオレセインからなる群より選択する。ヌクレオ
塩基は、プリンアナログについては主として9位にて結
合し、ピリミジンアナログについては1位にて結合す
る。Lで表される天然に存在する又は天然に存在しない
ヌクレオ塩基の例は、図2に描かれている。各m及びn
は、整数1又は2である(但し、mはnに等しくな
い)。この具体例において、主鎖反復単位は、分解が6
員環形成により最適化されるので、6原子の長さであ
る。
【0028】この発明の方法により、このポリマーは、
末端反復単位の反復遊離によって分解する。図1を参照
して、分解は、ポリマーの末端求核試薬(アミノ、ヒド
ロキシル又はチオール官能基)の末端求核試薬から5原
子離れた主鎖カルボニル炭素への分子内攻撃(適当な条
件下)を含む。1つの例は、図1に「攻撃2」として描
かれている(ここに、ポリマーはPNAである)。好適
具体例において、末端求核試薬はアミノ基である。末端
求核試薬と求電子性カルボニル炭素とが4つの原子によ
り分けられているとき、末端反復単位は、同時にポリマ
ーから遊離して安定な6員環を形成し、それにより、更
なる末端反復単位を有する短くなったポリマーを生成す
る。短くなったポリマーはすべての必要な官能基を含ん
でいるので、この過程は、短くなったポリマー上で、そ
れが完全に分解するか又は試料が分解反応の活性化エネ
ルギーより低く置かれるまで続く。他の環サイズ例えば
5員環及び7員環は、動力学的に6員環程望ましくはな
いが、この発明の範囲内に入る。
末端反復単位の反復遊離によって分解する。図1を参照
して、分解は、ポリマーの末端求核試薬(アミノ、ヒド
ロキシル又はチオール官能基)の末端求核試薬から5原
子離れた主鎖カルボニル炭素への分子内攻撃(適当な条
件下)を含む。1つの例は、図1に「攻撃2」として描
かれている(ここに、ポリマーはPNAである)。好適
具体例において、末端求核試薬はアミノ基である。末端
求核試薬と求電子性カルボニル炭素とが4つの原子によ
り分けられているとき、末端反復単位は、同時にポリマ
ーから遊離して安定な6員環を形成し、それにより、更
なる末端反復単位を有する短くなったポリマーを生成す
る。短くなったポリマーはすべての必要な官能基を含ん
でいるので、この過程は、短くなったポリマー上で、そ
れが完全に分解するか又は試料が分解反応の活性化エネ
ルギーより低く置かれるまで続く。他の環サイズ例えば
5員環及び7員環は、動力学的に6員環程望ましくはな
いが、この発明の範囲内に入る。
【0029】攻撃のための求核試薬の活性化は、求核試
薬の性質及び直接的化学的環境の関数である。求核攻撃
に助力する条件は、pHの適合及び/又は高い温度であ
る。1次アミノ基はpH10未満で陽子を得、それ故、
弱い求核試薬である。従って、末端アミノ基について
は、好適条件は、10より大きいpHである。ヒドロキ
シル基及びチオール基は、極めて酸性の条件下でのみ陽
子を得る。従って、分解は、ヒドロキシル及びチオール
末端化ポリマーについては、酸性pHの条件下でさえ予
想される。更に、ラクトン形成は酸性条件下で支援され
るが、エステル及びチオエステルは高いpHで加水分解
される。それ故、ヒドロキシル及びチオール求核試薬に
対する好適pH条件は、pH2〜10である。ヒドロキ
シル末端化ポリマーについての一層好適な条件は、pH
2〜4である。すべてについて、有利なpH条件、温度
を上昇させることは、分解速度を増大させる。末端アミ
ン開始される攻撃についての典型的温度は、20〜80
℃の範囲内である。好適条件は、55℃である。ヒドロ
キシル及びチオール開始される攻撃についての典型的温
度は、20〜60℃の範囲内である。
薬の性質及び直接的化学的環境の関数である。求核攻撃
に助力する条件は、pHの適合及び/又は高い温度であ
る。1次アミノ基はpH10未満で陽子を得、それ故、
弱い求核試薬である。従って、末端アミノ基について
は、好適条件は、10より大きいpHである。ヒドロキ
シル基及びチオール基は、極めて酸性の条件下でのみ陽
子を得る。従って、分解は、ヒドロキシル及びチオール
末端化ポリマーについては、酸性pHの条件下でさえ予
想される。更に、ラクトン形成は酸性条件下で支援され
るが、エステル及びチオエステルは高いpHで加水分解
される。それ故、ヒドロキシル及びチオール求核試薬に
対する好適pH条件は、pH2〜10である。ヒドロキ
シル末端化ポリマーについての一層好適な条件は、pH
2〜4である。すべてについて、有利なpH条件、温度
を上昇させることは、分解速度を増大させる。末端アミ
ン開始される攻撃についての典型的温度は、20〜80
℃の範囲内である。好適条件は、55℃である。ヒドロ
キシル及びチオール開始される攻撃についての典型的温
度は、20〜60℃の範囲内である。
【0030】分解は、末端求核試薬がブロックされる場
合には起こらない。陽子付加は、ブロック事象の一形態
である。ブロックは又、末端求核試薬と安定共有結合を
形成する試薬との反応を介しても起きる。典型的ブロッ
キング基は、アセチル、ベンゾイル、Fmoc、t−b
oc及びトリチル基である。それにもかかわらず、ブロ
ッキング基の除去は、分解のために適当な遊離の末端求
核試薬を再生する。従って、ブロッキング又は選択的保
護は、分解過程を制御し、それにより、末端求核試薬を
脱保護することによって脱保護反応を引き起こすことを
可能にするための手段である。
合には起こらない。陽子付加は、ブロック事象の一形態
である。ブロックは又、末端求核試薬と安定共有結合を
形成する試薬との反応を介しても起きる。典型的ブロッ
キング基は、アセチル、ベンゾイル、Fmoc、t−b
oc及びトリチル基である。それにもかかわらず、ブロ
ッキング基の除去は、分解のために適当な遊離の末端求
核試薬を再生する。従って、ブロッキング又は選択的保
護は、分解過程を制御し、それにより、末端求核試薬を
脱保護することによって脱保護反応を引き起こすことを
可能にするための手段である。
【0031】PNAの末端アミノ基は又、5原子離れた
主鎖カルボニル炭素に加えて、側鎖カルボニル炭素をも
攻撃することが示された。図1には、両方の攻撃事象を
描いてある。側鎖カルボニル炭素への攻撃(「攻撃1」
として記載)は、N−アシルシフトを引き起こす。これ
は共有結合ブロッキング事象であるが、可逆的である。
Christensen, L等、 Optimized Solid-Phase Synthesis
of PNA Oligomers, 第13回アメリカンペプチドシンポ
ジウム、ポスター No.7、6月20〜23日、カナダ国 E
dmonton を参照されたい。従って、分解は、一過的なN
−アシル化にもかかわらずに進行する。それにもかかわ
らず、N−アシル化は、PNAの分解過程を示す競争反
応である。
主鎖カルボニル炭素に加えて、側鎖カルボニル炭素をも
攻撃することが示された。図1には、両方の攻撃事象を
描いてある。側鎖カルボニル炭素への攻撃(「攻撃1」
として記載)は、N−アシルシフトを引き起こす。これ
は共有結合ブロッキング事象であるが、可逆的である。
Christensen, L等、 Optimized Solid-Phase Synthesis
of PNA Oligomers, 第13回アメリカンペプチドシンポ
ジウム、ポスター No.7、6月20〜23日、カナダ国 E
dmonton を参照されたい。従って、分解は、一過的なN
−アシル化にもかかわらずに進行する。それにもかかわ
らず、N−アシル化は、PNAの分解過程を示す競争反
応である。
【0032】この発明の他の具体例において、ポリマー
を配列決定する。この発明の方法により、ポリマーを部
分的に又は完全に分解し、それにより、ネストしたポリ
マー断片のセットを生成する。このネストしたポリマー
断片のセットは、すべてに共通の一端を有し及び各断片
が1つ以上の反復単位だけ短くなったポリマーを表すポ
リマー断片からなる。従って、各ポリマー断片はN−x
反復単位からなる(ここに、Nは親ポリマー内の反復単
位の総数であり、xはポリマーが受けた分解サイクルの
数である)。理想的には、ネストしたセットは、測定可
能な量の親ポリマーを表す断片及び順次的分解により形
成された短くなったポリマー断片の各々を含む。従っ
て、このネストしたセットは、ポリマーの配列を規定す
る。
を配列決定する。この発明の方法により、ポリマーを部
分的に又は完全に分解し、それにより、ネストしたポリ
マー断片のセットを生成する。このネストしたポリマー
断片のセットは、すべてに共通の一端を有し及び各断片
が1つ以上の反復単位だけ短くなったポリマーを表すポ
リマー断片からなる。従って、各ポリマー断片はN−x
反復単位からなる(ここに、Nは親ポリマー内の反復単
位の総数であり、xはポリマーが受けた分解サイクルの
数である)。理想的には、ネストしたセットは、測定可
能な量の親ポリマーを表す断片及び順次的分解により形
成された短くなったポリマー断片の各々を含む。従っ
て、このネストしたセットは、ポリマーの配列を規定す
る。
【0033】このポリマー断片のネストしたセットを、
次いで、分析にかける。1つの具体例において、分析
は、質量分析からなる。質量分析は、迅速原子衝撃質量
分光法(FAB−M/S)、エレクトロスプレーイオン
化質量分析又は他の質量分析法を用いて得ることが出来
る。好適具体例において、質量分析は、マトリックス援
助されたレーザー脱着飛行時間(maLD-TOF)質量分光法
による。
次いで、分析にかける。1つの具体例において、分析
は、質量分析からなる。質量分析は、迅速原子衝撃質量
分光法(FAB−M/S)、エレクトロスプレーイオン
化質量分析又は他の質量分析法を用いて得ることが出来
る。好適具体例において、質量分析は、マトリックス援
助されたレーザー脱着飛行時間(maLD-TOF)質量分光法
による。
【0034】すべての断片間の質量差を計算し、それに
より、順次的に分解した各ポリマーを生成するために消
失した末端反復単位を同定することによって配列を決定
する。詳細には、第1の末端反復単位(残基)の正体
を、親ポリマーとN−1ポリマーとの間の質量差によっ
て決定する。これら2種の質量を、好ましくは、maLD-T
OFによって決定する。この差は、特定の残基の質量と相
関する(例えば、表1に見られる)。第2残基を、前述
と同様のやり方で、N−1及びN−2ポリマー断片の間
の質量差によって同定する。第3残基を、N−2及びN
−3断片の間の相対的質量差によって同定する。分析
を、この方法で、ポリマーの1次構造が解明されるまで
続ける。しかしながら、ポリマーの最後の2残基の配列
は、典型的には、マトリックス及び末端反復単位により
生じたバックグラウンドピークが200〜500AMU
の範囲でマススペクトルを混乱させるので、同定されな
い。この配列の最後の2つのメンバーを評価するため
に、質量補償(off-setting )付加物分子をポリマーに
結合し、それにより、最後の2つのポリマー断片の質量
を、それらがmaLD-TOF質量分析計のバックグラウンドか
ら分離され得るように増加させることが出来る。
より、順次的に分解した各ポリマーを生成するために消
失した末端反復単位を同定することによって配列を決定
する。詳細には、第1の末端反復単位(残基)の正体
を、親ポリマーとN−1ポリマーとの間の質量差によっ
て決定する。これら2種の質量を、好ましくは、maLD-T
OFによって決定する。この差は、特定の残基の質量と相
関する(例えば、表1に見られる)。第2残基を、前述
と同様のやり方で、N−1及びN−2ポリマー断片の間
の質量差によって同定する。第3残基を、N−2及びN
−3断片の間の相対的質量差によって同定する。分析
を、この方法で、ポリマーの1次構造が解明されるまで
続ける。しかしながら、ポリマーの最後の2残基の配列
は、典型的には、マトリックス及び末端反復単位により
生じたバックグラウンドピークが200〜500AMU
の範囲でマススペクトルを混乱させるので、同定されな
い。この配列の最後の2つのメンバーを評価するため
に、質量補償(off-setting )付加物分子をポリマーに
結合し、それにより、最後の2つのポリマー断片の質量
を、それらがmaLD-TOF質量分析計のバックグラウンドか
ら分離され得るように増加させることが出来る。
【表1】
【0035】ポリマーが15より大きい反復単位を有す
る場合は、そのネストしたセットは、測定可能な量の短
い断片が形成される前に親ポリマーが完全に分解され得
るので、親ポリマー及びすべての可能な短い断片の測定
可能な量を含み得ない。この障害は、時間にわたって分
解反応をサンプリングすることによって克服される。第
1の時点における試料を用いて第1の少量の残基の配列
を上述の方法によって生成することが出来る。前に同定
された1つのポリマー断片が存在するならば、次の時点
を用いて続く残基を同定する。特に、前に同定されたポ
リマー断片については配列は既知であり、残りの配列が
前述の方法によってその後解明され得るので、親がもは
や検出可能でなくても配列の曖昧さはない。
る場合は、そのネストしたセットは、測定可能な量の短
い断片が形成される前に親ポリマーが完全に分解され得
るので、親ポリマー及びすべての可能な短い断片の測定
可能な量を含み得ない。この障害は、時間にわたって分
解反応をサンプリングすることによって克服される。第
1の時点における試料を用いて第1の少量の残基の配列
を上述の方法によって生成することが出来る。前に同定
された1つのポリマー断片が存在するならば、次の時点
を用いて続く残基を同定する。特に、前に同定されたポ
リマー断片については配列は既知であり、残りの配列が
前述の方法によってその後解明され得るので、親がもは
や検出可能でなくても配列の曖昧さはない。
【0036】この発明は、ポリマーの分解及び配列分析
を自動的に実施するための装置において具体化し得る。
今や、多くの異なる型の配列決定用装置が市販されてい
る。1つは、Millipore Model 6625 ProSequencer (商
標)(マサチューセッツ州、Bedford 在、Millipore Co
rporation )であり、これは、エドマン化学を利用する
蛋白質又はペプチドの気相配列決定装置である(199
2年6月6日に出願された米国特許出願第07/89
3,689号を参照されたい)。この出願を本明細書中
に参考として援用する。他の配列決定装置は、米国特許
第4065412号(Dreyer)、4603114号(Ho
od)及び4704256号(カリフォルニア州、Foster
City 在、Applied Biosystems, Inc.)に記載されてお
り、これらのすべてを参考として本明細書中に援用す
る。
を自動的に実施するための装置において具体化し得る。
今や、多くの異なる型の配列決定用装置が市販されてい
る。1つは、Millipore Model 6625 ProSequencer (商
標)(マサチューセッツ州、Bedford 在、Millipore Co
rporation )であり、これは、エドマン化学を利用する
蛋白質又はペプチドの気相配列決定装置である(199
2年6月6日に出願された米国特許出願第07/89
3,689号を参照されたい)。この出願を本明細書中
に参考として援用する。他の配列決定装置は、米国特許
第4065412号(Dreyer)、4603114号(Ho
od)及び4704256号(カリフォルニア州、Foster
City 在、Applied Biosystems, Inc.)に記載されてお
り、これらのすべてを参考として本明細書中に援用す
る。
【0037】図5は、本発明の配列決定装置の1つの可
能な具体例の概略図である。反応チャンバー10は、概
略図の中央に位置している。概略図の左からスタートし
て、塩基性蒸気及び酸性蒸気が輸送ライン20及びバル
ブ22を介して反応チャンバー10中に導入され得るよ
うに、塩基性蒸気14及び酸性蒸気18が接続されてい
る。典型的塩基性蒸気は、メチルアミン、ジメチルアミ
ン及びトリメチルアミンを含む。典型的酸性蒸気は、塩
化水素、酢酸及びハロ酢酸例えばトリフルオロ酢酸を含
む。選択される特定の蒸気は、試料をさらすべき所望の
pHに依存する。通常、一度に1種類の蒸気だけを導入
してポリマー試料のpHを制御する。
能な具体例の概略図である。反応チャンバー10は、概
略図の中央に位置している。概略図の左からスタートし
て、塩基性蒸気及び酸性蒸気が輸送ライン20及びバル
ブ22を介して反応チャンバー10中に導入され得るよ
うに、塩基性蒸気14及び酸性蒸気18が接続されてい
る。典型的塩基性蒸気は、メチルアミン、ジメチルアミ
ン及びトリメチルアミンを含む。典型的酸性蒸気は、塩
化水素、酢酸及びハロ酢酸例えばトリフルオロ酢酸を含
む。選択される特定の蒸気は、試料をさらすべき所望の
pHに依存する。通常、一度に1種類の蒸気だけを導入
してポリマー試料のpHを制御する。
【0038】求核性の攻撃の開始は、温度制御した反応
チャンバー10内の試料支持体12上に位置させた試料
に接触するこれらのガスのpHによって、部分的に制御
される。この支持体は、酸及び塩基耐性の任意の材料で
作ることが出来る。例えば、ガラス繊維ディスク又はP
TFE(ポリテトラフルオロエチレン)若しくはポリエ
チレン製の膜が適当である。PVDF膜も又、ある程度
まで酸及び塩基に安定である。かかる膜は、マサチュー
セッツ州、Bedford 在、Millipore Corporation から市
販されている。
チャンバー10内の試料支持体12上に位置させた試料
に接触するこれらのガスのpHによって、部分的に制御
される。この支持体は、酸及び塩基耐性の任意の材料で
作ることが出来る。例えば、ガラス繊維ディスク又はP
TFE(ポリテトラフルオロエチレン)若しくはポリエ
チレン製の膜が適当である。PVDF膜も又、ある程度
まで酸及び塩基に安定である。かかる膜は、マサチュー
セッツ州、Bedford 在、Millipore Corporation から市
販されている。
【0039】温度は、環化及び環状末端反復単位の除去
を開始するために操作し得る他の条件である。反応チャ
ンバー10は、従来法における加熱要素若しくはジャケ
ットを備えている。熱電対を用いて温度をモニターして
制御することが出来る。或は、コンピューターによって
デジタル式に温度制御をモニターし且つ制御することが
出来る。配列決定反応の速度を制御するために温度及び
pHを変えることが出来る。
を開始するために操作し得る他の条件である。反応チャ
ンバー10は、従来法における加熱要素若しくはジャケ
ットを備えている。熱電対を用いて温度をモニターして
制御することが出来る。或は、コンピューターによって
デジタル式に温度制御をモニターし且つ制御することが
出来る。配列決定反応の速度を制御するために温度及び
pHを変えることが出来る。
【0040】ポリマー断片のネストしたセットを適当な
条件下で作成する。トランスファー緩衝液16をライン
20及びバルブ22を通して導入して試料に接触させる
ことが出来る。典型的には、オペレーターにより決定さ
れたようにポリマーを分解するのに十分な時間の後に、
トランスファー緩衝液を導入して分析用システムを通し
て反応生成物を洗浄する。緩衝液16はライン20及び
バルブ22を通って反応チャンバー10へ流れ、分解し
たポリマー試料を支持体12から洗い出してライン20
へ入る。バルブ24を開いてこの緩衝液を通し、反応生
成物を試料ホルダー28へ通す。この工程の間、通気孔
26は閉じているが、これを開けば反応ガスを系外へ出
すことが出来る。試料ホルダー28は、典型的には、質
量分析計maLD-TOF30の高真空大気中への導入に適した
ステンレス鋼又は類似の材料から作られる。試料は、ma
LD-TOFへの導入の前に、窒素、アルゴン又はヘリウム等
の不活性ガスを用いて乾燥させることが出来る。
条件下で作成する。トランスファー緩衝液16をライン
20及びバルブ22を通して導入して試料に接触させる
ことが出来る。典型的には、オペレーターにより決定さ
れたようにポリマーを分解するのに十分な時間の後に、
トランスファー緩衝液を導入して分析用システムを通し
て反応生成物を洗浄する。緩衝液16はライン20及び
バルブ22を通って反応チャンバー10へ流れ、分解し
たポリマー試料を支持体12から洗い出してライン20
へ入る。バルブ24を開いてこの緩衝液を通し、反応生
成物を試料ホルダー28へ通す。この工程の間、通気孔
26は閉じているが、これを開けば反応ガスを系外へ出
すことが出来る。試料ホルダー28は、典型的には、質
量分析計maLD-TOF30の高真空大気中への導入に適した
ステンレス鋼又は類似の材料から作られる。試料は、ma
LD-TOFへの導入の前に、窒素、アルゴン又はヘリウム等
の不活性ガスを用いて乾燥させることが出来る。
【0041】このトランスファー緩衝液は、マトリック
ス援助されたレーザー脱着に必要な成分を含んでいる。
典型的に、及び実施例1に詳述するように、これは、シ
ナピン酸及びインシュリンを水/アセトニトリル緩衝液
中に含んでいる。反応生成物は、トランスファー緩衝液
中に希釈したときに、液体緩衝液を蒸発させることによ
り濃縮すべきであり、それにより、分析物の反応生成物
が中に存在する結晶シナピン酸の薄いフィルムを生じ
る。レーザー脱着は、実施例1に記載したような条件下
で起きる。
ス援助されたレーザー脱着に必要な成分を含んでいる。
典型的に、及び実施例1に詳述するように、これは、シ
ナピン酸及びインシュリンを水/アセトニトリル緩衝液
中に含んでいる。反応生成物は、トランスファー緩衝液
中に希釈したときに、液体緩衝液を蒸発させることによ
り濃縮すべきであり、それにより、分析物の反応生成物
が中に存在する結晶シナピン酸の薄いフィルムを生じ
る。レーザー脱着は、実施例1に記載したような条件下
で起きる。
【0042】或は、エレクトロスプレーイオン化MSを
用いてネストしたセットを分析することが出来る。この
場合、試料ホルダー28を四重極質量分析計に直接結合
するエレクトロスプレーインターフェースで置き換え
る。この技術は、米国特許第4,209,696号(Fi
te)に一層詳細に説明されており、本明細書中に参考と
して援用する。
用いてネストしたセットを分析することが出来る。この
場合、試料ホルダー28を四重極質量分析計に直接結合
するエレクトロスプレーインターフェースで置き換え
る。この技術は、米国特許第4,209,696号(Fi
te)に一層詳細に説明されており、本明細書中に参考と
して援用する。
【0043】今やこの発明を一般的に説明したので、同
様のものは、ある特定の例を参照することにより、一層
良く理解されるであろうが、それらは、説明のためにの
みここに含まれるのであって特定のものに限定すること
を意図するものではない。ここで引用するすべての特許
を参考として援用する。
様のものは、ある特定の例を参照することにより、一層
良く理解されるであろうが、それらは、説明のためにの
みここに含まれるのであって特定のものに限定すること
を意図するものではない。ここで引用するすべての特許
を参考として援用する。
【0044】
【実施例】実施例1 配列TTTTCCTCTC−リジンアミドを有する1ミリグラムの
精製PNA(デンマークのコペンハーゲン大学のMichae
l Egholm提供)を300μlの0.1%トリフルオロ酢
酸(TFA)水溶液に溶解させた。2.5μlのアリコ
ートを取り出し、溶媒を減圧下で蒸発させて除去した。
この乾燥試料に、95%アセトニトリル水溶液に溶解さ
せた10mg/mlの3,5−ジメトキシ−4−ヒドロ
キシ−桂皮酸(Aldrich Chemical, P/N D13,460-0;以
後、シナピン酸という)を含む10μlの溶液及び0.
1%TFA水溶液中のウシ膵臓からのインシュリン(Si
gmaChemical, P/N I-5500; 以後、インシュリンとい
う)の1mg/μl溶液2.0μlを加えた。この試料
を混合して1μlをmaLD-TOF質量分析計の試料ホルダー
に加えた。使用したmaLD-TOF質量分析計は、直線状の5
0cmの飛行チューブ、窒素レーザー(337nm)及
び2重チャンネル検出器を有する原型機であった。関心
あるイオンを30kVのポテンシャルにかけた。試料の
質量分析を得、且つ既知の質量のシナピン酸及びインシ
ュリンを内部標準として用いて分光計を較正した。この
試料は分解条件にかけなかったので、親ポリマー([M
+H]=2748)のみが観察された。
精製PNA(デンマークのコペンハーゲン大学のMichae
l Egholm提供)を300μlの0.1%トリフルオロ酢
酸(TFA)水溶液に溶解させた。2.5μlのアリコ
ートを取り出し、溶媒を減圧下で蒸発させて除去した。
この乾燥試料に、95%アセトニトリル水溶液に溶解さ
せた10mg/mlの3,5−ジメトキシ−4−ヒドロ
キシ−桂皮酸(Aldrich Chemical, P/N D13,460-0;以
後、シナピン酸という)を含む10μlの溶液及び0.
1%TFA水溶液中のウシ膵臓からのインシュリン(Si
gmaChemical, P/N I-5500; 以後、インシュリンとい
う)の1mg/μl溶液2.0μlを加えた。この試料
を混合して1μlをmaLD-TOF質量分析計の試料ホルダー
に加えた。使用したmaLD-TOF質量分析計は、直線状の5
0cmの飛行チューブ、窒素レーザー(337nm)及
び2重チャンネル検出器を有する原型機であった。関心
あるイオンを30kVのポテンシャルにかけた。試料の
質量分析を得、且つ既知の質量のシナピン酸及びインシ
ュリンを内部標準として用いて分光計を較正した。この
試料は分解条件にかけなかったので、親ポリマー([M
+H]=2748)のみが観察された。
【0045】実施例2 配列TTTTCCTCTC−リジンアミドを有する1ミリグラムの
精製PNAを300μlの33%アンモニア水(pH1
2.5)に溶解させ、その試料を55℃で100時間イ
ンキュベートした。2.5μlのアリコートを取り出
し、溶媒を減圧下で蒸発させて除去した。この乾燥試料
に、95%アセトニトリル水溶液に溶解させた10mg
/mlのシナピン酸を含む10μlの溶液を加えた。こ
の試料を混合して1μlをmaLD-TOF質量分析計の試料ホ
ルダーに加えた。実施例1のmaLD-TOFを用いて試料の質
量分析を得、且つ既知の質量のシナピン酸及び親イオン
を用いて分光計を較正した。
精製PNAを300μlの33%アンモニア水(pH1
2.5)に溶解させ、その試料を55℃で100時間イ
ンキュベートした。2.5μlのアリコートを取り出
し、溶媒を減圧下で蒸発させて除去した。この乾燥試料
に、95%アセトニトリル水溶液に溶解させた10mg
/mlのシナピン酸を含む10μlの溶液を加えた。こ
の試料を混合して1μlをmaLD-TOF質量分析計の試料ホ
ルダーに加えた。実施例1のmaLD-TOFを用いて試料の質
量分析を得、且つ既知の質量のシナピン酸及び親イオン
を用いて分光計を較正した。
【0046】100時間の分解の後にTTTTCCTCTC−リジ
ンアミドの質量分析から得られたスペクトルを図3に与
える。表1には、各型のPNA末端反復単位についての
公知の質量を列挙してある。表2に、図3に描いたスペ
クトル中に認められた断片の質量を列挙する。
ンアミドの質量分析から得られたスペクトルを図3に与
える。表1には、各型のPNA末端反復単位についての
公知の質量を列挙してある。表2に、図3に描いたスペ
クトル中に認められた断片の質量を列挙する。
【表2】 N=ポリマー中の末端反復単位の数
【0047】予想されるように、精製した親ポリマーは
2747の質量([M+H]=2748;図3及び表2
を参照されたい)を有している。1分解サイクルを受
け、それにより1末端反復単位を遊離したN−1ポリマ
ーは2481の質量を有する。親とN−1ポリマーとの
間の質量差は267である。表1が示すように、カルボ
キシメチルチミン(T)側鎖を有する末端反復単位は、
最も近い公知質量を有している。この質量分析計はこの
質量範囲内に±1原子質量単位(AMU)の誤差限界を
有するので、この残基の割り当てには曖昧さがない。同
様に、N−2ポリマーは2215の質量を有する。従っ
て、N−1とN−2ポリマーとの間の質量差は266で
ある。従って、第2の残基も又、カルボキシメチルチミ
ン(T)側鎖を含む。表2が描くように、この分析を、
配列が解明されるまで続けることが出来る。
2747の質量([M+H]=2748;図3及び表2
を参照されたい)を有している。1分解サイクルを受
け、それにより1末端反復単位を遊離したN−1ポリマ
ーは2481の質量を有する。親とN−1ポリマーとの
間の質量差は267である。表1が示すように、カルボ
キシメチルチミン(T)側鎖を有する末端反復単位は、
最も近い公知質量を有している。この質量分析計はこの
質量範囲内に±1原子質量単位(AMU)の誤差限界を
有するので、この残基の割り当てには曖昧さがない。同
様に、N−2ポリマーは2215の質量を有する。従っ
て、N−1とN−2ポリマーとの間の質量差は266で
ある。従って、第2の残基も又、カルボキシメチルチミ
ン(T)側鎖を含む。表2が描くように、この分析を、
配列が解明されるまで続けることが出来る。
【0048】実施例3 配列TGACTTT −グリシンアミド(マサチューセッツ州、B
edford, Ashby Road 80 在、 Millipore Corporation か
ら購入したPNAモノマー;A-モノマーP/N GEN063011
、シトシンモノマーP/N GEN063013 、グアニンP/N GEN
063012 及びチミンモノマーP/N GEN063010 を用いてこ
のポリマーを組み立てた。合成プロトコールは、Christ
ensen, L. 等、 Optimized Solid-Phase Synthesis of P
NA Oligomers, 第13回アメリカンペプチドシンポジウ
ム、ポスター、No.7, 1993年6月20〜23日、カナダ国、
Edmontonに記載された最適条件に従った。)を有する精
製PNAの1mgの試料を、100μlの33%アンモ
ニア水(pH12.5)に溶解させ、その試料を55℃
で全部で48時間インキュベートした。2.5μlのア
リコートを取り出し、溶媒を減圧下で蒸留して除去し
た。この乾燥試料に、95%アセトニトリル水溶液に溶
解させた10mg/mlのシナピン酸を含む10μlの
溶液及び0.1%TFA水溶液中のインシュリンの1m
g/ml溶液2.0μlを加えた。この試料を混合して
1μlを前述のように操作したmaLD-TOF質量分析計の試
料ホルダーに加えた。試料の質量分析を得、且つ既知の
質量のシナピン酸及びインシュリンを用いて分光計を較
正した。48時間の分析の後にTGACTTT −グリシンアミ
ドの質量分析から得られたスペクトルを図4に与える。
表3に、図4に描かれたスペクトル中に認められた断片
の質量を列挙する。
edford, Ashby Road 80 在、 Millipore Corporation か
ら購入したPNAモノマー;A-モノマーP/N GEN063011
、シトシンモノマーP/N GEN063013 、グアニンP/N GEN
063012 及びチミンモノマーP/N GEN063010 を用いてこ
のポリマーを組み立てた。合成プロトコールは、Christ
ensen, L. 等、 Optimized Solid-Phase Synthesis of P
NA Oligomers, 第13回アメリカンペプチドシンポジウ
ム、ポスター、No.7, 1993年6月20〜23日、カナダ国、
Edmontonに記載された最適条件に従った。)を有する精
製PNAの1mgの試料を、100μlの33%アンモ
ニア水(pH12.5)に溶解させ、その試料を55℃
で全部で48時間インキュベートした。2.5μlのア
リコートを取り出し、溶媒を減圧下で蒸留して除去し
た。この乾燥試料に、95%アセトニトリル水溶液に溶
解させた10mg/mlのシナピン酸を含む10μlの
溶液及び0.1%TFA水溶液中のインシュリンの1m
g/ml溶液2.0μlを加えた。この試料を混合して
1μlを前述のように操作したmaLD-TOF質量分析計の試
料ホルダーに加えた。試料の質量分析を得、且つ既知の
質量のシナピン酸及びインシュリンを用いて分光計を較
正した。48時間の分析の後にTGACTTT −グリシンアミ
ドの質量分析から得られたスペクトルを図4に与える。
表3に、図4に描かれたスペクトル中に認められた断片
の質量を列挙する。
【表3】 N=ポリマー中の末端反復単位の数
【0049】予想されるように、親ポリマーは、195
8の予想質量([M+H]=1959)を有した。1分
解サイクルを受け、それにより1末端反復単位を遊離し
たN−1ポリマーは1692の質量を有した。親とN−
1ポリマーとの間の相対的質量の差は267であった。
表1が示すように、カルボキシメチルチミン(T)側鎖
を有する末端反復単位は、正確な質量を有した。同様
に、N−2ポリマーは1401の質量を有した。従っ
て、N−1とN−2ポリマーとの間の質量差は291で
あった。従って、第2の残基はカルボキシメチルグアニ
ン(G)側鎖を含んだ。表3が描くように、この分析を
続けると、第3残基はカルボキシメチルアデニン(A)
を含み、第4残基はカルボキシメチルシトシン(C)を
含み、第5残基はカルボキシメチルチミン(T)側鎖を
含んだ。こうして、この実験は、特許請求の範囲に記載
した分解及び配列決定の機構が、PNA中に見出される
4種の末端反復単位のすべてについて有効であることを
示した。
8の予想質量([M+H]=1959)を有した。1分
解サイクルを受け、それにより1末端反復単位を遊離し
たN−1ポリマーは1692の質量を有した。親とN−
1ポリマーとの間の相対的質量の差は267であった。
表1が示すように、カルボキシメチルチミン(T)側鎖
を有する末端反復単位は、正確な質量を有した。同様
に、N−2ポリマーは1401の質量を有した。従っ
て、N−1とN−2ポリマーとの間の質量差は291で
あった。従って、第2の残基はカルボキシメチルグアニ
ン(G)側鎖を含んだ。表3が描くように、この分析を
続けると、第3残基はカルボキシメチルアデニン(A)
を含み、第4残基はカルボキシメチルシトシン(C)を
含み、第5残基はカルボキシメチルチミン(T)側鎖を
含んだ。こうして、この実験は、特許請求の範囲に記載
した分解及び配列決定の機構が、PNA中に見出される
4種の末端反復単位のすべてについて有効であることを
示した。
【0050】実施例4配列TGACTTT −lys−lys−
lys−リジンアミド(ここに、lysはアミノ酸リジ
ンであり、ペプチド及び次いでPNA合成化学を用いて
ポリマーを組み立てる)を有する精製PNAの1mgの
試料を100μlの33%アンモニア水(pH12.
5)中に溶解させ、その試料を55℃で全部で48時間
インキュベートする。2.5μlのアリコートを取り出
し、溶媒を減圧下で蒸留して除去する。この乾燥試料
に、95%アセトニトリル水溶液中に溶解させた10m
g/mlのシナピン酸を含む10μlの溶液及び0.1
%TFA水溶液中のインシュリンの1mg/ml溶液
2.0μlを加える。この試料を混合して1μlを前述
のように操作したmaLD-TOF質量分析計の試料ホルダーに
加える。実施例1のmaLD-TOFを用いて、試料の質量分析
を得、且つシナピン酸及びインシュリンの既知の質量を
用いて分光計を較正する。表4に、ポリマーの分解によ
り生成した断片のネストしたセットの質量スペクトル中
に予想された断片の質量を列挙する。
lys−リジンアミド(ここに、lysはアミノ酸リジ
ンであり、ペプチド及び次いでPNA合成化学を用いて
ポリマーを組み立てる)を有する精製PNAの1mgの
試料を100μlの33%アンモニア水(pH12.
5)中に溶解させ、その試料を55℃で全部で48時間
インキュベートする。2.5μlのアリコートを取り出
し、溶媒を減圧下で蒸留して除去する。この乾燥試料
に、95%アセトニトリル水溶液中に溶解させた10m
g/mlのシナピン酸を含む10μlの溶液及び0.1
%TFA水溶液中のインシュリンの1mg/ml溶液
2.0μlを加える。この試料を混合して1μlを前述
のように操作したmaLD-TOF質量分析計の試料ホルダーに
加える。実施例1のmaLD-TOFを用いて、試料の質量分析
を得、且つシナピン酸及びインシュリンの既知の質量を
用いて分光計を較正する。表4に、ポリマーの分解によ
り生成した断片のネストしたセットの質量スペクトル中
に予想された断片の質量を列挙する。
【表4】 N=ポリマー中の末端反復単位の数
【0051】親ポリマーは予想される質量2412
([M+H]=2413)を有している。1分解サイク
ルを受け、それにより1末端反復単位を遊離したN−1
ポリマーは質量2146を有する。親とN−1ポリマー
との間の質量差は266である。表1に示すように、カ
ルボキシメチルチミン(T)側鎖を有する末端反復単位
は正確な質量を有している。同様に、N−2ポリマーは
1855の質量を有する。従って、N−1とN−2ポリ
マーとの質量差は291である。従って、第2の残基は
カルボキシメチルグアニン(G)側鎖を含む。この分析
を続けると、第3残基はカルボキシメチルアデニン
(A)を含み、第4残基はカルボキシメチルシトシン
(C)を含み、第5残基はカルボキシメチルチミン
(T)側鎖を含み、第6残基はカルボキシメチルチミン
(T)側鎖を含み、第7残基はカルボキシメチルチミン
(T)側鎖を含む。こうして、質量補償付加物をこのポ
リマーに結合するならば、ポリマーのすべての残基を同
定することが出来る。
([M+H]=2413)を有している。1分解サイク
ルを受け、それにより1末端反復単位を遊離したN−1
ポリマーは質量2146を有する。親とN−1ポリマー
との間の質量差は266である。表1に示すように、カ
ルボキシメチルチミン(T)側鎖を有する末端反復単位
は正確な質量を有している。同様に、N−2ポリマーは
1855の質量を有する。従って、N−1とN−2ポリ
マーとの質量差は291である。従って、第2の残基は
カルボキシメチルグアニン(G)側鎖を含む。この分析
を続けると、第3残基はカルボキシメチルアデニン
(A)を含み、第4残基はカルボキシメチルシトシン
(C)を含み、第5残基はカルボキシメチルチミン
(T)側鎖を含み、第6残基はカルボキシメチルチミン
(T)側鎖を含み、第7残基はカルボキシメチルチミン
(T)側鎖を含む。こうして、質量補償付加物をこのポ
リマーに結合するならば、ポリマーのすべての残基を同
定することが出来る。
【0052】実施例5 配列TGACTTT を有する精製ポリエステルの1mgの試料
を100μlの0.1M水性トリフルオロ酢酸アンモニ
ウム緩衝液(pH2.0)に溶解させ、その試料を55
℃で全部で50時間インキュベートする。2.5μlの
アリコートを取り出し、溶媒を減圧下で蒸発させて除去
する。この乾燥試料に、95%アセトニトリル水溶液中
に溶解させた10mg/mlのシナピン酸を含む10μ
lの溶液及び0.1%TFA水溶液中のインシュリンの
1mg/ml溶液2.0μlを加える。この試料を混合
して1μlをmaLD-TOF質量分光計の試料ホルダーに加え
る。実施例1のmaLD-TOFを用いて、試料の質量分析を
得、且つシナピン酸及びインシュリンの既知の質量を用
いて分光計を較正する。50時間の分解の後に、ポリエ
ステルTGACTTT の質量スペクトルを得る。表1に、ポリ
エステルの分解により形成される末端反復単位について
の公知の質量を列挙してある。
を100μlの0.1M水性トリフルオロ酢酸アンモニ
ウム緩衝液(pH2.0)に溶解させ、その試料を55
℃で全部で50時間インキュベートする。2.5μlの
アリコートを取り出し、溶媒を減圧下で蒸発させて除去
する。この乾燥試料に、95%アセトニトリル水溶液中
に溶解させた10mg/mlのシナピン酸を含む10μ
lの溶液及び0.1%TFA水溶液中のインシュリンの
1mg/ml溶液2.0μlを加える。この試料を混合
して1μlをmaLD-TOF質量分光計の試料ホルダーに加え
る。実施例1のmaLD-TOFを用いて、試料の質量分析を
得、且つシナピン酸及びインシュリンの既知の質量を用
いて分光計を較正する。50時間の分解の後に、ポリエ
ステルTGACTTT の質量スペクトルを得る。表1に、ポリ
エステルの分解により形成される末端反復単位について
の公知の質量を列挙してある。
【0053】親ポリマーは予想される質量1908
([M+H]=1909)を有している。1分解サイク
ルを受け、それにより1末端反復単位を遊離したN−1
ポリマーは1642の質量を有する。親とN−1ポリマ
ーとの質量差は267である。表1に示すように、カル
ボキシメチルチミン(T)側鎖を有する末端反復単位
は、正確な質量を有する。同様に、N−2ポリマーは1
350の質量を有する。従って、N−1とN−2ポリマ
ーとの間の質量差は292である。従って、第2の残基
は、カルボキシメチルグアニン(G)側鎖を含む。同様
の分析を続けると、第3残基はカルボキシメチルアデニ
ン(A)側鎖を含み、第4残基はカルボキシメチルシト
シン(C)側鎖を含み、第5残基は再びカルボキシメチ
ルチミン(T)側鎖を含む。
([M+H]=1909)を有している。1分解サイク
ルを受け、それにより1末端反復単位を遊離したN−1
ポリマーは1642の質量を有する。親とN−1ポリマ
ーとの質量差は267である。表1に示すように、カル
ボキシメチルチミン(T)側鎖を有する末端反復単位
は、正確な質量を有する。同様に、N−2ポリマーは1
350の質量を有する。従って、N−1とN−2ポリマ
ーとの間の質量差は292である。従って、第2の残基
は、カルボキシメチルグアニン(G)側鎖を含む。同様
の分析を続けると、第3残基はカルボキシメチルアデニ
ン(A)側鎖を含み、第4残基はカルボキシメチルシト
シン(C)側鎖を含み、第5残基は再びカルボキシメチ
ルチミン(T)側鎖を含む。
【0054】実施例6 配列TGACTTT を有する精製ポリチオエステルの1mgを
100μlの0.1M水性トリフルオロ酢酸アンモニウ
ム緩衝液(pH2.0)に溶解させ、その試料を55℃
で全部で25時間インキュベートする。2.5μlのア
リコートを取り出し、溶媒を減圧下で蒸留して除去す
る。この乾燥試料に、95%アセトニトリル水溶液中に
溶解させた10mg/mlのシナピン酸を含む10μl
の溶液及び0.1%TFA水溶液中のインシュリンの1
mg/ml溶液2.0μlを加える。この試料を混合し
て1μlをmaLD-TOF質量分光計の試料ホルダーに加え
る。実施例1のmaLD-TOFを用いて試料の質量分析を得、
シナピン酸及びインシュリンの既知の質量を用いて分光
計を較正する。25時間の分解の後に、ポリチオエステ
ルTGACTTT の質量スペクトルが得られる。表1には、ポ
リチオエステルの分解により形成される末端反復単位に
ついての公知の質量を列挙してある。
100μlの0.1M水性トリフルオロ酢酸アンモニウ
ム緩衝液(pH2.0)に溶解させ、その試料を55℃
で全部で25時間インキュベートする。2.5μlのア
リコートを取り出し、溶媒を減圧下で蒸留して除去す
る。この乾燥試料に、95%アセトニトリル水溶液中に
溶解させた10mg/mlのシナピン酸を含む10μl
の溶液及び0.1%TFA水溶液中のインシュリンの1
mg/ml溶液2.0μlを加える。この試料を混合し
て1μlをmaLD-TOF質量分光計の試料ホルダーに加え
る。実施例1のmaLD-TOFを用いて試料の質量分析を得、
シナピン酸及びインシュリンの既知の質量を用いて分光
計を較正する。25時間の分解の後に、ポリチオエステ
ルTGACTTT の質量スペクトルが得られる。表1には、ポ
リチオエステルの分解により形成される末端反復単位に
ついての公知の質量を列挙してある。
【0055】親ポリマーは予想される質量2020
([M+H]=2021)を有している。1分解サイク
ルを受け、それにより1末端反復単位を遊離したN−1
ポリマーは1738の質量を有する。親とN−1ポリマ
ーとの間の質量差は283である。表1に示すように、
カルボキシメチルチミン(T)側鎖を有する末端反復単
位は正確な質量を有する。同様に、N−2ポリマーは質
量1430を有する。従って、N−1とN−2ポリマー
との質量差は308である。従って、第2の残基はカル
ボキシメチルグアニン(G)側鎖を含む。この分析を続
けると、第3残基はカルボキシメチルアデニン(A)側
鎖を含み、第4残基はカルボキシメチルシトシン(C)
側鎖を含み、第5残基はカルボキシメチルチミン(T)
側鎖を含む。
([M+H]=2021)を有している。1分解サイク
ルを受け、それにより1末端反復単位を遊離したN−1
ポリマーは1738の質量を有する。親とN−1ポリマ
ーとの間の質量差は283である。表1に示すように、
カルボキシメチルチミン(T)側鎖を有する末端反復単
位は正確な質量を有する。同様に、N−2ポリマーは質
量1430を有する。従って、N−1とN−2ポリマー
との質量差は308である。従って、第2の残基はカル
ボキシメチルグアニン(G)側鎖を含む。この分析を続
けると、第3残基はカルボキシメチルアデニン(A)側
鎖を含み、第4残基はカルボキシメチルシトシン(C)
側鎖を含み、第5残基はカルボキシメチルチミン(T)
側鎖を含む。
【0056】前述の発明は明白さと理解のための説明及
び例示によって説明したが、ある種の変化及び改変をこ
の発明の範囲内で実施し得ることは明白であり、この発
明は前記の特許請求の範囲によってのみ限定されるべき
ものである。例えば、ここに記載したもの以外の質量分
析法もポリマー断片を同定するのに役立ち得るし、この
発明の範囲内に入るものと考えられる。少なくとも5員
を有するもの以外のエネルギー的に有利な環の形成も又
この発明の教示及び範囲内に入るものである。
び例示によって説明したが、ある種の変化及び改変をこ
の発明の範囲内で実施し得ることは明白であり、この発
明は前記の特許請求の範囲によってのみ限定されるべき
ものである。例えば、ここに記載したもの以外の質量分
析法もポリマー断片を同定するのに役立ち得るし、この
発明の範囲内に入るものと考えられる。少なくとも5員
を有するもの以外のエネルギー的に有利な環の形成も又
この発明の教示及び範囲内に入るものである。
【図1】公知のPNAの末端求核試薬の攻撃部位を示す
該略図である。
該略図である。
【図2】DNA認識のための天然及び非天然のヌクレオ
塩基の化学構造の収集である。
塩基の化学構造の収集である。
【図3】PNA配列TTTTCCTCTC−リジンアミドの部分分
解により生成したポリマー断片のネストしたセットの質
量スペクトルである。
解により生成したポリマー断片のネストしたセットの質
量スペクトルである。
【図4】PNA配列TGACTTT −グリシンアミドの部分分
解により生成したポリマー断片のネストしたセットの質
量スペクトルである。
解により生成したポリマー断片のネストしたセットの質
量スペクトルである。
【図5】この発明の方法を実施するための装置の該略図
である。
である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12M 1/00 A C12N 15/09
Claims (37)
- 【請求項1】 ポリマーの主鎖の反復単位の少なくとも
一部を順次的に分解する方法であって、該ポリマーが求
核試薬及び該求核試薬から離れた主鎖カルボニル炭素か
らなる末端反復単位を有し、下記の工程を含む当該方
法: (a)該求核試薬の該主鎖カルボニル炭素への攻撃を、
エネルギーレベルを上げて該求核試薬を該攻撃のために
活性化することによって開始し、 (b)該末端反復単位を含む環を形成し、それにより同
時に該環を遊離し且つ該主鎖カルボニル炭素への求核攻
撃が可能な末端反復単位を有する短くなったポリマーを
生成し、そして、 (c)所望のポリマー部分が分解するまで工程a及びb
を反復するために必要な反応条件を維持する。 - 【請求項2】 前記のポリマーがペプチド核酸である、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記のポリマーを、ポリアミド、ポリエ
ステル又はポリチオエステルからなる群より選択する、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 前記のポリマーが、不均一な主鎖を有す
るポリマーからなり、主鎖の機能的結合をアミド、エス
テル及びチオエステルからなる群より選択する、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項5】 前記の主鎖の反復単位が2−アミノエチ
ルグリシンである、請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 前記の主鎖の反復単位が2−ヒドロキシ
エチルグリシンである、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 前記の主鎖の反復単位が2−チオエチル
グリシンである、請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 前記の求核試薬がアミノ基である、請求
項1に記載の方法。 - 【請求項9】 前記の求核試薬がヒドロキシル基であ
る、請求項1に記載の方法。 - 【請求項10】 前記の求核試薬がチオール基である、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項11】 前記のカルボニル炭素原子が前記の求
核試薬から少なくとも4原子離れている、請求項1に記
載の方法。 - 【請求項12】 前記のポリマーが下記の一般式のもの
である、請求項1に記載の方法: 【化1】 {式中、各Vは、独立に、OH、SH、NH2 及びNH
Rからなる群より選択し、各Wは、同一であるか又は異
なっていて、H、R、OR、SR、NHR、NR2、
F、Cl、Br及びIからなる群より選択し、各Y1 〜
Yq-1 は、同一であるか又は異なっていて、O、S、N
H及びNRからなる群より独立に選択し、各Zは、独立
に、H、OH、OR、NH2 、NHR、NR2 、SH、
SR、20種類の天然アミノ酸の内の何れか、ポリペプ
チド、蛋白質、DNAオリゴマー及びRNAオリゴマ
ー、ビオチン及びフルオレセインからなる群より選択し
(各Rは、同一であるか又は異なっていて、1〜5炭素
原子を有するアルキル基であり、適宜、ヘテロ原子又は
置換された若しくは置換されていないアリール基を含ん
で良い)、各A1 〜Aq は、単結合、次式の基 【化2】 及び次式の基 【化3】 (ここに、Wは上で定義した通りであり、各sは1〜5
の整数である)からなる群より選択し、各L1 〜Lq は
同一であるか又は異なっていて、独立に、W、アデニ
ン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジン、5−メチ
ルシトシン、2−アミノプリン、2−アミノ−6−クロ
ロプリン、2,6−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、
その他の天然のヌクレオ塩基アナログ、その他の非天然
ヌクレオ塩基、置換された若しくは置換されていない芳
香族部分、ビオチン及びフルオレセインからなる群より
選択し、 n=1〜2 m=1〜2(但し、mはnと等しくない) p=0〜1,000,000 である}。 - 【請求項13】 攻撃の開始が、第1に、末端ブロック
された親ポリマーの末端求核試薬のデブロッキングを含
む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項14】 エネルギーレベルを上げることが、前
記のポリマーの直接の環境の温度を実質的な求核攻撃が
始まるまで高めることを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項15】 エネルギーレベルを上げることが、前
記のポリマーの直接の環境のpHを実質的な攻撃が始ま
るまで調節することを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項16】 エネルギーレベルを上げることが、実
質的な求核攻撃が始まるまでポリマーの直接の環境のp
Hを調節すること及び温度を高めることの両者を含む、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項17】 ポリマーの主鎖の反復単位の少なくと
も一部分を配列決定する方法であって、該ポリマーが求
核試薬及び該求核試薬から離れた主鎖カルボニル炭素か
らなる末端反復単位を有し、下記の工程を含む当該方
法: (a)該求核試薬の該主鎖カルボニル炭素への攻撃を、
エネルギーレベルを上げて該求核試薬を該攻撃のために
活性化することによって開始させ、 (b)該末端反復単位を含む環を形成し、それにより同
時に該環を遊離し且つ該主鎖カルボニル炭素への求核攻
撃が可能な末端反復単位を有する短くなったポリマーを
生成し、 (c)工程a及びbを含む分解サイクルを反復するため
に必要な反応条件を維持し、それによりポリマー断片の
ネストしたセットを生成し、各断片はN−x反復単位を
有し(ここに、Nは親ポリマー中の反復単位の総数であ
り、xはポリマーが受けた分解サイクルの回数であ
る)、そして、 (d)該ポリマー断片のネストしたセットを分析してポ
リマーの配列を決定する。 - 【請求項18】 前記のポリマーがペプチド核酸であ
る、請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 前記のポリマーを、ポリアミド、ポリ
エステル又はポリチオエステルからなる群より選択す
る、請求項17に記載の方法。 - 【請求項20】 前記のポリマーが、不均一な主鎖を有
するポリマーからなり、主鎖の機能的結合を、アミド、
エステル及びチオエステルからなる群より選択する、請
求項17に記載の方法。 - 【請求項21】 前記の主鎖の反復単位が2−アミノエ
チルグリシンである、請求項17に記載の方法。 - 【請求項22】 前記の主鎖の反復単位が2−ヒドロキ
シエチルグリシンである、請求項17に記載の方法。 - 【請求項23】 前記の主鎖の反復単位が2−チオエチ
ルグリシンである、請求項17に記載の方法。 - 【請求項24】 前記の求核試薬がアミノ基である、請
求項17に記載の方法。 - 【請求項25】 前記の求核試薬がヒドロキシル基であ
る、請求項17に記載の方法。 - 【請求項26】 前記の求核試薬がチオール基である、
請求項17に記載の方法。 - 【請求項27】 前記のカルボニル炭素が前記の求核試
薬から少なくとも4原子離れている、請求項17に記載
の方法。 - 【請求項28】 前記のポリマーが下記の一般式のもの
である、請求項17に記載の方法: 【化4】 {式中、各Vは、独立に、OH、SH、NH2 及びNH
Rからなる群より選択し、各Wは、同一であるか又は異
なっていて、H、R、OR、SR、NHR、NR2、
F、Cl、Br及びIからなる群より選択し、各Y1 〜
Yq-1 は、同一であるか又は異なっていて、O、S、N
H及びNRからなる群より独立に選択し、各Zは、独立
に、H、OH、OR、NH2 、NHR、NR2 、SH、
SR、20種類の天然アミノ酸の内の何れか、ポリペプ
チド、蛋白質、DNAオリゴマー及びRNAオリゴマー
からなる群より選択し(各Rは、同一であるか又は異な
っていて、1〜6炭素原子を有するアルキル基であり、
適宜、ヘテロ原子又は置換された若しくは置換されてい
ないアリール基を含んで良い)、各A1 〜Aq は、単結
合、次式の基 【化5】 及び次式の基 【化6】 (ここに、Wは上で定義した通りであり、各sは1〜5
の整数である)からなる群より選択し、各L1 〜Lq は
同一であるか又は異なっていて、独立に、W、アデニ
ン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジン、5−メチ
ルシトシン、2−アミノプリン、2−アミノ−6−クロ
ロプリン、2,6−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、
その他の天然のヌクレオ塩基アナログ、その他の非天然
ヌクレオ塩基、置換された若しくは置換されていない芳
香族部分、ビオチン、フルオレセイン及びその他のレポ
ーターリガンドからなる群より選択し、 n=1〜2 m=1〜2(但し、mはnと等しくない) p=0〜1,000,000 である}。 - 【請求項29】 攻撃の開始が、第1に、末端ブロック
された親ポリマーの末端求核試薬のデブロッキングを含
む、請求項17に記載の方法。 - 【請求項30】 エネルギーレベルを上げることが、前
記のポリマーの直接の環境の温度を実質的な求核攻撃が
始まるまで高めることを含む、請求項17に記載の方
法。 - 【請求項31】 エネルギーレベルを上げることが、前
記のポリマーの直接の環境のpHを実質的な求核攻撃が
始まるまで調節することを含む、請求項17に記載の方
法。 - 【請求項32】 エネルギーレベルを上げることが、実
質的な求核攻撃が始まるまでポリマーの直接の環境のp
Hを調節すること及び温度を高めることの両者を含む、
請求項17に記載の方法。 - 【請求項33】 ポリマー断片のネストしたセットの分
析を質量分析により行なう、請求項17に記載の方法。 - 【請求項34】 質量分析計がマトリックス援助された
レーザー脱着飛行時間(maLD-TOF)質量分析計である、
請求項33に記載の方法。 - 【請求項35】 ポリマーの配列決定が下記の工程を含
む、請求項17に記載の方法: (a)2つのN−xポリマー断片の間の質量差を計算
し、 (b)該質量差を末端反復単位についての公知の質量の
表と比較し、それにより、遊離した末端反復単位を同定
し、そして、 (c)配列が決定されるまで、工程a及びbを反復す
る。 - 【請求項36】 ポリマーの主鎖の反復単位の少なくと
も一部分を配列決定するための装置であって、該ポリマ
ーが求核試薬及び該求核試薬から離れた主鎖カルボニル
炭素を含む末端反復単位を有し、下記の手段を含む当該
装置: (a)該求核試薬の該主鎖カルボニル炭素への攻撃を、
エネルギーレベルを上げることにより該求核試薬を該攻
撃のために活性化することによって開始させる手段、 (b)該末端反復単位を含む環を形成し、それにより同
時に該環を遊離し且つ該主鎖カルボニル炭素への求核攻
撃が可能な末端反復単位を有する短くなったポリマーを
生成する手段、 (c)工程a及びbを含む分解サイクルを反復するため
に必要な反応条件を維持し、それによりポリマー断片の
ネストしたセットを生成する手段(各断片はN−x反復
単位を有し、ここに、Nは親ポリマー中の反復単位の総
数であり、xはポリマーが受けた分解サイクルの回数で
ある)、及び (d)該ポリマー断片のネストしたセットを分析してポ
リマーの配列を決定する手段。 - 【請求項37】 前記のポリマーがペプチド核酸であ
る、請求項36に記載の装置。
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