JPH07213298A - 末端残基を順次除去するポリマーの分解及び配列決定のための方法及び装置 - Google Patents

末端残基を順次除去するポリマーの分解及び配列決定のための方法及び装置

Info

Publication number
JPH07213298A
JPH07213298A JP6215243A JP21524394A JPH07213298A JP H07213298 A JPH07213298 A JP H07213298A JP 6215243 A JP6215243 A JP 6215243A JP 21524394 A JP21524394 A JP 21524394A JP H07213298 A JPH07213298 A JP H07213298A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polymer
nucleophile
group
backbone
terminal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP6215243A
Other languages
English (en)
Inventor
James M Coull
ジェイムズ・エム・コウル
Leif Christensen
ライフ・クリステンセン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PERCEPTIVE BIOSYST Inc
Biosearch Inc
Original Assignee
PERCEPTIVE BIOSYST Inc
Biosearch Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PERCEPTIVE BIOSYST Inc, Biosearch Inc filed Critical PERCEPTIVE BIOSYST Inc
Publication of JPH07213298A publication Critical patent/JPH07213298A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ポリマーの主鎖の反復単位の少なくとも一部
を順次的に分解する方法を提供すること。 【構成】 ポリマーの主鎖の反復単位の少なくとも一部
を順次的に分解する方法であって、該ポリマーが求核試
薬及び該求核試薬から離れた主鎖カルボニル炭素からな
る末端反復単位を有し、下記の工程を含む当該方法： （ａ）該求核試薬の該主鎖カルボニル炭素への攻撃を、
エネルギーレベルを上げて該求核試薬を該攻撃のために
活性化することによって開始し、（ｂ）該末端反復単位
を含む環を形成し、それにより同時に該環を遊離し且つ
該主鎖カルボニル炭素への求核攻撃が可能な末端反復単
位を有する短くなったポリマーを生成し、そして、
（ｃ）所望のポリマー部分が分解するまで工程ａ及びｂ
を反復するために必要な反応条件を維持する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、一般に、ポリマー及
び合成核酸化学の分野に関係する。特に、この発明は、
末端残基を順次除去するポリマー特にペプチド核酸（Ｐ
ＮＡ）の分解及び配列決定に関係する。
【０００２】
【発明の背景】ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡ発現
の配列特異的な制御及び遺伝子をターゲットとする薬物
の調製のための有望な候補である最近発見された合成ポ
リアミドである。欧州特許出願ＥＰ９２／０１２１９及
び９２／０１２２０号を参照されたい。ＰＮＡは、ＤＮ
Ａのヌクレオチド塩基が結合したペプチド様の主鎖を有
するバイオポリマーハイブリッドである。特に、ＰＮＡ
は、アデニン、シトシン、グアニン及びチミンがメチレ
ンカルボニル基を介して結合したアミノ酸、２−アミノ
エチルグリシンの反復単位からなる合成ポリアミドであ
る。ＰＮＡの相補的配列は、ＤＮＡに高い特異性で結合
して二重及び三重のらせん形の両者を与える。驚くべき
ことに、ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、天然の二重ら
せんＤＮＡより一層安定である。それ故に、ＰＮＡは、
ＤＮＡ操作の多面的分野に応用するための有望な候補で
ある。Nielsen, Peter E等、 Science 254:1497-1500 (1
991)を参照されたい。現在、一度合成されたＰＮＡを配
列決定するための公知の技術は存在しない。
【０００３】ＤＮＡ、ポリペプチド及び蛋白質は、周知
の方法によって常例的に配列決定し得る天然に存在する
バイオポリマーである。ＰＮＡは核酸及びポリペプチド
様構造の両者を有するハイブリッドバイオポリマーであ
るので、ＤＮＡ及び蛋白質の配列決定法をＰＮＡの配列
決定に応用することを検討することは論理的である。
【０００４】ＤＮＡは、マクサム・ギルバート法又はサ
ンガー法の何れかによって配列決定することが出来る。
Stryer, L 著、 Biochemistry, W.H.Freeman and Co., S
an Francisco (1981) 591-93頁を参照されたい。更に、
短いＤＮＡオリゴマーは、モビリティー−シフト（ワン
ダリング・スポット）法によって配列決定された。Gai
t, M.J.著、 Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, N
Y (1990) 135-36頁を参照されたい。ポリペプチド及び
蛋白質は、エドマン分解によりそれらのアミン末端から
配列決定される。Stryer, L 著、 Biochemistry, W.H.Fr
eeman and Co., San Francisco (1981) 24-27 頁を参照
されたい。更に、ポリペプチドのカルボキシ末端配列決
定のための幾つかの新規な方法が記載された。Inglis,
A.S., Anal. Biochem. 195:183-96 (1991)を参照された
い。更に、ポリペプチドの配列決定は又、後で質量分析
されるネストした断片の（配列規定）セットを生成する
ことによっても記載された。Chait, Brian, T.等、 Scie
nce 257:1885-94 (1992)を参照されたい。しかしなが
ら、下記に一層詳細に検討するように、これらの技術
は、ＰＮＡが天然に存在しないポリアミド主鎖を含んで
いるハイブリッドバイオポリマーであるために、ＰＮＡ
を配列決定するために用いることは出来ない。
【０００５】ＤＮＡは、アデニン、シトシン、グアニン
及びチミンが結合したデオキシリボースリン酸エステル
主鎖からなるバイオポリマーである。マクサム・ギルバ
ート法及びサンガー法は、分離し及び分析して配列を決
定すべきポリマー断片のネストしたセットの生成を必要
とする。しかしながら、デオキシリボースリン酸エステ
ル主鎖は、如何なる公知の化学的方法によっても順次的
に分解されない。それ故に、ポリマー断片のネストした
セットは、別の方法によって生成される。
【０００６】「ネストしたセット」は、ポリマー配列を
決定するために用いるポリマーを部分的に分解／合成し
た試料を定義するために配列決定の分野で用いられる用
語である。理想的には、このネストしたセットは、測定
可能な量の分解／合成工程により生成した各断片を含
み、それにより、断片のセットの分析が配列を規定す
る。それ故、すべての断片は共通の一端を有するが、他
端は主鎖の開裂点又は合成停止点によって決定される。
従って、すべての短くしたポリマーの長さ／質量の相対
的差異は、主鎖の開裂点又は合成停止点に依存してい
る。
【０００７】マクサム・ギルバート法は、化学試薬を用
いてデオキシリボースリン酸エステル主鎖を開裂させ、
それにより、断片のネストしたセットを生成する。或
は、サンガー法は、酵素的方法を用いてネストしたセッ
トを合成する。配列決定すべきＤＮＡをテンプレートと
して用いて、プライマーをアニールさせ及びポリメラー
ゼ反応を４つの別々の容器内で進める。各容器は、取り
込んだ際に鎖延長を停止させそれによりネストしたポリ
マー断片のセットを生成する異なるジデオキシヌクレオ
チドを含む。最後に、ＤＮＡ配列決定のためのモビリテ
ィー−シフト（ワンダリング・スポット）法は、デオキ
シリボースリン酸エステル主鎖をランダムに開裂させそ
れによりネストしたポリマー断片のセットを生成するホ
スホジエステラーゼ酵素の利用を含む。
【０００８】これらの方法は、ＰＮＡの配列決定に適合
させることが出来ない。ＰＮＡはポリアミド主鎖からな
っているので、マクサム・ギルバートにより記載された
化学的処理はＰＮＡを開裂させない。同様に、ＰＮＡ
は、酵素ＤＮＡポリメラーゼの基質でないので、サンガ
ー法に従順でない。更に、ＰＮＡは、モビリティー−シ
フト（ワンダリング・スポット）分析のためにＤＮＡを
分解するのに用いるホスホジエステラーゼ酵素の基質で
ない。従って、何れの公知のＤＮＡ配列決定法も、分離
及び分析に適したＰＮＡ断片のネストしたセットを生成
しない。
【０００９】蛋白質配列決定の関連技術も又、ＰＮＡを
配列決定することを試みるのに助けとならない。蛋白質
及びポリペプチドは、２０種類の天然に存在するアミノ
酸から形成されるポリアミドである。その配列は、アミ
ノ又はカルボキシ末端配列決定法を用いて決定され得
る。蛋白質配列決定は、一般に、化学的に誘導される順
次的除去及び末端アミノ酸残基の同定を含む。ポリマー
断片のネストしたセットが生成されることを必要としな
いので、典型的な蛋白質配列決定法は、ＤＮＡ配列決定
技術と実質的に異なっている。
【００１０】エドマン分解は、ポリアミドがイソチオシ
アネートと反応する遊離のアミノ基を有することを必要
とする。Stryer, L 著、 Biochemistry, W.H.Freeman an
d Co., San Francisco (1981) 24-27 頁を参照された
い。イソチオシアネートは、典型的には、フェニルイソ
チオシアネートである。付加物は、分子内で、最も近い
ポリマー主鎖アミド基と反応し、それにより、５員環を
形成する。この付加物を転移し、次いで、末端アミノ酸
残基を強酸を用いて開裂させる。遊離されたアミノ酸の
フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）を同定し、及び短
くなったポリマーを分解及び分析の反復サイクルにかけ
ることが出来る。
【００１１】カルボキシ末端配列決定法は、エドマン分
解を真似ているが、ポリマーの反対の末端からの順次的
分解を含んでいる。Inglis, A.S., Anal. Biochem. 19
5:183-96 (1991)を参照されたい。エドマン分解と同様
に、カルボキシ末端配列決定法は、化学的に誘導する順
次的除去及び末端アミノ酸残基の同定を含む。
【００１２】ＰＮＡはポリアミド主鎖を含んでいるが、
蛋白質配列決定の化学は、このポリマーを分解するとは
期待されないであろう。ＰＮＡ主鎖は天然に存在しない
ものであり、その反復単位は実質的にポリペプチド主鎖
と異なる。従って、蛋白質分解及び配列決定に用いられ
た化学的方法は、ＰＮＡを分解せず又はＰＮＡを配列決
定するのに有用ではないであろう。
【００１３】もっと最近になって、ポリマー断片のネス
トしたセット（配列規定セット）を調製し、その後質量
分析を行なうことによるポリペプチド配列決定法が記載
された。Chait,B.T.等、 Science 257:1885-94 (1992)を
参照されたい。公知のアミノ酸残基の質量を有する断片
間の相対質量差を比較することによって配列を決定す
る。ポリマー断片のネストした（配列規定）セットの形
成がＤＮＡ配列決定に必要であるが、この方法は、各残
基の順次的除去及び同定からなる従来の蛋白質配列決定
法とは実質的に異なっている。それにもかかわらず、エ
ドマン化学が、やはり、ネストしたセットの形成に必要
である。それ故、ＰＮＡは、エドマン分解によっては順
次的に分解されないので、この方法によって配列決定す
ることは出来ない。
【００１４】合成ポリマーは又、解重合（「脱増殖（de
propagation ）」「鎖開き(chain unzipping) 」として
も知られる）によっても分解される。Rempp 等、 Polyme
r Synthesis, Huthig and Wepf Verlag, New York, (19
91) 202 頁を参照されたい。その過程は、フリーラジカ
ル機構による重合に共通している。解重合は、重合反応
の自発的逆転によってモノマーを再生する。解重合はポ
リマーの段階的分解であるが、それは配列分析のために
制御し又は操作するには速過ぎるランダムな平衡過程で
ある。更に、特にＰＮＡはフリーラジカル重合によって
は組み立てられず又、この機構によって分解されること
は示されていない。
【００１５】合成ポリマーは、「バックバイティング
（backbiting）」として知られる分子内反応を受ける
が、これらの過程はこのポリマーを分解しない。Bovey
等、 Macromolecules; an introduction to polymer sci
ence, Academic Press, New York, (1979), 48-49 頁及
び238-41頁を参照されたい。フリーラジカル重合の間
に、伸長中のポリマー鎖の末端から中間の原子へのフリ
ーラジカルの分子内転移によってバックバイティングが
起きる。鎖増殖がこの点から続き且つポリマーが分枝す
る。それにもかかわらず、ＰＮＡはフリーラジカル重合
によっては組み立てられないので、それらはこの機構に
よって分解されない。
【００１６】他のバックバイティング過程によって形成
されたポリマーの改造（reshuffling ）が起こり得る。
Rempp 等、 Polymer Synthesis, Huthig and Wepf Verla
g, New York, (1991) 51頁を参照されたい。ヒドロキシ
ル末端を有するポリエステルは、分子内で、ポリマー主
鎖のエステル基を攻撃する。更に、アミノ末端を有する
ポリアミドは、ポリマー主鎖のアミド基を攻撃する。こ
れらの条件下でのバックバイティングは、ポリマーの改
造を生じる。断片が消失する訳ではないので、ポリマー
の質量は変わらない。更に、バックバイティングがＰＮ
Ａ中で認められた。ＰＮＡの末端アミノ基の側鎖アミド
基への分子内攻撃が記載された。Christensen, L等、 Op
timized Solid-Phase Synthesis of PNA Oligomers, 第
１３回アメリカンペプチドシンポジウム、ポスター No.
7, 1993 年６月２０〜２３日、カナダ国、Edmontonを参
照されたい。この出願の図１、攻撃１をも参照された
い。この結果は、Ｎ−アシルシフトとして公知の再配列
である。ＰＮＡはバックバイティングを通して再配列す
るが、この方法は、ポリマーの質量が変わらないので、
配列決定法を与えないであろう。
【００１７】現在、ＰＮＡについての配列情報は、実際
の合成手順から得られるだけである。ＰＮＡモノマーの
合成のための方法は記載されている。前述の欧州特許出
願ＥＰ９２／０１２１９及び９２／０１２２０号を参照
されたい。ペプチド合成のための従来のｂｏｃ／ベンジ
ル保護化学を用いて、伸長中のアミノ末端と次のモノマ
ーのカルボキシル末端との順次的反応によってポリマー
を組み立てる。Gross,Erhard 等、 The Peptide, Academ
ic Press, NY (1980) 100-118頁を参照されたい。完全
に組み立てられたポリマーを脱保護し、粗試料を分析す
る。分析は、典型的には、分離ステップとその後の単離
した断片の質量分光分析とからなる。分離分析（例え
ば、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャ
ピラリー液体クロマトグラフィー又はキャピラリー電気
泳動）は、多くの成分及び各々の相対量を与える。もっ
と短いオリゴマーについては、これらの技術を用いてポ
リマーの長さ（反復モノマー単位の数）を決定すること
が出来る。しかしながら、配列情報は生じない。それ
故、もしこのポリマーを適当な長さではあるが組立の順
序が不正確であるように不適当に組み立てたならば、分
離分析はこの異常を検出することは出来ない。更に、分
離分析は、絶対に、単離されたポリマーを同定すること
は出来ない。
【００１８】質量分光分析は、分離工程から単離された
ＰＮＡを分析するために用いる場合、精製されたポリマ
ーの正確な質量を与えるので非常に有効である。所望の
生成物は、他の化合物がその予想される質量から異なっ
た質量を有しているので同定される。しかしながら、正
しいモノマー組成を有するが配列が異なるポリマーは、
それらが所望の生成物と同じ質量を有するので区別する
ことが出来ない。この状況は、組立の順序を間違ったと
きに起こるであろう。このように、質量分光分析のみを
用いては、ＰＮＡの配列を確かめることは不可能であ
る。
【００１９】ＰＮＡの配列が確実に知れることは重要で
ある（さもなければ、実験結果が誤解を生じ得る）。研
究は、単一塩基対のミスマッチがＰＮＡ−ＤＮＡ結合に
影響を与えることを示している。Egholm, M.等、 J. Am.
Chem. Soc. 114:9677-78 (1992)を参照されたい。エラ
ーは、ポリマーの化学的組み立ての間に起こり得るの
で、組み立てられたＰＮＡの配列の絶対的確認に適した
方法が望ましい。更に、治療剤の場合は、ＰＮＡは、ヒ
トにおいての使用を受ける前に十分確立されなくてはな
らない。それ故、配列決定は一次ポリアミド構造の絶対
的確認を与えるので、ＰＮＡについての配列決定法が必
要とされている。
【００２０】
【発明の要約】この発明は、末端反復単位（残基）を順
次的に遊離するポリマーの分解のための新規な方法及び
装置を含む。一般に、この発明の方法によって分解し得
るポリマーはＰＮＡ、ポリアミド、ポリエステル及びポ
リチオエステルである。詳細には、これらのポリマーは
末端反復単位及び主鎖反復単位の両者からなる。少なく
とも１つの末端反復単位は、末端求核試薬（アミノ、ヒ
ドロキシル又はチオール基）及びその末端求核試薬から
離れた主鎖カルボニル炭素を含む。好ましくは、これら
の末端反復単位は、２−アミノエチルグリシン、２−ヒ
ドロキシエチルグリシン又は２−チオエチルグリシンの
誘導体である。
【００２１】この発明の方法により、このポリマーは、
その末端反復単位（末端残基）の反復遊離によって分解
する。分解は、このポリマーの末端求核試薬がその求核
試薬から少なくとも４原子離れた主鎖カルボニル炭素へ
の分子内攻撃を開始することを含む。末端求核試薬の攻
撃の開始は、系のエネルギーレベルを高めることを必要
とする。この末端反復単位は、同時にポリマーから遊離
して安定な環状構造を形成し、それにより、求核試薬
（アミノ、ヒドロキシ又はチオール官能基）及び主鎖カ
ルボニル炭素からなる末端反復単位を有する短くなった
ポリマーを生成する。反応条件を維持すれば、短くなっ
たポリマーは必要な官能基をすべて含んでいるので、こ
のサイクルは、短くなったポリマー上で、所望の部分が
分解するか又は試料が分解反応の活性化エネルギーより
低く置かれるまで反復する。
【００２２】この発明は、ポリマーを順次的に分解する
ための方法を含んでいるが、それは又、ポリマーを配列
決定する方法をも提供する。この発明の方法を用いてポ
リマー試料を部分的に分解し、それにより、ポリマー断
片のネストしたセットを生成することが出来る。このポ
リマー断片のネストしたセットを、次いで、分析にかけ
る。一般に、分析は、質量分光法により得られる質量分
析からなる。好ましくは、質量分析は、マトリックス援
助されたレーザー脱着飛行時間（maLD-TOF）質量分光法
による。遊離して各々の順次的に分解されたポリマー断
片を生成する末端反復単位を、次いで、ポリマー断片間
の質量差の比較によって同定する。このデータの分析に
よって、このポリマーの配列が決定される。
【００２３】ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリアミド、ポ
リエステル及びポリチオエステルを順次的に分解するこ
とはこの発明の１つの目的である。ＰＮＡ、ポリアミ
ド、ポリエステル及びポリチオエステルの配列を決定す
ることはこの発明の他の目的である。ＰＮＡ、ポリアミ
ド、ポリエステル及びポリチオエステルの配列を決定す
るための装置を提供することはこの発明の更なる目的で
ある。
【００２４】
【発明の詳細な解説】出願人は、ある制御された状況下
において、ＰＮＡ、ポリアミド、ポリエステル及びポリ
チオエステルがそのポリマーの末端反復単位の反復遊離
によって順次的分解を受けることを発見した。これは、
この型の合成ポリマーを分解するための方法が知られて
いなかったことを考えると、驚くべき結果であった。こ
の方法の１つの具体例においては、ポリマー断片のネス
トしたセットが生成し、その質量分析を通してそのポリ
マーを配列決定する。他の具体例において、ＰＮＡライ
ブラリーから単離したＰＮＡの配列は、スクリーニング
アッセイ中に関心ある分子に対する結合を示すので、そ
の配列を決定することが出来る。更に他の具体例におい
ては、このポリマーは、ポリマーの分解速度によって決
定される制御された様式で化学薬剤を遊離するバイオエ
ラダブル（bioerrodable）マトリックスを形成すること
が出来る。この化学薬剤は、このポリマーマトリックス
によってトラップされ得るか又はポリマーの分解生成物
である。更なる具体例において、これらのポリマーを、
一度それらの有用性が使い尽くされたならば、この発明
の方法によって部分的に若しくは完全に分解される生物
分解性材料として用いることが出来る。例えば、ＰＮ
Ａ、ポリアミド、ポリエステル又はポリチオエステルか
ら製造される用いられる材料は、この発明の方法によっ
て処分のために分解されよう。
【００２５】この発明は、ポリマーの順次的分解のため
の方法である。この発明の方法によって分解するポリマ
ーは、２つの末端反復単位及びｐ個の主鎖反復単位から
なる（ここに、ｐは、１〜１，０００，０００の整数で
ある）。すべての反復単位は、機能的結合によって一緒
に繋がれ、それにより、ポリマー主鎖を形成している。
これらの機能的結合は、アミド、エステル及びチオエス
テルからなる群より選択する。用語「主鎖」、「反復単
位」及び「機能的結合」は、高分子化学の分野における
それらの通常の意味を有する。これらのポリマーは、主
鎖の組成において不均一であってよく、それにより、ア
ミド、エステル及びチオエステル機能的結合の任意の可
能な組合せを含むことが出来る。好適具体例において、
これらのポリマーは、主鎖の組成において均一であり、
ポリアミド、ポリエステル又はポリチオエステルであ
る。最も好適な具体例において、このポリマーはペプチ
ド核酸（ＰＮＡ）である。
【００２６】これらの末端反復単位は、同一であるか又
は異なっており、少なくとも１つの末端反復単位は、末
端求核試薬及びその求核試薬から少なくとも４原子離れ
た主鎖カルボニル炭素を含む。この末端求核試薬は、ア
ミノ、ヒドロキシル又はチオール基である。ｐ個の主鎖
反復単位があり、ＰＮＡ中でこれらすべては６原子の長
さである。すべての反復単位は、１つの末端にヘテロ原
子又はアルキル化ヘテロ原子を有し、他端にカルボニル
炭素を有する。好適反復単位は、２−アミノエチルグリ
シン、２−ヒドロキシエチルグリシン及び２−チオエチ
ルグリシンである。これらの反復単位は、適宜、結合さ
れた側鎖を有して良い。側鎖は、式−Ａ−Ｌで表される
（ここに、Ａ及びＬは以下に定義するものである）。
「側鎖」は、高分子化学の分野において普通に解釈され
ているように用いる。
【００２７】この発明の方法によって分解されるポリマ
ーは、下記の一般式のＰＮＡ、ポリアミド、ポリエステ
ル及びポリチオエステルである：
【化７】 末端求核試薬はＶで表されており、Ｖは、独立に、Ｏ
Ｈ、ＳＨ、ＮＨ2 及びＮＨＲからなる群より選択する。
原子又は基Ｗは、同一であるか又は異なっており、Ｈ、
Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨＲ、ＮＲ2 、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及び
Ｉからなる群より選択する。ヘテロ原子又はアルキル化
ヘテロ原子はＹで表されており、各Ｙ1 〜Ｙq-1 は同一
であるか又は異なっており、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮＲから
なる群より独立に選択する。末端原子又は基はＺで表さ
れており、各Ｚは独立に、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ2 、Ｎ
ＨＲ、ＮＲ2 、ＳＨ、ＳＲ、２０種類の天然アミノ酸の
内の任意のアミノ酸、ポリペプチド、蛋白質、ＤＮＡオ
リゴマー、ＲＮＡオリゴマー、ビオチン及びフルオレセ
インからなる群より選択する。アミノ酸は、アミド又は
遊離の酸として存在して良く、ａ−アミノ基を介してポ
リマーに結合しており、それにより、ポリマーに対する
アミド結合を形成している。同様に、ポリペプチド及び
蛋白質が、ａ−アミノ基末端を介してこれらのポリマー
に結合され、それによりアミド結合を形成する。ＤＮＡ
オリゴマーは、それらの５’又は３’ヒドロキシル基に
よりこれらのポリマーに結合され得るが、それにより、
エステル結合を形成する。ＲＮＡオリゴマーは、それら
の５’、３’又は２’ヒドロキシル基によりこのポリマ
ーに結合され得るが、それにより、エステル結合を形成
する。或は、末端５’、３’又は２’アミノ基を有する
ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴマーは、該アミノ基によりポリ
マーに結合することが出来、それにより、アミド結合を
形成する。各Ｒは、１〜６炭素原子を有し適宜ヘテロ原
子を含むアルキル基又は置換された若しくは置換されて
いないアリール基を表す。１つの具体例において、Ｒは
グリカン、炭水化物又は糖部分であって良い。結合基Ａ
は、リガンドＬを各主鎖反復単位に結合する。各Ａ1 〜
Ａq は、単結合、下記式の基；
【化８】 又は下記式の基である；
【化９】 （式中、Ｗは上で定義してあり、各ｓは１〜５の整数で
ある）。リガンドはＬで表され、各Ｌ1 〜Ｌq は、同一
であるか又は異なり、独立に、Ｗ、アデニン、シトシ
ン、グアニン、チミン、ウリジン、５−メチルシトシ
ン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリ
ン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、他の天
然に存在する若しくは天然に存在しないヌクレオ塩基、
置換された及び置換されていない芳香族部分、ビオチン
及びフルオレセインからなる群より選択する。ヌクレオ
塩基は、プリンアナログについては主として９位にて結
合し、ピリミジンアナログについては１位にて結合す
る。Ｌで表される天然に存在する又は天然に存在しない
ヌクレオ塩基の例は、図２に描かれている。各ｍ及びｎ
は、整数１又は２である（但し、ｍはｎに等しくな
い）。この具体例において、主鎖反復単位は、分解が６
員環形成により最適化されるので、６原子の長さであ
る。
【００２８】この発明の方法により、このポリマーは、
末端反復単位の反復遊離によって分解する。図１を参照
して、分解は、ポリマーの末端求核試薬（アミノ、ヒド
ロキシル又はチオール官能基）の末端求核試薬から５原
子離れた主鎖カルボニル炭素への分子内攻撃（適当な条
件下）を含む。１つの例は、図１に「攻撃２」として描
かれている（ここに、ポリマーはＰＮＡである）。好適
具体例において、末端求核試薬はアミノ基である。末端
求核試薬と求電子性カルボニル炭素とが４つの原子によ
り分けられているとき、末端反復単位は、同時にポリマ
ーから遊離して安定な６員環を形成し、それにより、更
なる末端反復単位を有する短くなったポリマーを生成す
る。短くなったポリマーはすべての必要な官能基を含ん
でいるので、この過程は、短くなったポリマー上で、そ
れが完全に分解するか又は試料が分解反応の活性化エネ
ルギーより低く置かれるまで続く。他の環サイズ例えば
５員環及び７員環は、動力学的に６員環程望ましくはな
いが、この発明の範囲内に入る。
【００２９】攻撃のための求核試薬の活性化は、求核試
薬の性質及び直接的化学的環境の関数である。求核攻撃
に助力する条件は、ｐＨの適合及び／又は高い温度であ
る。１次アミノ基はｐＨ１０未満で陽子を得、それ故、
弱い求核試薬である。従って、末端アミノ基について
は、好適条件は、１０より大きいｐＨである。ヒドロキ
シル基及びチオール基は、極めて酸性の条件下でのみ陽
子を得る。従って、分解は、ヒドロキシル及びチオール
末端化ポリマーについては、酸性ｐＨの条件下でさえ予
想される。更に、ラクトン形成は酸性条件下で支援され
るが、エステル及びチオエステルは高いｐＨで加水分解
される。それ故、ヒドロキシル及びチオール求核試薬に
対する好適ｐＨ条件は、ｐＨ２〜１０である。ヒドロキ
シル末端化ポリマーについての一層好適な条件は、ｐＨ
２〜４である。すべてについて、有利なｐＨ条件、温度
を上昇させることは、分解速度を増大させる。末端アミ
ン開始される攻撃についての典型的温度は、２０〜８０
℃の範囲内である。好適条件は、５５℃である。ヒドロ
キシル及びチオール開始される攻撃についての典型的温
度は、２０〜６０℃の範囲内である。
【００３０】分解は、末端求核試薬がブロックされる場
合には起こらない。陽子付加は、ブロック事象の一形態
である。ブロックは又、末端求核試薬と安定共有結合を
形成する試薬との反応を介しても起きる。典型的ブロッ
キング基は、アセチル、ベンゾイル、Ｆｍｏｃ、ｔ−ｂ
ｏｃ及びトリチル基である。それにもかかわらず、ブロ
ッキング基の除去は、分解のために適当な遊離の末端求
核試薬を再生する。従って、ブロッキング又は選択的保
護は、分解過程を制御し、それにより、末端求核試薬を
脱保護することによって脱保護反応を引き起こすことを
可能にするための手段である。
【００３１】ＰＮＡの末端アミノ基は又、５原子離れた
主鎖カルボニル炭素に加えて、側鎖カルボニル炭素をも
攻撃することが示された。図１には、両方の攻撃事象を
描いてある。側鎖カルボニル炭素への攻撃（「攻撃１」
として記載）は、Ｎ−アシルシフトを引き起こす。これ
は共有結合ブロッキング事象であるが、可逆的である。
Christensen, L等、 Optimized Solid-Phase Synthesis
of PNA Oligomers, 第１３回アメリカンペプチドシンポ
ジウム、ポスター No.7、６月２０〜２３日、カナダ国 E
dmonton を参照されたい。従って、分解は、一過的なＮ
−アシル化にもかかわらずに進行する。それにもかかわ
らず、Ｎ−アシル化は、ＰＮＡの分解過程を示す競争反
応である。
【００３２】この発明の他の具体例において、ポリマー
を配列決定する。この発明の方法により、ポリマーを部
分的に又は完全に分解し、それにより、ネストしたポリ
マー断片のセットを生成する。このネストしたポリマー
断片のセットは、すべてに共通の一端を有し及び各断片
が１つ以上の反復単位だけ短くなったポリマーを表すポ
リマー断片からなる。従って、各ポリマー断片はＮ−ｘ
反復単位からなる（ここに、Ｎは親ポリマー内の反復単
位の総数であり、ｘはポリマーが受けた分解サイクルの
数である）。理想的には、ネストしたセットは、測定可
能な量の親ポリマーを表す断片及び順次的分解により形
成された短くなったポリマー断片の各々を含む。従っ
て、このネストしたセットは、ポリマーの配列を規定す
る。
【００３３】このポリマー断片のネストしたセットを、
次いで、分析にかける。１つの具体例において、分析
は、質量分析からなる。質量分析は、迅速原子衝撃質量
分光法（ＦＡＢ−Ｍ／Ｓ）、エレクトロスプレーイオン
化質量分析又は他の質量分析法を用いて得ることが出来
る。好適具体例において、質量分析は、マトリックス援
助されたレーザー脱着飛行時間（maLD-TOF）質量分光法
による。
【００３４】すべての断片間の質量差を計算し、それに
より、順次的に分解した各ポリマーを生成するために消
失した末端反復単位を同定することによって配列を決定
する。詳細には、第１の末端反復単位（残基）の正体
を、親ポリマーとＮ−１ポリマーとの間の質量差によっ
て決定する。これら２種の質量を、好ましくは、maLD-T
OFによって決定する。この差は、特定の残基の質量と相
関する（例えば、表１に見られる）。第２残基を、前述
と同様のやり方で、Ｎ−１及びＮ−２ポリマー断片の間
の質量差によって同定する。第３残基を、Ｎ−２及びＮ
−３断片の間の相対的質量差によって同定する。分析
を、この方法で、ポリマーの１次構造が解明されるまで
続ける。しかしながら、ポリマーの最後の２残基の配列
は、典型的には、マトリックス及び末端反復単位により
生じたバックグラウンドピークが２００〜５００ＡＭＵ
の範囲でマススペクトルを混乱させるので、同定されな
い。この配列の最後の２つのメンバーを評価するため
に、質量補償（off-setting ）付加物分子をポリマーに
結合し、それにより、最後の２つのポリマー断片の質量
を、それらがmaLD-TOF質量分析計のバックグラウンドか
ら分離され得るように増加させることが出来る。
【表１】
【００３５】ポリマーが１５より大きい反復単位を有す
る場合は、そのネストしたセットは、測定可能な量の短
い断片が形成される前に親ポリマーが完全に分解され得
るので、親ポリマー及びすべての可能な短い断片の測定
可能な量を含み得ない。この障害は、時間にわたって分
解反応をサンプリングすることによって克服される。第
１の時点における試料を用いて第１の少量の残基の配列
を上述の方法によって生成することが出来る。前に同定
された１つのポリマー断片が存在するならば、次の時点
を用いて続く残基を同定する。特に、前に同定されたポ
リマー断片については配列は既知であり、残りの配列が
前述の方法によってその後解明され得るので、親がもは
や検出可能でなくても配列の曖昧さはない。
【００３６】この発明は、ポリマーの分解及び配列分析
を自動的に実施するための装置において具体化し得る。
今や、多くの異なる型の配列決定用装置が市販されてい
る。１つは、Millipore Model 6625 ProSequencer （商
標）（マサチューセッツ州、Bedford 在、Millipore Co
rporation ）であり、これは、エドマン化学を利用する
蛋白質又はペプチドの気相配列決定装置である（１９９
２年６月６日に出願された米国特許出願第０７／８９
３，６８９号を参照されたい）。この出願を本明細書中
に参考として援用する。他の配列決定装置は、米国特許
第４０６５４１２号（Dreyer）、４６０３１１４号（Ho
od）及び４７０４２５６号（カリフォルニア州、Foster
City 在、Applied Biosystems, Inc.）に記載されてお
り、これらのすべてを参考として本明細書中に援用す
る。
【００３７】図５は、本発明の配列決定装置の１つの可
能な具体例の概略図である。反応チャンバー１０は、概
略図の中央に位置している。概略図の左からスタートし
て、塩基性蒸気及び酸性蒸気が輸送ライン２０及びバル
ブ２２を介して反応チャンバー１０中に導入され得るよ
うに、塩基性蒸気１４及び酸性蒸気１８が接続されてい
る。典型的塩基性蒸気は、メチルアミン、ジメチルアミ
ン及びトリメチルアミンを含む。典型的酸性蒸気は、塩
化水素、酢酸及びハロ酢酸例えばトリフルオロ酢酸を含
む。選択される特定の蒸気は、試料をさらすべき所望の
ｐＨに依存する。通常、一度に１種類の蒸気だけを導入
してポリマー試料のｐＨを制御する。
【００３８】求核性の攻撃の開始は、温度制御した反応
チャンバー１０内の試料支持体１２上に位置させた試料
に接触するこれらのガスのｐＨによって、部分的に制御
される。この支持体は、酸及び塩基耐性の任意の材料で
作ることが出来る。例えば、ガラス繊維ディスク又はＰ
ＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）若しくはポリエ
チレン製の膜が適当である。ＰＶＤＦ膜も又、ある程度
まで酸及び塩基に安定である。かかる膜は、マサチュー
セッツ州、Bedford 在、Millipore Corporation から市
販されている。
【００３９】温度は、環化及び環状末端反復単位の除去
を開始するために操作し得る他の条件である。反応チャ
ンバー１０は、従来法における加熱要素若しくはジャケ
ットを備えている。熱電対を用いて温度をモニターして
制御することが出来る。或は、コンピューターによって
デジタル式に温度制御をモニターし且つ制御することが
出来る。配列決定反応の速度を制御するために温度及び
ｐＨを変えることが出来る。
【００４０】ポリマー断片のネストしたセットを適当な
条件下で作成する。トランスファー緩衝液１６をライン
２０及びバルブ２２を通して導入して試料に接触させる
ことが出来る。典型的には、オペレーターにより決定さ
れたようにポリマーを分解するのに十分な時間の後に、
トランスファー緩衝液を導入して分析用システムを通し
て反応生成物を洗浄する。緩衝液１６はライン２０及び
バルブ２２を通って反応チャンバー１０へ流れ、分解し
たポリマー試料を支持体１２から洗い出してライン２０
へ入る。バルブ２４を開いてこの緩衝液を通し、反応生
成物を試料ホルダー２８へ通す。この工程の間、通気孔
２６は閉じているが、これを開けば反応ガスを系外へ出
すことが出来る。試料ホルダー２８は、典型的には、質
量分析計maLD-TOF３０の高真空大気中への導入に適した
ステンレス鋼又は類似の材料から作られる。試料は、ma
LD-TOFへの導入の前に、窒素、アルゴン又はヘリウム等
の不活性ガスを用いて乾燥させることが出来る。
【００４１】このトランスファー緩衝液は、マトリック
ス援助されたレーザー脱着に必要な成分を含んでいる。
典型的に、及び実施例１に詳述するように、これは、シ
ナピン酸及びインシュリンを水／アセトニトリル緩衝液
中に含んでいる。反応生成物は、トランスファー緩衝液
中に希釈したときに、液体緩衝液を蒸発させることによ
り濃縮すべきであり、それにより、分析物の反応生成物
が中に存在する結晶シナピン酸の薄いフィルムを生じ
る。レーザー脱着は、実施例１に記載したような条件下
で起きる。
【００４２】或は、エレクトロスプレーイオン化ＭＳを
用いてネストしたセットを分析することが出来る。この
場合、試料ホルダー２８を四重極質量分析計に直接結合
するエレクトロスプレーインターフェースで置き換え
る。この技術は、米国特許第４，２０９，６９６号（Fi
te）に一層詳細に説明されており、本明細書中に参考と
して援用する。
【００４３】今やこの発明を一般的に説明したので、同
様のものは、ある特定の例を参照することにより、一層
良く理解されるであろうが、それらは、説明のためにの
みここに含まれるのであって特定のものに限定すること
を意図するものではない。ここで引用するすべての特許
を参考として援用する。
【００４４】
【実施例】実施例１ 配列TTTTCCTCTC−リジンアミドを有する１ミリグラムの
精製ＰＮＡ（デンマークのコペンハーゲン大学のMichae
l Egholm提供）を３００μｌの０．１％トリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）水溶液に溶解させた。２．５μｌのアリコ
ートを取り出し、溶媒を減圧下で蒸発させて除去した。
この乾燥試料に、９５％アセトニトリル水溶液に溶解さ
せた１０ｍｇ／ｍｌの３，５−ジメトキシ−４−ヒドロ
キシ−桂皮酸（Aldrich Chemical, P/N D13,460-0;以
後、シナピン酸という）を含む１０μｌの溶液及び０．
１％ＴＦＡ水溶液中のウシ膵臓からのインシュリン（Si
gmaChemical, P/N I-5500; 以後、インシュリンとい
う）の１ｍｇ／μｌ溶液２．０μｌを加えた。この試料
を混合して１μｌをmaLD-TOF質量分析計の試料ホルダー
に加えた。使用したmaLD-TOF質量分析計は、直線状の５
０ｃｍの飛行チューブ、窒素レーザー（３３７ｎｍ）及
び２重チャンネル検出器を有する原型機であった。関心
あるイオンを３０ｋＶのポテンシャルにかけた。試料の
質量分析を得、且つ既知の質量のシナピン酸及びインシ
ュリンを内部標準として用いて分光計を較正した。この
試料は分解条件にかけなかったので、親ポリマー（［Ｍ
＋Ｈ］＝２７４８）のみが観察された。
【００４５】実施例２ 配列TTTTCCTCTC−リジンアミドを有する１ミリグラムの
精製ＰＮＡを３００μｌの３３％アンモニア水（ｐＨ１
２．５）に溶解させ、その試料を５５℃で１００時間イ
ンキュベートした。２．５μｌのアリコートを取り出
し、溶媒を減圧下で蒸発させて除去した。この乾燥試料
に、９５％アセトニトリル水溶液に溶解させた１０ｍｇ
／ｍｌのシナピン酸を含む１０μｌの溶液を加えた。こ
の試料を混合して１μｌをmaLD-TOF質量分析計の試料ホ
ルダーに加えた。実施例１のmaLD-TOFを用いて試料の質
量分析を得、且つ既知の質量のシナピン酸及び親イオン
を用いて分光計を較正した。
【００４６】１００時間の分解の後にTTTTCCTCTC−リジ
ンアミドの質量分析から得られたスペクトルを図３に与
える。表１には、各型のＰＮＡ末端反復単位についての
公知の質量を列挙してある。表２に、図３に描いたスペ
クトル中に認められた断片の質量を列挙する。
【表２】 Ｎ＝ポリマー中の末端反復単位の数
【００４７】予想されるように、精製した親ポリマーは
２７４７の質量（［Ｍ＋Ｈ］＝２７４８；図３及び表２
を参照されたい）を有している。１分解サイクルを受
け、それにより１末端反復単位を遊離したＮ−１ポリマ
ーは２４８１の質量を有する。親とＮ−１ポリマーとの
間の質量差は２６７である。表１が示すように、カルボ
キシメチルチミン（Ｔ）側鎖を有する末端反復単位は、
最も近い公知質量を有している。この質量分析計はこの
質量範囲内に±１原子質量単位（ＡＭＵ）の誤差限界を
有するので、この残基の割り当てには曖昧さがない。同
様に、Ｎ−２ポリマーは２２１５の質量を有する。従っ
て、Ｎ−１とＮ−２ポリマーとの間の質量差は２６６で
ある。従って、第２の残基も又、カルボキシメチルチミ
ン（Ｔ）側鎖を含む。表２が描くように、この分析を、
配列が解明されるまで続けることが出来る。
【００４８】実施例３ 配列TGACTTT −グリシンアミド（マサチューセッツ州、B
edford, Ashby Road 80 在、 Millipore Corporation か
ら購入したＰＮＡモノマー；A-モノマーP/N GEN063011
、シトシンモノマーP/N GEN063013 、グアニンP/N GEN
063012 及びチミンモノマーP/N GEN063010 を用いてこ
のポリマーを組み立てた。合成プロトコールは、Christ
ensen, L. 等、 Optimized Solid-Phase Synthesis of P
NA Oligomers, 第１３回アメリカンペプチドシンポジウ
ム、ポスター、No.7, 1993年６月20〜23日、カナダ国、
Edmontonに記載された最適条件に従った。）を有する精
製ＰＮＡの１ｍｇの試料を、１００μｌの３３％アンモ
ニア水（ｐＨ１２．５）に溶解させ、その試料を５５℃
で全部で４８時間インキュベートした。２．５μｌのア
リコートを取り出し、溶媒を減圧下で蒸留して除去し
た。この乾燥試料に、９５％アセトニトリル水溶液に溶
解させた１０ｍｇ／ｍｌのシナピン酸を含む１０μｌの
溶液及び０．１％ＴＦＡ水溶液中のインシュリンの１ｍ
ｇ／ｍｌ溶液２．０μｌを加えた。この試料を混合して
１μｌを前述のように操作したmaLD-TOF質量分析計の試
料ホルダーに加えた。試料の質量分析を得、且つ既知の
質量のシナピン酸及びインシュリンを用いて分光計を較
正した。４８時間の分析の後にTGACTTT −グリシンアミ
ドの質量分析から得られたスペクトルを図４に与える。
表３に、図４に描かれたスペクトル中に認められた断片
の質量を列挙する。
【表３】 Ｎ＝ポリマー中の末端反復単位の数
【００４９】予想されるように、親ポリマーは、１９５
８の予想質量（［Ｍ＋Ｈ］＝１９５９）を有した。１分
解サイクルを受け、それにより１末端反復単位を遊離し
たＮ−１ポリマーは１６９２の質量を有した。親とＮ−
１ポリマーとの間の相対的質量の差は２６７であった。
表１が示すように、カルボキシメチルチミン（Ｔ）側鎖
を有する末端反復単位は、正確な質量を有した。同様
に、Ｎ−２ポリマーは１４０１の質量を有した。従っ
て、Ｎ−１とＮ−２ポリマーとの間の質量差は２９１で
あった。従って、第２の残基はカルボキシメチルグアニ
ン（Ｇ）側鎖を含んだ。表３が描くように、この分析を
続けると、第３残基はカルボキシメチルアデニン（Ａ）
を含み、第４残基はカルボキシメチルシトシン（Ｃ）を
含み、第５残基はカルボキシメチルチミン（Ｔ）側鎖を
含んだ。こうして、この実験は、特許請求の範囲に記載
した分解及び配列決定の機構が、ＰＮＡ中に見出される
４種の末端反復単位のすべてについて有効であることを
示した。
【００５０】実施例４配列TGACTTT −ｌｙｓ−ｌｙｓ−
ｌｙｓ−リジンアミド（ここに、ｌｙｓはアミノ酸リジ
ンであり、ペプチド及び次いでＰＮＡ合成化学を用いて
ポリマーを組み立てる）を有する精製ＰＮＡの１ｍｇの
試料を１００μｌの３３％アンモニア水（ｐＨ１２．
５）中に溶解させ、その試料を５５℃で全部で４８時間
インキュベートする。２．５μｌのアリコートを取り出
し、溶媒を減圧下で蒸留して除去する。この乾燥試料
に、９５％アセトニトリル水溶液中に溶解させた１０ｍ
ｇ／ｍｌのシナピン酸を含む１０μｌの溶液及び０．１
％ＴＦＡ水溶液中のインシュリンの１ｍｇ／ｍｌ溶液
２．０μｌを加える。この試料を混合して１μｌを前述
のように操作したmaLD-TOF質量分析計の試料ホルダーに
加える。実施例１のmaLD-TOFを用いて、試料の質量分析
を得、且つシナピン酸及びインシュリンの既知の質量を
用いて分光計を較正する。表４に、ポリマーの分解によ
り生成した断片のネストしたセットの質量スペクトル中
に予想された断片の質量を列挙する。
【表４】 Ｎ＝ポリマー中の末端反復単位の数
【００５１】親ポリマーは予想される質量２４１２
（［Ｍ＋Ｈ］＝２４１３）を有している。１分解サイク
ルを受け、それにより１末端反復単位を遊離したＮ−１
ポリマーは質量２１４６を有する。親とＮ−１ポリマー
との間の質量差は２６６である。表１に示すように、カ
ルボキシメチルチミン（Ｔ）側鎖を有する末端反復単位
は正確な質量を有している。同様に、Ｎ−２ポリマーは
１８５５の質量を有する。従って、Ｎ−１とＮ−２ポリ
マーとの質量差は２９１である。従って、第２の残基は
カルボキシメチルグアニン（Ｇ）側鎖を含む。この分析
を続けると、第３残基はカルボキシメチルアデニン
（Ａ）を含み、第４残基はカルボキシメチルシトシン
（Ｃ）を含み、第５残基はカルボキシメチルチミン
（Ｔ）側鎖を含み、第６残基はカルボキシメチルチミン
（Ｔ）側鎖を含み、第７残基はカルボキシメチルチミン
（Ｔ）側鎖を含む。こうして、質量補償付加物をこのポ
リマーに結合するならば、ポリマーのすべての残基を同
定することが出来る。
【００５２】実施例５ 配列TGACTTT を有する精製ポリエステルの１ｍｇの試料
を１００μｌの０．１Ｍ水性トリフルオロ酢酸アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ２．０）に溶解させ、その試料を５５
℃で全部で５０時間インキュベートする。２．５μｌの
アリコートを取り出し、溶媒を減圧下で蒸発させて除去
する。この乾燥試料に、９５％アセトニトリル水溶液中
に溶解させた１０ｍｇ／ｍｌのシナピン酸を含む１０μ
ｌの溶液及び０．１％ＴＦＡ水溶液中のインシュリンの
１ｍｇ／ｍｌ溶液２．０μｌを加える。この試料を混合
して１μｌをmaLD-TOF質量分光計の試料ホルダーに加え
る。実施例１のmaLD-TOFを用いて、試料の質量分析を
得、且つシナピン酸及びインシュリンの既知の質量を用
いて分光計を較正する。５０時間の分解の後に、ポリエ
ステルTGACTTT の質量スペクトルを得る。表１に、ポリ
エステルの分解により形成される末端反復単位について
の公知の質量を列挙してある。
【００５３】親ポリマーは予想される質量１９０８
（［Ｍ＋Ｈ］＝１９０９）を有している。１分解サイク
ルを受け、それにより１末端反復単位を遊離したＮ−１
ポリマーは１６４２の質量を有する。親とＮ−１ポリマ
ーとの質量差は２６７である。表１に示すように、カル
ボキシメチルチミン（Ｔ）側鎖を有する末端反復単位
は、正確な質量を有する。同様に、Ｎ−２ポリマーは１
３５０の質量を有する。従って、Ｎ−１とＮ−２ポリマ
ーとの間の質量差は２９２である。従って、第２の残基
は、カルボキシメチルグアニン（Ｇ）側鎖を含む。同様
の分析を続けると、第３残基はカルボキシメチルアデニ
ン（Ａ）側鎖を含み、第４残基はカルボキシメチルシト
シン（Ｃ）側鎖を含み、第５残基は再びカルボキシメチ
ルチミン（Ｔ）側鎖を含む。
【００５４】実施例６ 配列TGACTTT を有する精製ポリチオエステルの１ｍｇを
１００μｌの０．１Ｍ水性トリフルオロ酢酸アンモニウ
ム緩衝液（ｐＨ２．０）に溶解させ、その試料を５５℃
で全部で２５時間インキュベートする。２．５μｌのア
リコートを取り出し、溶媒を減圧下で蒸留して除去す
る。この乾燥試料に、９５％アセトニトリル水溶液中に
溶解させた１０ｍｇ／ｍｌのシナピン酸を含む１０μｌ
の溶液及び０．１％ＴＦＡ水溶液中のインシュリンの１
ｍｇ／ｍｌ溶液２．０μｌを加える。この試料を混合し
て１μｌをmaLD-TOF質量分光計の試料ホルダーに加え
る。実施例１のmaLD-TOFを用いて試料の質量分析を得、
シナピン酸及びインシュリンの既知の質量を用いて分光
計を較正する。２５時間の分解の後に、ポリチオエステ
ルTGACTTT の質量スペクトルが得られる。表１には、ポ
リチオエステルの分解により形成される末端反復単位に
ついての公知の質量を列挙してある。
【００５５】親ポリマーは予想される質量２０２０
（［Ｍ＋Ｈ］＝２０２１）を有している。１分解サイク
ルを受け、それにより１末端反復単位を遊離したＮ−１
ポリマーは１７３８の質量を有する。親とＮ−１ポリマ
ーとの間の質量差は２８３である。表１に示すように、
カルボキシメチルチミン（Ｔ）側鎖を有する末端反復単
位は正確な質量を有する。同様に、Ｎ−２ポリマーは質
量１４３０を有する。従って、Ｎ−１とＮ−２ポリマー
との質量差は３０８である。従って、第２の残基はカル
ボキシメチルグアニン（Ｇ）側鎖を含む。この分析を続
けると、第３残基はカルボキシメチルアデニン（Ａ）側
鎖を含み、第４残基はカルボキシメチルシトシン（Ｃ）
側鎖を含み、第５残基はカルボキシメチルチミン（Ｔ）
側鎖を含む。
【００５６】前述の発明は明白さと理解のための説明及
び例示によって説明したが、ある種の変化及び改変をこ
の発明の範囲内で実施し得ることは明白であり、この発
明は前記の特許請求の範囲によってのみ限定されるべき
ものである。例えば、ここに記載したもの以外の質量分
析法もポリマー断片を同定するのに役立ち得るし、この
発明の範囲内に入るものと考えられる。少なくとも５員
を有するもの以外のエネルギー的に有利な環の形成も又
この発明の教示及び範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】公知のＰＮＡの末端求核試薬の攻撃部位を示す
該略図である。
【図２】ＤＮＡ認識のための天然及び非天然のヌクレオ
塩基の化学構造の収集である。
【図３】ＰＮＡ配列TTTTCCTCTC−リジンアミドの部分分
解により生成したポリマー断片のネストしたセットの質
量スペクトルである。
【図４】ＰＮＡ配列TGACTTT −グリシンアミドの部分分
解により生成したポリマー断片のネストしたセットの質
量スペクトルである。
【図５】この発明の方法を実施するための装置の該略図
である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 15/09

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリマーの主鎖の反復単位の少なくとも
    一部を順次的に分解する方法であって、該ポリマーが求
    核試薬及び該求核試薬から離れた主鎖カルボニル炭素か
    らなる末端反復単位を有し、下記の工程を含む当該方
    法： （ａ）該求核試薬の該主鎖カルボニル炭素への攻撃を、
    エネルギーレベルを上げて該求核試薬を該攻撃のために
    活性化することによって開始し、 （ｂ）該末端反復単位を含む環を形成し、それにより同
    時に該環を遊離し且つ該主鎖カルボニル炭素への求核攻
    撃が可能な末端反復単位を有する短くなったポリマーを
    生成し、そして、 （ｃ）所望のポリマー部分が分解するまで工程ａ及びｂ
    を反復するために必要な反応条件を維持する。
  2. 【請求項２】 前記のポリマーがペプチド核酸である、
    請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記のポリマーを、ポリアミド、ポリエ
    ステル又はポリチオエステルからなる群より選択する、
    請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記のポリマーが、不均一な主鎖を有す
    るポリマーからなり、主鎖の機能的結合をアミド、エス
    テル及びチオエステルからなる群より選択する、請求項
    １に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記の主鎖の反復単位が２−アミノエチ
    ルグリシンである、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記の主鎖の反復単位が２−ヒドロキシ
    エチルグリシンである、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記の主鎖の反復単位が２−チオエチル
    グリシンである、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記の求核試薬がアミノ基である、請求
    項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記の求核試薬がヒドロキシル基であ
    る、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記の求核試薬がチオール基である、
    請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記のカルボニル炭素原子が前記の求
    核試薬から少なくとも４原子離れている、請求項１に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記のポリマーが下記の一般式のもの
    である、請求項１に記載の方法： 【化１】 ｛式中、各Ｖは、独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2 及びＮＨ
    Ｒからなる群より選択し、各Ｗは、同一であるか又は異
    なっていて、Ｈ、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨＲ、ＮＲ2、
    Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群より選択し、各Ｙ1 〜
    Ｙq-1 は、同一であるか又は異なっていて、Ｏ、Ｓ、Ｎ
    Ｈ及びＮＲからなる群より独立に選択し、各Ｚは、独立
    に、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ2 、ＮＨＲ、ＮＲ2 、ＳＨ、
    ＳＲ、２０種類の天然アミノ酸の内の何れか、ポリペプ
    チド、蛋白質、ＤＮＡオリゴマー及びＲＮＡオリゴマ
    ー、ビオチン及びフルオレセインからなる群より選択し
    （各Ｒは、同一であるか又は異なっていて、１〜５炭素
    原子を有するアルキル基であり、適宜、ヘテロ原子又は
    置換された若しくは置換されていないアリール基を含ん
    で良い）、各Ａ1 〜Ａq は、単結合、次式の基 【化２】 及び次式の基 【化３】 （ここに、Ｗは上で定義した通りであり、各ｓは１〜５
    の整数である）からなる群より選択し、各Ｌ1 〜Ｌq は
    同一であるか又は異なっていて、独立に、Ｗ、アデニ
    ン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジン、５−メチ
    ルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロ
    ロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、
    その他の天然のヌクレオ塩基アナログ、その他の非天然
    ヌクレオ塩基、置換された若しくは置換されていない芳
    香族部分、ビオチン及びフルオレセインからなる群より
    選択し、 ｎ＝１〜２ ｍ＝１〜２（但し、ｍはｎと等しくない） ｐ＝０〜１，０００，０００ である｝。
  13. 【請求項１３】 攻撃の開始が、第１に、末端ブロック
    された親ポリマーの末端求核試薬のデブロッキングを含
    む、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 エネルギーレベルを上げることが、前
    記のポリマーの直接の環境の温度を実質的な求核攻撃が
    始まるまで高めることを含む、請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 エネルギーレベルを上げることが、前
    記のポリマーの直接の環境のｐＨを実質的な攻撃が始ま
    るまで調節することを含む、請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 エネルギーレベルを上げることが、実
    質的な求核攻撃が始まるまでポリマーの直接の環境のｐ
    Ｈを調節すること及び温度を高めることの両者を含む、
    請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ポリマーの主鎖の反復単位の少なくと
    も一部分を配列決定する方法であって、該ポリマーが求
    核試薬及び該求核試薬から離れた主鎖カルボニル炭素か
    らなる末端反復単位を有し、下記の工程を含む当該方
    法： （ａ）該求核試薬の該主鎖カルボニル炭素への攻撃を、
    エネルギーレベルを上げて該求核試薬を該攻撃のために
    活性化することによって開始させ、 （ｂ）該末端反復単位を含む環を形成し、それにより同
    時に該環を遊離し且つ該主鎖カルボニル炭素への求核攻
    撃が可能な末端反復単位を有する短くなったポリマーを
    生成し、 （ｃ）工程ａ及びｂを含む分解サイクルを反復するため
    に必要な反応条件を維持し、それによりポリマー断片の
    ネストしたセットを生成し、各断片はＮ−ｘ反復単位を
    有し（ここに、Ｎは親ポリマー中の反復単位の総数であ
    り、ｘはポリマーが受けた分解サイクルの回数であ
    る）、そして、 （ｄ）該ポリマー断片のネストしたセットを分析してポ
    リマーの配列を決定する。
  18. 【請求項１８】 前記のポリマーがペプチド核酸であ
    る、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記のポリマーを、ポリアミド、ポリ
    エステル又はポリチオエステルからなる群より選択す
    る、請求項１７に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記のポリマーが、不均一な主鎖を有
    するポリマーからなり、主鎖の機能的結合を、アミド、
    エステル及びチオエステルからなる群より選択する、請
    求項１７に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記の主鎖の反復単位が２−アミノエ
    チルグリシンである、請求項１７に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記の主鎖の反復単位が２−ヒドロキ
    シエチルグリシンである、請求項１７に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記の主鎖の反復単位が２−チオエチ
    ルグリシンである、請求項１７に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記の求核試薬がアミノ基である、請
    求項１７に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記の求核試薬がヒドロキシル基であ
    る、請求項１７に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記の求核試薬がチオール基である、
    請求項１７に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記のカルボニル炭素が前記の求核試
    薬から少なくとも４原子離れている、請求項１７に記載
    の方法。
  28. 【請求項２８】 前記のポリマーが下記の一般式のもの
    である、請求項１７に記載の方法： 【化４】 ｛式中、各Ｖは、独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2 及びＮＨ
    Ｒからなる群より選択し、各Ｗは、同一であるか又は異
    なっていて、Ｈ、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨＲ、ＮＲ2、
    Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群より選択し、各Ｙ1 〜
    Ｙq-1 は、同一であるか又は異なっていて、Ｏ、Ｓ、Ｎ
    Ｈ及びＮＲからなる群より独立に選択し、各Ｚは、独立
    に、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ2 、ＮＨＲ、ＮＲ2 、ＳＨ、
    ＳＲ、２０種類の天然アミノ酸の内の何れか、ポリペプ
    チド、蛋白質、ＤＮＡオリゴマー及びＲＮＡオリゴマー
    からなる群より選択し（各Ｒは、同一であるか又は異な
    っていて、１〜６炭素原子を有するアルキル基であり、
    適宜、ヘテロ原子又は置換された若しくは置換されてい
    ないアリール基を含んで良い）、各Ａ1 〜Ａq は、単結
    合、次式の基 【化５】 及び次式の基 【化６】 （ここに、Ｗは上で定義した通りであり、各ｓは１〜５
    の整数である）からなる群より選択し、各Ｌ1 〜Ｌq は
    同一であるか又は異なっていて、独立に、Ｗ、アデニ
    ン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジン、５−メチ
    ルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロ
    ロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、
    その他の天然のヌクレオ塩基アナログ、その他の非天然
    ヌクレオ塩基、置換された若しくは置換されていない芳
    香族部分、ビオチン、フルオレセイン及びその他のレポ
    ーターリガンドからなる群より選択し、 ｎ＝１〜２ ｍ＝１〜２（但し、ｍはｎと等しくない） ｐ＝０〜１，０００，０００ である｝。
  29. 【請求項２９】 攻撃の開始が、第１に、末端ブロック
    された親ポリマーの末端求核試薬のデブロッキングを含
    む、請求項１７に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 エネルギーレベルを上げることが、前
    記のポリマーの直接の環境の温度を実質的な求核攻撃が
    始まるまで高めることを含む、請求項１７に記載の方
    法。
  31. 【請求項３１】 エネルギーレベルを上げることが、前
    記のポリマーの直接の環境のｐＨを実質的な求核攻撃が
    始まるまで調節することを含む、請求項１７に記載の方
    法。
  32. 【請求項３２】 エネルギーレベルを上げることが、実
    質的な求核攻撃が始まるまでポリマーの直接の環境のｐ
    Ｈを調節すること及び温度を高めることの両者を含む、
    請求項１７に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 ポリマー断片のネストしたセットの分
    析を質量分析により行なう、請求項１７に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 質量分析計がマトリックス援助された
    レーザー脱着飛行時間（maLD-TOF）質量分析計である、
    請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 ポリマーの配列決定が下記の工程を含
    む、請求項１７に記載の方法： （ａ）２つのＮ−ｘポリマー断片の間の質量差を計算
    し、 （ｂ）該質量差を末端反復単位についての公知の質量の
    表と比較し、それにより、遊離した末端反復単位を同定
    し、そして、 （ｃ）配列が決定されるまで、工程ａ及びｂを反復す
    る。
  36. 【請求項３６】 ポリマーの主鎖の反復単位の少なくと
    も一部分を配列決定するための装置であって、該ポリマ
    ーが求核試薬及び該求核試薬から離れた主鎖カルボニル
    炭素を含む末端反復単位を有し、下記の手段を含む当該
    装置： （ａ）該求核試薬の該主鎖カルボニル炭素への攻撃を、
    エネルギーレベルを上げることにより該求核試薬を該攻
    撃のために活性化することによって開始させる手段、 （ｂ）該末端反復単位を含む環を形成し、それにより同
    時に該環を遊離し且つ該主鎖カルボニル炭素への求核攻
    撃が可能な末端反復単位を有する短くなったポリマーを
    生成する手段、 （ｃ）工程ａ及びｂを含む分解サイクルを反復するため
    に必要な反応条件を維持し、それによりポリマー断片の
    ネストしたセットを生成する手段（各断片はＮ−ｘ反復
    単位を有し、ここに、Ｎは親ポリマー中の反復単位の総
    数であり、ｘはポリマーが受けた分解サイクルの回数で
    ある）、及び （ｄ）該ポリマー断片のネストしたセットを分析してポ
    リマーの配列を決定する手段。
  37. 【請求項３７】 前記のポリマーがペプチド核酸であ
    る、請求項３６に記載の装置。
JP6215243A 1993-08-20 1994-08-18 末端残基を順次除去するポリマーの分解及び配列決定のための方法及び装置 Withdrawn JPH07213298A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/109,548 US5527675A (en) 1993-08-20 1993-08-20 Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues
US109548 1993-08-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH07213298A true JPH07213298A (ja) 1995-08-15

Family

ID=22328250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6215243A Withdrawn JPH07213298A (ja) 1993-08-20 1994-08-18 末端残基を順次除去するポリマーの分解及び配列決定のための方法及び装置

Country Status (4)

Country Link
US (1) US5527675A (ja)
EP (1) EP0639607B1 (ja)
JP (1) JPH07213298A (ja)
DE (1) DE69407691T2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998033939A1 (fr) * 1997-01-31 1998-08-06 Hitachi, Ltd. Procede pour determiner une sequence de base d'acide nucleique et appareil correspondant

Families Citing this family (172)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1130399B1 (en) * 1992-05-29 2009-04-01 The Rockefeller University Method for the sequence determination of peptides using a mass spectrometer
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
US6194144B1 (en) 1993-01-07 2001-02-27 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry
DE4408533A1 (de) 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag PNA-Synthese unter Verwendung einer basenlabilen Amino-Schutzgruppe
US6428955B1 (en) 1995-03-17 2002-08-06 Sequenom, Inc. DNA diagnostics based on mass spectrometry
US5830655A (en) 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US6022688A (en) * 1996-05-13 2000-02-08 Sequenom, Inc. Method for dissociating biotin complexes
US5886165A (en) * 1996-09-24 1999-03-23 Hybridon, Inc. Mixed backbone antisense oligonucleotides containing 2'-5'-ribonucleotide- and 3'-5'-deoxyribonucleotides segments
ATE375403T1 (de) * 1996-11-06 2007-10-15 Sequenom Inc Dna-diagnostik mittels massenspektrometrie
US6140053A (en) * 1996-11-06 2000-10-31 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
US6133436A (en) 1996-11-06 2000-10-17 Sequenom, Inc. Beads bound to a solid support and to nucleic acids
DK0937096T3 (da) 1996-11-06 2004-06-14 Sequenom Inc Fremgangsmåde til massespektrometri-analyse
US6110676A (en) * 1996-12-04 2000-08-29 Boston Probes, Inc. Methods for suppressing the binding of detectable probes to non-target sequences in hybridization assays
GB9710582D0 (en) 1997-05-22 1997-07-16 Oxford Glycosciences Uk Ltd A method for de novo peptide sequence determination
US6962778B1 (en) 1997-09-25 2005-11-08 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for suppressing the binding of detectable probes to non-target sequences in hybridization assays
US6355421B1 (en) 1997-10-27 2002-03-12 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to PNA molecular beacons
US6485901B1 (en) 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
US6268131B1 (en) 1997-12-15 2001-07-31 Sequenom, Inc. Mass spectrometric methods for sequencing nucleic acids
US6326479B1 (en) 1998-01-27 2001-12-04 Boston Probes, Inc. Synthetic polymers and methods, kits or compositions for modulating the solubility of same
WO1999049293A2 (en) 1998-03-24 1999-09-30 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to detection complexes
US6723564B2 (en) 1998-05-07 2004-04-20 Sequenom, Inc. IR MALDI mass spectrometry of nucleic acids using liquid matrices
US7981599B1 (en) 1998-07-31 2011-07-19 Boston Probes, Inc. Non-nucleic acid probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection of individual human chromosomes X, Y, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18 and 20 as 13/21 as a pair
US6441152B1 (en) * 1998-12-08 2002-08-27 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for the identification of nucleic acids electrostatically bound to matrices
EP1274410A2 (en) 2000-03-31 2003-01-15 Trustees Of Boston University Use of locally applied dna fragments
US6451588B1 (en) * 2000-06-30 2002-09-17 Pe Corporation (Ny) Multipartite high-affinity nucleic acid probes
US6963807B2 (en) 2000-09-08 2005-11-08 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. Automated identification of peptides
US20020090626A1 (en) 2000-09-26 2002-07-11 Hyldig-Nielsen Jens J. Probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection, identification and/or enumeration of bacteria
EP1356113B1 (en) * 2000-12-15 2012-07-18 Life Technologies Corporation Methods for determining organisms
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US20040121310A1 (en) * 2002-12-18 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in forensic studies
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US20040121311A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US7718354B2 (en) * 2001-03-02 2010-05-18 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US20040121314A1 (en) * 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in containers
DE60216468T2 (de) * 2001-03-09 2007-09-27 Boston Probes, Inc., Bedford Kombinationsoligomere betreffende verfahren, kits und zusammensetzungen
AU2002257284A1 (en) 2001-05-18 2002-12-03 Boston Probes, Inc. Pna probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection of candida
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
US6800449B1 (en) * 2001-07-13 2004-10-05 Syngenta Participations Ag High throughput functional proteomics
EP1432826B1 (en) * 2001-09-24 2012-12-12 Life Technologies Corporation Methods, kits and compositions pertaining to the suppression of detectable probe binding to randomly distributed repeat sequences in genomic nucleic acid
WO2003080857A2 (en) * 2002-03-21 2003-10-02 Boston Probes,Inc. Pna oligomers, oligomers sets, methods and kits pertaining to the detection of bacillus anthracis
US20030211509A1 (en) * 2002-03-26 2003-11-13 Wiley Steven R. TNF-delta ligand and uses thereof
US20040005611A1 (en) * 2002-05-17 2004-01-08 Hyldig-Nielsen Jens J. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the determination of Listeria
US20040137469A1 (en) 2002-09-08 2004-07-15 Casale Ralph A Methods, compositions and libraries pertaining PNA dimer and PNA oligomer synthesis
US20040259132A1 (en) * 2002-11-22 2004-12-23 Henrik Stender Peptide nucleic acid probes for analysis of pseudomonas (sensu stricto)
CA2508726A1 (en) 2002-12-06 2004-07-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
AU2003299818A1 (en) 2002-12-20 2004-07-22 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction, methods of detection and uses thereof
US8046171B2 (en) 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US20120122102A1 (en) 2003-09-11 2012-05-17 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of bacteria
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
CA3048093A1 (en) 2003-11-26 2005-06-23 Celera Corporation Single nucleotide polymorphisms associated with cardiovascular disorders and statin response, methods of detection and uses thereof
US7666592B2 (en) * 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
WO2005111235A2 (en) * 2004-05-04 2005-11-24 Dak Denmark A/S Methods for detecting chromosome aberrations
EP2412826B1 (en) 2004-05-07 2014-01-08 Celera Corporation Genetic polymorphism associated with liver fibrosis methods of detection and uses thereof
US7714275B2 (en) 2004-05-24 2010-05-11 Ibis Biosciences, Inc. Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
WO2006016978A1 (en) * 2004-06-30 2006-02-16 Applera Corporation Analog probe complexes
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
WO2006135400A2 (en) 2004-08-24 2006-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of recombinant organisms
EP1836317A2 (en) * 2004-12-06 2007-09-26 BioVeris Corporation Methods and compositions for detecting bacillus anthracis
US20060292586A1 (en) * 2004-12-17 2006-12-28 Schroth Gary P ID-tag complexes, arrays, and methods of use thereof
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
EP1869180B1 (en) 2005-03-03 2013-02-20 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of polyoma viruses
JP5590697B2 (ja) 2005-03-11 2014-09-17 セレラ コーポレーション 冠動脈心疾患に関連する遺伝的多型、その検出方法および使用
AU2006252346B2 (en) 2005-06-02 2012-06-28 Advandx, Inc. Peptide nucleic acid probes for analysis of microorganisms
EP1919930B1 (en) 2005-07-01 2016-09-14 Dako Denmark A/S New nucleic acid base pairs
JP2009502137A (ja) 2005-07-21 2009-01-29 アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド 核酸変種の迅速な同定および定量のための方法
US7799530B2 (en) 2005-09-23 2010-09-21 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof
EP1785490B1 (en) * 2005-10-17 2007-11-14 RiNA Netzwerk RNA-Technologien GmbH Method for determining an unknown PNA sequence and uses thereof
US20070172842A1 (en) * 2006-01-25 2007-07-26 Andreas Braun Methods for isolating and identifying novel target-specific structuremers for use in the biological sciences
US9388462B1 (en) * 2006-05-12 2016-07-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University DNA sequencing and approaches therefor
US9149473B2 (en) 2006-09-14 2015-10-06 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
WO2008051511A2 (en) 2006-10-20 2008-05-02 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis, methods of detection and uses thereof
EP2069525A1 (en) * 2006-12-29 2009-06-17 Applied Biosystems, LLC Systems and methods for detecting nucleic acids
EP2118310B1 (en) * 2006-12-29 2013-03-06 Applied Biosystems, LLC Systems and methods for detecting nucleic acids
US20100172882A1 (en) * 2007-01-11 2010-07-08 Glazer Peter M Compositions and methods for targeted inactivation of hiv cell surface receptors
WO2008104002A2 (en) 2007-02-23 2008-08-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic dna analysis
US20120115131A1 (en) 2007-05-31 2012-05-10 Yale University Genetic lesion associated with cancer
US9598724B2 (en) 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
EP3023436A1 (en) 2007-07-03 2016-05-25 Dako Denmark A/S Improved methods for generation, labeling and use of mhc multimers
US8039212B2 (en) 2007-11-05 2011-10-18 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with liver fibrosis, methods of detection and uses thereof
US20090221620A1 (en) 2008-02-20 2009-09-03 Celera Corporation Gentic polymorphisms associated with stroke, methods of detection and uses thereof
CN102046808B (zh) 2008-05-27 2017-05-17 丹麦达科有限公司 使用新的杂交缓冲液用于检测染色体畸变的组合物和方法
JP2011521649A (ja) 2008-05-30 2011-07-28 イェール ユニバーシティー 遺伝子発現を改変するための標的化オリゴヌクレオチド組成物
EP3093351B1 (en) 2008-07-09 2018-04-18 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
US8550694B2 (en) 2008-09-16 2013-10-08 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods
WO2010033625A1 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and related computer program products and methods
WO2010033627A2 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
EP2396803A4 (en) 2009-02-12 2016-10-26 Ibis Biosciences Inc IONIZATION PROBE ASSEMBLIES
US9303287B2 (en) 2009-02-26 2016-04-05 Dako Denmark A/S Compositions and methods for RNA hybridization applications
US8309356B2 (en) * 2009-04-01 2012-11-13 Yale University Pseudocomplementary oligonucleotides for targeted gene therapy
AU2010265889A1 (en) 2009-06-25 2012-01-19 Yale University Single nucleotide polymorphisms in BRCA1 and cancer risk
US8950604B2 (en) 2009-07-17 2015-02-10 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
WO2011008972A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Systems for bioagent identification
WO2011027219A1 (en) 2009-09-04 2011-03-10 Progenika Biopharma, S.A. High throughput detection of small genomic deletions and insertions
US20120215459A1 (en) 2009-09-04 2012-08-23 Marianne Stef High throughput detection of genomic copy number variations
ES2628739T3 (es) 2009-10-15 2017-08-03 Ibis Biosciences, Inc. Amplificación por desplazamiento múltiple
US20110268810A1 (en) 2009-11-02 2011-11-03 Yale University Polymeric materials loaded with mutagenic and recombinagenic nucleic acids
US8445228B2 (en) * 2009-11-16 2013-05-21 Massachusetts Institute Of Technology Enhancement of in vitro translation by nanoparticle conjugates
US20130040294A1 (en) 2009-12-02 2013-02-14 Steen H. Matthiesen Compositions and methods for performing hybridizations with no denaturation
US9404160B2 (en) 2009-12-22 2016-08-02 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of microorganisms
US9714446B2 (en) * 2010-02-11 2017-07-25 Nanostring Technologies, Inc. Compositions and methods for the detection of small RNAs
US20110269735A1 (en) 2010-04-19 2011-11-03 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with statin response and cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
US20110262406A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Yale University Compositions and methods for targeted inactivation of hiv cell surface receptors
US20110293585A1 (en) 2010-04-21 2011-12-01 Helix Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of lysosomal storage disorders
US20120108651A1 (en) 2010-11-02 2012-05-03 Leiden University Medical Center (LUMC) Acting on Behalf of Academic Hospital Leiden (AZL) Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis and statin response, methods of detection and uses thereof
WO2012109363A2 (en) 2011-02-08 2012-08-16 The Johns Hopkins University Mucus penetrating gene carriers
WO2013044116A1 (en) 2011-09-21 2013-03-28 Yale University Antimicrobial compositions and methods of use thereof
EP2761028A1 (en) 2011-09-30 2014-08-06 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods using formamide
EP3252173A1 (en) 2011-10-21 2017-12-06 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods
US10465042B2 (en) 2011-12-02 2019-11-05 Yale University Poly(amine-co-ester) nanoparticles and methods of use thereof
US9895451B2 (en) 2011-12-02 2018-02-20 Yale University Formulations for targeted release of agents to low pH tissue environments or cellular compartments and methods of use thereof
WO2013082529A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Yale University Enzymatic synthesis of poly(amine-co-esters) and methods of use thereof for gene delivery
JP6375289B2 (ja) 2012-04-05 2018-08-15 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 免疫刺激組成物およびその使用方法
WO2014033314A1 (en) 2012-09-03 2014-03-06 Uab Bioseka Antisense oligonucleotide targeting bacterial glucosyltransferases
EP2929050A1 (en) 2012-12-10 2015-10-14 AdvanDx, Inc. Use of probes for mass spectrometric identification of microorganisms or cells and associated conditions of interest
WO2014113802A1 (en) 2013-01-18 2014-07-24 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. TARGETED SENSITIZATION OF NON-DEL(5q) MALIGNANT CELLS
CA2904440C (en) 2013-03-15 2021-09-07 Techulon Inc. Antisense molecules for treatment of staphylococcus aureus infection
CA2906663A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Techulon Inc. Antisense molecules for treatment of staphylococcus aureus infection
KR20240042200A (ko) 2013-09-11 2024-04-01 이글 바이오로직스 인코퍼레이티드 점도저하제를 함유하는 액체 단백질 제형
LT6214B (lt) 2013-10-07 2015-08-25 Uab "Bioseka" Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai
CA2927358C (en) 2013-10-16 2021-12-21 The University Of British Columbia Device for formulating particles at small volumes
ES2908345T3 (es) 2013-11-03 2022-04-28 Univ California Líquidos iónicos para la administración transdérmica de medicamentos
WO2015172153A1 (en) 2014-05-09 2015-11-12 Yale University Topical formulation of hyperbranched polyglycerol-coated particles thereof
US11918695B2 (en) 2014-05-09 2024-03-05 Yale University Topical formulation of hyperbranched polymer-coated particles
WO2015175539A1 (en) 2014-05-12 2015-11-19 The Johns Hopkins University Engineering synthetic brain penetrating gene vectors
US10335500B2 (en) 2014-05-12 2019-07-02 The Johns Hopkins University Highly stable biodegradable gene vector platforms for overcoming biological barriers
KR102497368B1 (ko) 2014-10-01 2023-02-10 이글 바이올로직스 인코포레이티드 점도-저하제를 함유하는 폴리삭카라이드 및 핵산 제형
US10682422B2 (en) 2014-11-18 2020-06-16 Yale University Formulations for targeted release of agents under low pH conditions and methods of use thereof
WO2016081621A1 (en) 2014-11-18 2016-05-26 Yale University Formulations for targeted release of agents under low ph conditions and methods of use thereof
WO2016168197A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Yale University Compositions for enhancing delivery of agents across the blood brain barrier and methods of use thereof
CA3009691C (en) 2016-01-06 2021-12-07 The University Of British Columbia Bifurcating mixers and methods of their use and manufacture
US10894985B2 (en) 2016-01-12 2021-01-19 Sitokine Limited Methods for predicting response to treatment
CA3014795A1 (en) 2016-02-16 2017-08-24 Yale University Compositions and methods for treatment of cystic fibrosis
US11136597B2 (en) 2016-02-16 2021-10-05 Yale University Compositions for enhancing targeted gene editing and methods of use thereof
AU2017224226A1 (en) 2016-02-26 2018-09-20 Yale University Compositions and methods of using piRNAs in cancer diagnostics and therapeutics
US20190117799A1 (en) 2016-04-01 2019-04-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications
WO2017197128A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Yale University Poly(amine-co-ester) nanoparticles and methods of use thereof
JP7179354B2 (ja) 2016-08-29 2022-11-29 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 皮膚処置のためのイオン種に基づく局所処方物
EP3519578B1 (en) 2016-10-03 2021-12-22 Precision Nanosystems Inc Compositions for transfecting resistant cell types
WO2018112470A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes
CN110121364A (zh) 2016-12-19 2019-08-13 文塔纳医疗系统公司 肽核酸缀合物
US10329620B2 (en) 2017-01-12 2019-06-25 Cardioforecast Ltd. Methods and kits for treating cardiovascular disease
WO2018187493A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Yale University Compositions and methods for in utero delivery
US11077199B2 (en) 2017-08-09 2021-08-03 Massachusetts Institute Of Technology Albumin binding peptide conjugates and methods thereof
US10953036B2 (en) 2017-11-20 2021-03-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of modulating HIF-2A to improve muscle generation and repair
EP3727470A1 (en) 2017-12-18 2020-10-28 Ventana Medical Systems, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
WO2019139997A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Trucode Gene Repair, Inc. Polymer-based nanoparticles, related formulation methods, and apparatus
US20210315820A1 (en) 2018-07-30 2021-10-14 Trucode Gene Repair, Inc. Lipid nanoparticle formulations comprising nucleic acid mimics
EP3830278A4 (en) 2018-08-01 2022-05-25 University of Georgia Research Foundation, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING EMBRYO DEVELOPMENT
US20210189431A1 (en) 2018-08-10 2021-06-24 Yale University Compositions and methods for embryonic gene editing in vitro
US20210338815A1 (en) 2018-08-31 2021-11-04 Yale University Compositions and methods for enhancing triplex and nuclease-based gene editing
WO2020112195A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Yale University Compositions, technologies and methods of using plerixafor to enhance gene editing
US11814464B2 (en) 2019-04-29 2023-11-14 Yale University Poly(amine-co-ester) polymers and polyplexes with modified end groups and methods of use thereof
US20220249660A1 (en) 2019-06-06 2022-08-11 Sitokine Limited Compositions and methods for treating lung, colorectal and breast cancer
US20220243211A1 (en) 2019-06-21 2022-08-04 Yale University Peptide nucleic acid compositions with modified hoogsteen binding segments and methods of use thereof
US20220372474A1 (en) 2019-06-21 2022-11-24 Yale University Hydroxymethyl-modified gamma-pna compositions and methods of use thereof
WO2021022161A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Yale University Compositions and methods for treating sickle cell disease
WO2021028469A1 (en) 2019-08-12 2021-02-18 Sitokine Limited Compositions and methods for treating cytokine release syndrome and neurotoxicity
US20230227583A1 (en) 2019-08-30 2023-07-20 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
WO2021205013A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Sitokine Limited Compositions and methods for treating covid-19
MX2022016581A (es) 2020-06-19 2023-02-01 Univ Yale Polimeros de poli(amina-co-ester) con grupos de extremo modificado y liberacion pulmonar mejorada.
AU2021331785A1 (en) 2020-08-31 2023-03-30 Gennao Bio, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
CN112557640B (zh) * 2020-12-28 2022-07-19 中蓝晨光化工有限公司 一种缩合型硅树脂取代度的测试方法
WO2023159189A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Yale University Branched poly(amine-co-ester) polymers for more efficient nucleic expression
WO2024081736A2 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Yale University Compositions and methods of using cell-penetrating antibodies

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5011861A (en) * 1988-06-28 1991-04-30 Millipore Corporation Membranes for solid phase protein sequencing
DK51092D0 (da) * 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
MX9207334A (es) * 1991-12-18 1993-08-01 Glaxo Inc Acidos nucleicos peptidicos y formulacion farma- ceutica que los contiene
AU5827294A (en) * 1992-12-11 1994-07-04 Chiron Corporation Synthesis of encoded polymers

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998033939A1 (fr) * 1997-01-31 1998-08-06 Hitachi, Ltd. Procede pour determiner une sequence de base d'acide nucleique et appareil correspondant

Also Published As

Publication number Publication date
EP0639607B1 (en) 1998-01-07
EP0639607A3 (en) 1996-07-03
EP0639607A2 (en) 1995-02-22
DE69407691D1 (de) 1998-02-12
US5527675A (en) 1996-06-18
DE69407691T2 (de) 1998-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH07213298A (ja) 末端残基を順次除去するポリマーの分解及び配列決定のための方法及び装置
US6225450B1 (en) DNA sequencing by mass spectrometry
CA2403114C (en) Mass labels
US6436640B1 (en) Use of LNA in mass spectrometry
US6140053A (en) DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
US6074823A (en) DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
US6635452B1 (en) Releasable nonvolatile mass label molecules
JP7032383B2 (ja) ナノポア検出にとって有用なタグ付きヌクレオチド
AU2001240834A1 (en) Mass labels
JPH08507926A (ja) エキソヌクレアーゼ分解を介した質量分析法によるｄｎａ配列決定
CN1413263A (zh) 表面上带有pna和/或dna寡聚物的寡聚物阵列
JP2002535011A (ja) ゲノムｄｎａプローブにおけるシトシン−メチル化型の確認法
JP2001509393A (ja) 核酸の特性決定
KR100811331B1 (ko) 폴리뉴클레오티드의 분석 방법
WO1999029897A1 (de) Verfahren zur identifikation von nucleinsäuren durch elektrospray massenspektrometrie
EP0721458B1 (en) Biopolymer synthesis utilizing surface activated, organic polymers
EP1015632A1 (en) Characterising nucleic acid by mass spectrometry
AU738203B2 (en) DNA sequencing by mass spectrometry
Ball A mass spectrometry based hybridisation assay for single nucleotide polymorphism analysis
Bentzley Characterization of the sequences and structures of oligonucleotide strands using matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20011106