JP2002535011A

JP2002535011A - ゲノムｄｎａプローブにおけるシトシン−メチル化型の確認法

Info

Publication number: JP2002535011A
Application number: JP2000596174A
Authority: JP
Inventors: オレク，アレクサンダ
Original assignee: エピゲノミクスアーゲー
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2002-10-22
Also published as: DE19905082C1; US6977146B1; CA2359182A1; EP1147228A2; ES2208285T3; IL144374A0; DE10080169D2; ATE252159T1; WO2000044934A3; AU764683B2; DE50004066D1; AU3144700A; WO2000044934A2; EP1147228B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ゲノムＤＮＡプローブにおけるシトシン−メチル化型の確認法に関する。【解決手段】ａ）ゲノムＤＮＡプローブを化学的に処理してシトシンと５−メチルシトシンとが異なって反応するようにし、両生成物の異なる塩基対挙動が二重に得られ；ｂ）このように処理したＤＮＡプローブの部分を酵素的に増幅し；ｃ）このように処理したＤＮＡプローブの増幅部分を表面に結合させ；ｄ）それぞれ少なくとも一つのジヌクレオチド配列５’−ＣｐＧ−３’を含む異なるヌクレオ塩基配列のゾンデの一組を、固定されたＤＮＡプローブにハイブリッド化し；ｅ）ハイブリッド化しなかったゾンデを除去し；ｆ）ハイブリッド化したゾンデを質量分析計で分析し、その際プローブ担体上のゾンデの位置はハイブリッド化されるＤＮＡプローブに前記ゾンデが付くことができるような位置であり；ｇ）質量スペクトルから得られるピーク型をメチル化型に重ね、新しいデータをデータバンクのそれと合わせる諸段階を特徴とする方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はゲノムＤＮＡプローブにおけるシトシン−メチル化型の確認法に関す
るものである。

【０００２】ゲノムＤＮＡを塩基列として完全に配列決定することによって得られる遺伝情
報は、１個の細胞のゲノムを完全に説明するには不十分である。細胞内のＤＮＡ
の可逆的メチル化によって生成する５−メチルシトシン核酸塩基は一つの後成的
情報担体であり、例えばプロモーターの調節に役立つ。ゲノムのメチル化状態は
ｍＲＮＡ発現型と同様に遺伝子の発現状態をあらわす。

【０００３】５−メチルシトシンは真核細胞のＤＮＡに最もしばしばあらわれる共有結合改
質塩基である。それは例えば転写、ゲノムの刷り込みの調節に、そして腫瘍発生
に或る役割を演ずる。そのため遺伝情報の成分としての５−メチルシトシンの確
認は非常に興味深い。しかし５−メチルシトシンの位置は塩基配列決定によって
は確認することができない。なぜならば５−メチルシトシンはシトシンと同様の
塩基対−挙動をとるからである。その上、ＰＣＲ増幅の際には５−メチルシトシ
ンが担っている後成的情報が完全に失われる。

【０００４】これらの問題を解決するために研究されている幾つかの方法は公知である。大
ていの場合、ゲノムＤＮＡの化学反応または酵素処理が行われ、その結果処理さ
れたシトシン塩基はメチルシトシン塩基から区別される。広く用いられている方
法は重亜硫酸塩によるゲノムＤＮＡの置換である。これは２段階で行われ、アル
カリ性加水分解後、シトシン塩基はウラシルに変換される（シャピロ（Shapiro,
R.）、コーエン（Cohen,B.）、サービス（Servis,R.） Nature ２２７巻、１０
４７ページ（１９７０））。５−メチルシトシンはこの条件のもとでは変化しな
い。Ｃ（シトシン）からＵ（ウラシル）への変換は塩基配列の変化を伴い、その
後の配列決定によって元々の５−メチルシトシンが明らかにされる（これだけが
Ｃ−痕跡量のバンドを与える）。

【０００５】５−メチルシトシンを証明する他の公知の可能性を展望してみると、例えば次
の総括的研究が挙げられる：ライン（Rein,T.）、デパンフィリス（DePamphilli
s,M.L.）、ゾルバス（Zorbas,H.）、核酸研究（Nucleic Acids Res.）、２６巻
、２２５５ページ（１９９８）等。

【０００６】重亜硫酸塩法はこれまで、わずかな例外（例えばゼシュニク（Zeschnigk,M.）
ら、Eur.J.Hum.Gen. ５巻、９４−９８ページ；クボタ（Kubota T.）ら Nat.Gen
et.１６巻、１６−１７ページ）を除いて研究分野だけで使用されている。重亜
硫酸塩処理後、公知の遺伝子の短い特異的小片が増幅されるようになり、完全に
配列決定されるか（オレク（Olek,A.）及びウォルター（Walter.J.）、Nat.Gene
t.１７巻、２７５−２７６ページ）、または“プライマー伸長反応法”（ゴンザ
ルゴ（Gonzalgo,M.L.）及びジョーンズ（Jones,P.A.）核酸研究、２５巻、２５
２９−２５３１ページ）または酵素切断法（キシオン（Xiong,Z）及びレアード
（Laird,P.W.）核酸研究、２５巻、２５３２−２５３４ページ）によって個々の
シトシン位置が明らかにされている。これらの参考文献は全て１９９７年以後に
発表されたものである。複雑な遺伝子病の表現型データと複雑なメチル化型とを
関連づける考え方が始めてＤＥ−１９５４３０６５Ａ１に記載された。ここでは
、例えば核酸ゾンデのハイブリッド形成を質量分析計で分析するという我々の検
出法は行われていない。

【０００７】実際に一遺伝子または遺伝子切片の全塩基配列を明らかにすること（塩基配列
決定ではそれが目的であるが）は必ずしも必要でない。多数の異なるプローブで
比較的長い塩基配列内の少ない５−メチルシトシン位置を調べるような場合は特
にそうである。このような場合配列決定は広い範囲にわたって過剰な情報を与え
、しかも非常にコスト高となる。塩基配列がすでにわかっていて、メチル化の位
置だけを知ればよいという場合もそうである。主として、異なるゲノムＤＮＡプ
ローブ間のメチル化型の違いだけに関心があるとか、また多数の一致するメチル
化位置の研究は断念してもよいという場合等もそうである。ここに提起された問
題については、これまでのところ、個々のプローブの配列を決定せずに所望の結
果を費用効率的に与える方法はない。

【０００８】塩基配列情報は新しいものほど、より多く研究されているに違いない。なぜな
らば、種々の生物の全塩基配列を目的とするゲノム−プロジェクトがスピーディ
ーに先頭を切って進んでいるからである。人のゲノムについては現在、配列決定
されたのは約５％に過ぎないが、他のゲノムプロジェクトもその目的を目指して
おり、それにより塩基配列決定の資源は自由になるから、配列決定は毎年５％以
上増えるであろう。２００６年には人のゲノムの完全配列決定に達すると考えら
れる。

【０００９】マトリックス式（Matrix-assistierte）レーザー脱着／イオン化質量分析（Ｍ
ＡＬＤＩ）は生体分子の分析のための新しい、非常に効率的な発明である（カラ
ス（Karas,M.）及びヒレンカンプ（Hillenkamp,F.）、１９８８、１０,０００ダ
ルトン以上の分子量を有するタンパク質のレーザー脱着イオン化（Laser desorp
tion ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 dalto
ns）Anal. Chem. ６０巻、２２９９−２３０１ページ）。被検体分子はＵＶを吸
収するマトリックスに埋め込まれる。短いレーザーパルスによってそのマトリッ
クスを真空中で気化させると、被検体は分解せずにガス相に放出される。かけら
れた電圧がイオンを field-free（電場をもたない）飛行管に加速する。質量が
異なるために、イオンは異なる強さで加速される。小さいイオンは大きいイオン
より速く検出器に達する。飛行時間をイオンの質量に換算する。

【００１０】この方法は、ハードウエアの技術的進歩により著しく改善された。ここで“遅
延抽出（delayed extraction）”法（ＤＥ）について述べる。ＤＥでは時間遅れ
をもった加速電圧がレーザーパルスにつながり、それによって、衝突数が減少す
るためシグナルの分解度が改善される。

【００１１】ＭＡＬＤＩはペプチドおよびタンパク質の分析に非常に適している。核酸では
感度がペプチドの場合の約１００分の１で、断片の大きさの増加につれて不釣り
合いに減少する。その理由は、ペプチド及びタンパク質のイオン化のためには、
たった１個のプロトンを捕捉すればよいからである。負に帯電した主鎖を何倍も
多く有する核酸では、上記マトリックスによるイオン化プロセスは実質的により
非効率的である。ＭＡＬＤＩではマトリックスの選択は非常に重要な役割を演ず
る。ペプチドの脱着のために、非常に細かい結晶化を行う非常に高効率のマトリ
ックスが幾つか見いだされている。ＤＮＡのためにも若干の適したマトリックス
が見いだされたのは確かだが、それによって上記の感度差は減少しなかった。主
鎖の一般的ホスフェートをチオホスフェートで置換したホスホロチオエート核酸
は、簡単なアルキル化反応によって電気的に中性のＤＮＡに変換される。

【００１２】 “電荷タグ”をこの改質ＤＮＡに付けると、ペプチドに見いだされた領域と同
じ領域の感度の上昇が起きる。この改質によって、ペプチドの脱着に用いるもの
と同様のマトリックスを利用する可能性も開かれる。電荷タグをつける利点は、
未改質の基質（Substrate）の証明を非常に難しくする不純物に対して分析の安
定性が高まることである。ＰＮＡｓ及びメチルホスホネートオリゴヌクレオチド
はＭＡＬＤＩで測定され、分析される。

【００１３】今のところ、この技術は、質量範囲１,００ないし４,００Ｄａでは１Ｄａの質
量差をもった分子を区別することができる。同位元素の自然の分布によって、大
抵の生体分子はすでに約５Ｄａの開きがある。技術的にこれらの質量測定法は好
都合なことに生体分子の分析にも適する。まともに考えると、区別しなければな
らない分析すべき生成物は少なくとも５Ｄａは離れていなければならない。この
質量範囲で６００の分子を区別することができた。

【００１４】何千もの標的ＤＮＡのアレーを固相に固定し、続いて或る配列の存在を調べる
ための一つのゾンデ（相補的配列を有する核酸）によって全ての標的ＤＮＡを同
時に調べることができる。

【００１５】標的ＤＮＡと上記ゾンデとの一致は、互いに２つの部分のハイブリッド化によ
って実現する。ゾンデは任意の長さの任意の核酸配列でよい。相互の重なりが最
小であるゾンデ配列を最適ライブラリーから選択するための種々の方法がある。
或る標的ＤＮＡ配列を見つけるために、ゾンデ配列を所望のように構成すること
もできる。オリゴフィンガープリンティングは、この技術を使用する装置である
。標的ＤＮＡのライブラリーを短い核酸ゾンデで調べる。この場合ゾンデは大抵
８−１２塩基の長さに過ぎない。ゾンデを、ナイロン膜に固定した標的ＤＮＡラ
イブラリーに一度だけハイブリッド化する場合もある。このゾンデは放射性標識
化されており、ハイブリッド形成は放射能の位置決定によって判断される。固定
されたＤＮＡアレーを調べるために、蛍光標識したゾンデも用いることができる
。

【００１６】米国特許第５,６０５,７９８号は固定した標的核酸と核酸ゾンデとのハイブリ
ッド形成及び質量測定法による分析を記載している。しかしここではメチル化型
の同定も行われず、改質核酸（例えばＰＮＡｓ、電荷タグ等）も使用せず、ゲノ
ム増幅も行われなかった。

【００１７】ゾンデとしては、配列特異的に標的ＤＮＡと相互作用し得る分子だけが考慮さ
れる。最も普及しているのはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。だが核酸
を改質したものも提案されている；例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチド、またはメチルホスホネートオリゴヌクレオチド等
。ゾンデの特異性は非常に重要である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
は最適とはいえない、なぜならばその構造には硫黄があり、そのためハイブリッ
ド形成が阻害されるからである。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが通常
、ジアステレオマー的純粋に合成されないのはこのためであると言える。メチル
ホスホネートオリゴヌクレオチドにも同様な問題があるが、このオリゴヌクレオ
チドは、ジアステレオマー的により純粋に合成される。これらの改質の本質的な
相違は、電荷をもたない主鎖である；それはハイブリッド形成の緩衝塩依存性を
減らし、全体的に反発の減少によって高親和性に導く。ペプチド核酸も電荷をも
たない主鎖を有する；それは同時に、核酸の主鎖の一般的糖リン酸塩構造とは化
学的に非常に大きく異なる。ＰＮＡの主鎖は一般的ＤＮＡの糖リン酸塩主鎖の代
わりにアミド配列を有する。ＰＮＡはＤＮＡ相補的配列と非常によくハイブリッ
ド化する。ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの融点は、対応するＤＮＡ／ＤＮＡハイ
ブリッドのそれより高く、ここでもまた、ハイブリッド形成の緩衝塩依存性は比
較的小さい。

【００１８】前段階の混合物から出発する組合わせ合成、すなわち物質ライブラリーの作製
は、液相よりも固相で行われる。とりわけ組合わせ固相合成は、副産物の分離が
非常に簡単であるため、早い時期に確立された。支持体に結合した標的化合物だ
けが洗浄段階で残り、合成の終わりにリンカーを切り離すことによって分離され
る。この方法は簡単に、多くの異なる化合物を固相で同時に合成することができ
、したがって化学的“純粋”な物質ライブラリーを得ることができる。

【００１９】こうして組合わせでない、従来の固相合成で合成される化合物群が、特に容易
に組合わせ化学を利用できるようになり、その結果、広く利用もされている。こ
れは特にペプチド核酸−及びＰＮＡ−ライブラリーに通用することである。

【００２０】ペプチドの合成は第一のＮ−保護アミノ酸（例えばＢｏｃ）を支持体に結合し
、その後保護基を外し、遊離した第一のＮＨ2基と第二のアミノ酸とを反応させ
るという方法で行われる。反応しなかったアミノ官能基はその後の“キャッピン
グ”段階で次の合成サイクルのその後の反応から除外される。第二のアミノ酸の
アミノ官能基の保護基を外すと、次の構成成分が結合できる。ペプチドライブラ
リーの合成のためには一段階または数段階でアミノ酸混合物が使用される。ＰＮ
Ａ及びＰＮＡ−ライブラリーの合成は意味通りに行われる。

【００２１】核酸ライブラリーは大抵の場合、種々のホスホルアミジット−ヌクレオシド混
合物で固相合成によって得られる。これは商業的に入手できるＤＮＡ合成器で、
合成プロトコルの変更をせずに行うことができる。

【００２２】ＰＮＡライブラリーの組み合わせ合成に関する多くの研究が発表されている。
これらの研究は組合わせ配列の作成、すなわち個々の固有の塩基が変性塩基に置
換され、それによって偶然形成された配列変異が出現するＰＮＡｓの合成を取り
扱っている。

【００２３】組合わせライブラリーの分析に質量分析法を適用することが多数報告されてい
る。

【００２４】ＤＮＡを固定する方法は種々ある。公知の方法はビオチンで官能化したＤＮＡ
をストレプトアビジン被覆表面に固定する方法である。この系の結合の強さは化
学的共有結合に匹敵する。標的ＤＮＡを、化学的に前処理した表面に結合するた
めには、標的ＤＮＡの対応する官能基が必要である。ＤＮＡそのものはこれに適
する官能価をもたない。標的ＤＮＡに適切な官能基を導入するための種々の変法
がある：操作しやすいのは、脂肪族第一アミンとチオールである。このようなア
ミンはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類で定量的に置換され、チオール
は適した条件のもとでアルキルヨージドと定量的に反応する。このような官能価
をＤＮＡに導入するのは難しい。最も簡単な変法はプライマーによってＰＣＲに
導入することである。上記の変法は５’−改質プライマー（ＮＨ2 及びＳＨ）と
一つの二官能性リンカーとを利用する。

【００２５】表面への固定の重要な要素は上記表面の性質である。これまでに報告された系
は主として珪素または金属（磁気ビーズ）からなる。標的ＤＮＡを結合するため
のもう一つの方法は、標的ＤＮＡにおける短い識別配列（例えば２０塩基）を用
いて、表面に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリッド化するという手法に
基づく。

【００２６】標的ＤＮＡに化学的活性化部位を導入するための酵素的変法も報告されている
。この場合は標的ＤＮＡに酵素的５’−ＮＨ2 官能化が行われる。

【００２７】本発明の課題は、現状の技術の欠点を克服し、固定されたゲノムＤＮＡプロー
ブのアレーにおいて、効果的かつ高度に平行したシトシン−メチル化を示すこと
のできる方法を作り出すことである。

【００２８】本発明の対象は、ゲノムＤＮＡにおける５−メチルシトシン塩基の形の後成的
情報担体を見つけだす方法であって、標的核酸アレーの質量分析研究のために多
数のゾンデを同時に使用する方法である。

【００２９】本発明の課題は、以下の方法を利用して、ゲノムＤＮＡプローブ中のシトシン
−メチル化型を同定することによって解決する：ａ）シトシンと５−メチルシトシンとが異なって反応するようにゲノムＤＮＡプ
ローブを化学的に処理し、両生成物の異なる塩基対挙動を二重に得る；ｂ）このように処理したＤＮＡ−プローブの部分を酵素的に増幅させる；ｃ）このように処理したＤＮＡプローブの増幅した部分を表面に固定する；ｄ）ジヌクレオチド配列５’−ＣｐＧ−３’を少なくとも一つは含む異なるヌク
レオ塩基配列のゾンデの一組を、固定されたＤＮＡプローブにハイブリッド化す
る；ｅ）ハイブリッドを形成しなかったゾンデを分離する；ｆ）ハイブリッド形成ゾンデを質量分析計で分析する、その際プローブ担体上の
ゾンデの位置は、ハイブリッド化すべきＤＮＡプローブに上記ゾンデが付くこと
ができるような位置である；ｇ）質量スペクトルから得られたピークの型をメチル化型に重ね、新しいデータ
をデータバンクのデータと合わせる。

【００３０】本発明により、ｃ）において、一つ以上の増幅ゲノムＤＮＡ断片を、表面に共
有結合した相補的オリゴヌクレオチド−またはＰＮＡ配列とハイブリッド化する
ことによって固定するのが好ましい。

【００３１】本発明により、ハイブリッド形成後、上記ゲノムＤＮＡ断片を、表面に結合し
たオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ配列と架橋させるのがより好ましい。ここで
架橋のために化学的共有結合を形成することが特に好ましい。本発明により、架
橋のために静電気的相互作用を形成することがさらに好ましい。

【００３２】上記表面に結合したオリゴヌクレオチド−またはＰＮＡ配列が５−ブロモウラ
シル成分を含むのがさらに好都合である。

【００３３】本発明により、固定された相補的オリゴヌクレオチド塩基配列が改質塩基、リ
ボース、または主鎖単位を含むことが好ましい。

【００３４】さらに、本発明による方法は、ｂ）においてゲノムＤＮＡプローブが多数回増
幅した断片の形に増加し、総ゲノムの少なくとも０.０１％が増幅されることを
特徴とする。

【００３５】本発明によると、増幅ＤＮＡプローブの異なる部分に結合することができる多
数の異なる点が存在する上記表面に、増幅されたＤＮＡ断片の混合物が結合する
ことも好ましい。

【００３６】さらに本発明により、ｄ）においてゾンデ１個あたりジヌクレオチド配列５’
−ＣｐＧ−３’を１個だけ含むゾンデの一組を用い、これらのゾンデはそれ以外
にはシトシン塩基もグアニン塩基も含まないことが好ましい。

【００３７】さらに、本発明により、段階ａ）において、重亜硫酸塩−またはピロ硫酸塩−
または二亜硫酸塩溶液またはこれら溶液の混合液を他の試薬類と共に用いて、シ
トシンを特異的または十分選択的にウラシルに変換することが好ましい。

【００３８】増幅されたプローブ−ＤＮＡを固定するために用いる表面が同時に質量分析計
のためのプローブ担体であることも好ましい。その際、増幅されたプローブ−Ｄ
ＮＡを固定するために用いる表面を全体的にｆ）の前に、質量分析のためのプロ
ーブ担体上にかぶせるのが好ましい。この際、ハイブリッド化したゾンデが、マ
トリックスとの接触前、または接触後、または接触中に、固定された増幅ＤＮＡ
−プローブから離れるのが好ましい。

【００３９】本発明によると、核酸のゾンデには１または数個の質量タグが付いているのが
さらに好ましい。本発明により、１または数個の質量タグは同時に電荷タグであ
るのも好都合である。または上記ゾンデは追加的に電荷タグも担うのも好ましい
。

【００４０】本発明によると、ゾンデが改質核酸分子であることが好ましい。この際、改質
核酸分子がＰＮＡｓ、アルキル化ホスホロチオエート核酸またはアルキルホスホ
ネート核酸であることが特に好ましい。

【００４１】本発明により、上記ゾンデを組合わせ合成によって作ることが好ましい。本発
明によると、種々の塩基−構成要素から合成されたゾンデ類を質量分析において
それらの質量によって区別できるように、上記種々の塩基−構成要素を標識する
のが特に好ましい。

【００４２】本発明により、上記ゾンデ類を部分ライブラリーとして作製し、これらに異な
る質量−および／または電荷タグをつけるのがさらに好ましい。

【００４３】本発明により特に好ましいのは、ｆ）においてマトリックス支援レーザー脱着
／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）を行うことである。

【００４４】本発明のその他の対象は本発明の方法を行うためのキットである。それは或る
ゲノムの任意に選択できる部分を固定するように改質された、質量分析計のプロ
ーブ担体、および／または上記プローブ担体に固定されたＤＮＡを質量分析によ
って分析する際に必要なゾンデライブラリー、および／またはその他の化学物質
、溶剤および／または助剤、並びに場合によっては取扱説明書を含む。

【００４５】本発明による方法は起源の異なるゲノムＤＮＡ中の５−メチルシトシンの位置
の決定に役立つ。ゲノムＤＮＡをまず最初に、そのシトシン塩基と５−メチルシ
トシン塩基との反応的差があらわれるような方法で化学的に処理する。使用でき
る試薬はここでは例えば重亜硫酸塩（二亜硫酸塩も含む）、ヒドラジン及び過マ
ンガン酸塩である。この方法の好適変法において、ゲノムＤＮＡをヒドロキノン
またはヒドロキノン誘導体の存在のもとで二亜硫酸塩で処理し、これに続くアル
カリ性加水分解によって選択的にシトシン塩基がウラシルに変換し、５−メチル
シトシンはこれらの条件下で変化せずに残る。過剰の二亜硫酸塩を分離除去する
精製プロセス後、前処理したゲノムＤＮＡの決められた断片をポリメラーゼ反応
で増幅する。この方法の好適変法においてはこの際ポリメラーゼ連鎖反応法を使
用する。本発明の特に好ましい変法では、ポリメラーゼ連鎖反応を次のように行
う；すなわち総ゲノムの少なくとも０.０１％が数個の断片の形で増幅される。

【００４６】今や、増幅され前処理されたＤＮＡプローブを上記方法の幾つかの変法で表面
に固定することができる。上記方法の好ましい一変法において、表面への固定を
行う際に、あらかじめ上記表面をオリゴヌクレオチド−またはＰＮＡ（ペプチド
核酸）配列で改質し、それによってＤＮＡプローブ中の相補的配列のハイプリッ
ド形成が行われた。原則的に、固定されたオリゴヌクレオチドはそれらの塩基で
も、それらの（デオキシ）−リボースおよび／または主鎖でも、本来のＤＮＡに
対して改質できる。今や種々のオリゴヌクレオチド−またはＰＮＡ配列はアレー
の形でこれらの表面に結合し、またはその表面上で合成される。こうしてこれら
の種々の配列の各々が増幅されたＤＮＡ断片の異なる部分に結合できる。この方
法の特に好ましい一変法においては、ハイブリッド形成に続いて両ストランドの
架橋が行われる。それは共有化学結合または安定静電気的相互作用の形成によっ
て行われる。その他の好ましい変法においては、ブロモウラシル構成要素に対し
て光化学的架橋が行われる。

【００４７】前処理したゲノムＤＮＡの断片類を別々に増幅し、それらの生成物を個々に表
面上の異なる場所に固定することもできる。この方法の好ましい一変法において
、ＰＣＲプライマーの一つに、表面に付与された官能基と結合できる、固定に適
した機能を与える。

【００４８】増幅されたＤＮＡ断片類が結合する表面は、それ自体ＭＡＬＤＩ質量分析計の
プローブ担体上にあるか、またはそれ自体がこれらのプローブ担体であるかどち
らかでなければならない。その際上記質量分析計の構造及びソフトウェアが、上
記プローブ担体上のその時の被験点がそこに最初に結合したプローブに割り当て
られることを保証する。

【００４９】固定された増幅ＤＮＡ断片に今や一組のゾンデがハイブリッド化し、その際こ
れらのゾンデは各々、配列５’−ＣｐＧ−３’を少なくとも一つは含み、それ以
外にはシトシン塩基もグアニン塩基も含まない。これらのゾンデはオリゴヌクレ
オチド、改質オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡｓ（ペプチド核酸）で良い。この
方法の好適変法において、組合わせ合成物中、この組のゾンデは組合わせライブ
ラリーとして作製される。その他の好適変法において、これらのゾンデはその質
量によって明らかに異なり、そこで質量から塩基配列を推測することができる。
その上、それらのゾンデに質量タグを付けることができ、その結果ことなるゾン
デが等しい質量になることを阻止できる。それらのゾンデに電荷タグを付け、そ
の結果質量分析計で質量スペクトルがよりよくあらわされ、塩類及び界面活性剤
の存在下でも分析の安定性を高めることができる。質量タグは同時に電荷タグで
もよい。ゾンデ類はやはり異なる質量−および／または電荷タグを付けた組み合
わせ部分ライブラリーとして作製することもできる。これらのゾンデとしてはＰ
ＮＡｓ、未改質核酸分子または改質核酸分子、例えばホスホチオエート核酸、ア
ルキル化ホスホロチオエート核酸またはアルキルホスホネート核酸があり、これ
らを質量または電荷タグによってさらに改質するかどうかは関係ない。

【００５０】ハイブリッドを形成しなかったゾンデは１回以上の洗浄段階で除去される。ハ
イブリッドを形成したゾンデはそれらの位置に留まって残る。

【００５１】上記表面はＭＡＬＤＩプローブ担体に固定されて質量分析計に移されるか、ま
たはその方法がＭＡＬＤＩプローブ担体そのもので行われた際には直接運搬され
る。ここでプローブのアレーはハイブリッド化ゾンデ上で質量分析で分析される
。好ましい一変法において、ハイブリッド化したゾンデはさらにＭＡＬＤＩマト
リックスとの接触によって脱ハイブリッド化され、ここに埋め込まれる；これは
、マトリックスの供給速度によって、隣接点の相互汚染なしに行われる。各点に
おいて、ハイブリッド形成ゾンデは、ハイブリッド化が行われた塩基配列を推測
し得るピーク型をもたらす。前処理（主として二亜硫酸塩による）に基づいて、
シトシン−メチル化−ＤＮＡ断片には異なる塩基配列があらわれる。こうして、
これらのゾンデによって生成する質量分析のピーク型は、そのときの被検ＤＮＡ
プローブの特徴的メチル化型である。このメチル化型とデータバンクのそれとを
合わせる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゲノムＤＮＡ−プローブのシトシン−メチル化型を確認する
方法であって、ａ）ゲノムＤＮＡプローブを化学的に処理してシトシンと５−メチルシトシンと
が異なって反応するようにし、両生成物の異なる塩基対挙動が二重に得られ；ｂ）このように処理したＤＮＡプローブの部分を酵素的に増幅し；ｃ）このように処理したＤＮＡプローブの増幅部分を表面に結合させ；ｄ）それぞれ少なくとも一つのジヌクレオチド配列５’−ＣｐＧ−３’を含む異
なるヌクレオ塩基配列のゾンデの一組を、固定されたＤＮＡプローブにハイブリ
ッド化し；ｅ）ハイブリッド化しなかったゾンデを除去し；ｆ）ハイブリッド化したゾンデを質量分析計で分析し、その際プローブ担体上の
ゾンデの位置はハイブリッド化されるＤＮＡプローブに前記ゾンデが付くことが
できるような位置であり；ｇ）質量スペクトルから得られるピーク型をメチル化型に重ね、新しいデータを
データバンクのそれと合わせる諸段階を特徴とする方法。
【請求項２】ｃ）において一つ以上の増幅したゲノムＤＮＡ断片を、表面
に共有結合している相補的オリゴヌクレオチド−またはＰＮＡ−配列とハイブリ
ッド化することによって固定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】ハイブリッド形成後、前記ゲノムＤＮＡ断片と、表面に結合
しているオリゴヌクレオチド−またはＰＮＡ−配列との架橋（Cross-linking）
が行われることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】架橋するために共有化学結合を形成することを特徴とする請
求項３記載の方法。
【請求項５】架橋するために静電気的相互作用を形成することを特徴とす
る請求項３記載の方法。
【請求項６】前記表面に結合したオリゴヌクレオチド−またはＰＮＡ配列
が５−ブロムウラシル−成分を含むことを特徴とする請求項３ないし請求項５の
いずれかの項に記載の方法。
【請求項７】固定された相補的オリゴヌクレオチド配列が改質塩基、リボ
ース、または主鎖単位を含むことを特徴とする先行請求項のいずれかの項に記載
の方法。
【請求項８】ｂ）においてゲノムＤＮＡプローブが幾つかの増幅した断片
の形に増幅し、その結果総ゲノムの最低０.０１％が増幅することを特徴とする
先行請求項のいずれかの項に記載の方法。
【請求項９】増幅したＤＮＡ断片の混合物を表面に結合させ、前記表面に
は増幅したＤＮＡプローブの異なる部分に結合することのできる種々の多数の点
が存在することを特徴とする先行請求項の少なくとも一つの項に記載の方法。
【請求項１０】ｄ）において、各ゾンデにつきジヌクレオチド配列５’−
ＣｐＧ−３’を一つだけ含むゾンデの一組を用い、前記ゾンデはそれ以外にはシ
トシン塩基もグアニン塩基も含まないことを特徴とする先行請求項のいずれかの
項に記載の方法。
【請求項１１】段階ａ）において、亜硫酸塩−またはピロ硫酸塩−または
二亜硫酸塩溶液またはこれらの溶液からなる混合液をその他の試薬類とともに用
いてシトシンを特異的または十分選択的にウラシルに変換することを特徴とする
先行請求項のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１２】増幅したプローブＤＮＡを固定するために用いる表面が同
時に質量分析計のプローブ担体でもある先行請求項のいずれかの項に記載の方法
。
【請求項１３】増幅したプローブＤＮＡを固定するために用いる表面を全
体として段階ｆ）の前に質量分析計のプローブ担体上にかぶせることを特徴とす
る請求項１ないし請求項１１の少なくとも一つの項に記載の方法。
【請求項１４】ハイブリッド化したゾンデが、マトリックスとの接触前、
接触後、または接触中に、固定した増幅ＤＮＡプローブから離れることを特徴と
する請求項１ないし請求項１３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１５】前記ゾンデが、一つ以上の質量タグを担った核酸であるこ
とを特徴とする先行請求項のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１６】一つ以上の質量タグが同時に電荷タグでもあることを特徴
とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】前記ゾンデが付加的に電荷タグも担うことを特徴とする請
求項１５記載の方法。
【請求項１８】前記ゾンデが改質核酸分子であることを特徴とする先行請
求項のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１９】改質核酸分子がＰＮＡｓ、アルキル化ホスホロチオエート
核酸またはアルキルホスホネート核酸であることを特徴とする請求項２０記載の
方法。
【請求項２０】前記ゾンデが組合わせ合成によって作製される先行請求項
のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２１】異なる塩基成分から合成されたゾンデが質量分析において
それらの質量によって区別できるように、前記異なる塩基成分を標識することを
特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】前記ゾンデが部分ライブラリーとして作製され、これらの
ゾンデに異なる質量−及び／または電荷タグを付けることを特徴とする先行請求
項のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２３】ｆ）においてマトリックス支援レーザー脱着／イオン化質
量分析（ＭＡＬＤＩ）を実施することを特徴とする先行請求項のいずれかの項に
記載の方法。
【請求項２４】請求項１記載の方法を実施するためのキットであって、或
るゲノムの任意に選択できる部分を固定するように改質された、質量分析計用の
プローブ担体、および／または前記プローブ担体に固定されたＤＮＡを質量分析
によって分析する際に必要なゾンデライブラリー、および／またはその他の化学
物質、溶剤および／または助剤、並びに場合によっては取扱説明書を含んでなる
キット。