JP2002535011A - ゲノムdnaプローブにおけるシトシン−メチル化型の確認法 - Google Patents
ゲノムdnaプローブにおけるシトシン−メチル化型の確認法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ゲノムDNAプローブにおけるシトシン−メチル化型の確認法に関する。
【解決手段】 a)ゲノムDNAプローブを化学的に処理してシトシンと5−メチルシトシンとが異なって反応するようにし、両生成物の異なる塩基対挙動が二重に得られ;b)このように処理したDNAプローブの部分を酵素的に増幅し;c)このように処理したDNAプローブの増幅部分を表面に結合させ;d)それぞれ少なくとも一つのジヌクレオチド配列5’−CpG−3’を含む異なるヌクレオ塩基配列のゾンデの一組を、固定されたDNAプローブにハイブリッド化し;e)ハイブリッド化しなかったゾンデを除去し;f)ハイブリッド化したゾンデを質量分析計で分析し、その際プローブ担体上のゾンデの位置はハイブリッド化されるDNAプローブに前記ゾンデが付くことができるような位置であり;g)質量スペクトルから得られるピーク型をメチル化型に重ね、新しいデータをデータバンクのそれと合わせる諸段階を特徴とする方法である。
Description
【0001】 本発明はゲノムDNAプローブにおけるシトシン−メチル化型の確認法に関す
るものである。
るものである。
【0002】 ゲノムDNAを塩基列として完全に配列決定することによって得られる遺伝情
報は、1個の細胞のゲノムを完全に説明するには不十分である。細胞内のDNA
の可逆的メチル化によって生成する5−メチルシトシン核酸塩基は一つの後成的
情報担体であり、例えばプロモーターの調節に役立つ。ゲノムのメチル化状態は
mRNA発現型と同様に遺伝子の発現状態をあらわす。
報は、1個の細胞のゲノムを完全に説明するには不十分である。細胞内のDNA
の可逆的メチル化によって生成する5−メチルシトシン核酸塩基は一つの後成的
情報担体であり、例えばプロモーターの調節に役立つ。ゲノムのメチル化状態は
mRNA発現型と同様に遺伝子の発現状態をあらわす。
【0003】 5−メチルシトシンは真核細胞のDNAに最もしばしばあらわれる共有結合改
質塩基である。それは例えば転写、ゲノムの刷り込みの調節に、そして腫瘍発生
に或る役割を演ずる。そのため遺伝情報の成分としての5−メチルシトシンの確
認は非常に興味深い。しかし5−メチルシトシンの位置は塩基配列決定によって
は確認することができない。なぜならば5−メチルシトシンはシトシンと同様の
塩基対−挙動をとるからである。その上、PCR増幅の際には5−メチルシトシ
ンが担っている後成的情報が完全に失われる。
質塩基である。それは例えば転写、ゲノムの刷り込みの調節に、そして腫瘍発生
に或る役割を演ずる。そのため遺伝情報の成分としての5−メチルシトシンの確
認は非常に興味深い。しかし5−メチルシトシンの位置は塩基配列決定によって
は確認することができない。なぜならば5−メチルシトシンはシトシンと同様の
塩基対−挙動をとるからである。その上、PCR増幅の際には5−メチルシトシ
ンが担っている後成的情報が完全に失われる。
【0004】 これらの問題を解決するために研究されている幾つかの方法は公知である。大
ていの場合、ゲノムDNAの化学反応または酵素処理が行われ、その結果処理さ
れたシトシン塩基はメチルシトシン塩基から区別される。広く用いられている方
法は重亜硫酸塩によるゲノムDNAの置換である。これは2段階で行われ、アル
カリ性加水分解後、シトシン塩基はウラシルに変換される(シャピロ(Shapiro,
R.)、コーエン(Cohen,B.)、サービス(Servis,R.) Nature 227巻、10
47ページ(1970))。5−メチルシトシンはこの条件のもとでは変化しな
い。C(シトシン)からU(ウラシル)への変換は塩基配列の変化を伴い、その
後の配列決定によって元々の5−メチルシトシンが明らかにされる(これだけが
C−痕跡量のバンドを与える)。
ていの場合、ゲノムDNAの化学反応または酵素処理が行われ、その結果処理さ
れたシトシン塩基はメチルシトシン塩基から区別される。広く用いられている方
法は重亜硫酸塩によるゲノムDNAの置換である。これは2段階で行われ、アル
カリ性加水分解後、シトシン塩基はウラシルに変換される(シャピロ(Shapiro,
R.)、コーエン(Cohen,B.)、サービス(Servis,R.) Nature 227巻、10
47ページ(1970))。5−メチルシトシンはこの条件のもとでは変化しな
い。C(シトシン)からU(ウラシル)への変換は塩基配列の変化を伴い、その
後の配列決定によって元々の5−メチルシトシンが明らかにされる(これだけが
C−痕跡量のバンドを与える)。
【0005】 5−メチルシトシンを証明する他の公知の可能性を展望してみると、例えば次
の総括的研究が挙げられる:ライン(Rein,T.)、デパンフィリス(DePamphilli
s,M.L.)、ゾルバス(Zorbas,H.)、核酸研究(Nucleic Acids Res.)、26巻
、2255ページ(1998)等。
の総括的研究が挙げられる:ライン(Rein,T.)、デパンフィリス(DePamphilli
s,M.L.)、ゾルバス(Zorbas,H.)、核酸研究(Nucleic Acids Res.)、26巻
、2255ページ(1998)等。
【0006】 重亜硫酸塩法はこれまで、わずかな例外(例えばゼシュニク(Zeschnigk,M.)
ら、Eur.J.Hum.Gen. 5巻、94−98ページ;クボタ(Kubota T.)ら Nat.Gen
et.16巻、16−17ページ)を除いて研究分野だけで使用されている。重亜
硫酸塩処理後、公知の遺伝子の短い特異的小片が増幅されるようになり、完全に
配列決定されるか(オレク(Olek,A.)及びウォルター(Walter.J.)、Nat.Gene
t.17巻、275−276ページ)、または“プライマー伸長反応法”(ゴンザ
ルゴ(Gonzalgo,M.L.)及びジョーンズ(Jones,P.A.)核酸研究、25巻、25
29−2531ページ)または酵素切断法(キシオン(Xiong,Z)及びレアード
(Laird,P.W.)核酸研究、25巻、2532−2534ページ)によって個々の
シトシン位置が明らかにされている。これらの参考文献は全て1997年以後に
発表されたものである。複雑な遺伝子病の表現型データと複雑なメチル化型とを
関連づける考え方が始めてDE−19543065A1に記載された。ここでは
、例えば核酸ゾンデのハイブリッド形成を質量分析計で分析するという我々の検
出法は行われていない。
ら、Eur.J.Hum.Gen. 5巻、94−98ページ;クボタ(Kubota T.)ら Nat.Gen
et.16巻、16−17ページ)を除いて研究分野だけで使用されている。重亜
硫酸塩処理後、公知の遺伝子の短い特異的小片が増幅されるようになり、完全に
配列決定されるか(オレク(Olek,A.)及びウォルター(Walter.J.)、Nat.Gene
t.17巻、275−276ページ)、または“プライマー伸長反応法”(ゴンザ
ルゴ(Gonzalgo,M.L.)及びジョーンズ(Jones,P.A.)核酸研究、25巻、25
29−2531ページ)または酵素切断法(キシオン(Xiong,Z)及びレアード
(Laird,P.W.)核酸研究、25巻、2532−2534ページ)によって個々の
シトシン位置が明らかにされている。これらの参考文献は全て1997年以後に
発表されたものである。複雑な遺伝子病の表現型データと複雑なメチル化型とを
関連づける考え方が始めてDE−19543065A1に記載された。ここでは
、例えば核酸ゾンデのハイブリッド形成を質量分析計で分析するという我々の検
出法は行われていない。
【0007】 実際に一遺伝子または遺伝子切片の全塩基配列を明らかにすること(塩基配列
決定ではそれが目的であるが)は必ずしも必要でない。多数の異なるプローブで
比較的長い塩基配列内の少ない5−メチルシトシン位置を調べるような場合は特
にそうである。このような場合配列決定は広い範囲にわたって過剰な情報を与え
、しかも非常にコスト高となる。塩基配列がすでにわかっていて、メチル化の位
置だけを知ればよいという場合もそうである。主として、異なるゲノムDNAプ
ローブ間のメチル化型の違いだけに関心があるとか、また多数の一致するメチル
化位置の研究は断念してもよいという場合等もそうである。ここに提起された問
題については、これまでのところ、個々のプローブの配列を決定せずに所望の結
果を費用効率的に与える方法はない。
決定ではそれが目的であるが)は必ずしも必要でない。多数の異なるプローブで
比較的長い塩基配列内の少ない5−メチルシトシン位置を調べるような場合は特
にそうである。このような場合配列決定は広い範囲にわたって過剰な情報を与え
、しかも非常にコスト高となる。塩基配列がすでにわかっていて、メチル化の位
置だけを知ればよいという場合もそうである。主として、異なるゲノムDNAプ
ローブ間のメチル化型の違いだけに関心があるとか、また多数の一致するメチル
化位置の研究は断念してもよいという場合等もそうである。ここに提起された問
題については、これまでのところ、個々のプローブの配列を決定せずに所望の結
果を費用効率的に与える方法はない。
【0008】 塩基配列情報は新しいものほど、より多く研究されているに違いない。なぜな
らば、種々の生物の全塩基配列を目的とするゲノム−プロジェクトがスピーディ
ーに先頭を切って進んでいるからである。人のゲノムについては現在、配列決定
されたのは約5%に過ぎないが、他のゲノムプロジェクトもその目的を目指して
おり、それにより塩基配列決定の資源は自由になるから、配列決定は毎年5%以
上増えるであろう。2006年には人のゲノムの完全配列決定に達すると考えら
れる。
らば、種々の生物の全塩基配列を目的とするゲノム−プロジェクトがスピーディ
ーに先頭を切って進んでいるからである。人のゲノムについては現在、配列決定
されたのは約5%に過ぎないが、他のゲノムプロジェクトもその目的を目指して
おり、それにより塩基配列決定の資源は自由になるから、配列決定は毎年5%以
上増えるであろう。2006年には人のゲノムの完全配列決定に達すると考えら
れる。
【0009】 マトリックス式(Matrix-assistierte)レーザー脱着/イオン化質量分析(M
ALDI)は生体分子の分析のための新しい、非常に効率的な発明である(カラ
ス(Karas,M.)及びヒレンカンプ(Hillenkamp,F.)、1988、10,000ダ
ルトン以上の分子量を有するタンパク質のレーザー脱着イオン化(Laser desorp
tion ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 dalto
ns)Anal. Chem. 60巻、2299−2301ページ)。被検体分子はUVを吸
収するマトリックスに埋め込まれる。短いレーザーパルスによってそのマトリッ
クスを真空中で気化させると、被検体は分解せずにガス相に放出される。かけら
れた電圧がイオンを field-free(電場をもたない)飛行管に加速する。質量が
異なるために、イオンは異なる強さで加速される。小さいイオンは大きいイオン
より速く検出器に達する。飛行時間をイオンの質量に換算する。
ALDI)は生体分子の分析のための新しい、非常に効率的な発明である(カラ
ス(Karas,M.)及びヒレンカンプ(Hillenkamp,F.)、1988、10,000ダ
ルトン以上の分子量を有するタンパク質のレーザー脱着イオン化(Laser desorp
tion ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 dalto
ns)Anal. Chem. 60巻、2299−2301ページ)。被検体分子はUVを吸
収するマトリックスに埋め込まれる。短いレーザーパルスによってそのマトリッ
クスを真空中で気化させると、被検体は分解せずにガス相に放出される。かけら
れた電圧がイオンを field-free(電場をもたない)飛行管に加速する。質量が
異なるために、イオンは異なる強さで加速される。小さいイオンは大きいイオン
より速く検出器に達する。飛行時間をイオンの質量に換算する。
【0010】 この方法は、ハードウエアの技術的進歩により著しく改善された。ここで“遅
延抽出(delayed extraction)”法(DE)について述べる。DEでは時間遅れ
をもった加速電圧がレーザーパルスにつながり、それによって、衝突数が減少す
るためシグナルの分解度が改善される。
延抽出(delayed extraction)”法(DE)について述べる。DEでは時間遅れ
をもった加速電圧がレーザーパルスにつながり、それによって、衝突数が減少す
るためシグナルの分解度が改善される。
【0011】 MALDIはペプチドおよびタンパク質の分析に非常に適している。核酸では
感度がペプチドの場合の約100分の1で、断片の大きさの増加につれて不釣り
合いに減少する。その理由は、ペプチド及びタンパク質のイオン化のためには、
たった1個のプロトンを捕捉すればよいからである。負に帯電した主鎖を何倍も
多く有する核酸では、上記マトリックスによるイオン化プロセスは実質的により
非効率的である。MALDIではマトリックスの選択は非常に重要な役割を演ず
る。ペプチドの脱着のために、非常に細かい結晶化を行う非常に高効率のマトリ
ックスが幾つか見いだされている。DNAのためにも若干の適したマトリックス
が見いだされたのは確かだが、それによって上記の感度差は減少しなかった。主
鎖の一般的ホスフェートをチオホスフェートで置換したホスホロチオエート核酸
は、簡単なアルキル化反応によって電気的に中性のDNAに変換される。
感度がペプチドの場合の約100分の1で、断片の大きさの増加につれて不釣り
合いに減少する。その理由は、ペプチド及びタンパク質のイオン化のためには、
たった1個のプロトンを捕捉すればよいからである。負に帯電した主鎖を何倍も
多く有する核酸では、上記マトリックスによるイオン化プロセスは実質的により
非効率的である。MALDIではマトリックスの選択は非常に重要な役割を演ず
る。ペプチドの脱着のために、非常に細かい結晶化を行う非常に高効率のマトリ
ックスが幾つか見いだされている。DNAのためにも若干の適したマトリックス
が見いだされたのは確かだが、それによって上記の感度差は減少しなかった。主
鎖の一般的ホスフェートをチオホスフェートで置換したホスホロチオエート核酸
は、簡単なアルキル化反応によって電気的に中性のDNAに変換される。
【0012】 “電荷タグ”をこの改質DNAに付けると、ペプチドに見いだされた領域と同
じ領域の感度の上昇が起きる。この改質によって、ペプチドの脱着に用いるもの
と同様のマトリックスを利用する可能性も開かれる。電荷タグをつける利点は、
未改質の基質(Substrate)の証明を非常に難しくする不純物に対して分析の安
定性が高まることである。PNAs及びメチルホスホネートオリゴヌクレオチド
はMALDIで測定され、分析される。
じ領域の感度の上昇が起きる。この改質によって、ペプチドの脱着に用いるもの
と同様のマトリックスを利用する可能性も開かれる。電荷タグをつける利点は、
未改質の基質(Substrate)の証明を非常に難しくする不純物に対して分析の安
定性が高まることである。PNAs及びメチルホスホネートオリゴヌクレオチド
はMALDIで測定され、分析される。
【0013】 今のところ、この技術は、質量範囲1,00ないし4,00Daでは1Daの質
量差をもった分子を区別することができる。同位元素の自然の分布によって、大
抵の生体分子はすでに約5Daの開きがある。技術的にこれらの質量測定法は好
都合なことに生体分子の分析にも適する。まともに考えると、区別しなければな
らない分析すべき生成物は少なくとも5Daは離れていなければならない。この
質量範囲で600の分子を区別することができた。
量差をもった分子を区別することができる。同位元素の自然の分布によって、大
抵の生体分子はすでに約5Daの開きがある。技術的にこれらの質量測定法は好
都合なことに生体分子の分析にも適する。まともに考えると、区別しなければな
らない分析すべき生成物は少なくとも5Daは離れていなければならない。この
質量範囲で600の分子を区別することができた。
【0014】 何千もの標的DNAのアレーを固相に固定し、続いて或る配列の存在を調べる
ための一つのゾンデ(相補的配列を有する核酸)によって全ての標的DNAを同
時に調べることができる。
ための一つのゾンデ(相補的配列を有する核酸)によって全ての標的DNAを同
時に調べることができる。
【0015】 標的DNAと上記ゾンデとの一致は、互いに2つの部分のハイブリッド化によ
って実現する。ゾンデは任意の長さの任意の核酸配列でよい。相互の重なりが最
小であるゾンデ配列を最適ライブラリーから選択するための種々の方法がある。
或る標的DNA配列を見つけるために、ゾンデ配列を所望のように構成すること
もできる。オリゴフィンガープリンティングは、この技術を使用する装置である
。標的DNAのライブラリーを短い核酸ゾンデで調べる。この場合ゾンデは大抵
8−12塩基の長さに過ぎない。ゾンデを、ナイロン膜に固定した標的DNAラ
イブラリーに一度だけハイブリッド化する場合もある。このゾンデは放射性標識
化されており、ハイブリッド形成は放射能の位置決定によって判断される。固定
されたDNAアレーを調べるために、蛍光標識したゾンデも用いることができる
。
って実現する。ゾンデは任意の長さの任意の核酸配列でよい。相互の重なりが最
小であるゾンデ配列を最適ライブラリーから選択するための種々の方法がある。
或る標的DNA配列を見つけるために、ゾンデ配列を所望のように構成すること
もできる。オリゴフィンガープリンティングは、この技術を使用する装置である
。標的DNAのライブラリーを短い核酸ゾンデで調べる。この場合ゾンデは大抵
8−12塩基の長さに過ぎない。ゾンデを、ナイロン膜に固定した標的DNAラ
イブラリーに一度だけハイブリッド化する場合もある。このゾンデは放射性標識
化されており、ハイブリッド形成は放射能の位置決定によって判断される。固定
されたDNAアレーを調べるために、蛍光標識したゾンデも用いることができる
。
【0016】 米国特許第5,605,798号は固定した標的核酸と核酸ゾンデとのハイブリ
ッド形成及び質量測定法による分析を記載している。しかしここではメチル化型
の同定も行われず、改質核酸(例えばPNAs、電荷タグ等)も使用せず、ゲノ
ム増幅も行われなかった。
ッド形成及び質量測定法による分析を記載している。しかしここではメチル化型
の同定も行われず、改質核酸(例えばPNAs、電荷タグ等)も使用せず、ゲノ
ム増幅も行われなかった。
【0017】 ゾンデとしては、配列特異的に標的DNAと相互作用し得る分子だけが考慮さ
れる。最も普及しているのはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。だが核酸
を改質したものも提案されている;例えばペプチド核酸(PNA)、ホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチド、またはメチルホスホネートオリゴヌクレオチド等
。ゾンデの特異性は非常に重要である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
は最適とはいえない、なぜならばその構造には硫黄があり、そのためハイブリッ
ド形成が阻害されるからである。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが通常
、ジアステレオマー的純粋に合成されないのはこのためであると言える。メチル
ホスホネートオリゴヌクレオチドにも同様な問題があるが、このオリゴヌクレオ
チドは、ジアステレオマー的により純粋に合成される。これらの改質の本質的な
相違は、電荷をもたない主鎖である;それはハイブリッド形成の緩衝塩依存性を
減らし、全体的に反発の減少によって高親和性に導く。ペプチド核酸も電荷をも
たない主鎖を有する;それは同時に、核酸の主鎖の一般的糖リン酸塩構造とは化
学的に非常に大きく異なる。PNAの主鎖は一般的DNAの糖リン酸塩主鎖の代
わりにアミド配列を有する。PNAはDNA相補的配列と非常によくハイブリッ
ド化する。PNA/DNAハイブリッドの融点は、対応するDNA/DNAハイ
ブリッドのそれより高く、ここでもまた、ハイブリッド形成の緩衝塩依存性は比
較的小さい。
れる。最も普及しているのはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。だが核酸
を改質したものも提案されている;例えばペプチド核酸(PNA)、ホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチド、またはメチルホスホネートオリゴヌクレオチド等
。ゾンデの特異性は非常に重要である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
は最適とはいえない、なぜならばその構造には硫黄があり、そのためハイブリッ
ド形成が阻害されるからである。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが通常
、ジアステレオマー的純粋に合成されないのはこのためであると言える。メチル
ホスホネートオリゴヌクレオチドにも同様な問題があるが、このオリゴヌクレオ
チドは、ジアステレオマー的により純粋に合成される。これらの改質の本質的な
相違は、電荷をもたない主鎖である;それはハイブリッド形成の緩衝塩依存性を
減らし、全体的に反発の減少によって高親和性に導く。ペプチド核酸も電荷をも
たない主鎖を有する;それは同時に、核酸の主鎖の一般的糖リン酸塩構造とは化
学的に非常に大きく異なる。PNAの主鎖は一般的DNAの糖リン酸塩主鎖の代
わりにアミド配列を有する。PNAはDNA相補的配列と非常によくハイブリッ
ド化する。PNA/DNAハイブリッドの融点は、対応するDNA/DNAハイ
ブリッドのそれより高く、ここでもまた、ハイブリッド形成の緩衝塩依存性は比
較的小さい。
【0018】 前段階の混合物から出発する組合わせ合成、すなわち物質ライブラリーの作製
は、液相よりも固相で行われる。とりわけ組合わせ固相合成は、副産物の分離が
非常に簡単であるため、早い時期に確立された。支持体に結合した標的化合物だ
けが洗浄段階で残り、合成の終わりにリンカーを切り離すことによって分離され
る。この方法は簡単に、多くの異なる化合物を固相で同時に合成することができ
、したがって化学的“純粋”な物質ライブラリーを得ることができる。
は、液相よりも固相で行われる。とりわけ組合わせ固相合成は、副産物の分離が
非常に簡単であるため、早い時期に確立された。支持体に結合した標的化合物だ
けが洗浄段階で残り、合成の終わりにリンカーを切り離すことによって分離され
る。この方法は簡単に、多くの異なる化合物を固相で同時に合成することができ
、したがって化学的“純粋”な物質ライブラリーを得ることができる。
【0019】 こうして組合わせでない、従来の固相合成で合成される化合物群が、特に容易
に組合わせ化学を利用できるようになり、その結果、広く利用もされている。こ
れは特にペプチド核酸−及びPNA−ライブラリーに通用することである。
に組合わせ化学を利用できるようになり、その結果、広く利用もされている。こ
れは特にペプチド核酸−及びPNA−ライブラリーに通用することである。
【0020】 ペプチドの合成は第一のN−保護アミノ酸(例えばBoc)を支持体に結合し
、その後保護基を外し、遊離した第一のNH2基と第二のアミノ酸とを反応させ
るという方法で行われる。反応しなかったアミノ官能基はその後の“キャッピン
グ”段階で次の合成サイクルのその後の反応から除外される。第二のアミノ酸の
アミノ官能基の保護基を外すと、次の構成成分が結合できる。ペプチドライブラ
リーの合成のためには一段階または数段階でアミノ酸混合物が使用される。PN
A及びPNA−ライブラリーの合成は意味通りに行われる。
、その後保護基を外し、遊離した第一のNH2基と第二のアミノ酸とを反応させ
るという方法で行われる。反応しなかったアミノ官能基はその後の“キャッピン
グ”段階で次の合成サイクルのその後の反応から除外される。第二のアミノ酸の
アミノ官能基の保護基を外すと、次の構成成分が結合できる。ペプチドライブラ
リーの合成のためには一段階または数段階でアミノ酸混合物が使用される。PN
A及びPNA−ライブラリーの合成は意味通りに行われる。
【0021】 核酸ライブラリーは大抵の場合、種々のホスホルアミジット−ヌクレオシド混
合物で固相合成によって得られる。これは商業的に入手できるDNA合成器で、
合成プロトコルの変更をせずに行うことができる。
合物で固相合成によって得られる。これは商業的に入手できるDNA合成器で、
合成プロトコルの変更をせずに行うことができる。
【0022】 PNAライブラリーの組み合わせ合成に関する多くの研究が発表されている。
これらの研究は組合わせ配列の作成、すなわち個々の固有の塩基が変性塩基に置
換され、それによって偶然形成された配列変異が出現するPNAsの合成を取り
扱っている。
これらの研究は組合わせ配列の作成、すなわち個々の固有の塩基が変性塩基に置
換され、それによって偶然形成された配列変異が出現するPNAsの合成を取り
扱っている。
【0023】 組合わせライブラリーの分析に質量分析法を適用することが多数報告されてい
る。
る。
【0024】 DNAを固定する方法は種々ある。公知の方法はビオチンで官能化したDNA
をストレプトアビジン被覆表面に固定する方法である。この系の結合の強さは化
学的共有結合に匹敵する。標的DNAを、化学的に前処理した表面に結合するた
めには、標的DNAの対応する官能基が必要である。DNAそのものはこれに適
する官能価をもたない。標的DNAに適切な官能基を導入するための種々の変法
がある:操作しやすいのは、脂肪族第一アミンとチオールである。このようなア
ミンはN−ヒドロキシスクシンイミドエステル類で定量的に置換され、チオール
は適した条件のもとでアルキルヨージドと定量的に反応する。このような官能価
をDNAに導入するのは難しい。最も簡単な変法はプライマーによってPCRに
導入することである。上記の変法は5’−改質プライマー(NH2 及びSH)と
一つの二官能性リンカーとを利用する。
をストレプトアビジン被覆表面に固定する方法である。この系の結合の強さは化
学的共有結合に匹敵する。標的DNAを、化学的に前処理した表面に結合するた
めには、標的DNAの対応する官能基が必要である。DNAそのものはこれに適
する官能価をもたない。標的DNAに適切な官能基を導入するための種々の変法
がある:操作しやすいのは、脂肪族第一アミンとチオールである。このようなア
ミンはN−ヒドロキシスクシンイミドエステル類で定量的に置換され、チオール
は適した条件のもとでアルキルヨージドと定量的に反応する。このような官能価
をDNAに導入するのは難しい。最も簡単な変法はプライマーによってPCRに
導入することである。上記の変法は5’−改質プライマー(NH2 及びSH)と
一つの二官能性リンカーとを利用する。
【0025】 表面への固定の重要な要素は上記表面の性質である。これまでに報告された系
は主として珪素または金属(磁気ビーズ)からなる。標的DNAを結合するため
のもう一つの方法は、標的DNAにおける短い識別配列(例えば20塩基)を用
いて、表面に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリッド化するという手法に
基づく。
は主として珪素または金属(磁気ビーズ)からなる。標的DNAを結合するため
のもう一つの方法は、標的DNAにおける短い識別配列(例えば20塩基)を用
いて、表面に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリッド化するという手法に
基づく。
【0026】 標的DNAに化学的活性化部位を導入するための酵素的変法も報告されている
。この場合は標的DNAに酵素的5’−NH2 官能化が行われる。
。この場合は標的DNAに酵素的5’−NH2 官能化が行われる。
【0027】 本発明の課題は、現状の技術の欠点を克服し、固定されたゲノムDNAプロー
ブのアレーにおいて、効果的かつ高度に平行したシトシン−メチル化を示すこと
のできる方法を作り出すことである。
ブのアレーにおいて、効果的かつ高度に平行したシトシン−メチル化を示すこと
のできる方法を作り出すことである。
【0028】 本発明の対象は、ゲノムDNAにおける5−メチルシトシン塩基の形の後成的
情報担体を見つけだす方法であって、標的核酸アレーの質量分析研究のために多
数のゾンデを同時に使用する方法である。
情報担体を見つけだす方法であって、標的核酸アレーの質量分析研究のために多
数のゾンデを同時に使用する方法である。
【0029】 本発明の課題は、以下の方法を利用して、ゲノムDNAプローブ中のシトシン
−メチル化型を同定することによって解決する: a)シトシンと5−メチルシトシンとが異なって反応するようにゲノムDNAプ
ローブを化学的に処理し、両生成物の異なる塩基対挙動を二重に得る; b)このように処理したDNA−プローブの部分を酵素的に増幅させる; c)このように処理したDNAプローブの増幅した部分を表面に固定する; d)ジヌクレオチド配列5’−CpG−3’を少なくとも一つは含む異なるヌク
レオ塩基配列のゾンデの一組を、固定されたDNAプローブにハイブリッド化す
る; e)ハイブリッドを形成しなかったゾンデを分離する; f)ハイブリッド形成ゾンデを質量分析計で分析する、その際プローブ担体上の
ゾンデの位置は、ハイブリッド化すべきDNAプローブに上記ゾンデが付くこと
ができるような位置である; g)質量スペクトルから得られたピークの型をメチル化型に重ね、新しいデータ
をデータバンクのデータと合わせる。
−メチル化型を同定することによって解決する: a)シトシンと5−メチルシトシンとが異なって反応するようにゲノムDNAプ
ローブを化学的に処理し、両生成物の異なる塩基対挙動を二重に得る; b)このように処理したDNA−プローブの部分を酵素的に増幅させる; c)このように処理したDNAプローブの増幅した部分を表面に固定する; d)ジヌクレオチド配列5’−CpG−3’を少なくとも一つは含む異なるヌク
レオ塩基配列のゾンデの一組を、固定されたDNAプローブにハイブリッド化す
る; e)ハイブリッドを形成しなかったゾンデを分離する; f)ハイブリッド形成ゾンデを質量分析計で分析する、その際プローブ担体上の
ゾンデの位置は、ハイブリッド化すべきDNAプローブに上記ゾンデが付くこと
ができるような位置である; g)質量スペクトルから得られたピークの型をメチル化型に重ね、新しいデータ
をデータバンクのデータと合わせる。
【0030】 本発明により、c)において、一つ以上の増幅ゲノムDNA断片を、表面に共
有結合した相補的オリゴヌクレオチド−またはPNA配列とハイブリッド化する
ことによって固定するのが好ましい。
有結合した相補的オリゴヌクレオチド−またはPNA配列とハイブリッド化する
ことによって固定するのが好ましい。
【0031】 本発明により、ハイブリッド形成後、上記ゲノムDNA断片を、表面に結合し
たオリゴヌクレオチドまたはPNA配列と架橋させるのがより好ましい。ここで
架橋のために化学的共有結合を形成することが特に好ましい。本発明により、架
橋のために静電気的相互作用を形成することがさらに好ましい。
たオリゴヌクレオチドまたはPNA配列と架橋させるのがより好ましい。ここで
架橋のために化学的共有結合を形成することが特に好ましい。本発明により、架
橋のために静電気的相互作用を形成することがさらに好ましい。
【0032】 上記表面に結合したオリゴヌクレオチド−またはPNA配列が5−ブロモウラ
シル成分を含むのがさらに好都合である。
シル成分を含むのがさらに好都合である。
【0033】 本発明により、固定された相補的オリゴヌクレオチド塩基配列が改質塩基、リ
ボース、または主鎖単位を含むことが好ましい。
ボース、または主鎖単位を含むことが好ましい。
【0034】 さらに、本発明による方法は、b)においてゲノムDNAプローブが多数回増
幅した断片の形に増加し、総ゲノムの少なくとも0.01%が増幅されることを
特徴とする。
幅した断片の形に増加し、総ゲノムの少なくとも0.01%が増幅されることを
特徴とする。
【0035】 本発明によると、増幅DNAプローブの異なる部分に結合することができる多
数の異なる点が存在する上記表面に、増幅されたDNA断片の混合物が結合する
ことも好ましい。
数の異なる点が存在する上記表面に、増幅されたDNA断片の混合物が結合する
ことも好ましい。
【0036】 さらに本発明により、d)においてゾンデ1個あたりジヌクレオチド配列5’
−CpG−3’を1個だけ含むゾンデの一組を用い、これらのゾンデはそれ以外
にはシトシン塩基もグアニン塩基も含まないことが好ましい。
−CpG−3’を1個だけ含むゾンデの一組を用い、これらのゾンデはそれ以外
にはシトシン塩基もグアニン塩基も含まないことが好ましい。
【0037】 さらに、本発明により、段階a)において、重亜硫酸塩−またはピロ硫酸塩−
または二亜硫酸塩溶液またはこれら溶液の混合液を他の試薬類と共に用いて、シ
トシンを特異的または十分選択的にウラシルに変換することが好ましい。
または二亜硫酸塩溶液またはこれら溶液の混合液を他の試薬類と共に用いて、シ
トシンを特異的または十分選択的にウラシルに変換することが好ましい。
【0038】 増幅されたプローブ−DNAを固定するために用いる表面が同時に質量分析計
のためのプローブ担体であることも好ましい。その際、増幅されたプローブ−D
NAを固定するために用いる表面を全体的にf)の前に、質量分析のためのプロ
ーブ担体上にかぶせるのが好ましい。この際、ハイブリッド化したゾンデが、マ
トリックスとの接触前、または接触後、または接触中に、固定された増幅DNA
−プローブから離れるのが好ましい。
のためのプローブ担体であることも好ましい。その際、増幅されたプローブ−D
NAを固定するために用いる表面を全体的にf)の前に、質量分析のためのプロ
ーブ担体上にかぶせるのが好ましい。この際、ハイブリッド化したゾンデが、マ
トリックスとの接触前、または接触後、または接触中に、固定された増幅DNA
−プローブから離れるのが好ましい。
【0039】 本発明によると、核酸のゾンデには1または数個の質量タグが付いているのが
さらに好ましい。本発明により、1または数個の質量タグは同時に電荷タグであ
るのも好都合である。または上記ゾンデは追加的に電荷タグも担うのも好ましい
。
さらに好ましい。本発明により、1または数個の質量タグは同時に電荷タグであ
るのも好都合である。または上記ゾンデは追加的に電荷タグも担うのも好ましい
。
【0040】 本発明によると、ゾンデが改質核酸分子であることが好ましい。この際、改質
核酸分子がPNAs、アルキル化ホスホロチオエート核酸またはアルキルホスホ
ネート核酸であることが特に好ましい。
核酸分子がPNAs、アルキル化ホスホロチオエート核酸またはアルキルホスホ
ネート核酸であることが特に好ましい。
【0041】 本発明により、上記ゾンデを組合わせ合成によって作ることが好ましい。本発
明によると、種々の塩基−構成要素から合成されたゾンデ類を質量分析において
それらの質量によって区別できるように、上記種々の塩基−構成要素を標識する
のが特に好ましい。
明によると、種々の塩基−構成要素から合成されたゾンデ類を質量分析において
それらの質量によって区別できるように、上記種々の塩基−構成要素を標識する
のが特に好ましい。
【0042】 本発明により、上記ゾンデ類を部分ライブラリーとして作製し、これらに異な
る質量−および/または電荷タグをつけるのがさらに好ましい。
る質量−および/または電荷タグをつけるのがさらに好ましい。
【0043】 本発明により特に好ましいのは、f)においてマトリックス支援レーザー脱着
/イオン化質量分析(MALDI)を行うことである。
/イオン化質量分析(MALDI)を行うことである。
【0044】 本発明のその他の対象は本発明の方法を行うためのキットである。それは或る
ゲノムの任意に選択できる部分を固定するように改質された、質量分析計のプロ
ーブ担体、および/または上記プローブ担体に固定されたDNAを質量分析によ
って分析する際に必要なゾンデライブラリー、および/またはその他の化学物質
、溶剤および/または助剤、並びに場合によっては取扱説明書を含む。
ゲノムの任意に選択できる部分を固定するように改質された、質量分析計のプロ
ーブ担体、および/または上記プローブ担体に固定されたDNAを質量分析によ
って分析する際に必要なゾンデライブラリー、および/またはその他の化学物質
、溶剤および/または助剤、並びに場合によっては取扱説明書を含む。
【0045】 本発明による方法は起源の異なるゲノムDNA中の5−メチルシトシンの位置
の決定に役立つ。ゲノムDNAをまず最初に、そのシトシン塩基と5−メチルシ
トシン塩基との反応的差があらわれるような方法で化学的に処理する。使用でき
る試薬はここでは例えば重亜硫酸塩(二亜硫酸塩も含む)、ヒドラジン及び過マ
ンガン酸塩である。この方法の好適変法において、ゲノムDNAをヒドロキノン
またはヒドロキノン誘導体の存在のもとで二亜硫酸塩で処理し、これに続くアル
カリ性加水分解によって選択的にシトシン塩基がウラシルに変換し、5−メチル
シトシンはこれらの条件下で変化せずに残る。過剰の二亜硫酸塩を分離除去する
精製プロセス後、前処理したゲノムDNAの決められた断片をポリメラーゼ反応
で増幅する。この方法の好適変法においてはこの際ポリメラーゼ連鎖反応法を使
用する。本発明の特に好ましい変法では、ポリメラーゼ連鎖反応を次のように行
う;すなわち総ゲノムの少なくとも0.01%が数個の断片の形で増幅される。
の決定に役立つ。ゲノムDNAをまず最初に、そのシトシン塩基と5−メチルシ
トシン塩基との反応的差があらわれるような方法で化学的に処理する。使用でき
る試薬はここでは例えば重亜硫酸塩(二亜硫酸塩も含む)、ヒドラジン及び過マ
ンガン酸塩である。この方法の好適変法において、ゲノムDNAをヒドロキノン
またはヒドロキノン誘導体の存在のもとで二亜硫酸塩で処理し、これに続くアル
カリ性加水分解によって選択的にシトシン塩基がウラシルに変換し、5−メチル
シトシンはこれらの条件下で変化せずに残る。過剰の二亜硫酸塩を分離除去する
精製プロセス後、前処理したゲノムDNAの決められた断片をポリメラーゼ反応
で増幅する。この方法の好適変法においてはこの際ポリメラーゼ連鎖反応法を使
用する。本発明の特に好ましい変法では、ポリメラーゼ連鎖反応を次のように行
う;すなわち総ゲノムの少なくとも0.01%が数個の断片の形で増幅される。
【0046】 今や、増幅され前処理されたDNAプローブを上記方法の幾つかの変法で表面
に固定することができる。上記方法の好ましい一変法において、表面への固定を
行う際に、あらかじめ上記表面をオリゴヌクレオチド−またはPNA(ペプチド
核酸)配列で改質し、それによってDNAプローブ中の相補的配列のハイプリッ
ド形成が行われた。原則的に、固定されたオリゴヌクレオチドはそれらの塩基で
も、それらの(デオキシ)−リボースおよび/または主鎖でも、本来のDNAに
対して改質できる。今や種々のオリゴヌクレオチド−またはPNA配列はアレー
の形でこれらの表面に結合し、またはその表面上で合成される。こうしてこれら
の種々の配列の各々が増幅されたDNA断片の異なる部分に結合できる。この方
法の特に好ましい一変法においては、ハイブリッド形成に続いて両ストランドの
架橋が行われる。それは共有化学結合または安定静電気的相互作用の形成によっ
て行われる。その他の好ましい変法においては、ブロモウラシル構成要素に対し
て光化学的架橋が行われる。
に固定することができる。上記方法の好ましい一変法において、表面への固定を
行う際に、あらかじめ上記表面をオリゴヌクレオチド−またはPNA(ペプチド
核酸)配列で改質し、それによってDNAプローブ中の相補的配列のハイプリッ
ド形成が行われた。原則的に、固定されたオリゴヌクレオチドはそれらの塩基で
も、それらの(デオキシ)−リボースおよび/または主鎖でも、本来のDNAに
対して改質できる。今や種々のオリゴヌクレオチド−またはPNA配列はアレー
の形でこれらの表面に結合し、またはその表面上で合成される。こうしてこれら
の種々の配列の各々が増幅されたDNA断片の異なる部分に結合できる。この方
法の特に好ましい一変法においては、ハイブリッド形成に続いて両ストランドの
架橋が行われる。それは共有化学結合または安定静電気的相互作用の形成によっ
て行われる。その他の好ましい変法においては、ブロモウラシル構成要素に対し
て光化学的架橋が行われる。
【0047】 前処理したゲノムDNAの断片類を別々に増幅し、それらの生成物を個々に表
面上の異なる場所に固定することもできる。この方法の好ましい一変法において
、PCRプライマーの一つに、表面に付与された官能基と結合できる、固定に適
した機能を与える。
面上の異なる場所に固定することもできる。この方法の好ましい一変法において
、PCRプライマーの一つに、表面に付与された官能基と結合できる、固定に適
した機能を与える。
【0048】 増幅されたDNA断片類が結合する表面は、それ自体MALDI質量分析計の
プローブ担体上にあるか、またはそれ自体がこれらのプローブ担体であるかどち
らかでなければならない。その際上記質量分析計の構造及びソフトウェアが、上
記プローブ担体上のその時の被験点がそこに最初に結合したプローブに割り当て
られることを保証する。
プローブ担体上にあるか、またはそれ自体がこれらのプローブ担体であるかどち
らかでなければならない。その際上記質量分析計の構造及びソフトウェアが、上
記プローブ担体上のその時の被験点がそこに最初に結合したプローブに割り当て
られることを保証する。
【0049】 固定された増幅DNA断片に今や一組のゾンデがハイブリッド化し、その際こ
れらのゾンデは各々、配列5’−CpG−3’を少なくとも一つは含み、それ以
外にはシトシン塩基もグアニン塩基も含まない。これらのゾンデはオリゴヌクレ
オチド、改質オリゴヌクレオチドまたはPNAs(ペプチド核酸)で良い。この
方法の好適変法において、組合わせ合成物中、この組のゾンデは組合わせライブ
ラリーとして作製される。その他の好適変法において、これらのゾンデはその質
量によって明らかに異なり、そこで質量から塩基配列を推測することができる。
その上、それらのゾンデに質量タグを付けることができ、その結果ことなるゾン
デが等しい質量になることを阻止できる。それらのゾンデに電荷タグを付け、そ
の結果質量分析計で質量スペクトルがよりよくあらわされ、塩類及び界面活性剤
の存在下でも分析の安定性を高めることができる。質量タグは同時に電荷タグで
もよい。ゾンデ類はやはり異なる質量−および/または電荷タグを付けた組み合
わせ部分ライブラリーとして作製することもできる。これらのゾンデとしてはP
NAs、未改質核酸分子または改質核酸分子、例えばホスホチオエート核酸、ア
ルキル化ホスホロチオエート核酸またはアルキルホスホネート核酸があり、これ
らを質量または電荷タグによってさらに改質するかどうかは関係ない。
れらのゾンデは各々、配列5’−CpG−3’を少なくとも一つは含み、それ以
外にはシトシン塩基もグアニン塩基も含まない。これらのゾンデはオリゴヌクレ
オチド、改質オリゴヌクレオチドまたはPNAs(ペプチド核酸)で良い。この
方法の好適変法において、組合わせ合成物中、この組のゾンデは組合わせライブ
ラリーとして作製される。その他の好適変法において、これらのゾンデはその質
量によって明らかに異なり、そこで質量から塩基配列を推測することができる。
その上、それらのゾンデに質量タグを付けることができ、その結果ことなるゾン
デが等しい質量になることを阻止できる。それらのゾンデに電荷タグを付け、そ
の結果質量分析計で質量スペクトルがよりよくあらわされ、塩類及び界面活性剤
の存在下でも分析の安定性を高めることができる。質量タグは同時に電荷タグで
もよい。ゾンデ類はやはり異なる質量−および/または電荷タグを付けた組み合
わせ部分ライブラリーとして作製することもできる。これらのゾンデとしてはP
NAs、未改質核酸分子または改質核酸分子、例えばホスホチオエート核酸、ア
ルキル化ホスホロチオエート核酸またはアルキルホスホネート核酸があり、これ
らを質量または電荷タグによってさらに改質するかどうかは関係ない。
【0050】 ハイブリッドを形成しなかったゾンデは1回以上の洗浄段階で除去される。ハ
イブリッドを形成したゾンデはそれらの位置に留まって残る。
イブリッドを形成したゾンデはそれらの位置に留まって残る。
【0051】 上記表面はMALDIプローブ担体に固定されて質量分析計に移されるか、ま
たはその方法がMALDIプローブ担体そのもので行われた際には直接運搬され
る。ここでプローブのアレーはハイブリッド化ゾンデ上で質量分析で分析される
。好ましい一変法において、ハイブリッド化したゾンデはさらにMALDIマト
リックスとの接触によって脱ハイブリッド化され、ここに埋め込まれる;これは
、マトリックスの供給速度によって、隣接点の相互汚染なしに行われる。各点に
おいて、ハイブリッド形成ゾンデは、ハイブリッド化が行われた塩基配列を推測
し得るピーク型をもたらす。前処理(主として二亜硫酸塩による)に基づいて、
シトシン−メチル化−DNA断片には異なる塩基配列があらわれる。こうして、
これらのゾンデによって生成する質量分析のピーク型は、そのときの被検DNA
プローブの特徴的メチル化型である。このメチル化型とデータバンクのそれとを
合わせる。
たはその方法がMALDIプローブ担体そのもので行われた際には直接運搬され
る。ここでプローブのアレーはハイブリッド化ゾンデ上で質量分析で分析される
。好ましい一変法において、ハイブリッド化したゾンデはさらにMALDIマト
リックスとの接触によって脱ハイブリッド化され、ここに埋め込まれる;これは
、マトリックスの供給速度によって、隣接点の相互汚染なしに行われる。各点に
おいて、ハイブリッド形成ゾンデは、ハイブリッド化が行われた塩基配列を推測
し得るピーク型をもたらす。前処理(主として二亜硫酸塩による)に基づいて、
シトシン−メチル化−DNA断片には異なる塩基配列があらわれる。こうして、
これらのゾンデによって生成する質量分析のピーク型は、そのときの被検DNA
プローブの特徴的メチル化型である。このメチル化型とデータバンクのそれとを
合わせる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI ,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID, IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,K Z,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA ,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ, PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,S K,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG ,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW
Claims (24)
- 【請求項1】 ゲノムDNA−プローブのシトシン−メチル化型を確認する
方法であって、 a)ゲノムDNAプローブを化学的に処理してシトシンと5−メチルシトシンと
が異なって反応するようにし、両生成物の異なる塩基対挙動が二重に得られ; b)このように処理したDNAプローブの部分を酵素的に増幅し; c)このように処理したDNAプローブの増幅部分を表面に結合させ; d)それぞれ少なくとも一つのジヌクレオチド配列5’−CpG−3’を含む異
なるヌクレオ塩基配列のゾンデの一組を、固定されたDNAプローブにハイブリ
ッド化し; e)ハイブリッド化しなかったゾンデを除去し; f)ハイブリッド化したゾンデを質量分析計で分析し、その際プローブ担体上の
ゾンデの位置はハイブリッド化されるDNAプローブに前記ゾンデが付くことが
できるような位置であり; g)質量スペクトルから得られるピーク型をメチル化型に重ね、新しいデータを
データバンクのそれと合わせる 諸段階を特徴とする方法。 - 【請求項2】 c)において一つ以上の増幅したゲノムDNA断片を、表面
に共有結合している相補的オリゴヌクレオチド−またはPNA−配列とハイブリ
ッド化することによって固定することを特徴とする請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 ハイブリッド形成後、前記ゲノムDNA断片と、表面に結合
しているオリゴヌクレオチド−またはPNA−配列との架橋(Cross-linking)
が行われることを特徴とする請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 架橋するために共有化学結合を形成することを特徴とする請
求項3記載の方法。 - 【請求項5】 架橋するために静電気的相互作用を形成することを特徴とす
る請求項3記載の方法。 - 【請求項6】 前記表面に結合したオリゴヌクレオチド−またはPNA配列
が5−ブロムウラシル−成分を含むことを特徴とする請求項3ないし請求項5の
いずれかの項に記載の方法。 - 【請求項7】 固定された相補的オリゴヌクレオチド配列が改質塩基、リボ
ース、または主鎖単位を含むことを特徴とする先行請求項のいずれかの項に記載
の方法。 - 【請求項8】 b)においてゲノムDNAプローブが幾つかの増幅した断片
の形に増幅し、その結果総ゲノムの最低0.01%が増幅することを特徴とする
先行請求項のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項9】 増幅したDNA断片の混合物を表面に結合させ、前記表面に
は増幅したDNAプローブの異なる部分に結合することのできる種々の多数の点
が存在することを特徴とする先行請求項の少なくとも一つの項に記載の方法。 - 【請求項10】 d)において、各ゾンデにつきジヌクレオチド配列5’−
CpG−3’を一つだけ含むゾンデの一組を用い、前記ゾンデはそれ以外にはシ
トシン塩基もグアニン塩基も含まないことを特徴とする先行請求項のいずれかの
項に記載の方法。 - 【請求項11】 段階a)において、亜硫酸塩−またはピロ硫酸塩−または
二亜硫酸塩溶液またはこれらの溶液からなる混合液をその他の試薬類とともに用
いてシトシンを特異的または十分選択的にウラシルに変換することを特徴とする
先行請求項のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項12】 増幅したプローブDNAを固定するために用いる表面が同
時に質量分析計のプローブ担体でもある先行請求項のいずれかの項に記載の方法
。 - 【請求項13】 増幅したプローブDNAを固定するために用いる表面を全
体として段階f)の前に質量分析計のプローブ担体上にかぶせることを特徴とす
る請求項1ないし請求項11の少なくとも一つの項に記載の方法。 - 【請求項14】 ハイブリッド化したゾンデが、マトリックスとの接触前、
接触後、または接触中に、固定した増幅DNAプローブから離れることを特徴と
する請求項1ないし請求項13のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項15】 前記ゾンデが、一つ以上の質量タグを担った核酸であるこ
とを特徴とする先行請求項のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項16】 一つ以上の質量タグが同時に電荷タグでもあることを特徴
とする請求項15記載の方法。 - 【請求項17】 前記ゾンデが付加的に電荷タグも担うことを特徴とする請
求項15記載の方法。 - 【請求項18】 前記ゾンデが改質核酸分子であることを特徴とする先行請
求項のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項19】 改質核酸分子がPNAs、アルキル化ホスホロチオエート
核酸またはアルキルホスホネート核酸であることを特徴とする請求項20記載の
方法。 - 【請求項20】 前記ゾンデが組合わせ合成によって作製される先行請求項
のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項21】 異なる塩基成分から合成されたゾンデが質量分析において
それらの質量によって区別できるように、前記異なる塩基成分を標識することを
特徴とする請求項20記載の方法。 - 【請求項22】 前記ゾンデが部分ライブラリーとして作製され、これらの
ゾンデに異なる質量−及び/または電荷タグを付けることを特徴とする先行請求
項のいずれかの項に記載の方法。 - 【請求項23】 f)においてマトリックス支援レーザー脱着/イオン化質
量分析(MALDI)を実施することを特徴とする先行請求項のいずれかの項に
記載の方法。 - 【請求項24】 請求項1記載の方法を実施するためのキットであって、或
るゲノムの任意に選択できる部分を固定するように改質された、質量分析計用の
プローブ担体、および/または前記プローブ担体に固定されたDNAを質量分析
によって分析する際に必要なゾンデライブラリー、および/またはその他の化学
物質、溶剤および/または助剤、並びに場合によっては取扱説明書を含んでなる
キット。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19905082A DE19905082C1 (de) | 1999-01-29 | 1999-01-29 | Verfahren zur Identifikation von Cytosin-Methylierungsmustern in genomischen DNA-Proben |
DE19905082.1 | 1999-01-29 | ||
PCT/DE2000/000288 WO2000044934A2 (de) | 1999-01-29 | 2000-01-27 | Verfahren zur identifikation von cytosin-methylierungsmustern in genomischen dna-proben |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000596174A Pending JP2002535011A (ja) | 1999-01-29 | 2000-01-27 | ゲノムdnaプローブにおけるシトシン−メチル化型の確認法 |
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---|---|
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JP (1) | JP2002535011A (ja) |
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ATE353975T1 (de) * | 2000-04-06 | 2007-03-15 | Epigenomics Ag | Diagnose von mit apoptose assoziierten erkrankungen mittels ermittlung des methylierungszustandes von apoptose-assozierten genen |
WO2002002807A2 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Epigenomics Ag | Diagnosis of diseases associated with cell signalling |
WO2002004686A2 (en) * | 2000-07-10 | 2002-01-17 | Epigenx Pharmaceutical, Inc. | Detecting methylated cytosine in polynucleotides |
DE10037769A1 (de) * | 2000-08-03 | 2002-02-21 | Epigenomics Gmbh | Diagnose von mit CD24 assoziierten Krankheiten |
EP1423528B1 (de) | 2000-09-01 | 2008-01-02 | Epigenomics AG | Verfahren zur bestimmung des methylierungsgrades von bestimmten cytosinen in genomischer dna im sequenzkontext 5'-cpg-3' |
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