JP2002513917A - 高分子の赤外マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析 - Google Patents

高分子の赤外マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析

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Abstract

(57)【要約】 核酸分子又はポリペプチドのような生体高分子及び赤外(ＩＲ)線を吸収するところの液体マトリックスを含有する混合物を提供する。これらの混合物は、ＩＲマトリックス補助レーザー(ＩＲ−ＭＡＬＤＩ)脱着／イオン化質量分析法による生体高分子の分析に有用である。また、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いる生体高分子の分析のための方法を提供する。例えば、試料中における生体高分子の存在又は本質を検出するか又は生体高分子の配位を決定するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (関連出願) 米国の目的には、この出願は、“液体マトリックスを用いる核酸のＩＲ−ＭＡ
ＬＤＩ質量分析法”の表題で、Ｆｒａｎｚ Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐに対して１９
９８年５月７日に出願した米国出願第０９／０７４，９３６号の一部継続である
。許可されている限り、ここではこの出願の内容をそのまま参照して組み入れる
。
【０００２】 (発明の分野) 開示した方法は、一般的にはゲノム、タンパク及び分子医学の分野に関し、更
に特異的には、生体高分子を分析するか、さもなければその存在を検出するか又
はその本質を測定するために、赤外マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質
量分析法を用いる方法に関する。
【０００３】 (発明の背景) 最近、多数の人間の遺伝病の分子生物学が組替ＤＮＡ技術の応用によって解明
されている。例えば、血友病、サラセミア、デュシェーヌ筋肉ジストロフィー、
ハンティングトン病、アルツハイマー病及び嚢胞性繊維症並びに乳がんのような
種々のがんを含む３０００以上の疾病が遺伝的な由来であると知られている(Coo
per and Krawczak, "Human Genome Mutations" (BIOS Publ. 1933))。遺伝病を
引き起こす突然変異遺伝子に加えて、或る出生時欠損は、例えば、２１トリソミ
ー (ダウン症候群)、１３トリソミー (パトー症候群)、１８トリソミー (エドワ
−ズ症候群)、Ｘモノソミー (ターナ―症候群)及びクラインフェルター症候群(
ＸＸＹ)のような他の性染色体異数性を含む染色体異常の結果である。
【０００４】 他の遺伝病は遺伝子中の異常な数のトリヌクレオチドの繰返し体により引き起
こされる。これらの疾病には、ハンティングトン病、前立腺がん、脊髄性小脳性
運動失調１(ＳＣＡ−１)、ぜい弱Ｘ症候群(Kremer et al., Science 252:1711-1
4 (1991); Fu et al., Cell 67: 1047-58 (1991); Hirst et al., J. Med. Gene
t. 28:824-29 (1991))；Ｉ型筋緊張性ジストロフィー (Mahadevan et al., Scie
nce 255:1253-55 (1992); Brook et al., Cell 68:799-808 (1992))、ケネディ
病（脊髄及び眼球筋萎縮症とも呼称される(La Spada et al., Nature 352:77-79
(1991))、マチャド−ジョセフ病並びに歯状核赤核小脳萎縮症及び淡蒼球視床下
核萎縮症が含まれる。異常数の三重繰返し体が、コード化領域、エキソンの非コ
ード化領域、イントロン又はプロモーターのような調節要素を含む各遺伝子領域
に特定される。これらの疾病の内、例えば、前立腺がんのような或るものでは、
三重繰返し体の数がその疾病の予後に確実に関連している。
【０００５】 トリヌクレオチド繰返し体の増幅が、上述の疾患の各々における分子病理に関
連している証拠がある。これらのトリヌクレオチド繰返し体の幾らかは非コード
化ＤＮＡにあるように見えるが、それらは明らかに、遺伝子発現に究極的に影響
する遺伝子領域の混乱状態に関連している。腫瘍細胞において体細胞突然変異に
起因する種々のジヌクレオチド及びトリヌクレオチド繰返し体の混乱状態も又、
遺伝子発現又は遺伝子調節に影響する。
【０００６】 或るＤＮＡ配列が、糖尿病、動脈硬化症、肥満、種々の自己免疫病並びに結腸
直腸性、乳性、卵巣性及び肺性のがんのようながんを含む数多くの他の疾病に個
人を罹患しやすくするという付加的証拠がある。遺伝病を引き起こすかそれに寄
与する遺伝的障害の知識によって、人が疾病又は疾患に罹るか又は危険性がある
かどうか並びにまた、少なくともある場合においては、疾病の予後を決めること
を可能にする。
【０００７】 数多くの遺伝子は多形性領域を有する。個人は多形性領域の幾らかな対立遺伝
子変異型の内のどれか一つを持っているので、各個人は遺伝子の多形性領域の対
立遺伝子変異型のタイプに基づいて確認され得る。そのような確認は、例えば、
法医学の目的に使用することが出来る。他の状況下では、個人における対立遺伝
子変異型の本質を知ることが重大である。例えば、主要組織適合性複合体(ＭＨ
Ｃ)のような或る遺伝子における対立遺伝子の相違が、骨髄移植での対宿主性移
植片病に関連している。したがって、遺伝子又は遺伝子障害の多形性領域におけ
る対立遺伝子変異型の本質を測定するための迅速で、高感度の且つ正確な方法を
開発することが非常に望まれる。
【０００８】 幾らかの方法が対立遺伝子変異型又は遺伝子障害を確認するのに用いられる。
例えば、対立遺伝子変異型の本質又は遺伝子障害の存在は、ゲル電気泳動により
増幅した核酸断片の移動度を既知標準と比較するか又は確認すべき配列に相補的
なプローブとのハイブリッド形成により測定することができる。そかしながら、
もし核酸断片が、例えば、放射性の(32Ｐ，35Ｓ)、蛍光性の又は化学発光性のレ
ポーターのような高感度のレポーター機能で標識化されれば、確認だけは達成す
ることができる。放射性標識は危険であり且つそれらが作成するシグナルは時と
ともに実質的に減衰する傾向がある。蛍光性標識のような非放射性標識は感度の
欠如及び高強度のレーザーを用いるときにはシグナルの消失という難点があり得
る。これに加えて、標識化、電気泳動及び引き続く検出は面倒で、時間が掛かり
且つ間違いやすい操作である。電気泳動は、核酸のサイズ又は分子量が、配列特
異的効果、二次構造及びゲルマトリックスとの相互作用がゲルを通る移動におい
て人工産物をもたらすので、ゲルマトリックス中の移動度と直接に相関し得ない
ことから、特に間違いやすい。
【０００９】 生科学における質量分析法の応用が報告されているが(Meth. Enzymmol., Vol.
193, Mass Spectrometry (Mccloskey, ed.; Academic Press, NY 1990); MacLa
ffery et al., Acc. Chem. Res. 27:297-386 (1994); Chait and Kent, Science
257:1885-1894 (1992); Siuzdak, Pro. Natl. Acad. Sci., USA 91:11290-1129
7 (1994)を参照)、これらは生体ポリマーの質量分析(Hillenkamp et al. (1991)
Anal. Chem. 63:1193A-1202Aを参照)及び生体高分子階層を生産して分析するた
めの(国際公開ＷＯ ９６/３６７３２; 米国特許第５，７９２，６６４号を参照
)方法を含む。
【００１０】 質量分析法は核酸の分析に使用されている(例えば、Schram，Mass Spectromet
ry of Nucleic Acid Components, Biomedical Applications of Mass Spectrome
try 34:203-287 (1990); Crain, Mass Spctrom. Rev. 9:505-554 (1990); Murra
y, J. Mass Spctrom. Rev. 31:1203 (1996); Nordhoff et al., Mass Spctrom.
Rev. 15:67-138 (1997); 米国特許第５，５４７，８３５号；米国特許第５，６
０５，７９８号；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ９４／１６１０１; ＰＣＴ出願公開第
ＷＯ ９６／２９４３１を参照)。
【００１１】 マトリックス補助レーザー脱着／イオン化(ＭＡＬＤＩ)及び電子噴霧イオン化
(ＥＳＩ)を含む、いわゆる“ソフトなイオン化”質量分析方法は、例えば、質量
で３００ｋＤａを十分に越す大きい分子の断片化させないイオン化、検出及び質
量測定を可能にする(Fenn et al., Science 246:64-71 (1989) ; Karas and Hil
lenkamp, Anal. Chem. 60:2299-3001 (1988))。ＭＡＬＤＩ質量分析法(ＭＡＬＤ
Ｉ−ＭＳ；Nordhoff et al., Mass Spctrom. Rev. 15:67-138 (1997)に総説があ
る)及びＥＳＩ−ＭＳは核酸を分析するのに使用されている。 核酸は揮発し難い
ところの非常に極性な生体分子でありそして、それ故に、明確で正確な分解能に
は上限の質量限度を持つ。
【００１２】 ＥＳＩは、メガダルトン質量領域にさえある大きい核酸の損なわれていない脱
着に使用されている(Ferstenau and Benner, Rapid Commun. Mass Spectrom. 9:
1528-1538 (1995) ; Chen et al., Anal. Chem. 67:1159-1163 (1995))。ＥＳ
Ｉを用いる質量の帰属は非常に悪くそして約１０％の不確定性でもって可能なだ
けである。ＥＳＩ−ＭＳにより正確に質量が測定されている最大の核酸は、質量
で約６５ｋＤａの１１４塩基対二本鎖ＰＣＲ生成物(Muddiman et al., Anal. C
hem. 68:3705-3712 (1996))及び質量で約３９ｋＤａの１２０ヌクレオチド大腸
菌５ＳｒＲＮＡ(Limbach et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 6:27-39 (1995
))である。更に、ＥＳＩは徹底的な試料の精製を必要とする。
【００１３】 ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、分析されるべき巨大分子のマトリックスへの取り込みを
必要とし、そして固体(例えば、結晶) マトリックス中に混合されたポリペプチ
ド上及び核酸上で実施している。これらの方法では、プローブの先で結晶してい
る生体ポリマー／マトリックス混合物をレーザーを使用して衝撃を与え、それに
より生体ポリマーの脱着及びイオン化を起こさせる。また、ＭＡＬＤＩ−ＭＳは
マトリックスとして結晶水(例えば、氷)又はグリセリンを用いてポリペプチド上
で実施している。マトリックスとして結晶水を用いたときには、ＭＡＬＤＩ−Ｍ
Ｓを実施する前にタンパク質を先ず凍結乾燥するか風乾する必要がある(Berkenk
amp et al. (1994) Pro. Natl. Acad. Sci., USA 93:7003-7007)。この方法の上
限質量限度は限られた感度(例えば、少なくとも１０ｐｍｏｌのタンパク質が必
要であった)を持って３０ｋＤａであると報告された。タンパク質の赤外ＭＡＬ
ＤＩ−ＭＳは、報告によると、ＵＶ ＭＡＬＤＩ−ＭＳに比較してスペクトル当
たり１００−１０００倍以上の物質を消費し且つ、グリセリンのようなマトリッ
クスと組み合わせて、高質量側でピークの広がるところの付加物を形成する傾向
があり得る(Hillenkamp et al. (1995) 43rd ASMS Conference on Mass Spectro
metry and Allied Topics, p. 357)。更に、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ ＭＳはＵＶ−Ｍ
ＡＬＤＩ ＭＳに比較すると少ない準安定断片化のために増加した質量分解能を
提供するように見えたが、準安定減衰のこの減少は断片化での増加を伴うと報告
されている。
【００１４】 ＵＶ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳは分析可能な生体高分子のサイズに限度がある。例え
ば、ＵＶ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより、約１００ヌクレオチド(１００マー)より大
きいような核酸分子を分析するのは困難である。
【００１５】 したがって、質量分析方法を核酸分子の分析に応用する努力にもかかわらず、
部分的には核酸の物理的化学的性質のために制限が残っている。例えば、核酸生
体ポリマーの極性な性質はそれらの揮発を困難にする。
【００１６】 大きいＤＮＡ分子のＵＶ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いる分析が報告されている(R
oss and Belgrader, Anal. Chem. 69:3966-3972 (1997); Tang et al., Rapid C
ommun. Mass Spectrom. 8:727-730 (1994); Bai et al., Rapid Commun. Mass S
pectrom. 9:1172-1176 (1995); Liu et al., Anal. Chem. 67:3482-3490 (1995
); Siegert et al., Anal. Biochem. 243:55-65 (1997))。これらの報告に基づ
くと、ＵＶ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより質量で３０ｋＤａ(おおよそ１００マー)を
超える核酸の分析は約９０ｋＤａの現行の上限質量限界ではだんだん困難に成り
つつある(Ross and Belgrader, Anal. Chem. 69:3966-3972 (1997))ことは明白
である。このＤＮＡ ＵＶ-ＭＡＬＤＩスペクトルの劣った品質は、リン酸バッ
クボーンのイオン断片化及び多重化塩形成の組み合わせに寄与している。ＲＮＡ
はＵＶ-ＭＡＬＤＩ条件下ではＤＮＡよりかなり安定であるので、ＲＮＡに対す
る達成可能な質量範囲は約１５０ｋＤａ迄である(Kirpekar et al., Nucl. Acid
Res. 22:3866-3870 (1994))。
【００１７】 固体スマトリックス(主としてコハク酸、より少なく、尿素及びニコチン酸)中
の核酸がＩＲ−ＭＡＬＤＩによって分析されている(Nordhoff et al., Rapid Co
mmun. Mass Spectrom. 6:771-776 (1992); Nordhoff et al., Nucl. Acids Res.
21:3347-3357 (1993); Nordhoff et al., J. Mass Spec. 30:99-112 (1995))
。Ｎｏｒｄｈｏｆｆ 等(１９９２)は初めにＤＮＡの２０マー及びＲＮＡの８０
マーが分解能には凡そ最上限度であると報告した。後で、Ｎｏｒｄｈｏｆｆ等(
１９９２)は、ＤＮＡの２６マー及びｔＲＮＡの１０４マーの明確なスペクトル
を提供しそして再現可能なシグナルが１４２ヌクレオチド迄のＤＮＡに対して得
られたと報告した。Ｎｏｒｄｈｏｆｆ 等(１９９５)はまたコハク酸でのＩＲ−
ＭＡＬＤＩによるよりは３−ヒドロキシピコリン酸の固体マトリックスによるＵ
Ｖ−ＭＡＬＤＩによる４０マーの分析では相当に良いスペクトルを得たが、しか
しＩＲ−ＭＡＬＤＩは相当な程度の迅速な断片化をもたらしたと報告した。
【００１８】 生体試料中の高分子の分析は、例えば、試料を取られる個人の条件についての
情報を提供することができる。例えば、ある個人から得られた生体試料の核酸分
析は、遺伝病又は染色体異常、疾病又は疾患の素質若しくは病原性生物による感
染を診断するのに有用であり得るか、又は本質、遺伝又は適合性に関する情報を
提供し得る。質量分析法は比較的迅速に実施することが可能でそして自動化しや
すいので、生体高分子、特にＤＮＡで約９０ｋＤａ及びＲＮＡで１５０ｋＤＡよ
り大きい大核酸分子に対して正確な質量スペクトルが得られる改良法が必要であ
る。
【００１９】 したがって、核酸分子中の遺伝子障害を検出する方法を含めて、核酸分子のよ
うな生体高分子を検出し特性化するための方法に対する必要性が存在する。特に
、疾患、疾病及び障害の診断との関連において、生体高分子を検出し特性化する
ための真度、感度、精度及び信頼性のある方法に対する必要性がある。それ故に
、これらの必要性を満たし且つ付加的な利点を提供する方法を提供することがこ
こでの目的である。
【００２０】 (発明の要約) 赤外マトリックス補助レーザー脱着／イオン化(ＩＲ−ＭＡＬＤＩ)質量分析法
及び液体マトリックスを用いて生体高分子の質量又は本質を測定する方法を提供
する。特に、液体マトリックス中でＤＮＡ及びＲＮＡを含む核酸の赤外マトリッ
クス補助レーザー脱着／イオン化(ＩＲ−ＭＡＬＤＩ)質量分析法を提供する。液
体マトリックス(室温、一気圧下で液体)は、ガラス状の又はガラス質の固体を形
成できるところのポリグリコール、特にグリセリンのようなＩＲを吸収する生体
適合性の物質である。ＩＲ−ＭＡＬＤＩ及び液体マトリックスの使用はどんな方
法、特に、これまではＵＶ-ＭＡＬＤＩで実施された診断法及び配列決定法にお
いて使用され得る。そのような方法、特に核酸及びタンパク質のための診断法は
、米国特許第５，５４７，８３５、５，６９１，１４１、５，６０５，７９８、
５，６２２，８２４、５，７７７，３２４、５，８３０，６５５及び５，７００
，６４２の各号、許可済み米国出願第０８／６１７，２５６、０８／７４６，０
３６、０８／７４４，４８１、０８／７４４，５９０、０８／６４７，３６８の
各号、公開国際ＰＣＴ出願第ＷＯ ９６／２９４３１、ＷＯ ９９／１２０４０
、ＷＯ ９８／２００１９、ＷＯ ９８／２０１６６、ＷＯ ９８／２００２０
、ＷＯ ９７／３７０４１、ＷＯ ９９／１４３７５、ＷＯ ９７／４２３４８
、ＷＯ ９８／５４７５１及びＷＯ ９８／２６０９５の各号に記載されたもの
を含むが、これらに限定されない。
【００２１】 核酸分析方法の態様を実施するには、核酸及び液体マトリックスを含有するＩ
Ｒ−ＭＡＬＤＩ用の組成物を一般的には固体担体であるところの基質上に析出さ
せて、核酸混合物の均一で透明な薄層を形成させる。この混合物は、核酸溶液が
脱着及びイオン化するように赤外線で照明させ、それによりイオン粒子を放出し
、それらを質量分析器を用いて分析して核酸の質量を測定する。好ましくは、試
料の作成及び付着は自動装置を用いて実施する。
【００２２】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いて試料中の生体高分子の存在又は不在を検
出する方法もまたここで提供する。特定の態様においては、生体高分子及び液体
マトリックスを含有するＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物を赤外線で照明させ、脱着
及びイオン化し、それによりイオン粒子を放出し、それらを分析して核酸が存在
するかどうかを測定する。
【００２３】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いて試料中の核酸の存在又は不在を検出する
方法もまたここで提供する。特定の態様においては、生体高分子及び液体マトリ
ックスを含有するＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物を赤外線で照明させ、脱着及びイ
オン化し、それによりイオン粒子を放出し、それらを分析して核酸が存在するか
どうかを測定する。
【００２４】 ここで公開した方法で使用するための液体マトリックスは脱着及びイオン化の
実施に用いられるべきレーザー波長において十分な吸収を有し且つ室温(２０℃)
で液体でありそしてガラス質の又はガラス状の固体を生成し得る。この液体は、
各々のＩＲ−ＭＡＬＤＩフォーマットでそして、そのようなフォーマットに適し
た各々の温度、典型的には約−２００℃から８０℃、好ましくは−６０℃から約
４０℃において用いることを意図する。
【００２５】 吸収目的のためには、その液体マトリックスは赤外線を強く吸収する少なくと
も一つの発色団又は置換基を含有してもよい。好ましい置換基は、ニトロ、スル
ホニル、スルホン酸、スルホンアミド、ニトリル又はシアン化物、カルボニル、
アルデヒド、カルボン酸、アミド、エステル、酸無水物、ケトン、アミン、ヒド
ロキシル、芳香環、ジエン及びその他の共役系を含む。
【００２６】 好ましい液体マトリックスの中にあるものは、置換又は非置換である、(１)グ
リセリン、糖、多糖、１，２-プロパンジオール、１，３-プロパンジオール、１
，２-ブタンジオール、１，３-ブタンジオール、１，４-ブタンジオール及びト
リエタノールアミンを含むアルコール；(２) ギ酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸
、酪酸、吉草酸、及びヘキサン酸又はそれらのエステルを含むカルボン酸；(３)
分岐するか又は分岐していない、アセトアミド、プロパンアミド、ブタンアミド
、ペンタンアミド及びヘキサンアミドを含む第一級又は第二級のアミド；(４)プ
ロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミン、ヘプチルアミ
ン、ジエチルアミン及びジプロピルアミンを含む第一級又は第二級アミン；並び
に(５) ニトリル、ヒドラジン及びヒドラジドである。これらの液体は結晶化し
ないで、むしろ、液体相から転移に至る乾燥、冷却又はその他の条件に付したと
きに、ガラス状又はガラス質の相を形成してもよい。比較的に低揮発性の物質が
、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ方法の間に真空条件下での迅速な蒸発を避けるために好まし
い。
【００２７】 好ましくは、そこで用いるための液体マトリックスは核酸適合性の溶液と混合
可能である。上述のように、この液体マトリックスは真空に安定であること、す
なわち、試料が質量分析器の中で迅速に蒸発しないように低い蒸気圧を有するこ
ともまた好ましい。好ましくは、この液体は、単独で又は核酸適合性の溶液と混
合して薄層のミクロ‐からナノ-リットル容量のマトリックスを分注するのに適
切な粘度を持つ。異なる液体マトリックス及びそのようなマトリックスへの添加
物の混合物は上述の一つ又はそれ以上の性質を与えるために望ましいであろう。
そのような混合物は、二つの液体マトリックス物質(すなわち、二成分混合物)、
三つ(三成分混合物)又はそれ以上を含有してもよい。
【００２８】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の核酸／マトリックス組成物は、好ましくは真空箱に入れ
た基質上に薄層として析出する。核酸／マトリックス溶液を保持するための好ま
しい基質は、例えば、ろ過板を付けるか付けてない、ビーズ、細管、平坦な担体
、ピン又はウエーハ等の固体担体であってもよい。好ましくは、その基質の温度
を調節してその核酸／マトリックス組成物を室温以下の温度に冷却してもよい。
【００２９】 好ましい赤外線は約２．５μｍから約１２μｍの中間−ＩＲ波長範囲にある。
特に好ましい光源はＣＯ、ＣＯ2及びＥｒレーザーである。ある態様においては
、このレーザーは、光ファイバーレーザーであってもよいが、又はそのレーザー
線は光ファイバーにより質量分析計につないでもよい。
【００３０】 更に好ましい態様においては、液体マトリックス中のアナライトの赤外照射に
より生成するイオン粒子は、質量分析計における分離と検出の前に遅延様式で質
量分析計による分析のために抽出される。好ましい分離フォーマットは、直線又
は非直線磁場を有する線型又はリフレクター、例えば、曲線磁場リフレクトロン
；飛行時間(ＴＯＦ)；単一又は多数の四重極；単一又は多数の磁気セクター、フ
ーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(ＦＴＣＩＲ)；又はイオントラップ質量分
析計を含む。
【００３１】 生体試料中にある目標核酸の存在を確認するためのＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析
法を提供する。そのような方法は、例えば、生体試料中にある核酸分子を増幅す
ることにより；増幅した核酸分子の中に存在する目標核酸配列にハイブリッド形
成し得るところの検出オリゴヌクレオチドに増幅した核酸分子を接触させること
により；反応生成物を赤外線を吸収する液体マトリックスと混合してＩＲ−ＭＡ
ＬＤＩ用の組成物を作成することにより；そして組成物中にある二重核酸分子を
ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により確認することにより実施し得るが、ここにお
いては、二重核酸分子の存在が生体試料中にある目標核酸の存在を確認する。
【００３２】 生体試料中にある目標核酸の存在を確認するための方法は、また、生体試料中
で得られる核酸分子を増幅すること；特に、少なくとも一つの適当なヌクレアー
ゼを用いて増幅した核酸分子を消化して、消化断片を生産すること；相補的捕獲
核酸配列とその消化断片をハイブリッド形成させるが、それらを固体担体に固定
化しそして目標核酸の消化断片にハイブリッド形成して固定化断片を生産するこ
と；固定化断片及び赤外線を吸収する液体マトリックスを含むＩＲ−ＭＡＬＤＩ
用の組成物を作成すること；そしてＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により固定化断
片を確認し、それにより生体試料中にある目標核酸の存在を確認することにより
実施することができる。
【００３３】 生体試料中にある目標核酸の存在は、また、生体試料中で得られる核酸分子上
において、目標核酸を含む核酸の一部分の増幅する能力のあるところのプライマ
ーの最初の組を用いる最初のポリメラーゼ連鎖反応を実施すること；最初の増幅
生成物及び赤外線を吸収する液体マトリックスを含むＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成
物を作成すること；そして組成物中にある最初の増幅生成物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ
質量分析法により検出し、それにより生体試料中にある目標核酸の存在を確認す
ることにより検出することができる。所望されれば、そのような方法は、ＩＲ−
ＭＡＬＤＩ用の組成物を作成する前に、目標核酸を含む最初の増幅生成物の少な
くとも一部分を増幅することができるところのプライマーの第二の組を用いて最
初の増幅生成物上に第二のポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含んでもよい
。
【００３４】 またここでは、組成物、特にＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物が公開されているが
、そのような組成物は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩによる分析に適した生体高分子及び赤
外線を吸収する液体マトリックスを含む。ＩＲ−ＭＡＬＤＩによる分析に適した
生体高分子は、例えば、核酸、ポリペプチド又は炭水化物であってもよく、若し
くは、核タンパク質複合体、タンパク質−タンパク質複合体等の高分子複合体で
あってもよい。ここで公開されたＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物は、生体高分子、
例えば、核酸、及び液体マトリックスを約１０-4から１０-9の比率で一般的に含
み、そして、約１０ピコモル以下の分析されるべき生体高分子、例えば、約１０
０アットモルから約１ピコモル(ｐｍｏｌ)の生体高分子を含んでもよい。(タン
パク質では、アナライトとマトリックスとの比率は典型的に約２×１０-4から２
×１０-5の範囲とより狭い)。ここで公開されているようなＩＲ−ＭＡＬＤＩ用
の組成物は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩによる生体高分子の検出を容易にするところの添
加物、例えば、液体マトリックス中で生体高分子の混和性を改善する添加物を含
んでもよい。一つの態様においては、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物は基質上に析
出されるが、それはシリコンウエーハ又はＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物の析出の
ための表面を提供する他の材料、例えば、ステンレススチールのような固体担体
であってもよい。
【００３５】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により生体高分子を特性化する方法を提供する。
例えば、生体高分子の質量は、分析されるべき生体高分子及び赤外線を吸収する
液体マトリックスを含むＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物を作成し；それからＩＲ−
ＭＡＬＤＩ質量分析法により組成物中の生体高分子を分析すること、それにより
生体高分子の質量の測定を可能にすることにより測定することができる。
【００３６】 ここで公開された方法はまた、目標生体高分子及び赤外線を吸収する液体マト
リックスを含むＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物を作成し、そしてＩＲ−ＭＡＬＤＩ
質量分析法を組成物に実施して組成物中の目標生体高分子を確認し、それにより
目標生体高分子を検出することにより目標生体高分子を検出するのに用いること
ができる。所望されれば、目標生体高分子は生体試料に存在するか又はそれから
得てもよい。したがって、生体試料中の目標生体高分子の存在を確認する方法を
提供する。目標核酸の存在は、例えば、核酸分子を含む生体試料(又は生体試料
から単離された核酸分子)及び赤外線を吸収する液体マトリックスを含むＩＲ−
ＭＡＬＤＩ用の組成物を作成すること；それからＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法に
より組成物を分析することにより確認することができるが、そこでは目標核酸分
子の分子質量を有する核酸分子の検出が生体試料中における目標核酸の配列の存
在を確認する。
【００３７】 また、個人から得られそして疾病又は素質に関連するところの生体高分子の特
性を検出することにより疾病又は疾病の素質を持つ個人を確認するためにＭＡＬ
ＤＩ質量分析法を用いる方法を提供する。そのような方法は、遺伝病、又は細菌
感染に関連する疾病、又はそのような疾病の素質を確認するために特に有用であ
り、そしてまた、本質、遺伝又は適応性を測定するためにも有用である。
【００３８】 ここで公開した方法は、例えば、各々が一つ又はそれ以上の目標生体高分子を
含む多数の組成物を、例えば、アレー型のチップのような固体担体上に析出させ
ることにより、一つ又はそれ以上の目標生体高分子、特に数多くの目標生体高分
子を分析するのに適している。この公開した方法は、その場合において多数の目
標生体高分子の各々が多重分析を容易にするように示差的に質量修飾されてもよ
いところの液体マトリックスを含む単一の組成物に含有される多数の目標生体高
分子の多重分析に特に適している。したがって、ここで公開した方法は高処理量
のアッセイフォーマットに容易に適用可能である。
【００３９】 核酸分子によりコード化された目標ポリペプチドの本質を測定することにより
核酸分子の配列上の情報を得る方法を提供する。この方法を実施するには、目標
ポリペプチド(又はその混合物)を目標ポリペプチドをコード化する核酸分子から
作成すること；その目標ポリペプチドの分子質量をポリペプチドと液体マトリッ
クス、又は或る態様においては、水又はコハク酸との混合物を提供しそしてＩＲ
−ＭＡＬＤＩを実施することにより測定する。目標ポリペプチドの本質は、その
目標ポリペプチドの分子質量を既知の本質の標準ポリペプチドの分子質量と比較
することにより測定される。そのことにより、目標ポリペプチドをコード化する
核酸分子におけるヌクレオチドの配列上での、突然変異の存在のような、情報が
得られる。
【００４０】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法の方法による分析に特に適した生体高分子は、核
酸、核酸類似体又は模擬体、三重らせん、ポリペプチド、ポリペプチド類似体又
は模擬体、炭水化物、脂質又はプリテオグリカンであってもよく、若しくは、タ
ンパク質−タンパク質複合体又は核タンパク質複合体又は他の複合体であっても
よい。ここに開示した方法による分析のために、目標生体高分子は、基質、特に
、例えば、ビーズ、平坦な表面、チップ、細管、ピン、コーム又はウエーハでも
よい固体担体に固定化してもよく、そして金属、セラミック、プラスチック、樹
脂、ゲル及び膜を含む種々の物質のどれであってもよい。固定化は可逆的結合(
すなわち、ビオチン／ストレプタビディンのようなイオン結合)、光切断可能結
合のような共有結合、チオール結合又は水素結合を通じてしてもよく、そしてそ
の結合は、例えば、化学的方法、酵素的方法又は物理的方法を用い、ＩＲ−ＭＡ
ＬＤＩ質量分析操作の間を含めて、切断することができる。
【００４１】 分析されるべき生体高分子は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法の前に適合化して
もよいが、それにより、例えば、質量スペクトルの分解能を改良することにより
、特定の生体高分子をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法によって分析する能力を改善
する。目標生体高分子は、例えば、イオン交換、アルキル化剤又は塩化トリアル
キルシリルとの接触又は生体高分子の少なくとも一つの質量修飾サブユニットの
取り込みにより適合化してもよい。所望されれば、生体高分子は適合化の前か又
はＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析の前に単離してもよい。
【００４２】 生体高分子の断片であってもよいところの多数の目標生体高分子における各々
の目標生体高分子の本質を測定する方法は、例えば、示差的な質量修飾した多数
の目標生体高分子及び赤外線を吸収する液体マトリックスより成るＩＲ−ＭＡＬ
ＤＩ用の組成物を作成すること；多数の示差的な質量修飾した目標生体高分子の
各々の分子質量をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により測定すること；そして多数
の示差的な質量修飾した目標生体高分子の各々の分子質量を対応する既知の生体
高分子の分子質量と比較することにより実施することができる。そのような方法
を、多数の目標生体高分子の各々が生体高分子の断片であるところの多数の目標
生体高分子を用いて実施する場合には、その断片はその生体高分子を、生体高分
子の生成に関わる結合、特に生体高分子のモノマーサブユニットの間の結合、を
切断する少なくとも一つの試剤と接触させることにより作成することができる。
【００４３】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いて生体高分子中の一つ又はそれ以上のサブ
ユニットを確認する方法、例えば、核酸配列中で突然変異を検出する方法もまた
提供する。目標ヌクレオチドの本質は、例えば、目標ヌクレオチドに近接する部
位において核酸分子と相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドと目標ヌクレ
オチドを含む核酸分子をハイブリッド形成すること、それによりハイブリッド形
成した核酸分子を生産すること；そのハイブリッド形成した核酸分子をジデオキ
シヌクレオシド又は３’-ジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡ依存ＤＮ
Ａポリメラーゼの完全な組とを接触させ、その結果、目標ヌクレオチドに相補的
であるジデオキシヌクレオシド又は３’-ジデオキシヌクレオシド三リン酸のみ
がプライマー上に伸長すること；その伸長プライマー及び赤外線を吸収する液体
マトリックスを含む組成物を作成すること；そしてその組成物中にある伸長プラ
イマーをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により検出し、それにより目標ヌクレオチ
ドの本質を測定することにより確認することができる。
【００４４】 目標核酸配列において突然変異の存在又は不在を検出する方法は、目標核酸配
列を含む核酸分子を目標核酸配列と相補的な３’末端を持つプライマーの少なく
とも一つとハイブリッド形成してハイブリッド形成した生成物を生産し；そのハ
イブリッド形成した生成物を適切なポリメラーゼ酵素及び続いて四つのヌクレオ
シド三リン酸の一つとを接触させ、それからその反応生成物及び赤外線を吸収す
る液体マトリックスを含む組成物を作成すること；そしてその組成物中の生成物
をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により検出し、そこにおいてはその生成物の分子
量が目標核酸分子においてプライマーの３’末端の隣で突然変異の存在又は不在
を示すことにより確認することができる。核酸分子における突然変異は、例えば
、その核酸分子をオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成してハイブリ
ッド形成した核酸分子を生産するが、そこにおいては突然変異部位においてミス
マッチが形成すること；そのハイブリッド形成した核酸分子を一本鎖特異的エン
ドヌクレアーゼと接触させ、それからその反応生成物及び赤外線を吸収する液体
マトリックスを含む組成物を作成すること；そしてその組成物をＩＲ−ＭＡＬＤ
Ｉ質量分析法により分析し、そこにおいては組成物中の目標核酸分子の一つ以上
の断片の存在が核酸が突然変異を含むことを示すことにより、また検出すること
ができる。
【００４５】 目標核酸配列において突然変異の存在又は不在を確認する方法は、例えば、目
標核酸配列を含む核酸分子に一組の連結反応遊離体及びＤＮＡリガーゼと少なく
とも一回のハイブリッド形成を実施すること；その反応性生物及び赤外線を吸収
する液体マトリックスを含む組成物を作成すること；そしてその組成物をＩＲ−
ＭＡＬＤＩ質量分析法により分析することにより実施することができる。そのよ
うな方法を用いて、その組成物中における連結反応生成物の検出が目標核酸配列
における突然変異の不在を確認するが、一方においてはその組成物中における連
結反応遊離体の組のみの検出が目標核酸配列における突然変異の存在を確認する
。上で公開したように、連結反応体の存在を検出する方法はまた、一組の連結反
応遊離体及び熱安定性ＤＮＡリガーゼを持つ目標核酸配列を含む核酸分子に少な
くとも一回のハイブリッド形成を実施すること；この反応生成物及び赤外線を吸
収する液体マトリックスを含む組成物を作成すること；そして組成物中にある連
結反応生成物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により確認し、それにより核酸配列
中の目標核酸の存在を検出することにより、目標ヌクレオチド又は目標核酸を検
出するのに有用であり得る。
【００４６】 生体高分子のサブユニット配列を決定する方法もまた提供する。目標生体高分
子の少なくとも一つの種類、ｉ、のサブユニット配列は、例えば、目標生体高分
子のその種類を生体高分子の生成に関わる結合を切断するために十分な試剤の少
なくとも一つと接触させて、その種類の生体高分子の欠失断片の入れ子のセット
を生産し、それからその欠失断片の入れ子のセット及び赤外線を吸収する液体マ
トリックスを含む組成物を作成すること；少なくとも一つの生体高分子断片の分
子質量をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により測定すること；そしてその組におけ
る各々の生体高分子断片の分子質量が決定されるまでそれらの工程を繰り返すこ
とにより、決定することができる。そのような方法は、多数のｉ＋１種類の目標
生体高分子の多重分析に特に適しているが、そこにおいては各々の種類の目標生
体高分子が示差的に質量修飾され、その結果、各々の種類の目標生体高分子の生
体高分子断片がＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により各々の異なる種類の生体高分
子から区別することができる。
【００４７】 少なくとも一つの種類の核酸のヌクレオチド配列を決定する方法もまた提供す
る。そのような方法は、オリゴヌクレオチドプライマーから出発し且つ鎖終結ヌ
クレオシド三リン酸の存在下で、配列決定されるその種類の核酸に相補的である
ところの相補的核酸を合成して塩基−特異的に終結する相補的ポリヌクレオチド
断片の四組を生産すること；その四組のポリヌクレオチド断片及び赤外線を吸収
する液体マトリックスを含むＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物を作成すること；各々
のポリヌクレオチド断片の分子量値をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により測定す
ること；そしてその分子量値を分子量に従い整列させることにより、その種類の
核酸のヌクレオチド配列を決定することにより実施することができる。そのよう
な方法は、ｉ＋１プライマーを使用して同時に配列決定され得るところの、多数
のｉ＋１種類の核酸の多重分析に特に適しており、そこにおいてはｉ＋１プライ
マーの一つは未修飾プライマーまたは質量修飾プライマーであり且つその他のｉ
プライマーは質量修飾プライマーであり、そしてそこにおいてはｉ＋１プライマ
ーの各々が他のものからＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により区別することができ
る。
【００４８】 目標核酸の配列もまた、少なくとも一つの部分的に一本鎖の目標核酸を一つ以
上の核酸プローブにハイブリッド形成し、各々のプローブは二本鎖部分、一本鎖
部分及び一本鎖部分を持つ測定可能な可変配列であることにより少なくとも一つ
のハイブリッド形成された目標核酸を生産すること；それからそのハイブリッド
形成された目標核酸及び赤外線を吸収する液体マトリックスを含む組成物を作成
すること； そしてその目標核酸がハイブリッド形成されたプローブの測定可能
な可変配列に基づいて、ハイブリッド形成された目標核酸の配列をＩＲ−ＭＡＬ
ＤＩ質量分析法により決定することにより、決定することができる。所望されれ
ば、この方法の工程を十分な回数で繰り返して目標核酸の全配列を決定し、そこ
においては多数の目標核酸が配列決定されて、一つ以上の核酸プローブをアレー
において固定化することができる。所望されれば、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物
を作成する前に、ハイブリッド形成された目標核酸を測定可能な可変配列に連結
することができる。
【００４９】 目標生体高分子の配列を決定する方法はまた、目標生体高分子から少なくとも
二つの生体高分子断片を生成し、それからその生体高分子断片及び赤外線を吸収
する液体マトリックスを含む組成物を作成すること； そしてその組成物中の生
体高分子断片をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により分析し、それにより目標核酸
分子の配列を決定することにより実施することができる。そのような方法は、大
きい配列の内にある生体高分子配列の二つ又はそれ以上の部分を整理するのに特
に有用である。
【００５０】 また、赤外線を吸収する液体マトリックス及び生体高分子を含むところのＩＲ
−ＭＡＬＤＩ用の組成物を提供する。特に、生体高分子及び液体マトリックスは
、その組成物中で液体マトリックスに対して生体高分子を約１０-4から１０-9の
比率で存在する。また、生体高分子が約１０ピコモル以下の生体高分子の、好ま
しくは約１００アットモルから約１ピコモルの生体高分子の量で、その中に存在
する組成物を提供する。この組成物は更に、ＩＲ−ＭＡＬＤＩによる核酸の検出
を容易にするところの添加物を含んでもよい。組成物がその上に析出するところ
の担体(又は基質)を提供する。
【００５１】 (定義) ここで引用する特許、特許出願、報文は、すべて参照文献により組みいれる。
本明細並びに請求項で用いるある種の用語及び語句の意味を以下に提示する。別
記せぬ限り、ここで用いる技術的ならびに科学的用語の意味は、その課題に属す
る当業者が通常理解しているものと同様である。
【００５２】 ここで用いる限りでは、生体高分子とは特に生体起源で見出され得るものをい
う。生体高分子は、モノマーサブユニットを含む分子であるところの生体ポリマ
ーを含み、そのサブユニットは同一又は異なってもよい。ゆえに、高分子はペプ
チド、タンパク質、小有機体、ペプチドのオリゴヌクレオチド又はモノマーユニ
ット、有機体、核酸及びその他の高分子を含む。モノマーユニットとは、それか
ら得られる分子を組み立てている構成要素の一つをいう。ゆえに、モノマーユニ
ットはヌクレオチド、アミノ酸及びそれから小有機分子が合成されるファルマコ
ホアを含む。
【００５３】 生体ポリマーとは当技術では公知のもので、例えば天然由来分子である核酸、
ポリペプチド、及び炭水化物を含む。しかし、本開示の目的には、生体ポリマー
のような生体高分子は、天然由来分子に基づくか又はそれから誘導される合成分
子であってもよく、又は核タンパク質複合体、タンパク質−タンパク質複合体の
ような高分子複合体でもよい。そのような分子が生体ポリマーである場合、それ
はモノマーサブユニットから成っていてもいなくてもよい第二の分子と関連した
モノマーサブユニットを含む分子を少なくとも一つ含むものとする。ゆえに、生
体ポリマーは、例えば、二つ又はそれ以上のヌクレオチド間にリン酸ジエステル
結合以外の結合を有するヌクレオチド配列；又は質量が修飾されたアミノ酸を一
つ以上を含むポリペプチド；若しくはＤＮＡ結合タンパク質認識部位を含むヌク
レオチド配列と関連したＤＮＡ結合タンパク質又はその突然変異体であり得る。
生体ポリマーのモノマーサブユニットは、例えば、ＤＮＡを通常構成する四種類
のヌクレオチド、ポリペプチドを通常構成する二十種類のアミノ酸、炭水化物を
構成する種々の糖、又はそのような天然由来モノマーサブユニットの誘導体、類
似体、又は模擬体であってもよい。他の生体高分子は脂質、糖ポリペプチド、リ
ンポリペプチド、ペプチドグリカン、オリゴヌクレオチド、多糖、ペプチド模擬
体、ペプチド類似体、核酸類似体及び三重らせんを含む他の核酸構造を含む。
【００５４】 ここで用いる限りでは、タンパク質に関する大生体高分子とはウシ血清アルブ
ミンよりほぼ大きなタンパク質をいう(すなわち、ほぼ６５ｋＤより大きいもの)
。
【００５５】 ここで用いる限りでは、分析するとは試料中の目標分子を確認又は検出するこ
と又は突然変異の存在又は不在やヌクレオチドの質量などの物理的又は構造的特
性の測定、若しくは生体高分子の性質をＩＲ−ＭＡＬＤＩを用いて評価するいか
なる方法をも意味する。
【００５６】 ここで用いる限りでは、用語“生体試料”は生物起源、例えば、ヒト又は他の
哺乳類のような動物、細菌、カビ、原生生物又はウイルスから得られるいかなる
物質をもいう。生体試料は、組織、細胞、細胞ペレットのような固体；尿、血液
、唾液、羊液、感染又は炎症部位からの浸出液のような生体体液；頬細胞を含有
する嗽液；細胞抽出物を含むいかなる形態、若しくは生検検体でもよい。
【００５７】 ここで用いる限りでは、用語“多形”は母集団における一形態以上の対立遺伝
子の共存をいう。多形は遺伝子と関連しない染色体領域において起こり又は、例
えば、遺伝子の対立遺伝子突然変異体又はその一部として起こり得る。少なくと
も二つの異なった形態、例えば、二つの異なったヌクレオチド配列に存在すると
ころの遺伝子の部分は“遺伝子の多形領域”という。遺伝子の多形領域は、異な
った対立遺伝子中でその本質が異なる単一ヌクレオチドでもよく、又は数個のヌ
クレオチドの長さでもよい。ここで特に興味深いものは、単一ヌクレオチド塩基
の変化によって生じる単一ヌクレオチド多形(ＳＮＰｓ)といわれる多形である。
【００５８】 ここで用いる限りでは、用語“液体分注システム” は規定量の液体を目標部
位に移送し得る装置を意味する。分注する液体量及び液体分注システムが反応混
合物でもよい液体を目標部位へ分注する速度は、手動又は自動的に調整可能であ
り、そのため目標部位は規定量の液体を保持し得る。好ましい分注システムはナ
ノリットル容積(すなわち、約１乃至１００ナノリットルの容積)の物質を分注す
べく設計されている。そのようなシステムは公知である（例えば、許可済み米国
特許出願第０８／７８７，６３９号並びに米国特許出願第０８／７８６，９８８
号に基づく公開国際ＰＣＴ出願第 ＷＯ ９８／２０２００号を参照)。
【００５９】 ここで用いる限りでは、用語“液体”とは室温、１気圧で非固体、非気体物質
を意味するために用い、それはその中に溶解、懸濁、さもなくば混合した一種又
はそれ以上の固体又は気体物質を含み得る。
【００６０】 ここで用いる限りでは、用語“目標部位”は、液体を保持し得る固体担体上の
特異的な座をいう。
【００６１】 固体担体は、無秩序的に又は、秩序的配置又は他の様式で配置された一つ又は
それ以上の目標部位を持つ。特に、目標部位はＸＹＺ座標のＺ方向への液体の増
加を制限する。ゆえに目標部位としては、例えば、ウェル又はピット、ピン又は
ビーズ、固体担体の表面上に置かれた物理的障壁、又はチップ上のビーズ、ウェ
ル中のチップ等のそれらの組み合わせであってもよい。目標部位は担体上に物理
的に置かれたり、又は担体表面上にエッチングされてもよく、又はエッチング後
に座の周囲に残る“タワー”であってもよいし、相対的な親水性、疎水性、又は
液体を主にＺ方向に増加させ得るところのその他のいかなる表面化学のような物
理化学的パラメーターによって規定されてもよい。固体担体は単一の目標部位を
持ってもよく、又は多数の同種又は異種の目標部位含んでもよく、そしてそこに
おいては、固体担体が一つ以上の目標部位を持つ場合には、例えば、各目標部位
の位置を規定している配置を含む、いかなる様式で配置されてもよい。
【００６２】 ここで用いる限りでは、用語“目標生体高分子”はＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析
法によって分析すべきところの、生体高分子の断片を含む興味ある生体高分子の
すべてをいう。例えば、目標生体高分子は遺伝子又はｍＲＮＡのような核酸、又
は制限断片又は欠失断片のような核酸の関連部分でもよい。目標核酸は、染色体
核酸の多形領域、例えば遺伝子、又は潜在的に突然変異を有する遺伝子の領域で
あってもよい。目標核酸は、ある特定の疾患やその原因疾患に特異的なヌクレオ
チド配列のモチーフ又はパターン、及び疾患のマーカーとして特異的であるが必
ずしもその疾患や症状の原因とはならないヌクレオチド配列を含むが、それに限
るものではない。目標核酸はまた、研究目的としては興味深いがしかし疾患には
直接関係しないか又は、まだ証明されていないが、疾患や症状に関連するかもし
ねないヌクレオチド配列でもよい。
【００６３】 目標生体高分子はまた、例えば多形や突然変異の存在を確認するためにＩＲ−
ＭＡＬＤＩ質量分析法が行われるポリペプチド及びその関連部分でもよい。目標
ポリペプチドはある特異的な疾患や症状の関連するタンパク質又はタンパク質の
一部をコード化するヌクレオチド配列によってコード化されてもよいし、又は翻
訳されるポリペプチドを通常コード化しないヌクレオチド配列によってコード化
されてもよい。目標ポリペプチドはまた、例えば、ジヌクレオチド繰返し体又は
トリヌクレオチド繰返し体等の配列からコード化されてもよいが、それらは染色
体核酸、例えば染色体のテロメア領域にある遺伝子のコード化又は非コード化領
域ような中に存在してもよい。目標ポリペプチドは天然由来のタンパク質から得
てもよいし、in vitro 法で核酸から合成してもよい。
【００６４】 目標生体高分子の本質は、分子の質量又は配列を対応する既知の生体高分子の
それと比較することにより測定される。
【００６５】 ここで用いる限りでは、用語“対応する既知の生体高分子”はある既知の特性
を有する生体高分子を意味し、それは、例えば、質量又は電荷、断片化剤で処理
後の断片パターン、そこで普通はその生体高分子が天然に見出される組織や細胞
種等を含む関連するいかなる特性であってもよい。対応する既知の生体高分子は
第二の生体高分子、特に目標生体高分子を比較するための対照として通常用いら
れる。目標生体高分子のスペクトルを対応する既知の生体高分子と比較すること
により、目標生体高分子に関する情報が得られる。
【００６６】 ここで用いる限りでは、対応する既知の生体高分子は、目標生体高分子と同様
なサブユニット配列を実質的に持っていても、又は実質的に異なっていてもよい
。例えば、目標ポリペプチドが単一アミノ酸差異だけ対応する既知のポリペプチ
ドと異なる対立遺伝子突然変異体である場合、そのポリペプチドのアミノ酸配列
はその唯一の差異を除けば同じとなろう。それに比べて、目標ポリペプチドをコ
ード化する核酸における突然変異が、例えば、コード化する核酸の読み取り枠を
変えたり又は停止コドンを挿入又は欠失させる場合、目標ポリペプチドの配列は
対応する既知の生体高分子の配列と実質的に異なり得る。
【００６７】 核酸に関しては、目標核酸が、例えば、前立腺がん患者のような患者から得ら
れ且つ前立腺がんに関連するトリヌクレオチド配列の増幅を証明する多形領域を
含むＤＮＡであってもよく、また対応する既知の核酸は前立腺がんを持たない患
者からの同じ多形領域であってもよい。増幅の量によっては、目標核酸は対応す
る既知の核酸よりも実質的に大きくなり得る。また目標核酸は、多形又は突然変
異遺伝子を持たない被験者と比べ被験者の表現型を変え得るような多形又は突然
変異遺伝子であってもよく、また対応する既知の核酸は、関連母集団における大
部分の患者に存在する対立遺伝子のヌクレオチド配列であってもよい。
【００６８】 目標生体高分子はより大きな生体高分子の断片であり、より大きな生体高分子
に適当な断片化剤を接触させて生産し得る。
【００６９】 ここで用いる限りでは、用語“断片化剤”は生体高分子と接触させると生体高
分子を少なくとも二つの離れた部分に切断する物理的、化学的、生物学的試剤を
いう。一般に、断片化剤はある特定の型の生体高分子に対して特異的であり、例
えば、ポリペプチドを切断するペプチダーゼ、核酸分子を切断するヌクレアーゼ
、炭化水素を切断するグリコシダーゼがある。非特異的な断片化剤もまた衆知で
あり、例えば、電離放射線又は超音波処理のような物理的試剤を含む。生体高分
子を断片化剤と接触させると生体高分子の断片を生成する。
【００７０】 ここで用いる限りでは、用語“断片”は生体高分子に関して用いる場合、その
生体高分子全体よりもより低い分子質量を持つその生体高分子の一部をいう。生
体高分子の断片とは、その生体高分子を構成するサブユニットの一つ又はそれ以
上のものであるか、欠失断片を含むサブユニットの一つ又はそれ以上を欠失した
生体高分子部分であり得る。
【００７１】 ポリペプチドの断片は、例えば、一般的にはポリペプチドの特異的な化学的又
は酵素的分解によって生成する。化学的又は酵素的切断が配列特異的に起こる場
合、ポリペプチド断片の生成は概ねそのポリペプチドの一次アミノ酸配列によっ
て規定される。ポリペプチド断片は、例えば、固体担体に固定化したポリペプチ
ドを、例えば、メチオニン残基でポリペプチドを切断するシアン化臭素又は高ｐ
ＨでＡｓｐ−Ｇｌｙを切断するヒドロキシルアミンのような化学的試剤と、又は
、例えば、Ｌｙｓ残基又はＡｒｇ残基でポリペプチドを切断するトリプシンのよ
うなエンドペプチダーゼ、又はポリペプチドのカルボキシ末端から脱離する一つ
以上の遊離アミノ酸とともにそれら一つ以上のアミノ酸を欠いたポリペプチド欠
失断片を生成するカルボキシペプチダーゼのようなエキソペプチダーゼのような
ペプチダーゼと接触させると生成する。
【００７２】 用語“欠失断片”は、生体高分子の末端からサブユニットの逐次的な切断後に
残る生体高分子の断片をいう。用語“欠失断片の入れ子のセット”とは、生体高
分子からのサブユニットの逐次的切断から生じる欠失断片の一母集団をいう。欠
失断片の入れ子のセットは、一般的には生体高分子の少なくとも一部分の各サブ
ユニットで終結する少なくとも一つの欠失断片を含み、それによって生体高分子
の配列決定を可能にする。ゆえに、“Ｎ”が生体高分子のサブユニット数である
場合、Ｎより少ない欠失断片も生成するけれども、Ｎと同じ数の欠失断片を生成
し得る。核酸断片の“入れ子のセット”はまた、例えば、ジデオキシ配列決定法
のような連鎖−停止ポリメラーゼ反応を実施することによっても用い、生成でき
ることを認識すべきである。
【００７３】 生体高分子を末端から切断する断片化剤を用いる欠失断片の生成と比べて、生
体高分子の特異的部位を認識する断片化剤で生体高分子を処理すると、“Ｍ”が
生体高分子の特異的切断部位数の場合、生体高分子のＭ+１個の断片の生成をも
たらす。例えば、内部に点在する四つのメチオニン残基を持つポリペプチドをシ
アン化臭素で処理すると、五つのポリペプチド断片の生成をもたらす。
【００７４】 核酸、炭化水素、又は他の生体高分子もまた生成し得る。例えば、ＤＮＡアー
ゼやＲＮＡアーゼを含むエキソヌクレアーゼ及び制限エンドヌクレアーゼを含む
エンドヌクレアーゼは、核酸分子の断片を生成するために使用し得る(Sambrook
et al., Molecular Cloning: A laboratory manual(核酸断片化剤をリストして
いるCold Spring Harbor Laboratory Press 1989)を参照)。核酸断片を生成する
ためのヌクレアーゼの選択は、実施する方法及びその核酸分子の特性、例えば、
それがＤＮＡ又はＲＮＡであるか、そしてＤＮＡであれば、それが必要ならば、
ヌクレアーゼが働くための認識部位を含むかどうかなどに依存する。同じく、炭
化水素の断片も、エキソグリコシダーゼ又はエンドグリコシダーゼ、例えば、α
-１，４-グリコシド結合を含む炭化水素の断片を生成できるアミラーゼ、のよう
な酵素を用いて生成し得る(米国特許第５，８２１，０６３号を参照)
【００７５】 目標生体高分子の欠失断片の入れ子のセットは、末端からその生体高分子を切
断する試剤を用いて生成できる。
【００７６】 ここで用いる限りでは、用語“生体高分子を末端から一方的に切断する試剤”
とは、生体高分子の一方の末端からサブユニットを逐次的に除去するための物理
的、化学的又は生物学的試剤をいう。生体高分子を末端から一方的に切断する生
物学的試剤は、ポリペプチドのカルボキシ末端からアミノ酸を順次に切断するカ
ルボキシペプチダーゼＹのようなエンドペプチダーゼ (米国特許第５，７９２，
６６４号；国際公開 ＷＯ９６／３６７３２を参照)、 又は二本鎖ＤＮＡの３’
−ヒドロキシル基から逐次的にヌクレオチドを切断するエキソヌクレアーゼＩＩ
Ｉのようなエキソヌクレアーゼ(国際公開 ＷＯ９４／２１８２２を参照)によっ
て例示される。物理的試剤は、光源、例えば、特にサブユニットが光不安定な結
合を通して生体高分子に結合している場合には、生体高分子から末端サブユニッ
トを切断できるレーザーがその例である。化学的試剤は、ポリペプチドから酸の
存在下で一つのアミノ末端アミノ酸を切断するフェニルイソチアシアネート(Ｅ
ｄｍａｎ 試薬)が例である。
【００７７】 ここで用いる限りでは、天然由来α-アミノ酸残基とは、天然に見出される二
十種類のα-アミノ酸残基であり、それらは人類においてはその同系ｍＲＮＡコ
ドンを持つ荷電ｔＲＮＡ分子の特異的認識によってタンパク質に組み込まれる。
【００７８】 ここで用いる限りでは、非天然由来アミノ酸とは、遺伝的にコード化されてい
ないアミノ酸をいう。好ましいそのような非天然アミノ酸は、ここでは不飽和側
鎖を持つものを含む。
【００７９】 ここで用いる限りでは、用語“ポリペプチド”は少なくとも二つのアミノ酸又
はアミノ酸誘導体を意味するが、それらは修飾ペプチド結合であってもよいペプ
チド結合で連結されたところの質量修飾アミノ酸又は非天然アミノ酸であっても
よい。典型的なポリペプチドは、それに限るものではないが、以下のものを含む
：生来のタンパク質、遺伝子産物、タンパク質複合体、突然変異又は多形のポリ
ペプチド、翻訳後に修飾したタンパク質、化学合成、in vitro 翻訳、ベクター
入れ換え、無作為又は指示的突然変異誘発及びペプチド配列無秩序化が関与する
速い進化システムを含む細胞を基にした発現システムの生成物を含む遺伝子工学
的遺伝子産物、オリゴペプチド、抗体、酵素、受容体、制御タンパク質、核酸結
合タンパク質、ホルモン、ファージ又は細菌展示法のような展示法のタンパク質
産物。
【００８０】 ポリペプチドは、コード化配列の一部に少なくとも存在するヌクレオチド配列
からか、若しくは、例えば、それがコード化枠以外の読み取り枠に存在するか、
又はそれがイントロン配列、又は３’又は５’非翻訳配列、又はプロモーターの
ような制御配列であるために、自然では翻訳されないヌクレオチド配列から翻訳
され得る。ポリペプチドはまた、化学的に合成してもよく、そして翻訳又は化学
合成後に化学的又は酵素的に修飾してもよい。用語“タンパク質”、“ポリペプ
チド”及び“ペプチド”に関しては、“ペプチド”は一般的には“ポリペプチド
”よりも小さく、また“タンパク質”はしばしば翻訳後修飾を受けるものの、こ
こでは、翻訳された核酸例えば遺伝子産物を言う場合、互換的に使用し得る。
【００８１】 ここで用いる限りでは、用語“核酸”とは少なくとも二つの共有結合したヌク
レオチド又はヌクレオチド類似体サブユニットを含むポリヌクレオチドをいう。
核酸はデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、リボ核酸(ＲＮＡ)、又はＰＮＡのようなＤＮ
Ａ又はＲＮＡの類似体であってもよく、そして、例えば、一つ又はそれ以上のヌ
クレオチド類似体又はリン酸ジエステル結合以外の共有結合(バックボーン)、例
えば、チオエステル結合、リン酸トリエステル結合又はペプチド結合を含んでも
よい(ペプチド核酸；ＰＮＡ；例えば、Tam et al., Nucleic Acids Res. 22:977
-986 (1994); Ecker and Crooke, BioTechnology 13:351360 (1995)を参照))；
三重らせんも意図されている。核酸は一本鎖、二本鎖、又はその混合物であって
もよい。ここでの目的には、別記せぬ限り、核酸は二本鎖であり又は前後より明
白である。ヌクレオチド類似体は市販入手可能であり且つそのようなヌクレオチ
ド類似体を含むポリペプチドの作成法は衆知である(Lin et al., Nucleic Acids
Res. 22:220-5234 (1994); Jellinek et al., Biochemistry 34:11364-11372 (
1995)；Pagratis et al., Nature Biotechnol. 15:68-73 (1997))。
【００８２】 核酸は一本鎖又は二本鎖のもので、例えばＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドを包む
。核酸はまた、例えば多形領域を保有する遺伝子の一部のように、より長い核酸
分子の一部であり得る。例えば、遺伝子やその一部など、核酸の分子構造はヌク
レオチド容量で規定され、それには一つ又はそれ以上のヌクレオチドの欠失、置
換、又は付加；ヌクレオチド配列；メチル化の状態；又はヌクレオチド配列の他
のあらゆる修飾が含まれる。核酸は一本鎖又は二本鎖分子を含めて、共有結合で
結合したヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を二つ又はそれ以上含み、上で考
察したように生成される核酸の“断片”は単一ヌクレオチドのように小さいこと
もあり得る。ＰＣＲプライマーのようなオリゴヌクレオチドは一般的には５０−
１００ヌクレオチド長以下であるが、ここでは用語“ポリヌクレオチド”及び“
オリゴヌクレオチド”もまた用いられ、共有結合で結合した二つ又はそれ以上の
ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を意味する。
【００８３】 ここで用いる限りでは、用語“目標生体高分子の本質の測定”は、核酸、ポリ
ペプチド、又は他の生体高分子であり得る生体高分子の特性を少なくとも一つ以
上測定することをいう。生体高分子の本質の測定とは、例えば、生体高分子の分
子量又は電荷の測定；生体高分子の少なくとも一つのサブユニット、又はサブユ
ニット配列の本質の測定；又はその生体高分子の特定の断片様式の測定を含み得
る。例えば、生体高分子が核酸である場合、目標核酸の本質の測定には、そのヌ
クレオチドを少なくとも一つ測定すること又はその縦列ヌクレオチド繰返し体配
列の反復数を決定することが含まれる。同様に、目標生体高分子がポリペプチド
である場合、その目標ポリペプチドの本質の測定には、アミノ酸少なくとも一つ
の測定又は例えばエンドペプチダーゼ処理後のペプチド断片の特定の様式の測定
が含まれる。目標生体高分子の本質の測定は、必要ならば目標生体高分子を特定
の反応、適切には；目標生体高分子又はその反応生成物と赤外線を吸収する液体
マトリックスを含有する組成物を作成；並びにＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法によ
り目標生体高分子又はその反応生成物の分析、に供し実施する。
【００８４】 ここで用いる限りでは、用語“赤外線”、“赤外波長”は、可視スペクトル中
の赤色光の波長より長くレーダー波より短い電磁波長、通常約７６０nmから約５
０μmまでの波長をいう。適切な赤外波長は、ここで開示するように、レーザー
を用いて発生し得る。
【００８５】 ここで用いる限りでは、用語“液体マトリックス”とは、脱着とイオン化を実
行する際に用いられるレーザー(すなわち、ＩＲ発光レーザー)の波長で十分な吸
光度を有し、且つ室温(約２０℃、１気圧)で液体である物質をいう。意図する液
体は、ピコリン酸又は３ＨＰＡのようなマトリックスが乾燥する際に形成するも
ののように、固体状態において結晶構造とは逆にガラス質の固体又はガラスを形
成し得るものである。ガラス質の固体及びガラスは明確な結晶状の不均一構造は
形成しないが、しかしむしろ秩序構造の欠如からくる液体の性質を保持する。更
に、そのような液体マトリックスは基質又は担体の表面につけるとき均一層を形
成する。ゆえに、本目的のためには、液体マトリックスは、生体適合性で、特に
核酸及び／又はタンパク質と適合性であるところの比較的非揮発性物質であり、
そして、それに限るものではないが、次のものを含む：グリセリンのようなグリ
コール及びポリオールを含むアルコール、スクロース、マンノース、ガラクトー
ス、及びその他の糖と多糖を含む糖、エチレングリコール、プロピレングリコー
ル、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、デキストロース、メチル
グリコシド又はソルビトール。スクロース、マンノース並びに結晶状態では結晶
構造よりむしろガラスを形成するような他のそのような物質。更に、“ガラス状
”水も含まれ、そのような状態は微量、すなわち、マイクロリットル以下、特に
ナノリットル又はそれ以下が分注されている条件下で生じる。他の液体マトリッ
クスは、トリエタノールアミンに限るものではないが、乳酸、３-ニトロベンジ
ルアルコール、ジエタノールアミン、ＤＭＳＯ、ニトロフェニルオクチルエーテ
ル(３-ＮＰＯＥ)、２，２’-ジチオジエタノール、テトラエチレングリコール、
ジチオトリエトール／エリトリトール(ＤＴＴ／ＤＴＥ)、２，３-ジヒドロキシ-
プロピル-ベンジルエーテル、α-トコフェロール、並びにチオグリセリンを含む
。他の好適な“液体”マトリックスを下に記載する。
【００８６】 吸収目的のためには、液体マトリックスは赤外線を強力に吸収する発色団又は
官能基の少なくとも一つを含み得る。適切な官能基の例は、ニトロ、スルホニル
、スルホン酸、スルホンアミド、ニトリル又はシアン化物、カルボニル、アルデ
ヒド、カルボン酸、アミド、エステル、酸無水物、ケトン、アミン、ヒドロキシ
ル、芳香環、ジエン及び他の共役系を含む。赤外線を吸収する液体マトリックス
は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩで分析すべき生体高分子と液体マトリックスを含有する組
成物を含み、生体高分子のＩＲ−ＭＡＬＤＩ分析を容易にする添加物を含有し得
る。
【００８７】 ここで用いる限りでは、適切な粘度とはガラス型液体マトリックスを分注する
ための粘度をいい、それが小容量として分注され得て且つ薄層中の小表面部分に
均等に分布することを意味する。
【００８８】 ここで用いる限りでは、用語“添加物”は生体高分子のＩＲ−ＭＡＬＤＩ分析
を容易にする物質を意味する。例えば、添加物は液体マトリックスを含有する組
成物中の生体高分子の溶解を容易にし得る。添加物はまた、例えば、ジニトロベ
ンゼン又はポリエンのように、脱着とイオン化のために用いるレーザー波長で高
い吸光係数(Ｅ)を持つ化合物や化合物群であり得る。添加物はまたマトリックッ
ス／試料又はマトリックスのイオン強度を変える化合物を含む。典型的な塩添加
物は、これに限るものではないが、アンモニウム塩及びアミンの塩を含む。この
目的のための典型的な塩添加物は酢酸アンモニウム並びにトリス−塩酸を含む。
【００８９】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩで分析すべき生体高分子が、例えば核酸である場合は、添加
物は液体マトリックスを酸性化し、それによって二本鎖核酸の解離を誘発するか
又はｔＲＮＡや他の一本鎖核酸のような核酸の二次構造を変性する化合物であり
得る。添加物はまた、マトリックスと生体高分子間の塩形成を最小化して、例え
ば、生体高分子を適合化する化合物であり得る。ＩＲ−ＭＡＬＤＩで二本鎖核酸
を分析又は検出することが望まれるときには、添加物はその二本鎖分子を安定化
するか又は二本鎖核酸の変性を減少するが、しかし一般的には質量分析と適合し
得る化合物であり得る。そのような添加物は、それに限るものではないが、塩を
含む。好ましい塩添加物としてはアンモニウム塩とアミンの塩を含む。この目的
のための典型的な塩添加物は酢酸アンモニウム並びにトリス−塩酸を含む。
【００９０】 マトリックスは、有害な誘導体及びその生成法の他の副生物を含む、他の有機
共雑物を除去するため更に精製する。
【００９１】 生体高分子及びその断片、特に目標生体高分子は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析
法に先立って適合化してもよい。
【００９２】 ここで用いる限りでは、用語“適合化された”又は“適合化”は、生体高分子
に対して用いるとき、それをイオン化し又は揮発させるに必要な赤外線の量を減
少させるために、生体高分子の不都合な断片化の可能性を最少化するために、又
は生体高分子やその断片の質量スペクトルの分解能を高めるために修飾すること
を意味する。目標生体高分子やその断片の質量スペクトルの分解能は、ＩＲ−Ｍ
ＡＬＤＩ質量分析法の実施以前に生体高分子を適合化することで増加し得る。適
合化はＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法以前のいかなる段階においても、特に生体高
分子が基質に固定化される間に実施し得る。適合化は、これらの結果を達成する
いかなる方法も含み、且つこれに限るものではないが、生体高分子を均一な電荷
分布を提供するイオン交換又は他の方法、質量修飾、核酸のリン酸ジエステルバ
ックボーンの修飾、リン酸ジエステルバックボーンから負電荷の除去、陽イオン
交換、更なる精製、及び適合化を達成するために当業者に公知な他のいかなる方
法を含む。
【００９３】 生体高分子の適合化はその生化学的性質に部分的に依拠する。例えば、生体高
分子は、陽イオン交換物質又は陰イオン交換物質による処理で適合化され、電荷
不均一性が減少し、それにより目標生体高分子に結合している陽イオン(陰イオ
ン)数の不均一性によるピーク幅増大が除去される。ポリペプチドは、例えば、
沃素化アルキル、沃素化アセタミド、沃素化エタノール、２，３-エポキシ-１-
プロパノールのようなアルキル化剤による処理で適合化され、ジスルフィド結合
の生成は阻害される。そのようなアルキル化剤はまたモノチオリン酸ジエステル
結合をリン酸トリエステル結合に変換して、核酸を適合化する。ポリペプチドも
また、リン酸ジエステル結合を非荷電誘導体に変えることにより核酸を適合化す
るために使用され得る塩化トリアルキルシリルとの接触により、荷電アミノ酸側
鎖が非荷電誘導体に変換され、適合化され得る。生体高分子はまた、対応する非
修飾サブユニットよりより安定な修飾サブユニットの挿入で適合化され、例えば
、目標核酸でのＮ７-又はＮ９-デアザプリンヌクレオチド置換は、その目標生体
高分子の断片化の可能性を最小化する。
【００９４】 ここで開示する方法は、例えば多重分析によるごとく、一回又は二、三回のサ
ンプリングにおける多数の生体高分子を分析する方法を提供する。
【００９５】 ここで用いる限りでは、用語“多重”とはＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法によっ
て少なくとも二つの目標生体高分子の本質を同時に測定することをいう。例えば
、異なった目標生体高分子の母集団が、マイクロチップ又は他の基質上に整列し
て存在する場合、多重化は多数の目標生体高分子の本質を測定するために使用で
きる。多重化は、例えば、興味深い各々の異なる生体高分子を示差的に質量修飾
し、そこで各異なる生体高分子の本質をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いて測
定することにより実施される。多重分析は、別々の質量分析をそれぞれの目標生
体高分子に対して実施しなければならないことに比較して、多数の目標生体高分
子が一つという少ないＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルで確認できるという利点
を提供する。
【００９６】 “多重化”は幾つかの異なる方法で達成し得る。例えば、幾つかの突然変異が
対応する検出(プローブ)分子(例えば、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオ
チド模擬体)を用い、一つの目標配列上で同時に検出できる。検出オリゴヌクレ
オチドＤ１、Ｄ２及びＤ３間の分子量の差異は、同時検出(多重化)が可能である
ためには十分大きくなければならない。これは配列それ自体(組成又は長さ)によ
るか又は検出オリゴヌクレオチドへの質量−修飾官能基の導入によるかのどちら
かで達成され得る。質量−修飾部分は、例えば、オリゴヌクレオチドの５’-末
端、核塩基(又は塩基)、リン酸バックボーン、そしてヌクレオシド(ヌクレオシ
ド類)の２’-位及び／又は末端３’-位のいずれかに結合させ得る。質量−修飾
部分の例は、例えば、ハロゲン、アジド、又は、Ｘは結合グループでＲは質量−
修飾官能基であるＸＲ型を含む。ゆえに質量−修飾官能基は、オリゴヌクレオチ
ド分子に規定の質量増分を導入するために用い得る。
【００９７】 質量−修飾部位、Ｍ、は、核塩基へ、例えば、Ｃ7-デアザヌクレオシドの場合
にはＣ-７へも、アルファリン酸では三リン酸基へ、又はヌクレオシド三リン酸
の糖環部の２’-位へのいずれかへ結合させ得る。更に、質量−修飾部位は、ヌ
クレオシド三リン酸の糖環状部の３’-位へ結合させるなど、鎖停止に影響する
ように結合させ得る。他の典型的な態様として、オリゴポリエチレングリコール
以外の種々の質量−修飾官能基、Ｒ、が選択され、適切な結合性化学成分、Ｘ、
を経て結合され得る。単純な質量−修飾は、Ｈを、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及び／又はＩ
のようなハロゲン又はＳＣＮ、ＮＣＳのような擬ハロゲンで置換することにより
、又は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ-ブチル、ヘキシル、フ
ェニル、置換フェニル、ベンジル、又はＣＨ2Ｆ、ＣＨＦ2、ＣＦ3、Ｓｉ(ＣＨ3) 3 、Ｓｉ(ＣＨ3)2(Ｃ2Ｈ5)、Ｓｉ(ＣＨ3) (Ｃ2Ｈ5) 2、Ｓｉ (Ｃ2Ｈ5) 3のような
種々のアルキル、アリール、又はアラアルキルを用いることにより達成され得る
。更に一つの他の質量−修飾が、核酸分子(例えば、検出器(Ｄ))又はヌクレオシ
ド三リン酸を通してホモ-又はヘテロペプチドを結合さすことにより達成され得
る。５７の質量増分をもたらす質量−修飾種を生成させる有用な一つの方法は、
オリゴグリシンの結合であり、例えば、７４(ｒ＝１、ｍ＝０)、１３１(ｒ＝１
、ｍ＝２)、１８８(ｒ＝１、ｍ＝３)、２４５(ｒ＝１、ｍ＝４)の質量−修飾が
達成される。単純なオリゴアミドもまた用いられ、例えば７４(ｒ＝１、ｍ＝０)
、８８(ｒ＝２、ｍ＝０)、１０２(ｒ＝３、ｍ＝０)、１１６(ｒ＝４、ｍ＝０)の
質量−修飾が達成され得る。質量−修飾は多重化を助けることのみならず断片の
質量分析の分解能を高めたり手助けをすることに役立つ(すなわち、質量−修飾
は分析のための核酸の適合化を助ける)。質量−修飾された化合物では用いられ
得る他の化学成分は、例えば、Origonucleotides and Analogues, A Practical
Approach, F. Eckstein, editor, IRL Press, Oxford, 1991に記載されているも
の及び質量分析の当業者に知られているものである。
【００９８】 ここで用いる限りでは、用語“多数性”とは、生体高分子に関して用いられる
とき、その各々が一つの異なったサブユニットを持つ二つ又はそれ以上の生体高
分子を意味する。配列における差異は、配列の中で自然に起こる突然変異、例え
ば、ヌクレオチド又はコード化されたアミノ酸における対立遺伝子突然変異、に
よることもあり得るし、又は種々の配列中へ特定の修飾を導入すること、例えば
、質量−修飾されたヌクレオチド又はアミノ酸を多数性にある核酸又はポリペプ
チドへ、それぞれ、示差的挿入をすることによることもあり得る。
【００９９】 ここで開示される方法は単離された生体高分子を用いて行い得る。
【０１００】 ここで用いる限りでは、用語“単離された”は、ある生体高分子がその自然状
態でそれと通常関連している多くの生体高分子から実質的に分離されることを意
味する。例えば、単離された核酸分子は、細胞中でそれと通常関連している細胞
性物質から実質的に分離されるか、又は、関連するものとして、細菌やウイルス
性物質から；組換え型ＤＮＡから生成される場合は培地から；又は核酸が化学合
成される場合には化学的前駆体又は他の化学物質から；実質的に分離され得る。
一般に、単離された核酸分子とは、それは大きな核酸の断片であってもよいが、
少なくともその自然状態に関して約５０％濃縮され、そして通常では約７０％か
ら８０％、特別には９０％又は９５％又はそれ以上濃縮されている。好ましくは
、単離された核酸は、例えば、核酸を含有する試料の少なくとも約５０％を構成
し、そして試料中にその物質が少なくとも約７０％から８０％、特に試料の少な
くとも約９０％から９５％又はそれ以上であってもよい。
【０１０１】 同様に、単離されたポリペプチドは、それが元々関連している物質に関して濃
縮されていることか又はそのポリペプチドを含む試料部分を構成することに基づ
いて確認し得るが、ここでは、上に定義されたと同程度に、すなわち、自然状態
に関して少なくとも約５０％濃縮されているか又はそのポリペプチドを含む試料
の少なくとも約５０％を構成する。単離されたポリペプチドは、例えば、それを
通常発現している細胞から精製してもよく又は組換え型ＤＮＡ法を用いて生産し
てもよく、そしてより大きなポリペプチドの断片であってもよい。
【０１０２】 生体高分子は、その生体高分子と又はその生体高分子に結合した標識と特異的
に相互作用する試薬を用いて単離し得る。例えば、目標ポリペプチドは、その目
標ポリペプチドと、又はその目標ポリペプチドに融合させた標識(すなわち、カ
ラムのように、試薬と特異的に結合することに役立つペプチド)と、又は目標ポ
リペプチドに結合したペプチド標識と特異的に相互作作用する試薬を用いて単離
され得る。
【０１０３】 ここで用いる限りでは、用語“試薬”とは、特定のリガンド結合分子又はリガ
ンドと、それぞれ、特異的に結合するリガンド又はリガンド結合分子を意味する
。用語“標識ペプチド”又は“ペプチド標識”は、質量標識と混同されるべきで
はなく、ここでは試薬が入手できるペプチドを意味するために用いる。用語“標
識(タグ)”とは、より一般的には、それに対して試薬が入手できて且つ、それゆ
えに、標識ペプチドを含む何れの分子をもいう。
【０１０４】 ここで用いる限りでは、試薬は、例えばポリペプチドのような目標生体高分子
のエピトープと、又はその目標生体高分子に結合させた標識と特異的に相互作用
する抗体であり得る。例えば、試薬はある目標ペプチドに融合させたｍｙｃエピ
トープと特異的に相互作用する抗-ｍｙｃエピトープ抗体であり得る。試薬はま
た、例えば、ポリヒスチジン標識ペプチドと特異的に相互作用するニッケルイオ
ン又はコバルトイオンのような金属イオン；亜鉛、銅、又は、例えば、ポリアル
ギニン又はポリリシン標識ペプチドと特異的に相互作用する亜鉛フィンガー領域
；ビオチン又はその誘導体のような標識と特異的に相互作用するアビジン、スト
レプトアビジン又はその誘導体(国際公開 ＷＯ ９７／４３６１７、これは、例
えば、アビジン及びストレプトアビジンを含むビオチン結合化合物からポリペプ
チドに結合した(ビオチン化された)ビオチン及びビオチン類似体を含むビオチン
化合物をアミン、特にアンモニアを用いて解離させる方法を記載している、を参
照)でもあり得る。
【０１０５】 ビオチンのような標識はまた目標核酸に挿入され、それゆえにアビジン又はス
トレプトアビジンのような試薬を用いて目標核酸の単離を可能にする。加えて、
目標核酸は、例えばビーズ、所望されれば、磁性ビーズのような固体担体に固定
化され得るところの相補的核酸配列を含む試薬へのハイブリッド形成により単離
され得る。
【０１０６】 用語“特異的に相互作用する”とは、試薬と目標生体高分子配列又はその試薬
が結合している標識に関して用いるとき、結合が比較的高い親和性で起こること
を示す。そのようなものとして、試薬は、特定の生体高分子配列又は標識に対し
、少なくとも約１ｘ１０6Ｍ-1、一般的には、少なくとも１ｘ１０7Ｍ-1、そして
特別には、少なくとも１ｘ１０8Ｍ-1の親和性を有する。例えば、ある特定の標
識ペプチドと特異的に相互作用する試薬は、他の無関係の分子の存在と無関係に
その標識ペプチドと第一に結合するので、その標識ペプチドを含む試料から、例
えばin vitro 翻訳反応から、その標識ペプチドに融合された目標ポリペプチド
を含む標識ペプチドを単離するのに有用である。同様に、目標核酸と特異的に相
互作用する核酸配列に相補的な試薬は選択的にその目標核酸と結合するが、無関
係な核酸分子とはしない。
【０１０７】 一般的にはオリゴヌクレオチドであるハイブリッドを形成する核酸配列は、少
なくとも９ヌクレオチドの長さであり、そのような配列はポリメラーゼ連鎖反応
(ＰＣＲ)のプライマーとして特に有用であり、また少なくとも１４ヌクレオチド
の長さ又は、所望されれば、少なくとも１７ヌクレオチドの長さであってもよく
、その配列は、ＰＣＲと同じく、特にハイブリッド形成に有用である。例えば、
ＰＣＲプライマーのようなオリゴヌクレオチドと、例えば、目標核酸である核酸
配列との特異的ハイブリッド形成に求められる条件は、部分的に、配列間で分注
される相補性の程度、ハイブリッドを形成する分子のＧＣ含量及びアンチセンス
核酸配列長に依存すること、並びに、特異的なハイブリッド形成を得るために好
適な条件は容易に利用できる公式に基づいて計算され得るか又は経験的に測定さ
れ得るということを認識すべきである[Sambrook et al., Molecular Cloning：A
Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology(Green Publ., NY 1989)]。
【０１０８】 開示方法を実行するには、生体高分子例えば目標核酸又は目標ポリペプチドを
、基質として、特にビーズ、マイクロチップ、ガラス又はプラスチック製細管の
ような固体担体、又は、ウェル、ピン又はその目標生体高分子を一つの部位に拘
束する他の手段のような構築物を含む何れかの表面、特に平坦な平面に固定化す
ると有利であり得る。生体高分子は以下のものを含む種々の手段によって固体担
体に複合され得る：例えば、ビオチンに対するアビジン又はストレプトアビジン
の相互作用；疎水相互作用；例えばストレプトアビジン被覆磁性ビーズＤＹＮＡ
ＢＥＡＤＳのように官能化された磁性ビーズ(Dynal社；Great Neck NY，米国)を
用いる磁気相互作用；二つの極性表面間又はオリゴ／ポリエチレングリコール間
の“浸潤”会合のような極性相互作用；アミド結合、ジスルフィド結合、チオエ
ーテル結合、又はそれと類似のもののような共有結合の生成；交差結合剤を通し
て；及び酸不安定性又は光切断性のリンカー[例えば、Hermanson、Bioconjugate
Techniques(Academic Press 1996) を参照]。更に、標識は興味のある生体高分
子、特に目標生体高分子に複合されてもよい。
【０１０９】 ここで用いる限りでは、用語“複合した”、“固定化した”は、共有結合でも
非共有結合でもよく、定められた条件下で安定である結合をいう。ここで開示す
るように、生体高分子は基質に固定化され得るし、最初の基質は第二番の基質に
複合化され得る。生体高分子の基質への固定化は、直接的なものでもリンカーを
通じた間接的なものでもよく、可逆的又は非可逆的なものでもよい。可逆的固定
化は、例えば光切断性の結合を切断するために光を用いて切断するか、又はその
結合を逆にする条件、例えばジスルフィド結合を逆にする還元条件に結合を置く
ことの何れかによって逆にし得る。
【０１１０】 ここで用いる限りでは、用語“基質”、“固体担体”は、反応性基を含む生体
高分子を含めて、官能基がそれに複合され得る平坦な表面又は構造を持つ表面を
いう。用語“構造を持つ表面”は、反応性基を含む生体高分子を含めて、官能基
がそれに連結され得る、例えばウェル、ピン、及びそれに類似のものを含む基質
を意味する。多数の固体担体(基質)の例はここで開示するかさもなければ公知技
術である。
【０１１１】 ここで開示される方法は、疾病又は症状を持つか又は素因がある被験者を確認
するために使用し得る。ここで用いる限りでは、用語“疾病”は被験者における
病理学的状態の普通に理解されている意味を持つ。用語“症状(condition)”は
、生体高分子の適合化(conditioning)からは区別されるべきで、ここでは例えば
病理学的状態又は、部分的に、いかに被験者が刺激に応答するかを測定する状態
を含めて、被験者のいかなる状態をも意味する。被験者の症状は、部分的には、
被験者が例えば移植片に如何に応答するか又はある特定の薬剤に如何に応答する
かについて示唆を与え得る被験者の遺伝子型を測定したり、又は、例えばある特
定の疾患に関連する炭水化物の発現等、被験者から得られる生体試料中の特定の
生体高分子を検出することによって決め得る。したがって、ある症状の素因があ
る被験者を参照することは、例えばその被験者が特定の薬剤に順調に反応しない
又は特定の移植片を拒絶するだろうということを示唆する遺伝子型を持つことを
示し得る。
【０１１２】 ここである疾患又は症状に“関連する”対立遺伝子又は対立遺伝子突然変異体
を参照することは、特定の遺伝子型が、少なくとも部分的には、その疾患又は症
状の素因がある被験者の母集団で示される遺伝子型に特有であることを意味する
。例えば、ＢＣＲＡ１遺伝子突然変異のような対立遺伝子突然変異は乳がんに関
連し、特定の遺伝子中のトリヌクレオチド数の正常値より高値のような対立遺伝
子突然変異は前立腺がんに関連する。技術専門家は、標本抽出や母集団の解析の
衆知の統計法を用いて対立遺伝子突然変異と疾患や症状との関連が確認できるこ
とを承認するであろう。
【０１１３】 ここで用いる限りでは、組成物は物質の混合物を示し溶液も同様である。
【０１１４】 別に開示する以外、ここで記述する方法の実施は、細胞生物学、細胞培養、分
子生物学、形質転換生物学、微生物学、組換えＤＮＡ，及び免疫学、慣習的な技
術を用い、これらはその専門技術に入り、例えば以下に記載されている、DNA Cl
oning, Volumes I and II(D.N. Gkover, ed,. 1985); Oligonucleotide Synthes
is (M，J，Gait，ed,. 1984); Mullisら，米国特許第４，６８３，１９４; Nucl
eic Acid Hybridization (M， Hames and Higgins，ed,. 1984); Transcription
and Translation(M， Hames and Higgins，ed,. 1984); culture of Animal Ce
lls (R．I．Freshney; Alan R．Liss， Inc，1987); Immobilized Cells and En
zymes(IRL Press，1986)； B．Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloni
ng(1987)； Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos，
eds．，Cold Spring Harbor Laboratory 1987) ；Methods In Enzymology， Vol
s．154 and 155(Wu et al．，Academic Press，NY)；Immunological Methods In
Cell And Molecular Biology(Meyer and Walker，eds．，Academic Press Lond
on，1987) ；Handbook Of Experimental Immunology ， Volumes I to IV(Weir
and Blackwell eds．，1986) ； Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring
Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor NY，1986)。
【０１１５】 (ＩＲ−ＭＡＬＤＩで使用するための方法と組成) ここで開示する方法と組成は、赤外(ＩＲ)補助レーザー脱着／イオン化質量分
析法(ＭＡＬＤＩ)による以下を含む生体高分子の検出、確認、又は特徴付けを可
能とする：核酸、ポリペプチド、炭水化物、及びタンパク質複合体及び核タンパ
ク質のような高分子複合体。ＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成、すなわち、少なくとも
ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法で分析すべき生体高分子と赤外線を吸収する液体マ
トリックスを含む組成、を提供する。基質上に置かれ得るそのような組成は、Ｉ
Ｒ−ＭＡＬＤＩ質量分析法による生体高分子の特質を測定するために有用である
。
【０１１６】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いて目標生体高分子を分析するための以下を
含む方法を提示する：例えば、試料、特に生体試料中の目標生体高分子を検出す
る方法；突然変異又は核酸における他の遺伝的変化の存在又は遺伝的変化を有す
る核酸によりコード化されたポリペプチド中のアミノ酸変化の存在のような、生
体高分子の本質を測定する方法；生体高分子の配列を決定する方法。ここで開示
する方法は、別々にではあるが、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法による一つ又はそ
れ以上の生体高分子の分析を可能にする、しかし、ハイスループット法のような
関連方法は生体高分子を連続的に分析でき、また例えば生体高分子をシリコンウ
ェーハ上にアレーに配置し、パラレルに分析し得る；又は多重化フォーマットを
用いる単一方法では、多数性の生体高分子の各々を、例えば生体高分子の示差的
な質量修飾によって、示差的に確認し得る。
【０１１７】 開示した方法と組成は、部分的には、赤外電磁波を放出するレーザーを用いて
核酸を液体マトリックス中で脱着及びイオン化することにより巨大核酸分子(Ｄ
ＮＡ及びＲＮＡ)の高分解能質量スペクトルが得られるという知見に基づく。し
たがって、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法を行うための一つの方法を次に提示する
：核酸組成を液体マトリックスと混合し、マトリックス／核酸組成を形成せしめ
、更にその組成を基質上に置きマトリックス／核酸組成の均一で薄い層を形成せ
しめる。そこで核酸を脱着及びイオン化せしめるため、核酸を含む基質にマトリ
ックスが吸収する適切な赤外線を照射し、それによって放出されるイオン粒子を
質量分析計が抽出(分離)、分析して生体高分子の質量を測定するものである。核
酸を質量分析法で分析する方法は、核酸と液体マトリックスを含む組成を基質上
に置きマトリックス／核酸組成の均一で薄い層を形成せしめ；そこで核酸を含む
基質に赤外線レーザーを照射し、核酸を脱着及びイオン化せしめる；そして質量
分離と解析の適切なフォーマットを用いイオン化した核酸粒子を分離、検出する
ものである。
【０１１８】 目標生体高分子と赤外線を吸収する液体マトリックスとを含む組成を形成せし
め、その組成中の目標生体高分子をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法で分析すること
によって、目標生体高分子特に目標核酸を分析する方法を提示する。ここで提示
する種々の方法は、目標生体高分子の分子量の測定、生体試料中に存在し得る目
標生体高分子の検出と確認、又は目標生体高分子のサブユニット配列の測定を可
能にする。目標生体高分子の起源によって、ここで開示される方法は、例えば、
個人の疾患又は疾患に対する素因の存在又は不在、又は個人の家系、同一性、又
は適合性の決定に有用である(国際公開 ＷＯ９８／２００１９を参照)。
【０１１９】 目標生体高分子、例えば目標核酸、は被験者から、特に被験者の細胞又は組織
から又は体液即ち生体試料から得られる。目標生体高分子が目標核酸又は目標ポ
リペプチドである場合、これらは、例えばその目標ポリペプチドをコード化して
いるＲＮＡのin Vitro翻訳により得られる；又は転写すべき核酸を被験者から入
手、目標ポリペプチドをコード化している核酸のin Vitro転写、次いでin Vitro
又は細胞中での翻訳により得られる。ここで開示した方法は、目標生体高分子に
関する情報を確認又は取得するめの速くて信頼できる方法を提供する。
【０１２０】 （生体試料から得られる目標分子の検出におけるＩＲ−ＭＡＬＤＩの典型的な利
点） ある程度精製された目標分子を含む生体試料でも、まだ純粋試料中には存在し
ない外来性共雑物を含有しがちである。例えば、外来性のタンパク質や塩が部分
的に精製された試料中に存在し、そのような試料を現実には純粋試料とは反対に
混合物としている。したがって、生体試料から得られる目標分子の存在の検出を
目的とする質量分析法では、質量分解能、精度、感度及びシグナル対ノイズ比が
非常に決定的なパラメーターになる。質量分析法の技術は、かなりの量では存在
しない目標分子を共雑物質から明確に測定できなければならない。
【０１２１】 それゆえに、ある特定の質量分析法が比較的純粋な生体分子の質量を測定する
ために用いられ得るという事実は、生体試料から得られる目標分子の検出に応用
できるという保証にはならない。更に、種々の型の質量分析法における固有差(
例えば、ＥＳＩとＭＡＬＤＩは異なったレーザー及び／又はマトリックスを使用
)のために、ある質量分析技術がある生体試料から得られる目標分子の検出に有
用であるという事実は、他の型がまたこの目的に適しているという保証にはなら
ない。したがって、ある特定の質量分析法又は条件が生体試料からのある特定の
型の目標分子の検出に使用され得るという事実は、それが生体試料から他の型の
目標分子の検出に効果的に使用され得ることを保証しない。例えば、丁度全く異
なる組の生体試料からの目標分子、例えば核酸対タンパク質、が異なった質量分
析法や条件では検出されたりされないことがあり得るように、ある一つの組の生
体試料からの目標分子の異なるサイズや型さえも(例えば、一本鎖対二本鎖ＤＮ
Ａ)異なった質量分析法や条件では検出されたりされないことがあり得る。
【０１２２】 タンパク質と核酸の比較が、それらの質量分析法に対する順応性に直接衝撃を
与える幾つかの差異を明らかにする。例えば、核酸は異なった塩基とデオキシリ
ボース部位間の不安定なＮ-グリコシド結合の結果、核塩基の離脱と脱プリンに
よって典型的にタンパク質よりも断片化をより受けやすい。また核酸のスペクト
ルは、タンパク質よりも付加体生成のより大きな傾向を示す。更に、脱着／イオ
ン化の相対的容易さは核酸に比べてタンパク質が大きく、その理由はタンパク質
が規定構造に折り畳む傾向を示す反面、核酸はタンパク質と比べて三次構造をと
ることが少ないためである。
【０１２３】 ここで開示するように、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法は、生体試料から得られ
た目標分子、特に大きな目標分子、の検出法の中で効果的且つ有利である。この
ことは、部分的には、生体試料から得られた目標分子を検出するために要求され
るもので、分解能、感受性、シグナル対ノイズレベルを規定する最適パラメータ
ー(例えば、特定の組み合わせのレーザー、波長、マトリックス、添加物、パル
ス幅、光線プロフィル、温度及び／又はフルエンス)を規定する重要性を認識し
たことに起因するものである。
【０１２４】 例えば、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法による目標分子の検出では、特に光電子
工学スウィッチを有するレーザーを使用し、より短いパルス幅が使用できる。Ｉ
Ｒ−ＭＡＬＤＩ質量分析法による検出では、典型的には約９０ｎｓより低いパル
ス幅、一般的には８０ｎｓが用い得る。
【０１２５】 更に、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法による目標分子の検出では、イオン抽出の
ためより低電界度を用い得る。ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法による目標分子の検
出では、典型的には約１０００Ｖ／ｍｍ以下、約２００Ｖ／ｍｍまでの電界力を
用い得る。更に、単ショットイオンシグナルはＵＶ−ＭＡＬＤＩ質量分析法で得
られるものよりも３−５倍強く、十分なシグナル対ノイズ比を得るためのショッ
トをより少なくできる。
【０１２６】 これらの改善によって、レーザーフルエンス(検体上の単位面積当たりのエネ
ルギー)の選択はそれほど重要でなくなる。ＵＶ−ＭＡＬＤＩ質量分析法での相
当なイオン断片化の危険を避けるために、開示されたＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析
法では、目標分子を検出するためにフルエンスをＨ0と１．５Ｈ0の間の値に制限
する必要があるが、特にグリセリンをマトリックスとして用いるときは、３Ｈ0
又は５Ｈ0までのフルエンス値を用い得る。
【０１２７】 更に、グリセリンを、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法でマトリックスとして用い
るときは、目標分子の存在及び非存在に対して分析される検体の中の塩、バッフ
ァー、界面活性剤などの共雑物に対して、特に許容性があることが見出されてい
る。このことは目標ポリぺプチド、特に大きなポリぺプチドをグリセリンをマト
リックスとしてＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法で検出する際、驚異的に有利となっ
たが、理由は生体試料から得られるポリペプチドがそのような共雑物を含有し得
るためである。そのような共雑物、例えば塩は、従来のより酸性の固体マトリッ
クスを使用するポリペプチドのＵＶ−ＭＡＬＤＩ質量分析法を妨害し得る。した
がって、生体試料からの目標分子の精製は、グリセリンをマトリックスとして用
いるＩＲ−ＭＡＬＤＩ分析用の試料の作成においては、ＵＶ-ＭＡＬＤＩによる
よりも、少なくてすむ。
【０１２８】 グリセリンマトリックスをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法で用いる場合には、ア
ナライト対マトリックスのモル比は、結晶性マトリックスに対するよりもそれほ
ど重要でなくなる。５ｘ１０-3及び１ｘ１０-6の範囲にあるアナライト対マトリ
ックスのモル比は、イオンシグナルの実質的な分解なしで、目標分子のＩＲ−Ｍ
ＡＬＤＩ質量分析法で用い得る。これは、生体試料の分析において特に目標分子
の濃度が分からないとき有利である。
【０１２９】 ここで記述したごとくこれらの改良条件並びに他の条件と方法により、かなり
大きな、例えば、生体試料からの目標分子である５００ｋＤａより大きいタンパ
ク質又は７００ｋＤａより大きい核酸に対する明瞭なシグナルがＩＲ−ＭＡＬＤ
Ｉ質量分析法を用いて得られ得る。したがって、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法に
よって、混合物、共雑物、不純物の存在のために分析が困難で周知の生体試料か
ら目標分子、特に大きな目標分子、の検出が可能となり、且つ更に、大規模診断
とスクリーニング法に要望される自動化も容易になっている。
【０１３０】 (生体分子のＩＲ−ＭＡＬＤＩ分析のための組成物) ＩＲ−ＭＡＬＤＩに好適な組成物をここで提供する。ここで“ＩＲ−ＭＡＬＤ
Ｉ用の組成物”というそのような組成物は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩによって分析され
るべき生体高分子と赤外線を吸収する液体マトリックスを含有する液体混合物で
あり得る。ＩＲ−ＭＡＬＤＩによる分析に好適な生体高分子は、例えば、核酸、
ポリペプチド又は炭水化物であってもよく、又は核タンパク質複合体、タンパク
質-タンパク質複合体、多糖、デクストランやデキストリンのようなオリゴ糖、
脂質、リポ多糖及び他の高分子のような高分子複合体であってもよい。
【０１３１】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物は、生体高分子、例えば、核酸と液体マトリック
スを一般的には約１０-4乃至１０-9の比で持つ。ＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物は
、分析する生体高分子の約１０ピコモルより少量の、例えば、１００アットモル
から１ピコモル(ｐｍｏｌ)の生体高分子を含んでもよい。ＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の
組成物はまた、その生体高分子の検出を容易にする添加物を含有し得る。例えば
、添加物は液体マトリックスにおける生体高分子の混和性を改善し得る。例えば
、組成物は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩにより分析する生体高分子として核酸をそして液
体マトリックスとしてグリセリンを含有し得る。液体マトリックスは、所望され
れば、リン酸バックボーンとのアルカリ塩生成を減少させるために、核酸と混合
する以前に陽イオン交換樹脂で処理してもよい。
【０１３２】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組成物は、基質、例えば、シリコンウェーハ、ビーズ、
当業者の知る他の固体担体、上に析出され、それによりＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の組
成物をその上に析出する固体担体を提供する。
【０１３３】 特に、固体担体がシリコンウェーハで且つＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の複数の組成物
はアドレサブルなアレーでウェーハ上に析出し得る。所望されれば、ＩＲ−ＭＡ
ＬＤＩ用の組成物は、例えば質量修飾によってその生体高分子を位差的に確認し
得るならば、二つ又はそれ以上の分析する生体高分子を含有し得る。
【０１３４】 (液体マトリックス) 上で定義したように液体マトリックスは、興味の高分子と適合し、ＩＲを吸収
し、ガラス(結晶構造よりはむしろ)を形成し得る物質をいう。液体マトリックス
は脱着とイオン化のために用いるレーザーの波長で十分な吸収を持ち、且つ室温
(１気圧)で液体(固体又は気体でない)である。
【０１３５】 更に、ここでＩＲ−ＭＡＬＤＩを行う目的のために、タンパク質及び核酸の診
断と検出の方法のための態様における意図したマトリックスは、また結晶構造を
形成する物質を含有し得る。そのような物質には、それに限るものではないが、
水、氷、コハク酸、ピコリン酸及び他の酸が含まれる。これらの型の物資には、
冷却、乾燥、及び／又は圧力下で秩序構造を形成するものが含まれる。そのよう
な型のマトリックスは、ＩＲ−ＭＡＬＤＩを用いたタンパク質の検出に使用する
ことを意図する。コハク酸がＲ-ＭＡＬＤＩのために選択された基質(又は担体)
に分注されるとき、好ましくは、核酸は分注以前に加えられるべきである。基質
上で乾燥する他のマトリックスの場合、核酸はその乾燥したマトリックス物質に
加え得る。
【０１３６】 吸収目的には、液体マトリックスは、赤外線を強力に吸収する少なくとも一つ
の発色団又は官能基を含み得る。好適な官能基の例としては、ニトロ、スルホニ
ル、スルホン酸、スルホナミド、ニトリル又はシアン化物、カルボニル、アルデ
ヒド、カルボン酸、アミド、エステル、酸無水物、ケトン、アミン、ヒドロキシ
ル、芳香環、ジエン及び他の共役系が含まれる。
【０１３７】 好ましい液体マトリックスは、飽和又は不飽和である(１)グリセリンのような
グリコール、１，２-プロパンジオール又は１，３-プロパンジオール、１，２-
ブタンジオール、１，３-ブタンジオール、１，４-ブタンジオール及びトリエタ
ノールアミン、スクロース、マンノース、並びに他のポリオールを含むアルコー
ル、好ましくは非揮発性液体(又は低揮発性液体)；(２)ギ酸、乳酸、酢酸，プロ
ピオン酸、ブタン酸、ペンタン酸及びヘキサン酸を含むカルボン酸、並びに、こ
れらのエステル；(３)分岐するか又は分岐していない、アセトアミド、プロパン
アミド、ブタンアミド、ペンタンアミド及びヘキサンアミドを含む第一級又は第
二級のアミド；(４)プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシル
アミン、ヘプチルアミン、ジエチルアミン及びジプロピルアミンを含む第一級又
は第二級アミン；(５) ニトリル、ヒドラジン及びヒドラジドを含むが、これに
限るものではない。
【０１３８】 特に好ましい化合物は、８又はそれより少ない炭素数を含む。例えば、特に好
ましいカルボン酸並びにアミドは、８又はそれより少ない炭素数を、好ましいア
ミンは約３から約７の炭素数を、そして好ましいニトリル化合物は８又はそれよ
り少ない炭素数を含む。いかなる程度でも不飽和である化合物は、不飽和性が化
合物に液体性を付与するため、より多数の炭素数を含み得る。液体マトリックス
として使用される特定の化合物は官能基を含まなければならないが、このマトリ
ックスは、好ましくは、それが分析すべき核酸を断片化したりさもなくば損傷す
るほど反応性でないものである。
【０１３９】 適切な液体マトリックスは、核酸と適合性の溶媒と混和しなくてはならない。
好ましくは、液体マトリックスはまた、単独又は核酸と適合性の溶媒と混合した
マイクロリットル又はナノリットル容積のマトリックスの分注を容易にするため
に、例えば、典型的には約１．５ｓ／ｍ2より小さいか又は同等の、好ましくは
、約１ｓ／ｍ2から約２ｓ／ｍ2の範囲において、室温でのグリセリンの値である
ところの適切な粘度を持つべきである。
【０１４０】 ここで使用するためには、液体マトリックスは、通常分析を完了するために典
型的には１０-10ミリバールの圧力範囲を有する分析計の真空中で適切な残存時
間をもたなければならない。適切な残存時間を持つ液体は“真空安定”であり、
それは厳密には、今度は試料温度に強く依存するところのマトリックスの蒸気圧
の関数である性質のものである。好ましいマトリックスは室温で低蒸気圧を持ち
、その理由によって、１０-5ミリバールより低いか同一の後背圧を有する質量分
析計中で、試料の分析に必要な時間、例えば１０分から２時間、に蒸発する量が
試料の約５０パーセント以下である。例えば、単一の試料に対して分析が何分間
かで実施し得ても、一方では、多数の試料では分析は完了するまでに何時間も必
要とし得る。
【０１４１】 グリセリンは、例えば、室温、真空中で約１０分から１５分間マトリックスと
して使用され得る。もしグリセリンを単一真空容器中で多試料の分析に用いると
すれば、試料を保つためには、その真空容器を分析完了に要する時間の間は−５
０℃から−１００℃ (約１７３゜Ｋから２２３゜Ｋ)の温度範囲に冷却する必要が
あろう。−２００℃のようなより低い温度も使用し得る。トリエタノールアミン
は、対照的にグリセリンよりも非常に低い蒸気圧を有し、室温でさえも真空中で
少なくとも一時間残存し得る。
【０１４２】 種々の液体マトリックスとそのようなマトリックスへの添加物との混合物が、
上記の性質の一つ又はそれ以上を付与するために望ましい。例えば、適切な液体
マトリックスは、ＩＲ吸収発色団を含む少量の組成物及び、例えば、そのなかで
核酸が可溶性であるところの多量の赤外不可視(非吸収性)物質を含有し得る。ま
た、脱着及びイオン化のために用いるレーザー波長で高い吸光係数(Ｅ)を持つ一
つ又は数つかの化合物、例えばジニトロベンゼン又はポリエン、の少量で“ドー
プされた”マトリックスの使用も有用であり得る。液体マトリックスを酸性化さ
せる添加物もまた、二本鎖核酸を解離させ、ｔＲＮＡ又は他のＲＮＡのような核
酸の二次構造を変性させるために加え得る。別の添加物もマトリックスとリン酸
バックボーン間の塩生成を最少化にするのに役立ち得る。例えば、その添加物は
アンモニウム塩又はマトリックスからアルカリイオンを除去するところのアンモ
ニウム添加イオン交換ビーズを含み得る。代わりに、液体マトリックスは、マト
リックスとリン酸バックボーン間の塩生成を最少化するために、核酸組成物との
混合以前に蒸留され得る。
【０１４３】 液体マトリックスは、また粘度と蒸発速度を調節するために、適当量の水又は
他の液体と混合し得る。すべての水は質量測定の間に蒸発するから、取り扱い容
易な量、例えば１μｌ、は試料作成や移送に有用であり得るが、しかしやはりご
く少量の液体マトリックスを生じる。したがって、ごく少量の核酸試料が、最終
の液体マトリックス滴中において約１０-16から約１０-12モル(約１００アット
モルから約１ピコモル)の核酸を生み出すのに必要とされるのみである。
【０１４４】 ここで開示するごとく、グリセリンがマトリックスとして用いられるとき、最
終的なアナライト対グリセリンモル比(濃度)は、約１０4ダルトンから１０6ダル
トンに範囲がわたる核酸の質量及び利用可能な核酸の全量に依存して、約１０-4 から１０-9の範囲にあるべきである。例えば、ここで開示される感受性テストに
対して、比較的高濃度の使用される核酸は標準的なＵＶスペクトル法で測定され
た。実用的にいえば、例えばＰＣＲ又は転写反応から一般的に生成される適切な
量が一般的に知られている。特定された広い領域は、分析される核酸の実際の量
が決定的ではないということを示す。典型的には、より多量の核酸はより良いス
ペクトルを生み出す。核酸試料が希釈を要する場合もあり得る。
【０１４５】 その他の液体マトリックスは、トリエタノールアミン、乳酸、３-ニトロベン
ジルアルコール、ジエタノールアミン、ＤＭＳＯ、ニトロフェニルオクチルエー
テル(３-ＮＰＯＥ)、２，２'‐ジチオジエタノール、テトラエチレングリコール
、ジチオトレイトール／エリトリトール(ＤＴＴ／ＤＴＥ)、２，３‐ジヒドロキ
シ‐プロピルベンジルエーテル、α-トコフェロール及びチオグリセリンを含む
が、これらに限定されるものではない。
【０１４６】 (生体高分子の固体担体又は基質への固定化) ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析のためには、目標生体高分子又は他の興味の生体高
分子は、その取り扱いを容易にするために、基質特に固体担体に固定化し得る。
固体担体はその技術でよく知られており、そして核酸、タンパク質、炭水化物等
(例えば、国際公開 ＷＯ ９８／２００１９を参照)を連結するための固体担体と
して用いられるいかなる物質をも含む。
【０１４７】 その基質は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法の分析条件を損なわないよう選択さ
れ、そして、生体高分子の固定化のために機能化され得るか又は、所望されれば
、第二の固体担体に更に会合され得る。例えば、基質、ビーズを第二の固体担体
に結合すべき場合には、生体高分子は機能化されたビーズに、それが第二の担体
に結合される以前、間、又は以後に固定化し得る。
【０１４８】 生体高分子は直接固体担体に結合させるか、若しくは、担体、又は担体に結合
したリンカー、又はその生体高分子、又はその両者の何れかに存在する官能基を
通して間接的に固定化され得る。例えば、ポリペプチドは固体担体に担体−ポリ
ペプチド間で疎水性の、親水性の、又はイオン性の相互作用を通して固定化され
得る。そのような方法は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法の前の生体高分子の適合
化のようなある種の取り扱いには有用であり得るが、そのような直接相互作用は
生体高分子の配向性が不明であり且つ相互作用をするサブユニット、例えばポリ
ペプチド中の疎水性アミノ酸、の位置上に無秩序に置かれ得るという点で限界が
ある。したがって、ポリペプチド又は他の生体高分子は通常、担体又は生体高分
子の何れか又はその両者にある官能基を通しての結合により規定の配向で固定化
される。
【０１４９】 生体高分子は適当な官能基を、その末端、例えば核酸の５’又は３’末端、又
はポリペプチドのカルボキシル末端又はアミノ末端、又は生体高分子の反応性基
、例えば、ヌクレオチドの反応性基又は核酸のリン酸ジエステルバックボーン、
又はアミノ酸の反応性側鎖、又はポリペプチドのペプチドバックボーンに加える
ことによって修飾され得る。核酸における天然由来ヌクレオチド又はポリペプチ
ドにおける天然由来アミノ酸もまたポリペプチドを固体担体に結合させるのに好
適な官能基を含み得る。例えば、ポリペプチド中に存在するシステイン残基は、
そのポリペプチドをスルフヒドリル基を持つ基質、例えば、それに結合したシス
テイン残基を有する固体担体に、ジスルフィド結合により固定化するために使用
し得る。二つのアミノ酸間に形成され得る他の結合は、例えば、ポリペプチド中
に挿入され得る非天然アミノ酸である二つのランチオニン残基間のモノスルフィ
ド結合；Ｇｌｕのγ-カルボキシ基(又はＡｓｐのβ-カルボキシ基)とＬｙｓのε
-アミノ基間のように、酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸の側鎖間のアミド転移反
応によって形成されるラクタム結合；又は、例えば、Ｓｅｒのヒドロキシ基とＧ
ｌｕのγ-カルボキシ基(又はＡｓｐのβ-カルボキシ基)間での架橋によって形成
されるラクトン結合を含む。かくして、固体担体は、望みのアミノ酸残基、例え
ば、Ｇｌｕ残基を含むように修飾され、そしてＳｅｒ残基、特にカルボキシ末端
又はアミノ末端にＳｅｒを保有するポリペプチドは、ラクトン結合の生成を通し
て固体担体に結合され得る。しかしながら、担体は、ポリペプチド中のＳｅｒと
のラクトン様結合を形成することを望む場合、特定のアミノ酸、例えばＧｌｕを
含むように修飾する必要はなくて、その代わりに、利用可能なカルボキシル基を
含むように修飾し得て、それによりＧｌｕのγ-カルボキシ基に対応する機能を
提供することを認識すべきである。
【０１５０】 生体高分子は、例えば、その生体高分子中の適当な位置、一般的には生体高分
子の末端、に化学的又は物理的な部分を挿入することにより、固体担体への固定
化を容易にするように修飾され得る。しかしながら、技術者は、そのような修飾
、例えばビオチン部分の挿入は、ある特定の試薬が生体高分子と特異的に相互作
用することに影響することを認識し、そして、したがって、もし適切であるなら
ば、興味の生体高分子を如何に最良に修飾するかの選択でこの因子を考えるであ
ろう。
【０１５１】 ここで提示する方法の一つの観点では、興味のポリペプチドが固体担体に共有
結合的に結合され、その固定化されたポリペプチドが、その固定化されたポリペ
プチドに結合する目標ポリペプチドを捕捉するために用いられ得る。目標ポリペ
プチドはそこでＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法のためイオン化又は揮発によって固
定化ポリペプチドから遊離され、一方においては、共有結合的に結合したポリペ
プチドは担体に結合して残る。
【０１５２】 したがって、ここで開示する方法は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩを使用することにより
、その興味のポリペプチドと特異的に相互作用するポリペプチドの本質を測定し
得るものである。例えば、固定化された興味のポリペプチドと特異的に相互作用
する一つ又はそれ以上の試料から得られる目標ポリペプチドの本質を測定し得る
し、又は固定化された興味のポリペプチド抗原に結合する抗体又は興味の固定化
されたポリペプチドリガンドに結合する受容体のような結合タンパク質の本質等
も測定し得る。そのような方法は、例えば、修飾された抗体、抗原、受容体、ホ
ルモン、又は他のポリペプチドのような修飾された目標ポリペプチドのコンビナ
トリーライブラリーをスクリーニングして、固定化されたポリペプチドと特異的
に相互作用するそれらの目標ポリペプチドの本質を測定するために有用であり得
る。
【０１５３】 固体担体はそれが提供し得る利点に基づいて選択される。例えば、固体担体は
比較的大きな表面積を提供し、それによって比較的多数の生体高分子の固定化を
可能にする。ビーズのような固体担体は、生体高分子、官能基、又は他の分子を
結合し得る表面を含む何らかの三次元構造を持つことができる。
【０１５４】 基質はまた生体高分子の固定化を容易にするために修飾され得る。チオール反
応性官能基は、特に固体担体にポリペプチドを固定化するのに有用である(国際
公開 ＷＯ ９８／２０１６６)。チオール反応性官能基は求核的チオール部分と
迅速に反応し、共有結合、例えばジスルフィド又はチオエーテル結合、を生成す
る。いろいろなチオール反応性官能基がこの技術で知られ、例えば、ヨードアセ
チルのようなハロアセチル；ジアゾケトン；エポキシケトン；α-エノン及びβ-
エノンのようなα-及びβ-不飽和カルボニル；並びにマレイミドのような他の反
応性Ｍｉｃｈａｅｌアクセプター；酸ハライド；ベンジルハライド等を含む。ジ
スルフィドの遊離チオール基は、例えば、ジスルフィド交換を含むジスルフィド
結合生成により、第二の遊離チオール基と反応することができる。チオール基又
は他の官能基の反応は、適切な保護基で保護して暫定的に阻止し得る(Green and
Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis 2nd ed, (John Wiley & Sons
1991)を参照)。
【０１５５】 ３-メルカプトプロピルトリエトキシシランのようなチオール反応性官能基は
、シリコン表面をチオール基で官能基化するために使用し得る。アミノ官能基化
されたシリコン表面は、それからアミノ安息香酸Ｎ-スクシニミジル(４-ヨード
アセチル) (ＳＩＡＢ；Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ)のような異種二
官能性試薬と反応し得る。所望されれば、チオール基は光切断性保護基で保護さ
れるが、それはそれから、例えば光リソグラフィーにより選択的に切断されて、
興味のポリペプチドの固定化のために活性化された表面部分を提供し得る。光切
断性保護基はこの技術で公知であリ(例えば、国際公開ＷＯ９２／１００９２; M
cCray et al., Ann. Rev. Biophs. Biophs. Chem. 18:239-270 (1989)を参照)そ
して、例えば、光リソグラフィーマスクを用いてその表面中の選択された面の照
射によって選択的に脱保護され得る。
【０１５６】 (固体担体(基質)) 固体担体は、合成反応とアッセイを実施するためのマトリックスとして当業者
に公知のどれかである。それは、シリコン、ガラス、シリコン被覆物質、金属、
複合体、プラスチックのようなポリマー物質、メタルグラフトポリマーのような
ポリマーグラフト物質又はここで開示される他の物質から作成される。この物質
は、必要ならば、例えば化学的に、細胞又は細胞膜、ウイルスエンベロープ、又
はそのような興味の生体物質のような分子及び他の粒子の結合を強化したり可能
にするために更に機能化される。担体の表面は、その表面上で好適なポリマーの
放射線グラフト化及びその変法などにより修飾され、分子又は細胞のような粒子
を結合捕獲するのに好適なものに変えられ得る。担体はまたそれに結合されるビ
ーズを含んでもよい(同時係属続許可済み米国出願第０８／７４６，０３６号、
同時係属米国出願第０８／９３３，７９２号及びＵＳ出願に優先権を主張する国
際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０１９４号を参照)。それはまた捕獲物質の樹枝
状ツリー又は他のそのような成分の組み合わせを含み得る。固体担体は、その各
々がある容量の液体を含有又は保持できる一つ又はそれ以上の目標部位を持ち得
る。
【０１５７】 例として、固体担体は以下のようなものであり得る：グラスファイバーフィル
ター、ガラス表面、シリコン又はシリコンジオキシド表面、複合体表面、又はス
チール、金、銀、アルミニウム又は銅の表面を含む金属表面のような平坦な表面
、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド又はポリビニリデンジフルオリド
を含むプラスチック物質、これらは更にマルチウェルプレート又は膜の形態でも
あってもよく；ウェーハ、例えば、シリコンウェーハのような平坦な表面のピッ
トの中にあってもよいところのシリカゲル、制御されたポアグラス、磁性又はセ
ルロースビーズのようなビーズ(又は他の形状)又は粒子の形態であってもよく；
若しくは，コンビナトリアル合成又は分析等に適するピンのアレー (例えば，国
際ＰＣＴ出願番号 ＷＯ９８／２００１９参照)を含むピン、コーム、マイクロチ
ップであってもよい。技術専門家は、開示された系又は方法で使用する特定の固
体担体の選択においては、担体のサイズ及び形状並びに担体の化学的及び物理的
安定性を含む種々の因子が考慮されることを認識するであろう。
【０１５８】 また、基質又は担体として光ファイバーケーブル又はプレートの端末の使用も
考慮される(例えば、そこで標本が存在する薄い移植プレートに対して接するこ
とのできる光ファイバーケーブルを経由して電磁線が送られる態様を記載してい
るところの米国特許第５，８２６，２１４号を参照)。
【０１５９】 固体担体はある容量の液体を含有し得る一つ又はそれ以上の目標部位を含む。
目標部位は、担体の表面上にある、例えば、ウェル、ピット、チャンネル、又は
縁があるか又はない他の窪みであってもよく；固体担体の表面に置かれ得るとこ
ろのピン、ビーズ又は他の材料であってもよく；若しくは、固体担体の表面に置
かれるシリンダー、円錐又は他のそのような障壁であってもよい。
【０１６０】 目標部位はまた、例えば、固体担体に結合している容器又は反応箱であっても
よい(例えば、Walters et al., Anal. Chem. 70:5172-5176 (1998)を参照)。更
に、目標部位は、光リソグラフィー法で、例えば、シリコンウェーハ上に刻まれ
てもよい (例えば、Woolley et al.(Anal. Chem. 68:4081-4086 (1996)を参照)
。光リソグラフィーは、ウェル又はタワーを含む極めて小さい目標部位の構築を
可能とし、そして，例えば、湿式化学エッチングと組み合わせて使用して、マイ
クロチップ上で“ピコリットルバイアル”を構築してきた(Clark., CHEMTECH 28
:20-25 (1998))。
【０１６１】 担体はまた、レーザー光のような望まれる波長の電磁線に透過性である極めて
薄い基底部を有するウェルを含むガラス又はシリコン表面であってもよく、それ
により容積のようなパラメーター又は蛍光測定のための励起波長の測定を可能に
する。
【０１６２】 目標部位はまた、親水性、疎水性、酸性又は塩基性基の存在、塩橋を形成でき
る基、又は液体を主にｚ方向に成長させる能力のあるいかなる表面化学のような
物理化学的パラメーターによって規定され得る。例えば、目標部位に置かれる液
体が水又は水溶液組成である場合には、目標部位は、固体担体の表面上で疎水性
領域により囲まれた親水性領域によって、又は、より疎水性の低い列とより疎水
性の高い列を交互に持ち、それによって水溶性混合物がより疎水性の低い列に拘
束されるような一連の列によって規定され得る。そのような目標部位に関しては
、水溶液組成は、例えば、親水性領域上に分注され、そして、隣接し且つ取り囲
む疎水性領域のために目標部位からの拡散から拘束される。逆に、液体が非極性
液体である場合には、それは疎水性領域に分注され、そしてその領域に隣接する
親水性領域又はその液体が添加されている領域よりもより低い疎水性領域のため
にその領域中に拘束される。
【０１６３】 固体担体は単一の目標部位を持ってもよく、又は多数の目標部位、例えば、２
部位、１０部位、１６部位、１００部位、１４４部位、３８４部位、１０００部
位又はそれ以上を含んでもよく，そのすべて又は幾つかは同一であってもよく又
は異なっていてもよい。固体担体が一つ以上の目標部位を含み、そして、それゆ
え、例えば一つ以上の反応混合物を含み得る場合には、各目標部位を規定する特
性は反応混合物を拘束することに役立つのみならず異なった反応混合物又は担体
上の他の液体の混合を抑制するのに役立つ。それに加えて、固体担体が一つ以上
の目標部位を含む場合には、それらの目標部位はいかなるパターン、例えば、線
状、らせん、同心円、列又は列と行のアレーに配置され得る。更に、多数の目標
部位の各目標部位の担体上での位置が規定され得る。固体担体上のそのようなア
ドレッサブルな目標部位の入手可能性は、多数の反応を平行して実施することを
可能にし、そして、例えば、多重反応を実施するために、すべてが同一条件で実
施されるように対照反応をテスト反応と共に含めるために、同様な反応を異なっ
た条件で実施するために又は異なった反応を行うために便利である。
【０１６４】 かくして、その上で、核酸の脱着とイオン化のために核酸／液体マトリックス
が析出され且つ保持されるところのいかなる基質もここで提供する方法で使用し
得る。好ましい基質は、次のものを含むが，これらに限られるものではない：ビ
ーズ、例えば、シリカゲル、制御されたポアガラス、磁石、商標Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ (Ｐｈａｒｍａｃｉａ)で市販されているような架橋したデキストラン及び水
素結合したポリサッカライド型のアガロースゲル(エピクロロヒドリン)である商
標Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(Ｐｈａｒｍａｃｉａ)で市販されているようなアガロース
ゲル、又はセルロース；細管；平坦な担体、例えば、ガラス製のフィルター、板
や膜、スチール、金、銀、アルミニウム、銅又はシリコンのような金属表面、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド又はジフッ化ポリビニリデンジのよう
なプラスチック；ピン、例えば、ろ過板のあるか又はないウェーハのような平坦
な表面のピットの中にあるビーズのコンビナトリアル合成及び分析に好適なピン
のアレー。
【０１６５】 好ましくは、選択した基質及びフォーマットが、疎水性又は親水性相互作用の
おかげで析出した物質を上述したように保持するチップのように容易に縮小化で
きるが、その中においては，目標部位は固体担体の表面にある疎水領域に取り囲
まれた親水性領域(又はその逆)によって規定され得る。
【０１６６】 好ましくは、多くの試料が単一の試料担体プレート上で、分析計の真空中に一
回のみの転送で作成されそして分析され、且つ分析のためには比較的短時間のみ
を要するように、核酸試料を作成しそして、薄い層、例えば、約１００μｍの層
、好ましくは約０．１μｍと約１００μｍの間、更に好ましくは１μｍと１０μ
ｍの間で、基質上に手動又は自動装置を用いて析出する。 即時の方法で使用す
る適当な自動化試料取り扱いシステムは、例えば、米国特許第５，７０５，８１
３; ５，７１６，８２５; 及び５，４９８，５４５の各号; 同時係属米国出願第
０９／２８５，４８１号並びに承認済み米国特許出願第０８／７８７，６３９号
及び公開国際ＰＣＴ出願第ＷＯ ９８／２０１６６号に記載されている。
【０１６７】 (固定化と活性化) タンパク質、核酸、及び他の生体分子を固体又は液体担体上に固定化するため
に多くの方法が開発されてきた[例えば、Mosbach (1976) Methods in Enzymolog
y 44; Weetall (1975) Immobilized Enzymes，Antigens，Antibodies，and Pept
ides; and Kennedy et al.(1983) Solid Phase Biochemistry，Analytical and
Synthetic Aspects, Scouten ed., PP. 253-391を参照; 一般的には、Affinity
Techniques, Enzyme Purification: Part B. Methods in Enzymology, Vol. 34,
ed. W. B. Jacoby, M, Wilchek, Acad. Press, N. Y.(1974); Immobilized Bio
chemicals and Affinity Chromatography, Advances in Experimental Medicine
and Biology, vol. 42, ed. R. Dunlap, Plenum Press. N. Y. (1974)を参照]
。
【０１６８】 最も普通に使用される方法の中には、吸収及び吸着、若しくは多くのジスルフ
ィド結合、チオエーテル結合、立体障害を受けたジスルフィド結合のような、直
接的又はリンカーを介する担体への共有結合、並びに、アミンとチオール基のよ
うな遊離反応性基間の共有結合があり、当業者に知られている[例えば、かかる
試薬の作成と使用について記載し，そしてそのような試薬の商業的入手源を提供
しているところのthe PIERCE CATALOG, ImmunoTechnolgy Catalog & Handbook,
1992-1993; 及び Wong (1993) Chemistry of Protein Conjugation and Cross L
inking, CRC Pressを参照; また、Dewitt et al.(1993) Proc. Nat. Acad. Sci.
U.S.A. 90:6909; Zuckermann et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:10646; K
urth et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:2661; Ellman et al. (1994) Proc
. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:4708; Sucholeiki (1994) Tetrahedron Letters
. 35:7307; 並びに光感受性リンカーについて記載しているところのSu-Sun Wang
(1996) J. Org. Chem. 41:3258; Padwa et al. (1971) J. Org. Chem. 41:3550
及び Vedejs et al. (1984) J. Org. Chem. 49:575を参照]。
【０１６９】 固定化を達成するためには、タンパク質又は他の生体分子の組成物を、ここに
何れかで述べたような担体物質、アルミナ、炭素、イオン交換樹脂、セルロース
、ガラス又はセラミックと接触させる。フルオロカーボンポリマーは生体分子が
吸着によって結合する担体として用いられてきた[米国特許第３，８４３，４４
３号；公開国際ＰＣＴ出願ＷＯ／８６ ０３８４０を参照]。
【０１７０】 タンパク質や核酸，分子を含む生体高分子を固体担体に結合させるさまざまな
種類の方法が知られている[例えば、米国特許第３，４５１，６８３号を参照]。
そのような結合は共有結合、イオン結合及び他の相互作用を通して達成される。
その結合は、特定のＥＭ周波数のようなある条件に対して可逆的に又は不安定に
なり得る
【０１７１】 例えば、米国特許第４，６８１，８７０号は、シリカゲル担体上へ遊離アミノ
基又はカルボキシル基を導入する方法を記載する。これらの基は次いで、タンパ
ク質又は他の抗-リガンドのような、他の基とカルボジイミドの存在下で共有的
に結合され得る。代わりに、シリカ担体がアルカリ条件下でハロゲン化シアンと
の処理で活性化されてもよい。抗-リガンドはその活性化表面への付加で表面に
共有結合される。他の一つの方法は、ビオチン、アビジン及び伸長剤の多重層の
継続的適用を通じるポリマー表面の修飾を含む[例えば、米国特許第４，２８２
，２８７号参照]；その他の方法は光活性化を含み、そこではポリペプチド鎖に
光感受性の非天然アミノ酸基を挿入することによりポリペプチド鎖を固体基質に
結合し、そして生成物を低エネルギー紫外線に暴露する[例えば、米国特許第４
，７６２，８８１号を参照]。
【０１７２】 オリゴヌクレオチドもまた、ソラーレン化合物のような光化学的活性試薬及び
基質にその光試薬を結合させる縮合剤を用いて結合されてきた[例えば、米国特
許第４，５４２，１０１号および米国特許第４，５６２，１５７号を参照]。光
試薬の光活性化は核酸分子を基質に結合して表面に結合したプローブを与える。
【０１７３】 タンパク質又は他の生体分子又は有機分子又は生体粒子を、化学的に活性化し
たガラス、合成ポリマー及び交差結合した多糖のような固体担体に共有結合させ
ることは、より頻繁に用いられる固定化技術である。分子又は生体粒子は直接に
担体に結合するか又は金属のようなリンカーを経て結合されてもよい[例えば、
米国特許第４，１７９，４０２号；及びSmith et al. (1992) Methods: A Compa
nion to Methods in Enz. 4:73-78を参照]。この方法の一例は、アガロースのよ
うな多糖担体の臭素化シアン活性化である。パーフルオロカーボンポリマーを基
本とする担体が酵素固定化及びアフィニティークロマトグラフィーに使用される
ことは米国特許第４，８８５，２５０号に記載されている。この方法では、生体
分子を最初、米国特許第４，９５４，４４４号に記載されているイソシアン酸パ
ーフルオロオクチルプロピルのようなパーフルオロアルキル化剤との反応で修飾
する。それから、その修飾されたタンパク質をフルオロカーボン担体上に吸着さ
せて固定化を達成する。
【０１７４】 この担体の活性化と使用は十分に既知であり、そしてそのような既知法のどれ
によっても達成され得る[例えば、Hermanson et al. (1992) Immobilized Affini
ty Ligand Techniques, Academic Press, Inc., San Diegoを参照]。例えば、ア
ミノ酸の縮合はその技術者によって馴染みのでありそして、例えば、Stewart an
d Young, 1984，Solid Phase Synthesis，Second Edition，Pierce Chemical Co
., Rockfordに提供されている技術により達成され得る。
【０１７５】 分子はまた、例えば、ＩｇＧ結合配列のような、その分子上にある固有の金属
結合部位又は金属イオンに結合するところの遺伝子的に修飾されたタンパク質を
用いて、Ｃｏ(III)のような速度論的に不活性な金属イオンを通じて担体と結合
し得る[例えば、Smith et al. (1992) Methods: A Companion to Methods in En
zymology 4, 73 (1992);Ill et al. (1993) Biophys. J. 64:919; Loetscher et
al. (1992) J. Chromatography 595:113-119; 米国特許第５，４４３，８１６
号；Hale (1995) Analytical Biochem. 231:46-49を参照]。
【０１７６】 分子と生体粒子を固体担体に結合させる他の好適な方法は当業者に衆知である
[例えば、米国特許第５，４１６，１９３号を参照]。これらのリンカーは、タン
パク質や核酸のような分子を担体に化学的に結合させるために適しているリンカ
ーを含み，それに限るものではないが、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、
立体障害を受けたジスルフィド結合、並びに、アミンとチオール基のような遊離
の反応性基間の共有結合を含む。これらの結合は、異種二官能性試薬を用いて一
方又は両方の部分に反応性チオール基を生成させて、そして次いで一方の部分上
のチオール基を、それに他方上で反応性マレイミド基又はチオール基が結合し得
るところの反応性チオール基又はアミノ基と反応させて、生成させることができ
る。他のリンカーは以下のものを含む：ビスマレイミドエトキシプロパン、より
強酸性の細胞内コンパートメントで切断されるところの酸不安定性-トランスフ
ェリン複合体及びアジピン酸ジヒドラジドのような酸切断リンカー；ＵＶ及び可
視光へさらすことで切断可能な交差リンカー並びにヒトＩＧＧ1の定常領域から
のＣH１、ＣH２、ＣH３のような種々の領域のようなリンカー[例えば、Batra et
al. (1993) Molecular Immunol. 30:379-386を参照]。現在好ましい結合は、分
子又は生体粒子を担体の表面に吸着させることにより達成する直接結合である。
他の好まれる結合は、光へさらすことによって活性化され得る光切断性結合であ
る[例えば、ここではリンカーが参照文献で収録されているところのGoldmacher
et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107を参照]。光切断性リンカーは、切断
波長が結合された部分を損傷しないよう選択する。 光切断性リンカーは、光へ
さらすことによって切断されるリンカーである[例えば、システインに対する光
切断性保護基としてニトロベンジルの使用を記載しているところのHazum et al.
(1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt, K. (Ed), pp.
105-110；ヒドロキシルプロピルメタアクリルアミドコポリマー、グリシンコポ
リマー、フルオレシンコポリマー及びメチルロダミンコポリマーを含む水溶性の
光切断性コポリマーを記載しているところのYen et al. (1989) Makromol. Chem
. 190:69-82；近紫外線(３５０ｎｍ)へさらすことで光分解を行う交差リンカー
と試薬を記載しているところのGoldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:10
4-107；光切断可能な結合を生成する塩化ニトロベンジルオキシカルボニル結合
試薬を記載しているところのSenter et al. (1985) Photochem. Photobio. 42:2
31-237を参照]。選択するリンカーはその特定の目的に依存し、必要ならば、経
験的に選択してよい。
【０１７７】 (リンカー) 生体高分子は直接に基質に固定化するか又は単一又は複数の結合部分を通じて
固定化することができる。固定化は、共有結合、イオン結合、物理的結合、及び
他のいかなる既知の結合を含むいかなる所望の結合によって達成し得る。結合は
可逆的及び／又は切断可能的でもよい。核酸、ポリペプチド、炭水化物又は他の
生体高分子を直接に又はスペーサーを通じて基質に固定化するのに好適であると
当業者に知られている、いかなるリンカーも使用し得る[国際公開 ＷＯ９８／２
００１９を参照]。好ましいリンカーには、ＩＲへさらすことで切断されるか，
さもなくば放出されるものがある。
【０１７８】 生体高分子は、リンカーを通じて直接基質に固定化するか又は可変のスペーサ
ーを通じて固定化することができる。更に、この結合は、例えば、レーザーによ
って切断され得るストレプタビジン又はアビジンのビオチンに対する相互作用の
ように、光切断性結合を通じて直接的に、又は光切断性リンカー(米国特許第５
，6４３，７２２号)又は酸不安定性リンカー、熱感受性リンカー、酵素的切断可
能なリンカー又は他のそのようなリンカーを通じて間接的に切断し得る。したが
って、リンカーは、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法の操作の途中でというような規
定の条件で切断されるような可逆的結合を提供し得る。そのようなリンカーは、
例えば、電荷移動錯体のような光切断性結合又は比較的安定な有機ラジカル間に
形成される不安定な結合であってもよい。
【０１７９】 生体高分子上のリンカー(Ｌ)は、固体担体上で第二の官能基(Ｌ’)と、一般に
は一時的な結合であるところの結合を形成し得る。更に、生体高分子が正味の負
電荷を持つか又はそのような電荷を持つように適合化されている場合には、結合
は、例えば、四級アンモニウム基であるＬ’と形成し得る。この場合、固体担体
の表面は、負に荷電した生体高分子を排斥する負電荷を有し、それによってＩＲ
−ＭＡＬＤＩ質量分析法のための生体高分子の脱着を容易にする。脱着は赤外線
によって作られる熱によるか、Ｌ’が発色団である場合には、発色団による赤外
線の特異的吸収により起こり得る。
【０１８０】 結合(Ｌ-Ｌ’)は、例えば以下のもであり得る：メルカプトエタノール又はジ
チオエリトロールで化学的に切断可能であるところのジスルフィド結合；光切断
性であるところのビオチン／ストレプトアビジン結合；酸性条件にさらして切断
可能であるところのトリチルエーテル基のヘテロ二官能性誘導体(例えば、Koest
er et al. Tetrahedron Lett. 31:7095 (1990)を参照)；ほぼ中性条件下でヒド
ラジニウム／アセテート緩衝液で切断可能であるところのレブリン酸-介在結合
；その一方がトリプシンのようなエンドペプチダーゼで切断可能であるところの
アルギニン-アルギニン又はリシン-リシン結合；ピロホスファターゼで切断可能
であるところのピロリン酸結合；又はリボヌクレアーゼを用いるか又はアルカリ
性条件にさらすことにより切断可能であるところのリボヌクレオチド結合。
【０１８１】 官能基、Ｌ及びＬ’、はまた電荷移動錯体を形成し、それによって一時的なＬ
-Ｌ’結合を形成し得る。ＩＲレーザーエネルギーは電荷移動の波長に対応する
エネルギーに調和させられ、そして固体担体からの特異的脱着が開始され得る。
Ｌ及びＬ’の幾つかの組み合わせがこの目的に役立つこと、並びにもし赤外線を
吸収する液体マトリックスが存在するならば、供与基が固体担体上に存在し得る
か、又は検出すべき生体高分子に結合され得るか又はその逆であるということが
分かるであろう。
【０１８２】 ここで開示されるような方法で特に有用である選択的に切断可能なリンカーは
、光切断性リンカー、酸切断性リンカー、酸-不安定リンカー及び熱感受性リン
カーを含む。酸切断性リンカーは、例えば、ビスマレイミドエトキシプロパン、
アジピン酸ジヒドラジドリンカー(Fattom et al. Infect. Immun. 60:584-589 (
1992))、並びに、細胞内トランスフェリン回路に入るに十分量のトランスフェリ
ンを含むところの酸不安定トランスフェリン複合体(Welhoner et al. J. Biolo.
Chem. 266:4309-4314 (1991))を含む。光切断性リンカーはまた、国際公開ＷＯ
９８／２００１９に記載されているリンカーを含む。
【０１８３】 ポリペプチドを、例えば、担体に化学的に結合させるのに適したリンカーは、
ジスルフィド結合、チオエーテル結合、立体障害を受けたジスルフィド結合、及
び、例えば、アミンとチオール基のような遊離反応性基間の共有結合を含む。
【０１８４】 結合を形成させるために有用な試剤は、例えば、ジマレイミド、ジチオ-ビス-
ニトロ安息香酸(ＤＴＮＢ)、Ｓ-アセチルチオ酢酸Ｎ-スクシニミジル(ＳＡＴＡ)
、３-２-ピリジルジチオプロピオン酸Ｎ-スクシニミジル(ＳＰＤＰ)、４-(Ｎ-マ
レイミドメチル)-シクロヘキサン-１-カルボン酸Ｎ-スクシニミジル(ＳＭＣＣ)
、６-ヒドラジノニコチミド(ＨＹＮＩＣ)を含む。固体担体ヘポリペプチドを結
合するために使用する，架橋剤でもあり得る、適切なリンカーは、担体の表面に
存在する官能基と、又はポリペプチド又はその両者と反応し得るところの多種の
試剤を含む。有用な架橋剤は、同種二官能性基又は異種二官能性基を含む試剤を
含む。有用な二官能性架橋剤は、それに限るものではないが、４-(Ｎ-ヨードア
セチル)アミノ安息香酸Ｎ-スクシニミジル (ＳＩＡＢ)、ジマレイミド、ジチオ-
ビス-ニトロ安息香酸(ＤＴＮＢ)、Ｓ-アセチルチオ酢酸Ｎ-スクシニミジル(ＳＡ
ＴＡ)、３-２-ピリジルジチオプロピオン酸Ｎ-スクシニミジル(ＳＰＤＰ)、４-(
Ｎ-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-１-カルボン酸Ｎ-スクシニミジル(ＳＭ
ＣＣ) 及び６-ヒドラジノニコチミド(ＨＹＮＩＣ)を含む。
【０１８５】 交差結合剤はまた、生体高分子と固体担体の間に選択的に切断可能な結合を形
成するために使用し得る。例えば、３-アミノ-(２-ニトロフェニル)プロピオン
酸(Brown et al. Molec. Divers. 4-12 (1995); Rothchild et al. Nucl. Acid.
Res. 24:351-66 (1996); 米国特許第５，６４３，７２２号) のような光不安定
な架橋剤は、固体担体からポリペプチドを切断する手段として用い得る。他の交
差結合剤はこの技術で十分に公知である(例えば、Wong, Chemistry of Protein
Conjugation and Cross Linking (CRC Press 1991); Hermanson, Bioconjugate
Techniques (Academic Press 1996)を参照)。
【０１８６】 例えば、ヒドロキシ酢酸エステル(グリコール酸エステル)、α-、β-、γ-、.
..ω-ヒドロキシアルカン酸エステル、ω-ヒドロキシ(ポリエチレングリコール)
ＣＯＯＨ、ヒドロキシ安息香酸エステル、ヒドロキシアリールアルカン酸エステ
ル、及びヒドロキシアルキル安息香酸エステルを含むヒドロキシルエステルリン
カーは、生体高分子の固定化に有用であり得る。光切断性リンカーもまた生体高
分子の固定化に有用である；そのようなリンカーの生成法は、国際公開ＷＯ９８
／２００１９に提供されている。更に、二官能性トリチルリンカーは、固体担体
に、例えば、Ｗａｎｇ樹脂のような樹脂上の４−ニトロフェニル活性エステルに
、アミノ樹脂を経由し樹脂上のアミノ基又はカルボキシル基を通じて結合され得
る。二官能性トリチルリンカーによるアプローチでは、固体担体は、生体高分子
が脱離することを保証するために、ギ酸又はトリフルオロ酢酸のような揮発性の
酸による処理が必要となり得る。そのような場合、生体高分子は固体担体のウェ
ルの底に又は固体担体の平坦な表面上にビーズを含まぬパッチとして析出され得
る。マトリックス組成物を加えた後に、その生体高分子はＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量
分析の間に脱着され得る。
【０１８７】 疎水性トリチルリンカーもまた、揮発性の酸を、又は酸性であるか又は液体マ
トリックスを酸性に変える添加物を含む適当なマトリックス組成物を使用するこ
とにより酸不安定なリンカーとして役立って、生体高分子からアミノ結合したト
リチル基を切断する。酸不安定性もまた変え得る。例えば、トリチル、モノメト
キシトリチル、ジメトキシトリチル又はトリメトキシトリチルは、適当なｐ-置
換の又はより酸不安定なトリチルアミン誘導体に変え得る。
【０１８８】 他のリンカーは、例えば、Ｒｉｎｋアミドリンカー(Rink, Tetrahedron Lette
rs. 28:3787 (1976))、塩化トリチルリンカー(Leznoff, Ace. Chem. Res. 11:32
7 (1978))、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄリンカー(Bodanzky et al., Peptide Synthes
is 2nd ed, Academic Press; New York, 1986)、トリチルリンカー(米国特許第５
，４１０，０６８号および５，６１２，４７４号)；及び (米国特許第５，１９
８，５３１号)を含む。
【０１８９】 他のリンカーは、ビスマレイミドエトキシプロパン、より強酸性の細胞内コン
パートメントで切断されるところの酸不安定性-トランスフェリン複合体及びア
ジピン酸ジヒドラジドのよう酸切断リンカー；ＩＲ，可視又はＵＶ光で切断され
るところの光切断性リンカー、リボソーム又は他のＲＮＡ酵素で切断されるとこ
ろのＲＮＡリンカー並びにヒトＩＧＧ1の定常領域からのＣH１、ＣH２、ＣH３の
ような種々の領域のようなリンカー(例えば、Batra et al. Mol. Immunol. 30:3
79-386 (1993)を参照)を含む。いかなるリンカーの組み合わせも、有用である、
例えば、珪素結合や光切断性結合のようにＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法の条件下
で切断され得るところのリンカーは、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法の条件下で切
断されないが他の条件では切断され得るところのアビジンビオチン結合のような
リンカーと組み合わせ得る。
【０１９０】 興味の生体高分子はビーズのような固体担体に固定化し得る。更に、ビーズの
ような第一の固体担体は、ビーズ又は他の基質であってもよい第二の固体担体と
あらゆる適切な手段により結合され得る。特に、生体高分子の固体担体への結合
に関しここで開示した結合の方法並びに手段のどれもまた、第一の担体と第二の
担体が同一又は異なっていてもよい場合に、第一の担体の第二の担体への結合に
適用され得る。更に、二官能性リンカーの使用は、担体から生体高分子の、又は
第二の担体から第一の担体への直交的な切断を可能にする。
【０１９１】 ここで開示するか又はその技術で既知のいかなる結合体も、ここで提供する例
に関して逆にされ得ることを認識すべきである。ゆえに、例えば、ビオチンは生
体高分子又は固体担体のどちらか一方に挿入され得るし、逆にアビジン又は他の
ビオチン結合部分は担体又はポリペプチドへ、それぞれ挿入し得る。ここで使用
を考慮する他の特異的な結合対は、ホルモンとその受容体、酵素とそれらの基質
、ヌクレオチド配列とその相補的配列、抗体とそれが特異的に相互作用する抗原
及び当業者の知る他のそのような対が例示される。
【０１９２】 目標生体高分子、特に、多数の目標生体高分子中の各目標生体高分子、は質量
修飾、適合化又は他の生体高分子の処理以前に固体担体に固定化し得る。特に、
固体担体は、多数の目標生体高分子の各々が、各特定のアドレスにアレーに置か
れ得るように、平坦な表面、又はウェルのような構造を持つ表面であり得る。一
般に、目標生体高分子は固体担体に、酸不安定性リンカー、化学的に切断可能な
リンカー又は光切断性リンカーのような切断可能なリンカーを通して固定化し得
る。開示した方法において目標生体高分子の反応後、好ましくない反応生成物が
反応から洗い出されそして残存する固定化した目標生体高分子は、例えば、適宜
，化学的切断、光切断によって遊離され、そしてＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法に
より分析され得る。しかし、例えば化学的又は酵素的分解又は他の反応を実施す
る以前の質量修飾などの生体高分子の取り扱いが、その反応の速度又は程度に影
響し得ることを認識すべきである。したがって、技術専門家は，反応の程度に対
する適合化、質量修飾等の影響は、方法を開始する以前に特定されるべきである
ことを知るであろう。
【０１９３】 ある場合には、特定の目標生体高分子をその目標生体高分子の両末端、例えば
、ポリペプチドのアミノ末端とカルボキシル末端を通じて、例えば、一方の末端
では化学的に切断可能なリンカーをそして他方の末端では光切断性のリンカーを
用いて、固定化することは有用であり得る。このようにして、例えば、ウェル中
のアレーにおいて固定化し得るところの目標生体高分子は、その目標生体高分子
の中にあるモノマーサブユニットを結び付けている少なくとも一つの結合を切断
する一つ又はそれ以上の試剤と接触し、その内部の生体高分子断片はそれからウ
ェルの中のその試剤及び他の試薬とともにウェルから洗い出すと、化学的に切断
可能なリンカーを通じてその固体担体に固定化された目標生体高分子の一つの断
片及び光切断性のリンカーを通して固定化された目標生体高分子の反対側の末端
から第二の目標生体高分子の断片が残る。そこで、各断片は、更に、ここで開示
する方法を用いて取り扱われるか又は逐次的な断片の切断、例えば、初めに化学
的に切断可能なリンカーの切断後に、そこで光切断性のリンカーの切断、に続い
てＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により分析され得る。そのような方法は生体高分
子の両末端を分析する簡便な手段を提供し、それにより目標生体高分子の分析を
容易にする。
【０１９４】 目標生体高分子の両末端での固定化は、その生体高分子の両末端を修飾するこ
と、例えば、一方の末端は固体担体と化学的に切断可能な結合を生成可能にする
ように修飾し、他の末端では固体担体と光切断性の結合を生成可能にするように
修飾することによって実施し得る。その代わりに、生体高分子は二つの部分、す
なわち，一方の末端において、例えば、化学的に切断可能な結合を生成可能にす
るように修飾されている一方の部分並びに他の末端において，例えば，光切断性
の結合を生成可能にするように修飾されている他方の部分、に分割し得る。その
二組の修飾された生体高分子は、それから、固定化を完結するための適切な官能
基を含む固体担体上に、一緒に、固定化され得る。
【０１９５】 (生体高分子のＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析) ここに開示する方法は、生体高分子及び赤外線を吸収する液体マトリックスを
含む組成物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法に付すことによる生体高分子の分析に
有用である。選択する方法によっては、ある生体高分子の存在を、例えば生体試
料中で、検出し得たり；又はある特定の生体高分子を、例えば対応する既知の生
体高分子との比較により又はその質量又は少なくともそのサブユニット配列の一
部を測定することによって確認し得る(例えば、米国特許第５，５０３，９８０
；５，５４７，８３５；５，６０５，７９８及び ５，６９１，１９４の各号を
参照；例えば、国際公開ＷＯ９４／１６１０１；ＷＯ９４／２１８２２，ＷＯ９
６／２９４３１；ＷＯ９７／３７０４１；ＷＯ９７／４２３４８；並びにＷＯ９
８／２００１９を参照)。
【０１９６】 (ＩＲレーザーを用いる質量分析) 試料を含有する担体は、試料中の核酸を確認又は検出するために質量分析計の
真空室に置くことができる。好ましくは、質量分析計は試料温度を、試料の作成
、配置、及び／又は分析中は、前もって選択した値、例えば、少なくとも約−２
００℃から約８０℃の範囲の温度、好ましくは少なくとも約−６０℃から約４０
℃、より好ましくは約−２００℃から約２０℃、そして最も好ましくは約−６０
℃から約２０℃に、保ち得る。例えば、ある場合には、改善されたスペクトルが
、試料の作成又は質量分析中、試料を室温以下の温度に冷却することによって得
ることができる。更に、上述のごとく、マトリックスの真空安定性が冷却によっ
て増加し得る。その代わりに、二本鎖核酸を一本鎖に変性させるために又は試料
作成の間に粘度を減少するために試料を加熱することも有益であり得る。
【０１９７】 試料の脱着とイオン化は、赤外線を用いる質量分析計中で行われる。好ましい
赤外波長は、中赤外波長領域、約２．５μｍから約１２μｍ ．．である。好ま
しい赤外線源は、約６μｍで発光するところのＣＯレーザー；約９．２μｍから
１１μｍで発光するところのＣＯ２レーザー；約３μｍの波長で発光する、何ら
かの種類の結晶、例えば、Ｅｒ-ＹＡＧ (イットリウム-アルミニウム-ざくろ石)
、Ｅｒ-ＹＩＬＦ又はＥｒ-ＹＳＧＧを有するＥｒレーザー；約２．５μｍから約
１２μｍで発光する光学的常磁性発振器レーザー、である。
【０１９８】 (パルス継続時間、電界強度及び他のパラメーター) １００ｎｓ程度のパルス幅を有する固体状エルビウムレーザーは、赤外補助レ
ーザー脱着／イオン化質量分析法(ＩＲ−ＭＡＬＤＩ)に使用され得る[Overberg
et al. Rapid.Commu.Mass Spectrom., 1990, 4, 293-296; Berkenkamp et al. R
apid. Commu. Mass Spectrom., 1997, 11, 1399-1406]。２，３ナノ秒のパルス
継続時間を持つ光学パラメトリック発振器(ＯＰＯ)もまたＩＲ−ＭＡＬＤＩ Ｍ
Ｓで用いられてよい。２，３ナノ秒のＯＰＯシステムの固定パルス幅は、ポンプ
レーザーで測定される。パルス継続時間及び／又は照射域のサイズ(スポットサ
イズ)は、多電荷イオンを発生させるために変え得る。好ましいパルス継続時間
は、約１００ピコ秒(ｐｓｅｃ)から約５００ナノ秒(ｎｓ)の範囲にある。
【０１９９】 ＥＲ：ＹＡＧ-及びＯＰＯレーザーは、５−２００ｎｓパルス幅及び３μｍ波
長においてＩＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳのパルス幅並びに波長依存性を研究するため
に用いられた。９０から１８５ｎｓのレーザーパルス継続時間に対しては、ＥＲ
：ＹＡＧレーザー(Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ、波長
λ＝２．９４μｍ)が用いられた。パルス継続時間は、Ｑ-スウィッチ遅延時間を
変えて変化させた。Ｎｄ：ＹＡＧ供給ＯＰＯレーザー(Ｍｉｒａｇｅ ３０００Ｂ
、Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ)に対しては、パ
ルス幅は６ｎｓに固定されたが、一方においてはこのシステムは２．２μｍから
４．０μｍまで調節でき得る。波長スケールは±５ナノメートルの精度で目盛り
をつけた。直線部(２．２ｍ)及びリフレクトロンポート(３．５ｍ に相当する飛
行長さ)を持つ自社製ＴＯＦ機器が用いられた。質量分析計は静的又は遅延型イ
オン抽出で運転された。二つのレーザー光線の迅速な交換を許すように特殊なレ
ンズが装備された。１５０μｍのピンホールはガウスビームの中央部によって照
明され且つ両レーザーに対し均一で等しい試料照明を保証するために試料上に結
像された。すべてのスペクトルは同一の機械条件でそして同一試料から得られた
。
【０２００】 結果：ａ)第一近似では、チトクロムＣの質量スペクトルを生成させるための
閾値フルエンスは、６−１８５ｎｓの範囲でパルス継続時間とは無関係であった
。
【表１】 ＯＰＯ―システムに対しては、閾値フルエンスは、Ｅｒ：ＹＡＧレーザーと比べ
て一定して且つ統計的に有意に１．５倍にまでも低かった。しかしながら、ＯＰ
Ｏに対する約５０ＭＷ／ｃｍ2(γ＝６ｎｓ)及びＥｒ：ＹＡＧレーザーに対する
約２ＭＷ／ｃｍ2(γ＝１８．５ｎｓ)の放射照度は、約２５倍異なる。したがっ
て、ＩＲ−ＭＡＬＤＩにおける脱着は、２００ｎｓまでのパルス継続時間に対す
るピークパワー又は放射照度よりは、むしろ単位体積当たりに投下されたエネル
ギーによって支配されていると結論された。
【０２０１】 ｂ)実験誤差以内で、コハク酸マトリックスから脱着した、ペプチドのシグナ
ルの質量分解能は、静的及び遅延型イオン抽出に対し６−１００ｎｓの範囲内で
パルス幅とは無関係であることが観察された。２００ｎｓまでのより長いパルス
幅と静的イオン抽出に対して、分解能は二倍だけ減少し標識ラミシジンＳのピー
ク分解能に対するレーザーパルス幅の影響の分析では、直線モードの質量分析計
でｍ／Δ＝１１０００の最高分解能が、遅延型イオン抽出で６ｎｓＯＰＯレーザ
ーパルスに対して並びに１００ｎｓエルビウムレーザーに対して観測された。
【０２０２】 ｃ)６ｎｓのパルスに対しては、１００ｎｓのパルスに比べて、多電荷イオン
のアバンダンスの増加とオリゴマーのシグナルの減少が観察された。
【０２０３】 ｄ)ＩＲ−ＭＡＬＤＩスペクトルの生成のための閾値フルエンスが、ＯＰＯシ
ステムで幾つかの固体及び液体マトリックスに対して、２．６μｍから３，６μ
ｍまでの波長領域で測定された。それらがマトリックスの対応する透過スペクト
ルと比較された[Merke, R., Langenbucher, F. Infrared Spectra, Hyden & Co.
, Freiburg 1964]。(逆)透過におけるコハク酸とグリセリンに対する閾値フルエ
ンスの間の明白な相関が、チトクロムＣの閾値フルエンスＨ0に対するレーザー
波長λの影響の研究で観察され標識リセリンに対しては二重ピーク構造が明白に
再現された。同様な挙動がトリエタノールアミンに対して観測された。コハク酸
に対してはその閾値フルエンスは、３．２−３．６μｍの範囲で吸収スペクトル
に従う。約２．８と３．２μｍの間の驚くべき低い閾値フルエンスは、コハク酸
ミクロ結晶中の残留水の強い吸収を反映するように思われる。
【０２０４】 典型的には１０００Ｖ／ｍｍより低い、好ましくは、２００Ｖ／ｍｍほどに低
い電界強度が、特にタンパク質に対して、用いられた。
【０２０５】 好ましいスポットサイズは、直径約５０μｍから約１ｍｍの範囲である。ＩＲ
−ＭＡＬＤＩは、線形及び非線形電界、例えば、 曲線状電界リフレクトロン、
を持つ直線部(ｌｉｎ)又はリフレクター (ｒｅｆ)、飛行時間(ＴＯＦ) 、単一又
は多重の四重極、単一又は多重の磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロト
ロン共鳴又はイオントラップを含む適当な質量分析計とよく適合され得る。好ま
しくは、検出は、イオンが静的又は遅延型抽出(ＤＥ)を用いる分割抽出で約３ｋ
Ｖから３０ｋＶの全ポテンシャル差を通じて加速されるように、ｌｉｎＴＯＦ又
はｒｅｆＴＯＦモード機器を使用し、陽又は陰イオンモードで行われる。ＴＯＦ
質量分析計は、発生したイオンが検出器に飛行する時間を測定することによりそ
の質量対電荷比にしたがってイオンを分離する。ＴＯＦ質量分析計の後背技術は
、例えば米国特許第５，６２７，３６９；５，６２５，１８４；５，４９８，５
４５； ５，１６０，８４０及び５，０４５，６９４の各号に記載されている。
約５０ｎｓｅｃから約５μｓｅｃの範囲にわたる遅延時間での遅延抽出は、液体
又は固体マトリックスを用いると、ある種の核酸、例えば約３０ｋＤａから５０
ｋＤａまでの質量範囲の核酸、の質量分解能を改善するかもしれない。遅延型抽
出に対しては、分解能の増加を与えるところのより長い最適の抽出遅延とそれに
よる長い滞在時間を許容するように条件を選択する(例えば、Juhasz et al., An
al. Chem. 68:941-946(1996); Vestal et al., Rapid. Commun. Mass Spectrom.
9:1044-1050(1995)を参照; また、ＭＡＬＤＩおよび遅延型抽出プロトコルに対
する記載については、米国特許第５，７７７，３２５；５，７４２，０４９；５
，６５４，５４５；５，６４１，９５９；５，６５４，５４５及び５，７６０，
３９３の各号を参照)。遅延型イオン抽出では、時間遅延がイオン生成と加速電
界の付加の間に導入される。この時間の遅れの間に、イオンはそれらの初期速度
にしたがって新しい位置に動く。遅延時間及び加速領域の電界を適切に選ぶこと
により、イオンの飛行時間は、飛行時間がその初期速度と無関係に一次的になる
ように調節され得る。
【０２０６】 （ＩＲ−ＭＡＬＤＩによる核酸の分析） ＵＶ ＭＡＬＤＩを用いる核酸の配列決定、診断、検出の方式並びに方法が開
発されており且つ当業者には公知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９
８；５，８３０，６５５、５，７００，６４２各号；許可済み米国特許出願第０
８／６１７，２５６号、公開国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９6／２９４３１、ＷＯ９８
／２００１９、ＷＯ９９／１４３７５、ＷＯ９７／０３４９９、ＷＯ９８／２６
０９５各号及び他のもの、を参照)。
【０２０７】 液体マトリックス中で核酸を分析するためにＩＲ−ＭＡＬＤＩを使用する方法
を提供する。この中で提供する方法により分析されるべき核酸はＤＮＡのような
いかなる一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドを含み得るが、それはゲノムＤＮＡ
及びｃＤＮＡ；ＲＮＡ；若しくはＲＮＡ又はＤＮＡの類似体、並びにヌクレオチ
ド又はヌクレオシド及びそれらのいかなる誘導体を含む。核酸は単一ヌクレオチ
ド又はヌクレオシドから何万塩基対にわたる範囲のいかなるサイズのものでもあ
り得る。ここでの分析に対し、好適な核酸は約千ヌクレオチド又はそれ以下のも
のである。
【０２０８】 核酸は生体試料から得られてもよく、それはヒト、動物、植物、バクテリア、
カビ、原生生物又はウイルスを含む、いかなる生物起源からその技術で衆知の種
々の方法の何れかを用いて得られるいかなる物質でもあり得る。生体試料から核
酸を得るための特定の単離法が、その特定の生体試料に適切なものとして選択さ
れ得る。例えば、凍結融解又はアルカリ分解法が固体物質から核酸分子を得るの
に有用であり、熱及びアルカリ分解法は核酸を血液から得るのに有用である(Rol
f et al., PCR: Clinical Diagnostic and Research (Springer Verlag 1994))
。
【０２０９】 液体マトリックスと混合する以前に、分析すべき特定の核酸は更に処理されて
比較的純粋な、単離された核酸試料を与えてもよい。例えば、標準的なエタノー
ル沈殿が制限酵素で消化されたＤＮＡに行われてもよい。それに代わって、ＰＣ
Ｒ生成物は分析以前にプライマー除去が必要と成るかもしれない。同様に、ＲＮ
Ａ鎖は in vitro 転写反応に常在する過剰モルの未成熟終末生成物から分離され
得る。
【０２１０】 (配列決定) (代表的フォーマット及び戦略) サンガー、エキソヌクレアーゼ及びハイブリッド形成各法を含む、当業者に公
知のいかなる配列決定戦略もここで提供するＩＲ−ＭＡＬＤＩ法、すなわち液体
マトリックス及びＩＲ−ＭＡＬＤＩ、との使用に適応し得る。例えば、サンガー
配列決定戦略は、塩基特異的鎖終末によって得られる入れ子の断片集合のそれら
の異なる分子質量を介する解析により配列情報を組み立てており、それはＩＲ−
ＭＡＬＤＩによって決定され得る。更なるスループットの増大が、もし必要なら
ば、オリゴヌクレオチドプライマー、鎖終結ヌクレオシド三リン酸及び／又は鎖
伸長ヌクレオシド三リン酸への質量修飾の導入、または同じく示差的分子量を持
つ標識特異的なプローブのハイブリッド形成により多重化を可能にする集積標識
配列の使用等の核酸断片の適合化によって得られることができる。
【０２１１】 エキソヌクレアーゼに基づく配列決定プロトコルもまた行われ得る。米国特許
第５，６２２，８２４号にＩＲ−ＭＡＬＤＩの使用に適するものと記載されたも
のを含む、これらの方法は、直接的な配列決定アプローチを含み且つ簡便なクロ
ーニングベクターにクローン化されたＤＮＡ断片で開始し得る。ＤＮＡは、保護
、酵素活性の特異性、もしくは固定化の手段によって、エキソヌクレアーゼ消化
を経て段階的な仕方で一方向に分解され、ヌクレオチド又は誘導体が質量分析で
検出される。酵素分解以前に、クローン化されたＤＮＡ断片の全配列にわたる秩
序的な欠失の組が形成される。このようなやり方で、質量修飾ヌクレオチドがエ
キソヌクレアーゼとＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼの組み合わせを用いて挿入され
得る。これは、多重質量分析による検出か、もしくは分解過程を同期させるよう
にエキソヌクレアーゼ活性の調整の何れかを可能にする。
【０２１２】 ハイブリッド形成による配列決定の方法は、ハイブリッド形成によるポジショ
ナル配列決定の方法を含む[例えば、米国特許第５，５０３，９８０；５，７９
５，７１４；及び５，６３１，１３４各号を参照]。要約すれば、ハイブリッド
形成による配列決定とは、すなわちその核酸を、無秩序ではあるが決定可能な配
列をその二本鎖部分に隣接する一本鎖部分に含む一群の核酸プローブとハイブリ
ッド形成することにより核酸の配列を決定する方法方法をいうが、そこではその
群の鎖部分が未決定領域にわたるすべての可能な組み合わせの配列を含むことが
好ましい。ハイブリッド形成は目標の一本鎖化した部分とプローブの一本鎖化し
た部分との相補的認識により起こり、プローブの隣接二本鎖性の存在によって熱
力学的に有利とされる。特に核酸目標のヌクレオチド配列をハイブリッド形成に
より決定する方法は、一組の核酸プローブを作成する工程を含むが、そこでは各
プローブが好ましくは１４−５０ヌクレオチド長であり、二本鎖部分、一本鎖部
分そしてその一本鎖部分内での決定可能な可変配列を持ち；少なくとも部分的に
は一本鎖化している目標物を一つ又はそれ以上の核酸プローブにハイブリッド形
成させ；そして何れかのプローブの一本鎖化した部分にハイブリッド形成する目
標のヌクレオチド配列を決定する工程を含む。プローブを検出するためには、目
標物は終末部位で第一の検出可能な標識で標識され、内部では第二の異なった検
出可能な標識で標識される。これらの標識は、ＩＲ質量分析法で検出すべく選択
する。
【０２１３】 (上記フォーマットの例) 一つの典型的な直接的配列決定の態様では、配列の決定は、目標核酸の多数の
核酸コピーを得るが、そこでは多数のコピーは四つの可能なヌクレオチド塩基の
一つに対応する少なくとも一つの質量修飾されたヌクレオチドを含むこと；多数
の質量修飾ヌクレオチドコピーを質量修飾ヌクレオチドで阻害される活性を有す
るエキソヌクレアーゼにより第一の端から第二の端に向けて切断し、それによっ
て塩基終末核酸断片を生成すること；入れ子の核酸断片をＩＲ−ＭＡＬＤＩで確
認すること；そして(iv)確認された入れ子の核酸断片から目標核酸の配列を決定
することである。
【０２１４】 アレーフォーマットを含め、すべてのフォーマットにおいて、核酸は固定化さ
れ得る。固定化は、ＩＲレーザーにより発光する赤外線によるように、切断可能
なリンカーによって効率的にされ得る。結合は可逆的又は不可逆的であり得る。
【０２１５】 したがって、目標生体高分子のサブユニットの配列を決定する方法もまた提供
する。目標生体高分子の配列は、その生体高分子をその生体高分子の端から一方
向に切断する試薬に接触させ、一群の入れ子の欠失フラグメントを生成させるこ
と；生体高分子断片の入れ子群と、赤外線を吸収するところの、液体マトリック
スとを含む組成物を作成すること；IR-ＭＡＬＤＩ質量分析法によりその組成物
中の各生体高分子断片の分子量値を測定すること；そしてその群の生体高分子断
片の分子量値から核酸の配列を決定すること、により決定され得る。
【０２１６】 目標核酸の配列は、例えば、目標核酸をいろいろな時間間隔の間エキソヌクレ
アーゼ消化に付すことにより目標核酸の配列を含む入れ子の群の欠失断片を生成
させ(国際公開 ＷＯ９４／２１８２２を参照)、そこで入れ子の群の欠失断片を
ＩＲ−ＭＡＬＤＩにより分析することにより決定され得る。同様に、目標ポリペ
プチドの配列は、ポリペプチドをエキソペプチダーゼ、それはカルボキシペプチ
ダーゼＹ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシ
ペプチダーゼＧ、カルボキシペプチダーゼＢのようなカルボキシペプチダーゼ；
又はアラニンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、ピログルタメ
ートペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ及びミクロソームペプチダーゼの
ようなアミノペプチダーゼ；又はフェニルイソチオシアネートのような化学的ポ
リペプチド断片化剤であり得るが、にいろいろな時間間隔の間付して、その生体
高分子の入れ子の群を生成させるが、それはＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法によっ
て分析され得てその目標生体高分子の配列を決定する(また、Protein LabFax, p
ages 273-276(ed., N.C. Price; Bios Scientific Publ., 1996);ポリペプチド
断片化剤をリスト、を参照)。エキソヌクレアーゼ、エキソペプチダーゼ、エキ
ソグリコシダーゼは、かかる試薬の活性を修飾する方法と同様に(例えば、米国
特許第５，７９２，６６４号; 国際公開ＷＯ９６／３６７３２を参照)、 この技
術でよく公知である(例えば、米国特許第５，８２１，０６３号を参照)。
【０２１７】 目標生体高分子の配列はまたその生体高分子を、ある時間制限された仕方で、
ある末端からそれを一方向的に切断する試薬で処理することそして遊離されたモ
ノマーサブユニットをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法で確認することによって決定
され得る。所望されれば、目標生体高分子の分解は反応機装置 (例えば、国際公
開ＷＯ９４／２１８２２を参照)の中で実施し得るが、そこにおいては生体高分
子は組成において任意で且つ切断する試剤が固定化され得るか、若しくは、そこ
においてはその試剤は組成において任意で且つその生体高分子が固定化され得る
。ある時間間隔で又は連続的な流れとして、遊離されたサブユニットを含む反応
混合物は反応機からＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法による分析のために移される。
ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析に先立って、遊離されたサブユニットは、質量修飾で
あり得るところの適合化のための反応容器に移され得る
【０２１８】 目標生体高分子の配列はまたその目標生体高分子から最低二つの生体高分子断
片を発生させること；その生体高分子断片と赤外線を吸収する液体マトリックス
を含む組成物を作成すること；そしてIR-ＭＡＬＤＩ質量分析法により組成物中
の生体高分子断片を分析し、それにより目標生体高分子の配列を測定すること、
により決定され得る。特に、かかる方法は大きな生体高分子配列内のサブユニッ
ト配列の順番の決定に有用であり得る((例えば、国際公開ＷＯ９8／２００１９
を参照)。
【０２１９】 目標生体高分子の少なくとも一種のサブユニット配列、ｉ、を決定する方法も
提供する。かかる方法は、例えば、目標生体高分子の種をその目標生体高分子中
の各モノマーサブユニット間の結合が各々切断するに十分な一つ又はそれ以上の
試剤と接触さすことにより、入れ子の群の欠失断片を生成させること；その群の
少なくとも一つの生体高分子断片と赤外線を吸収する液体マトリックスとを含有
する組成物を作成すること；そしてIR-ＭＡＬＤＩ質量分析法により少なくとも
一つの生体高分子断片の分子質量を測定すること；当該群中の各生体高分子断片
の分子質量が測定されしまうまでこれらの工程を反復し、それにより目標生体高
分子の種のサブユニット配列を決定することにより行われ得る。かかる方法は、
複数性ｉ＋１種の多重解析に特に適する。多重解析のためには、目標生体高分子
の各々の種は目標生体高分子の各々の種の生体高分子断片がIR-ＭＡＬＤＩ質量
分析によりあらゆる他の生体高分子種から識別され得るように示差的に質量修飾
され得る。
【０２２０】 核酸の少なくとも一種のヌクレオチド配列を決定する方法もまた提供する。か
かる方法は相補的核酸、それは配列決定されるべき核酸種に相補的であるもの、
をオリゴヌクレオチドプライマーから出発し且つ鎖終末ヌクレオシド三リン酸の
存在下で合成することにより、四群の塩基特異的鎖終末相補的ポリヌクレオチド
断片を生成させること；この四群のポリヌクレオチド断片と赤外線を吸収する液
体マトリックスとを含有するIR-ＭＡＬＤＩのための組成物を作成すること；IR-
ＭＡＬＤＩ質量分析法により各ポリヌクレオチド断片の分子量値を決定すること
；且つその分子量値を分子量にしたがって整列させることにより核酸の種のヌク
レオチド配列を決定することにより行われ得る。この方法は特に、複数性ｉ＋１
種の核酸の多重分析に好適で、それはｉ＋１のプライマーを用いて同時的に配列
決定され得る。多重分析に対しては、ｉ＋１のプライマーの一つが未修飾プライ
マーであるか又は質量修飾プライマーであり、他のｉプライマーは、ｉ＋１のプ
ライマーの各々があらゆる他のプライマーからIR-ＭＡＬＤＩ質量分析で識別さ
れ得るように、質量修飾されたプライマーである。
【０２２１】 目標核酸の配列はまた、少なくとも一つの部分的には一本鎖化された目標核酸
を一つ又はそれ以上の核酸プローブ、各プローブは二本鎖部分、一本鎖部分そし
てその一本鎖部分内での決定可能な可変配列を持つ、にハイブリッド形成させ、
少なくとも一つのハイブリッド形成した目標核酸を生成させること；このハイブ
リッド形成した目標核酸と赤外線を吸収する液体マトリックスとを含有する組成
物を作成すること；このハイブリッド形成した目標核酸の配列をこの目標核酸が
ハイブリッド形成しているプローブの決定可能な可変配列に基づいてIR-ＭＡＬ
ＤＩ質量分析により決定すること(米国特許第５，５０３，９８０号)により決定
され得る。 任意的にはハイブリッド形成した核酸は決定可能な可変配列に結ば
れてもよい。所望されれば、この方法の工程は目標核酸の全配列を決定するに十
分な回数繰り替えし得る。多数の目標核酸の配列を決定すべきときには、一つ又
はそれ以上の核酸プローブはアレーに固定化されてよい。
【０２２２】 ＩＲ-ＭＡＬＤＩ質量分析法はまた核酸によってコード化された目標ポリペプ
チドを分析することにより核酸配列を決定するために使用し得る。ポリペプチド
の質量はそれをコード化している核酸の質量のほんの約１０％であるから、翻訳
されたポリペプチドは質量分析で検出されやすい。更に、ポリペプチドのIR-Ｍ
ＡＬＤＩ質量分析法は高感度且つ高分解能の分析シグナルを生成し得る(Berkenk
amp et al., Rapid Commun, Mass Spectrom. 11:1399-1406(1997)を参照)。
【０２２３】 (ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法及び固定化した切断可能なプライマーを用いるオ
リゴヌクレオチドのサイズ測定、指紋法及び配列決定法) ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法はまた、米国特許第５，８３０，６５５号及び米
国特許第５，７００，６４２号に記載される固定化切断可能なプライマーもしく
は他のかかるプライマーと協力して、プライマー伸長生成物のサイズを測定する
ために使用し得る。一つの特異的な態様では、プライマー伸長生成物のサイズを
測定するための方法を提供する。それは以下の工程を含むがそれらは、(ａ)プラ
イマーを目標核酸とハイブリッド形成させるが、そこではプライマーが(i)目標
核酸に相補的である；(ii)プライマーの５’末端を含む第一の領域を持つ；そし
て(iii) プライマーの３’末端を含む第二の領域を持つが、そこでは３’末端が
酵素的な伸長のためのプライミング部位として働く能力を持ちそして、そこでは
第二の領域が選択された切断可能な部位を含む；(ｂ)プライマーを酵素的に伸長
させプライマー及び伸長セグメントから成る伸長生成物を含むポリヌクレオチド
混合物を生成する；(ｃ)切断可能な部位で伸長生成物を切断し伸長セグメントを
遊離させる、並びに (ｄ) 伸長セグメントのサイズをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析
法で液体マトリックスとともに測定し、それによってその切断が伸長セグメント
の読み取り長さを(ｂ)の生成物の読み取り長さと比して増加させるために効果的
である。
【０２２４】 一つの態様では、目標核酸は固定化結合部位を含み、それにより固体担体への
結合により固定化される。目標核酸は伸長以前に固定化し得る。また好ましくは
、目標核酸が切断以前に固定化されていることである。更に好ましくは、固定化
した目標核酸から(ｂ)の生成物が切断工程以前に分離されることである。
【０２２５】 もう一つの態様では、切断可能な部位は５’から ３’への酵素亢進の消化を
遮断し得るヌクレオチドであり、且つそこでは切断は５’から ３’へのエキソ
ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によりプライマーの第一の領域を消化することで行
われる。もう一つの態様では、切断可能な部位はプライマーの３’末端から約５
ヌクレオチドのところに又はそれ以内に位置している。より好ましくは、プライ
マーの第二の領域が、それに限るものではないが、リボヌクレオチド、ジアルコ
キシシラン、３’-(Ｓ)-ホスホロチオエート、５’-(Ｓ)-ホスホロチオエート、
３’-(Ｎ)-ホスホロアミデート、５’-(Ｎ)-ホスホロアミデート、ウラシル又は
リボースのような、切断可能な部位をまた含む単一ヌクレオチドである。工程(
ｂ)でプライマーを伸長する酵素はＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【０２２６】 更にもう一つの様態では、伸長は以下を含むヌクレオチドの存在下で行われる
(i)固定化結合部位及び (ii)それによって伸長セグメント中に挿入される遊離可
能部位。更に好ましくは、固定化結合部位に伸長セグメントを固定化すること並
びにＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法によるサイズ測定以前に遊離可能部位で伸長セ
グメントを遊離することの更なる工程が含まれる。
【０２２７】 もう一つの特異的な態様では、プライマー伸長生成物のサイズを測定する方法
を提供するが、その方法は以下を含む：(ａ)プライマーを目標核酸とハイブリッ
ド形成させるが、そこではプライマーが(i)目標核酸に相補的である；(ii)プラ
イマーの５’末端、そして固定化結合部位を含む第一の領域を持ち、そこではプ
ライマーの固定化結合部位は仲介的なオリゴヌクレオチドに相補的な一連の塩基
から成る；そして(iii)プライマーの３’末端を含む第二の領域を持ち、そこで
は３’末端が酵素的な伸長のためのプライミング部位として働く能力を持ちそし
て、そこでは第二の領域が選択された切断可能な部位を含む、(ｂ)プライマーを
酵素的に伸長させプライマー及び伸長セグメントから成る伸長生成物を含むポリ
ヌクレオチド混合物を生成する；(ｃ)切断可能な部位で伸長生成物を切断し伸長
セグメントを遊離させ、そこでは切断以前にプライマーを固定化結合部位の特異
的なハイブリッド形成により固体担体に結合された仲介オリゴヌクレオチドに固
定化する；並びに (ｄ)伸長セグメントのサイズをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法
で液体マトリックスとともに測定し、それによって切断が伸長セグメントの読み
取り長さを(ｂ)の生成物の読み取り長さと比して増加させるために効果的である
。
【０２２８】 更にもう一つの特異的な態様では、プライマー伸長生成物のサイズを測定する
方法を提供するが、その方法は以下を含む：(ａ)第一及び第二のプライマーを目
標核酸と、それらのプライマーが核酸とのハイブリッド形成を促進する条件下で
結合させ、プライマー／核酸複合体を生成し、そこでは第一のプライマーは(i)
５’末端と ３’末端を持つ、(ii)目標核酸に相補的である、(iii)第一のプライ
マーの ５’末端を含む第一の領域を持つ、そして(iv)第一のプライマーの３’
末端を含む第二の領域を持ち、そこでは３’末端は酵素的伸長のためのプライミ
ング部位として働く能力を持ちそして、そこでは第二の領域は切断可能な領域を
含み、並びに、そこでは第二のプライマーは５’末端と ３’末端を持つ、(ii)
目標核酸に相同的であり、(iii)第二のプライマーの３’末端を含む第一のセグ
メントを持つ、そして(iv)第二のプライマーの５’末端を含む第二のセグメント
及び固定化結合部位を持つこと；(ｂ)プライマー／核酸複合体をＤＮＡポリメラ
ーゼ及びデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で二本鎖断片に変換すること；
(ｃ)プライマー含有断片を以下の工程、すなわち、 (i)二本鎖断片を変性させて
一本鎖断片を生成する、(ii)一本鎖断片を第一及び第二のプライマーとハイブリ
ッド形成させて鎖／プライマー複合体を形成する、(iii)ＤＮＡポリメラーゼ及
びデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で鎖／プライマー複合体から増幅生成
物を生成する、そして(iv)所望する増幅が達成されるまで工程(i)から(iii)まで
を繰り返す、を連続的に繰り返すことにより増幅する；(ｄ)第二のプライマー含
有増幅生成物を固定化結合部位を経て固定化すること；(ｅ)固定化しない増幅生
成物を除去する；(ｆ)固定化した増幅生成物を切断可能部位で切断、二本鎖生成
物を含む混合物を生成する；(ｇ)二本鎖生成物を変性して伸長セグメント遊離さ
せること；並びに、(ｈ)伸長セグメントのサイズをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法
で液体マトリックスとともに測定し、それによって切断が伸長セグメントの読み
取り長さを(ｃ)の増殖鎖−プライマー複合体の読み取り長さと比して増加させる
ために効果的であることである。
【０２２９】 もう一つの態様では、サイズを測定するための方法は以下の工程を含む、すな
わち、(ａ)プライマーを目標核酸とハイブリッド形成させ、そこではプライマー
は(i)目標核酸に相補的である；(ii)プライマーの５’末端及び固定化結合部位
を含む第一の領域を持ち、そして(iii)プライマーの３’末端を含む第二の領域
を持ち、そこでは３’末端が酵素的な伸長のためのプライミング部位として働く
能力を持ちそしてそこでは、第二の領域が選択された切断可能な部位を含むこと
；(ｂ)プライマーを酵素的に伸長させてプライマー及び伸長セグメントから成る
伸長生成物を含むポリヌクレオチド混合物を生成すること；(ｃ)切断可能な部位
で伸長生成物を切断し伸長セグメントを遊離させ、そこでは切断以前にプライマ
ーは固定化結合部位に固定化されること；並びに(ｄ) 伸長セグメントのサイズ
をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法で液体マトリックスとともに測定し、それによっ
て切断が伸長セグメントの読み取り長さを(ｂ)の生成物の読み取り長さと比して
増加させために効果的であることである。
【０２３０】 一つの態様では、切断可能な部位はプライマーの３’末端から約５ヌクレオチ
ドのところで又はそれ以内に位置している。より好ましくは、プライマーの第二
の領域が、それに限るものではないが、リボヌクレオチド、ジアルコキシシラン
、３’-(Ｓ)-ホスホロチオエート、５’-(Ｓ)-ホスホロチオエート、３’-(Ｎ)-
ホスホロアミデート、５’-(Ｎ)-ホスホロアミデート、又はリボースのような切
断可能な部位をまた含む単一ヌクレオチドである。
【０２３１】 もう一つの態様では、切断以前に固定化生成物を洗浄する更なる工程を含む。
もう一つの態様では、プライマーは固体担体に結合された中間スペーサー腕への
固定化結合部位での結合によって固体担体上で固定化される。より好ましくは、
中間スペーサー腕は長さが６又はそれ以上である。固定化結合部位は好ましくは
ＤＮＡプライマーの塩基又は糖の一つに置換基として起こる。その他の態様では
、固定化結合部位はビオチンまたはジゴキシゲニンである。もう一つの態様では
、プライマーは、それに限るものではないが、ガラス、シリコン、ポリスチレン
、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、又は金を含む固体担体上で固定
化される。
【０２３２】 もう一つの態様では、プライマーのサイズを測定するための方法は以下の工程
を含む：(ａ)プライマーの核酸へのハイブリッド形成を促進する条件下で第一及
び第二プライマーを目標核酸に結合させ、かくしてプライマー／核酸複合体を生
成させ、そこでは第一のプライマーは(i)目標核酸に相補的である；(ii)プライ
マーの５’末端そして固定化結合部位を含む第一の領域を持つ、そして(iii)プ
ライマーの３’末端を含む第二の領域を持ち、そこでは３’末端が酵素的な伸長
のためのプライミング部位として働く能力を持ちそして、そこでは第二の領域が
切断可能な部位を含み、そして、そこでは第二のプライマーが目標核酸に相同で
あること；(ｂ)好適なポリメラーゼ及び四つすべてのｄＮＴＰｓの存在下でプラ
イマー／核酸複合体を二本鎖断片に変換すること；(ｃ)プライマー含有断片を(i
)二本鎖断片を変性させて一本鎖フラグメントを生成する、(ii)一本鎖フラグメ
ントをプライマーとハイブリッド形成させて鎖／プライマー複合体を形成する、
(iii)ＤＮＡポリメラーゼ及び四つすべてのｄＮＴＰｓの存在下で鎖／プライマ
ー複合体から二本鎖断片を生成する、そして(iv)所望する程度の増幅が達成され
るまで工程(i)から(iii)までを連続的に繰り返して増幅すること；(ｄ)増殖断片
を変性させて第一のプライマーと伸長セグメントから成る生成物を含む混合物を
生成すること；(ｅ)第一のプライマー含有増幅断片を固定化結合部位を利用して
固定化し、そして固定化しない増幅断片を除去すること；(ｆ)固定化した増幅断
片を切断可能部位で切断し、伸長セグメント遊離させること；並びに(ｇ)伸長セ
グメントのサイズをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法で液体マトリックスとともに測
定し、それによって切断が伸長セグメントの読み取り長さを(ｄ)の生成物の読み
取り長さと比して増加させるために効果的であること。
【０２３３】 もう一つの態様では、目標ＤＮＡの単一塩基指紋を測定する方法を提供する。
この方法は以下の工程を含むがそれらは：(ａ)プライマーを目標ＤＮＡとハイブ
リッド形成させるが、そこではプライマーは(i)目標ＤＮＡに相補的である；(ii
)プライマーの５’末端及び固定化結合部位を含む第一の領域を持つ、そして(ii
i)プライマーの３’末端を含む第二の領域を持ち、そこでは３’末端が酵素的な
伸長のためのプライミング部位として働く能力を持ちそして、そこでは第二の領
域が選択された切断可能な部位を含むこと；(ｂ)プライマーをその単一塩基に対
応するジデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で酵素で伸長させてプライマー
伸長生成物のポリヌクレオチド混合物を生成させるが、各生成物はプライマー及
び伸長セグメントを含むこと；(ｃ)切断可能な部位で伸長生成物を切断し伸長セ
グメントを遊離させ、そこでは切断以前にプライマーは固定化結合部位に固定化
されること；(ｄ)伸長セグメントのサイズをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法で液体
マトリックスとともに測定し、それによって切断がどの与えられた伸長セグメン
トの読み取り長さもその対応する(ｂ)のプライマー伸長生成物の読み取り長さと
比して増加させるために効果的であること、並びに(ｅ)目標ＤＮＡ中の単一塩基
の位置を伸長セグメントのサイズの比較により測定することである。
【０２３４】 もう一つの態様では、目標ＤＮＡ配列のアデニン指紋のための方法は以下によ
る：(ａ)プライマーを目標ＤＮＡとハイブリッド形成させ、そこではプライマー
は(i)目標ＤＮＡに相補的である；(ii)プライマーの５’末端及び固定化結合部
位を含む第一の領域を持つ、そして(iii)プライマーの３’末端を含む第二の領
域を持ち、そこでは３’末端が酵素的な伸長のためのプライミング部位として働
く能力を持ちそして、そこでは第二の領域が選択された切断可能な部位を含むこ
と；(ｂ)プライマーをその単一塩基に対応するデオキシアデノシン三リン酸(ｄ
ＡＴＰ)、デオキシチミジン三リン酸(ｄＴＴＰ)、デオキシシチジン三リン酸(ｄ
ＣＴＰ)、デオキシグアノシン三リン酸(ｄＧＴＰ)、デオキシウリジン三リン酸(
ｄＵＴＰ)の存在下で酵素で伸長させて、その目標の中でｄＡＴＰに対応する位
置にｄＵＴＰを含むプライマー伸長生成物のポリヌクレオチド混合物を生成する
が、各生成物はプライマー及び伸長セグメンを含むこと；(ｃ)ｄＵＴＰ位置で特
異的に断片化するためにプライマー伸長生成物をウラシルＤＮＡグリコシラーゼ
で処理して一群のプライマー伸長分解生成物を生成する；(ｄ)プライマー伸長分
解生成物を洗浄し、そこでは洗浄以前に、プライマー伸長分解生成物は固定化結
合部位で固定化されるが、各固定化さたプライマー伸長分解生成物はプライマー
と伸長セグメントを含有し、そこでは洗浄は固定化されない種類を除去するのに
効果的であること；(ｅ)切断可能な部位で固定化されたプライマー伸長分解生成
物を切断して伸長セグメントを遊離させること；(ｆ)伸長セグメントのサイズを
ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法で液体マトリックスとともに測定し、それによって
切断がどの与えられた伸長セグメントの読み取り長さをもその対応するプライマ
ー伸長分解生成物の読み取り長さと比して増加させるために効果的である；及び
(ｇ)目標ＤＮＡ中のアデニンの位置を遊離した伸長セグメントのサイズの比較に
より測定することによる。
【０２３５】 もう一つの特異的な態様では、ある目標ＤＮＡ配列のＤＮＡ配列を決定するた
めの方法を提供するが、その方法は以下から成る：(ａ)プライマーを目標ＤＮＡ
とハイブリッド形成させ、そこではプライマーは(i)目標ＤＮＡに相補的である
；(ii)プライマーの５’末端及び固定化結合部位を含む第一の領域を持つ、そし
て(iii)プライマーの３’末端を含む第二の領域を持ち、そこでは３’末端が酵
素的な伸長のためのプライミング部位として働く能力を持ちそして、そこでは第
二の領域が切断可能な部位を含むこと；(ｂ)プライマーを四個の異なるジデオキ
シヌクレオチドの第一のものの存在下で酵素で伸長させ、プライマー伸長生成物
の混合物を生成し、各生成物はプライマー及び伸長セグメンを含むこと；(ｃ)切
断可能な部位で切断して伸長セグメントを遊離させ、そこでは切断以前にプライ
マーは固定化結合部位に固定化されること；(ｄ)伸長セグメントのサイズをＩＲ
−ＭＡＬＤＩ質量分析で液体マトリックスとともに測定し、それによって伸長セ
グメントの読み取り長さを(ｂ)の生成物の読み取り長さと比して増加させるため
に効果的であること、(ｅ)工程(ａ)から(ｄ)までを第二、第三、そして第四のジ
デオキシヌクレオチドで繰り返すこと、並びに(ｆ)目標ＤＮＡ配列をサイズの比
較により測定することである。
【０２３６】 更にもう一つの特異的な態様では、ある目標ＤＮＡ配列のＤＮＡ配列を測定す
るための方法を提供するが、その方法は以下から成る：(ａ)プライマーを目標Ｄ
ＮＡとハイブリッド形成させ、そこではプライマーは(i)目標ＤＮＡに相補的で
ある；(ii)プライマーの５’末端及び固定化結合部位を含む第一の領域を持つ、
そして(iii)プライマーの３’末端を含む第二の領域を持ち、そこでは３’末端
が酵素的な伸長のためのプライミング部位として働く能力を持ちそして、そこで
は第二の領域が切断可能な部位を含むこと、(ｂ)プライマーを四つの異なるデオ
キシヌクレオシド α-チオトリホスフェート類似体(ｄＮＴＰαＳ)の第一のもの
の存在下で酵素で伸長させホスホロチオエート結合を含むプライマー伸長生成物
の混合物を生成すること、(ｃ)ホスホロチオエート結合を特異的に切断する試薬
で処理する、そこでは処理は限定切断を生成する条件下で行われ、一群のプライ
マー伸長分解生成物の生成をもたらすこと、(ｄ)プライマー伸長分解生成物を洗
浄し、そこでは洗浄以前に、プライマー伸長分解生成物は固定化結合部位に固定
化されるが、各固定化されたプライマー伸長分解生成物はプライマー及び伸長セ
グメンを含み、そこでは洗浄は固定化されない種類を除去するのに効果的である
こと、(ｅ)切断可能な部位で切断し伸長セグメントを遊離させること、(ｆ)伸長
セグメントのサイズをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で液体マトリックスとともに測
定し、それによって切断がどの与えられた伸長セグメントの読み取り長さもその
対応するプライマー伸長分解生成物の読み取り長さと比して増加させるために効
果的であること、並びに(ｇ)工程(ａ)から(ｆ)までを四つの異なるｄＮＴＰαＳ
の第二、第三、そして第四のもので繰り返すこと、並びに(ｈ)目標ＤＮＡのＤＮ
Ａ配列を四回の伸長反応の各々から得られた伸長セグメントのサイズの比較によ
り決定することである。より好ましくは、工程(ｃ)の試薬は、エキソヌクレアー
ゼ、２-ヨードエタノール、又は２，３-エポキシ-１-プロパノールである。
【０２３７】 (診断及び検出) (診断薬) ここに開示する方法を用いることによって、少なくとも２０００マー(少なく
とも質量約６５０ｋＤ)のＤＮＡ及び少なくとも１２００マー（少なくとも質量
約４００ｋＤ；実施例１を参照）のＲＮＡについて、ＤＮＡ試料の質量を正確に
(少なくとも約１％の精度で)得ることができる。加えて、１本鎖並びに２本鎖核
酸のシグナルをスペクトル上に得ることができる(図３を参照)。ＩＲ−ＭＡＬＤ
Ｉ質量分析を用いるＤＮＡの質量測定によって改善された正確さ(少なくとも１
％の精度)は、ゲルによる標準的なサイズ測定法(精度５％)で得られる精度より
遥かに優れている。適当なサイズマーカーが無いこと、及び十分適切なゲルマト
リックスが無いことその他の理由で、ゲル分析によるＲＮＡサイズの正確な測定
が、不可能ではないにしても、困難であるために、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析に
よるＲＮＡの質量測定の精度(少なくとも約０．５％の精度)は更に有意である。
【０２３８】 ここに開示する方法を用いることによって測定可能な質量範囲が拡大すること
に加えて、質量分析のために作成が必要なアナライトの量が、低フェムトモル(
ｆｍｏｌ)、又はアットモル(ａｔｔｏｍｏｌ)域にまで著しく減少し、また基本
的に単純な作成法でよい。また、固体マトリックスでなく液体マトリックスを用
いることにより、生成するイオンシグナルは照射毎の再現性がより高くなる。液
体マトリックスの使用はまた、例えばチップアレーの場への試料の分注を容易に
する。更に、液体マトリクスをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析に組み合わせて用いる
ことにより、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ分析後にターゲットに残る実質的に全ての試料を
回収して、以後の使用に供することができる。
【０２３９】 (診断と検出) 目標生体高分子の分子量をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析によって測定する方法を
提供する。この方法は、例えば、分析すべき生体高分子を含むＩＲ−ＭＡＬＤＩ
用の組成物、及び赤外線を吸収する液体マトリックスを作成し、組成物中の生体
高分子をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析によって分析することによって行われる(実
施例１を参照；また、Berkenkamp et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 11:
1399-1406 (1997)；Berkenkamp et al., Science 281: 260-262 (1998)を参照)
。目標生体高分子の分子量は、既知の分子量を有する一種以上の対照生体高分子
を、同時に又は別のスペクトルで測定し、目標スペクトルにより生成したスペク
トルを対照生体高分子のスペクトルと比較することによって測定される。対照生
体高分子としては、対応する既知の生体高分子であってもよく、一般には例えば
、互いに核酸又はポリペプチドという目標生体高分子と同じ型の分子である。目
標生体高分子の分子量測定のためには、対照生体高分子は目標生体高分子と同じ
型の分子である必要はない(実施例１を参照）。
【０２４０】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析はまた目標生体高分子の検出にも用いることができ
るがその方法は、生体高分子、及び赤外線を吸収する液体マトリックスを含有す
る組成物を作成し；組成物についてＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析を行うことにより
組成物中の目標生体高分子を確認し、これにより目標生体高分子を検出する。望
ましければ、目標生体高分子は生体試料中のままでも良く、又はこれより単離し
ても良い。したがって、生体試料中の目標生体高分子中の存在を確認する方法も
提供する。
【０２４１】 生体試料中の目標生体高分子、例えば核酸の存在は、核酸分子を含有する生体
試料(又は生体試料から単離された核酸分子)を含有するＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分
析用組成物、及び赤外線を吸収する液体マトリックスを作成し；次いで組成物を
ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で分析することによって確認することができる。目標
核酸配列の分子量を有する核酸分子を検出することにより、生体試料中に目標核
酸配列が存在することが確認される。目標生体高分子の分子量は、対照スペクト
ルとの比較により、又は対応する既知の生体高分子により生じるスペクトルに基
づいて決定することができる。又は、生体高分子の配列を決定することができる
ので、これによってその生体高分子の存在を確認することができる。
【０２４２】 ここに開示する方法により、生体試料由来の目標生体高分子の特徴づけを行う
ことができるため、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析は、疾患又は症状に関連する目標
生体高分子の特性を検出することによって、疾患又は症状を、若しくはその疾患
又は症状の素質を有する個人を確認するのに用いることができる。この方法は、
例えば、被験者から得られた生体高分子を含むＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析用組成
物、及び赤外線を吸収する液体マトリックスを作成し；ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分
析によって組成物中の生体高分子、又は生体高分子中の適切な一部分を分析する
ことにより行うことができる。目標生体高分子に特有の質量を測定することによ
り、個人がその疾患又は症状を、若しくはその疾患又は症状の素質を有すること
を確認することができる。このような方法は遺伝病、細菌感染、細菌感染に関連
した疾患、又はこれらの疾患に対する素質の確認に特に有用であり、また、本質
、遺伝又は適合性の測定に有用である。ここに開示される更なる方法は又、例え
ば個人より得られる目標生体高分子の配列を決定することにより、又は目標生体
高分子を対応する既知の生体高分子と比較することにより、そのような診断にも
有用である。
【０２４３】 ここに開示するＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析を用いる方法は、複数の生体高分子
試料を分析するのに有用であるが、例えば所望されれば、それぞれ１種以上の生
体高分子を含む複数の組成物をアレーの形式でのチップのような固体坦体に添加
して多数の試料を分析するのに特に有用であり。加えて、開示される方法は液体
マトリックスを含む１種又は数種の組成物に含まれる多数の生体高分子の多重分
析に適している。多数の生体高分子の各々は、多重分析を容易ならしめるために
、例えば異なる質量修飾を受けることができる。したがって、本方法はハイスル
ープットアッセイのフォーマットに容易に適合させることができる。
【０２４４】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析の方法による分析に特に適した生体高分子は核酸、
ポリペプチド、炭水化物、又はプロテオグリカンであり得るか、又は蛋白―蛋白
複合体又は核蛋白複合体のような高分子複合体であり得る。分析に際しては、目
標生体高分子は基質、特に固体坦体に固定化することができ、固体坦体は例えば
ビーズ、平面、チップ、毛管、ピン、コーム、又はウエーハであることができ、
また金属、セラミック、プラスティック、樹脂、ゲル、及び膜を含む種々の材料
のいずれであっても良い。例えば、固体坦体はシリコンウエーハ又はステンレス
スチールの平面でも良い。ここに開示される方法は、ハイスループットアッセイ
において多数の目標生体高分子を分析するのに特に有用であるため、この方法は
多数の目標生体高分子を固体坦体上に配列して固定化するのに特に有用である。
固定化は光切断可能な結合、チオール結合、又は水素結合のような可逆的結合を
介しても良く、またこの結合の切断は例えば化学的方法、酵素的方法、又は質量
分析中における切断を含む物理的方法による切断であっても良い。
【０２４５】 目標生体高分子が例えば核酸である場合、目標核酸は固体坦体に固定化した相
補的な捕獲核酸分子と、目標核酸を含む核酸分子の一部との間のハイブリッド形
成(水素結合)によって固定化することができる。しかし、ここに開示される方法
の一部においては、捕獲核酸とのハイブリッド形成によって固定化を行う場合、
例えば、検出用オリゴヌクレオチドを目標核酸の配列とハイブリッド形成させる
場合には、目標核酸を含む配列の少なくとも一部分は、目標核酸のハイブリッド
形成部分とは異なっていなければならない。
【０２４６】 目標生体高分子がポリペプチドである場合は、固体坦体と複合体を形成して結
合し、かつ目標ポリペプチドの少なくとも一部分、又は目標ポリペプチドに付け
た標識と特異的に相互作用する試薬に結合させることによって固体坦体に固定化
することができる。このような試薬は、例えば目標ポリペプチドのエピトープに
結合する抗体、又は目標ポリペプチドに含まれるポリヒスチジン配列標識に結合
するニッケルイオンであっても良い。ポリヒスチジン標識のような標識ペプチド
は、例えばin vivtro転写若しくは翻訳法により製造される目標ポリペプチドに
便利よく組み込むことができる。
【０２４７】 分析すべき生体高分子はＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析の前に適合化を行うことが
できる。適合化により、例えば、質量スペクトルの分解能が改善され、それによ
ってＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析による特定の生体高分子の分析能を改善すること
ができる。望ましいならば、適合化の前に、又は質量分析の前に、生体高分子を
単離してもよい。
【０２４８】 目標生体高分子は、例えばイオン交換により、アルキル化剤又は塩化トリアル
キルシリルと反応させることにより、又は生体高分子中に質量修飾を受けた少な
くとも１サブユニットを組み込むことにより、適合化を行うことができる。例え
ば、生体高分子が核酸である場合には、目標核酸は、陽イオン交換などによるリ
ン酸ジエステルバックボーン修飾により；又は核酸の脱プリン反応の感受性を低
下させ得るＮ７−デアザプリンヌクレオチド、Ｎ９−デアザプリンヌクレオチド
、又は２’−フルオロ−２’−デオキシヌクレオチドのようなヌクレオチドの少
なくとも１個を導入することにより；又は質量修飾を受けた少なくとも１個のヌ
クレオチドを導入することにより；又は標識プローブを、目標核酸を含む核酸分
子の一部分とハイブリッド形成させることにより、適合化を行うことができる(
米国特許第５，５４７，８３５号)。
【０２４９】 多数の目標生体高分子中の各々の目標生体高分子の本質を決定する方法は、例
えばそれぞれ示差的に修飾した多数の目標生体高分子及び赤外線を吸収する液体
マトリックスを含有する組成物を作成し；それぞれ示差的に質量修飾した多数の
目標生体高分子の分子量をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析によって測定し；次いで各
々のそれぞれ示差的に修飾した多数の目標生体高分子の分子量を、対応する既知
の生体高分子又はその断片の分子量と比較することによって行う。このような方
法を生体高分子の断片である多数の目標生体高分子を用いて実施する場合には、
断片を作成し得るには、生体高分子形成に関与する結合、特に生体高分子の単量
体サブユニット間の結合を切断する少なくとも１種類の断片化剤と生体高分子を
接触させて目標断片生体高分子を作成することによる。
【０２５０】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で分析される目標核酸は、生体試料中のものであっ
ても良く、また、所望されれば、分析に先だって増幅を行った後、ＩＲ−ＭＡＬ
ＤＩ質量分析で直接分析しても良い。それに代わって、増幅した核酸分子を、増
幅した核酸中に存在する目標核酸配列とハイブリッド形成できる検出用オリゴヌ
クレオチドと反応させることができるし；ＩＲ−ＭＡＬＤＩ用組成物は、反応生
成物を赤外線を吸収する液体マトリックスと混合して作成することができるし；
そしてＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析を行うことができる。検出用オリゴヌクレオチ
ドと増幅した目標核酸とのハイブリッド形成により生成するところの２本鎖核酸
の検出が、生体試料中の目標核酸の存在を確認する。
【０２５１】 目標核酸分子を含む核酸分子の増幅は周知の方法及び市販のキットを用いて実
施することができる。増幅にはポリメラーゼを使用することができるが、これは
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ ＤＮＡポリメラーゼ、
ディープベント(エキソ−)ＤＮＡポリメラーゼ、ベント ＤＮＡポリメラーゼ、
ベント(エキソ−)ＤＮＡポリメラーゼ、ベント ＤＮＡポリメラーゼ、ベント(
エキソ−)ＤＮＡポリメラーゼ、ディープベント ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅ
ｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、(エキソ−) Pseudococcus furiosus (Pfu)ＤＮＡ
ポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｕｌｔｍａｎ、９ｄｅｇｒｅｅ Ｎｍ、Ｔｔ
ｈ、Ｈｏｔ Ｔｕｂ、Pyrococcus furiosus (Pfu)、又はPyrococcus woesei (Pw
o)のＤＮＡポリメラーゼのような熱安定性ポリメラーゼであっても良い。増幅方
法にはポリメラーゼ連鎖反応(Newton and Graham, PCR (BIOS Publ. 1994))；核
酸配列に基づく増幅；転写に基づく増幅システム、自立性配列増幅；Ｑ−ベータ
レプリカーゼに基づく増幅；連結増幅反応、リガーゼ連鎖反応(Wiedemann et al
., PCR Meth. Appl. 3: 57-64 (1994)；Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., USA
88, 189-93 (1991))；鎖置換増幅(Walker et al., Nucl. Acids Res. 22: 2670-
77 (1994))；及び、例えば逆転写ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ；Higuchi et al., Bio/T
echnology 11: 1026-1030 (1993))、及び対立遺伝子特異的増幅を含むこれらの
方法の変法を含む。
【０２５２】 目標核酸の核酸配列をＰＣＲで増幅する場合には、周知の反応条件が用いられ
る。増幅反応の最小限の成分として、鋳型ＤＮＡ分子；それぞれ鋳型ＤＮＡ又は
これに連結したヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な前向きプライマー及
び逆向きプライマー；４種類の各ヌクレオシド三リン酸又はそれらの適切な類似
体；ＤＮＡポリメラーゼのような重合剤；及び適切なｐＨ、イオン強度を有し補
因子などを含有する緩衝液が含まれる。一般的に、各々変性工程、アニーリング
工程、及び伸長工程を含む増幅サイクルを約２５から３０サイクル実施するが、
例えば反応中に存在する鋳型ＤＮＡ分子の量によっては、より少ない回数のサイ
クルで十分であることも、より多数のサイクルを要することもあり得る。ＰＣＲ
反応の条件の例は米国特許第５，６０４，０９９号に記載されている。
【０２５３】 核酸配列は、米国特許第５，５４５，５３９号に記載のＰＣＲを用いて増幅す
ることができるが、そこでは増幅反応混合物中に有効量のグリシンを基本とする
浸透圧剤を含有させることにより目標核酸を増幅するための基本的方法の改良が
提供されている。グリシンを基本とする浸透圧剤の使用により、Ｇ及びＣ残基に
富む配列の増幅を改善することができ、したがって、例えばぜい弱Ｘ症候群(Ｃ
ＧＧ繰返し体)及び筋緊張性ジストロフィー(ＣＧＧ繰返し体)に関連する配列の
ようなトリヌクレオチド反復配列を増幅するのに有用である。
【０２５４】 生体試料中の目標核酸配列の存在はまた、増幅された核酸分子であってもよい
目標核酸を含む核酸分子を、少なくとも１種類の適切なヌクレアーゼで特異的に
消化し；核酸の消化断片を、固体坦体に固定化されかつ目標核酸の消化断片とハ
イブリッド形成し得る相補的な捕獲核酸配列とハイブリッド形成させ；固定化断
片と、赤外線を吸収する液体マトリックスとを含むＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析用
組成物を作成し；固定化断片をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析によって確認すること
によっても確認することができる（国際公開ＷＯ第９６／２９４３１号及び第９
８／２００１９号を参照）。相補的捕獲核酸配列とのハイブリッド形成により固
定化された核酸断片を検出することによって、生体試料中に目標核酸配列の存在
を確認することができる。固定化された核酸断片はＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析に
先だって、又はＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析の結果として、例えばＩＲ−ＭＡＬＤ
Ｉ中にＩＲで切断し得る結合が切断することにより、切り離して戻すことができ
る。
【０２５５】 生体試料中の目標核酸の存在はまた、生体試料から得られた核酸分子について
、目標核酸を含む核酸の一部分を増幅することのできる第１組のプライマーを用
いて第１回目のポリメラーゼ連鎖反応を実施し；第１回目の増幅生成物と赤外線
を吸収する液体マトリックスとを含有する組成物を作成し；組成物中の第１回目
の増幅生成物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析によって検出し、それによって生体試
料中の目標核酸の存在を検出することができる。このような方法は、ＩＲ−ＭＡ
ＬＤＩ質量分析に先だって、目標核酸を含む第１回目の増幅生成物の少なくとも
一部分を増幅することのできる第２組のプライマーを用いて第２回目のポリメラ
ーゼ連鎖反応を含むこともできる(国際公開ＷＯ９８／２００１９)。
【０２５６】 生体高分子中のサブユニットの確認を行う方法、例えば核酸配列中の突然変異
を検出する方法も提供する。目標ヌクレオチドの同一性は、目標核酸を含む核酸
分子を、目標ヌクレオチドに隣接する部位の核酸分子と相補的なプライマーオリ
ゴヌクレオチドとハイブリッド形成させ；ハイブリッド形成した核酸分子をジデ
オキシヌクレオシド又は３’−デオキシヌクレオシド三リン酸の完全な組及びＤ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと接触させて、目標ヌクレオチドと相補的なジデ
オキシヌクレオシド又は３’−デオキシヌクレオシド三リン酸のみをプライマー
上に伸長させ；伸長したプライマーと赤外線を吸収する液体マトリックスとを含
有する組成物を作成し；組成物中の伸長したプライマーをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量
分析で検出することによって測定することができる。目標ヌクレオチドの同一性
は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析により測定された伸長したプライマー中に存在す
るディデオキシヌクレオシド又は３’−デオキシヌクレオシド三リン酸に基づい
て測定される。
【０２５７】 目標核酸配列中の突然変異の有無はまた、目標核酸配列を含む核酸分子を、目
標核酸配列に相補的な３’末端塩基を有する少なくとも１種類のプライマーとハ
イブリッド形成させ；ハイブリッド形成した核酸を適当なポリメラーゼ酵素及び
４種類のヌクレオシド三リン酸の一つづつと順次接触させ；反応生成物と赤外線
を吸収する液体マトリックスとを含有する組成物を作成し；組成物中の伸長した
プライマーをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で検出することによって測定することが
できる。生成物の分子量に基づき、プライマーの３’末端に隣接する目標核酸分
子中の突然変異の有無を測定することができる(国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９８／２
００１９号)。
【０２５８】 目標核酸分子中の突然変異はまた、目標核酸分子をオリゴヌクレオチドとハイ
ブリッド形成を行わせて、突然変異部位にミスマッチの生じたハイブリッドを形
成した核酸を生成させ；ハイブリッド形成した核酸を１本鎖特異的エンドヌクレ
アーゼと接触させ；反応生成物と赤外線を吸収する液体マトリックスとを含有す
る組成物を作成し；組成物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析にかけることによって測
定することができる。この方法で用いるオリゴヌクレオチドプローブは、目標核
酸に対応する正常（突然変異を起していない）核酸配列について予想される配列
を有している。ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析によって、組成物中に複数の核酸断片
が検出されれば、目標核酸とオリゴヌクレオチドプローブとの間で生成したハイ
ブリッド形成物中にミスマッチが存在することを示し、したがって、目標核酸が
突然変異を有していることを示している(国際公開ＷＯ９８／２００１９）。
【０２５９】 目標核酸中における突然変異の有無はまた、目標核酸配列を含む核酸分子と１
組の連結反応生成物とＤＮＡリガーゼとで少なくとも１回のハイブリッド形成を
行い；反応生成物と赤外線を吸収する液体マトリックスとを含有する組成物を作
成し；組成物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で分析することによって確認すること
ができる。このような方法を用いることによって組成物中に連結反応産物が検出
されれば、目標核酸配列中に突然変異が存在しないことの確認ができ、一方、組
成物中に連結反応産物の組のみが確認されるならば、目標核酸配列中に突然変異
の存在が確認されたことになる。
【０２６０】 また、上に開示した、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析によって連結反応産物の存在
を確認する方法を用いれば、目標核酸を含む核酸分子上で、１組の連結反応生成
物及び熱安定性ＤＮＡリガーゼと少なくとも１回ハイブリッド形成を行い；反応
生成物と赤外線を吸収する液体マトリックスとを含有する組成物を作成し；組成
物中の連結反応産物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で確認することによって、目標
核酸の存在を検出することができる。
【０２６１】 ここに開示される方法はまた、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析を用いて、目標ポリ
ペプチドの特定のポリペプチド断片の質量を、対応する既知のポリペプチドの対
応するペプチド断片の質量と比較することにより、目標ポリペプチドの同一性を
測定する手段を提供する。このような方法は、例えば目標ポリペプチドをin vit
ro翻訳により、又はin vitro転写及びそれに続く目標ポリペプチドをコード化す
る核酸の翻訳により得て；翻訳されたポリペプチドを、ポリペプチド中の少なく
とも１個のペプチド結合を切断する少なくとも１種類の断片化剤と接触させ；ペ
プチド断片と赤外線を吸収する液体マトリックスとを含有する組成物を作成し；
少なくとも１種類のペプチド断片をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で測定し；ペプチ
ド断片の分子量を対応する既知ポリペプチドのペプチド断片の分子量と比較する
ことによって行うことができる。対応する既知ポリペプチドのペプチド断片の質
量は、目標ポリペプチドと同時に反応を行って、対応する既知ポリペプチドも試
薬と接触させることにより測定しても良く；また対応する既知のポリペプチドを
特定の切断剤と反応させて得たペプチド断片についての既知の質量と比較しても
良く；又はポリペプチドのペプチド断片の分子量測定に用いるアルゴリズムを用
いて得られるポリペプチド配列情報のデータベースから得ても良い。このような
方法は、例えば突然変異の確認、したがって特定の遺伝病のスクリーニングに特
に有用であり、例えば遺伝子の読み取り枠にＳＴＯＰコドンが挿入された１塩基
突然変異のスクリーニングに特に有用であるが、これはこのような突然変異は未
完成の切断型蛋白を生じるからであり；また例えばアラニンからグリシンへのア
ミノ酸の変化をもたらす１塩基変化のように、多形性遺伝子の対立遺伝子変異体
においてコード化が変化しているアミノ酸のスクリーニングに特に有用であるが
、これは異なるアミノ酸を含むポリペプチドはその質量によって識別できるため
である。
【０２６２】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析を用いて標識ポリペプチドを分析し、これをコード
化している核酸についての情報を得る方法は、ヌクレオチド繰返し体、特に異常
な数のヌクレオチド繰返し体が存在することを、そのような反復によってコード
化される目標ポリペプチドの本質を測定することによって確認するのに用いるこ
とができる。異常な数のヌクレオチド繰返し体は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析を
用いて目標ポリペプチドの質量を対応する既知のポリペプチドの質量と比較する
ことによって確認することができる。
【０２６３】 目標ポリペプチドは、目標ポリペプチドをコード化するＲＮＡ分子をin vitro
で翻訳することによって得ることができる。望ましいならば、ＲＮＡ分子は目標
ポリペプチドをコード化する核酸のin vitro転写によって得ることができる。目
標ポリペプチドの翻訳は、目標ポリペプチドをコード化するＲＮＡ分子をin vit
ro翻訳反応に直接導入して行わせることもできるが、目標ポリペプチドをコード
化するＤＮＡ分子をin vitro転写／翻訳反応に導入するか、又はin vitro転写反
応に導入し、次いでＲＮＡをin vitro翻訳反応に移すことによって行わせること
もできる。
【０２６４】 In vitro転写及びin vitro翻訳キットは技術上周知であり、市販されている。
in vitro翻訳システムは、ウサギ網状赤血球可溶化物、ウサギ卵母細胞可溶化物
、ヒト細胞可溶化物、昆虫細胞可溶化物、及びコムギ胚抽出物のような有核細胞
可溶化物を含む。これらの可溶化物及び抽出物は作成することができるが、市販
もされている(プロメガ社；ストラタジーン社、ＬａＪｏｌｌａ ＣＡ；アマシ
ャム社, Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ ＩＬ；及びGIBCO/BRL社, Ｇｒ
ａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ)。In vitro翻訳システムは通常酵素；翻訳因子、
開始因子、伸長因子；化学試薬；及びリボゾームのような高分子を含有する。精
製翻訳因子の混合物、及び可溶化物の組みあわせ、又は開始因子−１(ＩＦ−1）
、ＩＦ−２、ＩＦ−３(α又はβ)、伸長因子Ｔ(ＥＦ−Ｔｕ)又は終結因子のよう
な精製翻訳因子を添加した可溶化物をin vitro ｍＲＮＡ翻訳に用いることがで
きる。所望されれば、Spirin et al.(Science 242: 1162-64 (1988))によって記
載されている連続フローシステムを用いて、インキュベーションを連続して行う
ことができるが、そこにおいては試薬がシステム内に流入し、ナセントポリペプ
チドは取り出されるか又は蓄積するにまかされる。そのような方法はナセントポ
リペプチドの大量生成に望ましい場合がありうる。
【０２６５】 網状赤血球可溶化物を用いるin vitro翻訳反応は、例えば網状赤血球可溶化物
１０μｌをスペルミジン、クレアチンリン酸、アミノ酸、ＨＥＰＥＳ緩衝液(ｐ
Ｈ７．４)、ＫＣｌ、ＭｇＡｃ及び翻訳すべきＲＮＡと混合し、適切な時間、一
般に約１時間３０℃でインキュベートすることによって行うことができる。効率
良い翻訳を行わせるためのＭｇＡｃの至適量は網状赤血球可溶化物毎に異なるが
、ＲＮＡ標準品と約１ｍＭまでのＭｇＡｃを用いて測定することができる。ＫＣ
ｌの至適濃度も特定の反応毎に異なり得る。例えば、キャッピングされたＲＮＡ
の翻訳には通常７０ｍＭ ＫＣｌが至適であるが、キャッピングされていないＲ
ＮＡの翻訳には通常４０ｍＭ ＫＣｌが至適である。
【０２６６】 コムギ胚抽出物はRoberts and Paterson (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2
330-2334 (1973))が記載した方法、及び所望されればAnderson (Meth. Enzymol.
101: 635 (1983))が記載した変法によって作成することができる。このプロト
コールは更に製造用プロトコールＬ４１８(プロメガ社)に従って改変することも
できる。一般にはコムギ胚抽出物はコムギ胚を抽出緩衝液中で磨砕し、次いで遠
心分離して細胞破壊片を除去することにより作成する。上清をクロマトグラフィ
ーにかけて内因性アミノ酸及び翻訳を阻害する植物色素から分離する。抽出物は
また、ミクロコッカスのヌクレアーゼで処理して内因性ｍＲＮＡを分解し、これ
によりバックグラウンド翻訳を最小限に抑える。コムギ胚抽出物はｔＲＮＡ、ｒ
ＲＮＡ、及び開始、伸長、終結因子など蛋白合成に必要な細胞成分を含有する。
抽出物はホスホクレアチンキナーゼ及びホスホクレアチンのようなエネルギー再
生系を添加することにより更に至適化することができる。ＭｇＡｃは大多数のｍ
ＲＮＡ種の翻訳について推奨されるレベル、一般に約６．０から７．５ｍＭマグ
ネシウムのレベルで添加する(Erickson and Blobel Meth. Enzymol. 96: 38 (19
82)をも参照)が、改変して例えば最終イオン濃度を２．６ｍＭマグネシウム及び
１４０ｍＭカリウムとし、混合物をｐＨ７．５としてもよい(米国特許第４，９
８３，５２１号)。コムギ胚抽出物による翻訳はまた米国特許第５，４９２，８
１７号記載の方法で行うこともできる。
【０２６７】 至適in vitro翻訳条件又は反応の程度を測定するために、in vitroシステムに
おけるｍＲＮＡの翻訳を例えば質量分析によってモニタリングすることができる
。モニタリングはまた、例えば35Ｓ−メチオニンのような放射性アミノ酸を１種
以上添加し、インキュベーション中の種々の時点で、可溶化物中のタンパクをＴ
ＣＡなどで沈殿させ、沈殿中に存在する放射活性の量を計測して放射標識の翻訳
精製物への取り込みを測定することによっても行うことができる。翻訳生成物は
また、免疫沈降又はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析するこ
ともできる(例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual
(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Harlow and Lane, Antibodies
: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988)を参照)
。標識非放射性アミノ酸をナセントポリペプチドに取り込ませることもできる。
例えば、翻訳反応にミス−アミノアシル化ｔＲＮＡを含有させることもできる(
米国特許第５，６４３，７２２号)。非放射性標識をｔＲＮＡ分子にミス−アミ
ノアシル化し、ｔＲＮＡアミノ酸複合体を翻訳システムに添加しても良い。この
システムをインキュベートして非放射性標識をナセントポリペプチドに取り込ま
せ、標識の適切な検出法を用いて標識を含有するポリペプチドを検出することが
できる。ｔＲＮＡ分子のミス−アミノアシル化はまた、ポリペプチドの単離を容
易にするため標識をポリペプチドに添加するのにも用いることができる。このよ
うな標識としては例えばビオチン、ストレプトアビジン、及びそれらの誘導体が
含まれる(米国特許第５，６４３，７２２号)。
【０２６８】 In vitro転写と翻訳反応はまた、例えばＣｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ (プロメガ社、カタログ番号
＃Ｌ４６０６、＃Ｌ４６１０、又は＃Ｌ４９５０)のような市販品を用いて同時
に行わせることができる。ＲＮＡポリメラーゼ及び有核生物細胞可溶化物を用い
た転写翻訳共役システムは米国特許第５，３２４，６３７号に記載されている。
In vitro転写翻訳共役反応はまた、例えばE. coli S30無細胞系抽出物のような
細菌のシステムなど原核細胞システムを用いて行うこともできる(Zubay, Ann. R
ev. Genet. 7: 267 (1973))。
【０２６９】 目標ポリペプチドはまた、目標ポリペプチドをコード化する核酸で形質転換し
、これを発現する宿主細胞から得ることもできる。目標ポリペプチドをコード化
する核酸は、例えばＰＣＲによって増幅して発現ベクターに挿入し、目標核酸に
コード化されるポリペプチドの発現に適した宿主細胞にこの発現ベクターを導入
することができる。宿主細胞は有核細胞、特にヒト細胞のような哺乳動物細胞で
も良く、又は例えばE. coliを含む原核細胞でも良い。有核及び原核細胞の発現
ベクターは技術上周知であり、市販品を得ることができる。宿主細胞で発現させ
た後、目標ポリペプチドをここに開示される方法を用いて単離することができる
。例えば、もし目標ポリペプチドがポリヒスチジン標識ペプチドに融合していれ
ば、目標ポリペプチドはキレート化したニッケルイオンカラムのアフィニティー
クロマトグラフィーで精製することができる。
【０２７０】 目標ポリペプチドは目標ポリペプチドをコード化する核酸の増幅物から製造す
ることができる。目標ポリペプチドを例えば増幅された核酸から製造する場合に
は、１個以上の転写又は翻訳調節領域を、核酸又はそれがコード化するポリペプ
チドに機能的にリンクさせることが有用である。即ち、前向き又は逆向きＰＣＲ
プライマーに、所望されれば例えばＳＰ６、Ｔ３又は６Ｔ７プロモーターのよう
なバクテリオファージプロモーターなどプロモーターのヌクレオチド配列を含ま
せることができる。これらのプライマーを用いて核酸配列増幅を行えば、プロモ
ーターに機能的にリンクした、即ちプロモーターがプロモータとしての機能を発
揮する状態で増幅核酸の中に位置する、増幅核酸が生成する。このような核酸を
in vitro転写反応に用いて、増幅された目標核酸配列を転写することができる。
【０２７１】 プライマー、例えば前向きプライマーはまた原核又は有核細胞系におけるＲＮ
Ａの翻訳に必要な調節配列領域を含むことができる。特に、原核翻訳系で翻訳反
応を行うのが望ましい場合、プライマーは、プロモーター配列の下流に位置し開
始コドンの５から１０ヌクレオチド上流に位置する原核細胞のリボゾーム結合配
列(シャイン-ダルガルノ配列)を機能的に連結して含むことができる。
【０２７２】 プライマーはまた、開始コドン(ＡＴＧ)又はそれに相補的なコドンのいずれか
適当なほうを、プロモータが存在するならばその下流に位置して含ませ、それに
よって、目的の読み取り枠とフレームが合った機能的に連結したＡＴＧコドンを
含有する増幅目標配列が増幅によって得られるようにすることができる。読み取
り枠は天然の読み取り枠であっても良く、又はその他のどのような読み取り枠で
あっても良い。目標ポリペプチドが天然に存在するポリペプチドでない場合、目
標ポリペプチドをコード化する核酸に開始コドンを機能的に連結することによっ
て、目的の読み取り枠中の目標ポリペプチドの翻訳を行わせることができる。
【０２７３】 プライマー、一般に逆向きプライマーは目標ポリペプチドを適正に終結させる
ために、１個以上の読み取り枠中のＳＴＯＰコドンをコード化する配列を含むこ
とができる。更に、任意に数個の残基で分離した３個の読み取り枠と思われる配
列の各々に１個ずつＳＴＯＰコドンを有する配列が入るように、３個のＳＴＯＰ
コドンを逆向きプライマーを挿入することによって、挿入されていなければポリ
ペプチドの未成熟終結をもたらす筈の突然変異の下流(３’末端側)に生じる更な
る突然変異を検出することができる。
【０２７４】 前向き又は逆向きプライマーはまた、第２のポリペプチドをコード化するヌク
レオチド配列又はヌクレオチド配列の相補的配列(もし逆向きプライマーにある
ならば)を含むことができる。第２のポリペプチドは特定の試薬、例えば抗体と
特異的に相互作用する標識ペプチドであっても良い。第２のポリペプチドはまた
、ブロックされていず反応性を有するアミノ末端又はカルボキシル末端を有して
いても良い。
【０２７５】 標識ペプチドと目標ポリペプチド又はその他の目的ポリペプチドとの融合によ
って、ポリペプチドの検出と単離を行うことができる。標識ペプチドをコード化
する配列とフレームを合わせて連結した核酸でコード化された目標ポリペプチド
は、標識ペプチドと特異的に相互作用する試薬を用いることによってin vitro翻
訳反応混合物から単離することができ、次いで単離した目標ポリペプチドをこの
文書に開示するＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析に供することができる。標識ペプチド
又はその他の第２ポリペプチドと融合する単離目標ポリペプチドは、ＩＲ−ＭＡ
ＬＤＩ質量分析に供するに十分な程度精製された型になっていることを確認すべ
きであるが、それは標識の質量が判り、これが測定において考慮されるからであ
る。
【０２７６】 一般にプラスミド中に含まれる任意の物質に結合してその単離を助ける種々の
標識ペプチド、及びそれら標識ペプチドをコード化する核酸配列は周知でありま
た市販されている(ノバゲン社)。標識として用いるペプチドは、標識ペプチドと
特異的に相互作用する抗体のような試薬が入手可能であるか、又は作成可能でか
つ確認である限り、どのようなものでも良い。しばしば用いられる標識ペプチド
としては、ｃ−ｍｙｃの１０個のアミノ酸配列を含むｍｙｃエピトープ(Ellison
et al., J. Biol. Chem. 266: 21150-21157 (1991)を参照)；ｐＦＬＡＧシステ
ム(インターナショナル・バイオテクノロジーズ社)；ｐＥＺＺ−プロテインＡシ
ステム(ファルマシア社)；Haemophilus influenzaの赤血球凝集蛋白の１６アミ
ノ酸ペプチド部分、ＧＳＴポリペプチド；及び例えば６個のＨｉｓを含むＨｉｓ
−６のように一般的に４から１２個又はそれ以上の連続したＨｉｓ残基を含むポ
リヒスチジンペプチド、などが含まれる。標識ペプチドと特異的に相互作用する
試薬も技術上周知であって又市販されており、これらは抗体及び種々の他の分子
を含み、例えばＨｉｓ−６と特異的に相互作用するニッケル又はコバルトイオン
のような金属イオン；又はアガロースのような固体坦体に結合しＧＳＴと特異的
に相互作用するグルタチオンなど、標識の種類によって様々である。
【０２７７】 第２のポリペプチドはまた、目標核酸によってコード化される目標ポリペプチ
ドの質量修飾剤として役立つように設計することもできる。すなわち、目標ポリ
ペプチドは質量修飾用アミノ酸配列に機能的に連結した目標ポリペプチドをコー
ド化したＲＮＡを翻訳することによって質量修飾を行うことができ、ここで質量
修飾配列は融合ポリペプチドのアミノ末端にあっても良く、またカルボキシル末
端にあっても良い。これらの遺伝子組換え核酸に由来するポリペプチドの質量修
飾は、例えば数種類のポリペプチドを１回のＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で分析す
る際に有用である。何故ならば質量修飾によって、質量スペクトルの分解能が向
上し、２種以上の異なる目標ポリペプチドを多重化によって分析することが可能
になるためである。
【０２７８】 (標識付きペプチド) ポリペプチドはペプチド又はポリペプチド断片を目標ポリペプチドに添加する
ことによって修飾することができる。例えば、目標ポリペプチドは、目標ポリペ
プチドにポリヒスチジン、ポリリジン、又はポリアルギニンなど余分のアミノ酸
を含むように翻訳して修飾することができる。これらの修飾は精製、確認、及び
固相化(またＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析においても)に役立つ。修飾は翻訳後に付
加することもでき、又は目標ポリペプチドをコード化する核酸の配列を含む遺伝
子組換え核酸によってコード化することもできる。
【０２７９】 多数の目標ポリペプチドにそれぞれ異なる質量修飾を行おうとする場合には、
その多数の中の各々の目標ポリペプチドを、例えば異なるポリヒスチジン配列、
例えばＨｉｓ−４、Ｈｉｓ−５、Ｈｉｓ−６、等々を用いて質量修飾を行うこと
ができる。このような質量修飾成分を用いれば、その部分が標識ペプチドとして
作用し、例えばこれに付加した目標ポリペプチドの単離に有用であるという更な
る利点がある。したがって、開示した方法により多数のポリペプチドについて多
重化を行うことが可能となり、それ故多数のポリペプチド、特に多数の目標ポリ
ペプチドの各々のアミノ酸配列を測定するのに有用である。
【０２８０】 増幅用プライマーは、増幅反応によって核酸を生成し、その核酸が転写と翻訳
によって非天然型ポリペプチド、例えば天然に存在するポリペプチドをコード化
する読み取り枠とは異なる読み取り枠によってコード化されるポリペプチドを生
成するように選択することができる。したがって、適切なプライマーを設計する
ことにより、特に目的の読み取り枠の中に、またもし存在するならばプライマー
中のプロモーターの下流に開始コドンを含ませることにより、目標核酸から生成
するポリペプチドが核酸の２個の非読み取り枠の１個によりコード化されるよう
にすることができる。このような方法は、未完成の状態で蛋白を切断して本来含
まれるべきアミノ酸を除外するＳＴＯＰコドンのフレームからはずし、またより
可溶性のアミノ酸繰返し体を含むポリペプチドを作成するのに有用である。ここ
に開示する修飾法に有用なプライマーは市販のものを入手することもでき、又は
例えばホスホチオエステル法(Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90 (1979)；
米国特許第４，３５６，２７０号を参照；また米国特許第５，５４７，８３５号
、第５，６０５，７９８号、第５，６２２，８２４号を参照）を用いて合成する
こともできる。
【０２８１】 非天然型目標ポリペプチドはまた、核酸のエキソン領域の５’又は３’非コー
ド化領域によって、又はイントロンによって、又は６個のフレーム(鎖当りフレ
ーム３個)の１個の中に読み取り枠の少なくとも一部分を含むプロモーター配列
のような調節領域によって、コード化することができる。このような場合には、
目標核酸を増幅するためのプライマーの１個はプロモーターと開始コドンを含み
、目標核酸がin vitroで転写及び翻訳されうるようする。即ち、ここに開示する
目標ポリペプチドの確認法を用いれば、少なくとも２個のアミノ酸、一般的には
３又は４個のアミノ酸、特に少なくとも５個のアミノ酸より成るポリペプチドが
、ポリヌクレオチドの６個のフレームの１個によりコード化されていれば、染色
体のどの領域に位置するヌクレオチド配列であっても確認することができる。し
たがって、ここで開示する方法は、未知の核酸のヌクレオチド配列を直接決定す
るのに用いることができ、又は未知の核酸によってコード化されるポリペプチド
のアミノ酸配列を、対応する既知の核酸によってコード化されるポリペプチドの
アミノ酸配列と比較することによって間接的に決定するのに用いることができる
。ヌクレオチド配列が未知のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて決定される
場合には、未知のポリペプチドから決定されたヌクレオチド配列はポリペプチド
をコード化する天然型ヌクレオチド配列と同一のこともあるが、又は遺伝暗号の
同義性により天然型配列とは異なることもあり得る。
【０２８２】 プライマーオリゴ塩基伸長(PROBE)と呼称する方法をここで用いることができ
る。この方法では１個の検出用プライマーを使用し、次いでオリゴヌクレオチド
伸長工程により生成物を得、これをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析により容易に分離
することができる。生成物は、反復単位の数、又は反復領域内の第２部位の突然
変異に特異的な塩基数の数によって長さが異なる。この方法によって、例えば確
認、突然変異の確認、肉親関係、ＨＬＡ適合性、及び他のそのような標識の測定
をミクロサテライトＤＮＡのＰＲＯＢＥ−ＭＳ分析を用いて好都合に行うことが
できる。好ましい様態では、方法は以下の工程、即ち ａ) ２名の個人より生物学的試料を採取し、 ｂ) 各個人由来のＤＮＡにつき、２個又はそれ以上のミクロサテライトＤＮＡ
反復配列を含む領域を増幅し、 ｃ) 増幅ＤＮＡをイオン化／蒸発させ、 ｄ) 増幅ＤＮＡの存在を検出し、増幅ＤＮＡの分子量を比較する工程 を含む。 サイズが異なることは非同一性(即ち、野生型対突然変異型)、非遺伝的関係、若
しくは非適合性を示す。断片のサイズが類似していることは同一性、肉親関係、
又はＨＬＡ適合性の可能性を示す。異なる連結部位を有するプライマーを用いて
固定化することにより、１種以上の標識を同時に検査することができる。
【０２８３】 もう一つの突然変異検出法であるＬＯＯＰ−ＰＲＯＢＥと呼称するループ−プ
ライマーオリゴ伸長法は、特に主要な疾病誘起性突然変異あるいは普通に見られ
る多形性の検出に、ここで開示するＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析のフォーマットに
おいて用いることができる。特にここに示す様態では、この方法を用いて試料中
の目標核酸を検出する方法は以下の工程、即ち、 ａ) 試料中のβ−グロブリンのような目標核酸配列を、(ｉ) ５’末端が目標
ＤＮＡの目標コドンの直近の下流の部分と同一であり、次いで、β−グロブリン
の場合にはＣｆｏｌのような、唯一の制限酵素部位をアンプリコンに導入する配
列が続き、また３’末端プライマーは自己相補的である第１のプライマーと、(
ｉｉ) ストレプトアビジンビーズのような固体坦体にＤＮＡを固定化するため
の、ビオチンのような標識を含む第２の下流プライマーを用いて増幅し、 ｃ) 二本鎖増幅ＤＮＡを連結部位を介して固体坦体に固定化し、 ｄ) 固定化ＤＮＡを変性させて非固定化ＤＮＡ鎖を単離し、 ｅ) 単離した非固定化ＤＮＡ鎖の３’末端の自己相補的配列をアニーリングさ
せて３’末端がポリメラーゼにより伸長可能なようにするが、アニーリングは例
えば３７℃への加熱と冷却を繰り返すか、又はその他の適切な方法で行うことが
でき、 ｆ) ＤＮＡポリメラーゼ、３ｄＮＴＰｓ／１ｄｄＮＴＰを加えてアニールした
ＤＮＡを伸長させてＤＮＡ鎖の３’末端がＤＮＡポリメラーゼにより次のｄｄＮ
ＴＰ部位(即ち突然変異坐位)まで伸長するようにし、 ｇ) 伸長した二本鎖ステムループＤＮＡを唯一の制限エンドヌクレアーゼで切
断して、切断されたステムループＤＮＡを除去し、 ｉ) (任意にマトリックス、特にここに規定した液体マトリックスを添加し）伸
長生成物をイオン化／蒸発させ、そして ｊ) 伸長した目標核酸の存在を検出するが、ここで野生型と異なる質量のＤＮ
Ａ断片の存在は目標コドンが突然変異を起していることを示す、 という工程を含む。 この方法は、ＭＳを用いる他の突然変異分析法と比較して、突然変異検出用の特
異的試薬が１種類少なくて済み、それにより方法が簡略化され、自動化しやすい
。また、分析する特定の伸長生成物はプライマーから切断されるため、他の方法
に比べて短い。加えて、添加したプライマーに比べてアニーリング効率が高く、
したがってより多くの生成物ができると思われる。この方法は多重化に対応でき
、また種々の検出スキーム(例えば１塩基伸長、オリゴ塩基伸長及び配列測定)に
も対応できる。例えばループプライマーの伸長は、高度多形性領域内で短い診断
用シークエンシングラダーを生成させることにより、例えばＨＬＡタイピング、
抵抗性、又は生物種タイピングに用いることができる。
【０２８４】 (遺伝子型決定及び表現型決定) 遺伝子、特にヒト遺伝子の多形性領域の対立遺伝子変異体の本質を決定する方
法も提供する。対立遺伝子変異体は１個のヌクレオチド即ち塩基対が、例えば１
個のヌクレオチドの置換により異なっている場合；２個以上のヌクレオチド即ち
塩基対が異なっている場合；例えばヌクレオチド又はトリヌクレオチド繰返し体
の付加又は欠失によりヌクレオチドの数が異なる場合；又は転座のような染色体
配列換えによって異なっている場合がある。多形性領域の特定の対立遺伝子変異
体は特定の疾患と関連しており、また場合によっては疾患の予後と相関している
。
【０２８５】 表現型の遺伝的本質を測定する方法、又は表現型をもつ素質を確認する方法も
又提供する。例えば、被験者が特定の疾患又は状態の素質を有するか否か、即ち
被験者が、遺伝子の多形性領域の特定の対立遺伝子変異体と関連する疾患又は状
態を有しているか否か、若しくはこれを発症するリスクを有するか否か、を測定
することができる。このような被験者は、被験者が特定の疾患又は状態と関連す
る対立遺伝子変異体を有しているか否かを測定することによって確認することが
できる。更に、もし疾患が劣性遺伝により遺伝する疾患ならば、被験者が特定の
疾患又は状態に関連する遺伝子の劣勢対立遺伝子のキャリアーであるか否かによ
って測定することができる。
【０２８６】 種々の疾患又は状態が特定の遺伝子と、より具体的には特定の突然変異又は遺
伝子の遺伝的欠失と、連関することが明らかにされている。例えばがんのような
過増殖性疾患は特定の遺伝子の突然変異と関連している。これらのがんにはＢＲ
ＣＡ１又はＢＲＣＡ２の突然変異と関連する乳がんが含まれる。ＢＲＣＡ１の突
然変異対立遺伝子は例えば米国特許第５，６２２，８２９号に記載されている。
突然変異を起すとがんの発生に関連するがん抑制遺伝子のような他の遺伝子とし
ては、ｐ５３(多種類の型のがんと関連する）；Ｒｂ(網膜芽細胞腫)；ＷＴ１(ウ
ィルムス腫瘍)及びｃ−ｍｙｃ及びｃ−ｆｏｓのようなプロトオンコジーン(Thom
pson and Thompson, Genetics in Medicine 5th ed.,; Nora et al., Medical G
enetics 4th ed. (Lea and Febifer, eds.)を参照)などが含まれるが、これらに
限定するものではない。
【０２８７】 ここに開示される方法はまた、例えばＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２において生じ
るような切断型ポリペプチドの翻訳をもたらすＤＮＡ突然変異の検出にも用いる
ことができる。一つの様態では、このような突然変異を含む核酸領域の翻訳は切
断型ポリペプチドをもたらすが、これはＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析によって対応
する非切断型ポリペプチドから容易に区別することができる。
【０２８８】 ここに開示される方法はまた、被験者、例えば臓器又は骨髄移植のレシピエン
ト又はドナーになることが考えられている被験者、の遺伝子型を確認するのにも
用いることができる。例えば、被験者のＭＨＣ対立遺伝子、特にＨＬＡ遺伝子の
確認を行うことができる。このような方法を用いて得られた情報は、移植片と異
なる移植抗原を持つレシピエントに移植を行うことは移植片の拒絶を引き起こし
、また骨髄移植の場合には対宿主性移植片病を引き起こす可能性があるので有用
である。
【０２８９】 患者の薬剤に対する応答はチトクロームＣ４５０システムのような薬剤修飾シ
ステムの変化によって影響され、また特定の感染性疾患に対する感受性も遺伝的
状態によって影響を受ける。薬理遺伝学に関与する遺伝子は良く知られている(N
ora et al., Medical Genetics 4th ed. (Lea and Febiger, eds.))。即ち、特
定の対立遺伝子変異体を確認することによって、特定の薬剤に対する患者の応答
可能性又は感染性疾患に対する被験者の感受性を予測することができる。
【０２９０】 いかなる疾患又は状態にも関連しない多型性領域があるかもしれない。例えば
、ヒトゲノムの多数の遺伝子座は多形性の短い縦列反復(ＳＴＲ)領域を有してい
る。ＳＴＲは短い、３から７塩基対の長さの反復領域を含む。ヒトゲノム中に１
５ｋｂ当り１個の頻度で２００，０００個のトリマー又はテトラマーのＳＴＲが
あると予想されている(例えば、国際公開ＷＯ９２／１３９６９；Edwards et al
., Nucl. Acids. Res. 19: 4791 (1991); Beckmann et al., Genomics 12: 627-
631 (1932)を参照)。これらのＳＴＲ遺伝子座の半分近くは多形性であり、遺伝
標識形質としての豊富な資源を提供している。特定の遺伝子座の反復単位数の変
化は観察される多形性の原因であり、可変ヌクレオチド縦列反復(ＶＮＴＲ)遺伝
子座(Nakamura et al., Science 235: 1616-1622 (1987))；より長い反復単位を
有するミニサテライト遺伝子座(Jeffreys et al., Nature 314: 67-73 (1985))
；及びミクロサテライト又はジヌクレオチド反復遺伝子座(Luty et al., Nucl.
Adids Res. 19: 4308 (1991); Litt et al., Nucl. Adids Res. 18: 4301 (1990
); Litt et al., Nucl. Acids Res. 18: 5921 (1990); Luty et al., Am. J. Hu
m. Genet. 46: 776-783 (1990); Tautz, Nucl. Acids Res. 17: 6463-6471 (198
9); Weber et al., Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396 (1989); Beckman et al.,
Genomics 12: 627-631 (1992))の変異を示唆する。
【０２９１】 多形性のＳＴＲ遺伝子座及びその他の遺伝子多形性領域は、ヒトの確認、親子
関係の検査、遺伝子地図作成、移民及び遺産相続の紛争、双子の卵性診断、ヒト
における血族試験、ヒト培養細胞の品質管理、ヒトの遺体の確認、及び法医学に
おける精液試料、血痕その他の材料の試験のために極めて有用な標識である。こ
のような遺伝子座はまた、市販用動物の飼育及び系統分析、また市販用植物育種
においても有用な標識である。作物及び動物における経済上重要な特性もまた、
多形性ＤＮＡ標識を用いて連関分析により確認することができる。
【０２９２】 ＳＴＲ遺伝子座は、目標とする縦列反復に隣接する領域内に確認される特異的
なプライマー配列を用いてＰＣＲにより増幅することができる。これらの遺伝子
座の対立遺伝子型は増幅領域内に含まれる反復配列のコピー数により区別される
。ＳＴＲ遺伝子座の例としてはヒトＣＤ４遺伝子座中のペンタヌクレオチド繰返
し体（Edwards et al., Nucl. Acids Res. 19: 4791 (1991))；ヒトアロマター
ゼチトクロームＰ−４５０遺伝子中のテトラヌクレオチド繰返し体(ＣＹＰ１９
；Polymeropoulos et al., Nucl. Acids Res. 19: 195 (1991))；ヒト凝固ＸＩ
ＩＩ因子遺伝子中のテトラヌクレオチド繰返し体(Ｆ１３Ａ１；Polymeropoulos
et al., Nucl. Acids Res. 19: 4306 (1991))；Ｆ１３Ｂ遺伝子座中のテトラヌ
クレオチド繰返し体(Nishimura et al., Nucl. Acids Res. 20: 1167 (1992))；
ヒトｃ−ｌｅｓ／ｆｐｓプロトオンコジーン中のテトラヌクレオチド繰返し体(
ＦＥＳ；Polymeropoulos et al., Nucl. Acids Res. 19: 4018 (1991))；ＬＦＬ
遺伝子中のテトラヌクレオチド繰返し体(Zuliani et al., Nucl. Acids Res. 18
: 4958 (1990))；ヒト膵臓ホスホリパーゼＡ−２遺伝子のトリヌクレオチド反復
多形性(ＰＬＡ２；Polymeropoulos et al., Nucl. Acids Res. 18: 7468 (1990)
)；ＶＷＦ遺伝子中のテトラヌクレオチド反復多形性(Ploos et al., Nucl. Acid
s Res. 18: 4957 (1990))；及びヒト甲状腺ペルオキシダーゼ(ｈＴＰＯ)遺伝子
座中のテトラヌクレオチド繰返し体(Anker et al., Hum. Mol. Genet. 1: 137 (
1992))が含まれる。
【０２９３】 (遺伝病及び感染症の診断) 検出すべき目標生体高分子により、開示された方法は、例えば遺伝病又は染色
体異常；肥満、動脈硬化、糖尿病、又はがんなど遺伝子に影響される疾患又は状
態；又はウイルス、細菌、寄生虫又は真菌を含む病原生物による感染、の診断を
可能にし；又は例えばミニサテライト及びミクロサテライトの分析に基づく同一
性又は遺伝に関する情報；又は例えばＨＬＡ表現型に基づく組織適合性に関する
情報を提供する。したがって、例えば罹患していない個人の遺伝子中に反復があ
る場合、その数に比べて１０未満から１００以上付加した異常な数に亘るトリヌ
クレオチド繰返し体により特徴づけられる遺伝的損傷を、ここに開示した方法で
ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析を用いて目標核酸又はそれによりコード化される目標
ポリペプチドを分析することにより検出する方法を提供する。
【０２９４】 ヌクレオチド繰返し体によって特徴づけられる遺伝的損傷に関連した疾患は、
例えばハンティングトン病、前立腺がん、ＳＣＡ−１、ぜい弱Ｘ症候群(Kremer
et al., Science 252: 1711-14 (1991); Fu et al., Cell 67: 1047-58 (1991))
; Hirst et al., J. Med. Genet. 28: 824-29 (1991)))、Ｉ型筋緊張性ジストロ
フィー(Mahadevan et al., Science 255: 1253-55 (1992); Brook et al., Cell
68: 799-808 (1992))、ケネディ病(脊髄及び眼球筋萎縮症とも呼称される；La
Spada et al., Nature 352: 77-79 (1991); マチャド‐ジョセフ病、及び歯状核
赤核小脳萎縮症及び淡蒼球視床下核萎縮症を含む。異常数のトリプレット繰返し
体は遺伝子のいかなる領域にも位置することができ、それらはコーディング領域
、エキソンの非コーディング領域、イントロン、又はプロモーター若しくはその
他の調節領域を含む。例えば、筋緊張性ジストロフィーに関連したトリヌクレオ
チド繰返し体の拡大は第１９染色体のＭｔＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域(ＵＴＲ)
中に生じる。これらの疾患のあるもの、例えば前立腺がんでは、トリヌクレオチ
ド繰返し体の数は疾患の予後と正の相関があり、トリヌクレオチド繰返し体の数
が多いほど予後が不良である。
【０２９５】 したがって、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析によって核酸を検出する方法は、例え
ば３０００種を超す既知の遺伝病(Cooper and Krawczak, "Human Genome Mutati
ons" (BIOSIS Publ. 1993))のいずれの１つの存在の診断にも有用であり、これ
らの疾患には血友病、サラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハンティ
ングトン病、アルツハイマー病及び嚢胞性線維症が含まれ、また今後確認される
その他の遺伝病の診断にも有用である。加えて、これらの方法は、染色体異常の
結果起こるある種の出生時欠損の診断に有用であり、これらの染色体異常として
２１トリソミー(ダウン症候群)、１３トリソミー(パトー症候群)、１８トリソミ
ー(エドワーズ症候群)、Ｘモノソミー(ターナー症候群)及びクラインフェルター
症候群(ＸＸＸ)のようなその他の性染色体異数性が含まれる。これらの方法はま
た、多数の疾患のいずれについても、各々その素因となる特定のＤＮＡ配列の検
出にも用いることができ、その疾患には例えば糖尿病、動脈硬化、肥満、種々の
自己免疫疾患、及び結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん及び肺がんの
ようながんが含まれる。又はまたこれらの方法は、個人が特定の医療に適してい
るか否かを左右するＤＮＡ配列の検出に用いることもできる。
【０２９６】 又はまたこれらの方法は、宿主細胞に正常に含まれている配列とは異なる核酸
配列を有するウイルス、細菌、真菌、又はその他の感染性生物に特徴的な核酸の
検出にも用いることができる。これらの方法はまた、同一性、遺伝又は適合性に
関する情報を提供する特徴的な核酸配列を検出するのにも用いることができる。
【０２９７】 ヒト及び動物に感染し疾病を引き起こすウイルスであって、開示された方法で
検出できるウイルスには以下のものが含まれるが、これらに限定されるものでは
ない。即ち、Retroviridae (例えばＨＩＶ−１のようなヒト免疫不全症ウイルス
(ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ/ＬＡＶとも呼称される；Ra
tner et al., Nature 313: 227-284 (1985); Wain Hobson et al., Cell 40: 9-
17 (1985))、ＨＩＶ−２(Guyader et al., Nature 328: 662-669 (1987); 欧州
特許公開第Ｏ ２６９５２０号；Chakarabati et al., Nature 328: 543-547 (1
987)；欧州特許申請第Ｏ ６５５５０１号)、及びＨＩＶ−ＬＰ(国際公開ＷＯ９
４／００５６２)などその他の分離株；Picornaviridae (例えばポリオウイルス
、Ａ型肝炎ウイルス(Gust et al., Intervirology 20: 1-7 (1983))；エンテロ
ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス)；Cal
civirdae (例えば胃腸炎の原因となる株)、Togariviridae (例えばウマの脳症ウ
イルス、風疹ウイルス)；Flaviridae (例えばデング熱ウイルス、脳炎ウイルス
、黄熱病ウイルス)；Coronaviridae (例えばコロナウイルス)；Rhabdoviridae (
例えば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス)；Filoviridae (例えばエボラウ
イルス)；Paramyxoviridae (例えばパラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺
炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス)；Orthomyxoviridae (例えばインフ
ルエンザウイルス)；Bungaviridae (例えばハンターンウイルス、ブニヤウイル
ス、 フレボウイルス及びナイロウイルス)；Arenaviridae (出血熱ウイルス)；R
eoviridae (例えばレオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス)；Birnavir
idae；Hepadnaviridae (Ｂ型肝炎ウイルス)；Parvoviridae (パルボウイルス)；
Papovaviridae；Hepadnaviridae (Ｂ型肝炎ウイルス)；Parvoviridae (殆どのア
デノウイルス)；Papovariridae (パピローマウイルス、ポリオーマウイルス)；A
denoviridae (殆どのアデノウイルス)；Herpesviridae (単純疱疹ウイルス１(Ｈ
ＳＶ−１)及びＨＳＶ−２、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、
ヘルペスウイルス；Poxviridae (痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックス
ウイルス)；Iridoviridae (例えばアフリカ豚コレラウイルス)；及び未分類のウ
イルス(例えば海綿状脳障害の病原体、デルタ型肝炎の病原体(Ｂ型肝炎ウイルス
の欠損型衛星ウイルスと考えられている)、非Ａ、非Ｂ肝炎の病原体(クラス１＝
経口感染；クラス２＝非経口感染、即ち肝炎ウイルスＣ)；ノーウォークウイル
ス及び関連ウイルス、及びアストロウイルスである。
【０２９８】 感性性細菌の例としては以下のものが含まれる。即ち、Helicobacter pyloris
、Borelia burgdorferi、Legionella pneumophilia、Mycobacteria sp.(例えばM
. tuberculosis、M. avium、M. intracellulare、M. kansaii、M. gordonae), S
taphylococcus aureus、Neisseria gonorrheae、Neiserria meningitidis、 Lis
teria monocytogenes、Streptococcus pyogenes(Ａ群連鎖球菌)、 Streptococcu
s agalactiae(Ｂ群連鎖球菌) 、Streptococcus sp.(viridans) 、Streptococcus
faecalis、Streptococcus bovis, Streptococcus sp.(嫌気性種) 、Streptococ
cus pneumoniae、病原性Campylobacter sp. 、Enterococcus sp. 、Haemophilus
influenzae、Bacillus anthracis、Corynebacterium diphtheriae、Corynebact
erium sp.、 Erysipelothrix rhusiopathiae、Clostridium perfringens、Clost
ridium tetani、 Enterobacter aerogenes、Klebsiella pneumoniae、Pasteurel
la multocida、 Bacteroides sp. 、Fusobacterium nucleatum、Streptobacillu
s moniliformis、 Treponema pallidium、Treponema pertenue、Leptospira、及
びActinomyces israelliである。
【０２９９】 感染性真菌の例としては下記のものが含まれるが、これらに限定される訳では
ない。即ち、Cryptococcus neoformans、Histoplasma capsulatum、Coccidioide
s immitis、Blastomyces dermatitidis、Chlamydia trachomatis、Candida albi
cansである。他の感染性生物としては、Plasmodium falciparum及びToxoplasma
gondiのような原性生物が含まれる。
【０３００】 (可遊離性質量標識分子) ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析は標的分子の検出及び確認のために質量標識分子を
結合して行うことができる。可遊離性質量標識分子はPCT出願公開第ＷＯ９８／
２６０９５号に記載されており、参考として全文をここに添付する。これらの方
法では、目標に特異的な要素を介して質量標識を目標分子に結合させる。目標分
子から質量標識を遊離させた後、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で質量標識を検出す
ることによって、目標は“間接的に”検出される。標識の質量値が目標に特異的
な要素を確認し特徴付けを行う。即ち、目標分子自身でなく質量標識の検出が、
試料中の目標分子の存在を示す。
【０３０１】 ここに開示されるＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析の方法のいずれも、質量標識の検
出に用いることができる。例えば、質量標識はここに開示するマトリックスのい
ずれと混合してＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析にかけても良い。特定の様態では、質
量標識はＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析実施に先だってグリセリンマトリックスと混
合する。
【０３０２】 質量標識は遊離標識化合物の中に含まれ、また遊離標識化合物は更に１個以上
の反応性基及び１個以上の遊離性基を含む。反応性基は目標分子と反応する。質
量標識は可遊離性アタッチメントを介して反応性基に結合又は付着させる。典型
的には、質量標識は質量分析に先だって反応性基の全部又は一部から遊離させる
。この可遊離性アタッチメントは典型的には遊離性基の使用により生じるが、こ
れは質量標識と反応性基間の結合でも良く、又は反応性基の一部又は全てより成
っていても良く、又は反応性基内に含まれていても良い。
【０３０３】 典型的な目標分子は、ポリヌクレオチド、遺伝子配列、遺伝子又はタンパク配
列内の突然変異、毒素、金属、受容体、抗原、リガンド、ポリペプチド、炭水化
物及び脂質を含む。
【０３０４】 (質量標識) 質量標識(標識とも呼称される)は質量分析で検出可能などのような化合物でも
良く、合成ポリマー及びバイオポリマーを含む。合成ポリマーはポリエチレング
リコール、ポリビニルフェノール、ポリプロピレングリコール、ポリメチルメタ
クリレート、及びそれらの誘導体を含む。合成ポリマーは典型的にモノマー単位
を含み、それらはエチレングリコール、ビニルフェノール、プロピレングリコー
ル、メチルメタクリレート、及びそれらの誘導体及び組みあわせを含む。バイオ
ポリマーは、アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模擬体、核酸、核酸模擬体及
び類似体、糖及びそれらの組み合わせのようなモノマー単位より成るポリマーを
含む。特定の様態では、質量標識は約５００ダルトンを超える分子量を有する。
ある様態では質量標識は不揮発性 (非揮発性のものを含む)であり、また他の様
態では揮発性質量標識が使用される。他の質量標識としては、ヘムグループ、色
素、有機金属化合物、ステロイド、フラーレン、レチノイド、カロテノイド及び
多芳香環炭化水素が含まれる。
【０３０５】 (反応性基) 反応性基とは、検出対照の分子と反応できる基をいう。例えば、反応性基は特
異的分子認識可能な生体分子でも良い。特異的分子認識可能な生体分子は典型的
には唯一の分子又は分子のクラスと特異的相互作用可能などのような分子でも良
く、ペプチド、ポリペプチド、タンパク及びポリ核酸を含むが、これらに限定さ
れるものではない。ポリペプチドは２個以上の天然若しくは非天然アミノ酸モノ
マーより成る下記のものを含む。即ち、天然タンパク、遺伝子産物、タンパク複
合体、変異型又は多形性ポリペプチド、翻訳後修飾を受けたタンパク；化学合成
、in vitro翻訳、ベクターシャフリングによる迅速進化システム、ランダム又は
定方向突然変異及びペプチド配列のランダム化による細胞系発現システムの産物
、を含む組換え遺伝子産物；オリゴペプチド、抗体、酵素、受容体、調節タンパ
ク、核酸結合タンパク、ホルモン、又はファージ若しくは細菌によるディスプレ
ー法のようなディスプレー法によるタンパク生成物を含む。
【０３０６】 核酸は標準の、即ち天然の核酸、及びしばしば核酸ミミックス若しくはミメテ
ィックス(模擬体)として知られる修飾／非天然核酸を含む。即ち、ヌクレオチド
とは、天然ヌクレオチド及び修飾／非天然ヌクレオチドのことをいい、ヌクレオ
シド三、二、及び一リン酸並びにポリ核酸又はオリゴヌクレオチド内の一リン酸
モノマーを含む。ヌクレオチドはリボ、２’−デオキシ、２’、３’−デオキシ
ヌクレオチドでも良く、また技術上周知のその他様々なヌクレオチド模擬体でも
良い。模擬体は、３’−Ｏ−メチル化塩基、ハロゲン化塩基又は糖置換体のよう
な鎖終結ヌクレオチド、非糖アルキル環構造を含む代替糖構造、イノシン、デア
ザ修飾、キー及びプサイリンカー修飾、質量標識修飾を含む代替塩基、ホスホロ
チオアート、メチルホスホネート、ボラノホスフェート、アミド、エステル、エ
ーテルを含むリン酸ジエステル修飾又は置換、及び光切断性ニトロフェニル部位
のような切断可能部位を含むヌクレオチド間結合の基本的又は完全置換などを含
む。これらの修飾は技術上周知であり、Saenger (1983) Principles of Nucleic
Acid Structure, シュプリンガー−フェアラーク社(ＮＹ)に記載の基本原理に
基づく。
【０３０７】 ポリ核酸は１個以上の核酸を含む分子を含む。ポリ核酸はヌクレオチドモノマ
ーの２個それ以上の長さのものを含み、核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴ、ポ
リヌクレオチド、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、メッセージＤ
ＮＡ、コピーＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ＲＮＡ、
メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、触媒性ＲＮＡ、クロー
ン、プラスミド、Ｍ１３、Ｐ１、コスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、
哺乳動物人工染色体、増幅核酸、アンプリコン、ＰＣＲ産物及びその他の型の増
幅核酸を包括する。
【０３０８】 反応性基は相補的核酸配列にハイブリッド化した後に１個以上のヌクレオチド
又はオリゴヌクレオチドを付加したオリゴヌクレオチドであっても良い。ハイブ
リッド形成後に付加されたヌクレオチドは例えば、鎖終結ジデオキシヌクレオチ
ドのように鎖終結修飾を受けていても良い。付加されたヌクレオチドは固体坦体
に固定化され得る官能基、例えばビオチン又はジゴキシゲニンを有していても良
い。一般的に、この官能基又は結合基若しくは部位は標識化合物を固体坦体に付
着させ又は結合させることができる。結合部位は、付加されたヌクレオチド又は
オリゴヌクレオチドに中間連結基を介して直接付着させてても良く、又はそれ自
身固体坦体に結合した中間オリゴヌクレオチドとの特異的ハイブリッド形成を介
して付着させても良い。結合部位は、固体坦体に共有結合する官能基、高親和性
非共有結合の相互作用(ビオチンとストレプトアビジンの間のような)を介して固
体坦体に付着するリガンド、それ自身固体坦体に付着する中間オリゴヌクレオチ
ドに相補的な一連の塩基、及び本文書並びに全文を本文書に参考として添付した
ＰＣＴ申請公開第ＷＯ９６／３７６３０号、第ＷＯ９６／２９４３１号、第ＷＯ
９８／２００１９号、第ＷＯ９４／１６１０１号、第ＷＯ９８／２０１６６号に
記載の技術上周知のその他の方法を含む。
【０３０９】 反応性基はまた、エキソヌクレアーゼのようなヌクレアーゼによるオリゴヌク
レオチド消化をブロックするのに役立つヌクレアーゼブロッキング部位を含んで
いても良い。典型的なヌクレアーゼブロッキング部位は、ホスホロチオアート、
アルキルシリルジエステル、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、及びペ
プチド核酸を含む。
【０３１０】 (可遊離性アッタチメント) 質量標識は可遊離性アタッチメントを介して反応性基に結合又は付着させる。
遊離性基はこのような遊離可能なアタッチメントを提供する反応活性な基ならど
のようなものでもよい。遊離性基は即ち化学的に切断可能な結合若しくは不安定
な化学結合であって良い。このような結合は、典型的には酸、塩基、酸化、還元
、熱、光、又は金属イオンで触媒された置換又は脱離反応など当業者周知の方法
によって切断されても良い。例えば、化学的切断可能結合は修飾塩基、修飾糖、
ジスルフィド結合、リン酸バックボーンに挿入された化学的に切断可能な基、又
は化学的に切断可能なリンカーであっても良い。これらの結合の若干例はＰＣＴ
申請公開第ＷＯ９６／３７６３０号に記載されている。リン酸バックボーンに挿
入され得る化学的に切断可能な基は当業者周知であり、これらはジアルコキシシ
ラン、３’−(Ｓ)−ホスホロチオアート、５’−(Ｓ)−ホスホロチオアート、３
’−(Ｎ)−ホスホロアミデート、５’−(Ｎ)−ホスホロアミデートを含む。化学
的に切断可能なリンカーはリボースのような修飾糖であっても良く、また結合は
ジスルフィド結合であっても良い。
【０３１１】 可遊離性アタッチメントが反応性基の中に含まれている場合、可遊離性アタッ
チメントの遊離は選択的事象によって活性化しても良い。例えば、選択的遊離は
二本鎖又は一本鎖ＤＮＡに特異的なエキソヌクレアーゼのような酵素によって仲
介することができる。一般的には、可遊離性アタッチメントが反応性基の中に含
まれている場合には、反応性基はその構造の中に質量標識を標識成分から切す特
定の遊離性基を含んでいる。
【０３１２】 遊離性基は酵素で切断可能な基又は結合を含む。酵素的に切断可能な遊離性基
はリン酸ジエステル又はアミド結合、並びに制限エンドヌクレアーゼ認識部位を
含む。遊離性基を切断するヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼ及び制限エンドヌ
クレアーゼを含む。典型的なエキソヌクレアーゼは各々二本鎖及び一本鎖ポリ核
酸特異的なエキソヌクレアーゼの両者を含む。加えて、制限エンドヌクレアーゼ
はＩＩＳ型及びＩＩ型エンドヌクレアーゼを含む。遊離性基はエンドプロテイナ
ーゼを含むプロテアーゼで切断されるものであっても良い。
【０３１３】 更に、反応性基はヌクレオシド三リン酸を含んでいても良く、又は質量標識ヌ
クレオシド三リン酸を用いて合成しても良い。標識プローブは少なくとも２個の
唯一の質量標識を含んでいても良い。
【０３１４】 (例示的遊離性標識化合物) 例示的遊離性標識化合物は、反応性基が制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有
する二本鎖オリゴヌクレオチドであり、可遊離性アタッチメントが制限エンドヌ
クレアーゼにより切断可能なリン酸ジエステル結合を含み、質量標識が質量分析
で検出可能な標識であるものである。反応性基は更に修飾ヌクレオチドを含んで
も良く、質量標識は反応性基の一部を含んでも良い。二本鎖オリゴヌクレオチド
は二個の相補的鎖が互いに水素結合の相互作用でハイブリッド形成したもののみ
でなく、鎖の一部が一本鎖で一部が二本鎖であるような一本鎖ヌクレオチドをも
含む。例えば、反応性基の一部又は全部が自己相補的なオリゴヌクレオチドヘア
ピン構造をしていて、反応性基の一部が反応性基の他の一部と相補的であるもの
をも含む。この場合、特定の条件下で反応性基のこれら２つの部分の間で二重ラ
センが生成する。全ての反応性基が二本鎖である必要はない。例えば一本鎖領域
を含む遊離性標識化合物も反応性基に含まれる。
【０３１５】 更なる例示的遊離性標識化合物は、反応性基が二本鎖オリゴヌクレオチドであ
り、可遊離性アタッチメントが化学的に切断可能な遊離性基であり、質量標識が
質量分析で検出可能であるものである。この場合には、可遊離性アタッチメント
は典型的には反応性基内に位置している。化学的に切断可能な遊離性基の切断は
この場合遊離性基に存在する二本鎖オリゴヌクレオチドによって阻害されている
。３’−(Ｓ)−ホスホロチオアート、５’−(Ｓ)−ホスホロチオアート、３’−
(Ｎ)−ホスホロアミデート、５’−(Ｎ)−ホスホロアミデート又はリボースのよ
うな化学的に切断可能な遊離性基をこれらの様態で用いても良い。反応性基の一
部のみを目標核酸とハイブリッド形成させることにより、反応性基の一部を遊離
性基の部位において一本鎖にしても良い。
【０３１６】 遊離性標識の一組(例えば２個以上の一群の遊離性標識化合物)は目標核酸の検
出に使うこともできる。この場合、目標核酸は典型的には複数の遊離性標識を含
む。各遊離性標識化合物は反応性基、可遊離性アタッチメント及び質量標識を含
む。反応性基は可変性領域及び不変性領域を含むオリゴヌレオチドであっても良
く、可遊離性アタッチメントは遊離性基であり、質量標識は質量分析で検出可能
な標識である。不変性及び可変性領域は目標核酸と反応する。一般的に、組の各
遊離性標識化合物はそのグループの全ての他のメンバーとは異なるものである。
即ち、各メンバーはそれぞれ反応性基、遊離性基及び質量標識の異なる組み合わ
せを含む。典型的には、組の少なくとも１個のメンバーの質量標識により可変領
域内の特異的配列が特定される。ある場合には、組の各メンバーの質量標識は可
変領域内のそれぞれ異なる配列を個々に確認する。他の場合には、２個以上の遊
離性標識化合物の質量標識の組み合わせが可変領域内の各々異なる配列を確認す
る。
【０３１７】 (質量標識プローブの作成) 質量標識プローブの作成法は、ヌクレオシド又はアミノ酸モノマーと少なくと
も１個の質量標識モノマーとを、重合が起きる条件下で結合させる工程を含む。
重合は例えば酵素又は化学合成により仲介しても良い。質量標識プローブ作成の
ための合成法は基本的に標準的なペプチド及びＤＮＡ合成法である。
【０３１８】 (質量標識プローブを用いた目標分子検出法) 一般的に、目標分子を検出する一つの方法は、多数のプローブを得ることを含
むが、各々のプローブは本文書及びＰＣＴ申請公開第ＷＯ９８／２６０９５号に
記載のように反応性基、遊離性基及び質量標識を含む。典型的には、多数のプロ
ーブ中の各々は唯一の質量標識を有する。次に、目標分子を含む、又は含まない
試料を多数のプローブと、プローブ：目標複合体の形成を起させる適切な条件下
で接触させる。質量標識がプローブから遊離し、その質量標識の質量はＩＲ−Ｍ
ＡＬＤＩ質量分析により測定される。好ましい様態では、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量
分析を行うに当たって質量標識を液体マトリックスと混合する。特に好ましい液
体マトリックスはグリセリンである。典型的には、この質量は特定の目標分子を
示す。この方法を用いて、質量標識の唯一の組み合わせによって目標分子を確認
することができる。
【０３１９】 目標分子を検出するもう一つの方法では、当業者周知の何れかの方法を用いて
目標分子を増幅し、増殖された目標分子を生成させる。増幅された目標分子を次
いで本文書及びＰＣＴ申請公開第ＷＯ９８／２６０９５に記載されているような
プローブとハイブリッド形成させて、プローブ：目標分子複合体を生成させる。
増幅目標分子複合体上の質量標識を次いで遊離させ、質量標識の質量をＩＲ−Ｍ
ＡＬＤＩ質量分析で測定する。好ましい様態では、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析を
行うに当たって質量標識を液体マトリックスと混合する。特に好ましい液体マト
リックスはグリセリンである。増幅された標識分子は固体坦体上に固定化しても
良く、またプローブ：増幅目標分子複合体の一部でないプローブは全て洗浄によ
って除去する。
【０３２０】 多重化法もまた提供され、そこにおいては標識分子が多数のプローブと接触す
る。プローブの各反応性基は唯一の質量標識と関連づけられるか、又は唯一の１
組の質量標識と関連づけられる。即ち、目標分子は特定の質量標識又は特定の１
組の質量標識の質量スペクトル検出により検出される。質量スペクトル検出はＩ
Ｒ−ＭＡＬＤＩ質量分析によって遂行される。好ましい様態では、ＩＲ−ＭＡＬ
ＤＩ質量分析の前に１個又は複数の標識を液体マトリックスと混合する。特に好
ましい液体マトリックスはグリセリンである。１組の質量標識を用いた場合には
、その１組の質量標識を同一のプローブに付加しても良い。又は、組の各メンバ
ーを異なるプローブに付加しても良い。
【０３２１】 標識分子を検出するもう一つの方法は以下の工程を含む。即ち、(ａ)反応性基
、遊離性基及び非揮発性質量標識を含むプローブを得て、(ｂ)目標分子をプロー
ブと接触させてプローブ：目標分子複合体を生成させ、(ｃ)プローブ：目標分子
複合体から質量標識を選択的に遊離させて遊離質量標識を生成させ、(ｄ)遊離し
た質量標識の質量をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で測定する。更なる方法では工程
(ｄ)の前に、質量標識を液体マトリックス、好ましくはグリセリンと混合する。
【０３２２】 目標分子を検出するもう一つの法は以下の工程を含む。即ち、(ａ)反応性基、
遊離性基及び質量標識を含むプローブを得て、(ｂ)目標分子をプローブと接触さ
せてプローブ：目標分子複合体を生成させ、(ｃ)プローブ：目標分子複合体から
質量標識を遊離させて遊離質量標識を生成させ、(ｄ)遊離質量標識の質量をＩＲ
−ＭＡＬＤＩ質量分析で測定する。更なる方法では工程(ｄ)の前に、質量標識を
液体マトリックス、好ましくはグリセリンと混合する。
【０３２３】 標識分子の検出を多重化する方法は以下の工程を含む。即ち、(ａ)各々反応性
基、遊離性基及び質量標識を含む多数のプローブを得て、(ｂ)目標分子を多数の
プローブと接触させてプローブ：目標分子複合体を生成させ、(ｃ)プローブ：目
標分子複合体に属する任意のプローブから質量標識を遊離させて遊離質量標識を
生成させ、(ｄ)遊離質量標識の質量をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で測定する。こ
の場合、特定の標識分子を認識する各反応性基は質量標識の唯一の組と関連づけ
られる。多数の標識分子はまた、多数のプローブで検出することもできる。更な
る方法では工程(ｄ)の前に、質量標識を液体マトリックス、好ましくはグリセリ
ンと混合する。
【０３２４】 遺伝子発現をモニターする方法は以下の工程を含む。即ち、(ａ)各々反応性基
、遊離性基及び質量標識を含む多数のプローブを得て、(ｂ)目標核酸を多数のプ
ローブと接触させてプローブ：目標核酸複合体を生成させ、(ｃ)プローブ：目標
核酸複合体に属する任意のプローブから質量標識を選択的に遊離させて遊離質量
標識を生成させ、(ｄ)遊離質量標識の質量をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で測定す
る。更なる方法では工程(ｄ)の前に、質量標識を液体マトリックス、好ましくは
グリセリンと混合する。 目標核酸は工程(ａ)の前に増幅しても良い。
【０３２５】 目標分子を検出する更なる方法は以下の工程を含む。即ち、(ａ)１つ以上の目
標核酸を増幅して増幅核酸産物を生成させ；(ｂ)反応性基、遊離性基及び質量標
識を含む１つ以上の分子を、増幅過程の間に増幅核酸産物の中に取り込ませ；(
ｃ)増幅核酸産物中に取り込まれた質量標識を選択的に遊離させて遊離質量標識
を生成させ；(ｄ)遊離質量標識の質量をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で測定する。
更なる様態では工程(ｄ)の前に、質量標識を液体マトリックス、好ましくはグリ
セリンと混合する。
【０３２６】 目標分子を検出するもう一つの法は以下の工程を含む。即ち、(ａ)反応性基、
遊離性基及び質量標識より成るプローブを得て、(ｂ)プローブを目標核酸分子と
接触させてプローブ：核酸分子複合体を生成させ、(ｃ)プローブにヌクレオチド
又はオリゴヌクレオチドを付加してプローブ：核酸分子複合体を質量修飾するこ
とにより質量修飾質量標識を生成させ、(ｄ)質量修飾標識を遊離させ、(ｅ)質量
修飾標識の質量をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析で測定する。更なる様態では工程(
ｅ)の前に、質量標識を液体マトリックス、好ましくはグリセリンと混合する。
【０３２７】 (質量標識分子を用いる単一ヌクレオチド多形性(ＳＮＰ)検出法) 質量標識分子を用いる方法はまた、単一ヌクレオチド多形性(ＳＮＰ)の検出に
も用いることができる。多形性部位に直接隣接する部位にハイブリッド形成する
質量標識プローブを作成しても良く、次いでポリメラーゼを用いて多形性の部位
に１個の塩基を付加しても良い。例えば、単一プローブを用いる場合、それぞれ
唯一の質量標識を付加した４種の鎖終結三リン酸の混合物を添加しても良い。均
一なＳＮＰならば、４種の鎖終結ヌクレオチドの１種のみがプローブの末端に付
加して、ヌクレオチドに結合している質量標識をプローブにカップルする。プロ
ーブから質量標識を遊離させる手段は以下の方法を含むが、これに限定されるわ
けではない。即ち、化学的に不安定な官能基を用いて質量標識を終結ヌクレオチ
ドに結合させる方法、伸長プライマーのバックボーン又は鎖終結ヌクレオチド内
に化学的に不安定な官能基を入れておく方法、又は酵素を使って一つ以上のプラ
イマー伸長産物内のリン酸ジエステル又はグリコシド結合を切断する方法、であ
る。質量標識を遊離する部位が伸長産物のバックボーン内にある場合には、遊離
した質量標識は末端ヌクレオチド又はそれが若干の質量修飾を受けた物を含むか
もしれない。遊離部位がプライマー伸長産物内にあるもう一つの型では、各塩基
が唯一の質量を有しているため、未修飾の鎖終結ヌクレオチド自身が質量標識の
全部又は一部として機能することができる。質量標識がプローブから化学的に遊
離される場合には、取り込まれなかったヌクレオチドを先ず全て取り除くか洗浄
して除去し、それらが質量分析で検出されないようにしておく。
【０３２８】 ハイブリッド形成した質量標識鎖終結三リン酸の分離は質量の相違に基づいて
行うことができるが、これは目標とハイブリッド形成したプローブにハイブリッ
ドした標識三リン酸は、そうでない標識三リン酸よりも分子量が大きくなるから
である。プローブ又は目標はまた、ビオチン／ストレプトアビジン又は化学カッ
プリング又はＵＶクロスリンキングを含む種々の方法を介して固体坦体に付加す
ることができる。ヌクレアーゼもまた質量標識プローブを消化するのに用いるこ
とができる。ヌクレアーゼを用いれば、質量標識鎖終結ヌクレオチドは一リン酸
として遊離する。取り込まれなかった質量標識鎖終結ヌクレオチドは三リン酸の
ままで残っているので、一リン酸への質量シフトにより、どのヌクレオチドが取
り込まれたかが判る。この方法は、取り込まれなかったヌクレオチドを分析の前
に除去する手間を省いてくれる。
【０３２９】 多数のプローブを多重化することにより、多数のＳＮＰを同時に検出すること
ができる。質量標識が存在すれば、プールを形成するプローブの各々に唯一の標
識を付けることになる。ビオチニル化鎖終結ヌクレオチドを点多形性の部位へ付
加して、どのプローブが特定のビオチニル化鎖終結ヌクレオチドを取り込み、ど
のプローブがそうでないかに応じて、プローブ集団を分けることができる。例え
ば、質量標識プローブの集団と目標との反応は４種の反応に分けることができる
。第１の反応はビオチニル化ジデオキシアデノシン三リン酸のみを含み、第２の
反応はビオチニル化ジデオキシシチジン三リン酸のみを含み、第３の反応はビオ
チニル化ジデオキシグアニジン三リン酸のみを含み、第４の反応はビオチニル化
ジデオキチミジン三リン酸のみを含む。適切なヌクレオチド存在下に単一塩基伸
長ポリメラーゼ依存性反応を行った後、伸長産物を捕獲し、洗浄し、質量標識を
遊離して、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析により質量スペクトル分析を行う。第１の
反応ではＡを取り込んだ質量標識プローブのみが検出される。第２の反応ではＣ
を取り込んだ質量標識プローブのみが検出される。第３及び第４の反応ではそれ
ぞれＧ及びＴを取り込んだ質量標識プローブが検出される。
【０３３０】 質量標識内の質量変化のもう一つの例は、質量標識がプローブの３’末端に存
在する場合である。ポリメラーゼ依存性塩基伸長に続いて、質量標識を遊離させ
るが、付加された鎖終結塩基及び端から２番目の塩基もこれと共に遊離する。質
量標識の場所及び遊離部位は他の塩基でも良いが、好ましくは３’末端近辺が良
い。いずれの場合にも、質量標識は好ましくは遊離性基と３’末端の間に位置さ
せるべきである。他の様態では、実質的に短鎖で終結する配列生成反応となる反
応を行わせるのが好ましく、ここではジデオキシヌクレオチドに加えて若干量の
正常デオキシヌクレオチドを添加する。プライマーの伸長は入れ子になった１組
の産物を生成するが、その各々が鋳型鎖上の相補的な塩基に対応するジデオキシ
ヌクレオチドにより終結させられた鎖である。好ましい形では、質量標識はプラ
イマー内で化学的遊離性基を含む３’末端近辺に位置している。このような方法
は、短い配列の解読及び１個以上のＳＮＰの検出のための様態を提供する。全て
のＳＮＰ検出法は、生成するであろう異なる産物間の質量差を増大させるために
、異なるヌクレオチドを質量修飾した形のものの使用を含む。
【０３３１】 ＳＮＰはまた、マッチ又はミスマッチしたオリゴヌクレオチドプローブ存在下
に差別的エキソヌクレアーゼ反応を行うことによっても検出することができる。
この手法の一つの例は、可遊離性質量標識の使用をニックトランスレーションＰ
ＣＲと組み合わせることである。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはそのポリメラー
ゼ活性に加えて、５’→３’エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ活性を
有している。もし完全に相補的なオリゴヌクレオチドプローブをポリメラーゼ反
応、例えば核酸の増幅においてその経路上に置くと、ポリメラーゼはそのエキソ
ヌクレアーゼ活性によりプローブの５’末端を攻撃し、プローブ分子を消化して
小さくし、ハイブリッド形成不能に到らせる。しかし、もしオリゴヌクレオチド
が５’末端近辺で完全には相補的でなければ、例えばミスマッチが近くに存在す
れば、プローブの末端がほぐれ、ポリメラーゼのエキソヌクレーアーゼ活性では
なくエンドヌクレアーゼ活性による攻撃を受ける。ヌクレアーゼで切断された、
好ましくは質量標識を含む産物は、ミスマッチが存在するか否か、及びこのミス
マッチに対応してヌクレアーゼがどのように切断したかに応じて異なる最終質量
を有する。エンドヌクレアーゼ活性の開始はハイブリッド形成プローブ内のミス
マッチの存在及び位置によって影響され得ることが示されている。質量標識を、
予想されるミスマッチ部位に対してオリゴヌクレオチドの内側に選択的に配置す
ることにより、実際にミスマッチが存在するか否かに応じて異なるシグナルを得
ることができる。このアッセイは、複数のＳＮＰを同時に検出することができる
と期待される。特定のＳＮＰを標的とする各々のプローブは、多形性部位に相補
的な可能性のある４種の塩基のうちの１つを含む。質量標識は、もしプローブが
鋳型に対して完全にマッチしていれば、Ｔａｑポリメラーゼのエキソヌクレアー
ゼ活性により、主として単一ヌクレオチドを含む形で遊離するように配置される
。その他のプローブはミスマッチを生じ、ポリメラーゼのエンドヌクレアーゼが
プローブの切断を開始し、これは１個以上のヌクレオチドを切断する。質量標識
切断産物の質量のシフトから、ミスマッチが起こったか否かが判断できる。
【０３３２】 (質量標識プローブを用いた短い配列の確認法) 質量標識プローブは短い配列の確認にも用いることができる。特に、ハイブリ
ッド形成及び酵素(ポリメラーゼ又はリガーゼ)による伸長の組み合わせを標識プ
ローブと共に用いて、“プライミング”領域即ちプライマーが付着した領域に隣
接した短い配列の並びを確認することができる。これを行ういくつかの方法があ
る。その方法の一つでは、２個のドメイン、一つは典型的には１個又は数個の配
列のみを有する固定配列認識ドメイン、もう一つは全ての可能な配列の組(又は
そのあるサブセット)より成るランダム化ドメイン、を有するプローブの混合物
を合成する。プローブの固定配列は、特定の目標核酸内の単一部位をターゲット
としてプローブをハイブリッド形成させるのに用いられる。この目標部位は典型
的には不変部位である。この不変配列に隣接する配列は可変であり、目標によっ
て配列の全組み合わせのいずれの配列をも持ちうる。これら全ての可能性を調べ
るためには、この第２ドメイン配列の全ての可能な組み合わせを含むプローブを
合成する必要がある。例えば、もし第２のプローブ領域が４塩基の長さであれば
、２５６個の異なるプローブを合成する必要がある。これらのプローブは個々に
、それぞれ唯一の質量標識の組み合わせを可遊離性質量署名情報として持つプロ
ーブとして合成することもできる。又は、プローブはコンビナトリアル合成法を
用いて唯一の質量署名情報と共に合成することもできる。
【０３３３】 識別レベルを高め、短い配列の解読できる長さを伸ばすために、ポリメラーゼ
又はリガーゼのような酵素を用いて、付着したプローブの可変領域の末端に１個
のヌクレオチド又はポリヌクレオチドを付加することができるが、付加したヌク
レオチド又はオリゴヌクレオチド上に、これらの付加配列を確認できる質量標識
を含むようにしても良い。何れかの酵素によって塩基を付加するためには、可変
領域が酵素の作用を可能とする完全なハイブリッドになっているという厳密性が
要求される。ポリメラーゼの場合には、付加はプローブの３’側である必要があ
り、一方リガーゼの作用は３’又は５’いずれでも起こる。
【０３３４】 (質量標識プローブを用いたミスマッチ検出法) ミスマッチを検出する一つの方法では、増幅核酸産物はミスマッチを含む二本
鎖分子を含み、また鎖の３’末端にエキソヌクレアーゼをブロックする機能を含
む。典型的には、この方法は更に二本鎖の少なくとも１本のミスマッチ部位にお
ける切断と、質量標識の選択的遊離を含む。質量標識の選択的遊離は典型的には
エキソヌクレアーゼＩＩＩのようなエキソヌクレアーゼによって切断鎖を３’→
５’の方向に消化することにより遂行される。選択的遊離では、質量標識はプロ
ーブ：標識分子複合体に属するプローブから遊離され、このような複合体に属し
ていないプローブからは質量標識を遊離させないが、これら２つの型のプローブ
を物理的に分離する必要はない。ミスマッチは、ｍｕｔＨＬＳ、Ｔ４エンドヌク
レアーゼＶＩＩ、ｍｕｔＹ ＤＮＡグリコシラーゼ、チミジンミスマッチＤＮＡ
グリコシラーゼ又はエンドヌクレアーゼＶのような酵素によって切断することが
できる。ミスマッチはまた、ＯｓＯ4、ＨＯＮＯ2、ＫＭｎＯ4のような化学物質
によっても切断することができる。
【０３３５】 (ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析を用いたＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復対立遺伝子の
分析) (１．ＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復対立遺伝子の分析) ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析はＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列反復対立遺伝子の分
析に用いることができ、また一つ以上のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列反復遺伝子
座からの一つ以上のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列反復領域の確認を多重化するの
に用いることができる。上述したように、これらの分析にＵＶ質量分析を用いる
方法は技術上周知である。ここではこれらの方法をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析用
に改変した。
【０３３６】 一つの様態では、目標核酸中のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列遺伝子座にあるＤ
ＮＡの縦列ヌクレオチド反復対立遺伝子のＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析による分析
法を提供する。この方法は、遺伝子座のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列に隣接する
配列に相補的な１個以上のプライマーを用いて限定されたサイズ幅の核酸伸長産
物を得る工程；及び核酸伸長産物の質量を液体マトリックスを用いてＩＲ−ＭＡ
ＬＤＩ質量分析によって測定する工程を含む。
【０３３７】 一つの様態では、１個以上のプライマーの３’末端はＤＮＡ縦列ヌクレオチド
配列領域に直接隣接する。他の様態では、１個以上のプライマーは１個又は複数
のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列遺伝子座の１、２又は３個の縦列繰返し体に相補
的な配列を含む。もう一つの様態では、少なくとも１個のプライマーが切断部位
を含む。切断部位は、好ましくは制限エンドヌクレアーゼの認識部位、エキソヌ
クレアーゼブロッキング部位、又は化学的切断可能部位を含む。もう一つの様態
では、少なくとも１個のプライマーが固体坦体に付着させることができる。付着
させる手段はビオチン又はジゴキシゲニンを含む。
【０３３８】 もう一つの様態では、少なくとも１個のプライマーの伸長はジデオキシヌクレ
オチド三リン酸のような鎖終結試薬を用いて終結させる。複数の目標核酸を伸長
して、複数の核酸伸長産物を生成することができ、これにより複数の核酸を分析
することができる。例えば一つの様態では、複数のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列
遺伝子座の複数のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列対立遺伝子の質量を同時に測定で
きる。もう一つの様態では、ＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列対立遺伝子は重なり合
った質量領域を有する。もう一つの様態では、核酸伸長産物は交互に配置された
質量スペクトルのピークを有する。もう一つの好ましい様態では、少なくとも１
個の核酸伸長産物が質量修飾ヌクレオチドを含む。
【０３３９】 更にもう一つの好ましい様態では、少なくとも１個の核酸伸長産物の長さが切
断部位で切断を受けて短くなる。更に好ましくは、切断部位はエンドヌクレアー
ゼブロッキング部位又は化学的切断可能部位より成る。
【０３４０】 (２. 複数のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列遺伝子座由来の複数のＤＮＡ縦列ヌク
レオチド配列領域の確認の多重化) 複数のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列遺伝子座由来の複数のＤＮＡ縦列ヌクレオ
チド配列領域の確認を多重化する方法を提供する。これらの方法は、ＤＮＡ縦列
ヌクレオチド配列領域に隣接する配列に相補的な複数のプライマーを伸長させて
複数の核酸伸長産物を得る工程；及びｂ)複数の核酸伸長産物の質量を液体マト
リックスを用いてＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析によって同時に測定する工程を含み
、ここで核酸伸長産物は重なり合った対立遺伝子質量領域を有する。
【０３４１】 一つの様態では、１個以上のプライマーの３’末端がＤＮＡ縦列ヌクレオチド
配列領域に直接隣接する。他の様態では、１個以上のプライマーは１個又は複数
のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列遺伝子座の１、２又は３個の縦列繰返し体に相補
的な配列を含む。もう一つの様態では、少なくとも１個のプライマーの伸長をジ
デオキシヌクレオチド三リン酸のような鎖終結試薬を用いて終結させる。
【０３４２】 更にもう一つの様態では、少なくとも１個の目標核酸伸長産物が質量修飾グル
ープを有する。より好ましくは、質量修飾グループは質量修飾ヌクレオチドを含
む。またより好ましくは、質量修飾グループは非標準的デオキシリボヌクレオチ
ドより成る。更にもう一つの様態では、切断可能部位は制限エンドヌクレオチダ
ーゼ認識部位、エキソヌクレアーゼブロッキング部位、又は化学切断可能部位を
含む。更にもう一つの様態では、質量修飾グループは核酸伸長産物の伸長中又は
伸長後に取り込まれる。
【０３４３】 もう一つの様態では、複数のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列遺伝子座由来の複数
のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列領域のＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析による確認を多
重化する方法を提供する。この方法は、ＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列領域に隣接
する配列に相補的な複数のプライマーによって複数の核酸増幅産物を得る工程；
及び重なり合った対立遺伝子質量範囲を有する複数個の核酸増幅産物を液体マト
リックスを用いてＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析により同時に測定する工程を含む。
【０３４４】 このような様態の一つでは、１個以上のプライマーの３’末端がＤＮＡ縦列ヌ
クレオチド配列領域に直接隣接する。もう一つの様態では、１個以上のプライマ
ーが１個又は複数のＤＮＡ縦列ヌクレオチド配列遺伝子座の１、２、又は３個の
縦列繰返し体に相補的な配列を含む。
【０３４５】 更にもう一つの様態では、少なくとも１個の核酸増幅産物が質量修飾グループ
を含むが、これは好ましくは非標準デオキシリボヌクレオチドのような質量修飾
ヌクレオチドを含む。質量修飾グループは増幅前、増幅中、又は増幅後に取り込
ませることができる。更にもう一つの様態では、切断可能部位は制限エンドヌク
レアーゼの認識部位、エキソヌクレアーゼブロッキング部位、又は化学切断可能
部位を含む。
【０３４６】 (３. ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析をもちいた目標核酸中の突然変異検出) ここに記した通り、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析は目標核酸中の突然変異の検出
に用いることができる。一つの様態では、目標核酸の突然変異を検出する方法を
提供する。この方法は、目標核酸から１組のランダムでない長さの断片（ＮＬＦ
)を１本鎖の形で得る方法を含み、ここでこの組は目標核酸の正又は負の鎖のい
ずれか一方に由来するＮＬＦを含むか、又は目標核酸の正及び負の鎖由来の１本
鎖ＮＬＦのサブセットであり；また、次いで組のメンバーの質量を液体マトリッ
クスを用いてＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析により測定する方法を含む。
【０３４７】 一つの様態では、１本鎖ＮＬＦの組の少なくとも１つのメンバーが質量修飾ヌ
クレオチドで置換された１個以上のヌクレオチドを任意に有する。もう一つの様
態では、測定工程は、更により正確な質量を得るために内部自己較正物質の使用
を任意に含む。もう一つの様態では、目標核酸は１本鎖であり、これを得る工程
は１本鎖目標核酸を１個以上の断片化用プローブの組とハイブリッド形成を行わ
せて目標核酸／断片化用プローブ複合体を生成する工程を含む。複合体は少なく
とも１個の２本鎖領域を含み、また少なくとも１個の１本鎖領域を含む。次いで
目標核酸／断片化用プローブハイブリッド複合体を、少なくとも１個の１本鎖特
異的切断試薬を用いて全ての１本鎖領域で切断することによって目標核酸分子を
非ランダムに断片化して１組のＮＬＦを生成させる。好ましくは、断片化用プロ
ーブの組は、断片化用プローブの組と目標核酸とのハイブリッド形成により生成
した２本鎖領域の間に複数の１本鎖のギャップを残す。ハイブリッド形成工程は
更に、２組の１本鎖目標核酸を提供し、第１組の断片化用プローブを第１組の１
本鎖目標核酸に、第２組の断片化用プローブを第２組の１本鎖目標核酸にそれぞ
れ別々にハイブリッド形成させる工程を含み、ここで第２組の断片化用プローブ
のメンバーは、第１組の断片化用プローブのいずれのメンバーのいずれのヌクレ
オチド配列とも相補的でない目標核酸の領域に相補的な少なくとも１個の１本鎖
ヌクレオチド配列を含む。更に、第１組の断片化用プローブのメンバーは、第２
組の断片化用プローブのメンバーのヌクレオチド配列と重なり合うヌクレオチド
配列を含み得る。
【０３４８】 更にもう一つの様態では、１本鎖特異的切断試薬は１本鎖特異的エンドヌクレ
アーゼ又は１本鎖特異的化学切断試薬であり、後者は以下のものを含むがこれら
に限定されるわけではない。即ち、ヒドロキシルアミン、過酸化水素、四酸化オ
スミウム及び過マンガン酸カリウムである。
【０３４９】 目標核酸が１本鎖であるもう一つの様態では、非ランダム断片化工程後に更な
る工程が含まれる。この工程は１個以上のＮＬＦを、少なくとも１個のＮＬＦ及
び第１結合部位に相補的な１本鎖領域を含む１個以上の捕獲プローブにハイブリ
ッド形成させる工程、固体坦体に付着した第２結合部位に第１結合部位を結合さ
せる工程、ここで結合は１個以上の捕獲プローブとＮＬＦのハイブリッド形成前
又は形成後に起こり、次いで１組の１本鎖ＮＬＦを単離する工程を含む。
【０３５０】 目標核酸が１本鎖であり断片化用プローブが用いられるもう一つの様態では、
断片化用プローブは１本鎖部分と第１結合部位とを含む。この方法は更に、非ラ
ンダムな断片化工程の後に、固体坦体に付着した第２結合部位に第１結合部位を
結合させ、１組の１本鎖ＮＬＦを単離する工程を含む。
【０３５１】 もう一つの様態では、目的ＮＦＬの組を得る工程は更に、目標核酸を１種以上
の制限エンドヌクレオチダーゼで非ランダムに断片化して１組のＮＬＦを生成さ
せる工程；１組以上のＮＬＦ又はそのサブセットを１個以上のオリゴヌクレオチ
ドプローブとハイブリッド形成を行わせるが、ここでオリゴヌクレオチドプロー
ブの各々は１本鎖領域及び第１結合部位より成る核酸を含む工程、ハイブリッド
形成前又は形成後に、固体坦体に付着した第２結合部位に第１結合部位を結合さ
せる工程；及び１本鎖ＮＬＦの組又はそのサブセットを単離する工程を含む。好
ましくは、全てのオリゴヌクレオチドプローブが目的核酸の完全長の正又は負の
１本鎖のいずれか一つ及び第１結合部位を含み；又は第１結合部位と第２結合部
位の間の結合が共有結合であり；又は一つの結合部位が抗体、ホルモン、阻害剤
、補助因子部分、結合リガンド、及びポリヌクレオチド配列であり、他の結合部
位が抗体を認識しうる抗原、ホルモンを認識しうる受容体、阻害剤を認識しうる
酵素、補助因子部分を認識しうる補助因子酵素の結合部位、結合リガンドを認識
しうる基質、又は相補的ヌクレオチド配列の対応するメンバーであり；又は単離
工程が更に固体坦体に結合したＮＬＦの組を炭酸水素アンモニウム、炭酸水素ジ
メチルアンモニウム及び炭酸水素トリメチルアンモニウムのような揮発性塩より
成る組成物で洗浄する工程より成る。
【０３５２】 目標核酸が１本鎖であるもう一つの様態では、目的ＮＬＦの組を得る工程は更
に、１本鎖目標核酸を１個以上の制限部位プローブとハイブリッド形成を行わせ
て２本鎖領域を有するハイブリッド化目標核酸を生成させるが、ここでは制限部
位プローブが１本鎖目標核酸とハイブリッド形成しかつハイブリッドが少なくと
も１個の１本鎖領域を有している工程、及び２本鎖領域内の制限部位を切断する
１種以上の制限エンドヌクレアーゼを用いてハイブリッド化目標核酸を非ランダ
ムに断片化する工程を含む。非ランダム断片化工程の後に更なる工程を含めるこ
ともできる。この更なる工程は、ＮＬＦを少なくとも１個のＮＬＦに相補的な１
本鎖領域と第１結合部位とより成る１個以上の捕獲プローブとハイブリッド形成
させる工程、固体坦体に付着した第２結合部位に第１結合部位を結合させ、ここ
で結合がＮＬＦ１個以上の捕獲プローブへハイブリッド形成前又は形成後に起こ
る工程、及び１組の１本鎖ＮＬＦを単離する工程を含む。また、好ましくは、切
断された制限部位プローブは制限エンドヌクレアーゼ部位の半分に相補的な１本
鎖領域と第１結合部位を含み、更にこの方法は非ランダム断片化工程の後に、固
体坦体に付着した第２結合部位に第１結合部位を結合させる工程と、１組の１本
鎖ＮＬＦを単離する工程を含む。
【０３５３】 目標核酸が１本鎖であるもう一つの様態では、目的ＮＬＦの組を得る工程は更
に、１本鎖目標核酸が折り畳まれて分子内２次及び３次相互作用を有する３次元
構造を形成する条件下でこの方法を実施する工程；折り畳まれた目標核酸を少な
くとも１種類の構造特異的エンドヌクレアーゼで非ランダムに断片化して１組の
１本鎖ＮＬＦを生成させる工程、目標核酸又は１本鎖ＮＬＦの組のいずれかを修
飾し、１本鎖のＮＬＦの組のメンバーが１本鎖ヌクレオチド配列と少なくとも１
個の第１結合部位を含むようにする工程；固体坦体に付着した第２結合部位に第
１結合部位を結合させる工程；及び１本鎖ＮＬＦの組を単離する工程を含む。
【０３５４】 目標核酸が１本鎖であるもう一つの様態では、目的ＮＬＦの組を得る工程はま
た、１本鎖目標核酸が折り畳まれて分子内２次及び３次相互作用を有する３次元
構造を形成する条件下でこの方法を実施する工程；折り畳まれた目標核酸を少な
くとも１種類の構造特異的エンドヌクレアーゼで非ランダムに断片化して１組の
１本鎖ＮＬＦを生成させる工程、ＮＬＦの組の１つ以上を１本鎖ヌクレオチド配
列と第１結合部位を含む１個以上の捕獲プローブにハイブリッド形成させる工程
；ハイブリッド形成前又は形成後に、固体坦体に付着した第２結合部位に第１結
合部位を結合させる工程；及び１組のＮＬＦを単離する工程を含むことができる
。より好ましくは、単離された１本鎖ＮＬＦの組は、目標核酸の５’及び／又は
３’末端を有するいずれかのＮＬＦを含む。また好ましくは、構造特異的エンド
ヌクレアーゼはＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、ＲｕｖＣ、ＭｕｔＹ、又は熱安
定性ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼサブユニット由来のエンドヌ
クレアーゼ活性物である。
【０３５５】 目標核酸が１本鎖であるもう一つの様態では、目的ＮＬＦの組を得る工程は更
に、１本鎖目標核酸を１個以上の野生型プローブにハイブリッド形成させる工程
、及び目標核酸といずれかの野生型プローブとの間に生じるヌクレオチドミスマ
ッチ領域の全てを特異的に切断する１個以上の突然変異特異的切断試薬で目標核
酸を非ランダムに断片化する工程を含む。より好ましくは、非ランダム断片化工
程は更に、第１組の非ランダム長断片を１個以上の制限エンドヌクレアーゼで消
化する工程、又は第１組の非ランダム長断片を１個以上の１本鎖特異的切断試薬
で切断する工程を含む。また好ましくは、１本鎖ＮＬＦの組のメンバーは１本鎖
領域及び少なくとも１個の第１結合部位より成り；またこの方法は非ランダム断
片化工程の後に、固体坦体に付着した第２結合部位に第１結合部位を結合させる
工程、及び１組の１本鎖ＮＬＦを単離する工程を含む。更に、目的ＮＬＦの組を
得る工程は、ＮＬＦの組のメンバーを、１本鎖部分と少なくとも１個の第１結合
部位を含む１個以上の捕獲プローブにハイブリッド形成させる工程を含むことが
でき；またこの方法は固体坦体に付着した第２結合部位に第１結合部位を結合さ
せる工程、及び１組の１本鎖ＮＬＦを単離する工程を含む。目的ＮＬＦの組を得
る工程は更に、目標核酸の５’末端を有するＮＬＦのいずれかを含む１組の１本
鎖ＮＬＦを単離する工程を含むことができる。
【０３５６】 もう一つの様態では、目標核酸中の突然変異を検出する方法を提供する。この
方法は、好ましくは揮発性塩を含有する制限緩衝液中で、目標核酸を１個以上の
制限エンドヌクレアーゼによって非断片化して１組の２本鎖ＮＬＦを生成させ；
次いで２本鎖ＮＬＦの組のメンバーの質量を液体マトリックスを用いてＩＲ−Ｍ
ＡＬＤＩ質量分析により測定する工程を含む。
【０３５７】 更にもう一つの特定の様態では、目標核酸中の突然変異を検出する方法が提供
され、この方法は、目標核酸を１種以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて非ラ
ンダムに断片化して第１組の非ランダム長断片(ＮＬＦ)を生成させる工程；第１
セットのＮＬＦのメンバーと野生型プローブの組の相補的メンバーとの間に生じ
るぬヌクレオチドミスマッチの全ての領域で特異的に切断する１個以上の突然変
異特異的切断試薬を用いてＮＬＦの組の１つ以上のメンバーを非ランダムに断片
化させて第２組のＮＬＦを生成させる工程；及び第２組のＮＬＦのメンバーの質
量を液体マトリックスを用いてＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析により測定する工程を
含む。より好ましくは、野生型目標核酸を非ランダムに断片化することによって
得られる野生型断片化プローブの組は第１組のＮＬＦ作成に用いるのと同じ制限
エンドヌクレアーゼを用いて得られる。より好ましくは、野生型目標核酸を非ラ
ンダムに断片化して野生型断片化プローブを得る工程は単一の組成物で同時に行
われる。またより好ましくは、測定工程の前に更なる工程が含まれる。この更な
る工程は、第２組のＮＬＦを単離し、ここで第２組のメンバーは２本鎖領域及び
第１結合部位を含む工程；及び固体坦体に付着した第２結合部位に第１結合部位
を結合させる工程を含む。測定工程の前に更なる工程を含むこともできる。この
工程は、第２組のＮＬＦのメンバーを１本鎖領域及び第１結合部位を含む１種以
上の捕獲プローブとハイブリッド形成させることにより第２組のＮＬＦのメンバ
ーを単離する工程；及び固体坦体に付着した第２結合部位に第１結合部位を結合
させる工程を含む。
【０３５８】 もう一つの様態では、目標核酸中の突然変異を検出する方法が提供され、この
方法は、目標核酸を１個以上の揮発性塩を含有する組成物中で非ランダムに断片
化して１組の非ランダム長断片(ＮＬＦ)を生成させ；ＮＬＦの組のメンバーの質
量を液体マトリックスを用いてＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析により測定する工程を
含む。
【０３５９】 もう一つの様態では、バックグラウンドノイズを減少させる方法を提供する。
この方法では、試料を揮発性塩の組成物で洗浄し、次いで試料から塩を揮発させ
る。
【０３６０】 (ＩＲ−ＭＡＬＤＩを用いた２本鎖核酸の分析) ＩＲ−ＭＡＬＤＩは２本鎖核酸の分析に有利に用いられる。より長い断片の分
析には、イオン強度を上げるために液体マトリックスは核酸の質量分析に適合性
を有するアンモニウム塩を含むアミン塩又はその他の塩のような塩を含まねばな
らないことが本文書で示される(例えばNordhoff et al. Mass Specrrom. Rev. 1
996, 15, 67-138を参照)。
【０３６１】 本文書(実施例)に例証されるように、９ｋＤＡから５００ｋＤＡを超える範囲
の２本鎖ＤＮＡがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で脱離して分析される。グリセリ
ンをマトリックスとしたＩＲ−ＭＡＬＤＩは、塩を添加してイオン強度を調整す
ることにより、より大きな２本鎖ＤＮＡについて優れた結果を与えた。７０塩基
対又はそれ以上を有する２本鎖アナライトを用いて検討したところ、ＩＲ−ＭＡ
ＬＤＩで断片化は殆ど観察されず、またサブピコモル域の感度がルーチンに得ら
れた。より小さな質量域(約７０ｂｐまで)では、６−アザ―２−チオチミン(ATT
)をマトリックスとしたＵＶ−ＭＡＬＤＩを用いた。７０マーについて２本鎖型
の実質的に定量的な検出が観察された。しかしこれより大きな断片では、ＵＶ−
ＭＡＬＤＩではかなりの断片化が起こり、その結果感度及び質量分解能が低下し
た。
【０３６２】 (自動化分析) ここに記載する方法は自動化工程の一部として用いることもできる。例えば、
米国出願第０９／２８５、４８１号は、試料の作成、機器装備、及び生体高分子
試料分析を統合した完全自動化モジュラー分析システムを提供する。このシステ
ムは、例えば質量分析、放射能標識、質量標識、化学標識、蛍光化学発光、及び
それらの標識部位など検出及び分析法をロボット工学及び自動化学反応システム
と統合し、ハイスループットかつ正確な自動工程を提供する。ここで記載する機
器装備及び工程は自動化工程ライン又はいずれの自動化分析システム若しくはプ
ロトコールにも統合することができる。
【０３６３】 完全自動化モジュラー分析システムは機器装備を統合し、生体高分子試料の分
析が行えるようにしたものである。試料は例えば核酸、タンパク、ペプチド及び
炭水化物をなど全ての生体高分子を含むが、これらに限定されるわけではない。
このステムは、例えば質量分析、放射能標識、質量標識、化学標識、蛍光及び化
学発光のような検出及び分析法をロボット工学及び自動化学反応システムと統合
し、ハイスループットかつ正確な自動工程ライン(ＡＰＬ)を提供する。
【０３６４】 (キット) ここでは、液体マトリックスを用いてＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析を実施するた
めのキットをも提供する。このキットは、液体、坦体、及び任意にＩＲ−ＭＡＬ
ＤＩ質量分析用機器装備並びに特定の対照物質を含む。キットはまた、少なくと
も１つの目標生体高分子を特定の位置に固定化したアレーから成る坦体を含むこ
とができる。
【０３６５】 以下の実施例は具体的説明のためのみに含めるものであり、本発明の範囲を限
定しようとするものではない。
【０３６６】 (実施例１) (７０から２１８０ヌクレオチドを含む核酸分子のＭＡＬＤＩ質量分析) この実施例は、核酸分子を液体マトリックスに取り込むことによって、核酸分
子の正確な質量分析が行えることを示す。
【０３６７】 (Ａ. 実験材料及び方法) (１. 試料) 合成オリゴデオキシヌクレオチドはファルマシアバイオテク社(Ｕｐｐｓａｌ
ａ、スウェーデン)から得た。７０マーは同販売業者がＦＰＬＣ精製を行ったも
のであり、またより小さなオリゴヌクレオチドは更に精製することなく使用した
。プラスミドＤＮＡはキアゲンミディプレップキット(キアゲン社、Ｈｉｌｄｅ
ｎ、ドイツ)を用いて同製造業者の推奨する方法に従ってE.coli ＤＨ５α株か
ら精製した。制限酵素はニューイングランドバイオラブス社(Ｓｃｈｗａｌｂａ
ｃｈ／Ｔａｕｎｕｓ、ドイツ)より得た。プラスミドＤＮＡの制限酵素による消
化は供給業者のプロトコールに従って実施した。ＭＡＬＤＩ質量分析用試料を１
０ｍＭＥＤＴＡ及び２Ｍ酢酸アンモニウムに調整し、２倍容量のエタノールで沈
殿させた。ペレットを７０％エタノールで１回洗浄し、水に溶解して約０．５ｐ
ｍｏｌ／μｌの濃度にした。
【０３６８】 ＳｃａＩで消化したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋をＴ３ポリメ
ラーゼ(ＭＢＩフェルメンタス社、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア)の鋳型として１
２０６ヌクレオチドのin vitro転写物を合成し、標準的な方法に従ってエタノー
ル沈殿させた(Kirpekar et al., Nucl. Acids Res. 22: 3866-3870 (1994))。１
０μｌのＰｏｒｏｓ ５０Ｒ２(パースペクティブバイオシステムズ社、Ｆｒａ
ｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ)逆相カラムを作成し、文献(Kussman et al., J. Mass. S
pectrom. 32: 593-6010 (1997))記載の方法に従って３％アセトニトリル／１０
ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム(ＴＥＡＡ)で平衡化させた。ＲＮＡ試料を０．
３Ｍ ＴＥＡＡに調整してカラムにかけた。カラムを２００μｌの３％アセトニ
トリル／１０ｍＭ ＴＥＡＡで洗浄し、１０μｌの２５％アセトニトリル／１０
ｍＭ ＴＥＡＡで試料を溶出した。
【０３６９】 溶出液を凍結乾燥後、５μｌの水に溶解し、推定試料濃度１ｐｍｏｌ／μｌと
した。マイコプラズマに感染したＨｅＬａ細胞から粗ＤＮＡ標品を作成し、プラ
イマー５’−ＣＧＣ ＣＴＧ ＡＧＴ ＡＧＴ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＣ−３’(
配列識別番号１)及び５’−ＧＣＧ ＧＴＧ ＴＧＴ ＡＣＡ ＡＧＡ ＣＣＣ ＧＡ−３’(配列識別番号２)、及び遺伝子組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
(ＭＢＩフェルメンタス社)を用い、報告(Hopert et al., J. Immunol. Meth. 16
4: 91-100 (1993))記載の方法に基本的に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲにより
、マイコプラズマの１６Ｓ ｒＲＮＡに由来する約５１５ｂｐのＤＮＡ断片が生
成する(Hopert et al., J. Immunol. Meth. 164: 91-100 (1993))。しかしマイ
コプラズマの種が不明のためＰＣＲ産物の正確な長さは予想できない。
【０３７０】 ＰＣＲによる再増幅を、同一のプライマーの組を用いた同一の条件下で行い、
最終産物を４ｍＭ ＥＤＴＡ／２Ｍ酢酸アンモニウムに調整し、制限酵素消化物
について記載した方法で沈殿させた。ペレットを２００μｌの水に溶解し、Ｍｉ
ｃｒｏｃｏｎ−１００(アミコン社、Ｗｉｔｔｅｎ、ドイツ)マイクロ濃縮器にか
け、同製造業者の推奨法に従って１００μｌの水で続けて３回ダイアフィルトレ
ーションを行って精製した。保持液を凍結乾燥し、水に溶解してＵＶ分光測定に
より０．６ｐｍｏｌ／μｌの濃度にした。
【０３７１】 (２．試料作成) ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析にはグリセリンをマトリックスとして使用した。グ
リセリンを等容量のＨ＋陽イオン交換樹脂ビーズの懸濁液(Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ
−Ｘ８；バイオラド社、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ)とインキュベートした。これは
以後の操作で核酸のバックボーンであるリン酸がアルカリ塩を形成するのを抑え
るためである。典型的には、０．５から１μｌのグリセリンを同容量の水溶性ア
ナライト組成物とターゲット上で混合し、試料のアナライト対グリセリンの最終
分子比がアナライトの質量に応じて凡そ１０-4から１０-7になるようにした。混
合物を１から２ｍｍ2の範囲にまんべんなく塗布して、ステンレススチール基質
上に均一で透明な薄層を作った。約１０-2−１Ｐａの気圧で水を蒸発させて除い
た後、試料を質量分析計に導入した。
【０３７２】 ＵＶ−ＭＡＬＤＩ質量分析用試料は、１０-5から１０-8Ｍ濃度のアナライト水
溶液組成物１μｌと５０ｇ／ｌの３−ヒドロキシピコリン酸(３ＨＰＡ)組成物の
２０％アセトニトリル溶液０．７μｌとをターゲット上で混合して作成した。ア
ンモニウムを付加した陽イオン交換ビーズ約１０個を試料に加えた後、冷却気流
で乾燥した(Nordhoff et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 6: 771-776 (199
2))。
【０３７３】 (３．装置) 実験は自家製の３．５ｍの等価飛行距離を有するＭＡＬＤＩシングルステージ
リフレクトロン飛行時間型(ｒｅｆＴＯＦ) 質量分析計を用いて実施した(Berken
kamp et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 11: 1399-1406 (1997))。質量分
析計はまたリニアーＴＯＦ(ｌｉｎＴＯＦ)モードでも使用できる。特別に言及し
ないかぎり、実験はリフレクトロン及び陽イオンモードで実施した。
【０３７４】 静止又は遅延イオン抽出(ＤＥ)のいずれかを用いてスプリット抽出源中約１６
−２５ｋＶの総電位差によりイオンを加速する。陰極(質量に応じて約２０−２
７ｋＶのイオン衝撃エネルギー)の前方１０ｍｍの位置に設置した内部変換ダイ
ノードつきベネチアンブラインド型二次電子増倍管(ＥＭＩ ９６４３)、又はＣ
ｈｅｖｒｏｎ Ｍｉｃｒｏ−Ｃｈａｎｎｅｌ陽極検波器(ガリレオ社、Ｓｔｕｒ
ｂｒｉｄｇｅｍ、ＭＡ)をイオン検出に用いた。高質量イオンには、二次イオン
を有効に利用してイオンシグナルを増やすために、変換ダイノードと電子増倍管
陰極との間の電位差を数千ボルトに設定する。数千ダルトンまでの範囲で質量分
離能を最大にしたい場合には、両電極管の電位差を約５００Ｖ未満にして、二次
電子のみを検出し、それにより二次イオンの時間的(及び質量の)分散をさけるよ
うにした(例えば図２Ａを参照)。シグナルは約０．５ｎｓの時間分解能を有する
トランジエントレコーダー(ＬｅＣｒｏｙ９３５０)で処理した。ディジタル化し
たデータをＰＣに移して貯蔵し、更なる評価に供した。
【０３７５】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ実験には、２．９４μｍで発光するＥｒ−ＹＡＧレーザー(
スペクトルム社、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ；ｒ＝８０−９０ｎｓ、各発光間のエネ
ルギー安定性約±２−４％)を使用した。３５ｎｍ(ｒｚ＝６ｎｓ)のＵＶ領域で
発光する３倍の周波数を持つＹＡＧレーザーをＩＲ−ＭＡＬＤＩとＵＶ−ＭＡＬ
ＤＩの直接比較に使用した。単一レーザーパルスを試料の上に４５°の角度で約
１５０μｍ(ＩＲ)又は１００μｍ(ＵＶ)の直径のスポットに集光した。約５μｍ
の解像能のＣＣＤカメラを用いて試料をin situで観察した。
【０３７６】 (Ｂ．結果) 少なくとも約５０個のヌクレオチドを有する、適度の品質のＤＮＡのＵＶ−Ｍ
ＡＬＤＩスペクトルはｌｉｎＴＯＦによりＤＥモードでのみ得ることができた。
図１Ａ及び１Ｂは、合成ＤＮＡ７０マー(約２１．５ｋＤＡ)と３ＨＰＡマトリッ
クス(３５５ｎｍ)について２つの操作モードで得られたスペクトルの著しい品質
の差を示す。リフレクトロンモードで得られた図１Ｂのスペクトルの品質は、図
１Ａのスペクトルの品質よりいくつかの点で著しく劣っている。シグナル強度及
びシグナル−ノイズ比がかなり低下し、また質量分解能も図１Ａのスペクトルで
の６５から１５(Ｍ／Δｍ；ＦＷＨＭ(半値幅))に低下した。図２Ｂ中の約２００
０Ｄａ未満の質量幅中の飽和シグナルは、図に見られる強度のアナライトのシグ
ナルを得るために必要なレーザーフルエンスが増加していることを反映している
。質量分解能の損失の大部分は、ピークの低質量側がなだらかな傾斜になってい
ることの結果であり、これは準安定中性低分子が大量に消失していることを示し
ている。正確な質量測定はスペクトルの質の低下のため著しく損われている。
【０３７７】 同じＤＮＡ７０マーをグリセリンをマトリックスとして測定したＩＲ−ＭＡＬ
ＤＩスペクトル(ｒｅｆＴＯＦ、ＤＥモード)を図１Ｃに示す。このスペクトルの
質はシグナル強度及び質量分解能に関してリニアーモードで得られたＵＶ−ＭＡ
ＬＤＩ分析と同等である(図１Ａ)。基準ピークは急峻に立ち上がる低質量側エッ
ジを有し、準安定中性低分子の消失が全く無いことを示している。この挙動はグ
リセリンをマトリックスとして行った核酸のＩＲ−ＭＡＬＤＩで一貫して観察さ
れ、この事実はこの方法が高いイオン安定性を持った核酸のイオンを生じる非常
に穏やかな脱離法であることを示している。このことはコハク酸をマトリックス
に用いて得られた核酸のＩＲ−ＭＡＬＤＩとは著しい対照をなしている(Nordhof
f et al., Nucl. Acids Res. 21: 3347-3357 (1993)、図１ａ及び１ｅを参照)。
グリセリンマトリックスにおいて実質的に全く準安定中性分子の消失がないこと
は、したがって以前の経験からすれば全く予期しない結果であった。
【０３７８】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析による核酸の分析は、小さなオリゴヌクレオチドか
ら２０００ヌクレオチド超に到る幅広い質量範囲の核酸について有用である(図
２を参照)。合成２１−マーＤＮＡのｒｅＴＯＦ ＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量スペク
トルを図２Ａに示す。遅延イオン抽出を用いれば１５００(ＦＷＨＭ)の質量分解
能がえられ、これはこの質量範囲のタンパクについて本装置で得られる分解能に
匹敵する。スペクトルに現れたアナライトのピークの高質量側にあるいくつかの
分離の良くないピークは、イオン検出系により質量分解能を損なわないために、
ここでは二次電子のみを選択的に検出するモードで作動した変換ダイノードで発
生した残余二次イオンがアーティファクトとして検出されたものである。
【０３７９】 図２Ｂはプラスミドの制限酵素消化物(ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ＋をＢ
ｇｌｌ及びＲｓａｌで消化したもの)の高質量領域を示すが、２８０ｂｐ、３６
０ｂｐ、９２０ｂｐ、及び１，４００ｂｐの４個の断片が生じている。これら４
つのシグナルはいずれも１本鎖を表わし、２本の相補的鎖の混合シグナルである
。このスペクトルでは２本鎖のオリゴマーのシグナルは、あったとしても非常に
弱い。精製グリセリンで作成した試料中での２本鎖の解離は、Ｈ＋イオン交換樹
脂による酸性化によるものと暫定的に考えている。全ての高質量イオンシグナル
の質量分解能は約５０(ＦＷＨＭ)で、イオン質量には相対的に依存しないように
見受けられる。
【０３８０】 図１ＣのＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルは制限酵素消化物についてこれまで
に測定された質量の上限(１３０ｂｐ、６４０ｂｐ、２，１８０ｂｐ)を示す。２
，１８０ヌクレオチドの１本鎖断片のシグナルは制限酵素消化物を９５℃で５分
間加熱して初めて得ることができたが、これはこのように大きなＤＮＡ断片は、
１４００ｂｐまでのＤＮＡ断片とは対照的に、使用した条件下では１本鎖に分離
しないからだと思われる。このスペクトルで２，１８０ヌクレオチド断片の質量
分解能が３０と比較的悪く、また強いバックグラウンドシグナルが存在するのは
、現行の条件下では約７００ｋＤａの核酸のＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルが
質量の最高限度であることを示している。したがって、２本鎖２，１８０ヌクレ
オチド断片は観察されなかった。
【０３８１】 Ｉn vitro転写で得た１２０６ヌクレオチドのＲＮＡを含む、大きなＲＮＡ分
子のＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルも可能であった(図２Ｄ)。ＵＶ−ＭＡＬＤ
では、ＤＮＡに比べてＲＮＡの方がイオンがより安定であることが実証されてい
るが、検討した質量範囲ではＩＲ−ＭＡＬＤＩではそのようなことは観察されな
かった。大きなＲＮＡイオンと同様、大きなＤＮＡイオンもかなりの安定性を有
しているように見え、リフレクションモードでＴＯＦ分析にかけても十分安定で
あった。約５０ｋＤａに集中する大きな隆起は準安定な断片ではなく試料の不純
物を反映していると考えられる。低質量側のピークの立ち上がりが比較的急峻で
あることも、単一塩基など小さな中性粒子の消失が極めて限られていることを示
している。
【０３８２】 グリセリンをマトリックスに用いることの利点の一つは、各照射間の再現性が
優れていることと質量精度が高いことである(２００−４００ｐｐｍ；Nordhoff
et al., Nucl. Acids Res. 21: 3347-3357 (1993)を参照)。これらの値は元々タ
ンパクについて測定されたものであるが、より小さなオリゴヌクレオチドの分析
にもあてはまる。質量の真度は質量に依存する。アンジオテンシンＩＩ(１０４
７Ｄａ)及びウシインスリン(５７４３Ｄａ)を用いた外部２点較正により、２１
マー(６３９８Ｄａ)の質量は既知質量の±２Ｄａ以内、即ち０．００３％以内の
真度で測定された(図２Ａ)。７０マーの分子質量(理論質量２１５１７Ｄａ)は、
チトクロームＣオリゴマー(Ｍ＋、２Ｍ＋、３Ｍ＋)を用いた較正により図１Ｃの
スペクトルから±２５Ｄａ以内、即ち０．１％の真度で測定された。
【０３８３】 分析した１０種類の異なる高質量ＤＮＡの各々について、質量の測定値は配列
から計算された理論質量の約１％未満の差に収まった(例えば図２Ｂ及び図２Ｃ
を参照)。ＤＮＡ制限酵素断片の場合には、２本の１本鎖の平均質量を理論質量
として用いた。２本鎖の質量が１％以上異なることは決してなかった。大質量Ｒ
ＮＡは１例だけ測定した(図Ｄ)。このＲＮＡの質量測定値は３８８，２７０Ｄａ
であったが、遺伝子配列より算出された質量は３８６，６０６Ｄａである。遺伝
子配列からの予想より、試料は１個から３個の余分なヌクレオチドの分だけ伸長
した産物が少量混じった不均一な混合物の可能性が高いので(Melton et al., Nu
cl. Acids Res. 12: 7036-7056 (1984))、このＲＮＡ試料の実際の質量は多分配
列から算出された値よりは約５００Ｄａ大きいものと考えられる。したがって、
ＤＮＡについて観察された少なくとも約１％の真度はＲＮＡについても達成され
ているものと思われる。
【０３８４】 １００から４００ｋＤａの大きなＤＮＡ及びＲＮＡ分子の外部４点較正には、
例えば１０Ｍ＋、２０Ｍ＋、３０Ｍ＋、４０Ｍ＋のようなチトクロームＣのクラ
スター、又は例えば２Ｍ＋、３Ｍ＋、４Ｍ＋のようなＩｇＧモノクローナル抗体
の多量体を用いた。５００ｋＤａを超すアナライトにはＩｇＧモノクローナル抗
体による較正がより正確であった。未知ＤＮＡ断片の較正にはＤＮＡ又はＲＮＡ
較正物質を用いるのがより正確な質量測定ができて望ましいかもしれない。
【０３８５】 グリセリンをマトリックスとして用いる大きな核酸のＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分
析の感度を評価するための実験を、約５１５ヌクレオチドを有する未知配列のＰ
ＣＲ産物について行ったところ、質量は３１８，４８０Ｄａと測定された。この
測定には、イオン交換による精製を行っていないグリセリンを使用した。スペク
トルには２本鎖分子種の優勢なシグナルが見られる。精製グリセリンを用いて作
成した試料では２本鎖が解離していたが、これは陽イオンと置換したプロトンに
よりグリセリンが酸性化したことによるものと暫定的に考えている。ただしこれ
以外のパラメータがＩＲ−ＭＡＬＤＩ条件下での２本鎖の解離に関与していたか
も知れない。
【０３８６】 希釈実験の初期濃度は、ＵＶ分光測定で０．６ｐｍｏｌ／ｌであった。異なる
量の試料をターゲットに負荷して質量スペクトルを測定した(図３)。図３Ａに示
す１回照射による質量スペクトルでは３００ｆｍｏｌのＰＣＲ産物を負荷した。
このスペクトルの質は、Ｓ／Ｎ比が１００を超え、また２本鎖の質量分離能が６
５(ＦＷＨＭ)で、アナライト対マトリックス比(Ａ／Ｍ)が約１０-7）であること
を示しており、この分子量（約３２０ｋＤａ）のアナライトに充分適合している
。
【０３８７】 図３Ｂの質量スペクトルは総負荷量３ｆｍｏｌで得られたスペクトルである(
Ａ／Ｍ比約２ｘ１０-9)。強いバックグラウンドシグナルが低質量域で優勢であ
る。総シグナル強度、質量分解能(２本鎖イオンシグナルについて約２５ＦＷＨ
Ｍ)、及びＳ／Ｎ比は図３Ａに比べるとかなり劣る。質量測定は約１％の真度で
まだ可能であった。図３Ｃのスペクトルは、非常に少量の試料で約２７０μｍの
直径の試料スポットをターゲット上に作らせ、試料総量僅か３００ａｔｔｏｍｏ
ｌで得られたスペクトルである(Ａ／Ｍ約８ｘ１０-10)。このように少ない試料
容量による測定はマイクロピペット(例えばLittle, Anal. Chem. 69:4540-4546
(1997)を参照)による分注、又はアナライトを標準のマイクロリットル容量の適
切なグリセリン／水混合液で作成することにより可能である。後者の場合には、
試料を真空に入れる前又は後に水を蒸発させて除く。質量分離能は約１０と悪く
、このことは、３％を超える質量精度を得るためには、本実験で使用した装置及
び検出器では３００ａｔｔｏｍｏｌのアナライトが限度であることを示している
。ＵＶ−ＭＡＬＤＩ質量分析について報告されている値(Tang et al., Rapid Co
mmun. Mass Spectrom. 8: 727-730 (1994)；図５及び６を参照)と比較して、今
回ＩＲ−ＭＡＬＤＩで得られた感度はこのサイズの核酸については少なくとも２
から３桁改善されていることを示している。
【０３８８】 (実施例２) (ＩＲマトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析法の性能) 中赤外領域で発光する２種のレーザー、Ｅｒ−ＹＡＧ(波長２．９４μｍ、パ
ルス幅８０−９０ｍｓ)及びＥｒ−ＹＳＧＧ(波長２．７９μｍ、パルス幅８０ｎ
ｓ)赤外線レーザーの、生体高分子のＩＲマトリックス補助レーザー脱着／イオ
ン化質量分析(ＩＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ)における性能特性を検討した。グリセリ
ン及びコハク酸をマトリックスとして使用した。ＩＲ−ＭＡＬＤＩにおいては、
各レーザー照射毎の試料消費はＵＶ−ＭＡＬＤＩより２桁多いのが普通である。
グリセリンをマトリックスとして使用して得られる照射毎のイオンシグナルの再
現性はＵＶ−ＭＡＬＤＩで得られる最善の値に匹敵する。質量測定の精度及び真
度についてもこのことは当てはまる。コハク酸の場合にはこれらの値は有意に劣
るが、これは液滴の乾燥作成物に典型的に見られる試料の高度の不均一性のため
である。準安定な断片化は低質量域ではＵＶ−ＭＡＬＤＩ及びＩＲ−ＭＡＬＤＩ
ともほぼ同等であるが、約２０ｋＤａを超す質量域ではＩＲではより少なく、そ
のためＩＲ−ＭＡＬＤＩでは質量分解能が向上し、また質量の最高限度がより拡
大した。
【０３８９】 本実施例では、２．９４μｍ及び２．７９μｍで発光するＥＲレーザーで得ら
れたＩＲ−ＭＡＬＤＩ分析の性能データの結果、及び質量分離能改善のための遅
延抽出の応用可能性について述べる。特に、準安定断片化の程度が、高分子質量
の分析での質量分解能によって異なることを示す。
【０３９０】 (実験方法) 実験は３．５ｍの等価飛行距離を有する自家製シングルステージリフレクトロ
ンＴＯＦ質量分析計を用いて実施した。質量分析計はまたリニアーモードでも使
用できる。特別に言及しないかぎり、ここに報告する実験はリフレクトロンモー
ドで実施した。スプリット抽出源中１０−２０ｋＶの総電位差によりイオンを加
速する。遅延モード抽出では、最大電位差８ｋＶまで切り替えられる。イオン抽
出の最小遅延時間は１２０ｎｓである。これらの作動条件下では、いずれのマト
リックスを用いてもまた陽イオンモードでも陰イオンモードでもアークは生じな
かった。陰極(質量に応じて約２０−２７ｋＶのイオン衝撃エネルギー)の前方１
０ｍｍの位置に設置した変換ダイノードつきベネチアンブラインド型二次電子増
倍管(ＥＭＩ Ｒ２３６２)、又はＣｈｅｖｒｏｎ Ｍｉｃｒｏ−Ｃｈａｎｎｅｌ
陽極検波器(ガリレオ社、Ｓｔｕｒｂｒｉｄｇｅｍ、ＭＡ)をイオン検出に用いた
。大部分の実験ではシグナルは２．５ｎｓの時間分解能のトランジエントレコー
ダー(ＬｅＣｒｏｙ９４５０Ａ)で処理した。高質量分解能実験には０．５ｎｓの
時間分解能を持つＬｅＣｒｏｙ９３４８Ｌａレコーダーを使用した。データをＰ
Ｃに移して貯蔵し、更なる評価に供した。装置には２組の赤外線レーザーが装着
されていて、一つは２．９４μｍで発光し(Ｅｒ−ＹＡＧ：Ｆａスペクトルム社
、Ｇｅｒｌｉｎ、ドイツ、ｒ＝８０−９０ｎｓ、各照射間のエネルギー安定性約
±２−４％)、もう一つは２．７９μｍで発光する(Ｅｒ−ＹＳＧＧ：シュヴァル
ツエレクトロオプティクス社、米国：ｒ＝８０ｎｓ、エネルギー安定性約±２％
)。３５５ｎｍ(ｒｚ＝１６ｎｓ)のＵＶ領域で発光する３倍の周波数をもつＮｄ
−ＹＡＧレーザーをＩＲ−ＭＡＬＤＩとＵＶ−ＭＡＬＤＩの直接比較に使用する
。単一レーザーパルスを試料の上に４５°の角度で約２００μｍ(ＩＲ)又は１０
０μｍ(ＵＶ)の直径のスポットに集光する。約５μｍの解像能のＣＣＤカメラを
用いて試料をin situで観察する。ステンレスチールの基質は液体窒素で約１５
０−１７０ｋの温度に冷却可能である。その温度は±５Ｋの精度を有する熱電対
でモニターする。
【０３９１】 (試料の作成) 前述の通り、種々の低分子をマトリックスとしてＩＲ−ＭＡＬＤＩで使用でき
るが、コハク酸(固体マトリックス)及びグリセリン(液体又は凍結固体)が好まし
い。ＵＶ−ＭＡＬＤＥで汎用されるＤＨＢｓ(２，５−ジヒドロキシ安息香酸を
１０％２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸と混合したもの)もＩＲ−ＭＡＬ
ＤＩで使うことができ、いくつかの例で比較のために使用した。 加えて、例えばコハク酸／ＤＨＢｓ又はコハク酸／ＴＲＩＳ(トリス−ヒドロキ
シメチルアミノメタン)など化合物の混合物も適していることが判った。固体マ
トリックス試料は標準的な乾燥液滴法を用い、１０-4から１０-5Ｍのアナライト
水溶液約１−３μｌと３０ｇ／Ｌのマトリックス溶液１−５μＬとをターゲット
上で混合して作成し、次いで冷却気流で乾燥した。
【０３９２】 グリセリンを用いる場合には、アナライトは０．５−１０ｇ／Ｌの濃度に直接
溶解するか、又はグリセリンをアナライトの水溶液と混合してアナライト対グリ
セリンの最終モル比をアナライトの質量に応じて２ｘ１０-4から１ｘ１０-5にな
るようにした。典型的には１μＬの容量をステンレススチールの基質上に添加し
、３−４ｍｍ2の範囲にまんべんなく塗布して均一で透明な薄層を作る。アナラ
イトの水溶液をグリセリンと混合する場合には、試料を質量分析計に導入する前
に通常約１０-2−１Ｐａの気圧で水を蒸発させて除かなければならない。試料は
直接質量分析計に挿入するか、又は液体窒素中約１５０−１７０Ｋに冷却した後
挿入する。
【０３９３】 検討したマトリックスについては、ＩＲ−ＭＡＬＤＩは塩及び緩衝液に対して
極めて耐性が高いことが判った。２００ｍＭまでの濃度のＮａＣｌ、２０％(Ｗ
／Ｖ)までのサッカロース、又は１００ｍＭまでのトリス／塩酸緩衝液を含有す
る試料のスペクトルが、コハク酸及びグリセリンのいずれを用いてもスペクトル
の質を損うことなく得られた。
【０３９４】 (結果) (試料の消費及び分析感度) ＭＡＬＤＩの分析感度は分析に用いるアナライト溶液の最小濃度又は使用でき
るアナライトの総量によって限定される。実際の測定では、作成する試料の総容
量及び試料中のアナライト対マトリックス比を、与えられた条件に適合するよう
に一定の限度内に調整することができる。本項では、ＩＲ−ＭＡＬＤＩにおける
これらの量に関する典型的な値かつ限界値について述べ、対応するＵＶ−ＭＡＬ
ＤＩでの値と比較する。初めに、ＩＲ−ＭＡＬＤＩとＵＶ−ＭＡＬＤＩの間の若
干の一般的相違について考察する。
【０３９５】 試料上のレーザースポットのサイズが同等であるばあい、ＩＲレーザービーム
ではＵＶレーザービームに比べ１００-１０００倍多くの物質が脱離するが、こ
れは吸光係数が小さく試料中に放射光が深く透過するからである。ここで記述す
る実験条件下では、ＩＲ及びＵＶの単一照射イオンシグナルは典型的には互いに
ほぼ同等の強度を有していた。ＩＲ−ＭＡＬＤＩではレーザーパルス当りより多
くの物質がアブレーションを受けるので、物質は実際に実験的に観察されるよう
に主に大きなクラスター及び小さな粒子として離れるか、又はイオン収量が２か
ら３桁小さくなるか、又はその両方となる。
【０３９６】 低質量のシグナル強度、シグナル対ノイズ比、及び質量分解能は、記録される
質量スペクトルの質を決める主要な基準である。良好なスペクトルのシグナル強
度及び質を得るためのターゲット上のアナライト対マトリックスの至適モル比は
アナライトの分子量に依存する。分子量約５０ｋＤａ未満のアナライトでは、２
ｘ１０-4−２ｘ１０-5の比率が至適であることが判った。５０ｋＤａを超える分
子量を有するアナライトでは、１０-5の比率が至適であることが判った。したが
って、特に低質量域では、ＩＲ−ＭＡＬＤＩにおける至適アナライト濃度はＵＶ
−ＭＡＬＤＩで通常用いる濃度より１から２桁ほど高い。アナライトの分子量に
もよるが、アナライト対マトリックス比を２ｘ１０-6−10-7に下げてもほどほど
の質のスペクトルを得ることができる。これはレーザー照射当り１−５０ｆｍｏ
ｌの試料消費に相当する。ルーチンの応用では、ＩｇＧモノクローナル抗体(約
１５０ＫＤａ)のスペクトルが、１０-7Ｍの水溶液を用いコハク酸又はグリセリ
ンをマトリックスを使ってまずまずの質で得られている。これはＵＶ−ＭＡＬＤ
Ｉでの僅か数アットモルで得られるスペクトルの質と同程度である。
【０３９７】 実験結果はリゾチーム／グリセリン標品で得られる感度を示している。ここで
は約０．７ｆｍｏｌのリゾチーム標品に相当する１．２ｘ１０-7ｍｏｌ／Ｌの凍
結グリセリン溶液５．５ｘ１０-3μＬで試料を作成した。これはＡ／Ｍモル比約
１０-8に相当する。ターゲット上の凍結試料の直径は試料上のレーザースポット
の直径の約１．５倍の大きさであった。レーザー照射を１０回行ってスペクトル
を積算した後、若干の試料がまだターゲット上に残っていた。結果として、平均
試料消費量は１回のスペクトル当り７０アットモル未満であった。しかし、この
ような低いＡ／Ｍ比を用いると、質量分解能はｍ／Δｍ＝１０−２０と低下する
。シグナル対ノイズ比(Ｓ／Ｎ)もかなり損われ、低質量のバックグラウンドノイ
ズが過大になる。ＵＶ−ＭＡＬＤＩでは、高ゼプトモル台の試料消費が報告され
ている(Jespersen et al. (1996) p. 217 in Mass Spectrom. in Biol. Sci, Bu
rlingame, Ed.を参照)。
【０３９８】 ＩＲ−ＭＡＬＤＩでも、(非特異的)アナライトオリゴマー又は多重荷電イオン
の収量はＡ／Ｍに大きく依存する。このような傾向は、ＵＶ−ＭＡＬＤＩに比べ
てＩＲ−ＭＡＬＤＩでより顕著である。Ａ／Ｍ比２ｘ１０-4の作成試料から鶏卵
リゾチームの質量スペクトルが得られた。２５マー(約５００ｋＤａ)までのリゾ
チームのホモオリゴマーをスペクトルで確認した。逆に、Ａ／Ｍ比２ｘ１０-6未
満では多重荷電を帯びたアナライトイオンがスペクトル上でより顕著になり、一
方オリゴマーのシグナルはノイズレベル未満の値に減少する。このような傾向は
コハク酸及び水和水をマトリックスに用いた場合にも観察されており(Sadeghi (
1997) Rapid Commun. Mass Spectrom. 11: 393)、分子量５０ｋＤａを超えるア
ナライトで特に顕著である。アナライトのホモオリゴマーが高収率で観察される
ことから判断して、特に最も多いオリゴマーシグナルの詳細な分布はイオン抽出
条件、例えば２ステージイオン源で低い(軟らかい又は穏やかな)イオン抽出電界
を使うか高い(硬い又は過酷な)イオン抽出電界を使うか、の変化により有意に影
響を受けると言える。低い抽出電界は分布を高度オリゴマーの生成にシフトさせ
る。このような観察がなされることは、異なる抽出条件により分析計のアクセプ
タンスが異なることを反映している可能性に加えて、拡大した離脱プルームの中
でガス相の過程が起こっていることを強く示唆している。
【０３９９】 (再現性) 今回用いたＥｒ−ＹＡＧレーザーでは、照射間のパルス安定性は約±２％であ
り、この値は最善のＵＶレーザーでの値に匹敵し、したがってシグナルの変動に
はあまり影響しない。照射間のレーザーエネルギーの変動はこれらのレーザーで
は極く小さな影響しか及ぼさない。照射間のシグナル変動のもう一つの原因は試
料の均一度であり、これはマトリックス及び試料作成技術に依存する。コハク酸
のような固体マトリックスは多くの場合不均一なミクロクリスタルパターンを生
じる。高品質の質量スペクトルは‘スイートスポット’からのみ得られる。ＤＨ
Ｂ(２，５−ジヒドロキシ安息香酸と１０％２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息
香酸の混合物)のようないくつかのマトリックスの場合にはＵＶ−ＭＡＬＤＩに
ついてもこのことが言える。ＩＲ−ＭＡＬＤＩでは１個の‘スイートスポット’
から僅か３−４個のスペクトルが得られるのみであるが、ＵＶ−ＭＡＬＤＩでは
１個の‘スイートスポット’から５０−１００個のスペクトルを得ることができ
る。これはＩＲ−ＭＡＬＤＩでは曝露毎に遥かに大量の試料が消費されるためで
ある。
【０４００】 グリセリンのような液体マトリックスは非常に均一な層を作るため、試料の全
ての部位からほぼ同等の質のスペクトルを得ることができる。また、これら液体
試料の表面は各照射の後で元の状態に回復するため、典型的な透過性を有する試
料の場合、同一のスポットからほぼ同質のスペクトルを５００以上得ることがで
きる。鶏卵リゾチームのスペクトルは、レーザーを２Ｈｚの照射頻度で同一部位
を繰り返し２５０回を超えて照射して得られた。初期の曝露と後期の曝露との間
で、シグナル強度、質量分解能、又はＳ／Ｎ比又はオリゴマーの分布に有意な相
違は観察されなかった。結果として、グリセリンをマトリックスとして用いた場
合、ＩＲ−ＭＡＬＤＩスペクトルの再現性はＵＶ−ＭＡＬＤＩの作成試料におけ
る再現性より優れてまではいないとしてもほぼ同等であることが判った。コハク
酸のような固体マトリックスでは照射間のイオンシグナルの再現性は問題になる
ことがあり、良好な結果を得るためには操作する人のかなりの経験がしばしば要
求される。
【０４０１】 (断片化) 断片化もＭＡＬＤＩ−ＭＳにおける重要なパラメータである。一般的に、イオ
ン抽出時間に比べて短いタイムスケールで脱離及びイオン化過程で発生するいわ
ゆる‘プロンプト’なフラグメントの収量はＵＶ−ＭＡＬＤＩにおいてもＩＲ−
ＭＡＬＤＩにおいても非常に低い。これらのフラグメントはリニアー及びリフレ
クション飛行時間型(ＴＯＦ)分析計のいずれにおいてもその真の(フラグメント
の)質量として検出される。このことは遅延時間約１μｓ又はそれ未満の遅延抽
出下でも同様である。ＩＲ−ＭＡＬＤＩでは、そのようなプロンプトフラグメン
トはオリゴヌクレオチドについては若干増加した収量で得られているが、それで
も全体的な収量は非常に低い。したがって、ＴＯＦ質量分析計の無フィールド領
域でのマイクロ秒から百分の一マイクロ秒台の準安定イオン崩壊が遥かに重要で
ある。これは一方でリフレクトトン(ｒｅＴＯＦ)装置の質量分解能を損なうもの
の、他方、ポストソースディケイ (ＰＳＤ)モードにおける構造解析に用いるこ
とができるからである。約２０ｋＤａまでの質量域でペプチド及びタンパクの準
安定断片化に関してＵＶ−ＭＡＬＤＩとＩＲ−ＭＡＬＤＩ間に有意差はこれまで
のところ認められていない。２０ｋＤａを超える分子量を持つアナライトでは、
著しく異なる準安定断片化が観察されている。ＵＶ−ＭＡＬＤＩ(マトリックス
：ＤＨＢｓ)及びＩＲ−ＭＡＬＤＩ(マトリックス：コハク酸；マトリックス：グ
リセリン)によるＩｇＧモノクローナル抗体(マウス、ＭＷ約１５０ｋＤａ)のｒ
ｅＴＯＦスペクトルを測定した。親イオンの基準ピークは両ＩＲ−ＭＡＬＤＩス
ペクトルではおおよそ左右対称の形をしていたが、ＵＶ−ＭＡＬＤＩスペクトル
では低質量側に強いテーリングが見られ、かなりの準安定崩壊が起こっているこ
とを示している。ピークの半値幅(ＦＷＨＭ)はＵＶスペクトルにおける２０００
Ｄａから、コハク酸をマトリックスに用いたＩＲスペクトルでは１０００Ｄａに
減少し、またグリセリンをマトリックスに用いた場合には僅か７００Ｄａになっ
た。ＵＶ−ＭＡＬＤＩスペクトルではアナライトのシグナルがかなり底上げされ
たベースラインの上に乗っていることが注目されるが、これはイオン源の中の何
処かで遅延断片化が起こっていることによるものである。脱離フルエンスがイオ
ン検出閾値のフルエンスの約１−１．５倍の範囲内に留まっている限り、ＵＶ−
ＭＡＬＤＩスペクトルではそのようなベースラインの歪みは観察されなかった。
【０４０２】 ＵＶ−ＭＡＬＤＩでは分解性背圧の増加とともに準安定崩壊が有意に増加する
と文献に報告されている。ＩｇＧモノクローナル抗体(マウス)の２種類のスペク
トルを(ａ)ＵＶ−及び(ｂ)ＩＲ−ＭＡＬＤＩによって、上述のスペクトル測定で
用いたイオン源背圧４ｘ１０-4 Ｐａとは異なる４ｘ１０-3 Ｐａのイオン源背
圧で測定した。ＵＶ−ＭＡＬＤＩスペクトルは低質量側のテーリングがかなり増
大したシグナルを示し、これは２Ｍ-）及び３Ｍ2-）のオリゴマーで特に顕著に
見られたが、一方、ＩＲ−ＭＡＬＤＩスペクトルにはそのようなテーリングは見
られなかった。
【０４０３】 もう一つの観察された事実は、準安定断片化がアナライト対マトリックスの比
に依存するという事実である。ｒｅＴＯＦ ＵＶ−ＭＡＬＤＩでは、Ａ／Ｍ比が
高すぎると通常Ｓ／Ｎ比が低下して質量分解能が損なわれる。これはＤＨＢをマ
トリックスとしてチトクロームｃについて得たスペクトルで見られた。１０-3の
より高いＡ／Ｍ比でスペクトルを測定すると、ピークの低質量側に強いテーリン
グが生じ、ここでもテーリングは親イオンピークに比べてダイマーでより強かっ
たが、Ａ／Ｍ比１０-4の試料で得たスペクトルには見られなかった。同じ試料で
得たＩＲ−ＭＡＬＤＩスペクトルはそのようなテーリングを示さず、ここでも準
安定断片化がかなり少ないことを示唆していた。水和水を‘内因性’マトリック
スとして用いたチトクロームｃのＩＲ−ＭＡＬＤＩではＡ／Ｍモル比は更に高い
が(約５ｘ１０-3)、それでも有意な準安定崩壊は観察されなかった(Berkenkamp
et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 7003)。
【０４０４】 一般に、イオンがプルーム中でマトリックスの中性粒子及びスペクトル分析計
中の残余ガスに衝突することが準安定断片化の主な原因とされている(例えばSpe
ngler et al. (1992) J. Phys. Chem. 96: 9678を参照)。ＩＲ−ＭＡＬＤＩでは
ＵＶ−ＭＡＬＤＩに比べて遥かに多量の物質が脱離し、その結果よりプルームが
広がると思われること、またＩＲではそれに比例して吸収されたレーザーエネル
ギーのより多くがアナライト分子に入り込むことを考えれば、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ
における準安定断片化が全ての異なる条件下でＵＶ−ＭＡＬＤＩに比べて遥かに
少ないという知見は予想外であった。直感に反して、ＩＲ−ＭＡＬＤＩはＵＶ−
ＭＡＬＤＩよりも温和な方法であると思われる。
【０４０５】 (測定可能な質量範囲) ＩＲ−ＭＡＬＤＩは断片化の程度が低いため、非常に高質量の分析、特にイオ
ン鏡を用いたときの分析にＵＶ−ＭＡＬＤＩよりも有利である。断片化が少ない
と大きな親分子イオンのシグナルが強くなるだけでなく、更に重要な利点として
、ＵＶ−ＭＡＬＤＩの場合のようなスペクトルの質の劣化を伴うことなくイオン
検出閾値フルエンスの約２倍のより高いフルエンスのレーザーを用いることがで
きる。このため高質量のシグナルが更に大きくなる。
【０４０６】 質量５１０ｋＤａのグラミシジン−Ｓ−合成酵素を５０ｍＭトリス／塩酸、１
８％(Ｗ／Ｖ)サッカローズ及び５ｍＭジチオスレイトール含有水溶液からグリセ
リンマトリックスを使って試料を作成してそのスペクトルを測定したところ、Ｓ
／Ｎ比は極めて良好でまた質量分解能ｍ／Δｍ＝５０が得られた。ＵＶ−ＭＡＬ
ＤＩでは、種々の条件を試みたが本アナライトのシグナルを得ることはできなか
った。
【０４０７】 ＩｇＧモノクローナル抗体(マウス)の質量スペクトルは、ＩＲ−ＭＡＬＤＩと
ＴＯＦ質量分析計の組み合わせが１ＭＤａを超える分子量の生体高分子の分析に
使えることを示している。質量約２ＭＤａの１３マーホモダイマーの多重荷電イ
オンがスペクトル中明瞭に確認でき、最高９０００００のｍ／ｚ値を有する他の
オリゴマーのイオンのシグナルもスペクトル中はっきり確認できた。
【０４０８】 (質量分解能) ＵＶ−ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳでは質量分離能を上げるために遅延イオン抽
出(ＤＥ)が用いられる。ＤＥがＩＲ−ＭＡＬＤＩでも同様に有用であるかどうか
は、脱離量が遥かに多いこと、及びプルーム拡大のダイナミックスがかなり異な
る可能性を考えると、直ちには明らかではなかった。事実、１０００Ｄａの質量
領域のペプチドの質量分解能は同一条件下のＵＶ−ＭＡＬＤＩでは約１０００で
あるのに対し、ＩＲでは僅かに約２００(ＦＷＨＭ)に低下し、このことはイオン
発生過程が異なっていることを示唆している。それにも拘わらず、ＤＥはＩＲ及
びＵＶ−ＭＡＬＤＩで測定限度内で同一の質量分解能を与えた。これはコハク酸
をマトリックスとし、２．９４μｍのＥｒ−ＹＡＧレーザーで８０ｎｓのパルス
を用いて得たｒｅＴＯＦスペクトル(グラミシジン−ｓのナトリウム塩、ＭＷ１
１６４．５)に示す通りである。このスペクトルの質量分離能は１０００であり
、個々のピーク幅３．５ｎｓに相当するが、これはデュアルＭＣＰ検出器の時間
分解能(３．０ｎｓ)の限度によるものである。メリチン(２８４６Ｄａ)のｒｅＴ
ＯＦから、質量分解能９５００が、またチトクロームｃ(１２３６０Ｄａ)につい
て同様に１５００が得られた。即ち、ペプチドについては約５０倍、チロクロー
ムｃについては約４倍の分解能増大が得られた訳である。
【０４０９】 ２０ｋＶでの静止イオン抽出によるリニアーＴＯＦにおける高質量域の質量分
解能は約５０に留まり、これはＩＲ-及びＵＶ−ＭＡＬＤＩで共に同じ値である
。いずれの場合も、質量分解能は初期イオン速度と運動エネルギーの分布によっ
て決まる。ＤＥを使えば質量分解能は３倍改善され、ＩＲ-、ＵＶ−ＭＡＬＤＩ
とも約１５０になる。
【０４１０】 ５０ｋＤを超えるアナライトの場合には、ＵＶ−ＭＡＬＤＩとは対照的にＩＲ
−ＭＡＬＤＩにおける質量分解能はｒｅＴＯＦを使えば更に改善することができ
る。上で考察したスペクトル(ＩｇＧモノクローナル抗体のｒｅＴＯＦスペクト
ル)で実証されたように、ＩＲ−ＭＡＬＤＩでは準安定断片化が著しく減少する
ために、ＩＲレーザーによってグリセリンマトリックスから脱離したモノクロー
ナル抗体の親ピークの幅が僅か７００Ｄになり、一方ＵＶ−ＭＡＬＤＩスペクト
ルの場合にはピーク幅は約２０００である。７００Ｄａのピーク幅は分解能約２
００に相当し、これは検討した全ての条件で最善の値であった。グリセリン以外
のマトリックス、より広いパルス幅(≦９０ｎｓに代えて≧１２０ｎｓ)のＥｒ−
ＹＡＧレーザー、又は波長２．７９μｍ、パルス幅８０ｎｓのＥｒ−ＹＳＳＧレ
ーザーへの切り替えなどを用いると、ピーク幅は若干広がった。大きな質量につ
いては、ＤＥを用いたＩＲ−ＭＡＬＤＩ ｒｅＴＯＦスペクトルで質量分解能の
有意な改善は見られなかったが、これはＵＶ−ＭＡＬＤＩでの観察と一致してい
る。ＩｇＧモノクローナル抗体の電子スプレー質量分析10結果は、７００Ｄａの
ピーク幅が分子の種々のグリコシル化状態のpeak envelopeを反映していること
を示している。したがって、装置の質量分析能はこれよりも更に若干高いことに
なる。この想定は、コンドロイチナーゼのスペクトルにより支持された。即ち、
単電荷を持つダイマーのピークが質量２２４ｋＤａに観察されたが、そのピーク
幅は７００Ｄａであり、これは質量分解能３００に相当する。
【０４１１】 (質量の真度及び精度) ＩＲ−ＭＡＬＤＩのイオンシグナル強度の再現性と同様に、一連の測定におけ
る標準偏差として与えられる質量測定の精度は、マトリックス(試料の形態)及び
レーザーパルスエネルギーの照射毎の変動に依存する。
【０４１２】 プロンプトイオン抽出及びコハク酸や乾燥液滴試料のようなマトリックスにお
いては、質量精度は分子量１５０ｋＤａまでは通常４００−５００ｐｐｍである
。試料の形態が非常に不均一であることと、上述のように脱離部位を頻繁に変え
なければならないことのために、精度は限られてくる。プロンプト 抽出及び非
常に均一な層を形成するグリセリンのような液体マトリックスでは、パルスレー
ザーエネルギーの変動によって生じる全飛行時間の変動が質量測定の精度を測定
する。例えば、レーザーエネルギーを故意に閾値(Ｉ0)から１．５１Ｉ0に引き上
げると、チトクロームｃでは飛行時間が約０．１％増加した(全飛行時間約２５
３μｓ)。つまり、グリセリンの場合、質量測定の精度はレーザーのアウトプッ
トエネルギーに依存する。グリセリンをマトリックスとする現行のデザインによ
るＩＲでは、質量約１５０ｋＤａまでについて質量測定精度２００−４００ｐｐ
ｍを得ることができる。３０ｋＤａ未満のアナライトについては、プロンプト抽
出ＵＶ−ＭＡＬＤＩで通常得られる値よりも精度は凡そ１桁低い。高質量領域で
は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩの精度は少なくとも２倍優れていることが判ったが、これ
はこの質量域ではＩＲ−ＭＡＬＤＩの質量分解能が増加しているためである可能
性が高い。
【０４１３】 プロンプト抽出ＩＲ−ＭＡＬＤＩの質量真度は３個の良く知られた標準品(低
質量域：アンジオテンシン(ヒト)、メリチン、牛インスリン；高質量域：チトク
ロームｃ(牛心臓)、アポミオグロビン(馬)、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ(B
acillus subtilis)を用いた外部較正によって測定した。３０ｋＤａまでの質量
域では、各１５回のシングルショットの和スペクトル５個を用いて、較正用スペ
クトルから較正係数を得、２番目のスペクトルから‘未知’物質の質量を求めた
。コハク酸及びグリセリンのマトリックス両者について、質量の絶対真度は分子
量に応じて１０2−５ｘ１０3ｐｐｍであることが判った。４０ｋＤａまでのタン
パクについては、質量真度１００−５００ｐｐｍが得られ、これはＵＶ−ＭＡＬ
ＤＩ(静止抽出)について以前に報告された値20と良く一致している。４０ｋＤａ
を超えるアナライトでは、真度は１−５ｘ１０3ｐｐｍである。
【０４１４】 (結論) 準安定断片化の程度がＵＶ−ＭＡＬＤＩより小さいことから判断して、ＩＲ−
ＭＡＬＤＩは生体分子のイオンを発生させる両テクニックの中で、より‘穏やか
’な方法と見受けられる。グリセリン又はこれと同等の物質は固体マトリックス
に比べて再現性が高いので、多くの応用において最適のマトリックスである。今
回検討した２種のレーザーの中で、Ｅｒ−ＹＡＧレーザーはＥｒ−ＹＳＧＧレー
ザーよりグリセリンをマトリックスに使った場合には僅かに性能が良く、コハク
酸を使った場合にはかなり性能が良かった。準安定断片化が少ないことから、Ｉ
Ｒ−ＭＡＬＤＩはｒｅＴＯＦモードによる高質量アナライトの分析にも特に適し
ている。遅延イオン抽出はＩＲ−ＭＡＬＤＩで良好に機能し、ＵＶ−ＭＡＬＤＩ
に匹敵する結果が得られる。
【０４１５】 (実施例３) (ＩＲ−ＭＡＬＤＩによる２本鎖ＤＮＡの検出) 本実施例では、それぞれグリセリン及びＡＴＴをマトリックスに用いたＩＲ-
及びＵＶ−ＭＡＬＤＩ ＭＳによるｄｓＤＮＡの分析について記述する。 本実施例は、ＩＲ−ＭＡＬＤＩが診断用の道具として有効に使用できることを示
す。グリセリンマトリックスのようなグリコールマトリックスを用いたＩＲ−Ｍ
ＡＬＤＩは大きな２本鎖ＤＮＡで優れた結果を与えた。これらの結果は、塩を添
加してイオン強度を調節することによって達成された。７０以上の塩基対を有す
る２本鎖アナライトをＩＲ−ＭＡＬＤＩにかけたところ、断片化は殆ど起こらず
、サブピコモル台の感度がルーチンに得られた。
【０４１６】 ９ｋＤａから５００ｋＤａ超の範囲の２本鎖ＤＮＡ分子をＭＡＬＤＩ ＴＯＦ
質量分析計で脱離させ分析した。グリセリンをマトリックスに用いたＩＲ−ＭＡ
ＬＤＩでは、大きな２本鎖ＤＮＡで塩を添加してイオン強度を調整することによ
り優れた結果が得られた。７０以上の塩基対を有する２本鎖アナライトをＩＲ−
ＭＡＬＤＩにかけたとこ、断片化は殆ど起こらず、サブピコモル台の感度がルー
チンに得られた。低質量域(約７０ｂｐまで)では、６−アザ−２−チオチミンを
マトリックスに用いたＵＶ−ＭＡＬＤＩが、比較的少数の塩基対を含む特定の２
本鎖複合体を完全な形で脱離できたるため、最も良いイオン化法であった。この
モードで、７０マーについて２本鎖型の実質的に定量的な検出が可能であった。
ＵＶ−ＭＡＬＤＩの場合には有意な断片化が起こり、その結果感度が落ち質量分
解能が低下した。 ここに記述する方法は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、特にＩＲ−ＭＡＬＤＩが大きなＤ
ＮＡ／ＤＮＡ及びＤＮＡ-タンパク複合体の分析に用い得ることを示している。
【０４１７】 (実験材料及び方法) (試料) 合成オリゴデオキシヌクレオチドはファルマシアバイオテク社(Ｕｐｐ
ｓａｌａ、スウェーデン)から入手した。２本鎖オリゴヌクレチドの作成は、個
々の相補的１本鎖を１：１の比率(典型的には５−１０ｐｍｏｌ／μｌ水)で混合
し、７５℃で２分加温し、次いで１０℃で３０分間冷却した。合成オリゴヌクレ
オチドとそれらの混合物を５ｍＭ ＥＤＴＡ及び２Ｍ酢酸アンモニウムに調整し
、エタノールと２−プロパノ-ルの１：１混合物２容量を加えて沈殿させた。試
料を水に再溶解し１０-２０ｐｍｏｌ／μｌの濃度にした。
【０４１８】 ＤＮＡプラスミドｐＢＲ３２２及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋はE. coli
細胞からキアゲンミディプレップキットを用いて供給業者のプロトコールに従っ
て精製し(キアゲン社、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ)、制限酵素で消化した。制限酵素
はニューイングランドバイオラブス社(Ｓｃｈａｌｂａｃｈ／Ｔａｕｎｕｓ、ド
イツ)より入手し、供給業者の指示に従って使用したが、ＥｃｏＲＶ消化物につ
いては牛血清アルブミンの添加は省略した。制限酵素で消化したＤＮＡを５ｍＭ
ＥＤＴＡ及び２Ｍ酢酸アンモニウムに調整し、２容量のエタノールで沈殿させ
、最後に水に再溶解して約０．５ｐｍｏｌ／μｌの濃度にした。全ての制限酵素
消化物はアガロースゲル電気泳動で確認した。 ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析 陽イオンＩＲ−ＭＡＬＤＩ実験は３．５ｍの等価飛行距
離を有する自家製のリニアー／シングルステージリフレクトロン飛行時間型(Ｔ
ＯＦ) 質量分析計(リフレクトロンモード)を用いて行った。スプリット抽出源中
約１６−２５ｋＶの総電位差によりイオンを加速した。陰極(質量に応じて約２
０−４０ｋＶの総イオン衝撃エネルギー)の前方に設置した変換ダイノードつき
ベネチアンブラインド型二次電子増倍管をイオン検出に用いた。特別に言及しな
いかぎり、実験は全て静止イオン抽出によるリフレクトロンモードで実施した。
２．９４μｍで発光するＥｒ−ＹＡＧレーザー(スペクトルム社、Ｂｅｒｌｉｎ
、ドイツ；ｒ＝８０−９０ｎｓ、各照射間のエネルギー安定性約±２−４％)を
使用した。試料の上にレーザーパルスを直径約１４０μｍのスポットに４５°の
角度で集光した。装置は本文書の別項に記載のとおりである(又Berkenkamp et a
l., Rapid commun. Mass Spectrom. 1997, 11, 1399-1406を参照)。ＩＲ−ＭＡ
ＬＤＩでは、典型的にはステンレススチールのターゲット上で０．５−１μＬの
グリセリンマトリックスを約０．５−１μＬの水溶性アナライト(典型的には０
．５ｐｍｏｌ／μｌ)と混合してアナライト対グリセリンのモル比を１０-7−１
０-8とした。ｄｓＤＮＡを安定化させるために、酢酸アンモニウム又はトリス−
塩酸(ｐＨ８．０)を最終濃度約４０ｍＭになるように添加した。試料を質量分析
計に導入する前に、１０-2−１Ｐａの粗い真空中で水を蒸発させて除いた。残余
の水分を高真空下でより制御された条件で徐々に蒸発させるために、試料を載せ
たターゲットを液体窒素に投入して冷却した後、質量分析計に挿入した。
【０４１９】 陽イオンＵＶ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルはＶｉｓｉｏｎ２０００(サーモ
アナリシス社、Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、英国)質量分析計の試作品で
リニアーＴＯＦモードで遅延イオン抽出(ＤＥ)を用いて測定した。イオンをイオ
ン源で２０ＫｅＶに加速し、次いで二次電子増倍管の前の変換ダイノードで更に
(イオン質量に応じて)１０−１９ＫｅＶの電位差を通して後段加速した。この装
置は文献に詳細に記載されている(Gruic-Sovolj et al. J. of Biol. Chem. 199
7, 272, 32084-91)。ＵＶ−ＭＡＬＤＩマトリックスは、５０ｇ／ｌの３−ＨＰ
Ａの２０％アセトニトリル溶液０．７μｌに添加したアンモニウム基置換陽イオ
ン交換ビーズ(Norhoff et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1992, 6, 771-6)
約１０個、又は１０ｇ／ｌ ＡＴＴ + １０ｍＭクエン酸アンモニウムの５０
％アセトニトリル溶液１μｌより成る。いずれも場合も、次いで０．５−１μｌ
のアナライト水溶液(１０−２０ｐｍｏｌ／ｌ)をマトリックスと混合した。必ず
しも必要ではないが、３−ＨＰＡで作成した試料には高濃度のアナライトも使用
して、ＡＴＴを使って作成した試料と直接比較できるようにした。試料は冷却気
流中で乾燥した。
【０４２０】 (結果) ＩＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ ここに示すように、グリセリン又は類似の組成物をマトリックスとし、ＩＲ−
ＭＡＬＤＩで測定するという組み合わせは、大きな核酸の分析には優れた結果の
得られる組み合わせとなる。２０００超のヌクレオチドを含む１本鎖核酸をうま
く検出することができた。純粋なグリセリンマトリックス中に塩が無いため、及
びＩＲレーザーに曝露されるためにＤＮＡの２本鎖の安定性が失われることが、
アナライトが１本鎖として主に観察される理由であろうと思われる。
【０４２１】 本実施例では、２本鎖ＤＮＡは塩の添加により溶液中での安定性が保たれてい
る。特に、酢酸アンモニウム又はトリス−塩酸を使用したが、後者はｐＨ８．０
では溶液中で約５０％がプロトン付加１級アミンとして存在している。
【０４２２】 純粋なグリセリンをマトリックスとして使用すると、僅かに溶解した個々の１
本鎖７０マーがスペクトル上で基準ピークを生じる。酢酸アンモニウム又はｐＨ
８．０のトリス−塩酸を作成試料に添加すると、２本鎖ＤＮＡがスペクトル上に
基準ピークを生じる。１本鎖の整数質量の部位に来るシグナルのかなりの部分は
多分２重電荷を有するｄｓ部分より成ると考えられる。非特異的３量体に相当す
るシグナルは存在しない。即ち、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ用作成試料に塩を添加するこ
とによって、特定の２本鎖ＤＮＡを検出できることがこのように明らかになった
。酢酸アンモニウム又はトリス−塩酸を含有する２種の試料から得られたスペク
トル間に有意な差はない。
【０４２３】 塩で安定化させたｄｓ−ＤＮＡはそれでもなお酸性による変性を起しやすい。
１つの実験では、７５０ｂｐの断片を先ずトリス−塩酸で安定化させ、その結果
単電荷の２本鎖分子種からの強いシグナルが得られた。これと対照的に、ＩＲ−
ＭＡＬＤＩマトリックスとして広く使用されているコハク酸で同じ試料をターゲ
ット上で酸性化すると、１本鎖の単電荷及び２重電荷イオンのみが観察される。
３重電荷の２本鎖に相当するシグナルが明瞭に認められた。この結果は、コハク
酸添加効果は真の変性であり、荷電状態の全体的増加ではないことを示している
。即ち、ｄｓ−ＤＮＡは作成試料中で物理化学的手段によって安定化させること
も不安定化させることもできる訳である。使用した試料は実際には、プラスミド
の制限酵素消化で生成した、観察された７５０ｂｐ分子種及び３ｋｂｐを遥かに
超える断片１個の等モル混合物であった。大きいほうの分子種は検出されなかっ
たが、これはこの質量(＞２．０ＭＤａ)のイオンが大きなＤＮＡのＩＲ−ＭＡＬ
ＤＩにおける現行の質量限度約７００ｋＤａを超えるからである。脱離及びイオ
ン加速時に１本鎖にならず、飛行管中で解離するｄｓ−ＤＮＡも同様に検出する
ように、スペクトルは遅延イオン抽出によるリニアーＴＯＦモードで測定した。
リフレクトロンＴＯＦ設定ではこれは検出されないであろう。グリセリンマトリ
ックスで典型に見られることであるが、１００ｋＤａを超える試料をリニアーＤ
Ｅ−ＴＯＦモードで測定すると、観察されたバックグラウンドシグナルは質量の
減少とともに著しく増加した。
【０４２４】 イオン強度を増加することによって２本鎖が安定化するというこれらの観察を
発展させ、２８０ｂｐ、３６０ｂｐ、９２０ｂｐ及び１．４０ｋｂｐの断片を有
する制限酵素消化プラスミドＤＮＡに応用した。３個の小さな２本鎖分子種に相
当する質量１７５ｋＤａ、２２３ｋＤａ、及び５６５ｋＤａのピークがスペクト
ルで観測された。８７．５ｋＤａ、１１２ｋＤａ、及び２８３ｋＤａに観測され
るピークは１本鎖の整数質量に相当する。これらの結果から、２重電荷のｄｓイ
オンがこれらのシグナルの主要部分ではないとしてもかなりの部分を占めている
ことが示された。最大の断片である１．４０ｋｂｐの単一／２重荷電のｄｓイオ
ンの非常に小さなシグナルが質量４３２ｋＤａの部位に認められる。このｄｓ分
子種の単一荷電の８６４ｋＤａのｍ／ｚ値は、現行の検出限界である約７００ｋ
Ｄａを超える値である。安定化剤、特にトリス−塩酸をグリセリンで作成した試
料に添加すると、純粋なグリセリンで得られたスペクトルと比べてピークが広が
り、これは高質量側へのテールの広がりとして観察される。質量分離能は２分の
１に低下して、中程度のサイズの分子種ではリフレクトロンＴＯＦで約２５にな
るが、一方９２０ｂｐ断片及び７０マーｄｓＤＮＡの質量分解能は約５０である
。
【０４２５】 低質量域のｄｓイオンのピークが急峻に上昇するという観察は、ｓｓ分子種の
シグナルについて既に観察され本文書に示したように、準安定崩壊が非常に限ら
れていることの証拠である。準安定断片化が殆ど又は全く無いことは、ＵＶ−Ｍ
ＡＬＤＩ−ＭＳで核酸を分析した場合と著しく対照的であり、後者の場合は準安
定(及び線源での)フラグメンンテーションが制限因子となっており、大きなＤＮ
Ａ断片の分析において特に制限となっている。
【０４２６】 ｄｓ検出の特異性を示す実験も行った。もしシグナルのかなりの部分が、溶液
中で、又は脱離過程で生成した１本鎖がガス相で非特異的複合体を形成したこと
によるものであるならば、非特異的複合体、例えば２８０マーと３６０マーのそ
れぞれ１本鎖同志の複合体、が観測されたはずである。このような非特異的複合
体はタンパクではしばしば観測されるが、ＤＮＡスペクトルには観測されなかっ
た。したがって、元のアナライト溶液中に存在するｄｓ−ＤＮＡはＭＡＬＤＩ過
程を通じて大部分そのままの形で残っていることになる。
【０４２７】 ここに示すように、安定剤としての塩がなくても純粋なグリセリンから完全な
状態のｄｓ−ＤＮＡを脱離させることも可能である。安定化を行うことなく完全
な形の分子を検出できるかどうかを、広い質量範囲のＤＮＡ断片について検討し
た。ＤＮＡ試料の状態がこれらの実験には極めて重要であった。新しく作成した
ＤＮＡの試料のみで２本鎖のイオンが再現性良く検出された。塩で安定化させた
試料とは対照的に、レーザーフルエンスの調節には注意を要した。アナライトイ
オン検出の閾値フルエンス(１．２Ｈ0)では、１９０ｂｐ断片は主にｄｓイオン
を生じた。フルエンスを１．５Ｈ0に増加するとｓｓ成分のみが検出され、２個
の１本鎖が部分的に分離された。したがって、レーザー照射を調節することだけ
で大きなＤＮＡの２本鎖を変性させることができる。純粋なグリセリンから脱離
可能な最大のｄｓ−ＤＮＡは７５０ｂｐ断片で、また最小の断片は１００ｂｐで
あった。２本鎖のアナライトを脱離させたければ、一般に断片が小さければ小さ
いほど、レーザーフルエンスをＨ0に近づけなければならない。１００ｂｐの断
片ならば厳密に閾値のフルエンスが必要であり、またこれに加えてイオン抽出の
ために電界強度を低くしなければならない(≦１５０Ｖ／ｍｍ)。５００ｂｐ及び
７５０ｂｐのｄｓ断片を完全な形で脱離させる場合には、それぞれ１．５Ｈ0及
び２Ｈ0という高いフルエンスを用いることができた。
【０４２８】 (ＵＶ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ) ６０塩基対の２本鎖ＤＮＡをＩＲ−ＭＡＬＤＩで分析する試みは、ｄｓ型の検
出に関しては再現性がなく、またより小さなアナライトでは特異的ｄｓイオンは
全く検出されなかった。したがって、６−アザ−２−チオチミン(ＡＴＴ)マトリ
ックスを用いたＵＶ−ＭＡＬＤＩを使って比較的小さなｄｓ−ＤＮＡの検出を行
った。Lecchi & Pannel(Lecchi et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1995, 6,9
72-75)が報告したように、ｄｓ分子種のシグナルは最小では完全に相補的な合成
１２マーまでの低分子種で得られた。対照的に、１２マーとこれに完全に相補的
な８マーとの等モル混合物はｄｓイオンのシグナルを全く発生せず、これがｄｓ
−ＤＮＡを完全な形で脱離させるためのサイズの凡その下限であることを示して
いる。ＡＴＴマトリックスを用いたリフレクトロンＴＯＦではスペクトルは得ら
れないことに注意する必要があるが、これはリニアーＴＯＦモードで既に見られ
ているように、断片化が過大になるためであろう。
【０４２９】 ＡＴＴマトリックスを用いたＵＶ−ＭＡＬＤＩによるｄｓイオン検出の上限も
このシステムで検討した。ＩＲ−ＭＡＬＤＩで検討した２種の完全に相補的な合
成７０マーはＡＴＴ／ＵＶ−ＭＡＬＤＩのスペクトルでも同様にｄｓイオンのシ
グナルを生じた。３−ＨＰＡをマトリックスとして用いた場合には、互いに辛う
じて分離される２つの個々の７０マーのシグナルがスペクトルで優勢であった。
この分離は、同じ試料のグリセリン／ＩＲ−ＭＡＬＤＩスペクトルで見られるも
のとほぼ同じであった。この実験から、大きなアナライトの検出がＡＴＴで可能
であること、また少なくとも室温で試料を作成した場合にはｄｓ−ＤＮＡのシグ
ナルは３−ＨＰＡでは得られないことが確認される。４３．５ｋＤａのシグナル
が部分的に又は完全に非特異的なホモダイマーではなく、完全な形のｄｓ−ＤＮ
Ａを表わしていることの強力な証明を得るために、合成８０マーを相補的な７０
マー(連続する６２ヌクレオチドに亘って相補性を有する)又は非相補的な７０マ
ーとアニールさせ、ＡＴＴ／ＵＶ−ＭＡＬＤＩで分析した。スペクトルから、相
補的な７０／８０マー混合物のみがｄｓシグナルを生じ、一方２個の非相補的な
１本鎖はスペクトル上で基準ピークを形成することが明らかである。これらの結
果はまた、ｄｓ成分が基準ピークとなるスペクトルでは、その半分の質量の場所
に現れる小さなシグナルは単電荷の個々の１本鎖ではなく２重荷電のｄｓＤＮＡ
を表わすことを示している。したがってＡＴＴは、高質量域をも含めＵＶ−ＭＡ
ＬＤＩによるｄｓ−ＤＮＡの検出において、高度の選択性を有するマトリックス
である。
【０４３０】 (考察) 本実施例の結果は、２本鎖ＤＮＡのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析が、約１２ｂｐから
９２０ｂｐまでのサイズ幅のアナライトについて可能であることを示す。７０ｂ
ｐ以下のサイズ幅の断片にはＡＴＴをマトリックスとするＵＶ−ＭＡＬＤＩ−Ｍ
Ｓを用い、７０ｂｐ以上のＤＮＡ分子にはグリセリンをマトリックスとして塩を
添加したＩＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた。ＡＴＴを用いるＵＶ−ＭＡＬＤＩ−
ＭＳでは７０マーレベルの場合試料の消費がかなり多いため(１０−２０ｐｍｏ
ｌ)、これより大きいアナライトにこの方法を用いることはできない。生物起源
の試料としては、これはかなりの大量だからである。感度がこのように低い主な
理由は、イオン源における断片化が著しいためであり、こらはＡＴＴマトリック
スを用いる全てのスペクトルで観察される。２本鎖分子種の断片化では、１本鎖
への解離よりも１個又は複数の塩基の消失及び／又はバックボーンの切断が主で
あった。２本鎖のアナライトの断片化の程度は１本鎖のアナライトで観察された
ものと同程度であった。これは全てのヌクレオチドが塩基対を形成している筈の
２本鎖７０マーでも観察された。これらの結果は、もしＤＮＡが最小限のイオン
強度で維持されているならば、その非共有結合性のｄｓ構造はＵＶ−ＭＡＬＤＩ
−ＭＳで共有結合の切断を引き起こす条件下でも安定であることを示している。
【０４３１】 これとは対照的に、グリセリンを用いるＩＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは断片化は
殆ど観察されなかった。大きなＤＮＡ分子でさえ、１ｍｓ以上の飛行時間のリフ
レクトロンＴＯＦモードによる分析で準安定断片化を示さなかった。このことは
一般的に１本鎖及び２本鎖型のアナライトに当てはまる。加えて、純粋なグリセ
リンをマトリックスに用いた場合、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳの過剰なレーザーエ
ネルギーは、共有結合を切断するよりもむしろ不安定になった２本鎖の変性を起
す。
【０４３２】 ｄｓ−ＤＮＡは塩を添加することにより、即ちイオン強度を上げることにより
水溶液中で安定化する。この安定化は、リン酸バックボーンの近くに陽イオンが
濃縮し、それによってバックボーンの陰性荷電を部分的に中和して２本鎖間の静
電的な反発力を低下させることによって得られる。ここに述べた結果、及びＤＮ
Ａがグリセリンにはほぼ不溶性であるという事実は、分析計の真空中で一定の時
間経った後でも、ＤＮＡがグリセリン中で陽イオン濃縮に充分な量の溶媒水を殻
として保持していることを示唆する。
【０４３３】 アナライト中の２本鎖領域の長さと、ＡＴＴをマトリックスとするＵＶ−ＭＡ
ＬＤＩ−ＭＳにおけるｄｓ−ＤＮＡの程度との間には相関が見られた。このこと
は、ｄｓ−ＤＮＡの分析においてＵＶ−ＭＡＬＤＩが高い特異性を有することの
例証となる。自己相補的なＲＮＡは対応するＤＮＡよりも安定な２本鎖を形成す
るが、１２マーレベルのこのＲＮＡが同じ長さのＤＮＡよりもｄｓ型のシグナル
が大きい事実が、この特異性を裏付ける。
【０４３４】 ＵＶ−及びＩＲ−ＭＡＬＤＩによってｄｓ−ＤＮＡの特異的分析が可能である
という事実は、これらの方法がＤＮＡとタンパク間の非共有結合性複合体の研究
にも使用できるであろうことを示唆している。このような研究ができるための前
提条件として、ＤＮＡを２本鎖型で保持しておけることが必要である。ＩＲ−Ｍ
ＡＬＤＩ−ＭＳはサブピコモル台の感度を有するので、高感度が要求される診断
法での使用などにおいて最適の方法である。更に、ここに示したように、ピエゾ
電気ピペット(公開国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９８／２０１６６号及び許可済み同時
係属米国出願第０８／７８７，６３９号を参照)を用いて試料容量を微量化する
ことによって感度を少なくとも１００倍増大させることが可能である。ｄｓ−Ｄ
ＮＡのスペクトルを再現性良く得るためにトリス−塩酸又は酢酸アンモニウムの
添加が要求されることはむしろ利点である。殆どの核酸／タンパク複合体の安定
性にはｐＨと塩を調整した環境が必要だからである。核酸、ＤＮＡ三重らせん間
の相互作用、及び修飾ヌクレオチドと天然ＤＮＡ間のハイブリッド形成は更なる
応用の分野である。
【０４３５】 (実施例４) (波長１０．６μｍの電磁波を発射するレーザーを用いるＩＲ−ＭＡＬＤＩと
、３μｍの電磁波を発射するレーザーを用いるＩＲ−ＭＡＬＤＩとの比較) 波長域１０μｍで発光する密封型ＴＥＡ−ＣＯ2）レーザーが市販されており
、サイズ、価格、及び操作の簡便さはＵＶ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳに一般に用いられ
ている窒素ガスレーザーとほぼ同じである。これらのレーザーのＩＲ−ＭＡＬＤ
Ｉ−ＭＳにおける性能データを検討した。これは質量分解能と精度の向上のため
の遅延イオン抽出、及び特定のＩＲの応用のためのスペクトルを含む。
【０４３６】 波長１０．５９μｍの密封型ＴＥＡ−ＣＯ2）レーザー(μ−ＴＥＡ，レーザー
サイエンス社、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＭＡ)を自家製ＴＯＦ装置とリニアー(２．２
ｍ)及びリフレクションポート(３．５等価飛行距離)で連結した。比較実験では
、同装置に付属するＥｒ：ＹＡＧレーザー(λ＝２．９４μｍ)又は周波数が３倍
のＮｄ：ＹＡＧ(λ＝３５５ｎｍ)を用いることができる。
【０４３７】 結果：波長１０．６μｍではフマール酸及びグリセリンがマトリックスとして
最も性能が良かった。フマール酸は＜４０ｋＤａの質量域で質量分解能がより優
れ、特に静電イオン抽出でそうでった。グリセリンは高質量域での性能が最も良
く、優れた再現性を示した。分析感度をペプチドとフマール酸マトリックスの組
み合わせについて検討した。僅か数フェムトモルの試料負荷及びアナライト対マ
トリックスのモル比≧１０-7）で十分スペクトルが得られた。
【０４３８】 ３μｍのＩＲ−ＭＡＬＤＩでは準安定崩壊が少ないこと、質量＞１００ｋＤａ
のタンパクでは特にそうであることを述べたが、１０．６μｍでも同様の観察が
得られた。リフレクション型質量分析計と組み合われば、測定可能な質量幅が更
に広がる。例えば、グリセリンをマトリックスとするリフラクションモードで１
５０ｋＤａのマウスモノクローナル抗体(ＩｇＧ)について質量分解能１２５が得
られた。質量１．３５ＭＤａまでの抗体のホモオリゴマーがこのスペクトルで明
瞭に確認できた。
【０４３９】 ３μｍのＵＶ−及びＩＲ−ＭＡＬＤＩと同様に、遅延イオン抽出はペプチドの
分解能をかなり向上させる。グリセリン及びフマール酸をマトリックスとするサ
ブスタンスＰのスペクトルで、それぞれ４５００及び５０００−７０００の質量
分解能が得られた。スペクトル中の中間生成物及びダブルピークにより同位体の
分布が若干妨害を受け、その結果同じ装置でのＵＶ−又は中赤外レーザーシステ
ムと比較して全体としての性能が落ちた。このピークの“断片化”は(ｒ)2）レ
ーザーの不均一なビームプロファイルのためであると暫定的に考えている。しか
しそれでもペプチドについて低ｐｐｍ台の質量精度を得るのに十分な質量分解能
を有している。例えば、アンジオテンシンとレニンを内部標準として、サブスタ
ンスＰの質量を僅か１０ｍＤａの誤差で測定することができた。
【０４４０】 ミオグロビン(馬)をゲルで分離した後、高分子膜(Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ)に
エレクトロブロッティングした試料についてのＩＲ−ＣＯ2−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ
を検討した。コハク酸マトリックスを使用した。スペクトルの質を、３μｍのＥ
ｒ：ＹＡＧレーザーを用いて同じ膜から得られたスペクトルの質と比較した結果
、後者の方が良好のようであった。
【０４４１】 グリセリンマトリックスを用いた質量３００ｋＤａ超の２本鎖ＤＮＡの分析を
５１５ｂｐのＰＣＲ産物についても行った。波長３μｍ及び１０．６μｍで行っ
たＩＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳは非常に良く似た特徴を有していたが、応用の分野に
よっては３μｍの波長がより好ましいこともあろう。
【０４４２】 (実施例５) (大きな核酸のＩＲ−ＭＡＬＤＩ) 波長３μｍで発光するレーザーを用いた約２０ｋＤを超すタンパクのＭＡＬＤ
Ｉ−ＭＳはＵＶ−ＭＡＬＤＩより脱離イオンの断片化が有意に少なく、グリセリ
ンを(液体)マトリックスとして使用した場合特に少ない。大きな核酸の分析のた
めに、異なる波長のレーザー及び種々のマトリックスの検討を行った。グリセリ
ンマトリックスとＥｒ−ＹＡＧレーザー(２．９４μｍ)の組み合わせは、核酸の
完全な形での脱離及びイオン化を起す穏やかな方法であることが判った。実験に
はシングルステージリフレクトロン飛行時間(ｒｅｆＴＯＦ)質量分析計を用い、
加速電位差１６ｋＶを分割イオン抽出源として、プロンプトイオン抽出又は遅延
イオン抽出操作により行った(S. BerkenKamp, C. Menzel, M. Karns and F. Hil
lenkamp, Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 1399, (1997))。Ｅｒ：ＹＡＧレ
ーザー(λ＝２．９４μｍ、γ＝８５ｎｓ、スペクトルム社、Ｂｅｒｌｉｎ、ド
イツ)。試料作成の前に、グリセリンマトリックスを等容量のＨ+−陽イオン交換
ビーズ懸濁液とインキュベートした。
【０４４３】 プラスミドＤＮＡの制限酵素消化物(１０４５ｂｐ及び１９１３ｂｐ断片、３
２２ｋＤａ及び５９２ｋＤａ)で実証されたように、グリセリンマトリックスを
用いるＩＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳは約２０００ヌクレオチドのオリゴマーに使用す
ることができる。測定した全ての大きなＤＮＡにおいて、イオンシグナルの質量
分離能(ＦＷＨＭ)は約５０であり、またイオン質量には比較的依存しないようで
あった。ＤＮＡのＩＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳは約７００ｋＤａの質量の測定に使用
することができた。大きなＲＮＡも、in vitro合成した１２０６ヌクレオチド転
写物(約３８８ｋＤａ)で実証されているように、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析
することができる。この質量までは、ＲＮＡ及びＤＮＡはほぼ同等の安定性を示
す。測定した全ての高質量ＤＮＡ及びＲＮＡの試料について、質量の真度は配列
より算出された値の０．５％及び１．０％であった。２１８０ヌクレオチド断片
の質量でさえ、０．６％の真度で測定することができた。質量既知のＩｇＧモノ
クローナル抗体及びそのオリゴマーのシグナルを用いて質量較正を行った。グリ
セリンをマトリックスに用いる大きな核酸のＩＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳの感度を約
５１５ｂｐのＰＣＲ産物について調べた結果、低フェムトモル台であった。試料
総負荷量３００ａｍｏｌでもまずまずの質のスペクトルを得ることができた。上
に報告した結果は全て限られた精製の努力で得られた試料について得られたもの
である。制限酵素消化断片については１段階精製(沈殿)で充分であると思われた
。ＲＮＡについては、これに加えて逆相カラムを準備した。
【０４４４】 修飾は当業者に明白なので、この発明はここに付加した請求項によってのみ限
定されることを意図する。
【０４４５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ〜１Ｃ】 合成ＤＮＡ ７０マーの質量スペクトル 図１Ａは、紫外マトリックス補助レーザー脱着イオン化(ＵＶ−ＭＡＬＤＩ)及び
遅延型抽出及び３−ヒドロキシピコリン酸(３ＨＰＡ) マトリックスを用いる直
線型飛行時間(ＴＯＦ)機器による検出(単一発射質量スペクトルの２０回合計)を
示し；図１Ｂは、遅延型抽出及び３ＨＰＡマトリックスを用いるＵＶ−ＭＡＬＤ
Ｉリフレクトロン(ｒｅｆ)ＴＯＦスペクトル(単一発射質量スペクトルの２５回
合計)を示し；図１Ｃは、遅延型抽出及びグリセリンマトリックスを用いるＩＲ
−ＭＡＬＤＩ−ｒｅｆＴＯＦスペクトル(単一発射質量スペクトルの１５回合計)
を示す。
【図２Ａ〜２Ｄ】 ２．９４μｍの波長及びグリセリンマトリックスを用い
るＩＲ−ＭＡＬＤＩ ｒｅｆＴＯＦ質量スペクトル スペクトルは以下のとおりである：図２Ａ−合成ＤＮＡ ２１マー(単一発射ス
ペクトルの１０回合計)；図２Ｂ−２８０マー(８７ ｋＤＡ)、３６０マー(１１
２ ｋＤａ)、９２０マー(２９５ ｋＤａ)及び１４００マー(４３３ ｋＤａ)
の制限酵素生成物を含むＤＮＡ混合物(単一発射スペクトルの１０回合計)；図２
Ｃ−ＤＮＡ混合物；１３０マー(およそ４０ ｋＤａ)、６４０マー(１９８ ｋ
Ｄａ)及び２１８０マー(６７４ ｋＤａ)の制限酵素生成物(単一発射スペクトル
の２０回合計)；図４Ｄ−ＲＮＡ １２０６マー(およそ３８７ ｋＤａ) (単一
発射スペクトルの１５回合計)。縦座標のスケーリングは相互に共通である。
【図３Ａ〜３Ｃ】 ５１５マー二本鎖ＰＣＲ ＤＮＡ生成物のスペクトル 試料の全量を以下のとおりに入れた：図３Ａ−３００エフモル(単一発射スペク
トル) ；図３Ｂ−３エフモル(単一発射スペクトル) ；図３Ｃ−３００アットモ
ル(単一発射スペクトルの２５回合計)。ＩＲ−ＭＡＬＤＩ ｒｅｆＴＯＦを用い
て得られたが、そこにおいてはレーザーはグリセリンマトリックスを用いて２．
９４μｍの波長で放射した。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年７月５日（２０００．７．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２２６】 赤外マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析
法を約−８０℃から２０℃の範囲の温度で実施する、請求項２０３の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年６月６日（２００１．６．６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４５】 目標核酸配列において突然変異の存在又は不在を確認する方法は、例えば、目
標核酸配列を含む核酸分子において一組の連結反応遊離体及びＤＮＡリガーゼと
の少なくとも一回のハイブリッド形成を実施すること；その反応生成物及び赤外
線を吸収する液体マトリックスを含む組成物を作成すること；そしてその組成物
をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により分析することにより実施することができる
。そのような方法を用いて、その組成物中における連結反応生成物の検出が目標
核酸配列における突然変異の不在を確認するが、一方においてはその組成物中に
おける連結反応遊離体の組のみの検出が目標核酸配列における突然変異の存在を
確認する。上で公開したように、連結反応体の存在を検出する方法はまた、一組
の連結反応遊離体及び熱安定性ＤＮＡリガーゼと、目標核酸配列を含む核酸分子
において少なくとも一回のハイブリッド形成を実施すること；この反応生成物及
び赤外線を吸収する液体マトリックスを含む組成物を作成すること；そして組成
物中にある連結反応生成物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により確認し、それに
より核酸配列中の目標核酸の存在を検出することにより、目標ヌクレオチド又は
目標核酸を検出するのに有用であり得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２１５】 したがって、目標生体高分子のサブユニットの配列を決定する方法もまた提供
する。目標生体高分子の配列は、その生体高分子をその生体高分子の端から一方
向に切断する試薬に接触させ、入れ子の群の欠失フラグメントを生成させること
；入れ子の群の生体高分子断片と、赤外線を吸収するところの、液体マトリック
スとを含む組成物を作成すること；IR-ＭＡＬＤＩ質量分析法によりその組成物
中の各生体高分子断片の分子量値を測定すること；そしてその群の生体高分子断
片の分子量値から核酸の配列を決定すること、により決定され得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA13 QA17 QA19 QQ03 QQ06 QQ07 QQ10 QQ12 QQ42 QQ52 QQ58 QQ67 QQ70 QQ79 QR08 QR14 QR16 QR31 QR41 QR42 QR55 QR56 QR57 QR62 QR63 QR66 QR83 QR84 QS25 QS34 QX02

Claims (226)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸分子のマトリックス補助レーザー脱着／イオン化(ＭＡ
    ＬＤＩ)を質量分析法による分析のために行うにあたり、その工程が、 (a)核酸及び液体マトリックスを含有する溶液を基質上に析出させ、それによ
    り核酸／液体マトリックス溶液の均一な薄層を形成させること；そして (b)その基質を赤外線で照明させ、それにより溶液中の核酸を脱着及びイオン
    化させることより成る方法。
  2. 【請求項２】 更に、核酸の質量の測定をＭＡＬＤＩにより測定することよ
    り成る、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 更に、核酸の質量の測定をＭＡＬＤＩにより測定し、それに
    より試料中の核酸の存在を検出することより成る、請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 その液体マトリックスが以下の性質：i)核酸適合性の溶液と
    混合し得ること、ii)真空に安定であること、iii)単独で又は核酸適合性の溶液
    と混合して薄層のミクロ‐からナノ-リットル容量のマトリックスを分注するの
    に適切な粘度を持つことの少なくとも一つを有する、請求項１から３の何れか１
    つの方法。
  5. 【請求項５】 その液体マトリックスが照明、脱着及びイオン化工程の間に
    蒸発しないように十分に非揮発性である、請求項１から３の何れか１つの方法。
  6. 【請求項６】 その液体マトリックスが冷却下及び／又は加圧下でガラスを
    形成し得る、請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 そのマトリックスが糖、単糖、多糖より成る、請求項１の方
    法。
  8. 【請求項８】 そのマトリックスがポリグリセリン、スクロース、マンノー
    ス、ガラクトース、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチロー
    ルプロパン、ペンタエリトリトール、デキストロース、メチル配糖体又はソルビ
    トール、スクロース、マンノース、トリエタノールアミン、乳酸、３-ニトロベ
    ンジルアルコール、ジエタノールアミン、ＤＭＳＯ、ニトロフェニルオクチルエ
    ーテル(３-ＮＰＯＥ)、２，２’−ジチオジエタノール、テトラエチレングリコ
    ール、ジチオトレイトール／エリトリトール(ＤＴＴ／ＤＴＥ)、２，３−ジヒド
    ロキシ−プロピル−ベンジルエーテル、α−トコフェロール及びチオグリセリン
    より成る、請求項１の方法。
  9. 【請求項９】 その液体マトリックスが赤外線を吸収する置換基の少なくと
    も一つを含有する、請求項１の方法。
  10. 【請求項１０】 その置換基が、ニトロ、スルホニル、スルホン酸、スルホ
    ンアミド、ニトリル、カルボニル、アルデヒド、カルボン酸、アミド、エステル
    、酸無水物、ケトン、アミン、ヒドロキシル、芳香環及びジエンより成る群から
    選ばれる、請求項９の方法。
  11. 【請求項１１】 その液体マトリックスが、アルコール、カルボン酸、一級
    又は二級アミド、一級又は二級アミン、ニトリル、ヒドラジン、及びヒドラジド
    より成る群から選ばれる、請求項１の方法。
  12. 【請求項１２】 そのアルコールが、グリセリン、１，２−又は１，３−プ
    ロパンジオール、１，２−、１，３−又は１，４−ブタンジオール及びトリエタ
    ノールアミンより成る群から選ばれる、請求項１２の方法。
  13. 【請求項１３】 そのカルボン酸が、乳酸、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酪
    酸、吉草酸、ヘキサン酸及びそれらのエステルより成る群から選ばれる、請求項
    １１の方法。
  14. 【請求項１４】 そのアミドが、分岐するか又は分岐していない、アセトア
    ミド、プロパンアミド、ブタンアミド、ペンタンアミド及びヘキサンアミドより
    成る群から選ばれる、請求項１１の方法。
  15. 【請求項１５】 そのアミンが、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチル
    アミン、ヘキシルアミン、ヘプチルアミン、ジエチルアミン及びジプロピルアミ
    ンより成る群から選ばれる、請求項１１の方法。
  16. 【請求項１６】 その液体マトリックスが少なくとも二つの液体より成り、
    その各々が少なくとも一つの性質を授ける、請求項４の方法。
  17. 【請求項１７】 その液体マトリックスが添加物より成る、請求項１の方法
    。
  18. 【請求項１８】 その添加物が、分析に用いるレーザー波長において高い吸
    光係数を有する化合物、液体マトリックスを酸性化する添加物、液体マトリック
    スと核酸のリン酸バックボーン間の塩生成を最少にする添加物より成る群から選
    ばれる、請求項１７の方法。
  19. 【請求項１９】 その添加物がマトリックス組成物のイオン強度を増加させ
    る、請求項１７の方法。
  20. 【請求項２０】 工程(a)の前に、液体マトリックスと核酸のリン酸バック
    ボーン間の塩生成を最少にするように処理する、請求項１０の方法。
  21. 【請求項２１】 その液体マトリックスが蒸留又はイオン交換により処理さ
    れる、請求項１の方法。
  22. 【請求項２２】 その液体マトリックスが更に精製により処理される、請求
    項１の方法。
  23. 【請求項２３】 その液体マトリックスがグリセリン、乳酸又はトリエタノ
    ールアミンよりなる群から選ばれる、請求項１の方法。
  24. 【請求項２４】 その液体マトリックスがグリセリンであり、最終的なアナ
    ライト対グリセリンのモル比が約１０-4から約１０-9である、請求項２３の方法
    。
  25. 【請求項２５】 その液体マトリックスがグリセリンであり、核酸の質量が
    約１０4から約１０6Ｄaの範囲にありそしてそのグリセリンを工程(a)の前にイオ
    ン交換に付す、請求項１の方法。
  26. 【請求項２６】 その核酸がＤＮＡである、請求項１の方法。
  27. 【請求項２７】 そのＤＮＡが約２０００より少ないか又は同等の塩基から
    成る、請求項２６の方法。
  28. 【請求項２８】 その核酸がＲＮＡである、請求項１の方法。
  29. 【請求項２９】 そのＲＮＡが約１２００より少ないか又は同等の塩基から
    成る、請求項２０の方法。
  30. 【請求項３０】 その核酸がＰＮＡより成る、請求項１の方法。
  31. 【請求項３１】 その核酸が二本鎖核酸より成る、請求項１の方法。
  32. 【請求項３２】 その核酸が一本鎖核酸より成る、請求項１の方法。
  33. 【請求項３３】 その赤外線が約２．５μｍから約１２μｍの範囲にある波
    長を持つ、請求項１の方法。
  34. 【請求項３４】 その線パルスが約５００ｐｓから約５００ｎｓの範囲にあ
    る幅を持つ、請求項１の方法。
  35. 【請求項３５】 そのパルス持続時間が２００ｎｓ以下である、請求項１の
    方法。
  36. 【請求項３６】 そのパルス持続時間が１００ｎｓ以下である、請求項３５
    の方法。
  37. 【請求項３７】 その赤外線がＣＯレーザー、ＣＯ2レーザー、Ｅｒレーザ
    ー及び約２．５μｍから約１２μｍの範囲で放射する光学パラメトリック振動子
    レーザーより成る群から選ばれる光源から発生される、請求項１の方法。
  38. 【請求項３８】 その試料が約１０ピコモル以下の核酸を含有する、請求項
    １の方法。
  39. 【請求項３９】 その方法の全部又は一部が自動化されている、請求項１の
    方法。
  40. 【請求項４０】 その試料が約２０℃以下であるところの温度に冷却されて
    いる、請求項１の方法。
  41. 【請求項４１】 その試料が約２０℃より上で且つ８０℃より下であるとこ
    ろの温度に加熱されている、請求項１の方法。
  42. 【請求項４２】 そのマトリックスと試料の混合物が冷却され、それにより
    マトリックスがガラスを形成する、請求項１の方法。
  43. 【請求項４３】 そのガラスがガラス性水である、請求項１の方法。
  44. 【請求項４４】 そのマトリックスがグリセリンより成り且つそのグリセリ
    ンと試料の混合物が冷却され、それによりそのグリセリンが凍結する、請求項１
    の方法。
  45. 【請求項４５】 その核酸イオンを遅延抽出によりイオン源から抽出する、
    請求項１の方法。
  46. 【請求項４６】 その核酸を質量分析法で分析するにあたり、その工程が、 (a)核酸及び液体マトリックスを含む溶液を基質上に析出させ、それにより核
    酸／液体マトリックス混合物の均一な薄層を形成させること； (b)その(a)の基質を赤外レーザーで照明させ、それ故に溶液中の核酸が脱着及
    びイオン化されること；そして (c)質量を分離し且つ質量分離及び分析フォーマットを用いてイオン化した核酸
    を検出することより成る方法。
  47. 【請求項４７】 その液体マトリックスが照明、脱着及びイオン化の間に蒸
    発しないように十分に非揮発性である、請求項４６の方法。
  48. 【請求項４８】 その液体マトリックスが冷却下及び／又は加圧下でガラス
    を形成し得る、請求項４６の方法。
  49. 【請求項４９】 そのマトリックスが糖、単糖又は多糖より成る、請求項４
    ６の方法。
  50. 【請求項５０】 そのマトリックスがポリグリセリン、スクロース、マンノ
    ース、ガラクトース、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチロ
    ールプロパン、ペンタエリトリトール、デキストロース、メチル配糖体又はソル
    ビトール、スクロース、マンノース、トリエタノールアミン、乳酸、３-ニトロ
    ベンジルアルコール、ジエタノールアミン、ＤＭＳＯ、ニトロフェニルオクチル
    エーテル(３-ＮＰＯＥ)、２，２’−ジチオジエタノール、テトラエチレングリ
    コール、ジチオトレイトール／エリトリトール(ＤＴＴ／ＤＴＥ)、２，３−ジヒ
    ドロキシ−プロピル−ベンジルエーテル、α−トコフェロール及びチオグリセリ
    ンより成る、請求項４６の方法。
  51. 【請求項５１】 その液体マトリックスが以下の性質：i)核酸適合性の溶液
    と混合し得ること、ii)真空に安定であること、iii)単独で又は核酸適合性の溶
    液と混合して薄層のミクロ‐からナノ-リットル容量のマトリックスを分注する
    のに適切な粘度を持つことの少なくとも一つを有する、請求項４６の方法。
  52. 【請求項５２】 その液体マトリックスが赤外線を強く吸収する置換基の少
    なくとも一つを含有する、請求項４６の方法。
  53. 【請求項５３】 その置換基が、ニトロ、スルホニル、スルホン酸、スルホ
    ンアミド、ニトリル、カルボニル、アルデヒド、カルボン酸、アミド、エステル
    、酸無水物、ケトン、アミン、ヒドロキシル、芳香環及びジエンより成る群から
    選ばれる、請求項５２の方法。
  54. 【請求項５４】 その液体マトリックスが、アルコール、カルボン酸、一級
    又は二級アミド、一級又は二級アミン、ニトリル、ヒドラジン及びヒドラジドよ
    り成る群から選ばれる、請求項４６の方法。
  55. 【請求項５５】 そのアルコールが、グリセリン、１，２−又は１，３−プ
    ロパンジオール、１，２−、１，３−又は１，４−ブタンジオール及びトリエタ
    ノールアミンより成る群から選ばれる、請求項５４の方法。
  56. 【請求項５６】 そのカルボン酸が、乳酸、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酪
    酸、吉草酸、ヘキサン酸及びそれらのエステルより成る群から選ばれる、請求項
    ５４の方法。
  57. 【請求項５７】 そのアミドが、分岐するか又は分岐していない、アセトア
    ミド、プロパンアミド、ブタンアミド、ペンタンアミド及びヘキサンアミドより
    成る群から選ばれる、請求項５４の方法。
  58. 【請求項５８】 そのアミンが、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチル
    アミン、ヘキシルアミン、ヘプチルアミン、ジエチルアミン及びジプロピルアミ
    ンより成る群から選ばれる、請求項５４の方法。
  59. 【請求項５９】 その液体マトリックスが少なくとも二つの液体より成り、
    その各々が少なくとも一つの性質を授ける、請求項５１の方法。
  60. 【請求項６０】 その液体マトリックスが添加物より成る、請求項４６の方
    法。
  61. 【請求項６１】 その添加物が分析に用いるレーザー波長において高い吸光
    係数を有する化合物、液体マトリックスを酸性化する添加物、液体マトリックス
    と核酸のリン酸バックボーン間の塩生成を最少にする添加物より成る群から選ば
    れる、請求項６０の方法。
  62. 【請求項６２】 その添加物がマトリックス組成のイオン強度を増加させる
    、請求項６０の方法。
  63. 【請求項６３】 工程(a)の前に、液体マトリックスと核酸のリン酸バック
    ボーン間の塩生成を最少にするように処理する、請求項４６の方法。
  64. 【請求項６４】 その液体マトリックスが蒸留又はイオン交換により処理さ
    れる、請求項４６の方法。
  65. 【請求項６５】 その液体マトリックスが更に精製により処理される、請求
    項４６の方法。
  66. 【請求項６６】 その液体マトリックスがグリセリン、乳酸又はトリエタノ
    ールアミンより成る群から選ばれる、請求項４６の方法。
  67. 【請求項６７】 その液体マトリックスがグリセリンであり、最終的なアナ
    ライト対グリセリンのモル比が約１０-4から約１０-9である、請求項４３の方法
    。
  68. 【請求項６８】 その液体マトリックスがグリセリンであり、核酸の質量が
    約１０4から約１０6Ｄaの範囲にありそしてグリセリンを工程(a)の前にイオン交
    換に付す、請求項４６の方法。
  69. 【請求項６９】 その核酸がＤＮＡである、請求項４６の方法。
  70. 【請求項７０】 そのＤＮＡが約２０００より少ないか又は同等の塩基から
    成る、請求項４６の方法。
  71. 【請求項７１】 核酸がＲＮＡである、請求項４６の方法。
  72. 【請求項７２】 そのＲＮＡが約１２００より少ないか又は同等の塩基から
    成る、請求項７１の方法。
  73. 【請求項７３】 核酸がＰＮＡより成る、請求項４６の方法。
  74. 【請求項７４】 核酸が二本鎖核酸より成る、請求項４６の方法。
  75. 【請求項７５】 核酸が一本鎖核酸より成る、請求項４６の方法。
  76. 【請求項７６】 赤外線が約２．５μｍから約１２μｍの範囲にある波長を
    持つ、請求項４６の方法。
  77. 【請求項７７】 その線パルスが約５００ｐｓから約５００ｎｓの範囲にあ
    る幅を持つ、請求項４６の方法。
  78. 【請求項７８】 赤外線がＣＯレーザー、ＣＯ2レーザー、Ｅｒレーザー及
    び約２．５μｍから約１２μｍの範囲で放射する光学パラメトリック振動子レー
    ザーより成る群から選ばれる、請求項４６の方法。
  79. 【請求項７９】 試料が約１０ピコモル以下の核酸を含有する、請求項４６
    の方法。
  80. 【請求項８０】 その方法の全部又は一部が自動化されている、請求項４６
    の方法。
  81. 【請求項８１】 その試料が約２０℃以下であるところの温度に冷却されて
    いる、請求項４６の方法。
  82. 【請求項８２】 その試料が約２０℃より上で且つ８０℃より下であるとこ
    ろの温度に加熱されている、請求項４６の方法。
  83. 【請求項８３】 そのマトリックスと試料の混合物が冷却され、それにより
    マトリックスがガラスを形成する、請求項４６の方法。
  84. 【請求項８４】 そのガラスがガラス性水である、請求項４６の方法。
  85. 【請求項８５】 そのマトリックスがグリセリンであり且つそのグリセリン
    と試料の混合物が冷却されることで、そのグリセリンが凍結する、請求項４６の
    方法。
  86. 【請求項８６】 工程(ｃ)の前に、核酸イオンを遅延抽出によりイオン源か
    ら抽出する、請求項４６の方法。
  87. 【請求項８７】 質量分離及び分析フォーマットが飛行時間(ＴＯＦ)、四重
    極、磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(ＦＴＣＩＲ)、イオ
    ントラップ又はそれらの組み合わせより成る群から選ばれる、請求項４６の方法
    。
  88. 【請求項８８】 そのＴＯＦが直線であるか、又はＴＯＦがリフレクターを
    有する、請求項８７の方法。
  89. 【請求項８９】 そのＴＯＦリフレクターが直線磁場又は非直線磁場を有す
    る、請求項８７の方法。
  90. 【請求項９０】 その四重極が一個であるか又は四重極が複数個である、請
    求項８７の方法。
  91. 【請求項９１】 その磁気セクターが一個であるか又は磁気セクターが複数
    個である、請求項８７の方法。
  92. 【請求項９２】 プライマー伸長生成物のサイズを測定する方法であって、 (ａ)そこではプライマーが(i)目標核酸に相補的である；(ii) プライマーの５
    ’末端及び固定化連結部位を含む第一領域を有する；そして(iii) プライマーの
    ３’末端を含む第二領域を有するが、そこでは３’末端が酵素的伸長のためのプ
    ライマー結合部位として役立つことが可能でありそして、そこでは第二領域が選
    択された切断可能部位を含む、目標核酸を有するプライマーをハイブリッド形成
    させること； (ｂ)そのプライマーを酵素的に伸長させ、プライマー及び伸長セグメントより
    なる伸長生成物を含有するポリヌクレオチドの混合物を生成すること； (ｃ)そこでは切断の前にプライマーを固定化連結部位で固定化し、伸長生成物を
    切断可能部位で切断して伸長セグメントを遊離すること；そして (ｄ)請求項１の方法により伸長セグメントのサイズを測り、それによりその切断
    が(ｂ)の生成物の読み取り長さに比し伸長セグメントの読み取り長さを増加させ
    るのに効果的であることより成る方法。
  93. 【請求項９３】 プライマー伸長生成物のサイズを測定する方法であって、 (ａ)プライマーの核酸へのハイブリッド形成を促進する条件下で第一及び第二
    のプライマーを目標核酸に結合させることにより、プライマー／核酸複合体を生
    成させるが、そこではその第一プライマーが(i)目標核酸に相補的である；(ii)
    プライマーの５’末端及び固定化連結部位を含む第一領域を有する；そして(iii
    ) プライマーの３’末端を含む第二領域を有するが、そこでは３’末端が酵素的
    伸長のためのプライマー結合部位として役立つことが可能でありそして、そこで
    は第二領域が切断可能部位を含み、そして、そこでは第二領域が目標核酸に相同
    であること； (ｂ)適切なポリメラーゼ及び全て四つのｄＮＴＰｓの存在下で鎖／プライマー
    複合体を二本鎖断片に変換すること； (ｃ)（i）その二本鎖断片を変性させて一本鎖断片を生成する、(ii)その一本鎖
    をプライマーとハイブリッド形成させプライマー／核酸複合体を生成する、(iii
    )ＤＮＡポリメラーゼ及び全て四つのｄＮＴＰｓの存在下でその鎖／プライマー
    複合体から二本鎖断片を形成する、そして(iv)望ましい増幅度を達成するまで(i
    )から(iii)の工程を繰り返すところの、工程を連続して繰り返すことによりプラ
    イマー含有断片を増幅すること； (ｄ)その増幅した断片を変性して第一プライマー及び伸長セグメントよりなる生
    成物を含む混合物を生成すること； (ｅ)固定化連結部位を用いて、その第一プライマーを含む増幅した断片を固定
    化して、そして非固定化増幅断片を除去すること； (ｆ) その固定化増幅断片を切断可能部位で切断して伸長セグメントを遊離する
    こと； そして (ｇ)請求項１の方法により伸長セグメントのサイズを測り、それによりその切断
    が(ｄ)の生成物の読み取り長さに比し伸長セグメントの読み取り長さを増加させ
    るのに効果的であることことより成る方法。
  94. 【請求項９４】 目標ＤＮＡ配列のＤＮＡ配列を決定する方法であって、 (ａ)そこではプライマーが(i)目標ＤＮＡに相補的である；(ii) プライマーの
    ５’末端及び固定化連結部位を含む第一領域を有する；そして(iii) プライマー
    の３’末端を含む第二領域を有するが、そこでは３’末端が酵素的伸長のための
    プライマー結合部位として役立つことが可能であり、そして、そこでは第二領域
    が切断可能部位を含む、目標ＤＮＡを有するプライマーをハイブリッド形成させ
    ること； (ｂ)そのプライマーを四つの異なるジデオキシヌクレオチドの第一の存在下に酵
    素で伸長させ、各生成物がプライマー及び伸長セグメントを含有するプライマー
    伸長生成物の混合物を生成すること； (ｃ)そこでは切断の前にプライマーを固定化連結部位で固定化し、切断可能部位
    で切断して伸長セグメント遊離すること； (ｄ)請求項１の方法により伸長セグメントのサイズを測し、それによりその切断
    が(ｂ)の生成物の読み取り長さに比し伸長セグメントの読み取り長さを増加させ
    るのに効果的であること； (ｅ)(ａ)から(ｄ)の工程を四つの異なるジデオキシヌクレオチドの第二、第三及
    び第四で繰り返すこと；そして （ｆ）これら四つの伸長反応の各々から得られる伸長セグメントのサイズの比較
    により目標ＤＮＡ配列のＤＮＡ配列を決定することより成る方法。
  95. 【請求項９５】 目標ＤＮＡ配列のＤＮＡ配列を決定する方法であって、 (ａ)そこではプライマーが(i)目標ＤＮＡに相補的である；(ii) プライマーの
    ５’末端及び固定化連結部位を含む第一領域を有する；そして(iii) プライマー
    の３’末端を含む第二領域を有するが、そこでは３’末端が酵素的伸長のための
    プライマー結合部位として役立つことが可能であり、そして、そこでは第二領域
    が切断可能部位を含む、目標ＤＮＡを有するプライマーをハイブリッド形成させ
    ること； (ｂ)そのプライマーを四つの異なるデオキシヌクレオシドα-チオ三リン酸類似
    体(ｄＮＴＰαＳ)の第一の存在下で酵素で伸長させて、ホスホロチオアート結合
    を含むプライマー伸長生成物の混合物を生成すること； (ｃ)そのプライマー伸長生成物をホスホロチオアート結合を特異的に切断する
    試薬で処理するが、そこではその処理を限定切断を生じる条件下で行って、一群
    のプライマー伸長分解生成物の生産をもたらすこと； (ｄ)プライマー伸長生成物を洗浄するが、そこでは洗浄の前に、プライマー伸
    長生成物を固定化連結部位で固定化し、各々の固定化したプライマー伸長分解生
    成物はプライマー及び伸長セグメントを含有し、そこではその洗浄が非固定化物
    を除去するのに有効であること； (ｅ)切断可能部位で切断して伸長セグメント遊離すること； (ｆ)請求項１の方法により伸長セグメントのサイズを測り、それによりその切断
    が対応するプライマー伸長分解生成物の読み取り長さに比しそれぞれの与えられ
    た伸長セグメントの読み取り長さを増加させるのに効果的であること； (ｇ)(ａ)から(ｆ)の工程を四つの異なるｄＮＴＰαＳの第二、第三及び第四で繰
    り返すこと；そして （ｆ）これら四つの伸長反応の各々から得られる伸長セグメントのサイズの比較
    により目標ＤＮＡ配列のＤＮＡ配列を決定することより成る方法。
  96. 【請求項９６】 プライマー伸長生成物のサイズを測定する方法であって、 (ａ)そこではプライマーが(i)目標核酸に相補的である；(ii) プライマーの５
    ’末端及び固定化連結部位を含む第一領域を有する；そして(iii) プライマーの
    ３’末端を含む第二領域を有するが、そこでは３’末端が酵素的伸長のためのプ
    ライマー結合部位として役立つことが可能であり、そして、そこでは第二領域が
    選択された切断可能部位を含む、目標核酸を有するプライマーをハイブリッド形
    成させること； (ｂ)そのプライマーを酵素的に伸長させてプライマー及び伸長セグメントより
    なる伸長生成物を含有するポリヌクレオチドの混合物を生成すること； (ｃ)伸長生成物を切断可能部位で切断して伸長セグメント遊離すること；そして (ｄ)請求項１の方法により伸長セグメントのサイズを測り、それによりその切断
    が(ｂ)の生成物の読み取り長さに比し伸長セグメントの読み取り長さを増加させ
    るのに効果的であることより成る方法。
  97. 【請求項９７】 プライマー伸長生成物のサイズを測定する方法であり、そ
    れが、 (ａ)そこではプライマーが(i)目標核酸に相補的である；(ii) プライマーの５
    ’末端及び固定化連結部位を含む第一領域を有するが、そこではプライマーの固
    定化連結部位が中間オリゴヌクレオチドに相補的な一連の塩基よりなり；そして
    (iii) プライマーの３’末端を含む第二領域を有するが、そこでは３’末端が酵
    素的伸長のためのプライマー結合部位として役立つことが可能であり、そして、
    そこでは第二領域が選択された切断可能部位を含む、目標核酸を有するプライマ
    ーをハイブリッド形成させること； (ｂ)そのプライマーを酵素的に伸長させ、プライマー及び伸長セグメントより
    なる伸長生成物を含有するポリヌクレオチドの混合物を生成すること； (ｃ)伸長生成物を切断可能部位で切断して伸長セグメント遊離するが、そこでは
    切断の前にプライマーの固定化連結部位を固体担体に結合した中間オリゴヌクレ
    オチドに特異的にハイブリッド形成させることにより固定化すること；そして (ｄ)請求項１の方法により伸長セグメントのサイズを測り、それによりその切断
    が(ｂ)の生成物の読み取り長さに比し伸長セグメントの読み取り長さを増加させ
    るのに効果的であることより成る方法。
  98. 【請求項９８】 プライマー伸長生成物のサイズを測定する方法であって、 (ａ)プライマーの核酸へのハイブリッド形成を促進する条件下で第一及び第二
    のプライマーを目標核酸に結合させることにより、プライマー／核酸複合体を生
    成させるが、そこではその第一プライマーが(i)５’末端及び３’末端を有する
    、(ii)目標核酸に相補的である、(iii) プライマーの５’末端及び固定化連結部
    位を含む第一領域を有する、そして(iv) プライマーの３’末端を含む第二領域
    を有するが、そこでは３’末端が酵素的伸長のためのプライマー結合部位として
    役立つことが可能でありそして、そこでは第二の領域が切断可能な部位を含み、
    そして、そこでは第二プライマーが(i)５’末端及び３’末端を有する、(ii)目
    標核酸に相同である、(iii) 第二プライマーの３’末端を含む第一セグメントを
    有する、そして(iv) 第二プライマーの５’末端及び固定化連結部位を含む第二
    セグメントを有すること； (ｂ)ＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下で鎖／
    プライマー複合体を二本鎖断片に変換すること； (ｃ)（i）その二本鎖断片を変性させて一本鎖断片を生成する、(ii)その一本鎖
    を第一及び第二のプライマーとをハイブリッド形成させプライマー／核酸複合体
    形成する、(iii)ＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシヌクレオチド三リン酸の存在
    下でその鎖／プライマー複合体から増幅生成物を形成する、そして(iv)望ましい
    増幅度を達成するまで(i)から(iii)の工程を繰り返す、工程を連続して繰り返す
    ことによりプライマー含有断片を増幅すること； (ｄ)固定化連結部位を経由して、その第二プライマーを含む増幅した断片を固
    定化すること； (ｅ)非固定化増幅断片を除去すること； (ｆ)その固定化増幅断片を切断可能部位で切断して二本鎖生成物を含む混合物を
    生成すること； (ｇ) その二本鎖生成物を変性して伸長セグメントを遊離すること；そして (ｈ)請求項１の方法により伸長セグメントのサイズを測り、それによりその切断
    が(ｃ)の増殖した鎖／プライマー複合体の読み取り長さに比し伸長セグメントの
    読み取り長さを増加させるのに効果的であることより成る方法。
  99. 【請求項９９】 目標ＤＮＡ配列の単一塩基指紋を測定する方法であって、 (ａ)そこではプライマーが(i)目標ＤＮＡに相補的である；(ii) プライマーの
    ５’末端及び固定化連結部位を含む第一領域を有する；そして(iii) プライマー
    の３’末端を含む第二領域を有するが、そこでは３’末端が酵素的伸長のための
    プライマー結合部位として役立つことが可能でありそして、そこでは第二領域が
    選択された切断可能部位を含む、目標ＤＮＡを有するプライマーをハイブリッド
    形成させること； (ｂ)そのプライマーを単一塩基に相当するリン酸ジデオキシヌクレオシドの存在
    下で酵素で伸長させ、各生成物がプライマー及び伸長セグメントを含有するプラ
    イマー伸長生成物のポリヌクレオチド混合物を生成すること； (ｃ)そこでは切断の前にプライマーを固定化連結部位で固定化し、伸長生成物を
    切断可能部位で切断して伸長セグメント遊離すること； (ｄ)請求項１の方法により伸長セグメントのサイズを測り、それによりその切断
    が(ｂ)の対応するプライマーの伸長生成物の読み取り長さに比しそれぞれの与え
    られた伸長セグメントの読み取り長さを増加させるのに効果的であること； そ
    して (ｅ)これらの伸長セグメントのサイズの比較により目標ＤＮＡ配列中の単一塩基
    の位置を測定することより成る方法。
  100. 【請求項１００】 目標ＤＮＡ配列のアデニン指紋のための方法であって、 (ａ)そこではプライマーが(i)目標ＤＮＡに相補的である；(ii) プライマーの
    ５’末端及び固定化連結部位を含む第一領域を有する；そして(iii) プライマー
    の３’末端を含む第二領域を有するが、そこでは３’末端が酵素的伸長のための
    プライマー結合部位として役立つことが可能でありそして、そこでは第二領域が
    選択された切断可能部位を含む、目標ＤＮＡを有するプライマーをハイブリッド
    形成させること； (ｂ)そのプライマーをデオキシアデノシン三リン酸(ｄＡＴＰ)、デオキシチミジ
    ンアデノシン三リン酸(ｄＴＴＰ)、デオキシシチジンン三リン酸(ｄＣＴＰ)、デ
    オキシグアノシン三リン酸(ｄＧＴＰ)及びデオキシウリジン三リン酸(ｄＵＴＰ)
    の存在下で酵素で伸長させて、各生成物がプライマー及び伸長セグメントを含有
    し、目標中でｄＡＴＰに相当する位置にｄＵＴＰを含むプライマー伸長生成物の
    ポリヌクレオチド混合物を生成すること； (ｃ)そのプライマー伸長生成物をウラシルＤＮＡ−グリコシラーゼで処理する
    ことで、ｄＵＴＰ位置で特異的に断片化させて一組のプライマー伸長分解生成物
    の生産すること； (ｄ) プライマー伸長生成物を洗浄するが、そこでは洗浄の前に、プライマー
    伸長生成物を固定化連結部位で固定化し、各々の固定化したプライマー伸長分解
    生成物はプライマー及び伸長セグメントを含有して、その洗浄が非固定化物を除
    去するのに有効であること； (ｅ) 固定化したプライマー伸長分解生成物を切断可能部位で切断して伸長セグ
    メント遊離すること； (ｆ)請求項１の方法により伸長セグメントのサイズを測り、それによりその切断
    が対応するプライマー伸長分解生成物の読み取り長さに比しそれぞれの与えられ
    た伸長セグメントの読み取り長さを増加させるのに効果的であること；そして (ｇ)これらの遊離した伸長セグメントのサイズの比較により目標ＤＮＡ中のアデ
    ニンの位置を測定することより成る方法。
  101. 【請求項１０１】 目標核酸中で突然変異を検出する方法であって、 ａ) 目標核酸から一組の非ランダム長断片(ＮＬＦｓ)を一本鎖型で得るが、そ
    こにおいては、その組が目標核酸の正又は負の鎖のどちらかから誘導されたＮＬ
    Ｆｓから成るか又はその組が目標核酸の正又は負の鎖のどちらかから誘導された
    一本鎖ＮＬＦｓのサブセットであること；そして ｂ) 請求項１の方法によりその組のメンバーの質量を測定することより成る方
    法。
  102. 【請求項１０２】 目標核酸中で突然変異を検出する方法であり、それが、 ａ) 目標核酸を一つ又はそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで非ランダム的に
    断片化して一組の二本鎖ＮＬＦｓを形成するが、そこにおいては非ランダム的な
    断片化が更に制限緩衝液中で揮発性塩を使用することから成ること；そして ｂ) 請求項１の方法によりその組の二本鎖ＮＬＦｓのメンバーの質量を測定す
    ることより成る方法。
  103. 【請求項１０３】 二本鎖目標核酸中で突然変異を検出する方法であって、 a)目標核酸を一つ又はそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで非ランダム的に断
    片化して最初の一組の非ランダム的断片(ＮＬＦｓ)を形成すること； ｂ)最初のＮＬＦｓ組のメンバーを一組の野生型プローブにハイブリッド形成
    させること； ｃ) ＮＬＦｓ組の一つ又はそれ以上のメンバーを、最初のＮＬＦｓ組のメンバ
    ーとその組の野生型プローブの相補的メンバーとの間に形成する如何なるヌクレ
    オチドミスマッチの領域において特異的に切断するところの一つ又はそれ以上の
    突然変異−特異的切断試薬で非ランダム的に断片化するが、そこにおいてはその
    非ランダム的断片化工程が第二のＮＬＦｓ組を形成すること； そして ｄ)請求項１の方法によりその第二組のＮＬＦｓのメンバーの質量を測定する
    ことより成る方法。
  104. 【請求項１０４】 目標核酸中で突然変異を検出する方法であり、それが、 ａ) 目標核酸を一つ又はそれ以上の揮発性塩より成る混合物を使用して、非ラ
    ンダム的に断片化して一組の非ランダム長断片(ＮＬＦｓ)を形成すること；そし
    て ｂ) 請求項１の方法によりその組のＮＬＦｓのメンバーの質量を測定すること
    より成る方法。
  105. 【請求項１０５】 更に、核酸試料を揮発性塩の混合物で洗浄し、そしてそ
    の揮発性塩の混合物を試料から揮発させ、それによりバックグラウンドノイズを
    減少させる、請求項１の方法。
  106. 【請求項１０６】 目標核酸中でＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復遺伝子座にお
    けるＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復対立遺伝子を質量分析法により分析する方法で
    あって、それは ａ)ＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復領域より成る目標核酸を得る； ｂ)その目標核酸を一つ又はそれ以上のプライマーを用いて伸長させ、限定し
    たサイズ範囲の核酸伸長生成物を得るが、そこにおいては一つ又はそれ以上のプ
    ライマーが遺伝子座のＤＮＡ縦列ヌクレオチド繰返し体を挟む配列に相補的であ
    ること ；そして ｃ)請求項１の方法によりその核酸伸長生成物の質量を測定することより成る方
    法。
  107. 【請求項１０７】 一つ以上のＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復領域を一つ以上
    のＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復対立遺伝子から質量分析法により確認することを
    多重化する方法であって、それは ａ)ＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復領域を挟む配列に相補的である一つ又はそれ
    以上のプライマーを伸長させることにより一つ以上の核酸伸長生成物を得ること
    ； そして ｂ) 請求項１の方法により同時に一つ以上の核酸伸長生成物の質量を測定するが
    、そこにおいてはその核酸伸長生成物が対立遺伝子の重なり合った質量領域を持
    つことより成る方法。
  108. 【請求項１０８】 一つ以上のＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復領域を一つ以上
    のＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復対立遺伝子に対して確認することを多重化する方
    法であって、それは ａ)ＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復領域を挟む配列に相補的である二つ又はそれ
    以上のプライマーを増幅させることにより一つ以上の核酸増幅生成物を得ること
    ； そして ｂ) 請求項１の方法により同時に一つ以上の核酸増幅生成物の質量を測定するが
    、そこにおいてはその核酸伸長生成物が対立遺伝子の重なり合った質量領域を持
    つことより成る方法。
  109. 【請求項１０９】 目標核酸中でＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復遺伝子座にお
    けるＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復対立遺伝子を質量分析法により分析する方法で
    あって、 ａ)ＤＮＡ縦列ヌクレオチド反復領域より成る目標核酸を得る； ｂ)その目標核酸を一つ又はそれ以上のプライマーを用いて伸長させ、限定し
    たサイズ範囲の核酸伸長生成物を得るが、そこにおいては一つ又はそれ以上のプ
    ライマーが遺伝子座のＤＮＡ縦列ヌクレオチド繰返し体を挟む配列に相補的であ
    ること ；そして ｃ)請求項１の方法によりその核酸伸長生成物の質量を測定することより成る方
    法。
  110. 【請求項１１０】 一つ又はそれ以上のプライマーの３’末端が遺伝子座の
    ＤＮＡ縦列ヌクレオチド繰返し体を直ぐに挟むところの、請求項１０９の方法。
  111. 【請求項１１１】 一つ又はそれ以上のプライマーがＤＮＡ縦列ヌクレオチ
    ド反復遺伝子座の一つまでの縦列繰返し体に相補的な配列より成る、請求項１０
    ９の方法。
  112. 【請求項１１２】 一つ又はそれ以上のプライマーがＤＮＡ縦列ヌクレオチ
    ド反復遺伝子座の二つまでの縦列繰返し体に相補的な配列より成る、請求項１１
    １の方法。
  113. 【請求項１１３】 一つ又はそれ以上のプライマーがＤＮＡ縦列ヌクレオチ
    ド反復遺伝子座の三つまでの縦列繰返し体に相補的な配列より成る、請求項１１
    ２の方法。
  114. 【請求項１１４】 少なくとも一つのプライマーが切断可能部位より成る、
    請求項１０９の方法。
  115. 【請求項１１５】 その切断可能部位が制限エンドヌクレアーゼの認識部位
    、エキソヌクリアーゼ阻止部位又は化学的切断可能部位より成る、請求項１１４
    の方法。
  116. 【請求項１１６】 少なくとも一つのプライマーが固体担体に付着する能力
    がある、請求項１１４の方法。
  117. 【請求項１１７】 少なくとも一つのプライマーがビオチン又はジゴキシゲ
    ニンより成る、請求項１１６の方法。
  118. 【請求項１１８】 少なくとも一つのプライマーの伸長が鎖終結試薬を用い
    て終結される、請求項１０９の方法。
  119. 【請求項１１９】 その伸長が鎖終結試薬がデオキシヌクレオチド三リン酸
    である、請求項１０９の方法。
  120. 【請求項１２０】 目標分子を検出する方法であり、それが、 (a)目標分子を得ること； (ｂ)目標分子を増幅して増幅した目標分子を生産すること； (ｃ)反応基、遊離基及び質量標識より成るプローブを得ること； (ｄ)その増幅した目標分子をそのプローブにハイブリッド形成させ、プローブ
    ：増幅目標分子複合体を生産すること； (ｅ)そのプローブ：増幅目標分子複合体から質量標識を遊離して、遊離質量標識
    を得ること；そして (ｆ)請求項１の方法によりその遊離質量標識の質量を測定することより成る方法
    。
  121. 【請求項１２１】 工程(ｆ)の前に、その質量標識が液体マトリックスと混
    合される、請求項１２０の方法。
  122. 【請求項１２２】 その液体マトリックスがグリセリンである、請求項１２
    １の方法。
  123. 【請求項１２３】 目標分子を検出する方法であって、 (ａ)反応基、遊離基及び質量標識より成るプローブを得ること； (ｂ)目標分子を得ること； (ｃ)その目標分子をそのプローブと接触させ、プローブ：増幅目標分子複合体
    を生産すること； (ｄ)；そのプローブ：増幅目標分子複合体から質量標識を遊離すること；そし
    て (ｅ)請求項１の方法によりその質量標識の質量を測定することより成る方法。
  124. 【請求項１２４】 その質量標識が非揮発性であり且つその質量標識がプロ
    ーブ：目標分子複合体から特異的に遊離される、請求項１２３の方法。
  125. 【請求項１２５】 工程(ｅ)の前に、その質量標識が液体マトリックスと混
    合される、請求項１２３の方法。
  126. 【請求項１２６】 その液体マトリックスがグリセリンである、請求項１２
    ４の方法。
  127. 【請求項１２７】 目標分子の検出を多重化するする方法であって、 (ａ)各々が反応基、遊離基及び質量標識より成る多数のプローブを得ること；(
    ｂ)その目標分子をその多数のプローブと接触させ、プローブ：増幅目標分子複
    合体を生産するが、そこにおいては目標分子はプローブの反応基に付着すること
    ； (ｃ)そのプローブ：増幅目標分子複合体から質量標識を遊離して遊離質量標識
    を生産すること；そして (ｄ)請求項１の方法によりその遊離質量標識の質量を測定するが、そこではプ
    ローブ：増幅目標分子複合体中の各反応基が唯一の組の質量標識と結合すること
    より成る方法。
  128. 【請求項１２８】 工程(ｄ)の前に、その質量標識が液体マトリックスと混
    合される、請求項１２７の方法。
  129. 【請求項１２９】 その液体マトリックスがグリセリンである、請求項１２
    ７の方法。
  130. 【請求項１３０】 多数の目標分子を検出を多重化する方法であり、 (ａ)各々が反応基、遊離基及び質量標識より成る多数のプローブを得ること； (ｂ)その多数の目標分子をその多数のプローブと接触させ、プローブ：増幅目
    標分子複合体を生産するが、そこにおいては目標分子はプローブの反応基に付着
    すること； (ｃ)そのプローブ：増幅目標分子複合体から質量標識を遊離して遊離質量標識
    を生産すること；そして (ｄ)請求項１の方法によりその遊離質量標識の質量を測定するが、そこでは特
    定の目標分子に特異的な各反応基が唯一の質量標識と結合することより成る方法
    。
  131. 【請求項１３１】 工程(ｄ)の前に、その質量標識が液体マトリックスと混
    合される、請求項１３０の方法。
  132. 【請求項１３２】 その液体マトリックスがグリセリンである、請求項１３
    １の方法。
  133. 【請求項１３３】 目標生体高分子を検出をするにあたり、その工程が ａ)生体高分子及び赤外線を吸収する液体マトリックスより成る混合物を作成す
    ること；そして ｂ) その混合物にＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法を実施して混合物中にある目標生
    体高分子を確認し、それにより目標生体高分子を検出することより成る方法。
  134. 【請求項１３４】 その目標生体高分子が生体試料内にあり、それにより目
    標生体高分子の検出が生体試料内の目標生体高分子の存在を確認する、請求項１
    ３３の方法。
  135. 【請求項１３５】 その生体高分子が核酸である、請求項１３３の方法。
  136. 【請求項１３６】 その生体高分子がポリペプチドである、請求項１３３の
    方法。
  137. 【請求項１３７】 その生体高分子が炭水化物、脂質、核タンパク質、プロ
    テオグリカン及び高分子複合体より成る群から選ばれる、請求項１３３の方法。
  138. 【請求項１３８】 その目標生体高分子が固体担体上に固定化されている、
    請求項１３３の方法。
  139. 【請求項１３９】 その目標生体高分子が可逆的結合を経由して固体担体に
    固定化されている、請求項１３３の方法。
  140. 【請求項１４０】 その目標生体高分子が光切断可能結合を経由して固体担
    体に固定化されている、請求項１３３の方法。
  141. 【請求項１４１】 その可逆的結合がチオール結合又はイオン結合である、
    請求項１３８の方法。
  142. 【請求項１４２】 その目標生体高分子がＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法を実
    施する工程の間に担体より切断される、請求項１３８の方法。
  143. 【請求項１４３】 その固体担体がビーズ、平坦な表面、チップ、細管、ピ
    ン、コーム、ウエーハ、ナノ−ウェル又はくぼみの矢印がついたウエーハ、光フ
    ァイバーケーブルの端子、疎水性領域及び親水性領域より成る表面を持ち、それ
    により目標分子が担体上の遺伝子座に封じ込められている担体よりなる群から選
    ばれる、請求項１３８の方法。
  144. 【請求項１４４】 その固体担体が金属、セラミック、プラスチック、樹脂
    、ゲル及び膜よりなる群から選ばれる物質である、請求項１３８の方法。
  145. 【請求項１４５】 その担体がシリコンウエーハであり且つ目標生体高分子
    がアレーのおいて固定化されている、請求項１３８の方法。
  146. 【請求項１４６】 その目標核酸が、固体担体に固定化されているところの
    相補的捕獲核酸分子へのハイブリッド形成により固定化されている、請求項１３
    ５の方法。
  147. 【請求項１４７】 その目標生体高分子がＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法を実
    施する工程の前に適合化されている、請求項１３３の方法。
  148. 【請求項１４８】 その目標生体高分子がイオン交換により適合化されてい
    る、請求項１４７の方法。
  149. 【請求項１４９】 その目標核酸が、陽イオン交換により達成されるリン酸
    ジエステルバックボーン修飾；アルキル化剤又は塩化トリアルキルシリルとの接
    触；目標核酸中での脱プリン化に対する感度を減少させるところのヌクレオチド
    の少なくとも一つの取り込み；目標核酸中に少なくとも一つの質量修飾ヌクレオ
    チドの取り込み；目標核酸を含有するが目標核酸配列とは異なるところの核酸分
    子の一部分への標識プローブのハイブリッド形成よりなる群から選ばれる方法に
    より適合化されている、請求項１３５の方法。
  150. 【請求項１５０】 その目標ポリペプチドが、その目標ポリペプチドをコー
    ド化する核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳により、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写とそれ
    に続く翻訳により得られる、請求項１３６の方法。
  151. 【請求項１５１】 その目標ポリペプチドをコード化する核酸が、第二のポ
    リペプチドコード化するヌクレオチドより更に成る、請求項１５０の方法。
  152. 【請求項１５２】 その目標ポリペプチドが標識より成る、請求項１３６の
    方法。
  153. 【請求項１５３】 核酸分子を含有する生体試料中にある目標核酸配列の存
    在を検出するにあたり、その工程が ａ) 生体試料中に存在する目標核酸配列にハイブリッド形成することができると
    ころの検出オリゴヌクレオチドと核酸分子を接触させること； ｂ)工程ａ)の生成物及び赤外線を吸収する液体マトリックスより成るＩＲ−ＭＡ
    ＬＤＩ用の混合物を作成すること； ｃ) その混合物中にある二重らせんの核酸分子をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法に
    より確認し、それにより生体試料中にある目標核酸配列の存在を検出することよ
    り成る方法。
  154. 【請求項１５４】 工程ａ)の前に、生体試料中にある核酸を増幅する工程
    より更に成る、請求項１５３の方法。
  155. 【請求項１５５】 核酸分子を含有する生体試料中にある目標核酸配列の存
    在を検出するにあたり、その工程が ａ)少なくとも一つの適切なヌクレア−ゼを用いて核酸分子を特異的に消化し、
    それにより消化された断片を生産すること； ｂ)固体担体に固定化され且つ目標核酸の消化された断片にハイブリッド形成す
    ることができるところの相補的捕獲核酸分子と消化された断片をハイブリッド形
    成すること； ｃ) 固定化され断片及び赤外線を吸収する液体マトリックスより成るＩＲ−ＭＡ
    ＬＤＩ用の混合物を作成すること；そして ｄ) 消化された断片をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により確認し、それにより生
    体試料中にある目標核酸配列の存在を検出することより成る方法。
  156. 【請求項１５６】 更に、工程ａ)の前に、生体試料中にある核酸を増幅す
    る工程より成る、請求項１５５の方法。
  157. 【請求項１５７】 目標核酸配列の存在を検出するにあたり、その工程が ａ)一組の連結反応遊離体及び熱安定性ＤＮＡリガーゼを持つ目標核酸配列を含
    む核酸分子上で少なくとも一回のハイブリッド形成を実施すること； ｂ)工程ａ)の生成物及び赤外線を吸収する液体マトリックスより成るＩＲ−ＭＡ
    ＬＤＩ用の混合物を作成すること；そして ｃ)混合物中にある連結反応生成物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により確認し
    、それにより目標核酸配列を検出することより成る方法。
  158. 【請求項１５８】 核酸分子を含有する生体試料中にある目標核酸の存在を
    検出するにあたり、その工程が ａ)目標核酸を含む核酸分子の一部分を増幅する能力のあるところのプライマー
    の第一組を用いる最初のポリメラーゼ連鎖反応を核酸分子上で実施し、それによ
    り最初の増幅生成物を生産すること； ｂ)最初の増幅生成物及び赤外線を吸収する液体マトリックスより成るＩＲ−Ｍ
    ＡＬＤＩ用の混合物を作成すること；そして ｃ)混合物中にある最初の増幅生成物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により検出
    し、それにより生体試料中にある目標核酸配列の存在を検出することより成る方
    法。
  159. 【請求項１５９】 工程ｂ)の前に、目標核酸を含み、最初の増幅生成物の
    少なくとも一部分を増幅する能力のあるところのプライマーの第二組を用いて、
    第二のポリメラーゼ連鎖反応を最初の増幅生成物上で実施する、請求項１５８の
    方法。
  160. 【請求項１６０】 目標ヌクレオチドの本質を測定するにあたり、その工程
    が ａ)目標ヌクレオチドに近接する部位において核酸分子と相補的であるプライマ
    ーオリゴヌクレオチドと目標ヌクレオチドを含む核酸分子をハイブリッド形成し
    、それによりハイブリッド形成した核酸分子を生産すること； ｂ)そのハイブリッド形成した核酸分子を、ジデオキシヌクレオシド又は３’−
    ジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼの完全な組
    とを接触させ、その結果、ジデオキシヌクレオシド又は目標ヌクレオチドに相補
    的であるところの３’−ジデオキシヌクレオシド三リン酸のみがプライマー上に
    伸長され、それにより伸長プライマーを生産すること； ｃ) その伸長プライマー及び赤外線を吸収する液体マトリックスより成るＩＲ−
    ＭＡＬＤＩ用の混合物を作成すること；そして ｄ) その伸長プライマーをＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により検出し、それによ
    り目標ヌクレオチドの本質を測定することより成る方法。
  161. 【請求項１６１】 目標核酸配列において突然変異の存在又は不在を検出す
    るにあたり、その工程が ａ) 目標核酸配列を含む核酸分子を、そのプライマーが目標核酸配列と相補的な
    ３’末端を持つプライマーの少なくとも一つをハイブリッド形成し、それにより
    ハイブリッド形成した生成物を生産すること； ｂ)そのハイブリッド形成した生成物を適切なポリメラーゼ酵素及び続いて四つ
    のヌクレオシド三リン酸の一つとを接触させること； ｃ) その工程ｂ)の生成物及び赤外線を吸収する液体マトリックスより成るＩＲ
    −ＭＡＬＤＩ用の混合物を作成すること；そして ｄ) その混合物中の工程ｂ)の生成物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により検出
    し、そこにおいてはその生成物の分子量が目標核酸分子においてプライマーの３
    ’末端の隣で突然変異の存在又は不在を示すことより成る方法。
  162. 【請求項１６２】 目標核酸配列を含む核酸分子を固体担体に固定化する、
    請求項１６１の方法。
  163. 【請求項１６３】 工程ａ)の前に、目標核酸配列を含む核酸分子を増幅す
    る、請求項１６１の方法。
  164. 【請求項１６４】 目標核酸において突然変異を検出するにあたり、その工
    程が ａ) その目標核酸分子をオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成してハ
    イブリッド形成した目標核酸分子を生産するが、そこにおいては突然変異部位に
    おいてミスマッチが形成されること； ｂ)そのハイブリッド形成した目標核酸分子を一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触
    させること； ｃ) その工程ｂ)の生成物及び赤外線を吸収する液体マトリックスより成るＩＲ
    −ＭＡＬＤＩ用の混合物を作成すること；そして ｄ) その混合物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により分析し、そこにおいては混
    合物中の目標核酸分子の一つ以上の断片の存在が目標核酸における突然変異を検
    出する方法。
  165. 【請求項１６５】 目標核酸配列において突然変異の存在又は不在を確認す
    るにあたり、その工程が ａ)目標核酸配列を含む核酸分子上に一組の連結反応遊離体及びＤＮＡリガーゼ
    と少なくとも一回のハイブリッド形成を実施すること； ｂ)その工程ａ)の生成物及び赤外線を吸収する液体マトリックスより成るＩＲ−
    ＭＡＬＤＩ用の混合物を作成すること；そして ｃ)その混合物をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により分析し、そこにおいてはそ
    の混合物中における連結反応生成物の検出が目標核酸配列における突然変異の不
    在を確認し、そして そこにおいてはその混合物中における連結反応遊離体の組のみの検出が目標核酸
    配列における突然変異の存在を確認することより成る方法。
  166. 【請求項１６６】 多数の目標生体高分子における各々の目標生体高分子の
    本質を測定するにあたり、その工程が ａ)示差的な質量修飾した多数の目標生体高分子及び赤外線を吸収する液体マト
    リックスより成るＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の混合物を作成すること； ｂ)多数の示差的な質量修飾した目標生体高分子の各々の分子質量をＩＲ−ＭＡ
    ＬＤＩ質量分析法により測定すること； そして ｃ)多数の示差的な質量修飾した目標生体高分子の各々の分子質量を対応する既
    知の生体高分子の分子質量と比較し、それにより目標生体高分子又はそれらの断
    片について多数の示差的な質量修飾した目標生体高分子の各々の本質を測定する
    ことより成る方法。
  167. 【請求項１６７】 多数の目標生体高分子の各々が生体高分子の断片であり
    、各々の断片はその生体高分子を、生体高分子の生成に関わる結合を切断すると
    ころの少なくとも一つの試剤と接触させることにより作成される、請求項１６６
    の方法。
  168. 【請求項１６８】 目標生体高分子の配列を決定するにあたり、その工程が
    ａ)目標生体高分子から少なくとも二つの生体高分子断片を生成すること； ｂ)その生体高分子断片及び赤外線を吸収する液体マトリックスより成るＩＲ−
    ＭＡＬＤＩ用の混合物を作成すること； そして ｃ)その混合物中の生体高分子断片をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により分析し
    、それにより目標核酸分子の配列を決定することより成る方法。
  169. 【請求項１６９】 目標生体高分子の少なくとも一つの種類、ｉ、のサブユ
    ニット配列を決定するにあたり、その工程が ａ)目標生体高分子のその種類を、生体高分子の生成に関わる結合を切断すると
    ころの少なくとも一つの試剤と接触させ、その結果、生体高分子の生成に関わる
    各々の結合を切断し、それによりその種類の生体高分子の欠失断片の入れ子のセ
    ットを生産すること； ｂ) その欠失断片の入れ子のセット及び赤外線を吸収する液体マトリックスより
    成るＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の混合物を作成すること； そして ｃ) その混合物中の各々の欠失断片の分子質量をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法に
    より測定し、それによりその種類の目標核酸分子のサブユニット配列を決定する
    ことより成る方法。
  170. 【請求項１７０】 その切断する試剤は目標生体高分子を末端から一側性に
    切断する試剤である、請求項１６９の方法。
  171. 【請求項１７１】 その目標生体高分子は核酸であり且つ切断する試剤はエ
    キソヌクレアーゼである、請求項１７０の方法。
  172. 【請求項１７２】 その目標生体高分子はポリペプチドであり且つ切断する
    試剤はエキソペプチダーゼである、請求項１７０の方法。
  173. 【請求項１７３】 少なくとも一つの目標生体高分子の種類がｉ＋１種類の
    目標生体高分子より成り、そして各々の種類の目標生体高分子が示差的に質量修
    飾され、その結果、各々の種類の目標生体高分子の欠失断片がＩＲ−ＭＡＬＤＩ
    質量分析法によりその他の目標生体高分子の欠失断片から区別することができる
    、請求項１７０の方法。
  174. 【請求項１７４】 核酸の少なくとも一つの種類、ｉ、のヌクレオチド配列
    を決定するにあたり、その工程が ａ) オリゴヌクレオチドプライマーから出発し且つ鎖終結ヌクレオシド三リン酸
    の存在下で、配列決定されるその種類の核酸に相補的であるところの相補的核酸
    を合成し、それにより塩基−特異的に終結する相補的ポリヌクレオチド断片の四
    組を生産すること； ｂ) その四組のポリヌクレオチド断片及び赤外線を吸収する液体マトリックスよ
    り成るＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の混合物を作成すること； そして ｃ)各々のポリヌクレオチド断片の分子量値をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法によ
    り測定すること；そして ｄ)その分子量値を分子量に従い整列させることにより、その種類の核酸のヌク
    レオチド配列を決定することより成る方法。
  175. 【請求項１７５】 その種類の核酸はＲＮＡであり、鎖終結ヌクレオシド三
    リン酸はリボヌクレオチド又はそれらの誘導体であり、そしてオリゴヌクレオチ
    ドプライマーは開始オリゴヌクレオチドである、請求項１７３の方法。
  176. 【請求項１７６】 ｉ＋１種類の核酸がｉ＋１プライマーを使用する多重質
    量分析核酸配列決定法により同時に配列決定され、そこではそのｉ＋１プライマ
    ーの一つは未修飾プライマーまたは質量修飾プライマーであり且つその他のｉプ
    ライマーは質量修飾プライマーであり、そしてｉ＋１プライマーの各々が他のも
    のからＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法により区別することができる、請求項１７４
    の方法。
  177. 【請求項１７７】 目標核酸の配列を決定するにあたり、その工程が ａ) 少なくとも一つの部分的に一本鎖の目標核酸を一つ以上の核酸プローブにハ
    イブリッド形成し、各々のプローブは二本鎖部分、一本鎖部分及び一本鎖部分内
    における測定可能な可変配列より成り、それにより少なくとも一つのハイブリッ
    ド形成された目標核酸を生産すること； ｂ) そのハイブリッド形成された目標核酸及び赤外線を吸収する液体マトリック
    スより成るＩＲ−ＭＡＬＤＩ用の混合物を作成すること； ｃ) その目標核酸がハイブリッド形成されたプローブの測定可能な可変配列に基
    づいて、ハイブリッド形成された目標核酸の配列をＩＲ−ＭＡＬＤＩ質量分析法
    により測定すること；そして ｄ)工程ａ)からｃ)を十分な回数で繰り返して目標核酸の配列を決定することよ
    り成る方法。
  178. 【請求項１７８】 一つ以上の核酸プローブをアレーにおいて固定化する、
    請求項１７０の方法。
  179. 【請求項１７９】 工程ａ)の前に、ハイブリッド形成された目標核酸を測
    定可能な可変配列に連結する、請求項１７０の方法。
  180. 【請求項１８０】 試料中の生体高分子を分析する方法であって、 試料を赤外線にさらすこと； その試料をマトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析法を用いて分
    析すること； そこにおいてはマトリックス補助レーザー脱着／イオン化による質量測定の
    真度が約１０2から約５×１０3の範囲にあることより成る方法。
  181. 【請求項１８１】 マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析法に
    よる質量測定の真度が約１００から約５００ｐｐｍの範囲にある、請求項１８０
    の方法。
  182. 【請求項１８２】 マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析法に
    よる質量測定の真度が約１×１０3から約５×１０3の範囲にある、請求項１８０
    の方法。
  183. 【請求項１８３】 その生体高分子の分子量が１５０ｋＤａ以下であり；そ
    して マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析法による質量測定の精度が約
    ４００−５００ｐｐｍの範囲にある、請求項１８０の方法。
  184. 【請求項１８４】 その生体高分子の分子量が１５０ｋＤａ以下であり；そ
    して マトリックス補助レーザー脱着／イオン化による質量測定の精度が約２００−４
    ００ｐｐｍの範囲にある、請求項１８０の方法。
  185. 【請求項１８５】 その生体高分子の分子量が１ＭＤａ(メガダルトン)を超
    える、請求項１８０の方法。
  186. 【請求項１８６】 更に、遅延抽出によりイオン源からイオンを抽出するこ
    とより成り、それにより増強質量再混合が達成される、請求項１８０の方法。
  187. 【請求項１８７】 そのマトリックスがグリセリンである、請求項１８０の
    方法。
  188. 【請求項１８８】 そのマトリックスがコハク酸である、請求項１８０の方
    法。
  189. 【請求項１８９】 その生体高分子が５０ｋＤａより大きいポリペプチドで
    あり且つマトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析法をリフレクトロン
    飛行時間フォーマットを用いて実施する、請求項１８０の方法。
  190. 【請求項１９０】 試料中の核酸の存在又は不在を検出する方法であり、そ
    こにおいては： 試料をマトリックスと混合して核酸と均一な混合物を形成すること；そして もし試料中に存在すれば、核酸を検出する、請求項１８０の方法。
  191. 【請求項１９１】 その試料が生体試料である、請求項１９０の方法。
  192. 【請求項１９２】 その核酸が少なくとも２０００のヌクレオチドより成る
    、請求項１９０の方法。
  193. 【請求項１９３】 その核酸が少なくとも２８０のヌクレオチドより成る、
    請求項１９０の方法。
  194. 【請求項１９４】 その核酸がＤＮＡである、請求項１９０の方法。
  195. 【請求項１９５】 その核酸が少なくとも１２００のヌクレオチドより成る
    、請求項１９０の方法。
  196. 【請求項１９６】 その核酸がＲＮＡである、請求項１９０の方法。
  197. 【請求項１９７】 その核酸の存在又は不在が遺伝病の存在又は不在を示す
    、請求項１９０の方法。
  198. 【請求項１９８】 その核酸の存在又は不在が出生時欠損の存在又は不在を
    示す、請求項１９０の方法。
  199. 【請求項１９９】 その核酸の存在又は不在が感染性生物の存在又は不在を
    示す、請求項１９０の方法。
  200. 【請求項２００】 その核酸の存在又は不在が被験者の本質を示す、請求項
    １９０の方法。
  201. 【請求項２０１】 そのマトリックスが置換又は非置換アルコールである、
    請求項１９０の方法。
  202. 【請求項２０２】 その核酸／マトリックスがチップアレー、ピンのアレー
    又は平滑表面のくぼみ中のビーズの場上に析出している、請求項１９０の方法。
  203. 【請求項２０３】 試料中の目標生体高分子の存在又は不在を検出する方法
    であり、： 赤外マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析法を用いて試料を分析す
    ること； そこにおいてはもし試料中に存在すれば、目標生体高分子を検出する、請求項１
    ８０の方法。
  204. 【請求項２０４】 その試料が生体試料である、請求項２０３の方法。
  205. 【請求項２０５】 その試料が目標生体高分子以外の一つ以上の生体高分子
    を含有する、請求項２０３の方法。
  206. 【請求項２０６】 その目標生体高分子が生体ポリマーである、請求項２０
    ３の方法。
  207. 【請求項２０７】 その目標生体ポリマーがポリペプチドである、請求項２
    ０６の方法。
  208. 【請求項２０８】 その目標生体高分子が核酸である、請求項２０６の方法
    。
  209. 【請求項２０９】 その目標核酸が二本鎖核酸であるか又は目標核酸が一本
    鎖核酸であるか又は目標核酸が二本鎖及び一本鎖領域より成る、請求項２０６の
    方法。
  210. 【請求項２１０】 その目標生体高分子の存在又は不在が一つ以上の以下の
    項目； 遺伝病の存在又は不在若しくは出生時欠損の存在又は不在を示す； 感染性生物の存在又は不在； 被験者の本質を示す、請求項２０６の方法。
  211. 【請求項２１１】 遅延イオン抽出をそのマトリックス補助レーザー脱着／
    イオン化質量分析法に用いる、請求項２０３の方法。
  212. 【請求項２１２】 その目標生体高分子が炭水化物、核タンパク質、プロテ
    オグリカン、脂質、核酸類似体及び高分子複合体より成る群から選ばれる、請求
    項２０３の方法。
  213. 【請求項２１３】 その目標生体高分子が固体担体上に固定化されている、
    請求項２０３の方法。
  214. 【請求項２１４】 その目標生体高分子が切断可能結合及び／又は可逆的結
    合を経由して固体担体に固定化されている、請求項２１３の方法。
  215. 【請求項２１５】 その目標生体高分子がマトリックス補助レーザー脱着／
    イオン化質量分析法を実施する工程の間に担体より切断される、請求項２１３の
    方法。
  216. 【請求項２１６】 その担体が一つ以上の親水性区域より成り、そしてその
    一つ以上の区域の各々が一つの疎水性区域又は一つ以上の疎水性区領域で囲まれ
    且つその一つ以上の区域の各々が親水性区域で囲まれるか又は光ファイバーケー
    ブルの端子である、請求項２１３の方法。
  217. 【請求項２１７】 目標核酸が、固体担体に固定化されているところの相補
    的捕獲核酸分子へのハイブリッド形成により固定化されている、請求項２０９の
    方法。
  218. 【請求項２１８】 その目標生体高分子がマトリックス補助レーザー脱着／
    イオン化質量分析法を実施する工程の前に適合化されている、請求項２０３の方
    法。
  219. 【請求項２１９】 その目標生体ポリマーが、イオン交換；イオン交換によ
    り達成されるリン酸ジエステルバックボーン修飾；アルキル化剤又は塩化トリア
    ルキルシリルとの接触；目標核酸中での脱プリン化に対する感度を減少させると
    ころのヌクレオチドの少なくとも一つの取り込み；目標核酸中に少なくとも一つ
    の質量修飾ヌクレオチドの取り込み；目標核酸を含有するが目標核酸配列とは異
    なるところの核酸分子の一部分への標識プローブのハイブリッド形成より成る群
    から選ばれるところの方法により適合化されている、請求項２０３の方法。
  220. 【請求項２２０】 目標ポリペプチドが、その目標ポリペプチドをコード化
    する核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳により、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写とそれに続
    く翻訳により得られる、請求項２０８の方法。
  221. 【請求項２２１】 その目標ポリペプチドをコード化する核酸が、第二のポ
    リペプチドをコード化するヌクレオチドより更に成る、請求項２０３の方法。
  222. 【請求項２２２】 その目標ポリペプチドが標識より成る、請求項２０８の
    方法。
  223. 【請求項２２３】 その試料がマトリックスより成り；グリセリンであり；
    そして 生体高分子が約１×１０4ダルトンから約１×１０6ダルトンの範囲にある質量
    を持つ核酸である、請求項２０３の方法。
  224. 【請求項２２４】 マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析法に
    よる試料の分析の前に、試料を基質上に析出させることより更に成る、請求項２
    ０３の方法。
  225. 【請求項２２５】 当該析出が自動化液体分注装置による、請求項２２４の
    方法。
  226. 【請求項２２６】 赤外マトリックス補助レーザー脱着／イオン化質量分析
    法を約−８０℃から２０℃の範囲の温度で実施する、請求項２０３の方法。
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