DE102009013914B4

DE102009013914B4 - Kalibriersubstanzen für Atmosphärendruck-Ionenquellen

Info

Publication number: DE102009013914B4
Application number: DE102009013914A
Authority: DE
Inventors: Thomas Zey; Jan Willmann
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2009-03-19
Publication date: 2011-05-05
Anticipated expiration: 2029-03-20
Also published as: US8563315B2; GB2468765A; GB201004271D0; GB2468765B; US20100237230A1; DE102009013914A1

Abstract

Kalibriermischung für die Massenkalibrierung von Massenspektrometern mit APCI- oder APPI-Ionenquellen im Massenbereich unterhalb von 500 atomaren Masseneinheiten, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibriermischung mindestens fünf gesättigte Fettsäuren vorgegebener Konzentrationen in einem Lösungsmittel enthält.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Substanzgemische für die präzise Kalibrierung der Massenskala in Massenspektrometern, die mit Ionenquellen ausgerüstet sind, die bei Atmosphärendruck (AP) mit Ionisierungen der Analytmoleküle insbesondere durch APCI (chemische Ionisierung), aber auch durch APPI (Photoionisierung) arbeiten, oft bei hohen Temperaturen bis zu 470° Celsius.
In Flugzeitmassenspektrometern weicht die Massenskala nach neueren Erkenntnissen im unteren Massenbereich von der theoretisch erwartbaren Kalibrierkurve in manchmal irregulärer Weise ab, so dass eine enge und möglichst auch gleichmäßige Anordnung von Kalibrierstützpunkten notwendig ist, um für Substanzen mit niedrigem Molekülgewicht eine hohe Massengenauigkeit zu erzielen. Die genannten Ionisierungsarten werden in besonderen Ionenquellen angeboten, die statt der üblichen Elektrosprüh-Ionenquellen eingesetzt werden, meist in Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF-MS). Sie werden insbesondere für Analytmoleküle mit relativ niedrigem Molekülgewicht eingesetzt. Die Erfindung stellt Lösungen mit Kalibriersubstanzen bereit, die gut handhabbar, nicht toxisch, und bei den hohen Temperaturen stabil sind, sich sowohl positiv wie auch negativ ionisieren lassen, und im Massenbereich bis 500 atomaren Masseneinheiten (u) genügend Kalibrierungsstützpunkte liefern. Es werden in Toluol gelöste Gemische von gesättigten Fettsäuren, für Photoionisierung aber auch von Phenyl- und Naphtyl-Fettsäuren vorgeschlagen.
Stand der Technik
Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF-MS) werden gemeinhin mit Elektrosprüh-Ionenquellen (ESI), aber jüngst auch zunehmend mit Ionenquellen für andere Arten von Ionisierungen wie chemische Ionisierung und Photoionisierung betrieben. Da diese Ionenquellen bei Atmosphärendruck arbeiten, werden die Bezeichnungen APCI (atmospheric pressure chemical ionization) und APPI (atmospheric pressure photoionization) verwendet. Elektrosprüh-Ionenquellen werden gemeinhin mit Flüssigkeitschromatographen (HPLC = high Performance liquid chromatograph) gekoppelt; die APCI- und APPI-Ionenquellen erlauben es jedoch zusätzlich, auch Gaschromatographen (GC) anzuschließen, da die hiermit aufgetrennten Substanzen auch durch APCI und APPI ionisiert werden können. Diese Möglichkeit erweitert den Einsatz der OTOF-Massenspektrometer ganz außerordentlich, verlangt aber eine präzise Massenbestimmung im unteren Massenbereich.
In APCI- oder APPI-Ionenquellen werden dabei regelmäßig sehr hohe Temperaturen im Bereich von 200° bis 470° Celsius verwendet, damit die Solvathüllen von den Analytmolekülen entfernt werden und somit eine Ionisierung überhaupt erst stattfinden kann. Die Heizenergie wird über das Sprühgas zugeführt (manchmal auch Vernebelungsgas oder Zerstäubungsgas genannt). Wird keine Zufuhr der Analytsubstanzen über Gaschromatographen gewählt und wird die Analytlösung in flüssiger Form zugeführt, so zerstäubt das heiße Sprühgas diese Analytlösung. Diese Betriebsart der APCI- oder APPI-Ionenquelle findet ebenfalle bevorzugte Anwendung für leichte und besonders auf wenig polare bis apolare Analytsubstanzen, verwendet also auch hier insbesondere den unteren Massenbereich und verlangt hier ebenfalls besondere Massenpräzision. Die Ionisationen APCI und APPI erweitern den Bereich der zu analysierenden Substanzen auch auf die weniger polaren Substanzen.
Eine APCI-Ionenquelle verwendet ein ähnliches Gehäuse wie das einer Elektrosprüh-Ionenquelle. Die Sprüheinrichtung wird hier allein mit Sprühgas betrieben, das für die Zerstäubung und Verdunstung einer Lösung mit Analytmolekülen verwendet wird. Um die Verdunstung des Lösungsmittels und die Entfernung der Solvathülle von den Analytmolekülen zu bewirken, wird das Sprüh- oder Zerstäubungsgas (nebulizer gas) in einem Heizerblock stark aufgeheizt, auf Temperaturen, die bis zu 470° Celsius betragen. Die chemische Ionisierung erfolgt durch Reaktant-Ionen, die in einer Reaktionskette aus Primärionen aus Molekülen des Umgebungsgases, meist Luft, gebildet werden. Diese Primärionen werden in einer Corona-Entladung an der Spitze einer geeigneten Metallnadel erzeugt, an der einige Tausend Volt anliegen. Die Primärionen, meist Stickstoff-Ionen, reagieren mit den Wassermolekülen der Feuchtigkeit des Umgebungsgases zu komplexen Molekülen der Formen N_m(H₂O)_nH⁺ oder N_m(H₂O)_nOH^–, die zur Protonierung oder, im negativen Betriebsmodus, zur Deprotonierung der Analytmoleküle fähig sind und so die chemische Ionisierung bewirken.
Eine APPI-Ionenquelle ist einer APCI-Ionenquelle ähnlich, verwendet jedoch keine Corona-Entladung, sondern im Allgemeinen die Strahlung einer UV-Lampe zur Ionisierung. Werden UV-Laser eingesetzt, so spricht man von APLI (atmospheric Pressure laser ionization); dabei handelt es sich aber ebenfalls um eine Photoionisation. Es können damit nur Substanzmoleküle direkt ionisiert werden, die die UV-Strahlung absorbieren können; das sind im Wesentlichen aromatische Substanzen. Durch Zugabe einer aromatischen Mediator-Substanz wird diese ionisiert, und deren Ionen können dann als Reaktantionen viele Arten von Analytmolekülen chemisch ionisieren.
Beide Arten der Ionisierung lassen sich günstig mit der Flüssigkeitschromatographie koppeln und werden immer dann eingesetzt, wenn sich bestimmte wenig polare Substanzgruppen nicht durch Elektrosprühen ionisieren lassen. Im Gegensatz zu Biopolymeren wie beispielsweise Proteine, die sich hervorragend durch Elektrosprühen ionisieren lassen, gelingt die Ionisierung häufig nicht bei anderen Arten von organischen Substanzen; diese haben häufig relativ niedrige Molekülgewichte.
Die genannten Arten der Ionisierung lassen sich auch günstig mit der Gaschromatographie koppeln. Es wird dazu die gaschromatographische Trennkapillare bis in den Ionisierungsraum der Elektrosprüh-Ionenquelle geführt und entlässt dort die getrennten Analytsubstanzen in den Ionisierungsraum. Diese Kopplung der Gaschromatographie mit Flugzeitmassenspektrometern hoher Massengenauigkeit eröffnet neue Möglichkeiten einer sehr schnellen Erstellung eindeutiger Bruttoformeln für die Analytmoleküle. Bei den bisher üblichen Kopplungen der Gaschromatographie über Elektronenstoß-Ionenquellen mit Ionenfallen- oder Quadrupol-Massenspektrometern können wegen der geringeren Massengenauigkeit Identifizierungen der Substanzen nur über Spektrenvergleiche vorgenommen werden, was aber bei unbekannten Substanzen, beispielsweise bei der Analyse unbekannter Naturstoffe, versagt.
Die Kopplung eines OTOF-Massenspektrometers mit einem Gaschromatographen hat auch zur Entwicklung einer neuen Art von Ionisierung geführt: APLI (atmospheric Pressure laser ionization). Hier wird die Photonendichte im Strahl eines UV-Pulslasers ausgenutzt, aromatische Substanzen direkt durch Multiphotonenprozesse zu ionisieren. Dazu wird direkt vor der GC-Kapillare ein rechteckiger Querschnitt des Laserlichtpulsstrahls erzeugt, dessen Breite mit jedem Laserlichtpuls einen Teil des ausströmenden Trägergases erfasst, so dass, in Verbindung mit der Laserlichtpulsfrequenz (von meist 100 Hertz) das gesamte GC-Eluat erfasst wird. Es können damit hervorragend und mit höchster Empfindlichkeit die aromatischen Substanzen des GC-Eluats nachgewiesen werden. Durch die zusätzliche Anwendung von Mischungen aus aromatischen Mediatoren wie Benzol, Toluol oder dergleichen und nicht-aromatischen Mediatoren wie beispielsweise Chloroform ist es auch möglich, viele nicht-aromatische Substanzen zu ionisieren.
Bei der Entwicklung von OTOF-Massenspektrometem steht die Verbesserung der Massengenauigkeit für die Massenbestimmung von Analytionen ganz im Vordergrund. Es wird eine Massengenauigkeit von besser als einem Millionstel der Masse (einem ppm) angestrebt. Dabei wurde aber bisher das Augenmerk ganz auf den Massenbereich von etwa 500 bis zu einigen Tausend atomaren Masseneinheiten (u) gerichtet, weil das Haupteinsatzgebiet dieser Massenspektrometer auf dem Gebiet der Analyse von Biopolymeren liegt, hauptsächlich dem Gebiet der Proteinanalyse. Im Massenbereich unterhalb von 500 u wurde die Massengenauigkeit bisher vernachlässigt; erst in jüngster Zeit wurde erkannt, dass die Kalibrierkurve im unteren Massenbereich von der idealen Kalibrierfunktion deutlich abweicht und eine genaue Massenbestimmung verhindert.
In der Patentschrift von A. Brekenfeld DE 10 2007 027 143 B3 ( US 2008/0308724 A1 ) wird dargelegt, wie man die Abweichungen der Kalibrierkurve im unteren Massenbereich von der theoretisch zu erwartenden Kurve erklären und mathematisch mit sehr guter Näherung beschreiben kann. Die Näherung erlaubt es, die Massen der leichten Ionen im unteren Massenbereich von etwa 100 u bis 500 u auf nahezu ein Millionstel der Masse (1 ppm = 1 part per million) zu bestimmen, wenn die Koeffizienten der mathematischen Gleichung für die Kalibrierkurve durch genügend Stützpunkte für eine Kalibrierung genügend genau bestimmt werden können. Es ist besonders günstig, wenn die Stützpunkte gleiche Massenabstände voneinander haben.
In OTOF-Massenspektrometern, wie es in schematisch dargestellt ist, werden die Ionen eines Abschnittes aus einem feinen Ionenstrahl durch einen Ionenpulser (32) plötzlich senkrecht zu ihrer bisherigen Flugrichtung in die Flugstrecke (33) hinein beschleunigt. Sie werden dann in einem Reflektor (34) unter leichtem Winkel auf den Ionendetektor (36) reflektiert und dort als zeitlich veränderlicher Ionenstrom gemessen, der das Flugzeitspektrum darstellt. Die Beschleunigungsspannungen des Ionenpulsers (32) können aus Gründen der Leitungs- und Pulser-Kapazitäten nicht momentan eingeschaltet werden, sondern brauchen im anzustrebenden aperiodischen Grenzfall eine Einlaufkurve, deren Zeitkonstante bei einigen Nanosekunden liegt. Daher durchlaufen sehr leichte und schnell zu beschleunigende Ionen den Pulser, bevor die volle Beschleunigungsspannung erreicht ist. Das führt zu Abweichungen der Kalibrierkurve m/z = f(t) von der idealen Kurve m/z = a × t², wobei m/z die ladungsbezogene Masse, t die Flugzeit und a eine Konstante darstellt. Die besten Ergebnisse für eine relativ glatte Kalibrierkurve im unteren Massenbereich werden durch Einstellung des aperiodischen Grenzfalls erhalten. Wird der Idealfall des aperiodischen Grenzfalls nicht genau getroffen, so treten Überschwingungseffekte oder langsames Einschleichen auf, die zu noch größeren und manchmal irreguläreren Abweichungen führen. Leider lässt sich der aperiodische Grenzfall nicht immer beibehalten, da beispielsweise durch Alterungsprozesse der Elektronik, aber auch durch Temperaturänderungen Driften der Einstellungen vorkommen.
Die in der genannten Patentschrift gegebenen Näherungsgleichungen können für eine Kalibrierung des Massenspektrometers im unteren Massenbereich herangezogen werden. Es ist jedoch auch möglich, genaue Massenbestimmungen ohne Kenntnis einer mathematischen Näherungsgleichung durchzuführen, wobei die Massen zwischen den gespeicherten Stützpunkten der Massenskala jeweils mit einer Kurve n-ter Potenz interpoliert werden. Meist wird dabei durch Quadrierung der Flugzeiten t zunächst eine grobe Linearisierung in Bezug auf die Massenwerte m vorgenommen, da die Masse m in einem Flugzeitmassenspektrometer bis auf die oben angesprochenen Abweichungen proportional zum Quadrat t² der Flugzeit ist. Auch hier ist es vorteilhaft, wenn die Stützpunkte gleiche Massenabstände voneinander haben.
Da die genannten Ionisierungsarten APCI, APPI und APLI im Wesentlichen einfach geladene Molekülionen ohne Bruchstückionen liefern, ist für die Erzeugung eines Massenspektrums mit genügend Stützpunkten genau bekannter Massen notwendigerweise für jeden Stützpunkt eine eigene Kalibriersubstanz erforderlich, also insgesamt eine Mischung von Kalibriersubstanzen.
Es sind bereits Gemische von Substanzen bekannt, die für eine Kalibrierung der Massenskala in ESI-OTOF-Massenspektrometern verwendet werden können. Diese Gemische zielen aber bisher immer auf den hohen Massenbereich zwischen 500 und einigen Tausend atomaren Masseneinheiten, wobei regelmäßig im unteren Massenbereich nur sehr wenige Stützpunktmassen vorhanden sind. So wird beispielsweise in der Arbeit von S. J. Stout und A. R. daCunha „Tuning and Calibration in Thermospray Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Using Perfluorinated Alkyl Acids and Their Ammonium Salts” (Organic Mass Chemistry, 25, 187–190 (1990)), die wegen der verwendeten Substanzen der hier vorgestellten Erfindung am nächsten kommt, ein Gemisch aus durchgängig fluorierten Fettsäuren und deren Ammoniumsalze beschrieben, das aber im Massenbereich unterhalb von 500 u nur zwei Stützpunkte liefert. Außerdem zerfallen die Salze bei den hohen Temperaturen, die hier angewendet werden.
In der US-Patentschrif US 5 872 357 A (J. M. Flanagan, 1997) wird eine Mischung aus verschieden substituierten Triazatriphosphorinen beschrieben und unter Schutz gestellt. Das Massenspektrum der Mischung bietet Stützpunkte mit gleichmäßigen Massenabständen von jeweils 300 u oder 600 u, deren Massen präzise bekannt sind. Leider werden aber auch mit dieser Mischung trotz einer zusätzlich hinzugefügten Substanz, die im niedrigen Massenbereich einen weiteren Stützpunkt liefert, im unteren Massenbereich bis zu 500 u nur zwei Stützpunkte bereitgestellt. Die Mischung dieser Kalibriersubstanzen wird mit großem Erfolg kommerziell vertrieben, kann aber für präzise Massenbestimmungen aus den oben erläuterten Gründen nur im höheren Massenbereich von etwa 500 u bis zu etwa 3000 u eingesetzt werden. In diesem höheren Massenbereich lässt sich die Kalibrierkurve sehr exakt durch Näherungsgleichungen darstellen, die sehr glatt und steif verlaufen und nur wenige Stützpunkte brauchen.
Die Anforderungen an ein Gemisch von Kalibriersubstanzen für den unteren Massenbereich sind die folgenden:

– die Kalibriersubstanzen sollen bei Temperaturen bis 470°C thermisch stabil sein;
– sie sollen unterhalb von 500 u mindestens fünf, besser zehn Stützpunkte liefern;
– die Massen der Kalibriersubstanzen sollen möglichst gleiche Abstände besitzen;
– die Kalibriersubstanzen sollen sich positiv wie auch negativ ionisieren lassen;
– die Kalibriersubstanzen sollen nicht toxisch sein;
– die Kalibriersubstanzen sollen sich gemeinsam lösen lassen;
– die Lösung der Kalibriersubstanzen soll sich pulsförmig einspritzen lassen, wobei die Signale der Kalibriersubstanzen ohne Memory rasch wieder zurückgehen sollen.

Werden diese Anforderungen erfüllt, so lässt sich mit diesem Substanzgemisch ein automatisch arbeitendes Kalibrierverfahren erstellen, das regelmäßig vor oder sogar während analytischer Verfahrensläufe aufgerufen werden und Driften der Massenskalierung kompensieren kann. Eine Forderung nach einer Massengenauigkeit von einem Millionstel der Masse verlangt eine außerordentliche Stabilität aller thermischen, elektrischen und mechanischen Einflüsse auf das Massenspektrometer, die auch bei sorgfältigster Entwicklung nicht über längere Zeiten von Stunden konstant gehalten werden können. GC- und LC-Läufe können aber viele Stunden dauern.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, für die Massenkalibrierung von Flugzeitmassenspektrometern mit APCI-, APPI- oder APLI-Ionenquellen Mischungen von Kalibriersubstanzen bereitzustellen, die im Massenbereich unterhalb von 500 u mindestens fünf, besser mindestens zehn Stützpunkte für eine präzise Massenkalibrierung mit Massengenauigkeiten von einem Hunderttausendstel oder sogar einem Millionstel der Masse bietet und sich möglichst für ein automatisch ablaufendes Kalibrierverfahren eignet.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt insbesondere für APCI eine bevorzugt in Toluol gelöste Mischung gesättigter Fettsäuren (Alkancarbonsäuren) bereit, die im Bereich von 100 u bis 500 u genügend Stützpunktmassen für eine Kalibrierung der Massenskala liefert. Als gesättigte Fettsäuren der Mischung werden bevorzugt in geschlossener Reihe die ungeradzahligen Fettsäuren im Bereich von 5C-Atomen (Valeriansäure) bis zu 31C-Atomen verwendet, was 14 Stützpunkte ergibt. Es ist dabei günstig, dass diese ungeradzahligen Fettsäuren in der Natur selten vorkommen. Die Massenabstände betragen jeweils 28 u. Im positiven Betriebsmodus werden die protonierten Molekülionen der Fettsäuren gemessen, im negativen Modus kommen die deprotonierten Molekülionen zur Anwendung. Sie liefern im positiven Modus Stützpunkte von 103 u bis 467 u, im negativen Modus von 101 u bis 465 u. Die Fettsäuren sind ungiftig. Sie sind im Temperaturbereich bis 470° Celsius zumindest kurzfristig genügend stabil. Für APPI stellt das Lösungsmittel Toluol einen Mediator dar, mit dem bei weiterer Zugabe von Chloroform (Trichlorethan) als zweitem Mediator die Fettsäuren indirekt ionisiert werden können.
Für verbesserte Massenkalibrierungsspektren für APPI und APLI wird eine Mischung aus aromatisch modifizierten Fettsäuren (Phenyl- oder Naphtyl-Fettsäuren) vorgeschlagen, wobei die aromatischen Gruppen die Absorption der UV-Strahlung und damit eine direkte Ionisierung ermöglichen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
und zeigen die APCI-Massenspektren des vorgeschlagenen Gemischs aus ungeradzahligen gesättigten Fettsäuren im positiven ( ) und negativen ( ) Aufnahmemodus.
zeigt ein Schema eines Reflektor-Flugzeitmassenspektrometers mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF), das mit einer APCI-Ionenquelle im Gehäuse einer ESI-Ionenquelle (20) ausgerüstet ist. In der Ionenquelle (20) mit einer Sprühkapillare (21) in einem Heizerblock (22) mit Sprühgaszufuhr (23) werden durch eine Corona-Entladung an der Metallspitze (25) an Atmosphärendruck Ionen (24) erzeugt, die durch eine Kapillare (26) ins Vakuumsystem überführt werden. Ein Ionentrichter (27) sammelt die Ionen und schiebt sie durch ein Linsensystem (28) in das Ionenführungssystem (29), aus dem das Linsensystem (30) die Ionen heraussaugt und zu einem feinem Ionenstrahl formt. Ein Segment dieses primären Ionenstrahles wird im Pulser (32) durch plötzliches Einschalten einer Spannung senkrecht zur bisherigen Richtung unter Formung des Ionenstrahls (33) abgelenkt. Da diese Spannung erst in endlicher Zeit ihren Grenzwert annehmen kann, weicht die Massenskala im unteren Bereich physikalisch unumgänglich von der idealen Kurve ab. Der Ionenstrahl (33) wird im Reflektor (34) geschwindigkeitsfokussierend auf den Ionendetektor (36) reflektiert.
gibt die Verlaufskurve für die Ionenintensitäten nach APCI-Ionisierung des Kalibriergemischs wieder, die zeigt, dass die Ionensignale nach etwa 30 Sekunden wieder so weit verschwunden sind, dass der analytische Betrieb wieder aufgenommen werden kann.
Beste Ausführungsformen
Die Erfindung stellt insbesondere für APCI, aber auch für APPI, eine Mischung von Fettsäuren mit vorgegeben Konzentrationen bereit, die bevorzugt in Toluol gelöst sind und im Bereich niederer Massen zwischen 100 u bis 500 u genügend Stützpunktmassen für eine Kalibrierung der Massenskala liefern.
Als Fettsäuren der Mischung wird bevorzugt die geschlossene Reihe der gesättigten, unverzweigten, ungeradzahligen Fettsäuren im Bereich von 5 C-Atomen (Valeriansäure) bis zu 31 C-Atomen verwendet. Das ergibt 14 Stützpunkte. Diese kommen bei Pflanzen praktisch gar nicht, in tierischen Fetten nur sehr selten vor (maximal 5 Prozent). Sie besitzen leicht niedrigere Schmelz- und Siedepunkte als die geraden Fettsäuren, bezogen auf die Mittelwerte der beiden jeweils benachbarten Fettsäuren der kompletten Reihe, was für ihre Verdampfung günstig ist. Sie lassen sich thermisch stabil verdampfen. Die Massenabstände der ungeradzahligen Fettsäuren betragen jeweils 28 u, genauere Werte können aus den entsprechenden Tabellenwerken der Atomgewichte entnommen werden. Die Steuer- und Auswertungssoftware kommerzieller Massenspektrometer enthalten Tabellen und Programme zur präzisen Berechnung der Massen.
Im positiven Betriebsmodus werden die protonierten Fettsäuremolekülionen gemessen, im negativen Modus die deprotonierten. Die Fettsäuren sind ungiftig. Sie werden bevorzugt in Toluol (Toluen) gelöst angewendet; Toluol dient dabei für APPI als aromatischer Mediator für die Ionisierung der Fettsäuren. Da der Mediator Toluol nicht für die CI-Ionisierung aller Fettsäuren der Reihe geeignet ist, kann etwas Chloroform als zweiter Mediator hinzu gegeben werden. Die bevorzugte Mischung aus gesättigten, ungeradzahligen Fettsäuren von C5 bis C31 in geschlossener Reihe liefert im positiven Modus 14 Stützpunkte von 103 u bis 467 u, im negativen Modus 14 Stützpunkte von 101 u bis 465 u.
In einer Ionenquelle, wie sie in gezeigt ist, wird die Lösung der Fettsäuren in Toluol bevorzugt in den Heizerblock (22) für das Sprühgas eingespritzt, wobei möglichst direkt in den Eingang (23) für das Sprühgas eingespritzt wird. Der Heizerblock ist auf eine Temperatur von mindestens 350° Celsius, besser von 375° Celsius oder noch höher einzustellen. Es genügen ein bis zwei Mikroliter Lösung, um einige Sekunden lang Massenspektren aufnehmen zu können. Da OTOF-Massenspektrometer mit einer Aufnahmefrequenz von 5000 bis 10000 Einzelmassenspektren pro Sekunde arbeiten, die zu einem Summenspektrum addiert werden, wird in einigen Sekunden ein hervorragendes Massenspektrum für die Kalibrierung gewonnen. Wie aus ersichtlich, fallen die Signale der Kalibrierungssubstanzen schon nach etwa 30 Sekunden soweit ab, dass der analytische Betrieb wieder aufgenommen werden kann, beispielsweise mit einem neuen Chromatographie-Lauf. Es kann selbst innerhalb von längeren Chromatographie-Läufen eine Kalibrierung vorgenommen werden.
Obwohl durch das Lösungsmittel Toluol und zusätzlich zugeführtes Chloroform als Mediatoren die nichtaromatischen Fettsäuren der vorgeschlagenen Mischung auch durch APPI und APLI einigermaßen gut ionisiert werden, wird für APPI und APLI eine Mischung aus aromatisch modifizierten Fettsäuren (Phenyl- oder Naphtyl-Fettsäuren) vorgeschlagen, die ein verbessertes Massenspektrum der Stützpunkte ergibt, weil die aromatischen Gruppen die direkte Absorption der UV-Strahlung und damit eine direkte Ionisierung ermöglichen. Die Phenyl- und Naphtyl-Fettsäuren sind gleichfalls nicht toxisch. Es werden auch hier bevorzugt die ungeradzahligen, unverzweigten, gesättigten Fettsäuren verwendet.
In den und sind die positiven und negativen APCI-Massenspektren der bevorzugten Mischung aus gesättigten, ungeradzahligen Fettsäuren von C5 bis C31 gezeigt. Die Ionensignale zwischen den 14 Stützpunktmassen stammen weitgehend vom Toluol in verschiedenen Hydroxylierungszuständen und von Komplexionen aus Fettsäuren mit Toluol. Beide Massenspektren sind hervorragend für die Massenskalierung verwendbar. Ungleiche Signalhöhen der Fettsäuren können durch Änderungen der Konzentrationen ausgeglichen werden.
Die Forderung nach einer Mischung von Kalibriersubstanzen, die den unteren Massenbereich bis zu 500 u abdecken, stammt von erst jüngst erforschten Abweichungen der Kalibrierkurve von der idealen Funktion m/z = a × t², die in praktisch allen Flugzeitmassenspektrometern auftreten müssen, die mit einer gepulsten Beschleunigung arbeiten. Dieser Effekt tritt auch bei Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonalem Einschuss der Ionen auf, weil auch hier die Ionen einer plötzlich eingeschalteten Beschleunigung unterworfen werden.
zeigt schematisch ein solches Flugzeitmassenspektrometer, wie es dem Stand der Technik entspricht. In einer Ionenquelle (20) mit einer Sprühkapillare (21) in einem Heizerblock (22) mit Sprühgaszufuhr (23) werden durch eine Corona-Entladung an der Metallspitze (25) an Atmosphärendruck Ionen (24) erzeugt, die durch eine Kapillare (26) ins Vakuumsystem gebracht werden. Ein Ionentrichter (27) sammelt die Ionen und leitet sie durch ein Linsensystem (28) in ein Ionenführungssystem (29), aus dem Ionen durch ein weiteres Linsensystem (30) zu einem feinen Ionenstrahl geformt werden. Der Pulser (32) wird mit den Ionen dieses feinen Primärstrahls beschickt. Zwischen Linsensystem (30) und Pulser (32) ist die Flugstrecke durch eine Kapselung (31) abgeschirmt, um den gegenseitigen elektrischen Einfluss von Linsensystem (30) und Pulser (32) aufeinander und besonders alle elektrischen und magnetischen Störungen des Primärionenstrahls zu mindern. Der Pulser (32) pulst einen Abschnitt des Primärionenstrahls orthogonal aus, wodurch ein Ionenstrahl (33) entsteht. Der Ionenstrahl (33) wird im Reflektor (34) geschwindigkeitsfokussierend reflektiert und im Detektor (36) gemessen.
Durch das Einschalten der Spannungen an den Beschleunigungsblenden im Pulser (32), die sich nur mit einer Zeitkonstante von einigen Nanosekunden dem gewünschten Grenzwert nähern, besteht hier das eingangs geschilderte Problem der Verzerrung der Kalibrierkurve im unteren Massenbereich. Der besonders günstige aperiodische Grenzfall für das Einschwingen ist schwierig einzustellen und nicht immer während des Betriebes einzuhalten. Beim Schalten ist möglichst ein periodisches Überschwingen der Beschleunigungsspannung zu vermeiden, da sonst die Schwingungen auf die Kalibrierkurve abgebildet werden und die Kalibrierung weiter erschweren. Doch ist dieses Überschwingen nicht immer völlig zu vermeiden, da meist nicht nur eine einzige, sondern gleichzeitig mehrere Spannungen geschaltet werden müssen.
Die Massenbestimmung auf besser als ein Hunderttausendstel der Masse, möglichst sogar auf ein Millionstel, ist insbesondere für die Berechnung der Bruttoformeln der untersuchten Substanzen erforderlich. Das Problem ist dem einschlägigen Fachmann bekannt.
Insbesondere bei der Kopplung der Gaschromatographie mit Flugzeitmassenspektrometern hoher Massengenauigkeit ist die Erstellung eindeutiger Bruttoformeln für die Analytmoleküle von entscheidender Bedeutung. Bei den bisher üblichen Kopplungen der Gaschromatographie über Elektronenstoß-Ionenquellen mit Ionenfallen- oder Quadrupol-Massenspektrometern können wegen deren geringerer Massengenauigkeit Identifizierungen der Substanzen nur über Spektrenvergleiche vorgenommen werden, was aber bei unbekannten Substanzen, beispielsweise bei der Analyse unbekannter Naturstoffe, versagt.
Eine „Kalibrierkurve” ist im Prinzip eine Gleichung, die den Zusammenhang zwischen Masse und Flugzeit exakt beschreibt. Es wird der Begriff der Kalibrierkurve aber durchaus auch auf Näherungsgleichungen angewandt. Die Kalibrierkurve enthält eine Reihe von Koeffizienten, die durch einen Vergleich bekannter Massen der Ionen von Kalibriersubstanzen mit ihren gemessenen Flugzeiten durch ein Anpassungsprogramm (meist durch Minimierung der quadrierten Abweichungen) bestimmt werden können.
Die vorgeschlagenen Mischungen der Fettsäuren in Lösung können sehr gut für ein manuelles oder auch automatisiertes Kalibrierverfahren verwendet werden. In beiden Fällen wird die Lösung in den Heizerblock (22) eingespritzt, bevorzugt in den Eingang (23) für das Sprühgas. Das Einspritzen kann durch eine manuell oder motorisch betätigte Injektionsspritze erfolgen. Da sich die Nadel der Injektionsspritze im noch kühlen Sprühgas befindet, wird nach der Injektion kaum weiteres Lösungsmittel nachgeliefert; jedoch ist es vorteilhaft, die Injektionsspritze nach der Injektion zurückzuziehen, oder zumindest das Lösungsmittel in der Nadel der Injektionsspritze zurückzuziehen. Die automatische Kalibrierung verlangt den Einbau einer motorisch betätigten Injektionsspritze, die zumeist von der gegenwärtig eingebauten Steuersoftware gesteuert werden kann; dieses ist dem einschlägigen Fachmann bekannt.

Claims

Kalibriermischung für die Massenkalibrierung von Massenspektrometern mit APCI- oder APPI-Ionenquellen im Massenbereich unterhalb von 500 atomaren Masseneinheiten, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibriermischung mindestens fünf gesättigte Fettsäuren vorgegebener Konzentrationen in einem Lösungsmittel enthält.
Kalibriermischung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine geschlossene Reihe der ungeradzahligen gesättigten Fettsäuren enthält.
Kalibriermischung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine geschlossene Reihe der ungeradzahligen gesättigten Fettsäuren ab Valeriansäure enthält.
Kalibriermischung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäuren in Toluol gelöst sind.
Kalibriermischung für die Massenkalibrierung von Massenspektrometern mit APPI- oder APLI-Ionenquellen im Massenbereich unterhalb von 500 atomaren Masseneinheiten, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibriermischung Phenyl-Fettsäuren oder Naphtyl-Fettsäuren vorgegebener Konzentrationen in einem Lösungsmittel enthält.
Kalibriermischung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine geschlossene Reihe der ungeradzahligen gesättigten Fettsäuren enthält.
Kalibriermischung nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Phenyl- oder Naphtyl-Fettsäuren in Toluol gelöst sind.
Verfahren zur Kalibrierung eines Massenspektrometers im Massenbereich unterhalb von 500 atomaren Masseneinheiten mit einer Kalibriermischung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibriermischung gepulst in den Heizerblock für die Aufheizung des Sprühgases einer APCI- oder APPI-Ionenquelle gespritzt wird.
Verfahren zur Kalibrierung eines Massenspektrometers mit einer APPI- oder APLI-Ionenquelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Mediatorsubstanzen für die Ionisierung der Fettsäuren sowohl aromatische wie auch nicht-aromatische Substanzen eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Mediatorsubstanzen Toluol und Chloroform eingesetzt werden.