JP2002507883A - マススペクトロメトリーに基づくｄｎａ診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物試料中の特定核酸配列を検出するための迅速で高精度のマススペクトロメトリーに基づく方法を提供する。検出しようとする配列に応じて、本方法は例えば遺伝病もしくは染色体異数、疾病もしくは症状の予後、病原生物による感染を診断するため、又は同一性もしくは遺伝を判定するために使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 マススペクトロメトリーに基づくＤＮＡ診断法 発明の背景 突然変異の検出 全生物（例えば動物、植物及び微生物）の遺伝情報はデオキシリボ核酸（ＤＮ Ａ）でコードされている。ヒトでは、完全ゲノムは２４染色体に位置する約１０ ０，０００個の遺伝子から構成される（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，Ｔ ．Ｓｔｒａｃｈａｎ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ，１９９２）。各ゲノムは、転写及び翻訳による発現後に生細胞内で特定の生化 学機能を果たす特定タンパク質をコードする。ＤＮＡ配列の変異は突然変異とし て知られており、生化学活性が変化したり、場合によっては失われたタンパク質 を生じ、遺伝病の原因となる。突然変異にはヌクレオチド欠失、挿入又は置換（ 即ち点突然変異）がある。点突然変異には、タンパク質のアミノ酸配列に変異を 生じる「ミスセンス」と、ストップコドンをコードしてタンパク質を切断する「 ナンセンス」がある。 現在知られている遺伝病は３０００種を越え（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍ ｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｄ．Ｎ．ＣｏｏｐｅｒとＭ．Ｋｒａｗｃｚａｋ，ＢＩＯＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９３）、血友病、タラセミア、デュシェン筋ジスト ロフィー（ＤＭＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病及び嚢胞性線 維症（ＣＦ）等がある。遺伝病の原因となる遺伝子の突然変異に加え、トリソミ ー２１（ダウン症候群）、トリソミー１３（パトー症候群）、トリソミー１８（ エドワーズ症候群）、モノソミーＸ（ターナー症候群）及び他の性染色体異数（ 例えばクラインフェルター症候群（ＸＸＹ））等の染色体異常による先天性欠損 もある。更に、糖尿病、動脈硬化症、肥満、種々の自己免疫疾患及び癌（例えば 結腸直腸、乳房、卵巣、肺）等の多数の疾病は特定のＤＮＡ配列が個体に素因を 与えるらしいということが立証されつつある。 ウイルス、細菌、真菌及び他の感染性生物は宿主細胞に含まれる配列とは異な る特定核酸配列を含む。従って、感染性生物もその特定ＤＮＡ配列に基づいて検 出及び同定することができる。 約１６ヌクレオチドの配列はヒトゲノムのサイズでも統計的 に特異的であるので、比較的短い核酸配列を使用して高等生物における正常及び 欠損遺伝子を検出し、感染性生物（例えば細菌、真菌、原生生物及び酵母）及び ウイルスを検出することができる。同一種内の各個体の検出用フィンガープリン トとしてＤＮＡ配列を使用することもできる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．とＭ ．Ｗ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗ． Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９１） 参照）。 数種のＤＮＡ検出法が現在使用されている。例えば、増幅した核酸フラグメン トの移動度をゲル電気泳動又は同定しようとする配列に相補的なプローブとのハ イブリダイゼーションにより既知標準と比較することにより核酸配列を同定する ことができる。しかし、核酸フラグメントを感受性リポーター官能基（例えば放 射性同位体（³²Ｐ，³⁵Ｓ）、蛍光又は化学発光）で標識しなければ同定すること ができない。放射性ラベルは危険であり、ラベルが発生するシグナルは経時的に 減衰する。非同位体ラベル（例えば蛍光）は感度が不十分であり、高強度レーザ ーを使用する間にシグナルが減衰する。更に、標識と電気泳動後に検出するのは 手間と時間がかかり、エラーが発生し易い方 法である。電気泳動は核酸のサイズ又は分子量をゲルマトリックス中の移動度に 直接相関することができないので特にエラーが発生し易い。配列特異効果、二次 構造及びゲルマトリックスとの相互作用がアーチファクトの原因であることが分 かっている。 核酸の検出及び同定のためのマススペクトロメトリーの使用 マススペクトロメトリーは個々の分子を真空中でイオン化し、揮発により「飛 翔」させることにより「計量する」手段である。電場及び磁場の併用作用下でイ オンは夫々の個々の質量（ｍ）と電荷（ｚ）に応じた飛翔経路をたどる。低分子 量分子の範囲では、マススペクトロメトリーは親分子イオンの質量の測定により 有機分子を分析及び特性決定する日常的物理−有機手段の一つとして多年来用い られている。更に、この親分子イオンと他の粒子（例えばアルゴン原子）を衝突 させることにより分子イオンを断片化し、所謂衝突誘導解離（ＣＩＤ）により二 次イオンを形成する。断片化パターン／経路から詳細な構造情報が得られること は非常に多い。技術分野、特に生命科学ではマススペクトロメトリー法の多数の 応用が知られている（例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ ．１９３： “Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”（Ｊ．Ａ．ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ編）， １９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。 マススペクトロメトリーは高い検出感度、質量測定精度、ＣＩＤとＭＳ／ＭＳ コンフィギュレーション及び速度の組み合わせによる詳細な構造情報並びにオン ラインコンピューターデータ転送を実現するという明白な分析上の利点があるた め、核酸の構造分析にマススペクトロメトリーを使用することに関心が寄せられ ている。この分野を要約した最近の文献としては、Ｋ．Ｈ．Ｓｃｈｒａｍ，“Ｍ ａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｍ ｐｏｎｅｎｔｓ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍ ａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”３４，２０３−２８７（１９９０）と、Ｐ ．Ｆ．Ｃｒａｉｎ，“Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，”Ｍａｓｓ Ｓ ｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９，５０５−５５４（１９９０）が あり、更に米国特許第５，５４７，８３５号及び同５，６２２，８２４号にも記 載されている。 しかし、核酸は非常に揮発しにくい高極性バイオポリマーである。従って、マ ススペクトロメトリー検出は低分子量合成オリゴヌクレオチドに限られ、親分子 イオンの質量を測定することにより既知オリゴヌクレオチド配列を確認するため 、あるいは特に高速原子衝突（ＦＡＢマススペクトロメトリー）又はプラズマデ ソープション（ＰＤマススペクトロメトリー）をイオン化及び揮発に使用してＭ Ｓ／ＭＳコンフィギュレーションでＣＩＤにより二次イオン（フラグメントイオ ン）を生成することにより既知配列を確認するために使用されている。１例とし て、オリゴデオキシヌクレオチドの化学合成用保護ダイマーブロックの合成にＦ ＡＢを適用した例が記載されている（Ｋｏｓｔｅｒら（１９８７）Ｂｉｏｍｅｄ ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ １４，１１１−１１ ６）。 他のイオン化／脱着技術としては、エレタトロスプレー／イオンスプレー（Ｅ Ｓ）及びマトリックス介助レーザーデソープション／イオン化（ＭＡＬＤＩ）か ある。ＥＳマススペクトロメトリーはＦｅｎｎら（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８ ８：４４５１−５９（１９８４）；ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１４１４８号）によ り開発され、現在の適用例は論文に要約されている（例 えばＳｍｉｔｈら（１９９０）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６２．８８２−８９及びＡ ｒｄｒｅｙ（１９９２）Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏ ｍｅｔｒｙ，Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ Ｅｕｒｏｐｅ ４：１０−１８参照） 。テトラデカヌクレオチド（Ｃｏｖｅｙら（１９８８）Ｔｈｅ“Ｄｅｔｅｒｍｉ ｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎ ｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔｓ ｂｙ Ｉｏｎｓｐ ｒａｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，”Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ２：２４９−２５６参照）及び２ １量体（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９３，“Ｍａｓｓ Ｓｐ ｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”（ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ編），ｐ．４２５，１９９０，Ａ ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の分子量が公表されている。 マススペクトロメーターとしては、四重極が最も多く使用されている。多重イオ ンピークが存在し、その全てを質量計算に利用できるため、フェムトモル量の試 料の分子量を非常に正確に測定できる。 他方、ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーは飛行時間（ＴＯ Ｆ）コンフィギュレーション（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐら（１９９０）ｐｐ４９− ６０ ｉｎ“Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ ＵＶ−Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒ ｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍ ａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌ ｅｓ，”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｂｕｒ ｌｉｎｇａｍｅ ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅ ｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）を質量分析計として使用 する場合に有利であると思われる。殆どの場合、この技術では多重分子イオンピ ークが生成されないので、質量スペクトルは一般にＥＳマススペクトロメトリー よりも単純に思われる。 分子量４１０，０００ダルトンまでのＤＮＡ分子は脱着及び揮発されている（ Ｗｉｌｌｉａｍｓら，“Ｖｏｌａｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ ｂｕ Ｐｕｌｓｅｄ Ｌａｓｅｒ Ａ ｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒｏｚｅｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ， ”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６，１５８５−８７（１９８９））が、この技術は非常 に低い分解能しか示していない（オ リゴチミジル酸１８ヌクレオチドまで、Ｈｕｔｈ−ＦｅｈｒｅらＲａｐｉｄ Ｃ ｏｍｍｕｎ．ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｒｏｍ．，６，２０９−１３（１９９２ ）；ＤＮＡフラグメント５００ヌクレオチド長まで，Ｋ．Ｔａｎｇら，Ｒａｐｉ ｄ Ｃｏｍｍｕｎ．ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｒｏｍ．，８，７２７−７３０（ １９９４）；及び２８塩基対の２本鎖ＤＮＡ（Ｗｉｌｌｉａｍら，“Ｔｉｍｅ− ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ Ｌａｓｅｒ Ａｂｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｏｎｉｚ ａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ Ｆｒｏｚｅｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｍａｔｒｉｘ，” Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｒｏｍ．，４，３４８− ３５１（１９９０））。日本特許第５９−１３１９０９号は電気泳動、液体クロ マトグラフィー又は高速ゲル濾過により分離した核酸フラグメントを検出する装 置を記載している。ＤＮＡ中に通常は存在しないＳ、Ｂｒ、Ｉ又はＡｇ、Ａｕ、 Ｐｔ、Ｏｓ、Ｈｇ等の原子を核酸に組み込むことによりマススペクトロメトリー 検出を実施している。 本願と同一名義の米国特許第５，６２２，８２４号はマスス ペクトロメトリー検出に基づくＤＮＡシーケンシング方法を記載している。これ を実施するために、保護、酵素活性特異性又は固定化を利用し、エキソヌクレア ーゼ消化によりＤＮＡを段階的に片側分解し、ヌクレオチド又は誘導体をマスス ペクトロメトリーにより検出している。酵素分解前にクローン化ＤＮＡフラグメ ントに数組の定序欠失を作ることができる。こうして、ェキソヌクレアーゼとＤ ＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼの組み合わせを使用して質量改変ヌクレオチドを組み 込むことができる。この結果、多重マススペクトロメトリー検出又はエキソヌク レアーゼの活性の調節が可能になり、分解プロセスを同期させることができる。 本願と同一名義の米国特許第５，６０５，７９８号及び５，５４７，８３５号は 生物試料における特定核酸配列の検出方法を提供している。これらの方法は、検 出しようとする配列に応じて例えば診断法で使用することができる。これらの方 法は用途が広く、多数の態様に適用できるが、この種の適用の最初の開示である ため、改善の余地がある。 従って、本発明の目的は生物試料中のＤＮＡ分子を配列決定及び検出するため の改善方法を提供することである。本発明の別の目的は、遺伝病、所定の疾患の 素因、癌及び感染を診断す るための改善方法を提供することである。 発明の要約 本発明は、マススペクトロメトリーに基づいて核酸を検出及び／又は配列決定 することによる診断法を提供する。ＭＳ分析を使用して２本鎖ＤＮＡを検出し、 突然変異及び他の診断マーカーを検出する方法を提供する。特に、神経芽細胞腫 を診断し、遺伝関係、ＨＬＡ適合性、遺伝フィンガープリンティングを検出し、 癌診断のためにテロメラーゼ活性を検出する方法を提供する。 所定の態様ではＤＮＡを固体支持体に直接又はリンカー及び／又はビーズを介 して固定化する。固定化ＤＮＡを使用するＤＮＡ検出法の３種の例を挙ける。（ １）鋳型の固定化；プライマーのハイブリダイゼーション；プライマーの伸長又 はシーケンシングもしくは診断用プライマー（１本鎖ｄｄＮＴＰ）の伸長又はプ ライマーの伸長とエンドヌクレアーゼ分解（シーケンシング）；（２）プライマ ーの固定化；１本鎖鋳型のハイブリダイゼーション；及びプライマーの伸長又は シーケンシングもしくは診断用プライマー（１本鎖ｄｄＮＴＰ）の伸長又はプラ イマーの伸長とエンドヌクレアーゼ分解（シーケンシング）； （３）プライマーの固定化；２本鎖鋳型のハイブリダイゼーション；プライマー の伸長又はシーケンシングもしくは診断用プライマー（１本鎖ｄｄＮＴＰ）の伸 長又はプライマーの伸長とエンドヌクレアーゼ分解（シーケンシング）。 所定の態様では選択的に開裂可能なリンカーを介してＤＮＡを支持体に固定化 する。選択的に開裂可能なリンカーの非限定的な例としては光開裂性リンカー、 化学開裂性リンカー及び酵素（例えば制限部位（核酸リンカー）、プロテアーゼ 部位）開裂性リンカーが挙げられる。選択的に開裂可能なリンカーを加えると、 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳに適したＤＮＡの全固定化が可能になり、核酸の３’ 又は５’末端を介してＤＮＡを支持体に結合でき、増幅ＤＮＡ又はターゲットプ ライマーをＤＮＡ合成により伸長することができ、更に伸長産物（又はエキソヌ クレアーゼ分解による分解産物）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析に適した寸法 にすることができる（即ち単離又は合成ＤＮＡを大きくすることができ、小さい プライマー又は大きいプライマー配列を使用して遺伝子の小さい制限フラグメン ト又はその１本鎖をハイブリダイズすることができる）ので、ＭＡＬＤＩ−ＴＯ Ｆ ＭＳ分析の機能が広がる。 好ましい態様では、選択的に開裂可能なリンカーはマススペクトロメトリーの イオン化段階中に開裂される化学又は光開裂性リンカーである。リンカーの例と しては、ジスルフィド基、ロイビニル基、酸レービルトリチル基及び疎水性トリ チル基を含むリンカーが挙げられる。他の態様では、酵素開裂性リンカーとして 、ＲＮＡヌクレオチドであるか又は制限エンドヌクレアーゼ部位をコードする核 酸を利用できる。他の酵素開裂性リンカーとしては、ピロリン酸基、アルギニン ーアルギニン基及びリジン−リジン基が挙げられる。他のリンカーも本明細書中 に例示する。 本発明は、ＤＮＡの長いフラグメントを配列決定する方法を提供する。このよ うな配列決定を実施するためには、特定塩基を末端にもつフラグメントをターゲ ット核酸から生成する。全長核酸でなくフラグメントを分析すると、測定しよう とするイオンの質量は、一般にマススペクトロメトリーにより検出し易い低質量 範囲にシフトする。例えば、低質量にシフトすると、質量分解能、質量精度及び 特に検出感度が増す。ハイブリダイゼーションイベントとマススペクトロメトリ ーにより測定したフラグメントの実測分子量から配列情報が得られる（例えば突 然変異の存在及び／又は種類）。好ましい態様では、ハイブリダイゼーション及 び／又はマススペクトロメトリー検出前にフラグメントを固体支持体に捕獲する 。別の好ましい態様では、生成したフラグメントを並べてより大きい核酸の配列 を提供する。 核酸から特定塩基を末端にもつフラグメントを生成する方法の好ましい１例は 、適量のターゲット核酸を適量の特異的エンドヌクレアーゼと接触させ、ターゲ ット核酸を部分的又は完全に消化することにより実施される。反応が完全に行わ れないとしても、エンドヌクレアーゼは一般に配列を約５０〜７０ヌクレオチド 以下の部分に分解する。好ましい態様では、核酸はリボ核酸であり、エンドヌク レアーゼはＧ特異的ＲＮアーゼＴ₁、Ａ特異的ＲＮアーゼＵ₂、Ａ／Ｕ特異的ＲＮ アーゼＰｈｙＭ、Ｕ／Ｃ特異的ＲＮアーゼＡ、Ｃ特異的ニワトリ肝ＲＮアーゼ（ ＲＮアーゼＣＬ３）又はクリサビチンから選択されるリボヌクレアーゼ（ＲＮア ーゼ）である。別の好ましい態様では、エンドヌクレアーゼはターゲット核酸内 に含まれる少なくとも１個の部位を開裂する制限酵素である。特定塩基を末端に もつフラグメントを生成するための別の好ましい方法は、増幅と（例えば 連鎖停止ヌクレオチドに対して比較的低い親和性をもち、ターゲットの指数的増 幅を生じる第１のＤＮＡポリメラーゼと、連鎖停止ヌクレオチドに対して比較的 高い親和性をもち、重合の塩基特異的停止を生じるポリメラーゼとを適量使用す る）塩基特異的ターミネーション反応を併用実施する。ターゲット核酸の５’及 び／又は３’末端にタグを付けると、フラグメントを並べ易くなる。 本発明は未知核酸の配列の決定方法として、ターゲット核酸の５’及び／又は ３’末端にタグを付けてもよい方法を提供する。３’末端に非天然タグを付けて も有用であり、３’不均一性、早期停止及び非特異的伸長の影響を防止又は補償 できる。好ましい態様では、タグはアフィニティータグ（例えばビオチン又は捕 獲核酸にハイブリダイズする核酸）である。アフィニティータグは核酸を固体支 持体に結合し易くするものが最も好ましい。別の好ましい態様では、タグは質量 マーカー（即ち４種のヌクレオチドのいずれの質量にも対応しない質量のマーカ ー）である。更に別の態様では、タグはポリＡテール又は例えば転写反応に起因 し得る天然３’不均一性等の天然タグである。 本発明は、生物試料から得た核酸分子から核酸を複製し、１ 種以上のヌクレアーゼ（ＤＮＡにはデオキシリボヌクレアーゼ及びＲＮＡにはリ ボヌクレアーゼ）を使用して特異的に消化する配列分析方法を提供する。対応す る相補的配列を担持する固体支持体にフラグメントを捕獲させる。ハイブリダイ ゼーションイベントと捕獲ターゲット配列の実測分子量から遺伝子の突然変異に 関する情報が得られる。マススペクトロメトリーを使用してアレーをスポット毎 に分析することができる。更に、生成したフラグメントを並べると、より大きい ターゲットフラグメントの配列が得られる。 別の態様では、予想される突然変異を検出しようとする部位の近傍で、３’末 端塩基をもつ少なくとも１個のプライマーをターゲット核酸にハイブリダイズす る。３種のヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）にターミネーターとしての第４のヌ クレオシド三リン酸を加えた１組のヌクレオシド三リン酸と適当なポリメラーゼ を反応させる。伸長反応産物をマススペクトロメトリーにより測定し、突然変異 の存在及び種類を調べる。３種のＮＴＰと１種のｄｄ−ＮＴＰ（又は３種のＮＴ Ｐと１種の３’−デオキシＮＴＰ）の組み合わせを変えると、ターゲット核酸配 列中の（複合ヘテロ接合体を含む）数種の突然変異を区別する ことができる。 本発明は、組織又は細胞試料中の新形成／悪性の検出及び診断方法を提供する 。本方法はテロメア反復増幅プロトコール(ＴＲＡＰ)−ＭＳアッセイに基づき、 ａ）臨床単離物又は被疑細胞培養物等の組織又は細胞試料を得る段階と、 ｂ）試料からテロメラーゼを単離／抽出／精製する段階と、 ｃ）合成ＤＮＡのテロメラーゼ特異的伸長を生じる条件下で、場合により固定化 したテロメア反復に相補的な合成ＤＮＡプライマーと全４種のｄＮＴＰを含む組 成物にテロメラーゼ抽出物を加える段階と、 ｄ）好ましくはチオール化学又はストレプトアビジンに基づく部分等の「リンカ ー部分」を含むプライマーを使用してテロメラーゼ伸長ＤＮＡ産物を増幅する段 階と、 ｅ）例えば固体支持体に固定化した相補的結合パートナーを使用してリンカー増 幅プライマーを単離する段階と、 ｆ）場合によりＤＮＡを結晶形成のために条件付けする段階と、 ｇ）試料をイオン化／揮発させることによりＭＳを実施し、ＤＮＡ産物を検出す る段階を含む。テロメラーゼ特異的伸長は新 形成／悪性を表す。この方法を使用すると、特定悪性を検出することができる。 ＭＳを使用してＤＮＡ産物を検出すると、試料中のテロメラーゼ活性を表す伸長 産物を同定することができる。所望により、合成ＤＮＡはアレー形態でもよい。 本発明は、癌遺伝子の突然変異の検出方法と、新形成を表す形質転換細胞をス クリーニングするためのその使用を提供する。癌遺伝子に存在する突然変異の検 出は形質転換を表す。本方法は、 ａ）生物試料を得る段階と、 ｂ）１個のプライマーが固定化のためのリンカー部分をもつようにして形質転換 を表すコドンを含む選択した癌原遺伝子の一部を増幅する段階と、 ｃ）場合によりアレーの形態で固体支持体にリンカー部分を介してＤＮＡを固定 化する段階と、 ｄ）コドンの上流の癌原遺伝子配列に相補的なプライマーをハイブリダイズする 段階と、 ｅ）３ｄＮＴＰ／１ｄｄＮＴＰとＤＮＡポリメラーゼを加え、ハイブリダイズし たプライマーを次のｄｄＮＴＰロケーションまで伸長する段階と、 ｆ）試料をイオン化／揮発させる段階と、 ｇ）伸長ＤＮＡの質量を検出し、質量によって野生型対立遺伝子が存在するか又 は突然変異対立遺伝子が存在するかを判断し、コドンに突然変異対立遺伝子が存 在する場合には新形成であると診断する段階を含む。１態様では、伸長−ＭＳ分 析を使用してレトロウイルス（ＲＥＴ）癌原遺伝子における突然変異コドン６３ ４の存在を検出する。 別の態様では、形質転換細胞で発現される遺伝子の逆転写と増幅を使用して疾 患を診断する方法を提供する。特に、腫瘍細胞では発現されるが、正常骨髄細胞 等の正常細胞では発現されないカテコールアミン生合成酵素であるチロシンヒド ロキシラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）−ＭＳを使用して神経芽細胞腫を診断する方 法を提供する。本方法は、 ａ）組織試料を得る段階と、 ｂ）試料からポリＡ ＲＮＡを単離する段階と、 ｃ）逆転写を使用してｃＤＮＡライブラリーを調製する段階と、 ｄ）１個のオリゴプライマーがリンカー部分をもつようにして選択した遺伝子の ｃＤＮＡ産物又はその一部を増幅する段階と、 ｅ）リンカー部分を介してＤＮＡを固体支持体に固定化するこ とにより増幅産物を単離する段階と、 ｆ）場合によりＤＮＡを条件付けする段階と、 ｇ）試料をイオン化／揮発させ、選択した遺伝子の発現を表すＤＮＡピークの存 在を検出する段階を含む。例えば、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子の発現は神 経芽細胞腫を表す。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用して２本鎖核酸を直接検出する方法も提供す る。これらの方法は、 ａ）増幅法又は１本鎖ＤＮＡフラグメントのハイブリダイゼーションにより形成 したＭＳに適した寸法の２本鎖ＤＮＡを単離する段階と、 ｂ）ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ比を増加する条件として、低温（即ち４℃）で分析 用試料を調製することと、マトリックス中で高いＤＮＡ濃度を使用してデュプレ クス形成を誘導することのうちの１つ又は全部を含む条件下で分析用２本鎖ＤＮ Ａを調製する段階と、 ｃ）例えばイオン化用閾値照射を僅かに上回るレベルにレーザー出力を調節する ことにより、デュプレクスＤＮＡの維持を助長するように低いイオン加速電圧を 使用して段階ｂ）の試料をイオン化／揮発させる段階と、 ｄ）適当な質量のｄｓＤＮＡの存在を検出する段階を含む。好ましい態様では、 マトリックスは３−ヒドロキシピコリン酸を含む。検出されるＤＮＡは遺伝異常 、遺伝病、疾患染色体異常の遺伝素因を表す。他の態様では、２本鎖ＤＮＡの質 量は欠失、挿人、突然変異を表す。 本発明は、プライマーオリゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）と呼ぶ方法を提供する。 この方法は単一検出プライマーを使用した後、オリゴヌクレオチド伸長段階を実 施し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより容易に分解可能な産物 を得る。産物は多数の反復単位又は反復領域内の第２の部位突然変異に特異的な 数の塩基分だけ長さが異なる。この方法の１例では、ヒト染色体２１に位置する インターフェロン−αレセプター遺伝子のイントロン５におけるＡｌｕＶｐＡ多 型性と、ヒト染色体７に位置するＣＦＴＲ遺伝子からのイントロン８のスプライ ス受容部位のポリＴトラクトをモデルシステムとして使用する。この方法は例え ばマイクロサテライトＤＮＡのＰＲＯＢＥ−ＭＳ分析を使用して突然変異、家族 関係、ＨＬＡ適合性及び他の同様のマーカーの種類を決定し、同定するために使 用すると有利である。好ましい態様では、本方法は、 ａ）２個の個体から生物試料を得る段階と、 ｂ）２個以上のマイクロサテライトＤＮＡ反復配列を含む各個体からのＤＮＡの 領域を増幅する段階と、 ｃ）増幅したＤＮＡをイオン化／揮発させる段階と、 ｄ）増幅したＤＮＡの存在を検出し、増幅したＤＮＡの分子量を比較し、分子量 が相違する場合には不一致（即ち野生型と突然変異）、非遺伝又は非適合性と判 断し、フラグメントの寸法が同様の場合には、一致、家族関係又はＨＬＡ適合性 の可能性があると判断する段階を含む。 異なるリンカー部分をもつプライマーを固定化に使用し、２種以上のマーカー を同時に試験することもできる。 突然変異、特に主要疾患の原因となる突然変異又は一般的多型性を検出するた めの別法として、ループ−プライマーオリゴ塩基伸長法ＬＯＯＰ−ＰＲＯＢＥと 呼ぶ方法も提供する。特定態様では、本方法は試料中のターゲット核酸の検出方 法であり、 ａ）（ｉ）ターゲットコドンのすぐ下流のターゲットＤＮＡの一部に一致する５ ’末端と、β−グロビンの場合にはＣｆｏｌ等の固有制限エンドヌクレアーゼ部 位をアンプリコンに導入する配列と、自己相補的な３’末端をもつ第１のプライ マーと、 （ｉｉ）ストレプトアビジンビーズ等の固体支持体にＤＮＡを固定化するための ビオチン等のタグを含む第２の下流プライマーを使用して試料中のβ−グロビン 等のターゲット核酸配列を増幅する段階と、 ｃ）リンカー部分を介して２本鎖増幅ＤＮＡを固体支持体に固定化する段階と、 ｄ）固定化ＤＮＡを変性させ、非固定化ＤＮＡ鎖を単離する段階と、 ｅ）３’末端をポリメラーゼにより伸長できるように、例えば加熱後に約３７℃ まで冷却するか又は他の適当な方法により、単離した非固定化ＤＮＡ鎖の３’末 端の内部相補的配列をアニールする段階と、 ｆ）ＤＮＡ鎖の３’末端がＤＮＡポリメラーゼにより次のｄｄＮＴＰロケーショ ン（即ち突然変異ロケーション）まで伸長するように、ＤＮＡポリメラーゼ、３ ｄＮＴＰ／１ｄｄＮＴＰを加えてアニールしたＤＮＡを伸長する段階と、 ｇ）伸長した２本鎖ステムループＤＮＡを固有制限エンドヌクレアーゼで開裂し 、開裂したステムループＤＮＡを除去する段階と、 ｉ）（場合によりマトリックスを加えて）伸長産物をイオン化／揮発させる段階 と、 ｊ）伸長したターゲット核酸の存在を検出し、野生型と質量の異なるＤＮＡフラ グメントが存在する場合にはターゲットコドンに突然変異が存在すると判断する 段階を含む。この方法は他のＭＳ突然変異分析法と比較して特定の突然変異検出 用試薬を使用する必要がないので、プロセスが簡単になり、自動化し易い。また 、分析する特定伸長産物はプライマーから開裂されるので、他の方法よりも短い 。更に、アニーリング効率は添加したプライマーのアニーリングよりも高いので 、より多量の産物を生成できる。この方法は多重化及び種々の検出スキーム（例 えば単塩基伸長、オリゴ塩基伸長及びシーケンシング）に適合可能である。例え ば、ループ−プライマーの伸長を使用して高度多型性領域内で短い診断シーケン シングラダーを生成し、例えばＨＬＡ型別又は耐性及び種型別を実施することが できる。 別の態様では、ＲＮＡ増幅を使用して生物試料中のターゲット核酸を検出する 方法が提供される。本方法では、ターゲット配列に相補的な領域をもち、上流で Ｔ７プロモーター等のプロモーターをコードするプライマーを使用してターゲッ ト核酸を 増幅する。ＤＮＡ依存性Ｒポリメラーゼと適当なリボヌクレアーゼを加えてＲＮ Ａを合成し、ＭＳにより分析する。 本発明は、ＭＳを使用してＤＮＡを配列決定する改善方法を提供する。これら の方法では、ＭＳ分析の前に増幅用サーモサイクリングを使用してシグナルを増 加する。 本発明はＭＳ分析用プライマーも提供する。特に、配列番号１〜２２、２４、 ２７〜３８、４１〜８６、８９、９２、９５、９８、１０１〜１１０、１１２〜 １２３、１２６、１２８、１２９に示すヌクレオチド配列の配列のいずれかの全 塩基又は長いオリゴヌクレオチドで少なくとも約２０、好ましくは約１６個の塩 基を含むプライマーと、配列番号２８０〜２８７に示すプライマーを提供する。 プライマーは標識されておらず、場合により好ましくは５’末端に質量改変部分 を含む。 以下、図面、詳細な説明及び請求の範囲により本発明の方法の他の特徴及び利 点を更に説明する。 図面の簡単な説明 図１Ａは生物試料から得たターゲット核酸分子（Ｔ）内に含まれる１個のター ゲット検出部位（ＴＤＳ）でマススペクトロメトリー分析を実施するための方法 を示す図である。スペーサ ー（Ｓ）を介して固体支持体（ＳＳ）に特定捕獲配列（Ｃ）を結合する。捕獲配 列はターゲット捕獲部位（ＴＣＳ）として知られるターゲット核酸分子（Ｔ）上 の相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択する。スペーサー（Ｓ） は円滑なハイブリダイゼーションを助長する。次いで、ＴＤＳに相補的なデテク ター核酸配列（Ｄ）をＴＤＳと接触させる。マススペクトロメトリーによりＤと ＴＤＳのハイブリダイゼーションを検出することができる。 図１Ｂは固体支持体に直接結合することにより少なくとも１個のターゲット検 出部位（ここではＴＤＳ１とＴＤＳ２）でマススペクトロメトリー分析を実施す るための方法を示す図である。ターゲット核酸分子（Ｔ）上の適当な官能基（Ｌ ’）と固体支持体上の適当な官能基（Ｌ）の間に形成される可逆的又は不可逆的 結合の形成により、ターゲット検出部位（ＴＤＳ１及びＴＤＳ２）を含むターゲ ット配列（Ｔ）を固体支持体に固定化する。次いで、ターゲット検出部位（ＴＤ Ｓ１又はＴＤＳ２）に相補的なデテクター核酸配列（ここではＤ１とＤ２）をＴ ＤＳと接触させる。分子州差に基づいてＴＤＳ１とＤ１及び／又はＴＤＳ２とＤ ２のハイブリダイゼーションを検出及び区別す ることができる。 図１Ｃはターゲット（Ｔ）核酸配列における野生型（Ｄ^wt）及び／又は突然変 異（Ｄ^mut）配列の検出方法を示す図である。図１Ａと同様に、スペーサー（Ｓ ）を介して特定捕獲配列（Ｃ）を固体支持体（ＳＳ）に結合する。更に、捕獲配 列はハイブリダイゼーションにより検出しようとするターゲット捕獲部位（ＴＣ Ｓ）であるターゲット配列（Ｔ）上の相補的配列と特異的に相互作用するように 選択する。ターゲット検出部位（ＴＤＳ）が突然変異Ｘを含む場合には、マスス ペクトロメトリーにより検出部位を野生型から区別することができる。突然変異 が分子の中間に位置し、従って野生型デテクターオリゴヌクレオチド（Ｄ^wt）を 例えば対照としてのターゲットデテクター配列と接触させる場合に安定なハイブ リッドを形成しないようにデテクター核酸分子（Ｄ）をデザインすることが好ま しい。突然変異位置に対合塩基をもつ突然変異デテクターオリゴヌクレオチド（ Ｄ^mut）をハイブリダイゼーションに使用しても突然変異を検出することができ る。生物試料から得た核酸分子が特定配列に関してヘテロ接合である（即ちＤ^wt とＤ^mutを含む）場合には、ａｐｐと検出しようとするＤ^mutにＤ^wtとＤ^mutを同 時に結合する。 図２は１個のターゲット配列で数個の突然変異を同時に検出する方法を示す図 である。デテクターオリゴヌクレオチドＤ１、Ｄ２及びＤ３間の分子量差は同時 倹出（多重化）を可能にするために十分大きくなければならない。これは配列自 体（組成又は長さ）によっても得られるし、質量改変官能基Ｍ１〜Ｍ３をデテク ターオリゴヌクレオチドに導入しても得られる。 図３は更に別の多重検出フォーマットを示す図である。この態様では、平坦表 面（例えば「チップアレー」）に位置特異的に固定化した種々の特定捕獲配列を 使用することにより区別する。異なるターゲット配列Ｔ１〜Ｔｎが存在する場合 には、それらのターゲット捕獲部位ＴＣＳ１〜ＴＣＳｎは相補的固定化捕獲配列 Ｃ１〜Ｃｎと相互作用する。配列自体又は質量改変官能基Ｍ１〜Ｍｎにより適当 に質量差をつけたデテクターオリゴヌクレオチドＤ１〜Ｄｎを使用することによ り検出する。 図４は核酸（即ちＰＣＲ）増幅を使用して予めデサインしたターゲット捕獲部 位（ＴＣＳ）をターゲット配列に組み込むフォーマットを示す図である。（例え ばビオチンとストレプトアビジンをコートした磁性ビーズの相互作用を利用して ）一方の 鎖のみを捕獲し、他方を除去する。ビオチンをプライマー１に結合する場合には 、他方の鎖はＴＣＳにより適当に標識すればよい。検出は上記と同様にマススペ クトロメトリーにより対応するターゲット検出部位ＴＤＳと特定デテクターオリ ゴヌクレオチドＤの相互作用により行なう。 図５は増幅（ここではリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））産物を調製し、マススペ クトロメトリーにより検出する方法を示す図である。プライマー（夫々Ｐ１及び Ｐ４）に結合した質量改変官能基（Ｍ１及びＭ２）により質量差をつけることが できる。マススペクトロメトリーによる検出は直接（即ち固定化及びターゲット 捕獲部位（ＴＣＳ）を使用せずに）実施することができる。捕獲配列（Ｃ）の規 則アレーを構成することにより多重ＬＣＲ反応を並行して実施することができる 。このフォーマットは連結産物を分離し、質量差が十分である場合にはマススペ クトロメトリー又は多重化によりスポット毎に同定できる。 図６Ａは転写増幅法により増幅した核酸分子のマススペクトロメトリー分析を 示す図である。ＲＮＡ配列をそのＴＣＳ配列を介して捕獲すると、適当なデテク ターオリゴヌクレオチド（Ｄ）を使用することにより上記と同様に野生型及び突 然変異 ターゲット検出部位を検出することができる。 図６Ｂは質量改変デテクターオリゴヌクレオチドＭ１−Ｄ１及びＭ１−Ｄ２を 使用して同一ＲＮＡ上の２個の異なる（突然変異）部位を同時に検出するための 多重化を示す図である。 図６Ｃは質量改変ジデオキシヌクレオシド又は３’−デオキシヌクレオシド三 リン酸とＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより特定突然変異を 検出するための別の多重化方法を示す図である。あるいは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ ポリメラーゼとリボヌクレオチドリン酸を使用してもよい。このフォーマットは 突然変異の部位（Ｘ）に予想される全４種の塩基を同時に検出することができる 。 図７Ａは生物試料から得たターゲット核酸分子（Ｔ）内に含まれる１個のター ゲット検出部位（ＴＤＳ）でマススペクトロメトリー分析を実施するための方法 を示す図である。スペーサー（Ｓ）を介して固体支持体（ＳＳ）に特定捕獲配列 （Ｃ）を結合する。捕獲配列はターゲット捕獲部位（ＴＣＳ）として知られるＴ 上の相補的配列に特異的にハイブリダイズするように選択する。ＴＤＳの一部に 相補的な核酸分子をＴＤＳ内の突然変異部位（Ｘ）のＴＤＳ５’にハイブリダイ ズする。完全な１ 組のジデオキシヌクレオシド又は３’−デオキシヌクレオシド三リン酸（例えは ｐｐｐＡｄｄ、ｐｐｐＴｄｄ、ｐｐｐＣｄｄ及びｐｐｐＧｄｄ）とＤＮＡ依存性 ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを加えると、Ｘに相補的な１個のジデオキシヌク レオシド又は３’−デオキシヌクレオシド三リン酸のみを組み込むことができる 。 図７Ｂは核酸分子内の潜在突然変異部位（Ｍ）における突然変異の存在を調べ るためにマススペクトロメトリー分析を実施する方法を示す図である。このフォ ーマットは２本鎖ターゲット核酸分子の対立遺伝子（Ａ）及び（Ｂ）を同時に分 析することができ、ホモ接合正常、ホモ接合突然変異又はヘテロ接合を診断する ことができる。Ｍを含む領域内でＡ及びＢとハイブリダイズする相補的オリゴヌ クレオチド（夫々（Ｃ）及び（Ｄ））に対立遺伝子Ａ及びＢを各々ハイブリダイ ズさせる。次いで各ヘテロデュプレクスを１本鎖特異的エンドヌクレアーゼと接 触させ、Ｍに突然変異の存在を示すミスマッチにがあれば（Ｃ）及び／又は（Ｄ ）が開裂するので、マススペクトロメトリーにより検出することができる。 図８は逆向きロケーションに２種の異なるプロモーター（例 えばＳＰ６とＴ７プロモーター）をもつ転写ベクターを使用して検出するために ターゲットＤＮＡの両鎖を調製する方法を示す図である。このフォーマットはヘ テロ接合ターゲット検出部位（ＴＤＳ）を検出するのに特に有用である。ＳＰ６ 又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用すると、両鎖を別々又は同時に転写させるこ とができる。転写したＲＮＡ分子は、適当に質量差をつけたデテクターオリゴヌ クレオチドを使用して特異的に捕獲し、同時に検出することができる。これは溶 液中で直接実施することもできるし、特異的に固定化した捕獲配列の規則アレー 上で多数のターゲット配列を並行処理することにより実施することもできる。 図９は１種以上のリボヌクレアーゼと対応する相補的配列を担持する固体支持 体に捕獲したフラグメントを使用して図６、７及び８に示したように調製したＲ ＮＡを特異的に消化する方法を示す図である。ハイブリダイゼーションイベント と捕獲したターゲット配列の実測分子量から、遺伝子中の突然変異の有無とその 存在位置に関する情報が得られる。アレーはマススペクトロメトリーを使用して スポット毎に分析することができる。ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼを含むヌ クレアーゼカクテル を使用して消化することもできる。個々の特定フラグメントの分子量と野生型フ ラグメントの分子量の差により突然変異を検出することができる。 図１０Ａは後記実施例１に記載する実験により得られたＵＶスペクトルを示す 。パネルｉ）はハイブリダイゼーション前の２６量体の吸収を示す。パネルｉｉ ）はハイブリダイゼーション後の遠心分離濾液を示す。パネルｉｉｉ）は第１回 目の５０ｍＭクエン酸アンモニウム洗浄後の結果を示す。パネルｉｖ）は第２回 目の５０ｍＭクエン酸アンモニウム洗浄後の結果を示す。 図１０Ｂは３回の洗浄／遠心分離段階後の後記実施例１に記載する実験により 得られた質量スペクトルを示す。 図１０Ｃは後記実施例１に記載する実験により得られた質量スペクトルを示し 、図１Ｂに模式的に示したフォーマットに従ってハイブリダイズした２６量体を ビーズから脱着できることを示している。 図１１は後記実施例１に記載する実験により得られた質量スペクトルを示し、 図１Ｂに模式的に示したような実験でハイブリダイスした４０量体を脱着できる ことを実証している。検出 効率は、４０量体よりも著しく長いフラグメントでも脱着できることを示唆して いる。 図１２は後記実施例２に記載する実験により得られた質量スペクトルを示し、 エレクトロスプレーマススペクトロメトリーにより１８量体と１９量体を脱着及 び区別できることを示しており、夫々混合物（上段）、１８量体（中段）及び１ ９量体からのピーク（下段）を示す。 図１３は実施例３に記載するような嚢胞性線維症突然変異ΔＦ５０８の検出方 法の図である。 図１４は実施例３のΔＦ５０８ホモ接合正常のＤＮＡ伸長産物の質量スペクト ルである。 図１５は実施例３のΔＦ５０８ヘテロ接合突然変異のＤＮＡ伸長産物の質量ス ペクトルである。 図１６は実施例３のΔＦ５０８ホモ接合正常のＤＮＡ伸長産物の質量スペクト ルである。 図１７は実施例３のΔＦ５０８ホモ接合突然変異のＤＮＡ伸長産物の質量スペ クトルである。 図１８は実施例３のΔＦ５０８ヘテロ接合突然変異のＤＮＡ伸長産物の質量ス ペクトルである。 図１９は実施例４のアポリポタンパク質Ｅ遺伝子型別を実施するための種々の 方法の図である。 図２０はＥ３対立遺伝子（図２０Ｂ）によりコードされる正常アポリポタンパ ク質Ｅと、Ｅ２及びＥ４対立遺伝子（図２０Ａ）によりコードされる他のイソタ イプの核酸配列を示す。 図２１ＡはＣｆｏｌ制限エンドヌクレアーゼを使用したアポリポタンパク質Ｅ の種々の遺伝子型の複合制限パターンを示す。 図２１Ｂはアポリポタンパク質Ｅの種々の遺伝子型について３．５％ＭｅｔＰ ｈｏｒ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ中で得られた制限パターンを示す。 図２１Ｃはアポリポタンパク質Ｅの種々の遺伝子型について１２％ポリアクリ ルアミドゲル中で得られた制限パターンを示す。 図２２Ａはアポリポタンパク質ＥのＥ２、Ｅ３及びＥ４対立遺伝子の制限酵素 分解により得られた９１、８３、７２、４８及び３５塩基対フラグメントの分子 量を示すチャートである。 図２２Ｂはホモ接合Ｅ４アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型の制限消化産物の質量 スペクトルである。 図２３Ａはホモ接合Ｅ３アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型の制 限消化産物の質量スペクトルである。 図２３ＢはＥ３／Ｅ４アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型の制限消化産物の質量ス ペクトルである。 図２４は７．５％ポリアクリルアミドゲルに各増幅試料１０％（５μｌ）を加 えた実施例５のオートラジオグラフである。試料Ｍ：ＡｌｕＩで消化したｐＢＲ ３２２；試料１：血清分析でＨＢＶ陽性；試料２：同じくＨＢＶ陽性；試料３： 血清分析しなかったが、トランスアミナーゼ濃度が増加しており、肝疾患の徴候 を示す；試料４：ＨＣＶを含むＨＢＶ陰性；試料５：ＨＢＶ陽性；（（−）陰性 対照；陽性（＋）対照）。染色は臭化エチジウムを用いて実施した。 図２５ＡはＨＢＶ陽性の試料１の質量スペクトルである。２０７５４Ｄａのシ グナルはＨＢＶ関連増幅産物を表す（６７ヌクレオチド、計算分子量２０７３５ Ｄａ）。１０３９０Ｄａの質量シグナルは［Ｍ＋２Ｈ］²⁺分子イオンを表す（計 算値１０３７８Ｄａ）。 図２５Ｂは血清及びドットブロットアッセイでＨＢＶ陰性の核酸（即ちＰＣＲ ）に対応する試料３の質量スペクトルである。増幅産物は微量しか生成されてい ない。しかし、２０７５１ Ｄａ（計算質量：２０７３５Ｄａ）にはっきり検出される。１０３９７Ｄａの質 量シグナルは［Ｍ＋２Ｈ］²⁺分子イオンを表す（計算値１０３７６Ｄａ）。 図２５ＣはＨＢＶ陰性且つＨＣＶ陽性の試料４の質量スペクトルである。ＨＢ Ｖ特異的シグナルは検出されなかった。 図２６は実施例６のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）で使用した相補的オリゴヌク レオチドの結合部位をもつ大腸菌ｌａｃＩ遺伝子の一部を示す。ここでは野生型 配列を示す。突然変異体は連結部位でもあるｂｐ１９１に点突然変異を含む（太 字）。突然変異はＣ→Ｔ転位（及びＧ→Ａ転位）である。この結果、オリゴＢと Ｔ−Ｇミスマッチ（及びオリゴＣとＡ−Ｃミスマッチが生じる。 図２７は臭化エチジウムで染色した実施例６の７．１５％ポリアクリルアミド ゲルである。Ｍ：鎖長標準（ＭｓｐＩで消化したｐＵＣ１９ＤＮＡ）。レーン１ ：野生型鋳型を用いたＬＣＲ。レーン２：突然変異鋳型を用いたＬＣＲ。レーン ３：（対照）鋳型を用いないＬＣＲ。連結産物（５０ｂｐ）は野生型鋳型を含む 陽性反応のみで生成された。 図２８は２種の陽性ＬＣＲのプールのＨＰＬＣクロマトグラ ムである。 図２９は突然変異鋳型以外は同一条件を使用したＨＰＬＣクロマトグラムを示 す。連結産物の小さいシグナルは遊離体の鋳型なし連結又は（Ｇ−Ｔ、Ａ−Ｃ） ミスマッチでの連結に起因する。「偽陽性」シグナルは図２８に示す野生型鋳型 を用いた連結産物のシグナルよりも著しく弱い。連結遊離体を分析すると、オリ ゴヌクレオチドの２個が５’リン酸化されているので「二重ピーク」となってい る。 図３０（ｂ）は実施例６のＰｆｕ ＤＮＡ−リガーゼ溶液のＭＡＬＤＩ−ＴＯ Ｆ−ＭＳ分析により得られた複合シグナルパターンを示す。（ａ）は未精製ＬＣ ＲのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。質量シグナル６７５６９ＤａはＰｆ ｕ ＤＮＡリガーゼを表すと思われる。 図３１は２種の陽性ＬＣＲのプールのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す（ ａ）。７５２３Ｄａのシグナルは未連結オリゴＡ（計算値７５２１Ｄａ）を表し 、１５４４９Ｄａのシグナルは連結産物（計算値１５４５０Ｄａ）を表す。３７ ７４ＤａのシグナルはオリゴＡの［Ｍ＋２Ｈ］²⁺シグナルである。２０００Ｄａ 未満の質量範囲のシグナルはマトリックスイオンに起因す る。スペクトルは図２７のレーン１と図２８のクロマトグラムに対応する。（ｂ ）は２種の陰性ＬＣＲ（突然変異鋳型）のプールのスペクトルを示す。７５１７ ＤａのシグナルはオリゴＡ（計算値７５２１Ｄａ）を表す。 図３２は（鋳型としてサケ精子ＤＮＡを用いた）２種の対照反応産物プールの スペクトルを示す。２０００Ｄａ付近の質量範囲のシグナルはＴｗｅｅｎ２０に 起因し、予想通り、オリゴＡしか検出できなかった。 図３３は２種の陽性ＬＣＲプールのスペクトルを示す（ａ）。精製は本文に記 載するように限外濾過とストレプトアビジンＤｙｎａＢｅａｄｓを併用して実施 した。１５４４８Ｄａのシグナルは連結産物を表す（計算値１５４５０Ｄａ）。 ７５２７ＤａのシグナルはオリゴＡを表す（計算値７５２１Ｄａ）。３７６１Ｄ ａのシグナルはオリゴＡの［Ｍ＋２Ｈ］²⁺シグナルであり、５１４０Ｄａのシグ ナルは連結産物の［Ｍ＋３Ｈ］²⁺シグナルである。（ｂ）は２種の陰性ＬＣＲプ ール（鋳型なし）のスペクトルを示す。７５１４ＤａのシグナルはオリゴＡを表 す（計算値７５２１Ｄａ）。 図３４は実施例７に記載するような突然変異検出プライマー のオリゴ塩基伸長の模式図であり、夫々ｄｄＴＴＰ（Ａ）又はｄｄＣＴＰ（Ｂ） を反応混合物で使用している。理論質量計算値を括弧内に示す。図示配列は最も 一般的な嚢胞性線維症突然変異ΔＦ５０８とより低頻度の突然変異Δ１５０７と Ｉｌｅ５０６ＳｅｒをもつＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０の一部である。 図３５は突然変異検出のためにオリゴ塩基伸長プライマー沈殿から直接記録し たＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。（Ａ）及び（Ｂ）のスペクトル は夫々それ以上伸長反応せずにアニールしたプライマー（ＣＦ５０８）を示す。 パネルＣは伸長反応でｐｐｐＴｄｄを使用した野生型のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペ クトルを示し、ＤはｐｐｐＣｄｄをターミネーターとして使用した場合の５０６ Ｓ突然変異をもつヘテロ接合伸長産物を示す。パネルＥ及びＦは伸長反応でｐｐ ｐＴｄｄ及びｐｐｐＣｄｄをターミネーターとして使用したΔＦ５０８をもつヘ テロ接合体を示す。パネルＧ及びＨはｐｐｐＴｄｄ及びｐｐｐＣｄｄをターミネ ーターとして使用したヘテロ接合ΔＦ５０８突然変異を示す。診断の鋳型は各ス ペクトルの下に記載し、実測／予想分子量を括弧内に記載する。 図３６は未修飾及び７−デアザプリンを含む９９量体及び２００量体核酸の核 酸増幅用鋳型として実施例８で使用したｐＲＦｃ１ ＤＮＡの配列の部分と、１ ９量体順プライマーと、２種の１８量体逆プライマーの配列を示す。 図３７は未修飾及び７−デアザプリンを含む１０３量体核酸の核酸増幅に実施 例８で使用したＭ１３ｍｐ１８ ＲＦＩ ＤＮＡのヌクレオチド配列の部分を示 す。核酸増幅反応で使用した１７量体のヌクレオチド配列も示す。 図３８は実施例８に記載した増幅産物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析用に精 製及び濃縮したもののポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。Ｍ：鎖長 マーカー、レーン１：７−デアザプリンを含む９９量体増幅産物、レーン２：未 修飾９９量体、レーン３：７−デアザプリンを含む１０３量体及びレーン４：未 修飾１０３量体増幅産物。 図３９：５’−［³²Ｐ］標識プライマー１及び４を用いて実施した核酸（即ち ＰＣＲ）反応産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動のオートラジオグラム。レ ーン１及び２：未修飾及び７−デアザプリンで修飾した１０３量体増幅産物（５ ３３２１及び２３５２０カウント）、レーン３及び４：未修飾及び７− デアザプリンで修飾した２００量体（７１１２３及び３９５８２カウント）、レ ーン５及び６：未修飾及び７−デアザプリンで修飾した９９量体（１７３２１６ 及び９４４００カウント）。 図４０：ａ）未修飾１０３量体増幅産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル （合計１２個の単照射スペクトル）。２本の１本鎖の計算質量値（３１７６８ｕ と３１７５９ｕ）の平均値は３１７６３ｕである。質量分解能：１８。ｂ）７− デアザプリンを含む１０３量体増幅産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ 合計３個の単照射スペクトル）。２本の１本鎖の計算質量値（３１７２７ｕと３ １７１９ｕ）の平均値は３１７２３ｕである。質量分解能：６７。 図４１：ａ）未修飾９９量体増幅産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ 合計２０個の単照射スペクトル）。２本の１本鎖の計算質量値は３０２６１ｕと ３０７９４ｕである。ｂ）７−デアザプリンを含む９９量体増幅産物のＭＡＬＤ Ｉ−ＴＯＦ質量スペクトル（合計１２個の単照射スペクトル）。２本の１本鎖の 計算質量値は３０２２４ｕと３０７５０ｕである。 図４２：ａ）未修飾２００量体増幅産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル （合計３０個の単照射スペクトル）。２本の １本鎖の計算質量値（６１８７３ｕと６１５９５ｕ）の平均値は６１７３４ｕで ある。質量分解能：２８。ｂ）７−デアザプリンを含む２００量体増幅産物のＭ ＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（合計３０個の単照射スペクトル）。２本の１ 本鎖の計算質量値（６１７７２ｕと６１７１４ｕ）の平均値は６１６４３ｕであ る。質量分解能：３９。 図４３：ａ）リボ修飾プライマーを用いて増幅した７−デアザプリンを含む１ ００量体増幅産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。２本の１本鎖の計算質 量値（３０５２９ｕと３１０９５ｕ）の平均値は３０８１２ｕである。ｂ）加水 分解プライマー開裂後の増幅産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。２本の １本鎖の計算質量値（２５１０４ｕと２５２２９ｕ）の平均値は２５１６７ｕで ある。開裂したプライマー（５４３７ｕと５９１８ｕ）の平均値は５６７７ｕで ある。 図４４Ａ〜Ｄは３’ビオチン化によりストレプトアビジンビーズに固定化した ３９量体鋳型（配列番号２３）から得た４種のシーケンシングラダーのＭＡＬＤ Ｉ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。実施例９によるシーケンシングでは１４量体 プライマー（配列番号２４）を使用した。 図４５は３’ビオチン化によりストレプトアビジンビーズに固定化した７８量 体鋳型（配列番号２５）の固相シーケンシングのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペク トルを示す。シーケンシングでは１８量体プライマー（配列番号２６）とｄｄＧ ＴＰを使用した。 図４６は１本鎖オーバーハングをもつデュプレクスＤＮＡプローブが特定ＤＮ Ａ鋳型を捕獲すると共に固相シーケンシング用プライマーとしても機能すること を示すスキームである。 図４７Ａ〜Ｄは実施例９に記載するように５塩基オーバーハングを残して３’ ビオチン化１８量体（配列番号３０）にアニールした５’蛍光標識２３量体（配 列番号２９）を使用して１５量体鋳型（配列番号３１）を捕獲し、シーケンシン グ反応から得たＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。 図４８は慣用ＤＮＡシーケンサーを使用した以外は図４７に示した反応から得 られた同一産物のスタッキングフルオログラムを示す。 図４９は実施例１に記載するようなサイクルシーケンサーを使用して鋳型とし て生物増幅産物と１２量体(５’−ＴＧＣ ＡＣＣ ＴＧＡ ＣＴＣ−３’（配 列番号３４）)シーケンシン グプライマーから生成したシーケンシングラダーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペ クトルを示す。脱プリンに起因するピークと配列に無関係なピークはアステリス クを付けた。ＭＡＬＤＴ−ＴＯＦ ＭＳ測定はリフレクトロンＴＯＦ ＭＳで行 なった。Ａ）ｄｄＡＴＰで停止したシーケンシングラダー；Ｂ）ｄｄＣＴＰで停 止したシーケンシングラダー；Ｃ）ｄｄＧＴＰで停止したシーケンシングラダー ；Ｄ）ｄｄＴＴＰで停止したシーケンシングラダー。 図５０はプライマーの後に４０塩基までの対応計算分子量をもつ図４９で生成 したシーケンシングラターの模式図を示す。計算に使用した分子量は、プライマ ー３５８１．４Ｄａ、７−デアザ−ｄＡＴＰ３１２．２Ｄａ、ｄＴＴＰ３０４． ２Ｄａ、ｄＣＴＰ２８９．２Ｄａ及び７−デアザ−ｄＧＴＰ３２８．２Ｄａであ る。 図５１はシーケンシング用鋳型として使用したβ−グロビン遺伝子内の増幅２ ０９ｂｐ増幅産物の配列を示す。適当な増幅プライマーの配列と１２量体シーケ ンシングプライマーのロケーションも示す。この配列はプライマーから４塩基後 の位置のホモ接合突然変異体を表す。野生型配列ではこのＴはＡで置換 される。 図５２は実施例１１に詳細に記載するようなＡｌｕＶｐＡ多型性をもつインタ ーフェロン−レセプター遺伝子のイントロン５の一部である配列を示す。スキー ムはｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ又はその両者を停止に使用したプライマーオリゴ塩 基伸長（ＰＲＯＢＥ）を示す。多型性検出プライマー（ＩＦＮ）を下線で示し、 停止ヌクレオチドを太字で示す。２８人の無関係の個体と５人家族に存在する対 立遺伝子からの理論分子量値を表に示す。全部ではないが大半の１３単位対立遺 伝子に存在する２種の第２の部位突然変異を示す。 図５３は伸長サイクルＰＲＯＢＥ反応産物沈殿から直接記録したＭＡＬＤＩ− ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。インターフェロン−αレセプター遺伝子のイン トロン５におけるＡｌｕＶｐＡ多型性を使用した家族試験を示す（実施例１１） 。 図５４は反応混合物中で停止ヌクレオチドとしてｄｄＣを使用したＰＲＯＢＥ 産物からの質量スペクトルを示す。母親と子供２のＤＮＡからの約１１６５０Ｄ ａの分子量をもつ対立遺伝子は反復単位の１個に第２の部位突然変異が存在する ことを示唆している。 図５５はターミネーターとしてｐｐｐＣｄｄを使用し、ＣＦＴＲ遺伝子のイン トロン８の３’末端でポリＴトラクトの種々の対立遺伝子を検出するためのＰＲ ＯＢＥ法の模式図を示す（実施例１１）。 図５６は伸長ＰＲＯＢＥ反応産物沈殿から直接記録したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ− ＭＳスペクトルを示す。ＣＦＴＲ遺伝子のイントロン８の３’末端にポリＴトラ クトの全３種の一般的対立遺伝子が検出された。（ａ）Ｔ５／Ｔ９ヘテロ接合、 （ｂ）Ｔ７／Ｔ９ヘテロ接合（実施例１１）。 図５７はａ）ＣｆｏＩ単独及びｂ）ＣｆｏＩとＲｓａＩを使用して実施例１２ に記載するように消化した２５２量体アポＥ遺伝子増幅産物（ε３／ε３遺伝子 型）の質量スペクトルを示す。アステリスク：脱プリンピーク。 図５８はＣｆｏＩで消化し、ａ）エタノール／グリコーゲンで１回、ｂ）同２ 回及びｃ）イソプロピルアルコール／グリコーゲンで２回沈殿することにより精 製したアポＥ遺伝子増幅産物（ε３／ε３遺伝子型）の質量スペクトルを示す。 図５９はａ）ε２／ε３、ｂ）ε３／ε３、ｃ）ε３／ε４及びｄ）ε４／ε ４遺伝子型からのＣｆｏＩ／ＲｓａＩ消化産 物の質量スペクトルを示す。診断フラグメントに点線を引いた。 図６０は消化酵素Ｃｆｏｌ及びＲｓａＩによる２５２量体アポＥ遺伝子増幅産 物の同時消化に基づく未知アポＥ遺伝子型の迅速同定スキームを示す。 図６１はａ）ε２／ε３、ｂ）ε３／ε３、ｃ）ε３／ε４及びｄ）ε４／ε ４遺伝子型のマルチプレクス（コドン１１２及び１５８）質量スペクトルＰＲＯ ＢＥ結果を示す。Ｅ：伸長産物；Ｐ：未伸長プライマー。上段：コドン１１２及 び１５８領域、多型性部位は太字、プライマー配列は下線で示す。 図６２はテロメラーゼ活性を検出するためのＴＲＡＰアッセイの質量スペクト ルを示す（実施例１３）。スペクトルはプライマーシグナルの２個を示し、５， ４９７．３Ｄａ（計算値５５２３Ｄａ）に増幅産物ＴＳプライマーと、７，５３ ７．６Ｄａ（計算値７，５３７Ｄａ）にビオチン化ｂｉｏＣＸプライマーのシグ ナルを示し、１２，７５５．８Ｄａ（計算値１２，４５２Ｄａ）に３個のテロメ ア反復を含む第１のテロメラーゼ特異的アッセイ産物のシグナルを示し、アッセ イ産物の質量はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのエキステンダーゼ活性により１ｄ Ａヌクレオチド分だけ（１２，７６５Ｄａ）大きい。 図６３は図６２の高質量範囲を示し、即ち１２，７７５．６Ｄａのピークはこ れらのテロメア反復をもつ産物を表す。２０，３２２．１Ｄａのピークはテロメ ラーゼ活性の結果であり、７個のテロメア反復を形成している（１ｄＡヌクレオ チド分の伸長を含む計算値２０，３９５Ｄａ）。１、２、３及び４で示したピー クは１４，６７４Ｄａの４個のテロメア反復と二次イオン産物を含む。 図６４はヒトチロシンヒドロキシラーゼｍＲＮＡのＲＴ増幅産物のＭＡＬＤＩ −ＴＯＦスペクトルを示し、神経芽細胞腫細胞の存在を示している（実施例１４ ）。１８，７６３．８Ｄａのシグナルは入れ子増幅産物の非ビオチン化１本鎖６ １量体を表す（計算値１８，７５８．２Ｄａ）。 図６５（ａ）はＲＥＴ癌原遺伝子とｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄｄＴ ＴＰの混合物のＰＲＯＢＥ反応の模式図である（実施例１５）。Ｂはビオチンを 表し、センス鋳型鎖はビオチンとストレプトアビジンを介して固体支持体に結合 される。 図６５（ｂ）は野生型、Ｃ→Ｔ及びＣ→Ａアンチセンス鎖のｄｄＴ及びｄｄＡ 反応の予想ＰＲＯＢＥ産物を示す。 図６６は（ａ）陰性対照、（ｂ）ヘテロ接合患者１（Ｗｔ／ Ｃ→Ｔ）及び（ｃ）ヘテロ接合患者２（Ｗｔ／Ｃ→Ａ）のＰＲＯＢＥ産物質量ス ペクトルを示し、平均Ｍ_r値を報告する。 図６７は（ａ）野生型、（ｂ）Ｇ→Ａ、及び（ｃ）Ｇ→Ｔホモ接合、（ｄ）野 生型／Ｇ→Ａ、（ｅ）野生型／Ｇ→Ｔ及び（Ｆ）Ｇ→Ａ／Ｇ→Ｔヘテロ接合から のリボ開裂ＲＥＴ癌原遺伝子増幅産物に相当する合成類似体のＭＡＬＤＩ−ＦＴ ＭＳスペクトルを示し、最も強い同位体ピータの質量を報告する。 図６８は共有二官能性トリチルリンカーを介する核酸固定化の模式図である。 図６９は疎水性トリチルリンカーを介する核酸固定化の模式図である。 図７０は結合オリゴ（５’−イミノビオチン−ＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣ、配 列番号５６）を含むマトリックス処理Ｄｙｎａｂｅａｄｓの上清のＭＡＬＤＩ− ＴＯＦ質量スペクトルを示す。マトリックスには内部標準（ＣＴＧＴＧＧＴＣＧ ＴＧＣ、配列番号５７）を加えた。 図７１は結合オリゴ（５’−イミノビオチン−ＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣ、配 列番号５６）を含むマトリックス処理Ｄｙｎａｂｅａｄｓの上清のＭＡＬＤＩ− ＴＯＦ質量スペクトルを示 す。マトリックスには内部標準（ＣＴＧＴＧＧＴＣＧＴＧＣ、配列番号５７）を 加えた。 図７２はループ−プライマーオリゴ塩基伸長（ループＰＲＯＢＥ）反応で実施 する段階を模式的に示す。 図７３ＡはステムループのＣｆｏＩ消化後の上清のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量ス ペクトルを示す。図７３Ｂ〜Ｄは種々の遺伝子型のＭＡＬＤＴ−ＴＯＦ質量スペ クトルを示し、ＨｂＡは野生型遺伝子型（７４Ｂ）、ＨｂＣは鎌状赤血球症を誘 発するβ−グロビンのコドン６の突然変異（７４Ｃ）、ＨｂＳは鎌状赤血球症を 誘発するβ−グロビンのコドン６の別の突然変異（７４Ｄ）である。 図７４はＣＫＲ−５の増幅領域の核酸配列を示す。下線の配列は増幅プライマ ーに相同の領域に対応する。点線の領域は３２ｂｐ欠失に対応する。 図７５はセンスプライマーｃｋｒＴ７ｆを示す。Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼの 結合と分析しようとするＣＫＲ−５領域の増幅を助長するようにデザインし、２ ４塩基のランダムに選択した配列から始まり、１８塩基のＴ７プロモーターと１ ９塩基のＣＫＲ−５に相同の配列を含む。 図７６は後記実施例２１に記載するように生成したＣＫＲ−５増幅産物のＭＡ ＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。 図７７は選択したＲＮアーゼで消化した合成ＲＮＡ２５量体（５’−ＵＣＣＧ ＧＵＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵＧＡＧＧＡＣ−３’、配列番号６２）の陽イオ ンＵＶ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルである。合計約２０ｐｍｏｌのＲＮＡを含む ４．５μｌアッセイの０．６μｌアリコートを１．５μｌマトリックス（３−Ｈ ＰＡ）に固定して各酵素を分析した。５’末端を保存したフラグメントはＲＮア ーゼによって異なる種類の矢印で示す（Ｈａｈｎｅｒら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｓ ｏｆ ｔｈｅ ４４ｔｈ ＡＳＭＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍａｓ ｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｔｏｐｉｃｓ，ｐ．９ ８３（１９９６））。 図７８は合成ＲＮＡ２０量体の陽イオンＵＶ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルによ るＲＮアーゼＣＬ₃及びクサチビンの特異性試験である。予想及び／又は実測開 裂部位を矢印で示す。Ａ、Ｂ、Ｃは正しい開裂部位と対応する単一開裂フラグメ ントを示す。開裂の不在は？で示し、非特異的開裂はＸで示す。 図７９はＤＮＡ分子（１２量体、５’ビオチン化１９量体、 ２２量体及び５’ビオチン化２７量体）とストレプトアビジンをコートした磁性 ビーズの混合物の分離を示す。ａ）マトリックス（３−ＨＰＡ）１．５μｌと混 合した各種約２〜４ｐｍｏｌを含む混合物０．６μｌの陽イオンＵＶ−ＭＡＬＤ Ｉ質量スペクトル。ｂ）混合物を磁性ビーズとインキュベーション後に捕獲され たフラグメントを遊離させた以外はａ）と同一のスペクトル。 図８０はストレプトアビジンをコートした磁性ビーズからの固定化５’ビオチ ン化４９ｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物の溶雌を示す。（ａ）磁性ビーズとイ ンキュベーション前の転写産物の陽イオンＵＶ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトル。９ ５％ホルムアミド単独（ｂ）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｃ）、１０ｍＭ ＣＤＴＡ （ｄ）及び２５％水酸化アンモニウム（ｅ）の添加剤で溶離後の固定化ＲＮＡ転 写産物のスペクトル。ＥＤＴＡとＣＤＴＡは２５％水酸化アンモニウムでｐＨ８ に調整した。 図８１はＲＮアーゼＵ₂で１５分間消化後の５’ビオチン化４９ｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物の陽イオンＵＶ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。ａ）タ ーゲットＲＮＡ約１００ｐｍｏｌを含む２５μｌアッセイの分離前のスペクトル 。ｂ）磁 性ビーズに固定化した５’ビオチン化フラグメントの単離後のスペクトル。捕獲 したフラグメントは１０ｍＭ ＣＤＴＡを含む９５％ホルムアミドの溶液で遊離 させた。いずれの場合も試料の１μｌアリコートをマトリックス（３−ＨＰＡ） １．５μｌと混合した。 図８２はヒトβ−グロビン遺伝子のコドン５及び６とコドン３０と、ＩＶＳ− １供与部位における推定突然変異の並行検出を模式的に示す。図８２Ａはプライ マーβ２及びβ１１を使用したゲノムＤＮＡの増幅を示す。プライマー及び同定 タグのロケーションと野生型及び突然変異配列を示す。図８２Ｂは（コドン５及 び６の上流に結合する）プライマーβ−ＴＡＧ１と(コドン３０及び工ＶＳ−１ 供与部位の上流に結合する)β−ＴＡＧ２を使用した単純なＰｒｉｍｅｒ Ｒｅ ａｃｔｉｏｎ Ｏｌｉｇｏ Ｂａｓｅ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＰＲＯＢＥ）にお ける両部位の分析を示す。反応産物はストレプトアビジンをコートした常磁性粒 子に結合したビオチン化捕獲プライマー（夫々ｃａｐ−ｔａｇ−１及びｃａｐ− ｔａｇ−２）を使用して捕獲し、これらのプライマーは夫々β−ＴＡＧ１及びβ −ＴＡＧ２の５’末端に相補的な６個の５’末端塩基と、ユニバーサルプ ライマーに結合する部分をもつ。 図８３は図８２に模式的に示したように分析した１個体からのＤＮＡ試料のＰ ＲＯＢＥ産物の質量スペクトルを示す。 図８４はｃａｐ−ｔａｇ−２に結合した配列の質量スペクトルを示す。 図８５は図８２に示した方法に従い、ターミネーションにｄｄＡＴＰを使用し て１回のシーケンシング反応でβ−ＴＡＧ１及びβ−ＴＡＧ２プライマーを使用 した後に分別することにより得られた質量スペクトルを示す。 図８６は図８２に示した方法に従い、ターミネーションにｄｄＣＴＰを使用し て１回のシーケンシング反応でβ−ＴＡＧ１及びβ−ＴＡＧ２プライマーを使用 した後に分別することにより得られた質量スペクトルを示す。 図８７ＡはケモカインレセプターＣＫＲ−５遺伝子のフラグメントの野生型配 列と増幅に使用したプライマー（太字）を示す。ＣＫＲ−５対立遺伝子における ３２塩基対（ｂｐ）欠失を下線で示し、停止ヌクレオチドをイクリック体で示す 。図８７Ｂはアデノシンが付加された野生型鎖と付加されていない野生型鎖と、 その長さと分子量を示す。図８７Ｃは同じく３２ｂｐ 欠失を示す。図８７Ｄは野生型遺伝子のＰＲＯＢＥ産物を示し、図８７Ｅは突然 変異対立遺伝子のＰＲＯＢＥ産物を示す。 図８８は天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１５％）及び銀染色により分 析した種々の無関係個体の増幅産物を示す。野生型ＣＫＲ−５に対応するバンド は７５ｂｐに現れ、欠失をもつ遺伝子からのバンドは４３ｂｐに現れている。７ ５ｂｐよりも大きいバンドは非特異的増幅に起因する。 図８９Ａはヘテロ接合個体にからのＤＮＡのスペクトログラフを示し、質量２ ３３１９Ｄａのピークは野生型ＣＫＲ−５に対応し、質量１３１３７Ｄａ及び１ ３４５１Ｄａのピークは夫々アデノシンが付加された欠失対立遺伝子と付加され ていない欠失対立遺伝子に対応する。図８９ＢはＤＮＡをＴ４ ＤＮＡポリメラ ーゼで処理し、付加したアデノシンを除去した以外は図８９Ａと同一の個体から 得たＤＮＡのスペクトログラフを示す。図８９Ｃ及び図８９Ｄはホモ接合個体に 由来するスペクトログラフであり、図８９Ｄではアデノシンを除去している。質 量１３０００Ｄａ未満の全ピークは多電荷分子に起因する。 図９０Ａはヘテロ接合個体から得たＤＮＡで実施したＰＲＯＢＥ反応の結果の 質量スペクトルを示す。図９０Ｂはホモ接合 個体で実施したＰＲＯＢＥ反応の結果の質量スペクトルを示す。夫々質量６６０ ４Ｄａ及び６６０７Ｄａのピークは野生型対立遺伝子に対応し、質量６２７５Ｄ ａのピークは欠失対立遺伝子に対応する。プライマーは夫々質量５６７３及び５ ６７６Ｄａに検出される。 図９１は３個の異なる鋳型と５個の異なるＰＲＯＢＥプライマーを１回の反応 で同時に使用する実施例２４に記載するようなサーモサイクリングプライマーＯ ｌｉｇｏ Ｂａｓｅ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ｔｃ−ＰＲＯＢＥ）反応のＭＡＬＤ Ｉ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す。 図９２は実施例２５に記載するようにｐ５３遺伝子のエキソン５〜８を増幅及 び配列決定するためのシングルチューブプロセスを模式的に示す。質量スペクト ルは図９３のＡ反応である。 図９３は実施例２５に記載するようにｐ５３遺伝子のエキソン７の一部を配列 決定するための４回の別々の反応を重ねたプロットを示す。 図９４は実施例２５に記載するようにｐ５３遺伝子のエキソン７の一部を配列 決定するためにＡ反応から得られた質量スペクトルを示す。 図９５は各反応産物５ｎＬをチップのウェルに移し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによ り測定したｐ５３シーケンシングラダーの質量スペクトルを示す。 図９６Ａは合成５０量体（１５．３４ｋＤａ）と２７量体_nc（非相補的、８． ３０ｋＤａ）の混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。 図９６Ｂは合成５０量体（１５．３４ｋＤａ）と２７量体。（相補的、８．３ ４ｋＤａ）の混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。各オリゴヌク レオチドの終濃度は１０μＭとした。図９６Ｂの２３．６８ｋＤａのシグナルは ＷＣ特異的ｄｓＤＮＡに対応する。 図９７Ａは図９６と同様の試料調製を使用したアポリポタンパク質Ｅ遺伝子（ ε３遺伝子型）のエキソン４の領域のＣｆｏＩ／ＲｓａＩ消化産物のＭＡＬＤＩ −ＴＯＦ質量スペクトルを示す。 図９７ＢはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析用試料を４℃で調製した以外は図９７Ａと 同一のスペクトルを示す。 図９８は、試料を４℃で調製したアポリポタンパク質Ｅ遺伝子（ε４遺伝子型 ）のエキソン４の２５２塩基対領域のＣｆｏ Ｉ／ＲｓａＩ同時二重消化産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。 図９９はピンツールマイクロディスペンサーを使用して診断産物の１６エレメ ントアレーをＭＡＬＤＩターゲットに移すことにより１５人の患者の小集団試験 で得られた質量スペクトルを示す。 図１００は合成２０量体ＲＮＡのＴ₁消化後にサンプリングしたアリコートの ＭＡＬＤＩ質量スペクトルである。 発明の詳細な説明 定義 特に指定しない限り、本明細書中に使用する全科学技術用語は本発明の属する 技術の当業者に一般に理解されている意味をもつ。許可されるならば、同時係属 特許出願及び特許の各々の主題はその開示内容全体を本明細書の一部とする。 本明細書で使用する「生物試料」なる用語は任意生物源（例えばヒト、動物、 植物、細菌、真菌、原生生物、ウイルス）から得られる任意材料を意味する。本 発明の目的では、生物試料は一般に核酸分子を含む。適当な生物試料の非限定的 な例としては、固体材料（例えば組織、細胞ペレット、生検）と生物体 液（例えば尿、血液、唾液、羊膜液、嗽液、脳髄液及び他の体液）が挙げられる 。 本明細書で使用する「連鎖伸長ヌクレオチド」及び「連鎖停止ヌクレオチド」 なる用語は当技術分野で理解されている意味で使用する。例えば、ＤＮＡでは連 鎖伸長ヌクレオチドは２’−デオキシリボヌクレオチド（例えばｄＡＴＰ、ｄＣ ＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を含み、連鎖停止ヌクレオチドは２’，３’−ジ デオキシリボヌクレオチド（例えばｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄ ＴＴＰ）を含む。ＲＮＡでは連鎖伸長ヌクレオチドはリボヌクレオチド（例えは ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ）を含み、連鎖停止ヌクレオチドは３’−デ オキシリボヌクレオチド（例えば３’ｄＡ、３’ｄＣ、３’ｄＧ及び３’ｄＵ） を含む。完全な１組の連鎖伸長ヌクレオチドとはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ 及びｄＴＴＰを意味する。「ヌクレオチド」なる用語も当技術分野で周知である 。 本明細書で使用するヌクレオチドはヌクレオシド一、二及び三リン酸を含む。 ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドやデアザプリンヌクレオチド等 の修飾ヌクレオチドも含む。完全な１組の連鎖伸長ヌクレオチドとはＤＮＡ鋳型 を含む４種 の異なる塩基の各々にハイブリダイスすることが可能な４種の異なるヌクレオチ ドを意味する。 本明細書で使用する上添文字０〜ｉは質量差を付けたｉ＋１個のヌクレオチド 、プライマー又はタグを表す。場合により、上添文字０は特定反応体の未修飾種 を表し、上添文字ｉはこの反応体のｉ番目の質量改変種を表す。例えば２種以上 の核酸を同時に検出したい場合には、ｉ＋１個の異なる質量改変デテクターオリ ゴヌクレオチド（Ｄ⁰，Ｄ¹，．．．Ｄⁱ）を使用すると、マススペクトロメトリ ーにより質量改変デテクターオリゴヌクレオチド（Ｄ）の各種を相互に区別する ことができる。 本明細書で使用する「多重化」とは、（アレーの１スポットで）特定捕獲核酸 フラグメント上の２個以上の分析物（例えば２個以上の（突然変異）遺伝子座） を同時に検出することを意味する。 本明細書で使用する「核酸」なる用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリ ボ核酸（ＲＮＡ）等の１本鎖及び／又は２本鎖ポリヌクレオチドと、ＲＮＡ又は ＤＮＡの類似体又は誘導体を意味する。ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオ エートＤＮＡ等の核酸の類似体や、他の同様の類似体及び誘導体も「核 酸」の用語に含まれる。 本明細書で使用する「結合」なる用語は、安定な結合、好ましくはイオン又は 共有結合を意味する。好ましい結合手段はストレプトアビジン又はアビジンとビ オチンの相互作用；疎水性相互作用；（例えばＤｙｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｇｒｅａｔ Ｎｅｃｋ，ＮＹ及びノルウェー、オスロから市販されているストレプトアビジ ンをコートした磁性ビーズであるＤＹＮＡＢＥＡＤＳ等の官能化磁性ビーズを使 用する）磁性相互作用；例えば２つの極性表面間又はオリゴ／ポリエチレングリ コール間の「湿潤」会合等の極性相互作用；例えはアミド結合、ジスルフィド結 合、チオエーテル結合等又は架橋剤を介する共有結合の形成；並びに酸レービル 又は光開裂性リンカーによる結合である。 ２種の核酸配列に関して本明細書で使用する等価なる用語は、２種の該当配列 が同一配列のアミノ酸又は等価タンパク質をコードすることを意味する。２種の タンパク質又はペプチドについて「等価」という場合には、２種のタンパク質又 はペプチドがタンパク質又はペプチドの活性又は機能を実質的に変えない保存ア ミノ酸置換を除いて実質的に同一のアミノ酸配列をもつことを意味する。性質に ついて「等価」という場合には、性質 が同程まで存在する必要はない（例えば２種のペプチドは同一型の酵素活性を異 なる程度で示してもよい）が、活性は実質的に同一であることが好ましい。２種 のヌクレオチド配列に関して「相補的」という場合には、逆向きヌクレオチド間 のミスマッチが好ましくは２５％未満、より好ましくは１５％未満、更に好まし くは５％未満、最も好ましくはゼロとなるように２種のヌクレオチド配列を相互 にハイブリダイズできることを意味する。２種の分子は高ストリンジェンシー条 件下でハイブリダイズすることが好ましい。 本明細書で使用するミスマッチ百分率を決定する際のハイブリダイゼーション のストリンジェンシーは、当業者に理解される通りの条件であり、一般には、 １）高ストリンジェンシー：０．１×ＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳ，６５℃、 ２）中ストリンジェンシー：０．２×ＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳ，５０℃、 ３）低ストリンジェンシー：１．０×ＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳ，５０℃に実質 的に等価である。他の緩衝液、塩及び温度を使用しても等価ストリンジェンシー が得られるとみなされる。 本明細書で使用するプライマーとは、請求の範囲に記載する場合には固定化、 ハイブリダイジング、鎖置換、シーケンシングを必要とするマススペクトロメト リーに適したプライマーを意味する。核酸は十分に低分子量であり、一般に約７ ０ヌクレオチド又は７０未満であり且つマススペクトロメトリー検出に基づく本 発明のマススペクトロメトリー法で有用であるために十分な寸法でなければなら ない。これらの方法は核酸の検出及びシーケンシング用プライマーを使用し、こ のようなプライマーは安定なデュプレクスを形成するために十分な数のヌクレオ チド、一般に約６〜３０、好ましくは約１０〜２５、より好ましくは約１２〜２ ０のヌクレオチドを必要とする。従って、本発明の目的では、プライマーはプラ イマーの配列と用途に依存して約６〜７０、より好ましくは１２〜７０、より好 ましくは約１４〜上限７０までのヌクレオチド配列である。本発明のプライマー は、例えば突然変異分析に用いる場合には、診断に有用な遺伝子座の上流となる ように選択し、目的部位まで又は目的部位を通るシーケンシングを使用して実施 するときに、得られるフラグメントがマススペクトロメトリーにより検出するた めに十分であり且つ大き過ぎない質量をもつようにする。マス スペクトロメトリー法では、５’末端に質量タグ又は修飾因子を付け、それ以外 にはプライマーを標識しないことが好ましい。 本明細書で使用する核酸の「条件付け」なる用語は、ヌクレオチド単位当たり に結合したカチオンの不均〜一性によるピーク広幅化をなくす目的で核酸分子の ホスホジエステル主鎖を修飾（例えばカチオン交換）することを意味する。核酸 分子をヨウ化アルキル、ヨードアセトアミド、β−ヨードエタノール又は２，３ −エポキシ−１−プロパノール等のアルキル化剤と接触させると、核酸分子のモ ノチオホスホジエステル結合をホスホトリエステル結合に変換することができる 。同様に、塩化トリアルキルシリルを使用してホスホジエステル結合を無電荷誘 導体に変換してもよい。他の条件付け方法として、脱プリン（ＭＳ中の断片化） 感受性を弱めるヌクレオチド（例えはＮ７−又はＮ９−デアザプリンヌクレオチ ド等のプリン類似体）やＲＮＡ構成ブロックを組み込んでもよいし、オリゴヌク レオチドトリエステルを使用してもよいし、アルキル化されるホスホロチオエー ト官能基を組み込んでもよいし、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等のオリゴヌクレオチ ド模擬体を使用してもよい。 本明細書で使用する支持体とは、本明細書に記載する材料に 応じて試料を付着する不溶性支持体を意味する。適当な支持体の例としてはビー ズが挙げられ、例えばシリカゲル、ＣＰＧ、磁性、アガロースゲル及び架橋デキ ストロース（即ちＳｅｐｈａｒｏｓｅ及びＳｅｐｈａｄｅｘ）、セルロース及び 固体支持体マトリックスとして利用できることが当業者に知られている他の材料 からなる。例えば、支持体はシリカゲル、ガラス、磁性体、ポリスチレン／１％ ジビニルベンゼン樹脂（例えばＦｍｏｃ−アミノ酸−４−（ヒドロキシメチル） フェノキシメチルコポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン（ＤＶＤ））樹脂で あるＷａｎｇ樹脂、クロロトリチル（２−クロロトリチルクロリドコポリスチレ ン−ＤＶＢ樹脂）樹脂、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（クロロメチル化コポリスチレン −ＤＶＢ）樹脂）、金属、プラスチック、セルロース、例えば商品名Ｓｅｐａｈ ｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で市販されているもの等の架橋デキストラン、例 えば水素結合多糖型アガロースゲルである商品名Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）で市販されているもの等のアガロースゲル、並びに当業者に公知の 他の同様の樹脂及び固相支持体の任意のもの又はその組み合わせから形成するこ とができる。支持体マトリックスは任意の形状又は形態をとるこ とができ、非限定的な例としては、キャピラリー、ガラス繊維フィルター、ガラ ス表面、金属表面（鋼、金、銀、アルミニウム、銅及びケイ素）等の平坦支持体 、多重ウェルプレート又は膜を含むプラスチック材料（例えばポリエチレン、ポ リプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリド）、ピン（例えば組み 合わせ合成又は分析に適したピンのアレー）、平坦表面のピットに形成したビー ズ（例えばプレートをもつかもたないウェーハシリコン等のウェーハ）、及びビ ーズが挙げられる。 本明細書で使用する選択的に開裂可能なリンカーとは、選択条件下で開裂され るリンカーであり、例えば光開裂性リンカー、化学開裂性リンカー及び酵素開裂 性リンカー（即ち制限エンドヌクレアーゼ部位又はリボヌクレオチド／ＲＮアー ゼ消化）である。リンカーは支持体と固定化ＤＮＡの間に挿入する。 核酸分子の単離 核酸分子は技術分野で周知の多数の方法の任意のものを使用して特定生物試料 から単離することができ、特定生物試料に適合するように特定単離方法を選択す る。例えば、固体支持体から核酸分子を得るためには凍結−融解及びアルカリ溶 解法が有用であり、尿から核酸分子を得るためには熱及びアルカリ溶解 法が有用であり、血液から核酸を得るためにはプロテイナーゼＫ抽出を使用する ことができる（例えはＲｏｌｆｆら（１９９４）ＰＣＲ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄ ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｒｓｅａｒｃｈ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ参照）。 マススペクトロメトリーを実施するのに十分な量の核酸分子を得るためには、 増幅が必要である。本発明で使用するのに適した増幅法の例としては、クローニ ング（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） （Ｃ．Ｒ．ＮｅｗｔｏｎとＳ．Ｇｒａｈａｍ，ＰＣＲ，ＢＩＯＳ Ｐｕｂｌｉｓ ｈｅｒｓ，１９９４）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばＷｅｉｄｍａｎｎ ら（１９９４）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．Ｖｏｌ．３，ｐｐ．５７− ６４；Ｆ．Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１８９−９３参照）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えばＷａｌ ｋｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２６７０− ７７参照）及び変法（例えばＲＴ−ＰＣＲ（例えば Ｈｉｇｕｃｈｉら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６ −１０３０参照））、対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）並びに転写に基づく方法 が挙げられる。 核酸分子の固体支持体固定化 マススペクトロメトリー分析を容易にするためには、検出しようとする核酸配 列を含む核酸分子を不溶性（即ち固体）支持体に固定化することができる。適当 な固体支持体の例としてはビーズ（例えばシリカゲル、ＣＰＧ、磁性、Ｓｅｐｈ ａｄｅｘ／Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、セルロース）、キャピラリー、ガラス繊維フィ ルター、ガラス表面、金属表面（鋼、金、銀、アルミニウム、銅及びケイ素）等 の平坦支持体、多重ウェルプレート又は膜を含むプラスチック材料（例えばポリ エチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリド）、ピン （例えば組み合わせ合成又は分析に適したピンのアレー）、又は平坦表面のピッ トに形成したビーズ（例えばプレートをもつかもたないウェーハシリコン等のウ ェーハ）が挙げられる。 ターゲット核酸を含む試料は当業者に公知の種々の方法の任意のものにより固 体支持体に移すことができる。例えば、核酸試料を支持体（例えばシリコンチッ プ）の各ウェルに手で又は 本明細書に記載するようなピンツールマイクロディスペンサー装置により移すこ とができる。あるいは、圧電ピペット装置を使用すると、ナノリットルオーダー の少量の試料を支持体に移すことができ、チップ上で高いスループット小型化診 断性能が得られる。 固定化は例えば支持体に予め固定化しておいた捕獲核酸配列と、同様に検出し ようとする核酸配列を含む核酸分子内に含まれる相補的核酸配列のハイブリダイ ゼーションを利用して実施することができる（図１Ａ）。相補的核酸分子間のハ イブリダイゼーションが支持体によって妨げられないようにするために、捕獲分 子は例えば固体支持体と捕獲核酸配列間に少なくとも約５ヌクレオチド長のスペ ーサー領域を含むことができる。形成されるデュプレクスはレーザーパルスの作 用下で開裂し、脱着を開始することができる。固体支持体に結合した核酸分子は 、天然オリゴリボもしくはオリゴデオキシリボヌクレオチド及び類似体（例えば チオ修飾ホスホジエステル又はホスホトリエステル主鎖）を介して又は塩基配列 を酵素分解しにくくするＰＮＡ類似体(例えばＮｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２５４：１４９７（１９９１）)等のオリゴヌクレオチド模擬体を使用 して捕獲塩基配列に結合することができる。 リンカー ターゲット検出部位はターゲット核酸分子（Ｔ）上の適当な官能基（Ｌ’）と 捕獲分子上の適当な官能基（Ｌ）の可逆的又は不可逆的結合を介して固体支持体 に直接結合することができる（図１Ｂ）。可逆的結合はマススペクトロメトリー の条件下で開裂されるように実施することができる（即ち比較的安定な有機基の 間に電荷移動錯体又はレービル結合等の光開裂性結合を形成する）。 光開裂性リンカーは光にあたると開裂し（例えばＧｏｌｄｍａｃｈｅｒら（１ ９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．３：１０４−１０７参照）、光にあたると ターゲット物質を放出するリンカーである。光にあたると開裂し、光にあたると ターゲット物質を放出する光開裂性リンカーは公知である（例えはＨａｚｕｍら （１９８１）ｉｎ Ｐｅｐｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｅｕｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．，１ ６ｔｈ，Ｂｒｕｎｆｅｌｄｔ，Ｋ（編），ｐｐ．１０５−１１０はシステインの 光開裂性保護基としてのニトロベンジル基の使用を記載しており、Ｙｅｎら（１ ９８９）Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ １９０：６９−８２はヒドロキ シプロピルメタクリルアミドコポリマー、グリシンコポリマー、フルオレセイン コポリマー及びメチルローダミンコポリマーを含む水溶性光開裂性コポリマーを 記載しており、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒら（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ ．３：１０４−１０７は近紫外線（３５０ｎｍ）を照射すると光分解する架橋剤 を記載しており、Ｓｅｎｔｅｒら（１９８５）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏ ｂｉｏｌ ４２：２３１−２３７は光開裂性結合を生じるニトロベンジルオキシ カルボニルクロリド架橋剤を記載している）。好ましい態様では、マススペクト ロメトリー中に開裂する光開裂性リンカー部分を使用して核酸を固定化する。本 発明の好ましい光開裂性リンカーは実施例に記載する。 更に、Ｌ’を第４級アンモニウム基として結合を形成することができ、その場 合には、固体支持体の表面が負電荷をもつようにし、負電荷をもつ核酸主鎖と反 発し、マススペクトロメーターによる分析に必要な脱着を容易にすることが好ま しい。脱着はレーザーパルスにより生じる熱により行ってもよいし、及び／又は Ｌ’に応じてＬ’発色団と共鳴するレーザーエネルギーの特異的吸収により行っ てもよい。 従って、Ｌ−Ｌ’化学は（例えばメルカプトエタノール又はジチオトレイトロ ールにより化学的に開裂可能な）ある種のジスルフィド結合、ビオチン／ストレ プトアビジン系、弱酸性条件下及びマススペクトロメトリー条件下で開裂可能な トリチルエーテル基のヘテロ二官能性誘導体（例えばＫｏｓｔｅｒら（１９９０ ）“Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ａｃｉｄ−Ｌａｂｉｌｅ Ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕ ｌｅｓ，”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１：７０９５参照）、 ヒドラジニウム／酢酸緩衝液を含むほぼ中性条件下で開裂可能なレブリニル基、 トリプシン等のエンドペプチターゼ酵素により開裂可能なアルギニン−アルギニ ンもしくはリジン−リジン結合、ピロホスファターゼにより開裂可能なピロリン 酸結合又は例えばリボヌクレアーゼもしくはアルカリにより開裂可能なオリゴデ オキシヌクレオチド配列間のリボヌクレオチド結合であり得る。 官能基Ｌ及びＬ’は電荷移動錯体を形成し、一過性Ｌ−Ｌ’結合を形成しても よい。多くの場合に「電荷移動結合」はＵＶ／ｖｉｓスペクトロメトリーにより 測定できる（例えばＲ． Ｆｏｓｔｅｒ著Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈａｒｇｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｏｍｐｌ ｅｘｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９６９参照）ので、電荷移動波長 の対応エネルギーにレーザーエネルギーを同調させることができ、こうして固体 支持体から特異的脱着を開始することができる。当業者に自明の通り、この目的 には数種の組み合わせを利用することができ、供与官能基を固体支持体に付け、 検出しようとする核酸分子に結合してもよいし、逆に検出しようとする核酸分子 に供与官能基を付け、固体支持体に結合してもよい。 更に別のアプローチでは、比較的安定な基を均一に形成することにより可逆的 Ｌ−Ｌ’結合を形成してもよい。レーザーパルスの作用下でラジカル位置に（上 記のような）脱着とイオン化を行なう。当業者に自明の通り、他の有機基を選択 することもでき、これらの基の間の結合を均一開裂するために必要な解離エネル ギーに応じて対応するレーザー波長を選択することができる（例えばＣ．Ｗｅｎ ｔｒｕｐ著Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９８４参照）。 ＰＣＲ（図４）、ＬＣＲ（図５）又は転写増幅（図６Ａ）等の 増幅操作中に適当なプライマーを使用することにより、ターゲット捕獲配列（Ｔ ＣＳ）にアンカー基Ｌ’を組み込んでもよい。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用してエキソヌクレアーゼシーケンシングを実 施する場合には、その５末端を介して固体支持体に固定化した１本鎖ＤＮＡ分子 を３’向きエキソヌクレアーゼで片側分解し、分解したヌクレオチドの分子量を 順次測定する。逆Ｓａｎｇｅｒシーケンシングにより固定化ＤＮＡのヌクレオチ ド配列が判明する。選択的に開裂可能なリンカーを加えることにより、遊離ヌク レオチドの質量を測定できるだけでなく、洗浄によりヌクレオチドを除去すると 、固体支持体からＤＮＡを開裂後にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより残留フラグメント の質量も測定することができる。本発明の光開裂性及び化学開裂性リンカー等の 選択的に開裂可能なリンカーを使用すると、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのイオン化及び 揮発段階中にこの開裂が生じるように選択的することができる。デュプレクスに 分解される２本鎖ＤＮＡの５’固定化鎖についても同じことが言える。また、５ ’向きエキソヌクレアーゼを使用し、３’末端を介してＤＮＡを固体支持体に固 定化する場合も同様である。 本発明では少なくとも次の３種の固定化態様が考えられる。 １）ターゲット核酸を増幅又は獲得する（プライマーを増幅又は単離させるため にターゲット配列又は周囲ＤＮＡ配列は分かっていなければならない）。２）プ ライマー核酸を固体支持体に固定化し、ターゲット核酸をこれにハイブリダイズ する（これは試料中のターゲット配列の存在を検出するため又は配列決定するた めに行う）。３）（増幅又は単離した）２本鎖ＤＮＡを所定の鎖との結合を介し て固定化し、デュプレクスを除去するようにＤＮＡを変性した後、ターゲット部 位の上流に相同部分をもつ高濃度の相補的プライマー又はＤＮＡを加えて鎖置換 を生じ、プライマーを固定化鎖にハイブリダイズする。 プライマー核酸を固体支持体に固定化し、ターゲット核酸をこれにハイブリダ イズする態様では、開裂性リンカーを加えると、プライマーＤＮＡを５’末端に 固定化して遊離３’−ＯＨを核酸合成（伸長）に使用することができ、ハイブリ ダイズした鋳型を変性により除去でき、伸長したＤＮＡ産物を固体支持体から開 裂してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを実施できるので、「ハイブリダイズした」タ ーゲットＤＮＡの配列を決定することができる。３）でも同様に、固定化ＤＮＡ 鎖を鋳型にハイブリダイズして伸長させ、支持体から開裂することができる。こ のように、ターゲット配列の不変領域に相補的な既知上流ＤＮＡ配列の固定化プ ライマーを使用すると、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングと後述するプライマーオリ ゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）伸長反応を実施することができる。ヒトからの核酸を 得、可変領域（遺伝素因もしくは疾患の原因となる欠失、挿入、ミスセンス突然 変異、又はウイルス／細菌もしくは真菌ＤＮＡの存在）のＤＮＡ配列を検出する だけでなく、突然変異の実際の配列と位置も決定できる。 他の場合には、ターゲットＤＮＡを固定化し、プライマーをアニールしなけれ ばならない。このためには、既知配列に基づいてより大きいＤＮＡを増幅した後 、固定化フラグメントをシーケンシングする必要がある（即ち伸長したフラグメ ントをハイブリダイズするが、上記のように支持体には固定化しない）。これら の場合には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルはハイブリダイズしたＤＮＡのスペ クトルであるため、リンカーを加えることは望ましくなく、固定化鋳型を開裂す る必要がある。 本発明では核酸を固体支持体に固定化するためのリンカーとして当業者に公知 の任意のリンカーを使用して核酸を固体支持体に結合することができる。本発明 で好ましいリンカーは選択 的に開裂可能なリンカー、特に本明細書に例示するようなリンカーである。他の リンカーとしては、ビスマレイミドエトキシプロパン等の酸開裂性リンカーや、 酸レービルトリチルリンカーが挙げられる。 特にターゲット物質を反応させ易くするように開裂する必要がある場合には、 酸開裂性リンカー、光開裂性リンカー及び感熱性リンカーも使用できる。酸開裂 性リンカーの非限定的な例としてはビスマレイミドエトキシプロパン、アジピン 酸ジヒドラジドリンカー（例えばＦａｔｔｏｍら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔｉｏ ｎ ＆ Ｉｍｍｕｎ．６０：５８４−５８９参照）及び細胞内トランスフェリン 循環経路に入るために十分なトランスフェリン部分を含む酸レービルトランスフ ェリン結合体（例えばＷｅｌｈｏｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．２６６：４３０９−４３１４参照）が挙げられる。 光開裂性リンカー 本発明は光開裂性リンカーを提供する。特に、オリゴヌクレオチドの固相合成 に用いるそのホスホロアミダイト誘導体としての光開裂性リンカーを提供する。 リンカーはｏ−ニトロベンジル部分とリン酸結合を含み、ＵＶ照射すると数分以 内に結合 体を完全に光開裂することができる。使用するＵＶ波長は照射がオリゴヌクレオ チドを損傷しないように選択され、好ましくは約３５０〜３８０ｎｍ、より好ま しくは３６５ｎｍである。本発明の光開裂性リンは一般に使用されているホスホ ロアミダイトモノマー（Ｓｉｎｈａら（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ ｅｔｔ．２４：５８４３−５８４６；Ｓｉｎｈａら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４５３９−４５５７；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９ ９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９：６１２３−６１９４；及びＭａｔｔｅｕ ｃｃｉら（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１９ １参照）と同等の結合効率をもつ。 １態様において、光開裂性リンカーは式Ｉ： ［式中、Ｒ²⁰はω−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）アルキル又はω− ヒドロキシアルキルであり、Ｒ²¹は水素、アルキル、アリール、アルコキシカル ボニル、アリールオキシカ ルボニル及びカルボキシから選択され、Ｒ²²は水素又は（ジアルキルアミノ）（ ω−シアノアルコキシ）Ｐ−であり、ｔは０〜３であり、Ｒ⁵⁰はアルキル、アル コキシ、アリール又はアリールオキシである］をもつ。 好ましい態様において、光開裂性リンカーは式ＩＩ： ［式中、Ｒ²⁰はω−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）アルキル、ω−ヒ ドロキシアルキル又はアルキルであり、Ｒ²¹は水素、アルキル、アリール、アル コキシカルボニル、アリールオキシカルボニル及びカルボキシから選択され、Ｒ²² は水素又は（ジアルキルアミノ）（ω−シアノアルコキシ）Ｐ−であり、Ｘ²⁰ は水素、アルキル又はＯＲ²⁰である］をもつ。 特に好ましい態様において、Ｒ²⁰は３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキ シ）プロピル、３−ヒドロキシプロピル又はメチルであり、Ｒ²¹は水素、メチル 及びカルボキシから選択さ れ、Ｒ²²は水素又は（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−であ り、Ｘ²⁰は水素、メチル又はＯＲ²⁰である。より好ましい態様において、Ｒ²⁰は ３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルであり、Ｒ²¹はメチルで あり、Ｒ²²は（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−であり、Ｘ²⁰ は水素である。別のより好ましい態様において、Ｒ²⁰はメチルであり、Ｒ²¹は メチルであり、Ｒ²²は（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−で あり、Ｘ²⁰は３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシである。 別の態様において、光開裂性リンカーは式ＩＩＩ： ［式中、Ｒ²³は水素又は（ジアルキルアミノ）（ω−シアノアルコキシ）Ｐ−で あり、Ｒ²⁴はω−ヒドロキシアルコキシ、ω−（４，４’−ジメトキシトリチル オキシ）アルコキシ、ω−ヒドロキシアルキル及びω−（４，４’−ジメトキシ トリチル オキシ）アルキルから選択され、アルキル又はアルコキシ鎖上で１個以上のアル キル基により置換されていてもいなくてもよく、ｒ及びｓは各々独立して０〜４ であり、Ｒ⁵⁰はアルキル、アルコキシ、アリール又はアリールオキシである］を もつ。所定の態様において、Ｒ²⁴はω−ヒドロキシアルキル又はω−（４，４’ −ジメトキシトリチルオキシ）アルキルであり、アルキル鎖上でメチル基により 置換されている。 好ましい態様において、Ｒ²³は水素又は（ジイソプロピルアミノ）（２−シア ノエトキシ）Ｐ−であり、Ｒ²⁴は３−ヒドロキシプロポキシ、３−（４，４’− ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシ、４−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキ シ−１−プロピル、１−ヒドロキシ−２−プロピル、３−ヒドロキシ−２−メチ ル−１−プロピル、２−ヒドロキシエチル、ヒドロキシメチル、４−（４，４’ −ジメトキシトリチルオキシ）ブチル、３−（４，４’−ジメトキシトリチルオ キシ）−１−プロピル、２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）エチル、 １−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−２−プロピル、３−（４，４’ −ジメトキシトリチルオキシ）−２−メチル−１−プロピル及び４，４’−ジメ トキシトリチルオキシメチルから選択される。 より好ましい態様において、Ｒ²³は（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエ トキシ）Ｐ−であり、ｒ及びｓは０であり、Ｒ²⁴は３−（４，４’−ジメトキシ トリチルオキシ）プロポキシ、４−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ブ チル、３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピル、２−（４，４’ −ジメトキシトリチルオキシ）エチル、１−（４，４’−ジメトキシトリチルオ キシ）−２−プロピル、３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−２−メ チル−１−プロピル及び４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチルから選択さ れる。Ｒ²⁴は３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシが最も好 ましい。 光開裂性リンカーの製造 Ａ．式Ｉ又はＩＩの光開裂性リンカーの製造 式Ｉ又はＩＩの光開裂性リンカーは下記方法により製造することもできるし、 適当な出発材料を選択することにより下記方法を多少変更するか又は当業者に公 知の他の任意の方法により製造することもできる。式ＩＩの光開裂性リンカーの 詳細な合成手順は実施例に記載する。 Ｘ²⁰が水素である式ＩＩの光開裂性リンカーでは、リンカーは次のように製造 することができる。５−ヒドロキシ−２−ニ トロベンズアルデヒドをハロゲン化ω−ヒドロキシアルキル（例えば臭化３−ヒ ドロキシプロピル）でアルキル化した後、得られたアルコールを例えばシリルエ ーテルで保護すると、５−（ω−シリルオキシアルコキシ）−２−ニトロベンズ アルデヒドが得られる。アルデヒドに有機金属を加えると、ベンジルアルコール が得られる。使用可能な有機金属としては、（Ｒ²¹がアルキルであるリンカーの 場合には）トリメチルアルミニウム等のトリアルキルアルミニウム、（Ｒ²¹が水 素であるリンカーの場合には）ホウ水素化ナトリウム等のホウ水素化物、又は（ Ｒ²¹がカルボキシ又はアルコキシカルボニルであるリンカーの場合には）シアン 化カリウム等のシアン化金属が挙げられる。シアン化金属の場合には、その後、 反応生成物であるシアノヒドリンを水又はアルコールの存在下に酸性又は塩基性 条件下で加水分解すると、目的化合物が得られる。 その後、例えばフッ化テトラブチルアンモニウムで脱シリル化して対応するア ルコールを得た後、塩化４，４’−ジメトキシトリチルと反応させることにより 、得られたベンジルアルコールの側鎖のシリル基を４，４’−ジメトキシトリチ ル基に交換する。例えば２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダ イトと反応させると、Ｒ²²が（ジアルキルアミノ） 式ＩＩの光開裂性リンカーの特定合成例を下記スキームに示し、オリゴヌクレ オチド合成におけるリンカーの使用も示す。このスキームは単に例示の目的に過 ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。これらの合成変換の実験の詳細は 実施例に記載する。 Ｘ²⁰がＯＲ²⁰である式ＩＩのリンカーの合成では、例えば炭酸カリウム及び塩 化シリルとの反応により３，４−ジヒドロキシアセトフェノンの４−ヒドロキシ を選択的に保護する。アセトフェノンの代わりに安息香酸エステル、プロピオフ ェノン、ブチロフェノン等を使用してもよい。得られた４−シリルオキシ−３− ヒドロキシアセトフェノンを次に（Ｒ²⁰がアルキルであるリンカーの場合には） ハロゲン化アルキルで３−ヒドロキシルをアルキル化し、例えばフッ化テトラブ チルアンモニウムで脱シリル化すると、３−アルコキシ−４−ヒドロキシアセト フェノンが得られる。この化合物を次にハロゲン化ω−ヒドロキシアルキル（例 えば臭化３−ヒドロキシプロピル）と反応させて４−ヒドロキシルをアルキル化 すると、４−（ω−ヒドロキシアルコキシ）−３−アルコキシアセトフェノンが 得られる。次に側鎖アルコールをエステル（例えば酢酸エステル）として保護す る。次にこの化合物の５位を例えば濃硝酸で硝酸化すると、対応する２−ニトロ アセトフェノンが得られる。順序はどちらでもよいが、側鎖エステルを例えば炭 酸カリウムで鹸化し、ケトンを例えばホウ水素化ナトリウムで還元すると、２− ニト ロ−４−（ω−ヒドロキシアルコキシ）−５−アルコキシベンジルアルコールが 得られる。 次に塩化４，４’−ジメトキシトリチルと反応させることにより側鎖アルコー ルを対応する４，４’−ジメトキシトリチルエーテルとして選択的に保護する。 更に例えば２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイトと反応さ せると、Ｒ²²が（ジアルキルアミノ）（ω−シアノアルコキシ）Ｐ−であるリン カーが得られる。 式ＩＩの光開裂性リンカーの特定合成例を下記スキームに示す。このスキーム は単に例示の目的に過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。変換の詳細 な実験手順は実施例に記載する。 Ｂ．式ＩＩＩの光開裂性リンカーの製造 式ＩＩＩの光開裂性リンカーは下記方法により製造することもできるし、適当 な出発材料を選択することにより下記方法を多少変更するか又は当業者に公知の 他の方法により製造することもできる。 一般に、式ＩＩＩの光開裂性リンカーはω−ヒドロキシアルキル又はアルコキ シアリール化合物、特にω−ヒドロキシアルキル又はアルコキシベンゼンから製 造される。これらの化合物は市販されているが、ハロゲン化ω−ヒドロキシアル キル（例えば臭化３−ヒドロキシプロピル）とフェニルリチウム（ω−ヒドロキ シアルキルベンゼンの場合）又はフェノール（ω−ヒドロキシアルコキシベンゼ ンの場合）から製造することもできる。ω−ヒドロキシル基を（例えば酢酸エス テルとして）アシル化した後、塩化２−ニトロベンゾイルで芳香族環をフリーデ ル−クラフツアシル化すると、４−（ω−アセトキシアルキル又はアルコキシ） −２−ニトロベンゾフェノンが得られる。順序はどちらでもよいが、ケトンを例 えばホウ水素化ナトリウムで還元し、側鎖エステルを鹸化すると、２−ニトロフ ェニル−４−（ヒドロキシアルキル又はアルコキシ）フェニルメタノー ルが得られる。塩化４，４’−ジメトキシトリチルと反応させることにより、末 端ヒドロキシル基を対応する４，４’−ジメトキシトリチルエーテルとして保護 する。その後、ベンジルヒドロキシル基を例えば２−シアノエチルジイソプロピ ルクロロホスホロアミダイトと反応させると、Ｒ²³が（ジアルキルアミノ）（ω −シアノアルコキシ）Ｐ−である式ＩＩのリンカーが得られる。 式ＩＩＩの他の光開裂性リンカーは上記合成でω−ヒドロキシアルキル又はア ルコキシベンゼンを２−フェニル−１−プロパノール又は２−フェニルメチル− １−プロパノールに置き換えることにより製造することができる。これらの化合 物は市販されているが、例えば触媒第１銅イオンの存在下に臭化フェニルマグネ シウム又は臭化ベンジルマグネシウムを必要なオキシラン（即ちプロピレンオキ シド）と反応させることにより製造することもできる。 化学開裂性リンカー 種々の化学開裂性リンカーを使用して固定化核酸と固体支持体の間に開裂性結 合を導入することができる。酸レービル結合は３−ＨＰＡマトリックス溶液を加 えると核酸の条件付け中に 開裂されるので、マススペクトロメトリー、特にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳに好 ましい本発明の化学開裂性リンカーは酸レービルリンカーである。酸レービル結 合は別個のリンカー基（例えば酸レービルトリチル基、図６８、実施例１６参照 ）として導入してもよいし、ジイソプピルシリルを使用して１個以上のシリルヌ クレオシド間橋を導入することにより合成核酸リンカーに組み込み、ジイソプピ ルシリルに結合したオリゴヌクレオチド類似体を形成してもよい。ジイソプピル シリル橋はＤＮＡ主鎖中のホスホジエステル結合に置換し、１．５％トリフルオ ロ酢酸（ＴＦＡ）又は３−ＨＰＡ／１％ＴＦＡ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマトリック ス溶液等の弱酸性条件下でＤＮＡ分子に１個以上の鎖内切断を導入する。ジイソ プピルシリルに結合したオリゴヌクレオチド前駆物質及び類似体の製造方法は当 業者に公知である（例えばＳａｈａら（１９９３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８ ：７８２７−７８３１参照）。これらのオリゴヌクレオチド類似体は、ジイソプ ピルシリルを結合したデオキシリボヌクレオシドを使用するソリッドステートオ リゴヌクレオチド合成法により容易に製造することができる。 核酸条件付け マススペクトロメトリー分析の前に例えば揮発に必要なレーザーエネルギーを 低減するため及び／又は断片化を最小にするために核酸分子を「条件付け」する と有用であり得る。条件付けはターゲット検出部位を固定化している間に実施す ることが好ましい。条件付けの１例は核酸分子のホスホジエステル主鎖の修飾（ 例えばカチオン交換）であり、ヌクレオチド単位当たりに結合するカチオンの不 均一性によるピーク広幅化をなくすのに有用であり得る。核酸分子をヨウ化アル キル、ヨードアセトアミド、β−ヨードエタノール又は２，３−エポキシ−１− プロパノール等のアルキル化剤と接触させると、核酸分子のモノチオホスホジエ ステル結合をホスホトリエステル結合に変換することができる。同様に、塩化ト リアルキルシリルを使用してホスホジエステル結合を無電荷誘導体に変換しても よい。他の条件付け方法として、脱プリン（ＭＳ中の断片化）感受性を弱めるヌ クレオチド（例えばＮ７−又はＮ９−デアザプリンヌクレオチド等のプリン類似 体）やＲＮＡ構成ブロックを組み込んでもよいし、オリゴヌクレオチドトリエス テルを使用してもよいし、アルキル化されるホスホロチオエート官能基を組み込 んでもよいし、ＰＮＡ等のオリゴヌクレオチド模擬体を使用してもよい。 多重反応 用途によっては、（アレーの１スポットで）特定捕獲核酸フラグメント上の２ 個以上の（突然変異）遺伝子座を同時に検出することが有用な場合や、あるいは 種々の固体支持体上のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド模擬体アレー を使用することにより並行処理を実施することが有用な場合もある。「多重化」 は数種の異なる方法により実施することができる。例えば、対応するデテクター （プローブ）分子（例えばオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド模擬体） を使用することにより１個のターゲット配列上で数個の突然変異を同時に検出す ることができる。デテクターオリゴヌクレオチドＤ１、Ｄ２及びＤ３間の分子量 差は同時検出（多重化）を可能にするために十分大きくなければならない。これ は配列自体（組成又は長さ）によっても得られるし、質量改変官能基Ｍ１〜Ｍ３ をデテクターオリゴヌクレオチドに導入しても得られる（図２参照）。 核酸の質量改変 例えばオリゴヌクレオチドの５’末端（Ｍ¹）、ヌクレオ塩基 （又は塩基）（Ｍ²，Ｍ⁷）、リン酸主鎖（Ｍ³）及びヌクレオシドの２’位（Ｍ⁴ ，Ｍ⁶）及び／又は末端３’位（Ｍ⁵）に質量改変部分を結合することができる。 質量改変部分の例としては例えばハロゲン、アジド又はＸＲ型（式中、Ｘは結合 基であり、Ｒは質量改変官能基である）のものが挙げられる。こうして、質量改 変官能基を使用してオリゴヌクレオチド分子に規定質量増分を導入することがで きる。 質量改変官能基はヌクレオチド分子内の種々の位置に配置することができる（ 例えば米国特許第５，５４７，８３５号及び国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２１８ ２２号参照）。例えは、質量改変部分Ｍはヌクレオ塩基Ｍ²（ｃ⁷−デアザヌクレ オシドの場合にはＣ−７、Ｍ⁷にも）、三リン酸基のαリン酸Ｍ³又はヌクレオシ ド三リン酸の糖環の２’位Ｍ⁴及びＭ⁶に結合することができる。例えばα−チオ ヌクレオシド三リン酸等でホスホジエステル結合（Ｍ４）に修飾を加えると、こ れらの修飾は正しいワトソン−クリック塩基対合を妨げずに例えばアルキル化反 応により完全な核酸分子の１段階合成後部位特異的修飾が得られるという利点が ある（例えばＮａｋａｍａｙｅら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：９９４７−５９参照）。 特に好ましい質量改変官能基は、ポリメラーゼにより核酸に良好に組み込まれる という理由からホウ素修飾核酸である（例えばＰｏｒｔｅｒら（１９９５）Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１９６３−１１９６９；Ｈａｓａｎら（１９９ ６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：２１５０−２１５７；Ｌｉら （１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４４９５−４５０１参照） 。 更に、例えばヌクレオシド三リン酸の糖環の３’位Ｍ⁵に結合することにより 連鎖停止を変化させるように質量改変官能基を加えることもできる。当業者に自 明の通り、本発明の方法では多数の組み合わせを使用することができる。同様に 当業者に自明の通り、連鎖伸長ヌクレオシド三リン酸を同様に質量改変すること もでき、官能基及び結合位置については多数の変形及び組み合わせが可能である 。 特定理論の裏付けはないが、ＸＲのＲにオリゴ／ポリエチレングリコール誘導 体を使用して質量改変Ｍを導入することもできる。この場合の質量改変増分は４ ４であり、即ちｍを０から４に変え、核酸分子（例えば夫々デテクターオリゴヌ クレオチド（Ｄ）又はヌクレオシド三リン酸（図６（Ｃ）））に質量単 位４５（ｍ＝０）、８９（ｍ＝１）、１３３（ｍ＝２）、１７７（ｍ＝３）及び ２２１（ｍ＝４）を加えるだけで５種の異なる質量改変種を生成することができ る。オリゴ／ポリエチレングリコールはメチル、エチル、プロピル、イソプロピ ル、ｔ−ブチル等の低級アルキルでモノアルキル化することもできる。選択結合 基Ｘについても例示する。他の化学を質量改変化合物で使用することもできる（ 例えばＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，ＩＲＬ Ｐ ｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１に記載の化学参照）。 更に別の態様では、オリゴ／ポリエチレングリコール以外の種々の質量改変官 能基Ｒを選択し、適当な結合化学Ｘを介して結合することができる。単純な質量 改変はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及び／又はＩ等のハロゲン又はＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＳ等の 擬ハロゲンをＨに置換するか、あるいは種々のアルキル、アリールもしくはアラ ルキル部分（例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘ キシル、フェニル、置換フェニル、ベンシル）又は官能基（例えばＣＨ₂Ｆ、Ｃ ＨＦ₂、ＣＦ₃、Ｓｉ（ＣＨ₃）₃、Ｓｉ（ＣＨ₃）₂（Ｃ₂Ｈ₅）、Ｓｉ（ＣＨ₃） （Ｃ₂Ｈ₅）₂、Ｓｉ（Ｃ₂Ｈ₅）₃）を使用することにより得られる。更に別の質量 改変は核酸分子（例えばデテクター（Ｄ））又はヌクレオシド三リン酸を介して ホモ又はヘテロペプチドを結合することにより得られる。質量増分５７の質量改 変種を生成するのに有用な１例はオリゴグリシンの結合であり、例えば７４（ｒ ＝１、ｍ＝０）、１３１（ｒ＝１、ｍ＝１）、１８８（ｒ＝１、ｍ＝１）、２４ ５（ｒ＝１、ｍ＝３）の質量改変が達せられる。単純なオリゴアミドを使用する こともでき、例えば７４（ｒ＝１、ｍ＝０）、８８（ｒ＝２、ｍ＝０）、１０２ （ｒ＝３、ｍ＝０）、１１６（ｒ＝４、ｍ＝０）等の質量改変が得られる。本明 細書に記載するもの以外に種々の変形が当業者に自明である。 種々の質量改変デテクターオリゴヌクレオチドを使用して可能な全変異体／突 然変異体を同時に検出することができる（図６Ｂ）。あるいは、伸長及び停止ヌ クレオシド三リン酸の組み合わせを変えてＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ用プライ マーとして機能するようにデテクターオリゴヌクレオチドをデザイン及び配置す ることにより、１個の突然変異の部位で全４種の塩基を検出することができる（ 図６Ｃ）。例えば、増幅プロセス中 に質量改変を組み込んでもよい。 図３は平坦表面（例えば「チップアレー」）に位置特異的に固定化した種々の 特定捕獲配列を使用することにより区別する別の多重検出フォーマットを示す。 異なるターゲット配列Ｔ１〜Ｔｎが存在する場合には、それらのターゲット捕獲 部位ＴＣＳ１〜ＴＣＳｎは相補的固定化捕獲配列Ｃ１〜Ｃｎと特異的に相互作用 する。質量改変官能基Ｍ１〜Ｍｎにより適当に質量差をつけたデテクターオリゴ ヌクレオチドＤ１〜Ｄｎを使用することにより検出する。 マススペクトロメトリーによるＤＮＡシーケンシング法 本発明で利用可能なマススペクトロメトリーフォーマットとしては、マトリッ クス介助レーザーデソープションイオン化（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレー （ＥＳＩ）（例えば連続又はパルス）等のイオン化（Ｉ）技術と関連技術（例え ばイオンスプレー、サーモスプレー、高速原子衝突）及び質量クラスター衝撃（ ＭＣＩ）が挙げられ、これらのイオン源はインリニアフィールド飛行時間（ＴＯ Ｆ）、単一又は多重四重極型、単一又は多重磁気セクター、フーリエ変換イオン サイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、イオントラップ又はこれらを組み合わせ たハイブリッドデテクター（例えばイオントラップ−飛行時間）等の検出フォー マットに適合させることができる。イオン化には凍結分析調製物（ＭＡＬＤＩ） 又は溶剤組み合わせ（ＥＳＩ）等の多数のマトリックス／波長組み合わせを使用 することができる。 正常ＤＮＡ分子は４種のヌクレオチド単位（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）を含み、これら の各々の質量は固有である（夫々モノ同位体質量３１３．０６、３０４．０５、 ２８９．０５、３２９．０５Ｄａ）ので、正確な質量測定によりそのＤＮＡの可 能な塩基組成を規定又は限定することができる。各単位分子量は４９００Ｄａを 越えないと少なくとも１種の許容組成をもたず、全５量体のうちで非固有の公称 分子量は１種しかないか、８量体では２０種ある。これら以上のオリゴヌクレオ チドでは、このような質量オーバーラップは高分解能ＦＴＩＣＲ ＭＳで得られ る〜１／１０⁵（〜１０ｐｐｍ）質量精度で分解することができる。２５量体Ａ₅ Ｔ₂₀では、±０．５Ｄａで測定すると組成縮重は２０であるが、２ｐｐｍ精度で 測定すると３（Ａ₅Ｔ₂₀、Ｔ₄Ｃ₁₂Ｇ₉、ＡＴ₃Ｃ₄Ｇ₁₆）まで減る。所定の組成限 定（例えば鎖中の４種の塩基のうちの１種の有無）により、更にこれを 減らすことができる（下記参照）。 非限定的な例としてカーブドフィールドリフレクトロン又は遅延抽出飛行時間 ＭＳ装置等の中分解能装置を使用してもシーケンシング又は診断用ＤＮＡ検出を 改善することができる。これらの装置はいずれも例えばプライマーオリゴ塩基伸 長（ＰＲＯＢＥ）又は競合的オリゴヌクレオチド単塩基伸長（ＣＯＳＢＥ）、シ ーケンシング又は小さい増幅産物の直接検出から生成される≧３０量体鎖で９Ｄ ａ（Δｍ（Ａ−Ｔ））シフトを検出することが可能である。 バイオマス走査 実施例３３に記載するこの態様では、２本の１本鎖核酸を固体支持体に各々固 定化する。一方の支持体は野生型配列をコードする核酸を含み、他方の支持体は 突然変異ターゲット配列をコードする核酸を含む。完全ヒトゲノムＤＮＡを１種 以上の制限エンドヌクレアーゼ酵素で消化すると、２本鎖ゲノムＤＮＡの小さい フラグメント（１０〜１，０００ｂｐ）が生成される。消化したＤＮＡを固定化 １本鎖核酸と共にインキュベートし、試料を加熱してＤＮＡデュプレクスを変性 させる。固定化核酸は相補的ＤＮＡ鎖に関して他のゲノムＤＮＡ鎖と競合し、適 当 な条件下で相補的ＤＮＡ鎖の一部は固定化核酸とハイブリダイズし、鎖置換を生 じる。高ストリンジェンシー洗浄条件を使用することにより、固定化核酸とゲノ ムＤＮＡ鎖の間に厳密な一致が存在する場合のみ２種の核酸はＤＮＡデュプレク スとして残存する。固定化核酸にハイブリダイズした状態のＤＮＡをマススペク トロメトリーにより分析し、質量スペクトル中で適当な質量のシグナルを検出し 、野生型対立遺伝子であるか突然変異対立遺伝子であるかを診断する。こうして 生物試料から完全ゲノムＤＮＡを単離し、所定の突然変異の有無をスクリーニン グすることができる。種々の１本鎖核酸をアレーフォーマットとして固定化する ことにより、多数の遺伝子座について一連の突然変異を同時にスクリーニングす ることができる（即ち多重化）。 更に、低ストリンジェント洗浄条件を使用すると、ハイブリダイズしたＤＮＡ 鎖について、ターゲット制限エンドヌクレアーゼフラグメント内の欠失又は挿入 に起因する質量変化をマススペクトロメトリーにより分析することができる。 プライマーオリゴヌクレオチド塩基伸長 後記実施例１１に記載するように、プライマーオリゴ塩基伸 長（ＰＲＯＢＥ）法をマススペクトロメトリーと組み合わせると、シーケンシン グによって検出することしかできない反復単位の厳密な数（即ち均一配列内のヌ クレオチドの数）と多型性領域内の第２の部位突然変異を検出することができる 。このように、ＰＲＯＢＥ法は別個のゲノム部位における検出可能な対立遺伝子 の合計数を増し、多型性情報含有量（ＰＩＣ）を増し、例えば父親確定又は法廷 用途の統計分析に著しく確実な検証が可能になる。 この方法はデオキシＮＴＰとデオキシ形で存在しないジデオキシＮＴＰの混合 物の存在下にＤＮＡポリメラーゼを使用して可変ヌクレオチドタンデム反復（Ｖ ＮＴＲ）又は多型性モノヌクレオチド配列に隣接してアニールする検出プライマ ーの伸長に基づく。ＤＮＡを標識せずに、得られる産物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマ ススペクトロメトリーにより評価及び分解する。２８人の無関係個体による模擬 日常適用によると、外部較正を使用したこの方法の質量誤差は最悪の場合で０． ８３％（５６量体）であり、これは約０．１塩基の精度に匹敵し、日常標準質量 偏差は０．１％（０．０３塩基）の範囲である。慣用電気泳動法でこのような精 度に達するのは非現実的であり、法医学及び父 親確定試験におけるＰＲＯＢＥとマススペクトロメトリーの価値は明白である。 フーリエ変換マススペクトロメトリーは分解能が非常に高いので、４本のチュ ーブから塩基を計数する代わりに質量差から配列を解読できるため、Ｓａｎｇｅ ｒ又はＭａｘａｍ Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング実験の全反応を同時に測定す ることができる。 更に、エキソヌクレアーゼによる段階的片側分解により生じる隣接塩基間の質 量差を利用して、生成されるフラグメントの完全な配列を解読することができる 。エキソヌクレアーゼ酵素が相から出るときに生成されるヌクレオシド／ヌクレ オチド混合物はＵＶ又は蛍光測定により区別されないが、ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ及び ｄＣの分子量を区別する分解能が著しく高いのでマススペクトロメトリーには問 題ない。隣接塩基（即ちヌクレオチド）の質量は例えば高速原子衝突（ＦＡＢ） 又はエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）マススペクトロメトリーを使用して 測定することができる。 後記実施例４及び１２に詳細に記載するようにエンドヌクレアーゼ消化で生成 される質量のシフトしたフラグメントを探索 することにより、増幅産物全体を新たに突然変異スクリーニングすることができ る。 タンデムマススペクトロメトリー（Ｍｓⁿ）から得られる部分配列情報は前項 に記載したように組成限定を加えることができる。上記２５量体では、衝突によ り活性化される解離（ＣＡＤ）により３１３Ｄａ差の２個のフラグメントイオン が形成されるので、Ａヌクレオチドを含まないＴ₄Ｃ₁₂Ｇ₉の可能性はなくなり、 ２個以上の単一Ａが確認されるため、ＡＴ₃Ｃ₄Ｇ₁₆も可能な組成から除外される 。 ＭＳⁿを便用してもっと大きいＤＮＡの完全又は部分配列を決定することもで き、これを使用して所定の遺伝子領域で新しい突然変異を検出、位置決定及び同 定することができる。正確な質量の酵素消化産物をそれ以上分析する必要はなく 、質量シフトをもつ消化産物をマススペクトロメーターで複雑な混合物からリア ルタイムで単離することができ、部分的に配列決定し、新しい突然変異の位置を 決定することができる。 表Ｉは開発されている突然変異／多型性検出試験を示す。突然変異の検出 遺伝病の診断 上記マススペクトロメトリー法を使用して例えば現在知られている３０００種 を越える遺伝病（例えば血友病、タラセミア、デュシェン筋ジストロフィー（Ｄ ＭＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病及び嚢胞性線維症（ＣＦ） ）の任意のものを診断又は同定することができる。 後記実施例３は、野生型ＣＦＴＲ遺伝子と３塩基対（９００ダルトン）しか相 違しない嚢胞性線維症膜貫通伝達調節遺伝子（ＣＦＴＲ）の突然変異（ΔＦ５０ ８）のマススペクトロメトリー検出法について記載する。実施例３に詳述するよ うに、検出は正常又は突然変異対立遺伝子に相補的な３’末端塩基をもつ１対の プライマーを使用するシングルチューブ競合的オリゴヌクレオチド単塩基伸長（ ＣＯＳＢＥ）反応を利用する。ポリメラーゼと１塩基上流のヌクレオシド三リン 酸をハイブリダイゼーション及び付加すると、正しくアニールした（即ち３’末 端ミスマッチのない）プライマーのみが伸長し、分子量シフトにより産物を分解 し、マトリックス介助レーザーデソープションイオン化飛行時間マススペクトロ メトリーにより測定する。 嚢胞性線維症ΔＦ５０８多型性では、２８量体「正常」（Ｎ）及び３０量体「突 然変異」（Ｍ）プライマーから夫々Ｎ及びＭホモ接合とヘテロ接合の２９及び３ １量体が生成される。プライマーと産物の分子量は比較的小さく（＜１０ｋＤａ ）、これらの質量差は少なくとも１〜３００Ｄａヌクレオチド単位であるので、 このような測定には低分解能装置が適している。 実施例１１に詳述するようなサーモシーケンスサイクルシーケンシングも遺伝 病の検出に有用である。 遺伝病の原因となる遺伝子の突然変異に加え、トリソミー２１（ダウン症候群 ）、トリソミー１３（パトー症候群）、トリソミー１８（エドワーズ症候群）、 モノソミーＸ（ターナー症候群）及び他の性染色体異数（例えばクラインフェル ター症候群（ＸＸＹ））等の染色体異常による先天性欠損もある。この場合には 、該当染色体によりコードされる「ハウスキーピング」遺伝子が異なる量で存在 するので、増幅フラグメントの量と正常染色体構造における量の差をマススペク トロメトリーにより測定することができる。 更に、糖尿病、動脈硬化症、肥満、種々の自己免疫疾患及び癌（例えば結腸直 腸、乳房、卵巣、肺）等の多数の疾病は特定 のＤＮＡ配列が個体に素因を与えるらしいということが立証されつつある。また 、「ＤＮＡフィンガープリント」（例えば「ミニ及びマイクロサテライト配列」 等の多型性）の検出も同一性又は遺伝（例えば父親確定又は母親確定）を判定す るのに有用である。 後記実施例４及び１２はＥ２、Ｅ３及びＥ４対立遺伝子によりコードされるヒ トアポリポタンパク質Ｅの３種の異なるアイソフォームの任意のものを同定する ためのマススペクトロメーターによる方法について記載する。例えば、適当な制 限エンドヌクレアーゼで消化後に得られるＤＮＡフラグメントの分子量を使用し て突然変異及び／又は特定対立遺伝子の存在を検出することができる。 生物試料に応じて遺伝病、染色体異数又は遺伝素因の診断を出生前又は後に実 施することができる。 癌の診断 本発明は、腫瘍又は癌の存在の早期発見を実現するマススペクトロメーターに よる好ましい方法を提供する。例えば実施例１３に記載するように、テロメア反 復増幅プロトコール（ＴＲＡＰ）と基質プライマーのテロメラーゼ特異的伸長を 併用した 後、反復構造に相補的な第２のプライマーを使用する増幅段階によりテロメラー ゼ特異的伸長産物を増幅して得た伸長ラダーは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペク トロメトリーによりテロメラーゼ活性及び発癌の徴候として容易に検出された。 あるいは実施例１４に記載するように、ＲＴ−ＰＣＲによる腫瘍又は癌関連遺 伝子（例えばヒトチロシン５−ヒドロキシラーゼ）の発現とマススペクトロメト リーによる増幅産物の分析を使用して腫瘍又は癌を検出することができる（例え ばチロシン５−ヒドロキシラーゼによるカテコールアミンの生合成は神経芽細胞 腫の特徴である）。 更に、プライマーオリゴ塩基伸長反応とマススペクトロメトリーによる産物の 検出は、実施例１５に記載するようにＩＩ型多発性内分泌腫瘍症候群（ＭＥＮ ＩＩ）の誘発に関係するＲＥＴ癌原遺伝子コドン６３４等の癌遺伝子の存在を検 出するための迅速な手段を提供する。 感染の診断 ウイルス、細菌、真菌及び他の感染性生物は宿主細胞に含まれる配列とは異な る特定核酸配列を含む。感染性生物に特異的な核酸配列を検出又は定量すること は感染の診断又は監視に重 要である。ヒト及び動物に感染し、本発明の方法により検出可能な疾患の例とし ては、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えばＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡ Ｖ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶともいう。例えばＲａｔｎｅｒら（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２２７−２８４；Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎら（１９８５ ）Ｃｅｌｌ ４０：９−１７参照）、ＨＩＶ−２（Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７ ）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：６６２−６６９；ヨーロッパ特許公開第０２６９５２ ０号；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：５４３− ５４７；及びヨーロッパ特許出願第０６５５５０１号参照）、及び他の単離菌株 （例えばＨＩＶ−ＬＰ（国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／００５６２号、発明の名称 “Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕ ｓ”参照））等のヒト免疫不全ウイルス）；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例 えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（例えばＧｕｓｔら（１９８３）Ｉｎｔ ｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０：１−７参照）、エンテロウイルス、ヒトコクサッ キーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ （例えば胃腸炎を誘発する菌種）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ （例えばウマ脳脊髄炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例え ばデング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉ ｄａｅ（例えばコロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば水泡性 口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えばエボラウ イルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えばパラインフルエンザウイル ス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；Ｏｒｔ ｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えばインフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖ ｉｒｉｄａｅ（例えばハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス及 びナイロウイルス）；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖ ｉｒｉｄａｅ（例えばレオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）；Ｂｉ ｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）； Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（ パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（大半 のアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（Ｈ ＳＶ）１及び２、水痘ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、 ヘルペスウイルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイル ス、ポックスウイルス）及びＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えばアフリカブタ熱 ウイルス）並びに未分類ウイルス（例えば海綿様脳症の病原体、（Ｂ型肝炎ウイ ルスの欠損サテライトであると考えられる）δ肝炎病原体、非Ａ、非Ｂ肝炎病原 体（クラス１＝体内感染；クラス２＝親からの感染（即ちＣ型肝炎）；Ｎｏｒｗ ａｌｋと関連ウイルス及びアストロウイルス）が挙げられる。 感染性細菌の非限定的な例としては、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒ ｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎ ｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、ミコバクテリア種（例えばＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ 、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎ ｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎ ｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐ ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ ｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球 菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ビリダンス群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｈｈｅｎｕ ｍｏｎｉａｅ、病原性カンピロバクター種、腸球菌種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、コリネバクテリウム種、Ｅｒｙ ｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ ｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔ ｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍ ｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、バクテロイデス種、 Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌ ｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ 、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ及びＡｃｔｉ ｎｏｍｙｃｅｓｉｓｒａｅｌｌｉが挙げられる。 感染性真菌の例としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏ ｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａ ｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄ ａ ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられる。他の感染性生物（即ち原生生物）としては 、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍとＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏ ｎｄｉｉが挙げられる。 本発明の方法はターゲット配列の既知配列情報と既知突然変異部位を利用する が、新しい突然変異を検出することもできる。例えば図８に示すように、１種以 上のヌクレアーゼと対応する相補的核酸配列をもつ固体支持体に捕獲したフラグ メントを使用して生物試料から得た核酸分子の転写物を特異的に消化することが できる。ハイブリダイゼーションの検出と捕獲したターゲット配列の分子量は、 遺伝子中の突然変異の有無とその場所に関する情報を提供する。あるいは、１種 以上の特異的エンドヌクレアーゼによりＤＮＡを開裂し、フラグメントの混合物 を形成することができる。野生型と突然変異フラグメントの混合物の分子量を比 較することにより突然変異を検出する。 特定末端をもつフラグメントの生成によるシーケンシング 別の態様では、ターゲット核酸から特定末端をもつフラグメントを生成し、マ ススペクトロメトリーにより各フラグメントの質量を測定し、フラグメントを並 べてより大きいターゲット核酸の配列を決定することにより、比較的大きいター ゲット核酸の正確な配列決定が得られる。好ましい態様では、特定末端をもつフ ラグメントは特定塩基を末端にもつ部分又は完全フラグメントである。 特定塩基を末端にもつフラグメントを生成する方法の１例は、例えば転写反応 後に塩基特異的リボヌクレアーゼを使用する。好ましい塩基特異的リボヌクレア ーゼはＴ₁−リボヌクレアーゼ（Ｇ特異的）、Ｕ₂−リボヌクレアーゼ（Ａ特異的 ）、ＰｈｙＭ−リボヌクレアーゼ（Ｕ特異的）及びリボヌクレアーゼＡ（Ｕ／特 異的）から選択される。他の有効な塩基特異的リボヌクレアーゼは実施例１６に 記載するアッセイを使用して同定することができる。修飾ヌクレオチドを未修飾 ヌクレオチドと転写反応させることが好ましい。修飾ヌクレオチドと未修飾ヌク レオチドを約１：１の好ましい比率で組み込むように適当な濃度で転写反応に加 えると最も好ましい。あるいは、修飾ヌクレオチ ドと未修飾ヌクレオチドで２回別々にターゲットＤＮＡの転写を行い、結果を比 較してもよい。好ましい修飾ヌクレオチドとしては、ホウ素又は臭素修飾ヌクレ オチド（Ｐｏｒｔｅｒら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１９ ６３−１１９６９；Ｈａｓａｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：２１５０−２１５７；Ｌｉら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４４９５−４５０１）、α−チオ修飾ヌクレオチド及び上述のよ うな質量改変ヌクレオチドが挙げられる。 特定塩基を末端にもつフラグメントを生成する別の方法は、増幅と塩基特異的 ターミネーション反応を併用実施する。例えば、連鎖停止ヌクレオチドに対して 比較的親和性をもつ酵素による重合が指数的増幅を生じ、連鎖停止ヌクレオチド に対して比較的高い親和性をもつ酵素が重合を停止してシーケンシング産物を生 じるように、連鎖停止ヌクレオチドに対して各々異なる親和性をもつ少なくとも ２種の異なるポリメラーゼ酵素を使用して増幅とターミネーション反応を併用実 施することができる。 増幅とシーケンシングの併用は、ポリヌクレオチド合成能を もつ酵素（例えばポリメラーゼ）を使用する任意増幅法を利用することができる 。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく好ましい方法の１例は、１）２個の １本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ分子（鋳型：センス及びアンチセンス鎖）を得るのに適し た温度及び時間にわたって２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子を変性する段階と、２）ｓ ｓＤＮＡ鋳型を含むプライマーを得るのに適した温度及び時間にわたって少なく とも１個のｓｓＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする少なくとも１個のプライマーと 鋳型を接触させる段階と、３）鋳型を含むプライマーを適当な温度及び適当な時 間にわたって（ｉ）完全な１組の連鎖伸長ヌクレオチド、（ｉｉ）少なくとも１ 個の連鎖停止ヌクレオチド、（ｉｉｉ）連鎖停止ヌクレオチドに対して比較的低 い親和性をもつ第１のＤＮＡポリメラーゼ及び（ｉｖ）連鎖停止ヌクレオチドに 対して比較的高い親和性をもつ第２のＤＮＡポリメラーゼと接触させる段階から なる３段階の熱処理を含む。 段階１）〜３）は所望量の増幅シーケンシングラダーを得るために十分な回数 （サイクル）順次実施することができる。特定塩基を末端にもつフラグメントの 所望量に応じてサイクルの実施回数を決定する。サイクル数が増すと増幅レベル は増すが、 その後の検出感度が低下する。従って、約５０サイクル以上実施するのは一般に 望ましくなく、約４０サイクル未満（例えば約２０〜３０サイクル）実施すると より好ましい。 核酸配列を同時に増幅及び連鎖停止するための別の好ましい方法は、鎖置換増 幅（ＳＤＡ）（例えばＷａｌｋｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．２２：２６７０−７７；ヨーロッパ特許公開第０６８４３１５号、発明の名 称“Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ”参照）を利用する。 主にこの方法は、１）２個の１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ分子（鋳型：センス及びアン チセンス鎖）を得るのに適した温度及び時間にわたって２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分 子を変性させる段階と、２）ｓｓＤＮＡ鋳型を含むプライマーを得るのに適した 温度及び時間にわたって制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の認識／開裂部位を含 み且つ少なくとも１個のｓｓＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする少なくとも１個の プライマー（Ｐ）と鋳型を接触させる段階と、３）鋳型を含むプライマーを適当 な温度及び適当な時間にわたって（ｉ）完全な１組の連鎖伸長ヌクレオチド、（ ｉｉ）少なくとも１個の連鎖停 止ヌクレオチド、（ｉｉｉ）連鎖停止ヌクレオチドに対して比較的低い親和性を もつ第１のＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｖ）連鎖停止ヌクレオチドに対して比較的 高い親和性をもつ第２のＤＮＡポリメラーゼ及び（ｖ）プライマー認識／開裂部 位をニックするＲＥと接触させる段階からなる３段階を１サイクルとして含む。 段階１）〜３）は所望量の増幅シーケンシングラダーを得るために十分な回数 （サイクル）順次実施することができる。ＰＣＲに基づく方法と同様に、特定塩 基を末端にもつフラグメントの所望量に応じてサイクルの実施回数を決定する。 好ましくは５０サイクル未満、より好ましくは約４０サイクル未満、最も好まし くは約２０〜３０サイクルを実施する。 増幅と連鎖停止反応の併用では約０．５〜約３単位のポリメラーゼを使用する ことが好ましい。約１〜２単位を使用すると最も好ましい。ＰＣＲ又は他の熱増 幅法と併用するのに特に好ましいポリメラーゼはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−） 、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）及び Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ ａｂｓ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）又はｅｘｏ （−）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラ ーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）、ＡｍｐｌｉＴ ａｑ、Ｕｌｔｍａｎ、９ ｄｅｇｒｅｅ Ｎｍ、Ｔｔｈ。Ｈｏｔ Ｔｕｂ及びＰ ｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ等の熱安定ポリメラーゼである。更に、 ポリメラーゼは５’ー３’エキソヌクレアーゼ活性をもたないことが好ましい。 連鎖停止ヌクレオチドに対して比較的高い親和性をもつポリメラーゼと比較的 低い親和性をもつポリメラーゼに加え、プルーフリーディング能をもつ第３のＤ ＮＡポリメラーゼ（例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮ Ａポリメラーゼ）も増幅混合物に加え、増幅の忠実度を増進してもよい。 特定塩基を末端にもつフラグメントを生成するための更に別の方法は、適量の ターゲット核酸を特異的エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼと接触させ る。核酸の元の５’及び／又は３’末端にタグを付けてフラグメントを並べ易く することが好ましい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸転写産物を分析する場合に は３’末端にタグを付け、３’不均一性、早期停止及び非特異的伸長の影響を最 小限にすると特に好ましい。５’及び３’タグは天然（例えば３’ポリＡテール 又は５’もしくは３’不均一性）でもよいし、人工でもよい。好ましい５’及び ／又は３’タグは質量改変に関して上述したものから選択される。 以下、実施例により本発明の方法を更に説明するが、これにより発明を制限す るものではない。 実施例１ 固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドの直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ脱着 ＣｐＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）１ｇを３−（トリエ トキシシリル）エポキシプロパンで官能化し、ポリマー表面にＯＨ基を形成した 。β−シアノエチルホスホロアミダイト（Ｋｏｓｔｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４５３９）とＴＡＣ Ｎ保護基（Ｋｏｓｔ ｅｒら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３７：３６２）を使用してＤＮＡ 合成器（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ，Ｍｏｄｅｌ ７５００）でＯＨ−ＣＰＧ１３ｍｇか ら標準オリゴヌクレオチド合成を実施し、５０ヌクレオチドが「ハイポセティカ ル」５０量体配列に相補的な３’−Ｔ₅−５０量体オリゴヌクレオチド配列を合 成した。メタノール中飽和アンモニアで室温で２時間脱保護すると、ＤＭＴ基の 測定によるとＣＰＧ１ｇ当たり約１０μｍｏｌの５５量体を含むＣＰＧが得られ た。この５５量体を鋳型として使用し、（５’−ＤＭＴ基をもつ）２５量体及び （ＤＭＴ基をもたない）４０量体とハイブリダイズした。反応容量は１００μｌ であり、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び ２５ｍＭ ＮａＣｌ溶液（２６量体又は４０量体）中に鋳型としてのＣＰＧ結合 ５５量体約１ｎｍｏｌと、等モル量のオリゴヌクレオチドを含む。混合物を６５ ℃に１０分間加熱し、３０分間で３７℃まで冷却した（アニーリング）。ポリマ ーに結合した鋳型にハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドを遠心分離後 、氷冷５０ｍＭクエン酸アンモニウム各１００μｌで３回洗浄／遠心分離するこ とによりに除去した。ビーズを風乾し、マトリックス溶液（１：１アセトニトリ ル／水中３−ヒドロキシピコリン酸／１０ｍＭクエン酸アンモニウム）と混合し 、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより分析した。結果を図１０及 び１１に示す。 実施例２ １８量体と１９量体のエレクトロスプレー（ＥＳ）デソープション及び区別 ２−プロパノール／１０ｍＭ炭酸アンモニウム（１／９，ｖ／ｖ）中５０ｐｍ ｏｌ／μｌの濃度のＤＮＡフラグメントをエレクトロスプレーマススペクトロメ ーターにより同時に分析した。 図１２に示すように１８量体と１９量体はエレクトロスプレーマススペクトロ メトリーにより脱着及び区別できる。 実施例３ １段階ジデオキシ伸長による嚢胞性線維症突然変異ΔＦ５０８の検出とＭＡＬＤ Ｉ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによる分析（競合的オリゴヌクレオチド１塩 基伸長−ＣＯＳＢＥ） ＣＯＳＢＥ法の原理を図１３に示し、同図中、夫々Ｎは正常及びＭは突然変異 検出プライマーである。 材料と方法 ＰＣＲ増幅及び鎖固定化。標準ＰＣＲ条件（３０サイクル：１分間９５℃、１ 分間５５℃、２分間７２℃）を使用してエキソン１０特異的プライマーで増幅を 実施し、逆プライマーをビ オチンで５’標識し、カラム精製した（Ｏｌｉｇｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｃｒｕａｃｈｅｍ）。増幅後に増幅産物をカラム分離（Ｑ ｉａｇｅｎ Ｑｕｉｃｋｓｐｉｎ）により精製し、標準プロトコールに従ってス トレプトアビジンをコートした磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｄｙｎａｌ， ノルウェー）に固定化し、０．１Ｍ ＮａＯＨを使用してＤＮＡを変性させ、０ ．１Ｍ ＮａＯＨ，１×Ｂ＋Ｗ緩衝液とＴＥ緩衝液で洗浄し、非ビオチン化セン ス鎖を除去した。 ＣＯＳＢＥ条件。連結したアンチセンス鎖を含むビーズを反応混合物１（１０ ×Ｔａｑ緩衝液２μｌ、Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １μＬ（１単位）、２ ｍＭ ｄＧＴＰ ２μＬ及びＨ₂Ｏ １３μＬ）１８μｌに再懸濁し、８０℃で ５分間インキュベート後、反応混合物２（ＣＯＳＢＥプライマー各１００ｎｇ） を加えた。温度を６０℃まで下げ、混合物を５分間のアニーリング／伸長時間に わたってインキュベートした後、ビーズを２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム （ＴＥＡＡ）、次いで５０ｍＭクエン酸アンモニウムで洗浄した。 プライマー配列。慣用ホスホロアミダイト化学（Ｓｉｎｈａら（１９８４）Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２： ４５３９）を使用してＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｘｐ ｅｄｉｔｅ ８９００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで全プライマーを合成 した。（各々３’末端の１塩基前に意図的ミスマッチを含む）ＣＯＳＢＥプライ マーは、正常の５’末端から２塩基を除去した以外は従来のＡＲＭＳ研究（Ｆｅ ｒｒｉｅら（１９９２）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ５１：２５１−２６２ ）で使用されているものをしようした。 Ｅｘ１０ ＰＣＲ（順）：５’−ＢＴＯ−ＧＣＡ ＡＧＴ ＧＡＡ ＴＣＣ Ｔ ＧＡ ＧＣＧ ＴＧ−３’（配列番号１） Ｅｘ１０ ＰＣＲ（逆）：５’−ＧＴＧ ＴＧＡ ＡＧＧ ＧＴＴ ＣＡＴ Ａ ＴＧ Ｃ−３’（配列番号２） ＣＯＳＢＥ Δ−Ｆ５０８−Ｎ ５’−ＡＴＣ ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＡ Ｔ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＣ ＣＡＣ Ａ−３’（２８量体）（配列番号３） ＣＯＳＢＥ Δ−Ｆ５０８−Ｎ ５’−ＧＴＡ ＴＣＴ ＡＴＡ ＴＴＣ ＡＴ Ｃ ＡＴＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＴＴ−３’（３０量体）（配列番号４ ）。 マススペクトロメトリー。洗浄後、ビーズを１８Ｍｏｈｍ／ ｃｍ Ｈ₂Ｏ １μＬに再懸濁した。マトリックス（Ｗｕら（１９９３）Ｒａｐ ｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．７：１４２−１４６）溶液 （１：１Ｈ₂Ｏ：ＣＨ₃ＣＮ中０．７Ｍ ３−ヒドロキシピコリン酸、０．７Ｍ二 塩基性クエン酸アンモニウム）と再憑濁したビーズ（Ｔａｎｇら（１９９５）Ｒ ａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ８：７２７−７３０）各 ３００ｎＬを試料ターゲット上で混合し、風乾した。２０個までの試料をプロー ブターゲットディスクにスポットして未改造Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｓ ｉｓ（旧Ｆｉｎｎｉｇａｎ）Ｖｉｒｓｉｏｎｓ ２０００ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ のソース領域に導入し、ターゲット及び変換ダイノードで夫々５及び２０ｋＶの リフレクトロンモードで運転した。理論平均分子量（Ｍ_r（ｃａｌｃ））を原子 組成から計算した。市販ソフトウェアを使用し、外部較正を使用してピーク質量 中心を測定し、１．０８Ｄａを差し引いて電荷をもつプロトン質量を修正し、実 測Ｍ_r（ｅｘｐ）値を得た。 スキーム。結合した鋳型にアニーリング後、Ｎ及びＭプライマー（夫々８５０ ８．６及び９１４８．０Ｄａ）にｄＧＴＰを加えると、可変（Ｖ）位置に正しい ワトソンークリック塩基対 をもつプライマーのみがポリメラーゼにより伸長する。即ち、ＶがＮの３’末端 塩基に対合する場合には、Ｎは８８３７．９Ｄａ産物（Ｎ＋１）まで伸長する。 同様に、ＶがＭ末端に正しく対合している場合には、Ｍは９４７７．３Ｄａ Ｍ ＋１産物まで伸長する。 結果 図１４〜１８はＣＯＳＢＥ反応産物の代表的な質量スペクトルを示す。ビオチ ン化アンチセンス鎖を結合する前に増幅産物を精製すると、良好な結果が得られ た。 実施例４ マススペクトロメトリーによるヒトアポリポタンパク質Ｅアイソフォームの区別 アポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）はリポタンパク質のタンパク成分であり、脂 質代謝に重要な役割を果たす。例えば、コレステロール輸送、リポタンパク質粒 子の代謝、免疫調節及び多数の脂質分解酵素の活性化に関与している。 ヒトアポＥでは（Ｅ２、Ｅ３及びＥ４対立遺伝子によりコードされる）３種の アイソフォームがよく知られている。Ｅ３対立遺伝子が最もよく知られている。 Ｅ２対立遺伝子は血漿中の コレステロール濃度を低下させることが示されているので、動脈硬化症の発生に 対する防御効果をもつと思われる。Ｅ２対立遺伝子の一部をコードするＤＮＡを 配列番号１３０に示す。最後に、Ｅ４アイソフォームはコレステロール濃度の増 加に相関関係があるとされており、動脈硬化症の素因を与える。従って、特定個 体のアポＥの存在は心血管病の発生の危険の重要な決定基である。 図１９に示すように、アポリポタンパク質ＥをコードするＤＮＡの試料を被験 体から獲得し、（例えばＰＣＲにより）増幅し、増幅産物を適当な酵素（例えば ＣｆｏＩ）で消化することができる。得られた制限消化産物をその後、種々の手 段により分析することができる。図２０に示すように、アポリポタンパク質Ｅの ３種のアイソタイプ（Ｅ２、Ｅ３及びＥ４）は異なる核酸配列をもち、従って区 別可能な分子量値をもつ。 図２１Ａ〜Ｃに示すように、異なるアポリポタンパク質Ｅ遺伝子型は３．５％ ＭｅｔＰｈｏｒ Ａｇａｒｏｓ Ｇｅｌ又は１２％ポリアクリルアミドゲル中で 異なる制限パターンを示す。図２２及び２３に示すように、種々のアポリポタン パク質Ｅ遺伝子型もマススペクトロメトリーにより正確且つ迅速に決定すること ができる。 実施例５ 血清試料中のＢ型肝炎ウイルスの検出 材料と方法 試料調製 ウイルスＤＮＡのフェノール／クロロホルム抽出と最終エタノール沈殿は標準 プロトコールに従って実施した。 第１回ＰＣＲ 血清からのＤＮＡ調製物５μｌを使用して各反応を実施した。各プライマー１ ５ｐｍｏｌとＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｉ ｔｅｒｓｔａｄｔ，ドイツ）２単位を使用した。各ｄＮＴＰの終濃度は２００μ Ｍとし、最終反応容量は５０μｌとした。１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｌｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，ドイツ）は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ，ｐＨ８．３，５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．０１％ゼラ チン（ｗ／ｖ）を含むものとした。 プライマー配列： 入れ子ＰＣＲ： 夫々第１回ＰＣＲ反応産物１μｌ又は第１回ＰＣＲ産物の１：１０希釈液を鋳 型として使用して各反応を実施した。各プライマー１００ｐｍｏｌ、Ｐｆｕ（ｅ ｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， ドイツ）２．５ｕ、終濃度２００μＭの各ｄＮＴＰ及び１０×Ｐｆｕ緩衝液（２ ００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．７５，１００ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ））５μｌを最終容量５０ μｌ中で使用した。反応はサーモサイクラー（ＯｍｎｉＧｅｎｅ，ＭＷＧ−Ｂｉ ｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，ドイツ）で９２℃１分間、６０℃１分間及び ７２℃１分間を２０サイクル繰り返すプログラムを使用して実施した。オリゴデ オキシヌクレオチド（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，ドイツか ら購入したＨＰＬＣ精製品）の配列は以下の通りである。 増幅産物の精製： 各スペクトルを記録するために、（上述のように実施した）各ＰＣＲ産物５０ μｌを使用した。以下の手順に従って精製を行った。Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ 濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，ドイツ）を製造業者のプロ トコールに従って使用して限外濾過を行い、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離 した。ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ， ドイツ）２５μｌ（１０μｇ／μｌ）を製造業者の指示に従って調製し、Ｂ／Ｗ 緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ）２５μｌに再懸濁した。この懸濁液をまだ濾過装置にあるＰＣＲ試料 に加え、混合物を１５分間周囲温度で静かに震盪しながらインキュベートした。 懸濁液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒ ｔｉｃｌｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ，ＭＰＣ（Ｄｙｎａｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイ ツ）により上清を除去した。ビーズを０．７Ｍクエン酸アンモニウム溶液（ｐＨ ８．０）５０μｌで２回洗浄した（上清は各回毎にＭＰＣを使用して除去した） 。ビーズからの開裂は９０℃でホルムアミドを使用して実施することができる。 上清 をｓｐｅｅｄｖａｃで約１時間乾燥し、超純水（ＭｉｌｌｉＱＵＦ ｐｌｕｓ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，ドイツ）４μｌに再懸濁した。この調 製物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析に使用した。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： 試料０．５μｌを試料ホルダーにピペットで分注後、すぐにマトリックス溶液 (０．７Ｍ ３−ヒドロキシピコリン酸,５０％アセトニトリル，７０ｍＭクエン 酸アンモニウム)０．５μｌと混合した。この混合物を周囲温度で乾燥し、マス スペクトロメーターに導入した。全スペクトルはリフレクトロン（５ｋｅＶイオ ン源、２０ｋｅＶ後加速）と３３７ｎｍ窒素レーザーを取り付けたＦｉｎｎｉｇ ａｎ ＭＡＴ Ｖｉｓｉｏｎ ２０００（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ，Ｂｒｅｍ ｅｎ，ドイツ）を使用して陽イオンモードで測定した。４０量体と１００量体の 混合物で較正を行った。各試料を種々のレーザーエネルギーで測定した。陰性試 料では、増幅産物はレーザーエネルギーの高低に拘わらず検出されなかった。陽 性試料ではレーザーエネルギーを変えても試料スポットの種々の場所で増幅産物 が検出された。 結果 入れ子ＰＣＲシステムを使用し、ＨＢＶコア抗原（ＨＢＶｃＡｇ）をコードす るＨＢＶゲノムのｃ領域に相補的なオリゴヌクレオチド（プライマー１：相補鎖 のマップ１７６３位から開始、プライマー２：マップ２０３２位から開始）を使 用して血液試料中のＨＢＶ ＤＮＡを検出した。ＤＮＡは標準プロトコールに従 って患者血清から単離した。第１回ＰＣＲは第１組のプライマーを使用してこれ らの調製物からのＤＮＡで実施した。ＨＢＶ ＤＮＡが試料中に存在する場合に は、２６９ｂｐのＤＮＡフラグメントが生成された。 第２回反応では、第１回ＰＣＲで生成されたＰＣＲフラグメント内の領域に相 補的なプライマーを使用した。ＨＢＶ関連増幅産物が第１回ＰＣＲに存在する場 合には、この入れ子ＰＣＲで６７ｂｐのＤＮＡフラグメントが生成された（図２ ５Ａ参照）。入れ子ＰＣＲシステムを検出に使用すると、高い感度が得られ、外 部ＰＣＲの特異性対照としても有用である（Ｒｏｌｆｓら（１９９２）ＰＣＲ： Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｐ ｒｉｎｇｅｒ Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ）。精製低下は避けられないが、第２回Ｐ ＣＲ で生成されるフラグメントの量が問題ない検出を確保するために十分高いという 利点もある。 ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓで限外濾過して試料を精製した。この 精製を行ったのは、立体上の理由により短いプライマーフラグメントのほうがビ ーズに高い効率で固定化されるからである。固定化は非特異的膜吸着による物質 損失を避けるために限外濾過膜に直接行った。固定化後、ビーズをクエン酸アン モニウムで洗浄し、カチオン交換を行った（Ｐｉｅｌｅｓら（１９９３）Ｎｕｃ ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３１９３−３１９６）。２５％アンモニアを使 用して固定化ＤＮＡをビーズから分離するとＤＮＡをビーズから非常に短時間で 分離することができ、ナトリウムや他のカチオンも混入しなかった。 入れ子ＰＣＲとＭＡＬＤＩ ＴＯＦ分析は血清分析結果を知らずに実施した。 ウイルス力価が不明のため、第１回ＰＣＲの各試料は鋳型として夫々未希釈のま ま及び１：１０に希釈して使用した。 試料１はＨｂｓ及びＨｂｅ抗原試験で陽性であり且つドットブロット分析で陰 性であった慢性活性ＨＢＶ感染患者から採取 した。試料２はドットブロット分析でＨＢＶ陽性であった活性ＨＢＶ感染と顕著 なウイルス血症をもつ患者からの血清試料とした。試料３は変性血清試料であり 、従って、トランスアミナーゼ濃度を上げると血清分析を実施することができず 、肝疾患が検出されることを示した。オートラジオグラフ分析（図２４）でこの 試料の第１回ＰＣＲは陰性であった。しかし、ＨＢＶ感染の多少の徴候があった 。この試料は精製操作後に低レベルの量ではあるが増幅産物を検出できるので、 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に重要である。試料４はＨＢＶ感染が治癒した患者から 採取した。試料５及び６は慢性活性ＨＢＶ感染患者から採取した。 図２４は入れ子ＰＣＲ反応のＰＡＧＥ分析の結果を示す。試料１、２、３、５ 及び６には増幅産物が明白に示される。試料４では増幅産物は生成されず、血清 分析通り、確かにＨＢＶ陰性である。陰性及び陽性対照は夫々＋及び−で示す。 未希釈鋳型を使用した場合にもレーン２、５、６及び＋には増幅アーチファクト が見られる。これらのアーチファクトは鋳型を１：１０に希釈して使用した場合 には生じなかった。試料３では鋳型を希釈しない場合のみに増幅産物を検出でき た。ＰＡＧＥ分析結果は上述のように試料３を除き、血清分析により得られたデ ー タに一致している。 図２５Ａは上述のように生成及び精製した試料番号１からの入れ子増幅産物の 質量スペクトルを示す。２０７５４Ｄａのシグナルは１本鎖増幅産物を表す（計 算値：２０７３５Ｄａ、ビーズから開裂した増幅産物の両鎖の平均質量）。計算 値と実測地の質量差は１９Ｄａ（０．０９％）である。図２５Ａに示すように、 試料番号１は多量の増幅産物を生成し、はっきり検出された。 図２５Ｂは試料番号３から得られたスペクトルを示す。図２４に示すように、 このセクションで生成された増幅産物の量は試料番号からの量よりも著しく少な い。しかし、増幅産物は質量２０７５１Ｄａ（計算値２０７３５）ではっきり現 れている。質量差は１６Ｄａ（０．０８％）である。図２５Ｃに示すスペクトル は（図２４と同様に）ＨＢＶ陰性の試料番号４から得た。予想通り、増幅産物に 対応するシグナルは検出できなかった。図２５に示す全試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯ Ｆ ＭＳで分析した処、全ＨＢＶ陽性試料で増幅産物が検出されたが、ＨＢＶ陰 性試料では検出されなかった。これらの結果は数回の独立した実験で再現された 。 実施例６ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによるリガーゼ連鎖反応産物の分析 材料と方法 オリゴデオキシヌクレオチド ビオチン化したものを除き、他の全オリゴヌクレオチドはβ−シアノエチルホ スホロアミダイト法（Ｓｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．ら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４５３９−４５７７）を使用してＭｉｌｌｉｇｅｎ ７５００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏ ｒｄ，ＭＡ，米国）で０．２μｍｏｌ規模で合成した。オリゴデオキシヌクレオ チドは標準プロトコールに従ってＲＰ−ＨＰＬＣ精製及び脱保護した。ビオチン 化オリゴデオキシヌクレオチドはＢｉｏｍｅｔｒａ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，ドイ ツから購入した（ＨＰＬＣ精製物）。使用したオリゴヌクレオチドの配列と計算 分子量は以下の通りである。 オリゴヌクレオチドＡ及びＤの５−リン酸化 これは公表手順に従ってポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を用いて実施し、５’−リン酸化オリゴヌクレオチ ドを精製せずにＬＣＲに使用した。 リガーゼ連鎖反応 ＬＣＲは、大腸菌ｌａｃＩ遺伝子の野生型と、ｌａｃＩ遺伝子のｂｐ１９１に 単一点突然変異をもつこの遺伝子の突然変異体とを夫々担持した２種の異なるｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＩＩファージミドを含むリガーゼ連鎖反応キット（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）とＰｆｕ ＤＮＡリガー ゼを使用して実施した。 各反応で以下のＬＣＲ条件を使用した。最終容量２０μｌの緩衝液中、鋳型Ｄ ＮＡ１００ｐｇ（０．７４ｆｍｏｌ）、キャ リヤーとして音波処理サケ精子ＤＮＡ５００ｐｇ、各５’−リン酸化オリゴヌク レオチド２５ｎｇ（３．３ｐｍｏｌ）、各非リン酸化オリゴヌクレオチド２０ｎ ｇ（２．５ｐｍｏｌ）、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ４Ｕを使用し、ｓｓ５０量体（ １ｆｍｏｌ）を鋳型として使用し、この場合にはオリゴＣもビオチン化した。全 反応はサーモサイクラー（ＯｍｎｉＧｅｎｅ，ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅ ｒｓｂｅｒｇ，ドイツ）で４分間９２℃、２分間６０℃及び２５サイクル２０秒 間９２℃、４０秒間６０℃のプログラムに従って実施した。ＨＰＬＣ分析以外は 、ビオチン化連結遊離体Ｃを使用した。対照実験では、ビオチン化及び非ビオチ ン化オリゴヌクレオチドは同一のゲル電気泳動結果を示した。反応物を７．５％ ポリアクリルアミドゲルで分析した。連結産物１（オリゴＡ及びＢ）の計算質量 ：１５４５０Ｄａ、連結産物２（オリゴＣ及びＤ）の計算質量：１５３８７Ｄａ 。 ＳＭＡＲＴ−ＨＰＬＣ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｍｏｎｏ Ｑ，ＰＣ １．６／５カラムを使用してＳＭ ＡＲＴシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，ドイツ）でイオン交 換ＨＰＬＣ（ＩＥ ＨＰＬＣ） を実施した。溶離剤は緩衝液Ａ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴ Ａ及び０．３Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）と緩衝液Ｂ（１Ｍ ＮａＣｌとした以 外はＡと同様）を使用した。１００％Ａで５分間流速５０μｌ／ｍｉｎから出発 し、３０分間で０→７０％Ｂの勾配を加えた後、２分間で１００％Ｂまで増加し 、１００％Ｂに５分間維持した。野生型又は突然変異鋳型で実施した２種のＬＣ Ｒプール（４０μｌ）を注入した。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用試料調製 固定化ＤＮＡの調製：各スペクトルを記録するために、（上記のように実施し た）２種のＬＣＲをプールし、２×Ｂ／Ｗ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ，ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ）で１：１に希釈した。試料 にストレプトアビジンＤｙｎａＢｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイ ツ）５μｌを加え、混合物を周囲温度で１５分間静かに震盪しながら結合させた 。Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ，ＭＰＣ（Ｄｙｎ ａｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）を使用して上清を除去し、ビーズを０．７Ｍク エン酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）５０μｌで２回洗浄した（上清は各回毎 にＭＰＣを使用して除去した）。ビーズを超純水 （ＭｉｌｌｉＱ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｂｅｌｏｗ）１μ ｌに再懸濁した。 限外濾過とストレプトアビジンＤｙｎａＢｅａｄｓの併用：スペクトルを記録 するために、（上記のように実施した）２種のＬＣＲをプールし、２×Ｂ／Ｗ緩 衝液で１：１に希釈し、製造業者の指示に従って５０００ＮＭＷＬ Ｕｌｔｒａ ｆｒｅｅ−ＭＣフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ， ドイツ）で濃縮した。濃縮後、試料を１×Ｂ／Ｗ緩衝液３００μｌで洗浄し、ス トレプトアビジンＤｙｎａＢｅａｄｓを加えた。ビーズをＵｌｔｒａｆｒｅｅ− ＭＣ濾過装置で１×Ｂ／Ｗ緩衝液３００μｌで１回洗浄し、上記のように処理し た。ビーズを１×Ｂ／Ｗ緩衝液３０〜５００μｌに再懸濁し、１．５ｍｌエッペ ンドルフチューブに移した。上清を除去し、ビーズを０．７Ｍクエン酸アンモニ ウム（ｐＨ８．０）５０μｌで２回洗浄した。最後に、ビーズをアセトン３０μ ｌで１回洗浄し、超純水１μｌに再懸濁した。ビーズに固定化後の連結混合物を 下記のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に使用した。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ストレプトアビジンをコートした磁性ビーズにＤＮＡを固定 化したものの懸濁液を試料ホルダーにピペットで分注後、すぐにマトリックス溶 液（５０％アセトニトリル中０．７Ｍ ３−ヒドロキシピコリン酸，７０ｍＭク エン酸アンモニウム）０．５μｌと混合した。この混合物を周囲温度で乾燥し、 マススペクトロメーターに導入した。全スペクトルはリフレクトロン（５ｋｅＶ イオン源、２０ｋｅＶ後加速）と窒素レーザー（３３７ｎｍ）を取り付けたＦｉ ｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ Ｖｉｓｉｏｎ ２０００（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ， Ｂｒｅｍｅｎ，ドイツ）を使用して陽イオンモードで測定した。Ｐｆｕ ＤＮＡ リガーゼの分析では、溶液０．５μｌを試料ホルダーでマトリックス溶液１μｌ と混合し、上述のように調製した。未精製ＬＣＲの分析では、ＬＣＲ１μｌをマ トリックス溶液１μｌと混合した。 結果 大腸菌ｌａｃＩ遺伝子を単純なモデルシステムとして使用し、リガーゼ連鎖反 応で生成される産物の検出法としてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの適合性を調べ た。この鋳型システムはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＩＩファージミドに大腸菌 ｌａｃＩ野生型遺伝子を含み、同一ファージミドにｂｐ１９１に単一点突然変異 （Ｃ→Ｔ転位、配列番号１３１）をもつ大腸菌ｌａｃＩ 遺伝子を含む。４種の異なるオリゴヌクレオチドを使用した処、大腸菌ｌａｃＩ 野生型遺伝子が存在する場合しか連結しなかった（図２６）。 Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼを使用し、各陽性反応で少なくとも１ｐｍｏｌの連結 産物が得られるようにＬＣＲ条件を至適化した。連結反応をＳＭＡＲＴシステム でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）とＨＰＬＣにより分析した（図 ２７、２８及び２９）。図２７は野生型鋳型による陽性ＬＣＲ（レーン１）、突 然変異鋳型による陰性ＬＣＲ（１及び２）及び酵素とオリゴヌクレオチドを含み 、鋳型の代わりにサケ精子ＤＮＡを含む陰性対照のＰＡＧＥを示す。ゲル電気泳 動は、野生型鋳型を用いた反応でしか連結産物（５０ｂｐ）が生成されず、点突 然変異をもつ鋳型やサケ精子ＤＮＡによる対照反応では増幅産物が生じないこと を明示している。図２８ではＨＰＬＣを使用して、同一条件下で野生型鋳型を用 いて実施した２種のＬＣＲのプールを分析した。連結産物ははっきりと現れた。 図２９は突然変異鋳型による２種の陰性ＬＣＲプールを分析したＨＰＬＣの結果 を示す。図２７に示すデータと結果をまとめると、このシステムが野生型鋳型を 用いた場合しか有意量の連結産物 を生成しないことは明白であるが、このことはこれらのクロマトグラムからも裏 付けられる。 適当な対照試験を実施し、ＬＣＲ実験で用いる種々の化合物の保持時間を測定 した。試験した化合物は４種のオリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）、（連 結産物と同一配列をもつ）合成ｄｓ５０量体、野生型鋳型ＤＮＡ、音波処理サケ 精子ＤＮＡ及びＰｆｕ ＤＮＡリガーゼである。 どのような精製操作を実施すればＬＣＲ反応をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによ り分析できるかを試験するために、未精製ＬＣＲのアリコート（図３０Ａ）と酵 素ストック溶液のアリコート（図３０Ｂ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析し た。その結果、未精製ＬＣＲの全シグナルはＰｆｕ ＤＮＡリガーゼのＭＡＬＤ Ｉ−ＴＯＦ−ＭＳ分析で得られたシグナルに対応するので、適切な試料調製は絶 対必要であることが判明した。オリゴＡと連結産物の計算質量値は夫々７５２１ Ｄａ及び１５４５０Ｄａである。図３０のデータは、酵素溶液が連結遊離体の予 想シグナルに反する質量シグナルを生じ、従って明確なシグナル帰属が不可能で あることを示す。更に、スペクトルは分析物／マトリックス混合物の結晶化挙動 に悪影響を与える酵素保存用 緩衝液の一部である洗剤Ｔｗｅｅｎ２０のシグナルも示した。 １精製フォーマットではストレプトアビジンをコートした磁性ビーズを使用し た。最近の論文に示したように、ビーズに共有結合した相補的ＤＮＡフラグメン トにワトソン−クリック塩基対合により固定化したＤＮＡの直接脱着は可能であ り、非ビオチン化鎖のみが脱着される（Ｔａｎｇら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３１２６−３１３１）。固定化ｄｓＤＮＡを使用 するこのアプローチは、非ビオチン化鎖のみが脱着されるように確保できる。非 固定化ｄｓＤＮＡを分析すると、両方の鎖が脱着され（Ｔａｎｇら（１９９４） Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．７１８３−１８６）、２ 本の１本鎖の質量鎖に依存して広いシグナルになる。従って、このシステムをＬ ＣＲに使用すると、オリゴＣの５’末端をビオチン化し、ストレプトアビジンを コートしたビーズに固定化するならば、計算質量７５２１Ｄａの非連結オリゴヌ クレオチドＡとオリゴＡ及びオリゴＢからの連結産物（計算質量：１５４５０Ｄ ａ）のみが脱着される。この結果、ＬＣＲ遊離体及び産物を簡単且つ明確に同定 できる。 図３１Ａは（上述のように実施した）ＬＣＲ産物をストレプ トアビジンＤｙｎａＢｅａｄｓで精製し、ビーズから直接脱着した２種のプール から得たＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示し、使用した精製法が（図３０ に比較して）効率が高いことを示す。未連結オリゴＡに相当するシグナルと、連 結産物に対応するシグナルを検出することができた。質量の計算値と実測値の一 致は特筆に値し、連結産物の明確なピーク帰属と正確な検出が可能になる。他方 、突然変異鋳型を用いた２種のＬＣＲプールから得たスペクトルに連結産物は検 出されず、オリゴＡしか検出できなかった（図３１Ｂ）。特定鋳型の不在下で連 結反応を実施すると、ＬＣＲ条件の特異性及び選択性とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ検出 の感度が更に立証される。図３２は陰性対照としてサケ精子ＤＮＡのみを使用し た２種のＬＣＲプールから得たスペクトルを示し、予想通り、オリゴＡしか検出 できなかった。 図３１Ａに示す結果は図２７のゲルのレーン１に相関でき、図３１Ｂに示すス ペクトルは図２７のレーン２と等価であり、図３２のスペクトルも図２７のレー ン３に対応する。これらの結果は図２８及び２９に示すＨＰＬＣ分析に一致する 。ゲル電気泳動（図２７）とＨＰＬＣ（図２８及び２９）は連結産物が 連結遊離体よりも過剰又はほぼ等量であることを示すが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマ ススペクトロメトリーによる分析は連結産物のほうが弱いシグナルを生じる（図 ３１Ａ）。 連結産物シグナルの強度が低いのは、２４量体と５０量体の脱着／イオン化効 率が異なるためであると思われる。５０塩基対のデュプレクスのＴ_m値は２４塩 基対に比較してかなり高いので、２４量体のほうがよく脱着できる。シグナル強 度の低下はオリゴヌクレオチドが長い場合のほうが断片化度が高くなるためであ るとも思われる。 ストレプトアビジンＤｙｎａＢｅａｄｓによる精製に関係なく、図３２は２０ ００Ｄａ付近の領域に微量のＴｗｅｅｎ２０を示す。粘性コンシステンシーをも つ物質は結晶化プロセスに悪影響を与えるので、マススペクトロメトリーに有害 であると思われる。従って、酵素保存用緩衝液の一部であるＴｗｅｅｎ２０とグ リセロールはマススペクトロメーター分析前に完全に除去すべきである。このた め、ＤｙｎａＢｅａｄｓ処理前に付加的限外濾過段階を含む改善精製法を検討し た。この試料精製の結果、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー性能は確 かに著しく改善された。 図３３は夫々陽性（図３３Ａ）及び陰性（図３３Ｂ）の２種のＬＣＲプールか ら得たスペクトルを示す。陽性反応はオリゴＣ及びＤの連結産物に等価の配列を もつ化学的に合成した１本鎖５０量体を鋳型として用いて実施した。オリゴＣは ５’ビオチン化した。従って、鋳型は検出されなかった。予想通り、固定化して 連結したオリゴＣ及びＤからはオリゴＡ及びＢの連結産物（計算質量１５４５０ Ｄａ）しか脱着できなった。この新たに生成されたＤＮＡフラグメントは図３３ Ａに１５４４８Ｄａの質量シグナルにより示される。図３２Ａに比較して、この スペクトルはこの試料調製法が改善された分解能と強度をもつシグナルを生じる ことを明白に示している。 実施例７ プライマーの固相オリゴ塩基伸長による突然変異検出及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマ ススペクトロメトリーによる分析（Ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ Ｂａｓｅ Ｅｘ ｔｅｎｓｉｏｎ＝Ｐｒｏｂｅ） 要約 固相オリゴ塩基伸長法は増幅ＤＮＡで点突然変異と小欠失と小挿入を検出する ものである。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼと３種のｄＮＴＰの混合物と欠損 しているジデオキシヌクレ オチドを使用してアフィニティ捕獲増幅鋳型上の可変ヌクレオチド位置に隣接し てアニールする検出プライマーの伸長に基づく。得られた産物を標識せずにＭＡ ＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより評価及び分解する。以下の実験の 目的は、突然変異及び対立遺伝子を迅速且つ確実に決定することであった。 実験の説明 本方法は単一検出プライマーを使用した後、オリゴヌクレオチド伸長段階を実 施し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより容易に分解可能な長さ で突然変異又は野生型対立遺伝子に特異的な数塩基の長さが異なる産物を得た。 ＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０を例にとってこの方法を説明する。この遺伝子の エキソン１０は、ホモ接合状態で嚢胞性線維症の臨床表現型を誘導する突然変異 （ΔＦ５０８）をもち、これは多数の民族群で最も一般的な突然変異である。 材料と方法 ゲノムＤＮＡ ゲノムＤＮＡは健康個体、ΔＦ５０８突然変異のホモ接合又はヘテロ接合個体 及び１５０６Ｓ突然変異のヘテロ接合個体か ら得た。野生型及び突然変異対立遺伝子は標準Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによ り確認した。 ＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０のＰＣＲ増幅 ＰＣＲ増幅用プライマーはＣＦＥ×１０−Ｆ（イントロン９に位置し、ビオチ ン化した５’−ＧＣＡＡＧＴＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧ−３’（配列番号１ ３））及びＣＦＥ×１０−Ｒ（イントロン１０に位置する５’−ＧＴＧＴＧＡＡ ＧＧＧＣＧＴＧ−３’（配列番号１４））とした。プライマーは８ｐｍｏｌの濃 度で使用した。Ｔａｑ−ポリメラーゼと１０×緩衝液はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ− Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入し、ｄＴＮＰはＰｈａｒｍａｃｉａから購入した。総 反応容量は５０μｌとした。ＰＣＲのサイクリング条件は５分間９５℃から開始 後、１分間９４℃、４５秒間５３℃及び３０秒間７２℃を４０サイクル繰り返し 、５分間７２℃の最終伸長時間とした。 増幅産物の精製 増幅産物はＱｉａｇｅｎのＰＣＲ精製キット（Ｎｏ．２８１０６）を製造業者 の指示に従って使用することにより精製した。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）５０μｌで精製物をカラムから溶離した。 ２本鎖ＤＮＡのアフィニティ捕獲及び変性 ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（Ｎｏ.１６４５ ６８４ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ又はＮｏ.９５０２９２６２ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）の１個のウェルに精製増幅産物の１０μＬアリコート を移した。次いでインキュベーション用緩衝液(８０ｍＭリン酸ナトリウム，４ ００ｍＭ ＮａＣｌ，０．４％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．５)１０μｌと水３０ μｌを加えた。室温で１時間インキュベーション後、ウェルを洗浄用緩衝液（４ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅ ｎ２０，ｐＨ８．８）２００μｌで３回洗浄した。２本鎖ＤＮＡを変性するため に、ウェルを５０ｍＭ ＮａＯＨ溶液１００μｌで３分間処理し、ウェルを洗浄 用緩衝液２００μｌで３回洗浄した。 オリゴ塩基伸長反応 アニーリング用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ（ ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，２ｍＭ ＭｇＳＯ₂，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，ｐＨ８） ５０μｌで５０℃で１０分間２５ｐｍｏｌ検出プライマー（ＣＦ５０８：５’− ＣＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡ−３’（配列番 号１５））のアニーリングを実施した。ウェルを洗浄用緩衝液２００μｌで３回 、ＴＥ緩衝液２００μｌで１回洗浄した。伸長反応はＵＳＢ製品ＤＮＡシーケン シングキット（Ｎｏ．７０７７０）の一部のコンポーネントとＰｈａｒｍａｃｉ ａ製品ｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰを使用して実施した。総反応容量は４５μｌとし 、水２１μｌ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝液６μｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ溶液３μｌ 、０．５ｍＭの３種のｄＮＴＰ ４．５μｌ、２ｍＭ欠損ｄｄＮＴＰ ４．５μ ｌ、ダリセロール酵素希釈用緩衝液５．５μｌ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２．００． ２５μｌ及びピロホスファターゼ０．２５とした。反応溶液を氷上にピペットで とった後、１５分間室温及び５分間３７℃でインキュベートした。その後、ウェ ルを洗浄用緩衝液２００μｌで３回、７０ｍＭ クエン酸ＮＨ₄溶液６０μｌで １回洗浄した。 伸長プライマーの変性及び沈殿 伸長したプライマーを１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）水溶液５０μ ｌで８０℃で１０分間変性させた。沈殿のために、酢酸ＮＨ₄（ｐＨ６．５）１ ０μｌ、グリコーゲン（１０ｍｇ／ｍｌ水，Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｇ１７６５）０ ．５μｌ及 び無水エタノール１００μｌを上清に加え、１時間室温でインキュベートした。 １３，０００ｇで１０分間遠心分離後、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、 １８Ｍｏｈｍ／ｃｍＨ₂Ｏ水１μｌに再懸濁した。 試料調製及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによる分析 試料調製はマトリックス溶液（１：１Ｈ₂Ｏ：ＣＨ₃ＣＮ中０．７Ｍ ３−ヒド ロキシピコリン酸、０．０７Ｍ二塩基性クエン酸アンモニウム）と再懸濁ＤＮＡ ／グリコーゲンペレット各０．３μｌを試料ターゲット上で混合し、風乾するこ とにより実施した。２０個までの試料をプローブターゲットディスクにスポット して未改造Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ（旧Ｆｉｎｎｉｇａｎ）Ｖｉ ｓｉｏｎｓ ２０００ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのソース領域に導入し、夫々ターゲ ット及び変換ダイノードで５及び２０ｋＶのリフレクトロンモードで運転した。 理論平均分子量（Ｍ_r（ｃａｌｃ））は原子組成から計算し、報告実測Ｍｒ（Ｍ_r （ｅｘｐ））値は外部較正を使用して決定した１プロトン化形態の値である。 結果 本実験の目的は、厳密なストリンジェンシーから独立した迅速で確実な突然変 異検出方法を開発し、遺伝病の診断で高品質と高スループットを実現することで あった。そこで、特殊なＤＮＡシーケンシング（１個の突然変異検出プライマー のオリゴ塩基伸長）をマトリックス介助レーザーデソープションイオン化（ＭＡ ＬＤＩ）マススペクトロメトリー（ＭＳ）によるミニシーケンシング産物の評価 と併用した。可能な質量測定システムとして飛行時間（ＴＯＦ）リフレクトロン 構成を選択した。ＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０の突然変異はコーカソイド集団 で最も一般的な単一遺伝子疾患である嚢胞性線維症の臨床表現型を誘導すること があるので、この仮説を証明するために、ＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０で試験 を実施した。 図３４に示す図は、ＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０（配列番号１３２）の野生 型及び種々の突然変異の理論計算分子量をもつ短い予想シーケンシング産物を示 す。短いシーケンシング産物はｄｄＴＴＰ（図３４Ａ、配列番号１３３〜１３５ ）又はｄｄＣＴＰ（図３４Ｂ、配列番号１３６〜１３９）を用いて初期ＤＮＡ鎖 に最終的配列関連停止配列を導入することにより生成 した。健康、突然変異ヘテロ接合及び突然変異ホモ接合個体のＭＡＬＤＩ−ＴＯ Ｆ−ＭＳスペクトルを図３５に示す。全試料はマススペクトロメトリー分析との 間に不一致を示さないことが標準Ｓａｎｇｅｒシーケンシングにより確認された 。種々の分子量の実測精度は予想範囲−２１．８及び＋８７．１ダルトン（Ｄａ ）の範囲内であった。従って、各場合に結果を確実に解読することができる。こ の方法はΔ１５０７突然変異を明確に検出できるという利点もある。ｄｄＴＴＰ 反応では野生型対立遺伝子が検出され、ｄｄＣＴＰ反応では３塩基対欠失が検出 される。 本方法はＤＮＡの単一点突然変異又は微小損傷の検出に非常に適している。突 然変異検出プライマーを慎重に選択すると、多重化が可能になり、同等の対立遺 伝子特異的手順で必要な厳密なストリンジェンシーを必要とすることなく遺伝診 断で高スループットと高品質が得られる。遺伝情報の固有性により、突然変異検 出プライマーのオリゴ塩基伸長は本明細書にも記載するように、可変数タンデム リピート（ＶＮＴＲ）又は他の単一ヌクレオチド多型性（例えばアポリポタンパ ク質Ｅ遺伝子）等のゲノムで各疾患遺伝子又は多型性領域で適用可能である。 実施例８ マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−Ｔ ＯＦ）マススペクトロメトリーによる７−デアザプリン部分を含むポリメラーゼ 連鎖反応産物の検出 材料と方法 核酸増幅 以下のオリゴヌクレオチドプライマーは、標準ホスホロアミダイト化学（Ｓｉ ｎｈａ，Ｎ．Ｄ．ら（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ．Ｖｏｌ．２ ４，Ｐｐ．５８４３−５８４６；Ｓｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．ら（１９８４）Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１２，Ｐｐ．４５３９−４５５７）に従 い、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ７５００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｍｉｌｌ ｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，米国）で２００ｎｍｏｌ規模で合成するか 、又はＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，ドイツ、プライマー３） 及びＢｉｏｍｅｔｒａ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，ドイツ、プライマー６〜７）か ら購入した。 ９９量体（配列番号１４１）及び２００量体ＤＮＡ鎖（配列番号１４０、修飾 及び未修飾）とリボ及び７−デアザ修飾１００量体は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣ ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ （ｐＨ８．８）、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ₄、（ｅｘｏ（−）Ｐｓｅｕｄｏｃ ｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）−緩衝液）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆ ｒｅｉｂｕｒｇ，ドイツ）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ各ＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，ドイツ）、１μｍｏｌ／Ｌ各プライマー及びｅｘｏ（−） Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， ドイツ）１単位を含む１００μＬの反応容量中でｐＲＦｃｌ ＤＮＡ（１０ｎｇ 、ハンブルグ大学Ｓ．Ｆｅｙｅｒａｂｅｎｄ氏から寄贈）から増幅した。９９量 体にはプライマー１及び２、２００量体にはプライマー１及び３、１００量 体にはプライマー６及び７を使用した。７−デアザプリン修飾核酸を得るために は、ＰＣＲ増幅中にｄＡＴＰとｄＧＴＰを７−デアザ−ｄＡＴＰと７−デアザ− ｄＧＴＰで置換した。反応は、サーマルサイクラー（ＯｍｎｉＧｅｎｅ，ＭＷＧ −Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，ドイツ）で９５℃で１分間変性、５１ ℃で１分間アニーリング及び７２℃で１分間伸長からなるサイクルを使用して実 施した。全ＰＣＲで反応サイクル数は３０とした。最終サイクル後に更に１０分 間７２℃で反応物を伸長させた。 １０３量体ＤＮＡ鎖（修飾及び未修飾、配列番号２４５）は、プライマー４及 び５を使用して１００μＬ反応容量中で他の濃度は変えずにＭ１３ｍｐ１８ＲＦ Ｉ ＤＮＡ（１００ｎｇ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，ドイツ）か ら増幅した。反応は９５℃で１分間変性、４０℃で１分間アニーリング及び７２ ℃で１分間伸長からなるサイクルを使用して実施した。夫々未修飾１０３量体で は３０サイクル、修飾１０３量体では４０サイクル後に試料を更に１０分間７２ ℃でインキュベートした。 ５’−［³²−Ｐ］標識ＰＣＲプライマーの合成 プライマー１及び４はＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と（γ−³²Ｐ）−ＡＴＰ（ＢＬＵ／ＮＧＧ／５０ ２Ａ，Ｄｕｐｏｎｔ，ドイツ）を製造業者のプロトコールに従って使用して５’ −［³²−Ｐ］標識した。反応はＰＣＲのプライマー１及び４の１０％を標識プラ イマーに置換し、他の反応条件は変えずに実施した。増幅したＤＮＡを１０％ポ リアクリルアミドゲルでゲル電気泳動により分雛した。適当なバンドを切り出し 、Ｐａｃｋａｒｄ ＴＲＩ−ＣＡＲＢ ４６０Ｃ液体シンチレーションシステム （Ｐａｃｋａｒｄ，ＣＴ，米国）で計数した。 リボ修飾ＰＣＲ産物からのプライマー分離 Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルターユニット（３０，０００ＮＭＷＬ）を使 用して増幅ＤＮＡを精製した後、０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ １００μｌに再 溶解し、９５℃に２５分間加熱した。次に溶液をＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）で酸性 化し、下記に記載するようにＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルターユニット（１ ０，０００ＮＭＷＬ）を使用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析のために更に精製した 。 増幅産物の精製 全試料はＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルターユニット３００００ＮＭＷＬ（ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，ドイツ）を製造業者の指示に従って使 用して精製及び濃縮した。凍結乾燥後、増幅産物を超純水５μＬ（２００量体は ３μＬ）に再溶解した。この分析物溶液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定に直接使用し た。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 分析物溶液０．５μＬとマトリックス溶液（アセトニトリル／水（１：１，ｖ ／ｖ）中０．７ｍｏｌ／Ｌ ３−ＨＰＡと０．０７ｍｏｌ／Ｌクエン酸アンモニ ウム）０．５μＬのアリコートを平坦な金属試料支持体上で混合した。周囲温度 で乾燥後、試料をマススペクトロメーターに導入して分析した。使用したＭＡＬ ＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメーターはＦｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ Ｖｉｓｉｏ ｎ ２０００（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ，Ｂｒｅｍｅｎ，ドイツ）とした。ス ペクトルは５ｋｅＶイオン源及び２０ｋｅＶ後加速で陽イオンリフレクターモー ドで記録した。装置は窒素レーザー（３３７ｎｍ波長）を取り付けた。システム の真空度はアナライザー領域で３〜４・１０^-8 ｈＰａとし、ソース領域で１〜４・１０^-7ｈＰａとした。修飾及び未修飾ＤＮＡ 試料のスペクトルは同一相対レーザー出力で得、合成オリゴデオキシヌクレオチ ド（７〜５０量体）の混合物で外部較正を行った。 結果と考察 ７−デアザプリンヌクレオチドを含む核酸のＰＣＲによる酵素合成 短い増幅産物の迅速な無ゲル分析にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを利用できるこ とを立証すると共に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ条件下における核酸の７−デアザプリ ン修飾の効果を検討するために、２種の異なるプライマー−鋳型系を使用してＤ ＮＡフラグメントを合成した。図３６及び３７に配列を示す。１０３量体増幅産 物の２本の１本鎖はほぼ等しい質量であったが（Δｍ＝８ｕ）、９９量体の２本 の１本鎖は５２６ｕの差があった。化学ＤＮＡ合成の７−デアサプリンヌクレオ チド構成ブロックが通常のものよりも約１６０倍も高価であることと（Ｐｒｏｄ ｕｃｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒ ａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）、標準β−シアノホスホロアミダイト化 学におけるその利用は自明 ではない（Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ら（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：１５７０）ことを考慮す ると、７−デアザプリンで修飾したプライマーのコストは非常に高いと思われる 。従って、本方法の適用性と範囲を拡大するために、通常入手可能な未修飾オリ ゴヌクレオチドプライマーを使用して全ＰＣＲを実施した。ポリメラーゼ連鎖反 応でｄＡＴＰ及びｄＧＴＰをｃ⁷−ｄＡＴＰ及びｃ⁷−ｄＧＴＰに置き換えると、 ９９量体及び１０３量体では約８０％、２００量体では約９０％の７−デアザプ リン修飾ヌクレオチドを含む産物が得られた。表ＩＩは全ＰＣＲ産物の塩基組成 を示す。 ¹「ｓ」及び「ａ」は２本鎖増幅産物の「センス」及び「アンチセンス」鎖を表 す。² プリンヌクレオチドの合計量に対する７−デアザプリン修飾ヌクレオチドの百 分率として相対修飾率を示す。 ８０〜９０％の７−デアザプリン修飾率が正確なマススペクトロメトリー検出 に十分であるか否かは判断できなかった。そこで、酵素増幅段階中に全プリンヌ クレオチドを置換できるか否かを判断することが重要であった。Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼを使用する場合にＰＣＲでｄＡＴＰをｃ⁷−ｄＡＴＰに完全に置き 換えられないことは報告されていた（Ｓｅｅｌａ，Ｆ．とＡ．Ｒｏｅｌｌｉｎｇ （１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，５５−６１）ので 、これは自明ではなかった。幸運なことに、ｅｘｏ（−）Ｐｆｕ ＤＮＡポリメ ラーゼは未修飾プリンヌクレオシド三リン酸の不在下で実際にｃ⁷−ｄＡＴＰ及 びｃ⁷−ｄＧＴＰを受容できることが判明した。取り込みは低率であったので、 増幅産物の収率は低かった（図３８）。 これらの結果を確認するために、［³²Ｐ］標識プライマーによる増幅を繰り返 した。オートラジオグラム（図３９）は修飾ＰＣＲ産物のほうが収率が低いこと を明示している。ゲルからバンドを切り出し、計数した。全増幅産物で修飾核酸 の収率は対応する未修飾増幅産物に対して約５０％であった。更に実験を続けた 結果、ｅｘｏ（−）Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ及びＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーセもＰＣＲ中にｃ⁷−ｄＡＴＰとｃ⁷−ｄＧＴＰを取り込めるこ とが判明した。しかし、総性能は、増幅中の副生物が最も少なかったｅｘｏ（− ）Ｐｆｕ ＤＮＡが最良であることが判明した。全３種のポリメラーゼを使用し た処、等電子体でなくｃ⁷−ｄＡＴＰとｃ⁷−ｄＧＴＰを使用したこれらのＰＣＲ は副反応が少なく、よりクリーンなＰＣＲ産物を生じることが判明した。増幅副 生物が生じにくいことは、ＰＣＲ中に合成される長い鋳型によるプライマーミス マッチの低下により説明できる。７−デアザプリンを含むＤＮＡデュプレクスの 融点が低いことは既に記載されている（Ｍｉｚｕｓａｗａ，Ｗ．ら，（１９８６ ）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４，１３１９−１３２４）。上記 ３種のポリメラーゼ（ｅｘｏ（−）Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、 ５Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ及びｅｘｏ（−）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラー ゼ）以外に、大胞菌ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ及びＵ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの大きいＫｌｅｎ ｏｗフラグメント等の他のポリメラーゼも利用できると予想される。更に、ＲＮ Ａが鋳型である場合には、ＳＰ６又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリ メラーゼを使用しなければならない。 修飾及び未修飾増幅産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー ９９量体、１０３量体及び２００量体増幅産物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳに より分析した。過去の実験によると、脱プリン度は分析物の脱着及びイオン化に 使用するレーザーエネルギーに依存することが知られていた。脱プリンによる断 片化に及ぼす７−デアザプリン修飾の影響は検討されていないので、全スペクト ルを同一相対レーザーエネルギーで測定した。 図４０ａ及び４０ｂは修飾及び未修飾１０３量体核酸の質量スペクトルを示す 。修飾１０３量体の場合には断片化が広い（Ｍ＋Ｈ）⁺シグナルを生じている。 ピークの最大値は低質量にシフトしており、帰属質量は（Ｍ＋Ｈ）⁺シグナル自 体でなく（Ｍ＋Ｈ）⁺シグナルと断片化イオンのシグナルの平均値に相当する。 修飾１０３量体はオリゴヌクレオシドプライマーからのＡ及びＧをまだ約２０％ 含んでいるが、シグナルが著しく狭く対称になっていることから断片化が少ない ことを示している。特に脱プリンによる低質量側にテールをもつピークは実質的 に減っている。従って、予想質量よりはまだ低いものの、測定質量と計算質量の 差は非常に小さくなっている。未修飾試料では、 計算質量との差が９７ｕ又は０．３％で３１６７０に（Ｍ＋Ｈ）⁺シグナルが観 察された。他方、修飾試料の場合にはこの質量差は１０ｕ又は０．０３％に減っ た（実測値３１７１３ｕ、計算値３１７２３ｕ）。これらの観測は２本の１本鎖 の（Ｍ＋Ｈ）⁺シグナルの質量分解能の著しい増加により裏付けられる（Δｍ＝ 半最大値の全幅ｆｗｈｍとしたときにｎ／Δｍ＝６７、未修飾試料では１８）。 ２本の１本鎖の質量差が小さい（８ｕ）ため、各シグナルは分解しなかった。 ９９塩基対ＤＮＡフラグメントの結果によると、７−デアザプリンを含むＤＮ Ａの質量分解能増加の効果は一層明白になる。プリンとピリミジンの分布が不均 一であるために増幅産物の２本の鎖の質量差が５２６ｕと非常に大きいにも拘わ らず、未修飾試料の２本の１本鎖は分解しなかった（図４１ａ）。これに対して 、修飾ＤＮＡは２本の１本鎖に異なるピークを示し（図４１ｂ）、分子量を測定 するためにこのアプローチがゲル電気泳動法よりも著しく優れていることを立証 している。基線分解は得られなかったが、各質量を０．１％の精度即ちＬ鎖では Δｍ＝２７ｕ（計算質量＝３０２２４ｕ）、Ｈ鎖ではΔｍ＝１４ｕ（計算質量＝ ３０７５０ｕ）で帰属させることができた。ま た、７−デアザプリンを含む試料では半最大値の全幅が実質的に減少することが 判明した。 ９９量体と１０３量体の場合には、７−デアザプリンを含む核酸はまだ約２０ ％の未修飾プリンヌクレオチドを含んでいるという事実にも拘わらず、高い感度 を与えると思われる。同等の（Ｍ＋Ｈ）⁺シグナルの強度で同等のシグナル対ノ イズ比を得るためには、未修飾９９量体は２０回のレーザー照射が必要であるが 、修飾９９量体では１２回であり、未修飾試料の１０３量体は１２回必要である が、７−デアザプリンヌクレオシドを含む増幅産物の１０３の量体では３回であ る。 修飾及び未修飾２００量体アンプリコンのスペクトルを比較すると、この場合 も７−デアザプリンを含む試料では質量分解能の改善とシグナル強度の強化が判 明した（図４２Ａ及び４２Ｂ）。修飾試料のスペクトルには１本鎖のシグナルが 優勢であるが、未修飾試料では１本鎖のＤＮＡデュプレクスと２量体が最強のシ グナルを与えた。 ＰＣＲで修飾プライマーを使用するか又は部分的に修飾した増幅産物から未修 飾プライマーを分離することにより核酸の完全な７−デアザプリン修飾を実施す ることができる。上述のよ うに修飾プライマーは不都合を伴うので、リボ修飾をもつプライマーを使用して １００量体を合成した。本発明者らの研究所で先に開発した方法に従ってプライ マーをＮａＯＨで加水分解した（Ｋｏｅｓｔｅｒ，Ｈ．ら，Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．，３５９，１５７０−１５８９）。図４３Ａ及び４３Ｂはプライマ ー開裂前後の増幅産物のスペクトルを示す。図４３ｂは加水分解に成功したこと を示す。加水分解増幅産物と２種の遊離プライマーを残留未開裂１００量体から の小さいシグナルと共に検出することができた。プライマーに由来する未修飾プ リンの割合は増幅配列の長さが短くなるにつれて増加するので、この方法は非常 に短いＰＣＲ産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に特に有用である。 ７−デアザプリンで修飾した核酸の優れた性質は、より効果的な脱着及び／又 はイオン化、イオン安定性の増加及び／又は２本鎖プリン修飾核酸の変性エネル ギーの低下により説明することができる。メチル基のＮ−７を交換する結果、水 素結合の受容体が１個減り、核酸が非ワトソン−クリック塩基対合による二次構 造を形成する能力が変化する（Ｓｅｅｌａ，Ｆ．とＡ．Ｋｅｈｎｅ（１９８７） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６， ２２３２−２２３８）。これに加え、７−デアザプリンの芳香族系は電子密度が 低く、ワトソン−クリック対合を弱めるので、２本鎖の融点が低下する（Ｍｉｚ ｕｓａｗａ，Ｓ．ら，（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１ ４，１３１９−１３２４）。この効果により、ＭＡＬＤＩプロセスでデュプレク スの変性に必要なエネルギーが低減すると思われる。これらの側面と、Ｎ−７窒 素上に正電荷をもつと予想される部位の損失により、７−デアザプリン修飾核酸 は低極性になり、脱着効果が増すと思われる。 プロトン受容体としてのＮ−７の不在と７−デアザプリンヌクレオシドにおけ るＣ−Ｎ結合の分極の低下により、溶液中の加水分解に認められているメカニズ ムによる脱プリンが避けられる。溶液及び気相中の反応の直接相関は問題がある が、ＭＡＬＤＩプロセスでは修飾核酸の脱プリンによる断片化が少ないと予想す ることができる。脱プリンは電荷の損失により電荷種の総効率を低下させたり、 あるいは電荷をもつ断片化産物を生じ、非断片化分子イオンシグナルの強度を低 下させると考えられる。 ７−デアザプリンを含む試料の断片化の低下による感度の増 加と低質量側の（Ｍ＋Ｈ）⁺シグナルのピークテーリングの低下は、ＭＡＬＤＩ −ＴＯＦプロセスにおける脱プロセスのメカニズムに実際にＮ−７原子が不可欠 であることを示している。結論として、７−デアザプリンを含む核酸はＭＡＬＤ Ｉ−ＴＯＦ条件下で顕著なイオン安定性と感度の増加を示し、従って、高い質量 精度と質量分解能を提供する。 実施例９ 固相シーケンシング及びマススペクトロメーター検出 材料と方法 オリゴヌクレオチドはＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｌａｍｅ ｄａ，ＣＡ）から未精製形態で購入した。シーケンシング反応はＳｅｑｕｅｎａ ｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｏｎ Ｈｅｉ ｇｈｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）用シーケンシングキットからの試薬を使用して固 相で実施した。 ３９量体ターゲットのシーケンシング シーケンシング複合体： 固相Ｄシーケンシングを実施するために、鋳型鎖ＤＮＡ１１６８３を末端デオ キシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより３’−ビオチン化した。ＤＮＡ１ １６８３ ６０ｐｍｏｌ、ビオチン１４−ｄＡＴＰ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒ ａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）１．３ｎｍｏｌ、末端トランスフェラーゼ（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）３０ 単位及び１×反応緩衝液（酵素を含む）を含む反応混合物３０μｌを３７℃で１ 時間インキュベートした。末端トランスフェラーゼを７０℃で１０分間熱不活化 して反応を停止した。得られた生成物をＴＥ−１０スピンカラム（Ｃｌｏｎｔｅ ｃｈ）に通して脱塩した。ＤＮＡ１１６８３の３’末端にビオチン１４−ｄＡＴ Ｐ２分子以上を加えることができた。ビオチン化ＤＮＡ１１６８３を１×結合及 び洗浄用緩衝液３０μｌ中でＤｙｎａｌストレプトアビジンビーズ０．３ｍｇと 共に周囲温度で３０分間インキュベートした。ビーズをＴＥで２回洗浄し、ＴＥ ３０μｌに再溶解し、（ビーズ０．１ｍｇを含む）１０μｌアリコートをシーケ ンシング反応に使用した。 Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキットからの５×Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝液(２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び２５０ｍＭ Ｎ ａＣｌ)２μｌと対応するプライマーＰＮＡ１６／ＤＮＡ ５ｐｍｏｌを含む１ ０μｌ容量に前段階からのビーズ０．１ｍｇを再懸濁した。アニーリング混合物 を７０℃まで加熱し、２０〜３０分間かけて室温までゆっくり放冷させた。次に 、０．１Ｍジチオトレイトール溶液１μｌ、Ｍｎ緩衝液（０．１５Ｍイソクエン 酸ナトリウムと０．１Ｍ ＭｇＣｌ₂）１μｌ及び希釈Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２μ ｌ（３．２５単位）を加えた。反応混合物を各３μｌの４個のアリコートに分け 、（５０ｍＭ ＮａＣｌ中３２μＭ ｃ７ｄＡＴＰ、３２μＭ ｄＣＴＰ、３２ μＭ ｃ７ｄＧＴＰ、３２μＭ ｄＴＴＰ及び４種のｄｄＴＮＰのうちの１種３ ．２μＭからなる適当なターミネーション混合物各３μｌを含む）ターミネーシ ョン混合物と混合した。反応混合物を３７℃で２分間インキュベートした。伸長 の完了後、ビーズを沈殿させ、上清を除去した。ビーズを２回洗浄し、ＴＥに再 懸濁し、４℃に維持した。 ７８量体ターゲットのシーケンシング シーケンシング複合体： ターゲットＴＮＲ．ＰＬＡＳＭ２をビオチン化し、前項（３９量体ターゲット のシーケンシング）に記載したと同様の手順を使用してシーケンシングした。 部分的デュプレクスプローブによる１５量体ターゲットのシーケンシング シーケンシング複合体： １Ｍ ＮａＣｌ ３０μｌとＴＥ（１×結合及び洗浄用緩衝液）中で６０ｐｍ ｏｌのＣＭ１Ｂ３Ｂを０．３磁性ビーズと共に室温で３０分間インキュベートす ることにより、ストレプトアビジンをコートしたＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２８０ （Ｄｙｎａｌ，ノルウェー）にＣＭ１Ｂ３Ｂを固定化した。ビーズをＴＥで２回 洗浄し、ＴＥ３０μｌに再溶解し、（夫々ビーズ０．１ 又は０．２ｍｇを含む）１０又は２０μｌアリコートをシーケンシング反応に使 用した。 デュプレクスは、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキットからの５×Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ緩 衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂及 び２５０ｍＭ ＮａＣｌ）２μｌを含む９μｌ容量中で前段階からのビーズの対 応するアリコートを１０ｐｍｏｌのＤＦ１１ａ５Ｆ（又はビーズ０．２ｍｇを２ ０ｐｍｏｌのＤＦ１１ａ５Ｆ）とアニールすることにより形成した。アニーリン グ混合物を６５℃まで加熱し、２０〜３０分間かけて３７℃までゆっくり放冷さ せた。次に、デュプレクスプライマーを１μｌ容量中１０ｐｍｏｌのＴＳ１０（ ビーズ０．２ｍｇには２０ｐｍｏｌのＴＳ１０）と混合し、得られた混合物を３ ７℃で５分間、室温で５〜１０分間更にインキュベートした。次に、０．１Ｍジ チオトレイトール溶液１μｌ、Ｍｎ緩衝液（０．１５Ｍイソクエン酸ナトリウム と０．１Ｍ ＭｇＣｌ₂）１μｌ及び希釈Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２μｌ（３．２５ 単位）を加えた。反応混合物を各３μｌの４個のアリコートに分け、（５０ｍＭ ＮａＣｌ中１６μＭ ｄＡＴＰ、１６μＭ ｄＣＴＰ、１６μＭ ｄＧＴＰ、 １６μＭ ｄＴＴＰ及び４種 のｄｄＮＴＰのうちの１種１．６μＭからなる適当なターミネーション混合物各 ４μｌを含む）ターミネーション混合物と混合した。反応混合物を室温で５分間 と、３７℃で５分間インキュベートした。伸長の完了後、ビーズを沈殿させ、上 清を除去した。ビーズをＴＥ２０μｌに再懸濁し、４℃に維持した。各チューブ からの（２０μｌのうちの）２μｌのアリコートを分取し、ホルムアミド８μｌ と混合し、得られた試料を９０〜９５℃で５分間変性させ、７Ｍ尿素と０．６× ＴＢＥを含む１０％ポリアクリルアミドゲルを使用して（合計１０μｌのうちの ）２μｌをＡＬＦ ＤＮＡシーケンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａ ｗａｙ，ＮＪ）に加えた。残りのアリコートはＭＡＬＤＴ−ＴＯＦ ＭＳ分析に 使用した。 ＭＡＬＤＩ試料調製及び装置 ＭＡＬＤＩ分析に先立ち、シーケンシングラダーを加えた磁性ビーズを５０ｍ Ｍクエン酸アンモニウムで２回洗浄し、純水０．５μｌに再懸濁した。次に、懸 濁液をマススペクトロメーターの試料ターゲットに加え、飽和マトリックス溶液 （５０％アセトニトリル中３−ヒドロキシピコリン酸（ＨＰＡ）：クエン酸アン モニウム＝１０：１モル比）０．５μｌを加えた。マ ススペクトロメーター分析前に混合物を乾燥させた。 リフレクトロンＴＯＦＭＳマススペクトロメーター（Ｖｉｓｉｏｎ ２０００ ，Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ，Ｂｒｅｍｅｎ，ドイツ）を分析に使用した。イオ ン源に５ｋＶし、後加速に２０ｋＶを使用した。全スペクトルは陽イオンモード で測定し、窒素レーザーを使用した。一般に、各スペクトルは１００回以上の照 射を平均し、標準２５点平滑化を適用した。 結果と考察 慣用固相シーケンシング 慣用シーケンシング法では、プライマーを鋳型に直接アニールした後、Ｓａｎ ｇｅｒジデオキシシーケンシングで伸長及び停止する。通常はビオチン化プライ マーを使用し、ストレプトアビジンをコートした磁性ビーズによりシーケンシン グラダーを捕獲する。洗浄後、ＥＤＴＡとホルムアミドを使用して産物をビーズ から溶離する。従来の知見によると、デュプレクスのアニール鎖しか脱着されず 、固定化鎖はビーズに結合したままである。従って、鋳型を固定化し、プライマ ーをアニールすると有利である。シーケンシング反応及び洗浄後、鋳型を固定化 し、シーケンシングラダーをアニールしたビーズをマススペク トロメーターターゲットに直接加え、マトリックスと混合することができる。Ｍ ＡＬＤＩでは、アニールしたシーケンシングラダーしか脱着及びイオン化されず 、固定化した鋳型はターゲットに止まる。 まず、末端トランスフェラーゼによりビオチン−１４−ｄＡＴＰを加えること により３９量体鋳型（配列番号２３）の３’末端をビオチン化した。この酵素に よりビオチン−１４−ｄＡＴＰ２分子以上を加えることができた。鋳型はＭＡＬ ＤＩ中にビーズに固定化したままであるので、ビオチン−１４−ｄＡＴＰの数は 質量スペクトルにしないと思われる。１４量体（配列番号２４）を固相シーケン シングに使用し、下記ＤＮＡフラグメント３〜２７（配列番号１４２〜１６６） を生成した。４種のシーケンシングラダーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル を図４４に示し、予想理論値を表ＩＩＩに示す。 シーケンシング反応は比較的均一なラダーを生じ、全長配列は容易に決定され た。全反応に現れる５１５０付近の１個のピークは同定されない。これは、鋳型 の小部分がループ等のある種の二次構造を形成し、シーケナーゼ伸長を妨げたと 考えることもできる。これらのピークの強度はシーケンシングラダーよりも著し く低かったので、誤った取り込みはさほど問題にならない。シーケンシング反応 ではＮ−グリコシド結合を安定化して脱プリンを阻止することが可能な７−デア ザプリンを使用したが、プライマーは７−デアザプリンで置換されなかったので まだ僅かな塩基損失が観察された。３’末端にｄｄＡをもつ完全長ラダーは１１ ８９９．８の見かけの質量でＡ反応に現れた。より強度な１２３３３のピークが 全４種の反応で現れ、これはＳｅｑｕｅｎａｓｅ酵素によるヌクレオチド付加に 起因すると思われる。 同一方法を使用してもっと長いＤＮＡフラグメントを配列決定することができ た。末端トランスフェラーゼを介してビオチン−１４−ｄＡＴＰを加えることに より、ＣＴＧ反復を含む７８量体鋳型（配列番号２５）を３’ビオチン化した。 ＣＴＧ反復のすぐ外側に１８量体プライマー（配列番号２６）をアニー ルすると、反復をプライマー伸長直後に配列決定することができた。４種の反応 産物を洗浄し、通常通りＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。Ｇ反応の１ 例を図４５（配列番号１６７〜２２０）に示し、予想シーケンシングラダーを各 ラダー成分の理論質量値と共に表ＩＶに示す。最後の成分（理論値２０５７７． ４）がバックグラウンドから区別できなかった以外は、全シーケンシングピーク は良好に分解した。２つの隣り合うシーケンシングピーク（６２量体と６３量体 ）も分離し、このシーケンシング分析をもっと長い鋳型に適用できると思われた 。更に、このスペクトルには、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ酵素によるヌクレオチドの付 加が観察された。この付加は鋳型特異的ではなく、全４種の反応で現れたので、 同定し易い。プライマーピークに比較して、シーケンシングピークは長い鋳型の 場合のほうが著しく強度が低かった。 捕獲及びプライミング用デュプレクスＤＮＡプローブを使用するシーケンシング １本鎖オーバーハングをもつデュプレクスＤＮＡプローブは特定ＤＮＡ鋳型を 捕獲することができ、固相シーケンシング用プライマーとして利用できることが 立証されている。スキームを図４６に示す。デュプレクスプライマーと１本鎖鋳 型のスタッキング相互作用により、５塩基のオーバーハングだけで捕獲に十分で ある。このフォーマットに基づき、５塩基オーバーハングを残して５’蛍光標識 ２３量体（５’−ＧＡＴ ＧＡＴ ＣＣＧ ＡＣＧ ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＧＣ ＴＣ−３’）(配列番号２９)を３’ビオチン化１８量体(５’−ＧＴＧ ＡＴＧ ＣＧＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＡＴＣ−３’)（配列番号３０）にアニールした。 １５量体鋳型（５’−ＴＣＧ ＧＴＴ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＣＴ−３’）（配列 番号３１）をデュプレクスにより 捕獲し、５塩基オーバーハングの伸長によりシーケンシング反応を実施した。反 応産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを図４７Ａ〜Ｄに示す。全シーケン シングピークは比較的低強度ではあったが分解した。各反応の最後のピークは、 Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ酵素により全長伸長産物に１個のヌクレオチドが非特異的に 付加されたためである。比較のために、同一産物を慣用ＤＮＡシーケンサーで試 験し、結果のスタッキングフルオログラムを図４８に示す。同図から明らかなよ うに、質量スペクトルは２３量体プライマーよりも著しく低強度のシーケンシン グピークをもつフルオログラムと同一パターンであった。 実施例１０ サーモシーケナーゼサイクルシーケンシング 材料と方法 ＰＣＲ増幅。ヒト白血球ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅に使用した。β−グロビン 遺伝子の２０９ｂｐフラグメントを増幅するためのＰＣＲプライマーとしては、 β２順プライマー（５’−ＣＡＴ ＴＴＧ ＣＴＴ ＣＴＧ ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＴＧ−３’、配列番号３２）とβ１１逆プライマー（５’−ＣＴＴ ＣＴＣ ＴＧＴ ＣＴＣ ＣＡＣ ＡＴＧ Ｃ−３’、配列番号 ３３）を使用した。Ｔａｑ−ポリメラーゼと１０×緩衝液はＢｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ドイツ）から購入し、ｄＮＴＰはＰｈａｒｍａｃｉａ（ Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，ドイツ）から購入した。総反応容量は５０μｌとし、各プラ イマー８ｐｍｏｌ、鋳型として使用したゲノムＤＮＡ約２００ｎｇ及び最終ｄＮ ＴＰ濃度２００μＭとした。ＰＣＲ条件は、５分間９４℃の後、３０秒間９４℃ 、４５秒間５３℃、３０秒間７２℃を４０サイクル繰り返し、最終伸長時間２分 間７２℃とした。生成した増幅産物をＱｉａｇｅｎ“Ｑｉａｑｕｉｃｋ”ＰＣＲ 増幅キット（＃２８１０６）で情製及び濃縮し（２×）、Ｈ₂Ｏ中に保存した。 サイクルシーケンシング。下記条件でＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登 録商標）−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ Ｓｃ ｉｅｎｃｅ，＃Ｅ７９０００Ｙ）を用いてプライマー伸長によりシーケンシング ラダーを生成した。即ち、総容量２５μｌ中精製濃縮増幅産物６μｌ（即ち元の 増幅産物１２μｌ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２．５単位及びＴｈｅ ｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ反応緩衝液２．５ｍｌにＨＰＬＣ精製プライマー（ Ｃａｄ５ １２量体： ５’−ＴＧＣ ＡＣＣ ＴＧＡ ＣＴＣ−３’、配列番号３４）７ｐｍｏｌを加 えた。最終ヌクレオチド濃度は適当なｄｄＮＴＰ（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄ ｄＧＴＰ又はｄｄＴＴＰ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，＃２７−２０ ４５−０１）３０μＭと各ｄＮＴＰ（７−デアザ−ｄＡＴＰ、ＤＣＴＰ、７−デ アザ−ＧＴＰ、ｄＴＴＰ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２１０μＭと した。 サイクリング条件は４分間９４℃で変性後、３０秒間９４℃、３０秒間３８℃ 、３０秒間５５℃を３５サイクル繰り返し、２分間７２℃の最終伸長とした。 試料調製及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分析。サイクリングプログラム の完了後、Ｈ₂Ｏ ２５μｌを加えて反応容量を５０μｌまで増量した。アンモニ ウム飽和ＤＯＷＥＸ（Ｆｌｕｋａ ＃４４４８５）カチオン交換ビーズ３０μｌ を分析物５０μｌと共に２分間室温で震盪することにより脱塩を行った。プロト ン化形態で購入したＤｏｗｅｘビーズは２Ｍ ＮＨ₄ＯＨで前処理してアンモニ ウム形態に変換後、上清が中性になるまでＨ₂Ｏで洗浄し、最後に１０ｍＭクエ ン酸アンモニウムに加えて使用した。カチオン交換後、ＤＮＡを精製し、３Ｍ酢 酸ア ンモニウム（ｐＨ６．５）５μｌ、グリコーゲン（１０ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ ）０．５μｌ及び無水エタノール１１０μｌを分析物に加えてエタノール沈殿に より濃縮し、室温で１時間インキュベートした。２０，０００×ｇで１２分間遠 心分離後、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、１８Ｍｏｈｍ／ｃｍ Ｈ₂Ｏ 水１μｌに再葱濁した。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析のために、再懸濁したＤＮＡ ０．３５μｌを ステンレス鋼試料ターゲットディスク上でマトリックス溶液（１：１Ｈ₂Ｏ：Ｃ Ｈ₃ＣＮ中０．７Ｍ ３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）、０．７Ｍクエ ン酸アンモニウム）０．３５〜１．３μｌと混合し、風乾後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｂ ｉｏａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｉｓｉｏｎ ２０００ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦをターゲ ット及び変換ダイノード夫々５及び２０ｋＶのリフレクトロンモードで運転して スペクトルを測定した。８個のピーク（３０００〜１８０００Ｄａ）から生成し た外部較正を全スペクトルに使用した。 結果 図４９は鋳型として生物増幅産物と１２量体（５’−ＴＧＣ ＡＣＣ ＴＧＡ ＣＴＣ−３'（（配列番号３４））シーケン シングプライマーから生成したシーケンシングラダーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量 スペクトルを示す。脱プリンに起因するピークと配列に無関係のピークをアステ リスクにより示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定はリフレクトロンＴＯＦ Ｍ Ｓで行った。Ａ．）ｄｄＡＴＰで停止したシーケンシングラダー；Ｂ．）ｄｄＣ ＴＰで停止したシーケンシングラダー；Ｃ．）ｄｄＧＴＰで停止したシーケンシ ングラダー；Ｄ．）ｄｄＴＴＰで停止したシーケンシングラダー。 図５０は図４９で生成したシーケンシングラダーと、プライマーから４０塩基 までの対応する計算分子量を示す（配列番号２２１〜２６０）。計算には、プラ イマー３５８１．４Ｄａ、７−デアザ−ｄＡＴＰ ３１２．２Ｄａ、ｄＴＴＰ ３０４．２Ｄａ、ｄＣＴＰ ２８９．２Ｄａ及び７−デアザ−ｄＧＴＰ ３２８ ．２Ｄａの分子量を使用した。 図５１はシーケンシング用鋳型として使用したβ−グロビン遺伝子内の増幅２ ０９ｂｐ増幅産物（配列番号２６１）の配列を示す。適当なＰＣＲプライマーの 配列と１２量体シーケンシングプライマーの位置も示す。この配列はプライマー から４位後のホモ接合突然変異体に相当する。野生型配列では、このＴ はＡに置き換えられる。 実施例１１ オリゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーを 使用するマイクロサテライト分析 要約 本方法は単一検出プライマーを使用後、オリゴヌクレオチド伸長段階を実施し 、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより容易に分解可能な長さで反 復単位数又は反復領域内の第２の部位突然変異に特異的な塩基数だけ長さの異な る産物を生成する。ヒト染色体２１に位置するインターフェロン−αレセプター 遺伝子のイントロン５におけるＡｌｕＶｐＡ多型性と、ヒト染色体７に位置する ＣＦＴＲ遺伝子からのイントロン８のスプライス受容部位のポリＴトラクトをモ デルシステムとして使用して本方法を説明する。 材料と方法 ゲノムＤＮＡは１８人の無関係の個体と、母親、父親及び３人の子供からなる １家族から得た。反復領域を変性ゲル電気泳動により常法で評価し、得られた結 果を標準Ｓａｎｇｅｒシーケンシングにより確認した。 ＰＣＲ増幅用プライマー（各８ｐｍｏｌ）は、インターフェロン−αレセプタ ー遺伝子のイントロン５の一部にはＩＦＮＡＲ−ＩＶＳ５−５’：（５’−ＴＧ Ｃ ＴＴＡ ＣＴＴ ＡＡＣ ＣＣＡ ＧＴＧ ＴＧ−３’、配列番号３５）と ＩＦＮＡＲ−ＩＶＳ５−３’．２：（５’−ＣＡＣ ＡＣＴ ＡＴＧ ＴＡＡ ＴＡＣ ＴＡＴ ＧＣ−３’、配列番号３６）を使用し、ＣＦＴＲ遺伝子のフラ ンキングイントロン配列をもつＣＦＴＲエキソン９には（５’−ピオチン化）Ｃ ＦＥｘ９−Ｆ：（５’−ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＴＣ ＴＧＡ ＣＡＡ ＡＣＴ Ｃ ＡＴＣ−３’、配列番号３７）とＣＦＥｘ９−Ｒ：（５’−ＣＡＴ ＧＧＡ Ｃ ＡＣ ＣＡＡ ＡＴＴ ＡＡＧ ＴＴＣ−３’、配列番号３８）を使用した。Ｔ ａｑ−ポリメラーゼと１０×緩衝液はＢｏｅｈｒｉｎｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍか ら購入し、ｄＮＴＰはＰｈａｒｍａｃｉａから購入した。総反応容量は５０μｌ とした。ＰＣＲ条件は５分間９４℃の後、１分間９４℃、４５秒間５３℃及び３ ０秒間７２℃を４０サイクル繰り返し、５分間７２℃の最終伸長時間とした。 ＱｉａｇｅｎのＰＣＲ精製キット（Ｎｏ．２８１０６）を製造業者の指示に従 って使用して増幅産物を精製した。ＴＥ緩衝 液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）５０μｌで 精製物をカラムから溶離した。 Ａ）プライマーオリゴ塩基伸長反応（熱サイクリング法） 精製鋳型１ｐｍｏｌ、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｖｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．＃Ｅ７９０００Ｙ）２単位、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝液２．５μｌ、各デオキシヌクレオチド２５μｍｏｌ（ ７−デアザ−ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及び実験により付加的ｄＣＴＰ）及びジデオキ シグアニン１００μｍｏｌ及び実験により付加的ｄＣＴＰを含む総容量２５μｌ 中で適当な検出プライマー（ＩＦＮ：５’−ＴＧＡ ＧＡＣ ＴＣＴ ＧＴＣ ＴＣ−３’、配列番号３９）５ｐｍｏｌを使用してサイクルＰＲＯＢＥを実施し た。サイクリング条件は５分間９４℃の初期変性後、３０サイクル３０秒間４４ ℃のアニーリング温度と１分間５５℃の伸長温度とした。 プライマーオリゴ塩基伸長反応（等温法） ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレートウェル（５０μｌ 容量当たり〜１６ｐｍｏｌ容量；Ｎｏ．１６４５６８４ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に精 製２本鎖増幅産物の１０μｌアリコート（〜３ｐｍｏｌ）を移した後、インキュ ベーション用緩衝液（８０ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭ ＮａＣｌ，０．４ ％Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ７．５）１０μｌと水３０μｌを加えた。１時間室温 でインキュベーション後、ウェルを洗浄用緩衝液Ａ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ８．８）２ ００μｌで３回洗浄し、５０ｍＭ ＮａＯＨ １００μｌと共に３分間インキュ ベートし、２本鎖Ｄを変性させた。最後に、ウェルを７０ｍＭクエン酸アンモニ ウム溶液２００μｌで３回洗浄した。 アニーリング用緩衝液（５０ｍＭリン酸アンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０及び １００ｍＭ塩化アンモニウム）５０μｌ中で６５℃で２分間、３７℃で１０分間 及び室温で１０分間検出プライマー（ＣＦｐＴ：５’−ＴＴＣ ＣＣＣ ＡＡＡ ＴＣＣ ＣＴＧ−３’、配列番号４０）１００ｐｍｏｌのアニーリングを行っ た。ウェルを洗浄用緩衝液Ｂ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍ Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ８．８）２００μｌで３回、 ＴＥ緩衝液２００μｌで１回洗浄した。ＵＳＢ製ＤＮＡシーケンシングキット（ Ｎｏ． ７０７７０）の一部の成分とＰｈａｒｍａｃｉａ製ｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰを使 用して伸長反応を実施した。総反応容量は４５μｌとし、水２１μｌ、Ｓｅｑｕ ｅｎａｓｅ緩衝液６μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ溶液３μｌ、７−デアザ−ｄＡＴ Ｐ ５０μｍｏｌ、ｄｄＣＴＰ ２０μｍｏｌ、グリセロール酵素希釈用緩衝液 ５．５μｌ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２．０ ０．２５μｌ及びピロホスファターゼ ０．２５μを含むものとした。反応産物を氷上にピペットでとった後、１５分間 室温及び５分間３７℃でインキュベートした。最後に、ウェルを洗浄用緩衝液Ｂ ２００μｌで３回洗浄した。 伸長したプライマーを５０ｍＭ水酸化アンモニウム溶液５０μｌ中で８０℃に １０分間加熱することにより鋳型鎖から変性させた。 沈殿のために、３Ｍ酢酸ＮＨ₄（ｐＨ６．５）１０μｌ、グリコーゲン（１０ ｍｇ／ｍｌ水，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ｇ１７６５）０．５μｌ及び無水エタノ ール１１０μｌを上清に加え、１時間室温でインキュベートした。１３，０００ ｇで１０分間遠心分離後、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、１８Ｍｏｈｍ ／ｃｍＨ₂Ｏ水１μｌに再懸濁した。 試料調製はマトリックス溶液（１：１Ｈ₂Ｏ：ＣＨ₃ＣＮ中０．７Ｍ ３−ヒド ロキシピコリン酸、０．０７Ｍ二塩基性クエン酸アンモニウム）０．６μｌを再 懸濁ＤＮＡ／グリコーゲンペレット０．３μｌと試料ターゲット上で混合し、風 乾することにより実施した。２０個までの試料をプローブターゲットディスクに スポットし、Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ（旧Ｆｉｎｎｉｇａｎ）Ｖ ｒｓｉｏｎｓ ２０００ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのソース領域に導入し、夫々ター ゲット及び変換ダイノード５及び２０ｋＶのリフレクトロンモードで運転した。 理論平均分子量（Ｍ_r（ｃａｌｃ））は原子組成から計算し、報告実測Ｍ_r（Ｍ_r （ｅｘｐ））値は外部較正を使用して決定した１プロトン化形態の値である。 結果 本実験の目的は、多型性領域内の第２の部位突然変異の検出能を含め、マイク ロサテライト中の反復単位数又はモノヌクレオチド配列の長さを正確に決定する ための迅速で確実な方法を開発することであった。そこで、特殊なＤＮＡシーケ ンシング（プライマーオリゴ塩基伸長、ＰＲＯＢＥ）をマトリックス介助レーザ ーデソープションイオン化（ＭＡＬＤＩ）マススペク トロメトリー（ＭＳ）による産物の評価と併用した。可能な質量測定システムと して飛行時間（ＴＯＦ）リフレクトロン構成を選択した。初期可用性試験として 、まずヒトインターフェロン−αレセプター遺伝子のイントロン５に位置するＡ ｌｕＶｐＡ反復多型性（サイクルＰＲＯＢＥ反応）、次にヒトＣＦＴＲ遺伝子の イントロン８に位置するポリＴトラクト（等温ＰＲＯＢＥ反応）で試験を行った 。 ＡｌｕＶｐＡ反復多型性のサイクルＰＲＯＢＥ実験の模式図を図５２に示す。 センス鎖を鋳型として使用してアンチセンス鎖（配列番号２６２）の伸長を実施 した。検出プライマーを下線で示す。家族試験では、電気泳動法とサイクルＰＲ ＯＢＥ法の実施後、マススペクトロメトリー分析により種々の対立遺伝子の共優 性分離を立証することができた（図５３）。母親と子供２の対立遺伝子は、増幅 産物の直接電気泳動によると２コピーのうちの一方が１３個の反復単位をもつと 思われたが、ｄｄＧをターミネーターとしてサイクルＰＲＯＢＥで測定すると１ １単位しかもたないことが判明した。ｄｄＧをｄｄＣに置き換えると、母親と子 供２のＤＮＡには約１１６５０の分子量をもつ別の予想外の短い対立遺伝子が検 出された（図５４）。配列分 析によると、１３反復単位をもつ対立遺伝子には２つの第２の部位突然変異の存 在が確認された。一方は３番目の反復単位のＣ→Ｔ転位であり、第２の突然変異 は９番目の反復単位のＴ→Ｇ転位である。２８人の無関係個体の試験によると、 １３単位対立遺伝子はサイクルＰＲＯＢＥを使用すると正常対立遺伝子と切断対 立遺伝子にスプライスされる。統計評価によると、多型性はどちらの方法でもハ ーディ・ワインベルグ平衡状態にあるが、検出法としてサイクルＰＲＯＢＥを使 用すると、多型性情報頻度は０．７３４まで増加する。 更にＰＲＯＢＥを等温法として使用し、ＣＦＴＲ遺伝子のイントロン８スプラ イス受容部位（配列番号２６３）における３種の一般的な対立遺伝子を検出した 。図５５は予想診断産物（配列番号２６４〜２６６）と理論質量値を示す。反応 はアンチセンス方向でも実施した。 図５６は、この遺伝子座における全３個の一般的対立遺伝子（夫々Ｔ５、Ｔ７ 及びＴ９）をこの方法により確実に検出できたことを立証している。図５６から 明らかなように、この試験で使用したリフレクトロン飛行時間の質量正確度及び 精度は０〜０．４％であり、相対標準偏差０．１３％であった。これは ＩＦＮＡＲシステムで生成される＜９０量体診断産物の単塩基精度よりも遥かに 良好である。このような高い分析感度は９０量体に＞１％質量シフトを誘導する 反復単位又はそのフランキング領域内で単一又は多重挿入／欠失突然変異を検出 するために十分である。これは図５６のポリＴトラクト分析でも同様である。早 期産物ターミネーションを生じない他の突然変異（即ちＩＦＮＡＲ遺伝子Ａ３Ｔ 反復内のＡ→Ｔ又はＴ→Ａ突然変異）はｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰとＰＲＯＢＥ及び 低性能ＭＳ装置をどのように組み合わせても検出することができず、９０量体の ９Ｄａシフトは０．０３％質量シフトに対応する。１００量体まで一桁のＤａ精 度が得られるフーリエ変換（ＦＴ）ＭＳ等の高性能装置では、このような微量質 量シフトを検出するために必要な正確度及び精度を達成できることが立証されて いる。更に、質量シフトしたフラグメントを装置内で単離及び解離し、配列特異 的フラグメントを生成することができるタンデムＦＴＭＳは、同等寸法の産物で 塩基の点突然変異を位置決定できることが立証されている。従って、ＰＲＯＢＥ を高性能装置と組み合わせると、反復領域の完全シーケンシングといった手間の かかるに作業によってしか達成できないような分析感度が得ら れよう。 実施例１２ プライマーオリゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロ メトリーを使用するアポリポタンパク質Ｅの遺伝子型別の改善 材料と方法 ＰＣＲ増幅。 従来公表されている文献（Ｂｒａｕｎ，Ａら，（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅ ｎｅｔ．８９：４０１−４０６）による１００人の匿名個体からのヒト白血球ゲ ノムＤＮＡについて常法によりアポリポタンパク質Ｅをスクリーニングした。ア ポＥ遺伝子のエキソン４の一部を増幅するためのＰＣＲプライマーは公表配列に 従って作製した（Ｄａｓ，ＨＫら，（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６ ０：６２４０−６２４７）（順プライマー、アポＥ−Ｆ：５’−ＧＧＣ ＡＣＧ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＧＧＡ Ｇ−３’、配列番号４１；逆、アポＥ−Ｒ ：５’−ＡＧＧ ＣＣＧ ＣＧＣ ＴＣＧ ＧＣＧ ＣＣＣ ＴＣ−３’、配列 番号４２）。Ｔａｑ−ポリメラーゼと１０×緩衝液はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍ ａｎｎｈｅｉｍ（ドイツ） から購入し、ｄＴＮＰはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，ドイツ）から 購入した。総反応容量は５０μｌとし、各プライマー８ｐｍｏｌ、１０％ＤＭＳ Ｏ（ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａ）及び鋳型として使用したゲノムＤＮＡ 約２００ｎｇを含むものとした。１Ｕポリメラーゼを加える前に溶液を８０℃ま で加熱した。ＰＣＲ条件は２分間９４℃の後、３０秒間９４℃、４５秒間６３℃ 及び３０秒間７２℃を４０サイクル繰り返し、７２℃で２分間の最終伸長時間と した。 制限酵素消化及びポリアクリルアミド電気泳動。 ＣｆｏＩ及びＲｓａＩと反応用緩衝液ＬはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈ ｅｉｍから購入し、ＨｈａＩはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，ドイツ ）から購入した。ＣｆｏＩ単独及びＣｆｏＩ／ＲｓａＩ同時消化では、増幅産物 ２０ｐＬを水１５μｌとＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ緩衝液Ｌ４ｐ Ｌで希釈し、適当な制限酵素１０単位の添加後、試料を６０分間３７℃でインキ ユベートした。ＨｈａＩ／ＲｓａＩ同時消化操作では、まず緩衝液Ｌ中でＲｓａ Ｉで１時間消化後、ＮａＣｌ（終濃度５０ｍＭ）とＨｈａＩを加えて更に１時間 インキュベーションが必要であった。他の文献（Ｈｉｘｓｏｎ （１９９０）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１：５４５−５４８）に記載されてい るように１２％ポリアクリルアミドゲル上で制限消化産物２０ｐＬを分析した。 ＲｓａＩとＣｆｏＩ（ＨｈａＩ）の認識配列は夫々ＧＴ／ＡＣ及びＧＣＧ／Ｃで あり、２５２量体増幅産物のＣｆｏＩ単独及びＣｆｏＩ（又はＨｈａＩ）とＲｓ ａＩの同時二重消化による予想消化フラグメントの質量を表Ｖに示す。 熱ＰＲＯＢＥ。 増幅産物をＱｉａｇｅｎ“Ｑｉａｑｕｉｃｋ”キットで精製し、取り込まれな かったプライマーを除去した以外は上記と同様にＰＣＲ増幅を実施した。ストレ プトアビジンをコートした磁性ビーズに固定化した精製ビオチン化アンチセンス 鋳型〜１ｐｍｏｌ、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ２．５単位、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝液２μｌ、各ｄＮＴＰ５０μＭ及びｄｄＸＴＰ２００μ Ｍ（Ｎ及びＸの塩基種は本文に記載する通りである）を含む２０μｌ中で増幅産 物３５μｌとコドン１１２(５'−ＧＣＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＡＣ Ｇ ＡＧ−３'配列番号４３)及び１５８(５'−ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＧＡＣ Ｃ ＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ−３’配列番号４４) 検出プライマー各８ｐｍｏｌを使用して多重熱ＰＲＯＢＥを実施した。サイクリ ング条件は変性（９４℃、３０秒間）後、９４℃（１０分間）と６０℃（４５秒 間）を３０サイクルとした。 試料調製及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分析。 消化産物とＰＲＯＢＥ産物の沈殿（Ｓｔｕｌｔｓら，（１９９１）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５：３５９−３６３）のために 、３Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）５μｌ、グリコーゲン（１０ｍｇ／ｍｌ ，Ｓｉｇｍａ）０．５μｌ及び無水エタノール１１０μｌを分析物溶液５０μｌ に加え、室温で１時間保存した。１３，０００×ｇで１０分間速心分離後、ペレ ットを７０％エタノールで洗浄し、１８Ｍｏｈｍ／ｃｍ Ｈ₂Ｏ水１μｌに再懸 濁した。本実験では、アンモニウム飽和ＤＯＷＥＸ（Ｆｌｕｋａ ＃４４４８５ ）カチオン交換ビーズ１０〜２０μｌを分析物４０μｌに加えて震盪することに より更に脱塩した。プロトン化形態で購入したビーズは２Ｍ ＮＨ₄ＯＨで５分 間スピンデカント段階を３回実施した後、Ｈ₂Ｏと１０ｍＭクエン酸アンモニウ ムで前処理した。 再懸濁したＤＮＡ０．３５μｌをステンレス鋼試料ターゲッ トディスク上でマトリックス溶液（Ｗｕら（１９９３）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕ ｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．７：１４２−１４６）（１：１Ｈ₂Ｏ：ＣＨ₃ ＣＮ中０．７Ｍ ３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）、０．０７Ｍクエン 酸アンモニウム）０．３５〜１．３μＬと混合して風乾後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｉ ｏａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｉｓｉｏｎ ２０００ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦをターゲッ ト及び変換ダイノード夫々５及び２０ｋＶのリフレクトロンモードで運転してス ペクトルを測定した。フラグメントの理論平均分子量（Ｍ_r（ｃａｌｃ））は原 子組成から計算し、実測分子量（Ｍ_r（ｅｘｐ））は組データ値からプロトンの 質量（１．０８Ｄａ）を差し引き、中性基準で報告する。８個のピーク（３００ ０〜１８０００Ｄａ）から生成した外部較正を全スペクトルに適用した。 結果 ＣｆｏＩ単独消化。 図５７ａの挿入図は２５２ｂｐアポＥ増幅産物のＣｆｏＩ消化後のε３／ε３ 遺伝子型の１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動分離を示す。電気泳動バンド を分子量ラダーに比較すると、切断パターンはε３／ε３遺伝子型にほぼ予想さ れる通り （表Ｖ）である。相違点として、約２５ｂｐの微かなバンドは予想外であり、最 小フラグメントは観察されない。沈殿消化産物の質量スペクトルは高分解能で同 様のパターンを示す。表Ｖと比較すると、観察される質量は１本鎖ＤＮＡに一致 する。酸性マトリックス環境（３−ＨＰＡ，ｐＫ_a３）と、イオン化により３３ ７ｎｍで吸収する３−ＨＰＡとの相互作用を介して熱エネルギーを吸収させるこ とを組み合わせると、正常ＭＡＬＤＩ条件下でｄｓＤＮＡの短い配列は変性する ことが知られている（Ｔａｎｇ，Ｋら，（１９９４）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ８：１８３−１８６）。 電気泳動で分解しなかった約２５量体はＭＳにより３個の１本鎖フラクメント として分解し、最大のもの（７４２７Ｄａ）は１４．８ｋＤａフラグメント（ｍ ＝１４８５０，ｚ＝２；ｍ／ｚ＝７４２５）からの２電荷イオンに相当し、６７ １５及び７１５３ＤａフラグメントはＰＣＲアーチファクト又はプライマー不純 物に起因すると思われ、増幅産物を消化前にＱｉａｇｅｎ精製キットで精製する と、全３個のピークは観察されない。表Ｖの８８７１Ｄａ２９量体センス鎖３’ 末端フラグメントは観察されず、９１８６Ｄａで検出される種はＰＣＲ増幅中に Ｔａｑ−ポリメラーゼにより付加される付加塩基（９１８７−８８７１＝３１６ 、Ａに一致）に一致する（Ｈｕ，Ｇら，（１９８３）ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：７６３−７７０）。＜３５塩基をもつ各２本鎖（１１ｋＤａ ）の個々の１本鎖は単一ピークとして分解されるが、４８塩基１本鎖（Ｍ_r（ｃ ａｌｃ）１４８４５及び１４８５８）は１４８５０Ｄａで未分解単一ピークとし て観察される。これらを単一ピークに分離するには、この試験で使用した標準リ フレクトロン飛行時間装置で通常得られるよりも約一桁大きい１４８５０／１３ ＝１１４０の質量分解能（ｍ／Δｍ、質量と半高ピーク幅の比）が必要であるが 、この質量範囲で３桁まで上の分解能を提供するフーリエ変換ＭＳ等の高性能装 置ではこのような小さい質量差を分解できることが立証されている。９１量体１ 本鎖（Ｍ_r（ｃａｌｃ）２７８４９及び２８４３６）は＜５０の分解能しか必要 としないが、この鎖も分解されない。質量が増すとピーク品質が著しく低下する のは、レーザー照射中及び照射後に内部エネルギーが過剰に吸収される結果、準 安定断片化（即ち脱プリン）が生じるためである。 ＣｆｏＩ及びＲｓａＩ同時消化。 図５７ｂ（挿入図）はε３／ε３二重消化産物の１２％ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動分離を示し、２４、３１、３６、４８及び５３塩基対をもつｄｓＤＮ Ａに一致するバンドが検出されるが、これよりも小さいフラグメントは倹出され ない。ＣｆｏＩ単独で消化するよりも多くのピークが生成される（表Ｖ）が、全 フラグメントは＜６０塩基を含み、これは妥当な精度のＭ_r値（例えば０．１％ ）が所望される場合にＭＡＬＤＩ−ＭＳに遥かに適切な寸法範囲であるので、対 応する質量スペクトルの解読は容易になる。この質量範囲のフラグメントでは、 外部較正を使用した質量測定精度は−０．１％（即ち１０ｋＤａで＜＋１０Ｄａ ）である。１０ｋＤａを上回る全ピークに（図にアステリスクで示す）顕著な脱 プリンが観察されるが、１７１７１Ｄａの最大ピークでもその脱プリンピークか ら明白に分解されるので、正確なＭ_rを測定することができる。消化産物のモル 濃度は一定であるべきだが、これらのフラグメントとの間に≦１１塩基の差が観 察されるのはエタノール／グリコーゲン沈殿段階での損失に起因すると思われる 。生成されるフラグメントが小さいほうが高精度質量測定に良好であり、全遺伝 子型で２量体ピークが高質量診断ピークにオーバーラップする可能 性はないので、ＣｆｏＩ（又はＨｈａＩ）とＲｓａＩの同時消化によるＭＳの品 質はＣｆｏＩ（又はＨｈａＩ）単独よりも優れている。ＲｓａＩ／ＣｆｏＩ及び ＲｓａＩ／ＨｈａＩによる消化は同一制限フラグメントを生じるが、前者は緩衝 液要件が同一であるため同時消化として実施できるので、制限消化プロトコール によるその後の全遺伝子型別にはこの酵素混合物を使用した。 ^aＣｆｏＩ不変フラグメント質量：１８４８、２１７７、２１８６、２４３５、 ４９２４、５００４、５４１２、５７５０、８８７１、９６２８Ｄａ。^b ＣｆｏＩ／ＲｓａＩ不変フラグメント質量：１８４８、２１７７、２１８６、 ２４３６、４９２４、５００４、５４１２、５７５０、６７４５、７５１０、８ ８７１、９６２８、１６２４０、１７１７５Ｄａ。 ^aコドン１１２検出プライマー由来（未伸長５６２９．７Ｄａ）。^b コドン１５８検出プライマー由来（未伸長６４８０．３Ｄａ）。 ダッシュ（−）：この遺伝子型は１００人の患者の分析プールから得られない。 図５８ａ〜ｃはＣｆｏＩ消化後のアポＥε３／ε３遺伝子型と種々の沈殿スキ ームを示し、同一増幅産物の等容量アリコートを各々使用した。酢酸アンモニウ ム／エタノール／グリコーゲン溶液から１回沈殿させた試料（図５８ａ）は特に 高質量で幅広いピークをもつ質量スペクトルを生じる。５．４、１０．７及び１ ４．９ｋＤａの高強度ピークの質量は夫々予想値よりも ２６Ｄａ（０．５％）、６１Ｄａ（０．６％）及び４５Ｄａ（０．３％）高く、 これらの各々の分解能(合計強度の２分の１におけるピーク幅とピークの測定質 量の比)は−５０であり、質量の増加と共に低下する。このような観測結果は高 レベルの不揮発性カチオン付加に一致し、１０．８ｋＤａフラグメントでは、観 察される質量シフトは付加：非付加分子イオンの単位比を上回る。 再溶解し、二度目に沈殿した試料からのＭＳピークのほうが著しくシャープで あり（図５８ｂ）、分解値は対応する図５８ａのピークのほぼ２倍である。質量 精度値も著しく改善され、各々夫々の計算値の０．０７％以内であり、３−ＨＰ Ａをマトリックスとして使用するＤＮＡ測定の独立して測定した計器限界に近い 。エタノールの代わりにイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で一回（図示せず） 及び２回（図５８Ｃ）沈殿すると、分解能及び質量精度値は対応するエタノール 沈殿と同等になるが、二量化レベルの増加が観察され、このようなダイマーが溶 液中に存在する高質量「診断」モノマーにオーバーラップする場合には測定が混 乱しかねない。グリコーゲンを核生成剤としてＥｔＯＨ／酢酸アンモニウム沈殿 すると、７量体以外のフラ グメントをほぼ定量的に回収できるので、ＭＳ検出前に同時濃縮及び脱塩段階と して利用できる。グリコーゲンの不在下で同一ＥｔＯＨ／酢酸アンモニウム溶液 から沈殿すると、特に低質量で回収は著しく不十分である。 これらの結果が示すように、１ＰＡ及びＥｔＯＨ／沈殿後に正確なＭ_r（ｅｘ ｐ）値を得るためには、第２の沈殿により高い質量精度と分解能を維持すること が必要である。 マトリックス：消化産物の比もスペクトル品質に影響し、（１μＬに再溶解し た）１：１容量のマトリックス：消化産物で観察される高質量フラグメント（図 示せず）の著しい減少は、３〜５倍容量のマトリックスを使用することにより軽 減される。 酵素消化によるアポＥ遺伝子型別。コドン１１２及び１５８多型性は（Ｒｓａ Ｉでなく）ＣｆｏＩ認識配列に該当する。本実施例で試験した２５２ｂｐ増幅産 物では、不変（即ち全遺伝子型で切断される）部位は塩基３１、４７、１３８、 １５６、２３９及び２４６の後に切断を生じる。塩基６６の後の切断部位はε４ にしか存在せず、塩基２０４の後の切断部位はε３とε４に存在し、ε２遺伝子 型はこれらの部位のいずれでも切断されない。これらの制限パターンの相違は質 量スペクトルの変 化として立証することができる。図５９は１００人の患者のプールから入手可能 な数種のアポＥ遺伝子型の質量スペクトルを示す（Ｂｒａｕｎ，Ａら，（１９９ ２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｔ．８９：４０１−４０６）。予想される表Ｖの診断フラグ メントに対応する質量に縦点線を引き、他の表示フラグメントは不変である。表 Ｖに関して、所与の対立遺伝子に２コピーが存在する場合にしかフラグメントは 「不変」とみなさず、この要件を満たすためには、このようなフラグメントはε ２ｍε３及びε４対立遺伝子の各々で生成されなければならないことに留意され たい。 図５９ａのスペクトルは３ｋＤａを上回る全予想不変フラグメントと、３４２ ８及び４０２１（いずれも弱い）、１１２７６及び１１６２７（いずれも強い） 、１４８４５、１８２７１並びに１８８６５Ｄａの診断ピークを含む。図５９ｂ のスペクトルは、１８ｋＤａのピーク対が検出されず、特に１１〜１８ｋＤａフ ラグメント間の相対ピーク強度が異なる点を除いてほぼ同一である。図５９ｃの スペクトルは更に１８ｋＤａフラグメントをもたない代わりに５〜６ｋＤａ間に 別の低強度ピークをもつ。９ｋＤａを上回るフラグメントの強度比は１１ｋＤａ フラグメント対が比較的低い点を除いて図５９ｂと同様である。図５９ｄも５〜 ６ｋＤａにピーク群を含むが、１１ｋＤａフラグメントを含まない唯一のスペク トルであり、先の２つのスペクトルと同様に１８ｋＤａフラグメントをもたない 。 各スペクトルの膨大な数のピークにも拘わらず、表Ｖｂの診断ピークの数個の みの有無により各遺伝子型を同定することができる。使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯ Ｆ装置の分解能の制限により、５．２〜６．０ｋＤａの４個の診断フラグメント は数個の不変ピークにほぼオーバーラップするので、ε４対立遺伝子の特徴であ るこれらのフラグメントの有無に基づく遺伝子型は最も区別しにくい。本発明で は、５２８３Ｄａ診断フラグメントは５４１２Ｄａ不変フラグメントからの脱プ リンピークにオーバーラップし、５７８１Ｄａ診断ピークは通常は５７５０Ｄａ 不変フラグメントから完全に分解されないことが判明した。従って、５８８０及 び５９９９Ｄａフラグメントの有無によりε２／ε４とε２／ε３又はε３／ε ４とε３／ε３対立遺伝子を区別する。これらの各々は図５９ｃ及び５９ｄには 存在するが、５９ａ又は５９ｂには存在しない。 図５９の患者の各々の遺伝子型は図６０のフローチャートを 参照すると、より迅速に同定することができる。図５９ａのスペクトルについて 説明すると、１１ｋＤａに強いピーク対があるのでホモ接合ε４の可能性はない が、他の５種の遺伝子型は区別できない。同様に、１４．８ｋＤａの未分解フラ グメントが存在するのでホモ接合ε２ではないが、４種の可能性（ε２／ε３、 ε２／ε４、ε３／ε３、ε３／ε４）がある。これらのうちでε２／ε３とε ２／ε４のみが１８ｋＤａピークに一致し、５２８３、５８７９、５７７９及び ５９９８Ｄａのピークをもたないことから、図５９ａの試料はε２／ε３である と判断される。同一手順を使用して図５９ｂ〜ｄの遺伝子型を夫々ε３／ε３、 ε３／ε４及びε４／ε４と同定することができる。現在までこの方法による全 対立遺伝子同定は慣用方法により得られる同定に一致しており、多くの場合には 慣用方法よりも容易に解読されている。フラグメント強度比を表Ｖのコピー数に 一致させることにより帰属を更に確認することができる。例えば、図５９ａでは １４．８ｋＤａフラグメントは１６〜１７ｋＤａフラグメントよりも強度が低い が、図５９ｂ〜ｄでは逆である。後者３種の遺伝子型では１４．８ｋＤａが２コ ピー存在するが、前者はε２を含むヘテロ接合体であるため、 増幅産物の２分の１は１４．８ｋＤａシグナルに加えられないので、これは予想 通りである。同様に、１１ｋＤａフラグメントの強度を９．６及び１４．８ｋＤ ａフラグメントの強度に比較すると、このフラグメントは図５９ａ、ｄでは夫々 ２、２、１及び０コピーである。これらのデータは、ＭＡＬＤＩがこれらの条件 下で半定量的に実施できることを裏付けている。 プライマーオリゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）によるアポＥ遺伝子型別。コドン１ １２及び１５８多型性の同時検出手段としてＰＲＯＢＥ反応を更に試験した。３ ’末端が可変部位のすぐ下流となるように検出プライマーを１本鎖ＰＣＲ増幅鋳 型にアニールした。３種のｄＮＴＰと（ｄＮＴＰとして存在しない）１種のｄｄ ＸＴＰの存在下にこのプライマーをＤＮＡポリメラーゼにより伸長すると、多型 性塩基の種類に依存する長さと質量をもつ産物が生じる。特定塩基特異的チュー ブが−９９％ｄＸＴＰ及び−１％ｄｄＸＴＰを含む標準Ｓａｎｇｅｒ型シーケン シングとは異なり、ＰＲＯＢＥ混合物は他の３種のｄＮＴＰと共に特定ｄｄＸＴ Ｐ１００％を含む。このように、ＰＲＯＢＥではｄｄＸＴＰに相補的な第１の塩 基に到達後に全検出プライマーの完全な停止が達せられる。 ε２／ε３遺伝子型では、ＰＲＯＢＥ反応（ｄｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ 、ｄＧＴＰの混合物）によりコドン１１２プライマーは５９１９Ｄａ、コドン１ ５８プライマーは６７６９及び７９６７ＤａにＭ_r（ｅｘｐ）シフトし（表ＶＩ ）、ε２／ε３遺伝子型はこの位置でヘテロ接合であるため、単一コドン１５８ プライマーの結果として１対の伸長産物が生じる。ヘテロ接合体ε３／ε４から は３種の伸長産物（コドン１５８から１種とコドン１１２から２種）も観察され る（図６１ｃ及び表ＶＩ）が、図６１ｂ（ε３／ε３）及び図５９ｄ（ε４／ε ４）ホモ接合対立遺伝子からは２種の産物（各プライマーから１種）しか観察さ れない。表ＶＩを参照すると、利用可能な対立遺伝子の各々は理論質量の０．１ ％以内で全予想ｄｄＴ反応産物質量を生じるので、各々はこのデータだけで明確 に特徴付けられる。ｄｄＣＴＰ（及びｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）を用いて 反応を繰り返すことにより、対立遺伝子種の別の構造も得られ、表ＶＩにも要約 するこれらの結果はｄｄＴの結果を明確に裏付ける。 方法の妥当性。図５９（制限消化）及び６１（ＰＲＯＢＥ）を比較すると、Ｐ ＲＯＢＥ法は制限消化分析よりもコドン１１２ 及び１５８多型性の多重分析のために著しく容易に解読可能なスペクトルを提供 する。消化産物は質量スペクトル当たり−２５ピークまでを生じ、診断フラグメ ントが不変フラグメントとオーバーラップする場合もあるが、ＰＲＯＢＥ反応は 検出プライマー当たり最大２個のピークしか生じない（即ち多型性）。後者のほ うが自動化ピーク検出、スペクトル分析及び対立遺伝子同定が遥かに容易である ことは明白である。同一又は異なる増幅産物からの数個の多型性部位を単一チュ ーブから測定する高度多重化ＰＲＯＢＥのスペクトルも簡単に分析できると予想 される。その融通性を強調すると、ＰＲＯＢＥデータ分析はプライマー長を慎重 に先験的に選択することにより更に単純にすることができ、プライマー長はプラ イマー又は産物の質量がオーバーラップしないようにデザインすることができる 。 従って、ＰＲＯＢＥは予め十分に特性決定された多型性部位の大規模臨床試験 に選択される方法であるが、本実施例に記載するような制限消化分析は新しい突 然変異のスクリーニングに理想的に適している。本試験で論じる２種の多型性の 各々の型はフラグメントパターンに影響を与えるので、多型性の型が使用する唯 一の情報である場合には、ＭＳ検出は制限フラグメン ト長多型性産物の慣用電気泳動分離よりも迅速な代用方法である。他の単一点突 然変異は突然変異を含む２本鎖フラグメントの１本鎖の各々の質量を必然的に変 化させるので、フラグメントＭ_r値の正確な測定は、酵素認識部位から完全に離 れた部位に関する情報を与えることができる。２５２ｂｐ増幅産物が対立遺伝子 変異体も含む場合には、例えば従来記載されているＧｌｙ１２７Ａｓｐ（Ｗｅｉ ｓｇｒａｂｅｒ，ＫＨら，（１９８４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：１ ０２４−１０３３）、Ａｒｇ１３６Ｓｅｒ（Ｗａｒｄｅｌｌ，ＭＲら，（１９８ ７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８０：４８３−４９０）、Ａｒｇ１４２Ｃｙ ｓ（Ｈｏｒｉｅ，Ｙら，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．２６７：１９６ ２−１９６８）、Ａｒｇ１４５Ｃｙｓ（Ｒａｌｌ ＳＣ Ｊｒら，（１９８２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：４６９６−４７０ ０）、Ｌｙｓ１４６Ｇｌｕ（Ｍａｎｎ，ＷＡら，（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ ｎｖｅｓｔ．９６：１１００−１１０７）、又はＬｙｓ１４６Ｂｌｎ（Ｓｍｉｔ ，Ｍら，（１９９０）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１：４５−５３）置換を生じ る。Ｇ→Ａ塩基置換はＧｌｙ１２７Ａｓｐアミノ酸置換をコー ドし、センス鎖の−１６Ｄａシフトとアンチセンス鎖の＋１５Ｄａ（Ｃ→Ｔ）シ フトを生じるが、制限パターンには変化を生じない。このような小さい変化は電 気泳動ではほとんど判別できないが、精密質量測定により置換を検出することが でき、１６２４０(センス)及び１７１７５Ｄａの不変５５量体は夫々１６２２４ 及び１７１９０Ｄａにシフトする。微量の未分解付加物及び／又は十分に定義さ れないピークは正確な質量測定能を制限するので、現行のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装 置を使用してこのような小さい質量シフトを検出するために必要な質量精度を得 ることは内部較正を用いても容易でない。高性能エレクトロスプレーイオン化フ ーリエ変換（ＥＳＩ−ＦＴＭＳ）を使用すると、１００量体まで（Ｌｉｔｔｌｅ ，ＤＰら，（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４８９３−４８ ９７）の合成オリゴヌクレオチド（Ｌｉｔｔｌｅ，ＤＰら，（１９９５）Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２３１８−２３２２）で 高いＤａ精度が達成されており、最近ではＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳを使用して２５ 量体までで同様の結果が達成されている（Ｌｉ，Ｙら，（１９９６）Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．６８：２０９０−２０９６）。 実施例１３ テロメラーゼ活性に関連するＤＮＡフラグメントのマススペクトロメトリー測定 方法 序論 米国の全死因の４分の１は悪性腫瘍である（Ｒ．Ｋ．Ｊａｉｎ，（１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１０７９−１０８０）。診断及び治療目的で確実且つ 高感度の腫瘍細胞検出方法に高い関心が寄せられている。 悪性細胞は種々の性質により正常細胞から区別することができる。その１つと して、悪性細胞は不死化しており、無制御に細胞増殖することができる。正常２ 倍体哺乳動物細胞を培養すると、老化前に限定回数の集団倍加を経る。集団倍加 数は各細胞分裂でテロメアと呼ばれる染色体末端の短縮に関係があると予想され る。この短縮の理由は慣用半保存複製機構の性質による。ＤＮＡポリメラーゼは ５’→３’方向にしか作用せず、ＲＮＡプライマーを必要とする。 不死化は活性テロメラーゼの発現に関係があると考えられる。このテロメラー ゼは鋳型の反復伸長を触媒するリボヌクレオタンパク質である。この活性はテロ メア反復増幅プロトコール （ＴＲＡＰ）として知られる特殊なＰＣＲシステムによりテロメラーゼを含む細 胞の天然タンパク抽出物で検出することができる（Ｎ．Ｗ．Ｋｉｍら（１９９４ ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１１−２０１５）。本実施例で使用するアッセ イは、基質プライマー（ＴＳ）のテロメラーゼ特異的伸長と、反復構造に相補的 な第２のプライマー（ｂｉｏＣＸ）を使用したＰＣＲ段階によるテロメラーゼ特 異的伸長産物の後期増幅に基づく。ゲル電気泳動及び標識又は染色システムを使 用してこれらのアッセイの特徴的ラダーフラグメントを常法により検出する。こ れらの方法をＭＡＬＤ−ＴＯＦマススペクトロメトリーに置き換えると、より迅 速で正確な自動検出が得られる。 材料と方法 細胞の調製 培養テロメラーゼ陽性細胞１×１０⁶個をペレット化し、ＰＢＳ（滅菌ＤＥＰ Ｃ水中１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，４．３ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏ，１．４ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄）で１回洗浄した。調製した細胞は−７５ ℃で保存することができる。組織試料は抽出前に当業者に周知の手順によりホモ ジナイズする必要がある。 テロメラーゼ抽出 ペレットをＣＨＡＰＳ溶解用緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７． ５，１ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１ｍＭ ＥＧＴＡ，０．１ｍＭベンズアミジン、５ｍ Ｍ β−メルカプトエタノール，０．５％ＣＨＡＰＳ，１０％グリセロール）２ ００μｌに再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。試料を１２，０００ ｇで３０分間４℃で遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、使用時まで７ ５℃で保存した。 ＴＲＡＰアッセイ 最終容量５０μｌ中、１０×ＴＲＡＰ緩衝液(２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ，ｐＨ８．３，１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，６３０ｍＭ ＫＣｌ，０．０５％ Ｔｗ ｅｅｎ２０，１０ｍＭ ＥＧＴＡ)、５０×ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴ Ｐ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ各２．５ｍＭ）、ＴＳプライマー１０ｐｍｏｌ及びｂ ｉｏＣＸプライマー５０ｐｍｏｌの混合物にテロメラーゼ抽出物２μｌを加えた 。混合物を３０℃で１０分間及び９４℃で５分間インキュベートし、Ｔａｑ Ｐ ｏｌｙｍｅｒａｓｅ２単位を加え、３０秒間９４℃、３０秒間５０℃及び４５秒 間７２℃を３０サイクル繰り返してＰＣＲを実施した。 ＴＲＡＰアッセイ産物の精製 各ＴＲＡＰアッセイ産物を精製するために、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍ− ２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを１×ＢＷ緩衝液（５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，１Ｍ ＮａＣｌ ）で２回洗浄した。２×ＢＷ緩衝液５０μｌをＰＣＲ混合物に加え、ビーズをこ の混合物に再懸濁した。ビーズを静かに震盪しながら１５分間周囲温度でインキ ュベートした。上清を取り出し、ビーズを１×ＢＷ緩衝液で２回洗浄した。ビー ズに２５％水酸化アンモニウム５０μｌを加え、６０℃で１０分間インキュベー トした。上清を取り出し、操作を繰り返し、２つの上清をプールし、エタノール （１００％）３００μｌを加えた。３０分後にＤＮＡを１３，０００ｒｐｍで１ ２分間ペレット化し、ペレットを風乾し、超純粋６００ｎｌに再懸濁した。 ＴＲＡＰアッセイ産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 試料３００ｎｌを飽和マトリックス溶液（５０％水性アセトニトリル中３−Ｈ ＰＡ：クエン酸アンモニウム＝１０：１モル比）５００ｎｌと混合し、周囲温度 で乾燥し、マススペクトロメーター（Ｖｉｓｉｏｎ ２０００，Ｆｉｎｉｇａｎ ＭＡＴ） に導入した。外部較正を使用してリフレクターモードで全スペクトルを測定した 。 配列及び質量 ｂｉｏＣＸ：ｄ(ｂｉｏ−ＣＣＣ ＴＴＡ ＣＣＣ ＴＴＡ ＣＣＣ ＴＴＡ ＣＣＣ ＴＡＡ、配列番号４５)、質量：７５４０Ｄａ。 ＴＳ：ｄ（ＡＡＴ ＣＣＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＡＧＡ ＧＴＴ、配列番号４６） 、質量：５５２３Ｄａ。 テロメア反復構造：（ＴＴＡＧＧＧ）_n、１反復の質量：１９０９．２。 増幅産物： テロメア反復３個分伸長したＴＳ（第１回増幅産物）：１２４５２Ｄａ（Ｎ₃） 。 テロメア反復４個分伸長したＴＳ：１４３６１Ｄａ（Ｎ₄）。 テロメア反復７個分伸長したＴＳ：２００８８Ｄａ（Ｎ₇）。 結果 図６２はＴＲＡＰアッセイＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルの一部を示す。 プライマーＴＳ及びｂｉｏＣＸは夫々５４９７及び７５３７Ｄａ（計算値５５２ ３及び７５４０Ｄａ）に帰属 される。アステリスクを付けたシグナルは化学ＤＮＡ合成のｎ−１プライマー産 物に相当する。第１のテロメラーゼ特異的ＴＲＡＰアッセイ産物は１２７７５Ｄ ａに帰属される。この産物は３個のテロメア反復を含む４０量体に相当する。プ ライマー配列により、これは陽性ＴＲＡＰアッセイの第１の予想増幅産物である 。この産物はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのエキステンターゼ活性による付加的 ヌクレオチドの分だけ伸長している（非伸長産物計算値：１２４５２Ｄａ、Ａ分 伸長した産物：１２７６５Ｄａ）。６３８９Ｄａのシグナルはこの産物の２電荷 イオンに相当する（計算値：６３８７Ｄａ）。図６３は図６２に示すと同一のス ペクトルの高質量部分を示し、従って、１２７７５Ｄａのシグナルは図６２と同 一である。７個のテロメア反復を含み、同様に付加ヌクレオチド分伸長した６４ 量体に相当するＴＲＡＰアッセイ産物は２０３２２Ｄａ（計算値２０３９５Ｄａ ）で検出される。１、２、３及び４で示したシグナルは基線分解することができ ない。この領域は、１は２量体ｎ−１プライマーのシグナルを含み、２は４個の テロメア反復を含み、従って、４６量体（計算値：１４３４１Ｄａ／エキステン ダーゼ伸長産物１４６７５Ｄａ）に相当する第２のＴＲ ＡＰアッセイ増幅産物を含み、３は２量体プライマーイオンと更にその対応する 全脱プリンシグナルを含む。第２の伸長産物と第５の伸長産物のシグナルにはギ ャップが観察される。このシグナルギャップはＴＲＡＰアッセイのオートラジオ グラフ分析で場合により第３及び第４の伸長産物に観察されるバンド強度の低下 に対応する（Ｎ．Ｗ．Ｋｉｍら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１３ ）。 ２量体プライマー及び関連シグナルにより生じる上記問題は、ＭＡＬＤＩ−Ｔ ＯＦ ＭＳ分析前にプライマーを除去するための分子量カットオフ膜を使用する 限外濾過段階により解決することができる。こうすると、第２の増幅産物の明確 な帰属が可能になる。 実施例１４ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによる神経芽細胞腫特異的入れ子Ｒ Ｔ増幅産物の検出方法 序論 神経芽細胞腫は主に乳幼児腫瘍であり、症例の６６％が５歳未満の幼時に発生 している。最も一般的な症状は腫瘍塊、骨の痛み又は過剰カテコールアミン分泌 に起因する症状である。稀 ではあるが、出生前に神経芽細胞腫が確認される場合もある(Ｒ．Ｗ．Ｊｅｎｎ ｉｎｇｓら，（１９９３）Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇｅｒｙ ２８：１１６８−１１ ７４)。神経芽細胞腫をもつ患者の約７０％は診断時に転移症状をもつ。予後は 診断時の年齢、臨床段階及び他のパラメーターに依存する。 診断目的では、例えば自己由来骨髄移植又は進行中の治療の制御下に腫瘍細胞 を検出する確実で高感度の方法に高い関心が寄せられている。 カテコールアミン合成は神経芽細胞腫細胞の特徴的性質であり、骨髄細胞はこ の活性を欠く（Ｈ．Ｎａｉｔｏら，（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２ ７：７６２−７６５）ので、神経芽細胞腫細胞又は骨髄転移はカテコールアミン の生合成の第１段階を触媒するヒトチロシン３−ヒドロキシラーゼ（Ｅ．Ｃ．１ ．１４．１６．２，ｈＴＨ）により同定することができる。 ｈＴＨの発現は逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により検出す ることができ、増幅産物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより分 析することができる。 材料と方法 細胞又は組織処理 培養細胞をペレット化し（１０分間、８０００ｒｐｍ）、ＰＢＳ（滅菌ＰＥＰ Ｃ水中１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，４．３ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏ，１．４ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄）で２回洗浄した。溶液が粘性になるまで ペレットを溶解／結合用緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０， ５００ｍＭ ＬｉＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ドデシル硫酸Ｌｉ，５ｍＭ ＤＴＴ）１ｍｌに再懸濁した。１ｍｌシリンジを使用してＤＮＡ剪断段階により 粘度を下げた。溶解液は−７５℃で保存してもよいし、そのまま更に処理しても よい。固体組織（例えば患者試料）は溶解前にホモジナイズする必要がある。 磁性オリゴ−ｄＴ（２５）ビーズの調製 細胞１×１０⁶個当たりビーズ１００μＬを保存用緩衝液から分離し、溶解／ 結合用緩衝液２００μＬで２回洗浄した。 ポリＡ⁺ＲＮＡの単離 調製したビーズに細胞溶解液を加え、５分間周囲温度でインキュベートした。 ビーズを２〜５分間磁気的に分離し、ＬＤＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ Ｈ８．０，０．１５Ｍ ＬｉＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ ＬｉＤＳ）０．５ｍＬで２回洗浄した 。 固相第１鎖ｃＤＮＡ合成 ポリＡ⁺ＲＮＡを含むビーズを逆転写混合物(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ Ｈ８．３，８ｍＭ ＭｇＣｌ₂，３０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＤＴＴ，１．７ ｍＭ ｄＮＴＰ、３Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素）２０μＬに再懸濁し、１時間４５℃ でインキュベートした（再懸濁段階は１０分間）。ビーズを逆転者混合物から分 離し、溶離用緩衝液（２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）５０μＬに再懸濁し、９ ５℃まで１分間加熱し、ＲＮＡを溶離した。ｃＤＮＡ第１鎖を含むビーズはその 後の処理に備えてＴＢ（０．０８９Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基，０．０８９Ｍ硼酸，０ ．２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０． １ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）又は７０％エタノールに保存することができる 。 入れ子ポリメラーゼ連鎖反応 ｃＤＮＡ第１鎖を含むビーズ１×ＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ，ｐＨ８．７５，１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，２ｍＭ Ｍｇ ＳＯ₄，０．１％ Ｔｒｉ ｔｏｎ Ｘ−１００，０．１ｍｇウシ血清アルブミン）て２回洗浄し、（各外部 プライマー１００ｐｍｏｌ、Ｐｆｕ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕ、 各ｄＮＴＰ ２００μＭ及び最終容量５０μＬのＰＣＲ緩衝液を含む）ＰＣＲ混 合物に再懸濁した。混合物を７２℃で１分間インキュベートし、３０サイクルＰ ＣＲ増幅した。入れ子反応のために、第１回ＰＣＲ産物１μＬを鋳型として（外 部プライマーを入れ子プライマーに変えた以外は上記と同様の）ＰＣＲ混合物に 加え、１分間９４℃、１分間６５℃及び１分間７２℃の温度プログラムを２０サ イクル実施した。 入れ子増幅産物の精製 １０，０００Ｄａカットオフ限外濾過装置を使用してプライマーと低分子量反 応副生物を除去する。限外濾過は７，５０００ｇで２５分間実施した。各ＰＣＲ 産物を精製するために、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍ−２８０ Ｄｙｎａｂｅ ａｄｓ（１０ｍｇ／ｍｌ）５０μＬを１×ＢＷ緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ，ｐＨ７．５，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，１Ｍ ＮａＣｌ）で２回洗浄し、限外 濾過膜に加え、静かに震盪しながら１５分間周囲温度でインキュベートした。上 清を取り出し、ビーズを １×ＢＷ緩衝液で２回洗浄した。ビーズに２５％水酸化アンモニウム５０μＬを 加え、周囲温度で１０分間インキュベートした。上清を取り出し、操作を繰り返 し、２つの上清をプールし、エタノール（１００％）３００μＬを加えた。３０ 分後にＤＮＡを１３，０００ｒｐｍで１２分間ペレット化し、ペレットを風乾し 、超純粋６００ｎｌに再懸濁した。 入れ子増幅産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ 試料３００ｎｌを飽和マトリックス溶液（５０％水性アセトニトリル中３−Ｈ ＰＡ：クエン酸アンモニウム＝１０：１モル比）５００ｎｌと混合し、周囲温度 で乾燥し、マススペクトロメーター（Ｖｉｓｉｏｎ ２０００，Ｆｉｎｉｇａｎ ＭＡＴ）に導入した。外部較正を使用してリフレクターモードで全スペクトル を測定した。 外部プライマー： ｈＴＧ１：ｄ（ＴＧＴ ＣＡＧ ＡＧＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＡＧＴ ＧＴ、配列 番号４７） ｈＴＨ２：ｄ（ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＴＣ ＴＴＣ ＣＣＧ ＧＴＡ ＧＣ、配列 番号４８ 入れ子プライマー： ｂｉｏ−ｈＴＨ ｄ（ｂｉｏ−ＣＴＣ ＧＧＡ ＣＣＡ ＧＧＴ ＧＴＡ ＣＣ Ｇ ＣＣ、配列番号４９）、質量：６４８５Ｄａ。 ｈＴＨ６：ｄ（ＣＣＴ ＧＴＡ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＡＴ ＣＴＣ、配 列番号５０）、質量：６４２２．２１Ｄａ。 ビオチン化１本鎖増幅産物の質量：１９２５３．６Ｄａ。 非ビオチン化１本鎖増幅産物の質量：１８７５８．２Ｄａ。 結果 ヒトチロシン３−ヒドロキシラーゼ（ｈＴＨ）特異的入れ子増幅産物（６１量 体）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを図６４に示す。１８７６３Ｄａのシ グナルは増幅産物の非ビオチン化鎖に対応する（計算値：１８７５８．２Ｄａ、 質量誤差：０．０２Ｄａ）。１０，０００Ｄａ未満及び３５，０００Ｄａを上回 るシグナルは夫々多電荷及び２量体増幅産物イオンに起因する。 産物は上述のように神経芽細胞腫細胞系（Ｌ−Ａ−Ｎ−１）の細胞１×１０⁶ 個から逆転写反応で誘導した固相ｃＤＮＡから得た。外部プライマー（ｈＴＨ１ 及びｈＴＨ２）を使用してｃＤＮＡ第１鎖に第１回ＰＣＲを実施し、このＰＣＲ のアリコ ートを鋳型とし、入れ子プライマー（ｂｉｏｈＴＨ及びｈＴＨ６）を使用して第 ２回ＰＣＲを実施した。入れ子増幅産物を精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分 析した。 図６４のスペクトルは入れ子ＲＴ−ＰＣＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析 を使用して神経芽細胞腫細胞を検出できることを立証するものである。 実施例１５ マススペクトロメトリーを使用するＲＥＴ癌原遺伝子コドン６３４突然変異の迅 速検出 材料と方法 プローブ ３個の対立遺伝子の各々におけるコドン６３４の存在をＲｓａＩ酵素消化、１ 本鎖コンホメーション多型性又はＳａｎｇｅｒシーケンシングにより確認した。 ５’−ビオチン化順（５’−ビオチン−ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＡＧ ＣＡ Ｔ ＡＣＧ ＣＡ−３’、配列番号５１）及び未修飾逆（５’−ＧＡＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＣＣ ＧＡＧ ＡＣＧ ＡＴ−３’、配列番号５２）プライマーを チューブ当たり各８ｐｍｏｌ使用してＴａｑ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ ｎｈｅｉｍ）でゲノムＤＮＡからＲＥＴ遺伝子のエキソン１１を増幅し（４０サ イクル）、増幅産物をＱｉａｇｅｎ“ＱＩＡｑｕｉｃｋ”キットで精製し、取り 込まれていないプライマーを除去した。Ｄｙｎａｌストレプトアビジンをコート した磁性ビーズ１０μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）に増幅産物１５μｌを固定化し、製 造業者のプロトコールを使用して変性させ、アンチセンス鎖を含む上清を捨て、 ｔｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＴＳ）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ）とＰｈａｒｍａｃｉａ ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰを使用してＰＲＯ ＢＥ反応を実施した。Ｈ₂Ｏ １３μＬ、ＴＳ緩衝液２μＬ、２ｍＭ ｄｄＡＴ Ｐ（又はｄｄＴＴＰ）２μＬ及び０．５ｍＭ ｄＧＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ( 又はｄＧＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＡＴＰ)０.２μＬに伸長プライマー(５'−ＣＧＧ ＣＴＧ ＣＧＡ ＴＣＡ ＣＣＧ ＴＧＣ ＧＧ−３’、配列番号５３）８ｐｍ ｏｌを加え、混合物を３０秒間９４℃に加熱した後、１０秒間９４℃及び４５秒 間５０℃を３０サイクル繰り返し、５分間９５℃でインキュベーション後、上清 をデカントし、１０ｍｇ／ｍＬグリコーゲン０．５μＬを加えてエタノール沈殿 により生成物を脱塩した。得られたペレットを７０％エタノールで 洗浄し、風乾し、Ｈ₂Ｏ １μＬに懸濁した。この懸濁液３００ｎＬをステンレ ス鋼試料プローブ上でＭＡＬＤＩマトリックス（１：１Ｈ₂Ｏ：ＣＨ₃ＣＮ中０． ７Ｍ ３−ヒドロキシピコリン酸、０．０７Ｍクエン酸アンモニウム）と混合し 、風乾した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｉｓｉｏｎ ２０００ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦをターゲット及び変換ダイノード夫々５及び２０ｋＶのリ フレクトロンモードで運転して質量スペクトルを測定した。報告実測質量（Ｍ_r （ｅｘｐ））は外部較正を使用して測定した中性分子の質量である。 診断産物の直接測定 コドン６３４を含む４４ｂｐ領域のＰＣＲ増幅条件は、Ｐｆｕポリメラーゼを 使用し、順プライマーの３’末端にリボヌクレオチドを加えた以外は上記と同一 とした（順、５’−ＧＡＴ ＣＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＧＡＣ ＧＡＧ Ｃ（配 列番号５４）−ｒｉｂｏ；逆、５’−ＧＣＧ ＧＣＴ ＧＣＧ ＡＴＣ ＡＣＣ ＧＴＧ Ｃ（配列番号５５））。産物固定化及び洗浄後、１２．５％ＮＨ₄Ｏ Ｈ８０μＬを加え、８０℃に一晩加熱し、４４量体（センス鎖）からプライマー を開裂し、２５量体を得た。高温のうちに上消をピペットで捨て、乾燥し、Ｈ₂ Ｏ ５０μＬ に再懸濁し、沈殿させ、再懸濁し、上述のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより測定 した。２５量体合成類似体のＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳスペクトルを従来記載されて いるように測定し（Ｌｉ，Ｙら，（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：２０ ９０−２０９６）、要約すると、ＤＮＡ１〜１０ｐｍｏｌを直接挿入プローブ上 でマトリックスと１：１で混合し、外部イオン源（陽イオンモデル）に入れ、３ ３７ｎｍ波長レーザーパルスを照射してイオン化し、ｒｆ専用四重極ロッドによ り６．５テスラ磁場に移し、衝突によりトラップした。１５秒遅延後、広帯域ｃ ｈｉｒｐパルスによりイオンを励起し、２５６Ｋデータ点を使用して検出した処 、５秒周期の時間ドメインシグナルが得られた。報告（中性）質量は電荷をもつ プロトンの質量（１．０１Ｄａ）を差し引いた後の最高頻度同位体ピークの質量 である。 結果 本実施例の第１のスキームは図６５に模式的に示すＰＲＯＢＥ反応を利用する 。突然変異部位の下流の相補的鋳型上の領域に特異的に結合するように２０量体 プライマーをデサインし、ビオチンで標識してストレプトアビジンをコートした 磁性ビー ズに固定化した鋳型にアニーリングすると、３種のデオキシヌクレオチド三リン 酸（ｄＮＴＰ）の混合物、ジ−ｄＮＴＰ（ｄｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ がＰＲＯＢＥプライマーに結合する（図６５）。プライマーはコドン６３４中の 可変塩基の種に特異的な一連の塩基分だけ伸長し、任意の反応混合物(例えばｄ ｄＡ＋ｄＴ＋ｄＣ＋ｄＧ)で３種の対立遺伝子に相当する３種の可能な伸長産物 が得られる（図６５）。 陰性対照（図６６）では、ｄｄＡＴＰ＋ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ｔ，Ｃ，Ｇ）を用いて ＰＲＯＢＥ反応を行うと、プライマーのＭ_r（ｅｘｐ）は６１３５から６７２６ Ｄａにシフトする（Δｍ＋５９１）。６４３２のピークが存在しないのでＣ→Ａ 突然変異の可能性はなく（図６５）、観察される単一ピークの質量はＣ→Ａ突然 変異体に予想されるＡ₃ＴＣ₂ＧからＴ−ｄｄＡ伸長した質量（Ｍ_r（ｃａｌｃ） ６７３６，−０．１５％誤差）よりもＣ−ｄｄＡ伸長した質量（Ｍ_r（ｃａｌｃ ）６７２１，＋０．０７誤差）に近い。ｄｄＡ及びｄｄＴ反応データをまとめる と、陰性対照は予想通りコドン６３４でホモ接合正常であることが明らかである 。 患者１のｄｄＡ反応も野生型とＣ→Ｔ突然変異の予想値の間 に単一ピーク（Ｍ_r（ｅｘｐ）＝６７３１）を生じる（図６５ｂ）。しかし、ｄ ｄＴ反応はヘテロ接合野生型（Ｍ_r（ｅｘｐ）８２４９，＋０．０４％質量誤差 ）／Ｃ→Ｔ突然変異体（Ｍ_r（ｅｘｐ）６４２８Ｄａ，＋０．０８％質量誤差） に一致する２個の明白に分解したピークを生じる。患者２では、図６６ｃのｄｄ Ａ産物対はヘテロ接合Ｃ→Ａ（Ｍ_r（ｅｘｐ）６４３１，−０．０６％質量誤差 ）／正常（Ｍ_r（ｅｘｐ）６７１９，−０．０３％質量誤差）対立遺伝子に相当 する。ｄｄＴ反応はこれを裏付け、未分解野生型及びＣ→Ａ対立遺伝子に一致す る単一ピークが８２６４Ｄａで測定される。図６６ａ及び６６ｂを比較すると二 重反復実験の意義がわかり、患者１ではｄｄＡ反応からの６７２６のピークは１ 種にしか相当しないが、患者１からの同様のピークは実際には質量が１５Ｄａ異 なる１対の未分解ピークである。 点突然変異検出の代替スキームは診断産物質量の直接測定による対立遺伝子の 区別である。ＲＥＴ６３４部位を含む４４量体をＰＣＲにより生成し、その３’ 末端のリボヌクレオチドのＮＨ₄ＯＨ開裂により１９量体センスプライマーを除 去した。 図６７はＲＥＴ６３４突然変異部位を含む短い増幅産物の合 成類似体の一連のＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳスペクトルを示す。図６７ａ〜ｃ及び６ ７ｄ〜ｆは夫々ホモ接合及びヘテロ接合遺伝子型である。野生型遺伝子型に最高 頻度の同位体ピークを使用して内部較正を行い、この（外部）較正を５個の他の スペクトルに適用すると、各々２０ｐｐｍよりも良好な質量精度が得られた。対 立遺伝子の質量のみによる区別は１６．００（図６７ｄ）、２５０１（図６７ｅ ）又は９．０１Ｄａ（図６５ｆ）の差のある成分のヘテロ接合混合物でも確実で ある。小さいＤＮＡ質量シフトの認識を突然変異の有無の診断の基礎とする場合 には、高性能ＭＳの価値は明白である。最近では遅延抽出（ＤＥ）技術の再導入 により短いＤＮＡでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの性能が改善されており（Ｒｏｓｋｅｙ ，Ｍ．Ｔ．ら，（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：９４１−９４６）、混 合塩基５０量体で＞１０³の分解能（ＲＰ）が報告されており、可変位置にＣ又 はＴ（Δｍ１５Ｄａ）をもつ１対の３１量体が基線付近で分解している。このよ うに、ＤＥ−ＴＯＦ−ＭＳはヘテロ接合体の個々の成分の分離に必要なＲＰを提 供することがわかっている。しかし、ＤＥでもＴＯＦによるＤＮＡ質量測定精度 は外部較正を使用すると一般に０．１％（８ｋＤａで８Ｄａ）であ り、診断を誤るに十分高い値である。空間電荷誘導周波数シフト（Ｍａｒｓｈａ ｌｌ，Ａ．Ｇ．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２１５Ａ〜２２９Ａ ）の可能性にも拘わらず、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ質量誤差が０．００５％（８ｋ Ｄａで０．４Ｄａ）以上になることは稀であり、内部較正が不要である。 本発明のＤＮＡ点突然変異法は単塩基突然変異の分析のみならず、単一又は多 重塩基挿入又は欠失の検出や、２、３又は３個のタンデム塩基反復の定量にも適 用できる。ＰＲＯＢＥ反応は比較的低性能のＥＳＩ又はＭＡＬＤＩ装置により分 析可能な産物を生じ、短い増幅産物質量の直接測定は更に直接的な突然変異検出 手段であるため、ＦＴＭＳで利用可能な高性能ＭＳへの関心の高まりと共に益々 普及されると思われる。 実施例１６ 酸レービル共有二官能性トリチルリンカーによる核酸の固体支持体固定化 標準方法に従ってアミノ結合ＤＮＡを調製及び精製した。一部（１０当量）を ｓｐｅｅｄｖａｃで蒸発乾涸し、無水ＤＭＦ／ピリジン（９：１；０．１ｍｌ） に懸濁した。これに塩化ク ロロトリチル樹脂（１当量、１．０５μｍｏｌ／ｍｇ添加）を加え、混合物を２ ４時間震盪した。樹脂試料を抽出し、８０％ＡｃＯＨを使用してこれを脱トリチ ル化し、２６０ｎｍの吸光度を測定することにより添加量を調べた。添加量は約 １５０ｐｍｏｌ／ｍｇ樹脂であった。 ８０％酢酸中で開裂半減期は実質的に５分未満であることが判明したが、これ に対してトリチルエーテルを利用したアプローチの半減期はパラ及びメタ置換二 官能性ジメトキシトリチルリンカーで夫々１０５及び３９分である。ＤＮＡをク ロロトリチル樹脂から開裂するにはヒドロキシピコリン酸マトリックス単独で十 分であることも先行結果から分かった。 実施例１７ 疎水性トリチルリンカーによる核酸の固体支持体固定化 慣用トリチル−ｏｎ ＤＮＡ合成を使用してプライマーに５’−ジメトキシト リチル基を付けた。 フィルターチップに入れたオリゴ精製カートリッジからのＣｌ８ビーズ（０． ２ｍｇ）をアセトニトリルで洗浄した後、ＤＮＡ溶液（２５μｌ中５０ｎｇ）で フラッシュした。次にこれをクエン酸アンモニウム緩衝液（７０ｍＭ，２５０μ ｌ）中５％ アセトニトリルで洗浄した。ＤＮＡをＣｌ８から分離するために、ビーズを４０ ％アセトニトリル水溶液（１０μｌ）で洗浄し、Ｓｐｅｅｄｖａｃで約２μｌま で濃縮した。次に試料をＭＡＬＤＩにかけた。 その結果、疎水性相互作用を解離するには約＞３０％のレベルのアセトニトリ ル／水で十分であることが判明した。ＭＡＬＤＩで使用したマトリックスは５０ ％アセトニトリルを含むので、（ＭＡＬＤＩプロセス中に除去したトリチル基を 用いて）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用してＤＮＡを支持体から遊離させ、有 効に検出することができる。 図６９は疎水性トリチルリンカーによる核酸固定化の模式図である。 実施例１８ ストレプトアビジン−イミノビオチンによる核酸の固体支持体固定化 実験手順 製造業者に推奨される条件に従って、３’−又は５’−アミノリンカーにより ２−イミノビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ）をオ リゴヌクレオチドに結合し た。反応の完了をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析により確認し、産物を逆相ＨＰ ＬＣにより精製した。 各反応毎にストレプトアビジンをコートした磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ製品Ｄｙ ｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）０．１ｍｇを１Ｍ ＮａＣｌと５０ｍＭ炭酸アンモニウム（ｐＨ９．５）の存在下に対応するオリゴ ８０ｐｍｏｌと室温で１時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドと結合し たビーズを５０ｍＭ炭酸アンモニウム（ｐＨ９．５）で２回洗浄した。次に、ビ ーズを３−ＨＰＡマトリックス２μｌ中で室温で２分間インキュベートした。上 清の０．５μｌアリコートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに加えた。ビオチン置換実験で は、遊離ビオチン１．６ｍｏｌ（結合したオリゴの８０倍）を５０ｍＭクエン酸 アンモニウム１μｌに溶かしてビーズに加えた。５分間室温でインキュベーショ ン後、３−ＨＰＡマトリックス１μｌを加え、上清０．５μｌをＭＡＬＤＩ−Ｔ ＯＦ ＭＳに加えた。結合したイミノビオチンオリゴの回収を最大にするために 、上記処理からのビーズをもう一度３−ＨＰＡマトリックス２μｌと共にインキ ュベートし、上清０．５μｌをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳに加えた。マトリック ス単独及び遊離ビ オチン処理により、図７０及び７１に示すようにストレプトアビジンビオチンか らイミノビオチンオリゴが定量的に遊離した。 実施例１９ ループプライマーオリゴ塩基慎重を使用する突然変異分析 材料と方法 ゲノムＤＮＡ。ゲノムＤＮＡは健康個体と鎌状赤血球貧血患者から得た。野生 型及び突然変異対立遺伝子は標準Ｓａｎｇｅｒシーケンシングにより慣用方法で 決定した。 ＰＣＲ増幅。ストレプトアビジンをコートしたビーズで捕獲する後期精製段階 を実施せずに反応産物を使用するようにβ−グロビンの一部のＰＣＲ増幅を設定 及び至適化した。順プライマーとしてｌｏｏｐ−ｃｏｄ５ ｄ（ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＣＧ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＴＣ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＧＣ、配列番号５８）及びビオチン化逆プライマーとしてβ−１１ −ｂｉｏ ｄ（ＴＣＴ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＣＣ ＣＡＧ、配 列番号５９）を使用してＬＯＯＰ−ＰＲＯＢＥ反応のターゲット増幅を実施した 。ｌｏｏｐ−ｃｏｄ５プライマー中の下線を引いたヌクレオチドは不変ＣｆｏＩ 制限部位をアンプリコンに導入するように突然 変異させており、イタリック体で示したヌクレオチドは増幅産物の一部に相補的 である。総ＰＣＲ容量は５０μｌとし、ゲノムＤＮＡ２００ｎｇ、Ｔａｑ−ポリ メラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ＃１５９６５９４ ）１Ｕ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ＃１２７７０４９）及び各プライマー１０ｐｍｏ ｌを含むものとした。５分間９４℃の後、３０秒間９４℃、３０秒間５６℃、３ ０秒間７２℃を４０サイクルと、２分間７２℃最終伸長のサイクリング条件を使 用してβ−グロビン遺伝子の特定フラグメントを増幅した。 ビオチン化鋳型の捕獲及び変性。ストレプトアビジンをコートした常磁性ビー ズ（１０ｍｇ／ｍｌ；Ｄｙｎａｌ，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ストレプト アビジンＣａｔ＃１１２．０６）１０μｌを５×結合溶液（５Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ， ０．３ＭＮＨ₄ＯＨ）で処理し、４０μｌＰＣＲ容量に加えた（増幅産物１０μ ｌは電気泳動を調べるためにとっておいた）。３０分間３７℃でインキュベーシ ョン後、上清を捨てた。捕獲した鋳型を１００ｍＭ ＮａＯＨ５０μｌで５分間 周囲温度で変性させた後、５０ｍＭ ＮＨ₄ＯＨ５０μｌで１回、１０ｍＭ Ｔ ｒｉｓ． Ｃｌ（ｐＨ８．０）１００μｌで３回洗浄した。１本鎖ＤＮＡをＰＲＯＢＥ反応 の鋳型として使用した。 プライマーオリゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）反応。酵素としてＳｅｑｕｅｎａｓ ｅ ２．０（ＵＳＢ Ｃａｔ＃Ｅ７０７７５Ｚ、緩衝液を含む）と、Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ製品ｄＮＴＰ及びｄｄＮＴＰ（Ｃａｔ＃１２７７ ０４９及び１００８３８２）を使用してＰＲＯＢＥ反応を実施した。ｄＮＴＰ（ ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）とｄｄＡＴＰの比は１：１とし、合計使用濃度 は各ヌクレオチド５０μＭとした。１倍Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ−緩衝液５μｌの添 加後、ビーズを５分間６５℃、１０分間３７℃でインキュベートした。この時間 中に部分的に自己相補的なプライマーがターゲット部位にアニールした。１００ ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）０．５μｌ、ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ溶液３． ５μｌ及びＳｅｑｕｅｎａｓｅ（０．８Ｕ）０．５μｌの添加後に酵素反応が開 始し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、ビーズを１倍ＴＥ緩衝液 （１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で１回洗浄した。 ＣｆｏＩ制限消化。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ から購入した１倍緩衝液Ｌ中１０Ｕ ＣｆｏＩを使用して総容量５μｌ中で制限 酵素消化を実施した。インキュベーション時間は３７℃で２０分間とした。 診断産物のマススペクトロメトリー分析用条件付け 制限消化後、上清をＨ₂Ｏ ４５μｌ、３Ｍ酢酸ＮＨ₄（ｐＨ６．５）１０μｌ 、グリコーゲン（水中１０ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃Ｇ１７６５）０． ５μｌ及び無水エタノール１１０μｌで１時間室温で沈殿させた。１３，０００ ｇで１０分間遠心分離後、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、１８Ｍｏｈｍ ／ｃｍ Ｈ₂Ｏ２μｌに再懸濁した。ビーズを０．７Ｍクエン酸ＮＨ₄ １００μ ｌ、次いで０．０５Ｍクエン酸ＮＨ₄１００μｌで洗浄した。ビーズを５０ｍＭ ＮＨ₄ＯＨ ２μｌ中で８０℃に２分間加熱することにより診断産物を得た。 試料調製及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー分析。 ビーズを試料ターゲット上で５０ｍＭ ＮＨ₄ＯＨ中で加熱後、再懸濁したＤ ＮＡ／グリコーゲンペレット又は上清０．３μｌとマトリックス溶液（１：１Ｈ₂ Ｏ：ＣＨ₃ＣＮ中０．７Ｍ３−ヒドロキシピコリン酸、０．０７Ｍ二塩基性クエ ン酸アン モニウム）０．６μｌを混合することにより試料調製を実施し、風乾した。未改 造Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｖｏｙａｇｅｒ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのソース領域 に試料ターゲットを自動導入し、ターゲット及び変換ダイノード夫々５及び２０ ｋＶの遅延抽出リニアモードで運転した。理論分子量（Ｍ_r（ｃａｌｃ））は原 子組成から計算し、報告実測（Ｍ_r（ｅｘｐ））値は１プロトン化形態の値であ る。 結果 鎌状赤血球貧血を誘発するヒトβ−グロビン遺伝子のコドン６の最も一般的な 突然変異の検出にＬＯＯＰ−ＰＲＯＢＥを適用した。方法の各段階を図７２に模 式的に示す。コドン６の分析では、ビオチン化逆プライマーβ１１ｂｉｏとＣｆ ｏＩ制限部位を導入するように修飾したプライマーｌｏｏｐ−ｃｏｄ５を使用し てＰＣＲによりβ−グロビン遺伝子の一部を増幅した（図７２ａ）。増幅産物は １９２ｂｐ長であった。ＰＣＲ後に、上述のようにストレプトアビジンをコート した常磁性粒子に増幅産物を結合した。２本鎖増幅産物の変性によりアンチセン ス鎖を単離した（図７２ｂ）。短時間の熱変性段階と３７℃のインキュベーショ ンにより相補的３’末端の分子内アニーリング を実施した。アンチセンス鎖の３’末端はこうして部分的に２本鎖になった（図 ７２ｃ）。アンチセンス鎖の自己アニールした３’末端の下流のＤＮＡを分析す るために、ｄｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを使用してプライマーオ リゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）を実施した（図７２ｄ）。こうすると、分析個体の 遺伝子型に特異的な長さの種々の産物が生成される。これらの診断産物の長さを 決定する前に、伸長産物の５’を切断するＣｆｏＩ制限エンドヌクレアーゼと共 にＤＮＡをインキュベートした。この段階でステムループは鋳型ＤＮＡから遊離 するが、伸長産物は鋳型に付着し続ける。その後、伸長産物を加熱して鋳型鎖か ら変性させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより分析する。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は非較正装置で実施したので、実測値と予測値の質量 差は理論計算よりも約０．６％高かった。しかし、得られた結果は反復実験内で 確実且つ再現可能であった。制限消化後に分析した全上清でステムループを検出 することができた。遺伝子型から独立してステムループは全分析で分子量約８１ ５０Ｄａ（予測値８１１１Ｄａ）であった。図７３ａに１例を示す。この図面で 質量４０７６Ｄａの第２のピークはス テムループの２電荷イオンである。図７３ｂ〜７３ｄは夫々の挿入図に示すよう な異なる遺伝子型の分析を示す。ＨｂＡは野生型遺伝子型であり、ＨｂＣ及びＨ ｂＳは鎌状赤血球病を誘発するβ−グロビン遺伝子のコドン６における２種の異 なる突然変異である。野生型状態では、分子量４２４７Ｄａの単一ピークと６６ ９６Ｄａの別のピークが検出される（図７３ｂ）。後者はＰＣＲ反応で使用され なかったビオチン化ＰＣＲプライマー（β−１１−ｂｉｏ）に対応し、実験によ っては除去されている。前者はＨｂＡの診断産物に対応する。ＨｂＳ形質をもつ ２個の各ＤＮＡ分子とヘテロ接合性鎌状赤血球病化合物（ＨｂＳ／ＨｂＣ）を分 析しても明白に予想通りの結果が得られる（図７３ｃ及び７３ｄ）。 結論として、ＬＯＯＰ−ＰＲＯＢＥは突然変異、特に主要疾患を誘発する突然 変異又は一般的多型性の強力な検出手段である。この方法は特定の突然変異検出 用試薬を使用する必要がないため、プロセスが簡単になり、自動化し易い。分析 する特定伸長産物はプライマーから開裂されるので、慣用方法に比較して短い。 更に、アニーリング効率は添加したプライマーのアニーリングよりも高いので、 より多量の産物を生成できる。この 方法は多重化及び種々の検出スキーム（例えば単塩基伸長、オリゴ塩基伸長及び シーケンシング）に適合可能である。例えば、ループ−プライマーの伸長を使用 して高多型性領域内で短い診断シーケンシングラダーを生成し、例えばＨＬＡ型 別又は耐性及び種型別（例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌ ｏｓｉｓ）を実施することができる。 実施例２０ ＣＫＲ−５のＴ７−ＲＮＡポリメラーゼ依存性増幅及びＭＡＬＤＴ−ＭＳによる 検出 材料と方法 ゲノムＤＮＡ。ヒトゲノムＤＮＡは健康な個体から得た。 ＰＣＲ増幅及び精製。センスプライマーｄ（ＡＣＣ ＴＡＧ ＣＧＴ ＴＣＡ ＧＴＴ ＣＧＡ ＣＴＧ ＡＧＡ ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＣＡＧ ＣＴＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＴＡ Ｃ（配列番号６ ０））としてｃｋｒＴ７ｆを使用してＣＫＲ−５遺伝子の一部のＰＣＲ増幅を行 った。下線配列はＣＫＲ−５に相同の配列に対応し、太字配列はＴ７−ＲＮＡポ リメラーゼプロモーター配列に対応し、イタリック体の配列はランダムに選択し た。アンチセンスプラ イマーｄ（ＡＡＣ ＴＡＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＴＧＣ ＡＣＡ ＡＣＡ（配列番 号６１））としてｃｋｒ５ｒを使用した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製キット（Ｑｉａ ｇｅｎ，ｃａｔ＃２８１０４）を使用して増幅産物の精製と取り込まれなかった ヌクレオチドの除去を行った。最終ＰＣＲ容量は５０Aμｌとし、ゲノムＤＮＡ ２００ｎｇ、Ｔａｑ−ポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ ，Ｃａｔ＃１５９６５９４）１Ｕ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭ ｄＮ ＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ＃１２７７０４９）及 び各プライマー１０ｐｍｏｌとした。５分間９４℃の後、４５秒間９４℃、４５ 秒間５２℃、５秒間７２℃を４０サイクルと、５分間７２℃の最終伸長からなる サイクリング条件を使用してＣＫＲ−５遺伝子の特定フラグメントを増幅した。 Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ条件。精製したＤＮＡの３分の１（約６０ｎｇ）を Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ反応で使用した。（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ，Ｃａｔ＃８８１７６７）。反応は試薬に含まれる緩衝液を使用して製 造業者の条件に従って３７℃で２時間実施した。最終反応容量は２０μｌとし、 ＲＮアーゼ（３３Ｕ／μｌ）０．７μｌを加えておい た。伸長反応後、酵素を５分間６５℃でインキュベートして不活化した。 ＤＮＡ消化及び診断産物のマススペクトロメトリー分析用条件付け。 無ＲＮアーゼＤＮアーゼＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ｃａ ｔ＃７７６７５８）を不活化Ｔ７混合物に加えて室温で２０分間インキユベート することにより鋳型ＤＮＡを消化した。グリコーゲン（水中１０ｍｇ／ｍｌ、Ｓ ｉｇｍａ，Ｃａｔ＃Ｇ１７６５）１μｌ、３Ｍ酢酸ＮＨ₂（ｐＨ６．５）１／１ ０容量及び無水エタノール３容量を加え、室温で１時間インキュベートすること により沈殿させた。１３，０００ｇで１０分間速心分離後、ペレットを７０％エ タノールで洗浄し、１８Ｍｏｈｍ／ｃｍ Ｈ₂Ｏ３μｌに再懸濁した。１μｌを アガロースゲルで分析した。 試料調製及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー分析。 試料ターゲット上でマトリックス溶液（１：１Ｈ₂Ｏ：ＣＨ₃ＣＮ中０．７Ｍ ３−ヒドロキシピコリン酸、０．０７Ｍ二塩基性クエン酸アンモニウム）０．６ μｌを再懸濁ＤＮＡ／グリコーゲンペレット０．３μｌと混合することにより試 料調製を 実施した。試料ターゲットを未改造Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＶＩＳＩＯＮ２０００ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのソース領域に自動導入し、５ｋＶのリフレクトロンモード で運転した。理論分子量は原子組成から計算し、報告実測値は１プロトン化形態 の値である。 結果 ケモカインレセプターＣＫＲ−５はＨＩＶ−１における主要コレセプターとし て同定されている（例えばＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＷＯ ９６／３９４３７；Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．らＳｃｉｅｎｃｅ ２７５：１２６１参照 ）。ＨＩＶ−１血清陰性集団の１６％には３２ｂｐ欠失を特徴とする突然変異対 立遺伝子が認められるが、ＨＩＶ−１血清陽性集団ではこの対立遺伝子の頻度は ３５％低い。この対立遺伝子のホモ接合個体はＨＩＶ−１耐性であると予想され る。Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ依存性増幅を利用してケモカインレセプターＣＫ Ｒ−５のこの特異領域を同定した（図７４）。慣用ＰＣＲを使用してヒトゲノム ＤＮＡを増幅した。センスプライマーは、ポリメラーゼ結合を助長する２４塩基 のランダム配列とＴ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むように改変 した（図７５）。推定転写開始はプロモーター配列の５’の最初の 塩基である。ｃｋｒ５ｒをアンチセンスプライマーとして使用した。ＰＣＲ条件 は上記に要約した通りである。野生型対立遺伝子に由来する増幅産物は７５ｂｐ 長である。Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製キットを使用してプライマーと ヌクレオチドを増幅産物から分離した。精製物の３分の１をＴ７−ＲＮＡポリメ ラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に用いた。鋳型ＤＮＡの干渉を避けるために 、無ＲＮアーゼＤＮアーゼＩを加えて消化した。開裂したＤＮＡ上清中に残し、 ＲＮＡを沈殿させた。再溶解したＲＮＡの一部をアガロースゲルで分析し、残り の試料はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に用いた。産物の予想計算質量は２４５６０Ｄ ａである。概算質量２５３７８．５Ｄａに対応する主要ピークを観察することが できる。このピークは非常に広いので、分子量を正確に測定することはできなか った。このピークは残留ＤＮＡ鋳型には対応しない。第１に鋳型ＤＮＡは消化さ れ、第２に、ＤＮＡ鎖は夫々質量２３０３６．０及び２３１７４Ｄａをもつと思 われるからである。 本実施例から明らかなように、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはターゲットＤＮＡ を有効に増幅することができる。生成したＲＮＡはマススペクトロメトリーによ り検出することができる。 ＲＮＡポリメラーゼにより特異的に取り込まれるが、それ以上伸長しない修飾（ 例えば３’−デオキシ）リボヌクレオチドと組み合わせると、本方法は鋳型ＤＮ Ａの配列を決定するために適用することができる。 実施例２１ ＲＮＡエンドヌクレアーゼ消化産物のＭＡＬＤエマススペクトロメトリー 材料 合成ＲＮＡ（試料Ａ：５’−ＵＣＣＧＧＵＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵＧＡＧ ＧＡＣ−３’（配列番号６２）；試料Ｂ：５’−ＧＵＣＡＣＵＡＣＡＧＧＵＧＡ ＧＣＵＣＣＡ−３’（配列番号６３）；試料Ｃ：５’−ＣＣＡＵＧＣＧＡＧＡＧ ＵＡＡＧＵＡＧＵＡ−３’（配列番号６４））試料はＤＮＡ技術(Ａａｈｕｓ， デンマーク)から得、変性ポリアクリルアミドゲル（Ｓｈａｌｅｒ，Ｔ．Ａ．ら （１９９６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：５７６６−５７９）で精製した。ＲＮ アーゼＴ₁（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、Ｕ₂（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、Ａ（Ｂｏ ｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）及びＰｈｙＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）はそ れ以上精製せずに使用した。ストレプトアビジン をコートした磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖ ｉｄｉｎ，Ｄｙｎａｌ）は０．１％ＢＳＡ及び０．０２％ＮａＮ₃を含むリン酸 緩衝塩類（ＰＢＳ）にビーズ６〜７×１０₈個／ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）を溶か した懸濁液として使用した。３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）（Ａｌｄ ｒｉｃｈ）は、他の文献（Ｌｉｔｔｌｅ，Ｄ．Ｐ．ら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，２３１８−２３２２）により詳 細に説明されているように使用前に別の脱塩段階により精製した。 方法 ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応。（制限酵素ＢａｍＨＩで直鎖化した）プラスミド ｐＵＴＭＳ２をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で転写することによ り５’−ビオチン化４９ｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物（配列番号６５）：Ａ ＧＧＣＣＵＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＧＧＡＡＡＧＡＣＣＡＵＧＧＵＣＣＣＵＮＡＵ ＣＵＧＣＣＧＣＡＧＧＡＵＣを生成した。転写反応には、１ｕ／μｌ ＲＮＡガ ード（Ｒｎａｘインヒビター、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．５ｍＭ ＮＴＰ、１ ．０ｍＭ ５’−ビオチン−ＡｐＧジヌクレオチド、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ（ｐＨ８．０）、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭスペルミジン及び１０ｍＭ Ｄ ＴＴを含む５０μｌ容量中で鋳型ＤＮＡ３μｇとＴ７ＲＮＡポリメラーゼ５０ｕ を使用した。３７℃で１時間インキュベーションを行った後、Ｔ７ＲＮＡポリメ ラーゼ５０単位の別のアリコートを加え、インキュベーションを更に１時間続け た。混合物を２Ｍ酢酸ＮＨ₄に調整し、エタノール１容量とイソプロパノール１ 容量を加えてＲＮＡを沈殿させた。沈殿したＲＮＡを４℃で９０分間２０，００ ０×ｇで遠心分離して集め、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、８ Ｍ尿素に再溶解した。他の文献（Ｓｈａｌｅｒ，Ｔ．Ａ．ら（１９９６）Ａｎａ ｌ．Ｃｈｅｍ．６８：５７６−５７９）に記載されているように変性ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動により更に精製した。５’−ビオチン化転写産物と非ビオ チン化転写産物の比は約３：１であった。 リボヌクレアーゼアッセイ。選択したＲＮアーゼで部分消化するために、表Ｖ ＩＩに要約するような種々の酵素濃度及びアッセイ条件を使用した。各酵素の溶 剤は製造業者の指示に従って選択した。合成ＲＮＡ試料とｉｎ ｖｉｔｒｏ転写 産物の濃度は５〜１０×１０^-6Ｍに調整した。 アッセイの０．６μｌアリコートを３ＨＰＡ溶液１．５μｌと混合することに より選択時間で反応を停止した。次に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に備えて溶剤を冷 気流中で蒸発させた。 等容量（２．０μｌ）の２５％水酸化アンモニウムとＲＮＡ試料（５〜１０× １０^-6Ｍ）を６０℃で混合することにより制限アルカリ加水分解を実施した。選 択時間に１μｌアリコートを分取し、冷気流中で乾燥した。これらの試料の場合 には、まず冷気流中で消化産物を乾燥してからマトリックス溶液１．５μｌとＮ Ｈ₄＋負荷カチオン交換ポリマービーズ０．７μｌを加えることが重要であるこ とが分かった。 ５’−ビオチン化フラグメントの分離。ストレプトアビジンをコートした磁性 ビーズを使用し、部分ＲＮアーゼ消化後にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物の５’−ビ オチン化フラグメントを分離した。５’−ビオチン−ｐＡｐＧ−ジヌクレオチド により開始された転写反応中にこの試料中のビオチン部分が導入された。使用前 に、ビーズを２×結合及び洗浄用（ｂ＆ｗ）緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．２）で２回洗浄し、２×ｂ＆ ｗ緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。上記プロトコールを使用してＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物約２５ｐｍｏｌをＲＮアーゼＵ２で消化した。１０ｍ Ｍトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ ＣＤＴＡ）を含む９５％ホルムアミド３μｌを９０℃で５分間加えて消化を停止 した後、氷冷した。次いで、消化産物６μｌをビーズ懸濁液６μｌ及びｂ＆ｗ緩 衝液３μｌと共に室温で１５分間インキュベートすることによりビオチン化フラ グメントの捕獲を行った。製造業者により明示されているようにビーズ１ｍｇ当 たりビオチン化オリゴヌクレオチド２００ｐｍｏｌのビーズ結合能であるので、 ほぼ２倍のオリゴヌクレオチドを使用してビーズの完全な添加を確保した。上清 を取り出し、ビーズをＨ₂Ｏ ６μｌで２回洗浄した。ＣＤＴＡと９５％ホルム アミドを９０℃に５分間加熱した。溶剤とホルムアミドの蒸発後、フラグメント ≦２．５ｐｍｏｌをＨ₂Ｏ ２μｌに再懸濁し、上述のようにＭＡＬＤＩ−ＭＳ により分析した。 ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用試料調製。３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）を超 純水に約３００ｍＭの濃度に溶かした。従来詳細に記載されているように（Ｌｉ ｔｔｌｅ，Ｄ．Ｐ．ら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ．Ｓ． Ａ．９２：２３１８−２３２２）金属カチオンをＮＨ₄ ⁺と交換した。分析物溶液 の０．６μｌのアリコートを平坦不活性金属支持体上で３−ＨＰＡ１．５μｌと 混合した。ＮＨ₄ ⁺負荷カチオン交換ポリマービーズの溶液０．７μｌを加え、試 料溶液中と支持体表面上に残っているアルカリカチオンを除去した。溶剤蒸発中 に、調製物の内部に蓄積したビーズは分析に使用されず、ピペットチップで容易 に除去した。 装置。典型的なＶｉｓｉｏｎ ２０００（ＴｈｅｒｍＢｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ，Ｈｅｍｅｌ，Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，英国）リフレクトロン飛行時間マススペク トロメーターをマススペクトロメトリーに使用した。イオンは周波数３倍ＮＤ： ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ，５ｎｓ；Ｓｐｅｋｔｒｕｍ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌ ｉｎ，ドイツ）の照射により生成し、１０ｋｅＶまで加速した。遅延イオン抽出 を使用するとシグナル対ノイズ比及び／又はシグナル強度が実質的に増加するの で、図面に示すスペクトルは遅延イオン抽出を使用して獲得した。システムの等 価飛行経路長は１．７ｍであり、基本圧力は１０^4-Ｐａである。高質量イオンを 有効に検出するために変換ダイノードを取り付けたディスクリートダイノード二 次電子マルチプライヤー（Ｒ ２３６２，Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）でイオンを検出した。変 換ダイノードに加えるイオンの総衝撃エネルギーは検出する質量に応じて１６〜 ２５ｋｄＶの範囲の値に調節した。ＳＥＭの前置増幅出力シグナルは４００ＭＨ ｚまでのサンプリング速度でＬｅＣｒｏｙ９４５０トランジェントリコーダー（ ＬｅＣｒｏｙ，Ｃｈｅｓｔｎｕｔ Ｒｉｄｇｅ，ＮＹ，米国）によりディジタル 化した。保存とその後の評価のために、特注ソフトウェア（ＵＬＩＳＳＥＳ）を 搭載したパーソナルコンピューターにデータを移した。全スペクトルは陽イオン モードで測定した。図面に示すスペクトルは各々２０〜３０の単照射スペクトル の平均である。 結果 ＲＮアーゼの特異性。塩基特異的ＲＮＡ開裂とＭＡＬＤＩ−ＭＳを併用するに は、選択した酵素の活性及び特異性を維持するように至適化した反応条件と、Ｍ ＡＬＤＩの境界条件を満たすことが必要である。不適合の主因は、従来記載され ている反応に一般に使用されているリン酸Ｎａ、クエン酸Ｎａ又は酢酸ＮａやＥ ＤＴＡ等のアルカリイオン緩衝液がＭＡＬＤＩ試料調製を妨げ、マトリックス結 晶化及び／又は分析物取り込みを損 なうと予想されるためである。これに対して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ又はアンモニウ ム塩緩衝液はＭＡＬＤＩ適合性である（Ｓｈａｌｅｒ，Ｔ．Ａ．ら（１９９６） Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：５７６−５７９）。更に、試料中のアルカリ塩は分 析物の多重塩の不均一混合物を形成し、リン酸基数の増加と共に問題は増加する 。このような混合物は質量分解能及び精度とシグナル対ノイズ比を低下させる（ Ｌｉｔｔｌｅ，Ｄ．Ｐ．ら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２３１８−２３２２；Ｎｏｒｄｈｏｆｆ，Ｅ．，Ｃｒａｍ ｅｒ，Ｒ．Ｋａｒａｓ，Ｍ．，Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｆ．，Ｋｉｒｐｅｋａｒ ，Ｆ．，Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｋ．及びＲｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，Ｐ．（１９ ９３）Ｎｕｃｌｉｅｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３３４７−３３５７）。 従って、文献に記載されている条件を多少変更してＲＮアーゼ消化を行った。こ れらの条件は上記表ＶＩＩに要約した。ＲＮアーゼＴ₁、Ａ、ＣＬ₃及びクサチビ ンには、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６〜７．５）を緩衝液として使用した。２０ｍ Ｍ ＤＡＣはＲＮアーゼＵ₂及びＰｈｙＭの最大活性に推奨されているｐＨ５を 提供する。濃度１０〜２０ｍＭのこれらの化合物はＭＡＬＤＩ分 析をさほど妨げないことが判明した。これらの条件下で選択リホヌクレオチドの 特異性を試験するために、異なるヌクレオチド配列をもつ３種の合成２０〜２５ 量体ＲＮＡ分子を消化した。 図７７のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルはＲＮアーゼＴ₁、Ｕ₂、ＰｈｙＭ、Ａに よる部分消化とアルカリ加水分解後に得られた２５ｎｔ ＲＮＡの５種の異なる 開裂パターン（Ａ〜Ｅ）を示す。これらのスペクトルは、配列を最適にカバーす るように実験により決定したインキュベーション時間後にアッセイから分取した アリコートから得た。得られた試料はマススペクトロメトリー前に断片化しなか ったので、その時点で各ＲＮアーゼにより生成された全フラグメントを含んでい る。実際に、開裂の均一性は特定ホスホジエステル結合に優先的な攻撃により変 化し得る（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ，Ｈ．，Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．，及びＧｉ ｌｂｅｒｔ，Ｗ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４，１ ９５７−１９７８；Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ，Ｈ．（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉ ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８ ３１３３−３１４２）。予想されるフラグメン トの大部分は実際にスペクトルに観察される。使用されているような反応プロト コールでは、２’、３’−環状リン酸 基と仮定した場合にしか全フラクメントの正しい帰属は不可能であることにも留 意すべきである。このような環状リン酸は開裂反応の中間体であり、酵素を用い る別の独立した遅い反応段階で加水分解されることがよく知られている（Ｒｉｃ ｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．とＷｙｃｏｆｆ，Ｈ．Ｗ．ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｖｏｌ．４，第３版（Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．編）７４６−８０６（１９７１， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｕ とＷ．Ｓａｅｎｇｅｒ（１９８５）Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５７，４１ ７−４２２；Ｉｋｅｈａｒａ，Ｍ．ら（１９８７）Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅ ｍ．５９−９６５−９６８；Ｖｒｅｓｌｏｗ，Ｒ．とＸｕ，Ｒ．(１９９３）Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１２０１−１２０７）。少 数の例では異なるフラグメントの質量が１ダルトン程度しか違わない場合もある 。これらの場合には、質量ピークをフラグメントに明確に帰属させることができ ない。そこで、これらの曖昧さを解決するために、更に２種の異なる２０ｎｔ ＲＮＡ試料の消化が行われた（Ｈａｈｎｅｒ，Ｓ．，Ｋｉｒｐｅｋａｒ，Ｆ．， Ｎｏｒｄｏｆｆ，Ｅ．，Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｋ．， Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，Ｐ．及びＨｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｆ．（１９９６）Ｐｒ ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ４４ｔｈ ＡＳＭＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ ｅ ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇ ｏｎ）。試験した全試料で、選択したリボヌクレオチドは特定ヌクレオチドでの み開裂し、単一及び多重開裂からのフラグメントが得られると思われる。 図７７中、元の５’末端を含むフラグメントを示すピークは矢印で示す。無印 の全ピークは内部配列又は保存された３’末端をもつ配列に帰属させることがで きる。完全な配列を得るには、元のＲＮＡの５’又は３’末端の一方のみをもつ 可能な全フラグメントで十分である。実際に、全３種の合成ＲＮＡ試料のインキ ュベーション後に得られるスペクトルは異なる全ＲＮアーゼの５’イオンの元の もののほぼ完全な組みを含むので、５’末端フラグメントはこの目的に好適であ る（Ｈａｈｎｅｒ，Ｓ．，Ｋｉｒｐｅｋａｒ，Ｆ．，Ｎｏｒｄｏｆｆ，Ｅ．，Ｋ ｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｋ．，Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ及びＨｉｌｅｎｋａｍｐ， Ｆ．（１９９６）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ４４ｔｈ ＡＳＭＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ ）。内部フラグメントは多少少なく、元の３’末端を含むフラグメントはスペク トルで抑制されているように見える。文献の報告されている知見通り（Ｇｕｐｔ ａ，Ｒ．Ｃ．とＲａｎｄｅｒａｔｈ，Ｋ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓ．，４，１９５７−１９７８）、ＲＮアーゼＴ₁及びＵ₂によるＲＮ Ａ２５量体の部分消化産物では（内部フラグメントであるか又は元の５’末端を 含む場合であっても）３’末端に近い開裂が部分的に抑制された。このような開 裂からのフラグメントは質量スペクトル中に弱く十分に分解されないシグナルと して現れる。 もっと大きいＲＮＡ分子では、二次構造が酵素開裂の均一性に影響を与えるこ とが知られている（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ，Ｈ．，Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及 びＧｉｌｂｅｒｔ，Ａ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８ ，３１３３−３１４２）。これは主に反応条件を変えることにより解決すること ができる。５〜７Ｍ尿素を含むアッセイ溶液では、ＲＮＡは十分に変性されるが 、Ｔ₂、Ｕ₂、Ａ、Ｃｌ₃及びＰｈｙＭ等のＲＮアーゼの活性は保持されることが 知られている（Ｄｏ ｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ，Ｈ．，Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ａ． （１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４，２５２７−２５３７ ；Ｂｏｇｕｓｋｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｈｉｅｔｅｒ，Ｐ．Ａ．及びＬｅｖｙ，Ｃ．Ｃ． （１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５，２１６０−２１６３；Ｄｏｎ ｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ，Ｈ．（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ，８，３１３３−３１４２）。試料中の尿素濃度がこのように高いと、３−ＨＰ ＡをマトリックスとするＵＶ−ＭＡＬＤＩ分析は不可能である。反応緩衝液中２ Ｍまでの尿素濃度では、マトリックス結晶化に有意変化が観察されたが、試料の ＭＡＬＤＩ分析はまだ可能であった。２Ｍ尿素の存在下で消化したＲＮＡ２０量 体（試料Ｂ）のスペクトルは表ＶＩＩに記載した条件下で得られるものとまだ似 ていた。 フラグメントパターンの複雑さを少なくし、各ヌクレオ塩基のマッピングを容 易にするためには、１種のヌクレオ塩基のみを認識するＲＮアーゼによる消化が 望ましい。ＲＮアーゼＣＬ₃及びクサチビンはシチジル酸残基で開裂することが 報告されている酵素である。非変性条件下でＲＮアーゼ２０量体（試料Ｂ）をＣ Ｌ₃及びクサチビンで制限消化すると、従来報告されている データ（Ｂｏｇｕｓｋｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｈｉｅｔｅｒ，Ｐ．Ａ．及びＬｅｖｙ，Ｃ ．Ｃ．（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５，２１６０−２１６３； Ｒｏｊｏ，Ｍ．Ａ．，Ａｒｉａｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｉｇｌｅｓｉａｓ，Ｒ．，Ｆｅｒ ｒｅｒａｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｕｎｏｚ，Ｒ．，Ｅｓｃａｒｍｉｎｓ，Ｃ．，Ｓｏｒ ｉａｎｏ，Ｆ．，Ｌｌｏｐｅｚ−Ｆａｎｄｏ，Ｍｅｎｄｅｚ，Ｅ．，及びＧｉｒ ｂｅｓ，Ｔ．（１９９４）Ｐｌａｎｔａ，１９４，３２８−３３８）と同様に、 確かにシチジル残基での開裂に対応するフラグメントが観察された（図７８）。 しかし、図７８の分解パターンによると、全てのシチジン残基が認識される訳で はなく、特に隣接するＣ残基は認識されていない。ＲＮアーゼＣＬ₃も二次構造 の影響を受け易いと報告されている（Ｂｏｇｕｓｋｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｈｅｉｔｅｒ ，Ｐ．Ａ．，及びＬｅｖｙ，Ｃ．Ｃ．（１９８０）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２５５，２１６０−２１６３）が、本試験で使用した寸法のＲＮアーゼではこの ような影響は少ない。従って、この場合に認識されない開裂部位はこの酵素が特 異性を欠くためであると考えられる。これらのデータを裏付けるために、ＲＮＡ ２０量体（試料Ｃ）で更にＲＮアーゼＣＬ₃消化を行った。この分析物の 配列の結果として、シチジル酸を含む全３個の結合は容易に加水分解されたが、 ウリジル酸残基での開裂も検出された。温度増加（９０℃）、種々の酵素対基質 比及び２Ｍ尿素の添加等、反応条件を変えても予想される特異的消化は生じなか ったので、この酵素はシーケンシングにそれ以上適用しなかった。Ｃｕｃｕｍｉ ｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．の乾燥種子から単離した新規シチジン特異的リボヌク レアーゼであるクサチビンの採用はＲＮＡシーケンシングに有望であると思われ た（Ｒｏｊｏ，Ｍ．Ａ．，Ａｒｉａｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｉｇｌｅｓｉａｓ，Ｒ．，Ｆ ｅｒｒｅｒａｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｕｎｏｚ，Ｒ．，Ｅｓｃａｒｍｉｓ，Ｃ．，Ｓｏ ｒｉａｎｏ，Ｆ．，Ｌｌｏｐｅｚ−Ｆａｎｄｏ，Ｊ．，Ｍｅｎｄｅｚ，Ｅ．及び Ｇｉｒｂｅｓ，Ｔ．（１９９４）Ｐｌａｎｔａ，１９４，３２８−３３８）。図 ７８に示すように、酵素の推奨濃度でシチジン残基の全てが加水分解された訳で はなく、ウリジル酸残基にも開裂が生じた。従って、ＲＮアーゼＣＬ₃及びクサ チビンではシチジン残基のマッピングに所望される配列情報が得られないので、 それ以上使用しなかった。他方、Ｐｈｙｓａｒｕｍ ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ ＲＮアーゼ（ＡｐＮ，ＮｐＮを開裂）及び膵ＲＮアーゼＡ（ＵｐＮ， ＣｐＮを開裂）等の多重特異性をもつＲＮアーゼを使用すると、ピリミジン残基 を区別することができる（図７７参照）。単一特異的ＲＮアーゼＵ₂により生成 され、図７７Ｃのスペクトルに現れている全５’末端フラグメントはＲＮアーゼ ＰｈｙＭ消化産物のスペクトル（図７７Ｄ）でも明白であった。６個のウリジル 開裂部位のうちの５個をこの間接法によりこうして固有に同定することができた 。次段階では、ウリジン開裂部位の情報を使用し、同様に元の５’末端を含むイ オンのみを使用してＲＮアーゼＡと共にインキュベーション後に記録したスペク トル（図７７Ｅ）からウリジル酸残基の開裂部位を同定した。４個の予想開裂部 位のうちの２個をこうして同定した。元の５’末端を含むフラグメントのみを配 列決定に使用する場合には、これらのスペクトルから多少のアーチファクト認め られる。最初から２個のヌクレオチドは低質量マトリックスバックグラウンドで シグナルが消えるので通常は分析されない。このため、対応するフラグメントは Ｕ及びＣ特異的開裂スペクトル中に存在しない。３’末端に近接する開裂部位を もつ大きいフラグメントは収率が低く（上記参照）、非消化転写産物の強力なシ グナルが近くにあることが多いので、特にＲＮアーゼＴ₁及びＵ₂消 化産物では同定しにくいことが多い。従って、２２及び２３位の開裂はＧ特異的 ＲＮアーゼＴのスペクトル（図７７Ａ）には現れず、Ｕ₂及びＰｈｙＭ消化産物 のスペクトル（図７７Ｃ及びＤ）から開裂部位２４を同定することはできない。 同様に図７７ＥのＲＮアーゼＡスペクトルでも２個の隣接するシチジル酸部位１ ６及び１７は同定できない。これらの知見から明らかなように、５’末端フラグ メントのみを決定しても必ずしも十分ではなく、完全な配列分析には内部フラグ メントに含まれる情報が必要である。 最後に、制限アルカリ加水分解は、配列データを補うために使用可能なフラグ メントの連続を提供する（図７７Ｂ）。この場合も、加水分解は全ホスホジエス テル結合に等しく行われるが、スペクトルは５’末端を含むフラグメントのイオ ンが優勢である。酵素消化の場合と同様に、正しい質量帰属には全フラグメント が２’，３’−環状リン酸をもつと仮定する必要がある。従って、ピークの分布 は３’−エキソヌクレアーゼ消化後に得られるものに似ている（Ｐｉｅｌｅｓ， Ｕ．，Ｚｕｒｃｈｅｒ，Ｗ．，Ｓｃｈａｒ，Ｍ．及びＭｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．，（ １９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３１９１ −３１９６；Ｎｏｒｄｈｏｆｆ，Ｅ．ら（１９９３）Ｂｏｏｋ ｏｆ Ａｂｓｔ ｒａｃｔｓ，１３ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｃｏ ｎｆ．，Ｂｕｄａｐｅｓｔ ｐ．２１８；Ｋｉｒｐｅｋａｒ，Ｆ．，Ｎｏｒｄｈ ｏｆｆ，Ｅ．，Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｋ．，Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，Ｐ．， Ｌｅｚｉｕｓ，Ａ．Ｈａｈｎｅｒ，Ｓ．，Ｋａｒａｓ，Ｍ．及びＨｉｌｌｅｎｋ ａｍｐ．Ｆ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，３８６ ６−３８７０）。従って、原則としてアルカリ加水分解は単独で完全なシーケン シングに使用することができると思われる。しかし、大きいフラグメントイオン で質量が数質量単位しか違わないものはスペクトルで分解せず、ピークが部分的 又は完全に分解するとしても、大きいイオンの質量は１Ｄａよりも良好な必要精 度で測定することができないので、これは非常に小さいオリゴヌクレオチドにし か適用できない。元の５’末端を含むフラグメントのみがマススペクトロメトリ ー前に分離されるならば、特に未知のＲＮＡ試料の消化産物からのスペクトルの 解読は実質的に簡単になる。このアプローチの方法を次項に記載する。 ５’−ビオチン化フラグメントの分離。ストレプトアビジン をコートした磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ）が元の５’末端を含むフラグメントを消 化産物から抽出できるかどうかを試験した。この固相アプローチにチェックすべ き主要な特徴はビオチン化種の選択的固定化と効率的溶離である。先行実験で５ ’−ビオチン化ＤＮＡ（１９ｎｔ）とストレプトアビジンをインキュベートし、 標準調製後にＭＡＬＤＩ分析した。ストレプトアビジン−ビオチン相互作用の高 親和性にも拘わらず、ＭＡＬＤＩスペクトルに無傷の複合体は認められなかった 。その代わりに、ストレプトアビジンとビオチン化ＤＮＡのモノマーサブユニッ トのシグナルか検出された。複合体か酸性マトリックス溶液（ｐＫＡ３）中又は ＭＡＬＤＩ脱着プロセス中に解離するか否かは不明である。驚くべきことに、ス トレプトアビジンを磁性ビーズ等の固体表面に固定化すると、同一結果は観察さ れない。２種の５’−ビオチン化ＤＮＡ試料（１９ｎｔ及び２７ｎｔ）と２種の 未標識ＤＮＡ配列（１２ｎｔ及び２２ｎｔ）の混合物をビーズと共にインキュベ ートした。ビーズを抽出し、注意深く洗浄した後、３−ＨＰＡ ＭＡＬＤＩマト リックス中でインキュベートした。これらの試料から分析物シグナルを得ること はできなかった。ビオチン化種がビーズに結合しているか否か を試験するために、抽出及び洗浄したビーズを９５％ホルムアミドの存在下に９ ０℃に加熱することにより溶離を行った。この操作はストレプトアビジンを変性 させ、ストレプトアビジン／ビオチン複合体を破壊すると予想される。図７９Ｂ は２種のビオチン化種の予想シグナルを示し、ＭＡＬＤＩ法における結合分子の 遊離がビーズの結合よりもむしろ問題であることを証明している。図７９Ａは標 準調製後の同一試料のスペクトルを示し、基準として全４種の分析物のシグナル を示す。溶離後でマススペクトロメトリー分析前にホルムアミドを完全に除去す ることが重要であり、そうしないと、マトリックスの結晶化を損なうことが分か った。スペクトル７９Ｂにおける質量分解能及びシグナル対ノイズ比は基準スペ クトルと同等である。Ｄｙｎａｌビーズと共にインキュベーション後に非ビオチ ン化分析物のシグナルは全く又は僅かしか検出されなかったので、これらの結果 はストレプトアビジン−ビオチン相互作用の特異性を裏付けている。結合用緩衝 液に洗剤Ｔｗｅｅｎ−２０を加えると、非特異的結合の抑制が増すことが報告さ れている（Ｔｏｎｇ，Ｘ．とＳｍｉｔｈ，Ｌ．Ｍ．（１９９２）Ａｎａｌ Ｃｈ ｅｍ．，６４，２６７２−２６７７）。この効果は本試験でも 確認することができたが、ピークの広幅化が洗剤の残留量によるスペクトルの品 質を悪化させた。捕獲ビオチン化種の検出の前提条件として溶離段階が必要なの は、ストレプトアビジンの磁性ビーズ固定化による複合体の安定化効果のためで あると考えられる。 この固相法をシーケンシングに実際に適用するには、ビオチン化種の結合及び 溶離効率を最大にすることが最も重要である。従来検討されている種々の条件の うちでは、ＤＮＡシーケンシングの場合には緩衝液にイオン強度を提供すること によりＥＤＴＡ等の塩を加えると最良の結果が得られた（Ｔｏｎｇ，Ｘ．とＳｍ ｉｔｈ，Ｌ．Ｍ．（１９９２）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，６４，２６７２−２６７ ７）。固相方法に及ぼすこのような効果を試験するために、５’−ビオチン化Ｒ ＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物（４９ｎｔ）の結合及び溶離に関して数種の添 加剤を試験した。結果を図８０に示す。各シグナルの相対強度、シグナル対ノイ ズ比及び分解能から判断すると、１０ｍＭ ＣＤＴＡを含む９５％ホルムアミド 溶液（図８０Ｄ）が結合／溶離に最も有効である。ＣＤＴＡは２価カチオンのキ レート化剤として作用するので、ＲＮＡの固有二次及び三次構造の形成が 妨げられる。エレクトロスプレーマススペクトロメトリーによるＲＮＡ試料の分 析では、このような条件下で感度とスペクトル分解能の改善が立証されている（ Ｌｉｍｂａｃｈ，Ｐ．Ａ．，Ｃｒａｉｎ，Ｐ．Ｆ．及びＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ ．Ａ．（１９９５）Ｊ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，６，２ ７−３９）。ＭＡＬＤＩ分析の改善はホルムアミドのみを含む溶液で得られるス ペクトルに比較して実際にさほど顕著ではない（図８１ｂ）が、良好な品質のス ペクトルの再現性はＣＤＴＡ／ホルムアミド溶液のほうが実質的に改善された。 従って、結合／溶離の改善に加え、この添加剤は分析物のマトリックス結晶取り 込みも改善すると思われる。残念ながら、ＥＤＴＡ、ＣＤＴＡ又は２５％水酸化 アンモニウムを含むホルムアミド溶液の場合には、高質量側に顕著なシグナル広 幅化が観察された。これは２５％水酸化アンモニウムの場合にも最も顕著であり 、この添加剤はＥＤＴＡ及びＣＤＴＡを最適ｐＨに調整するためにも使用したの で、ＮＨ₃付加物イオン形成が目立ったのだと予想できる。 ストレプトアビジンをコートした磁性ビーズによる分離をＲＮＡシーケンシン グに適用できることを５’−ビオチン化ＲＮ Ａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物（４９ｎｔ）のＲＮアーゼＵ₂消化について立証 した（図８１）。ＲＮアーゼＵ₂と共にインキュベーション後に得られた完全な フラグメントパターンをスペクトル８１Ａに示す。５’末端フラグメントのみが ビーズに捕獲されるので、ビオチン化フラグメントの分離はスペクトルの複雑さ を少なくする（図８１Ｂ）。スペクトル中のシグナルは広幅化しており、低質量 範囲のシグナル数が増加し、ビーズのストリンジェント洗浄後も結合と溶離に使 用した緩衝液と洗剤が多少残存していることを示している。従って、方法の一層 の改善が必要である。磁性ビーズを適用する別のストラテジーとして、その後の 分析のために残存フラグメントを溶離することによりＲＮアーゼ消化前にターゲ ットＲＮＡを固定化することも考えられる。この場合、その他の反応条件を同一 にすると消化反応時間が延び、ＲＮＡの開裂が悪化した。 実施例２２ タグ付きプライマーを使用する並行ＤＮＡシーケンシング突然変異分析及びマイ クロサテライト分析とマススペクトロメトリー検出 本実施例はＤＮＡ分析で生成されたＤＮＡ産物の特異的捕獲 に関する。捕獲は相補的配列に結合する分析産物の５’末端の特定タグ（５〜８ ヌクレオチド長）を利用する。捕獲配列は固体支持体に結合した部分２本鎖オリ ゴヌクレオチドにより提供することができる。例えば慣用チューブ又はマイクロ タイタープレート（ＭＴＰ）を使用して種々のＤＮＡ分析（例えばシーケンシン グ、突然変異、診断、マイクロサテライト分析）を並行して実施することができ る。タグオリゴヌクレオチド上の相補的同定配列を介して産物を特異的に捕獲し 、分別する。捕獲オリゴヌクレオチドは化学的又は生物学的結合により固体支持 体（例えばシリコンチップ）に結合することができる。試料の同定は、捕獲オリ ゴヌクレオチドの規定位置により提供される。精製、条件付け及びマススペクト ロメトリーを固体支持体で実施する。この方法を使用して６塩基タグ配列をもつ 特定プライマーを捕獲した。 材料と方法 ゲノムＤＮＡ ゲノムＤＮＡは健康な個体から得た。 ＰＣＲ増幅 順プライマーとしてβ２ｄ（ＣＡＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣ ＡＣＡＡＣＴ、配列番号６６）と逆プライマーとしてβ１１ｄ（ＴＣＴＣＴＧＴ ＣＴＣＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧ、配列番号６７）を使用してβ−グロビン遺伝子 の一部のＰＣＲ増幅を行った。総ＰＣＲ容量は５０μｌとし、ゲノムＤＮＡ２０ ０ｎｇ、Ｔａｑ−ポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃ ａｔ＃１５９５９４）１Ｕ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ＃１２７７０４９）及び各プ ライマー１０ｐｍｏｌを含むものとした。５分間９４℃の後、３０秒間９４℃、 ４５秒間５３℃、３０秒間７２℃を４０サイクル繰り返し、２分間７２℃の最終 伸長を行うサイクリング条件を使用してβ−グロビン遺伝子の特定フラグメント を増幅した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ ２８１０４ ）を使用して増幅産物の精製と取り込まれなかったヌクレオチドの除去を行った 。精製産物の５分の１をプライマーオリゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）又はシーケン シング反応に夫々使用した。 プライマーオリゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）及びシーケンシング反応 夫々ヒトβ−グロビン遺伝子のコドン５及び６とコドン３０ 並びにＩＶＳ−１供与部位における推定突然変異の検出を並行して実施した（図 ８２Ａ）。β−ＴＡＧ１（ＧＴＣＧＴＣＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣ 、配列番号６８）をプライマーとして使用してコドン５及び６を分析し、β−Ｔ ＡＧ２（ＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡ）配列番号６９）をコ ドン３０及びＩＶＳ−１供与部位の分析に使用した。プライマーオリゴ塩基伸長 （ＰＲＯＢＥ）反応は以下の条件を使用してサイクリングにより実施した。最終 反応容量は２０μｌとし、β−ＴＡＧ１プライマー（５ｐｍｏｌ）、β−ＴＡＧ ２プライマー（５ｐｍｏｌ）、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（終濃度各２５μ Ｍ）、ｄｄＡＴＰ（終濃度１００μＭ）、ｄＮＴＰ及びｄｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒ −ｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ製品、Ｃａｔ＃１２７７０４９及び１００８３ ８２）、１０×ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎｃｅ緩衝液２μｌ及びＴｈｅｒｍｏＳ ｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＣＡＴ＃Ｅ７９０００Ｙ）２．５Ｕとし た。サイクリングプログラムは５分間９４℃、３０秒間５３℃、３０秒間７２℃ 及び８分間７２℃の最終伸長段階とした。シーケンシングは反応容量を２５μｌ とし、ヌクレオチドの濃度をｄｄＮＴＰ２５０μＭとした以外は同一条件 で実施した。 ＴＡＧ配列を用いる捕獲及び試料調製 捕獲オリゴヌクレオチドｃａｐ−ｔａｇ１ ｄ（ＧＡＣＧＡＣＧＡＣＴＧＣＴ ＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡ、配列番号７０）とｃａｐ−ｔａｇ２ ｄ（ＡＣＡＧＣ ＧＧＡＣＴＧＣＴＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡ、配列番号７１）を夫々等モル量のｕ ｎｉ−ａｓ ｄ（ＴＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＡＧＣＡＧＴＣ、配列番号７２）にア ニールした（図８２Ａ）。各オリゴヌクレオチドの濃度はｄｄＨ₂Ｏ中１０ｐｍ ｏｌ／μｌとし、２分間８０℃と５分間３７℃でインキュベートした。この溶液 を−２０℃で保存し、アリコートを分取した。アニールした捕獲オリゴヌクレオ チド１０ｐｍｏｌを３０分間３７℃でインキュベートすることによりストレプト アビジンをコートした常磁性ビーズ１０μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ；Ｄｙｎａｌ，Ｄ ｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃａｔ＃１１２． ０６）に結合した。ビーズを捕獲し、ＰＲＯＢＥ又はシーケンシング反応産物を 夫々捕獲オリゴヌクレオチドに加えた。夫々β−ＴＡＧ１及びβ−ＴＡＧ２の結 合を容易にするために、反応体を５分間２５℃と３０分間１６℃でインキュベー トした。ビーズを 氷冷０．７Ｍクエン酸ＮＨ₄で２回洗浄し、非特異的な結合伸長産物とプライマ ーを除去した。ＤＤＨ₂Ｏ １μｌを加えて結合産物を溶解し、２分間６５℃で インキュベートし、氷冷した。試料０．３μｌをマトリックス溶液（アセトニト リル／水（５０／５０．ｖ／ｖ）中、飽和３−ヒドロキシピコリン酸、１０％モ ル比クエン酸アンモニウム）０．３μｌと混合し、風乾した。試料ターゲットを 未改造Ｐｅｒ−ｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｖｏｙａｇｅｒ− ＭＡＬＤＴ−ＴＯＦのソ ース領域に自動導入し、ターゲット及び変換ダイノード夫々５及び２０ｋＶの遅 延抽出リニアモードで運転した。理論平均分子量（Ｍ，（ｃａｌｃ））は原子組 成から計算し、報告実測Ｍ_r（Ｍ_r（ｅｘｐ））値は１プロトン化形態の値である 。 結果 短い相補的配列による伸長産物の混合物の特異的捕獲を利用してシーケンシン グ及びプライマーオリゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）産物を単離した。この方法を使 用して夫々ヒトβ−グロビン遺伝子のコドン５及び６とコドン３０並びにＩＶＳ −１供与部位における推定突然変異を検出した（図８２Ａ）。ゲノムＤＮＡはプ ライマーβ２及びβ１１を使用して増幅した。増幅産 物を精製し、ヌクレオチドを分離した。精製産物の５分の１をプライマーオリゴ 塩基伸長による分析に使用した。１回の反応で両部位を分析するために、プライ マーβ−ＴＡＧ１及びβ−ＴＡＧ２を夫々使用した。β−ＴＡＧ１はコドン５及 び６の上流に結合し、β−ＴＡＧ２はコドン３０とＩＶＳ−１供与部位の上流に 結合する。これらのプライマーの伸長はｄｄＡＴＰとｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄ ＴＴＰの存在下にサイクリングにより実施し、個体の表現型に応じて特異的産物 を得た。次に反応産物を捕獲オリゴヌクレオチドと混合した。捕獲オリゴヌクレ オチドはビオチン化捕獲プライマー夫々ｃａｐ−ｔａｇ１及びｃａｐ−ｔａｇ２ を含む。これらは夫々β−ＴＡＧ１及びβ−ＴＡＧ２の５’末端に相補的な６塩 基を５’末端にもつ。従って、捕獲オリゴヌクレオチドはこれらのプライマーと 伸長産物を特異的に捕獲する。ユニバーサルオリゴヌクレオチド（ｕｎｉ−ａｓ ）を捕獲オリゴヌクレオチドにアニールすることにより、捕獲配列のみを１本鎖 とする部分２本鎖分子に捕獲プライマーを変換する（図８２）。ストレプトアビ ジンをコートした常磁性粒子にこの分子を結合し、ＰＲＯＢＥ又はシーケンシン グ反応産物を夫々加える。特異的にアニールしたオリゴヌクレ オチドのみを結合するように混合物を洗浄した。捕獲したオリゴヌクレオチドを 溶解し、マススペクトロメトリーにより分析する。 １個の固体のＰＲＯＢＥ産物（図８３）は分子量７２８２．８Ｄａの小さいピ ークを示す。これは計算質量７２８７．８Ｄａをもつ未伸長β−ＴＡＧ１に対応 する。８４９８．６Ｄａのピークは４塩基分伸長した産物に対応する。これは野 生型状態に対応する。この産物の計算質量は８５００．６Ｄａである。ヘテロ接 合状態を示す有意ピークは存在しない。更に、β−ＴＡＧ２は捕獲されずにβ− ＴＡＧ１のみが捕獲され、この方法の高特異性を示している。 ｃａｐ−ｔａｇ２に結合したものの分析（図８４）は、分子量９３３１．５Ｄ ａのただ１個の主要ピークを示す。これは８ヌクレオチドの伸長に対応する。こ れは予想産物の計算質量が９３５５Ｄａであるホモ接合野生型状態を示す。有意 量の未伸長プライマーは存在せず、β−ＴＡＧ２のみが捕獲されている。 このアプローチが特異的シーケンシング産物を捕獲するのにも利用できること を証明するために、同一の２種のプライマー夫々β−ＴＡＧ１及びβ−ＴＡＧ２ を使用した。プライマーを 混合し、１回のシーケンシング反応で使用した後、上記方法を適用することによ り分別した。これらのプライマーでｄｄＡＴＰとｄｄＣＴＰを用いる２種の異な るターミネーション反応を実施した（夫々図８５及び８６）。スペクトログラム に観察される全ピークは野生型状態の計算質量に対応する。 上述のように、異なる突然変異（例えば異なるＰＲＯＢＥプライマー）の並行 分析が可能である。更に、本発明の方法は特異的シーケンシング産物を捕獲する のにも利用できる。捕獲は１個の反応チューブ／ウェルから異なるシーケンシン グプライマーの分離、特異的多重増幅産物、ＰＲＯＢＥ産物の単離等に使用する ことができる。サイクルシーケンシング等の慣用方法と慣用容量を使用すること ができる。汎用チップデザインにより多種多様のアプリケーションを利用できる 。更に、この方法は高スループットを得るために自動化することができる。 実施例２３ マススペクトロメトリーによる欠失検出 種々のフォーマットを利用して遺伝子内の欠失をマススペクトロメーターによ り検出することができる。例えば、上記実施例に記載したように２本鎖増幅産物 の分子量を測定したり、２ 本鎖産物の一方又は両方の鎖を単離して質量を測定することができる。 あるいは、本実施例に記載するように、特異的酵素反応を実施し、対応する産 物の質量をマススペクトロメトリーにより測定することもできる。欠失寸法は数 十塩基長までとすることができ、この場合も野生型と突然変異対立遺伝子の同時 検出が可能である。特異的産物の同時検出により、個体が特異的対立遺伝子又は 突然変異のホモ接合であるかヘテロ接合であるかを１回の反応で同定することが 可能である。 材料と方法 ゲノムＤＮＡ 白血球ゲノムＤＮＡは無関係の健康個体から得た。 ＰＣＲ増幅 ターゲットＤＮＡのＰＣＲ増幅は、ストレプトアビジンをコートしたビーズを 捕獲する後期精製段階を実施せずに反応産物を使用できるように設定及び至適化 した。ターゲット増幅及びＰＲＯＢＥ反応用プライマーは、ＣＫＲΔ−Ｆ：ｄ（ ＣＡＧ ＣＴＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＴＡ Ｃ、配列番号７３）及びＣ ＫＲΔ−Ｒ ｂｉｏ：ｄ（ＡＧＣ ＣＣＣ ＡＡＧ ＡＴ Ｇ ＡＣＴ ＡＴＣ、配列番号７４）とした。ＣＫＲ−５は２分間９４℃、４５ 秒間５２℃、５秒間７２℃及び５分間７２℃最終伸長からなるプログラムにより 増幅した。最終容量は５０μｌとし、ゲノムＤＮＡ２００ｎｇ、Ｔａｑ−ポリメ ラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ＃１５９６５９４） １Ｕ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ＃１２７７０４９）、未修飾正プライマー１０ｐｍ ｏｌ及び５’ビオチン化逆プライマー８ｐｍｏｌを含むものとした。 ビオチン化鋳型の捕獲及び変性 ストレプトアビジンをコートした常磁性ビーズ（１０ｍｇ／ｍｌ；Ｄｙｎａｌ ，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃａｔ＃１１ ２．０６）１０μｌを５×結合溶液（５Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ，０．３Ｍ ＮＨ₄ＯＨ） に加え、ＰＣＲ反応液４５μｌに加えた（ＰＣＲ反応液５μｌは電気泳動用にと っておいた）。３０分間３７℃でインキュベーションにより結合後、上清を捨て た。捕獲した鋳型を１００ｍＭ ＮａＯＨ ５０μｌで５分間周囲温度で変性さ せ、５０ｍＭ ＮＨ₄ＯＨ ５０μｌで１回、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ ８．０）１００μｌで３回洗浄した。１本鎖ＤＮＡをＰＲＯＢＥ反応の鋳型とし て使用した。 プライマーオリゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）反応 Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０（ＵＳＢ Ｃａｔ＃Ｅ７０７７５Ｚ、緩衝液を含 む）を使用してＰＲＯＢＥ反応を実施した。ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰとｄｄＮＴＰは Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した（Ｃａｔ＃１２７７０４ ９及び１００８３８２）。ｄ（ＣＡＧ ＣＴＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＴ Ａ Ｃ（配列番号７３））をＰＲＯＢＥプライマーとして使用した（図８７）。 以下の溶液：Ｈ₂Ｏ ３．０μｌ、反応緩衝液１．０μｌ、ＰＲＯＢＥプライマ ー１．０μｌ（１０ｐｍｏｌ）をビーズに加え、６５℃で５分間、次いで３７℃ で１０分間インキュベートした。次いでＤＴＴ ０．５μｌ、ｄＮＴＰ／ｄｄＮ ＴＰ（各５０μＭ）３．５μｌ及びＳｅｑｕｅｎａｓｅ ０．５μｌを加え、３ ７℃で１０分間インキュベートした。 ＤＮＡのＴ４処理 平滑末端ＤＮＡを生成するために、増幅産物をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃａｔ＃１００４７８６）で処理した。反応は製造業者のプロトコールに従って ２０分間１１℃で実施した。 伸長産物の直接寸法決定 増幅産物の寸法を決定するために、増幅産物の一方の鎖にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ を適用した。試料を上述のようにビーズに結合し、下記のように条件付け及び変 性した。 ＤＮＡ条件付け ＰＲＯＢＥ反応後、上清を捨て、ビーズをまず７００ｍＭクエン酸ＮＨ₄ ５ ０μｌ、次いで５０ｍＭクエン酸ＮＨ₄ ５０μｌで洗浄した。ビーズをＨ₂Ｏ ２μｌ中で８０℃に２分間加熱することにより、生成した診断産物を鋳型用に取 り出した。上清はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に使用した。 試料調製及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによる分析。 マトリックス溶液（１：１Ｈ₂Ｏ：ＣＨ₃ＣＮ中０．７Ｍ ３−ヒドロキシピコ リン酸、０．０７Ｍ二塩基性クエン酸アンモニウム）０．６μｌを試料ターゲッ ト上で水中で診断ＰＲＯＢＥ産物０．３μｌと混合することにより試料調製を実 施し、風乾した。１００個までの試料をプローブターゲットディスクに スポットして未改造Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｖｏｙａｇｅｒ ＭＡＬＤＩ−Ｔ ＯＦ装置のソース領域に導入し、ターゲット及び変換ダイノード夫々５及び３０ ｋＶの遅延抽出リニアモードで運転した。分析物の理論平均分子量（Ｍ，（ｃａ ｌｃ））は原子組成から計算し、報告実測Ｍ_r（Ｍ_r（ｅｘｐ））値はＰＲＯＢＥ 反応の場合には未伸長プライマーによる内部較正を使用して決定した１プロトン 化形態の値である。 慣用分析 標準プロトコールに従って天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動により慣用分 析を実施した。診断産物をゲルに加える前にホルムアミドで変性させ、夫々臭化 エチジウム又は銀で染色した。 結果 健康な個体からランダムに選択した１０個のＤＮＡ試料のＣＫＲ−５状態を分 析した。白血球ＤＮＡをＰＣＲ増幅し、増幅産物のアリコートをＤＮＡの標準ポ リアクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色により分析した（図８８）。４個の試 料が２個のバンドを示し、ＣＫＲ−５ヘテロ接合性を示すと予想され、他の６個 の試料はホモ接合遺伝子に対応する１個のバンドを示 した（図８８）。２個のバンドが観察された場合には、野生型遺伝子の７５ｂｐ と欠失をもつ対立遺伝子の４３ｂｐの予想寸法に対応する（図８７）。１個のバ ンドが観察された場合には、寸法は約７５ｂｐであり、ホモ接合野生型ＣＫＲ− ５対立遺伝子を示した。ヘテロ接合と予想されるものからのＤＮＡ試料１個とホ モ接合個体からの試料１個をその後の全分析に使用した。増幅産物の分子量を決 定するために、マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化と飛行時間 分析の併用分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によりＤＮＡを分析した。ストレプトア ビジンをコートした常磁性粒子に結合した２本鎖ＤＮＡを変性させ、上清から遊 離した鎖を分析した。図８９Ａはポリアクリルアミドゲル電気泳動（図８８）か らの結果によりヘテロ接合であると予想されたＤＮＡ試料のスペクトログラフを 示す。野生型遺伝子のセンス鎖の計算質量は２３０８６Ｄａであり、欠失対立遺 伝子をもつセンス鎖は１３１４３Ｄａである（図８７及び表ＶＩ）。多数の熱安 定ポリメラーゼは産物の３’末端に非特異的にアデノシンを付加するので、その 質量も計算した。これらの質量は２３３４９及び１３４５６Ｄａである。観察さ れるピーク（図８９Ａ）の質量は２３１１９Ｄａであり、アデノシン が付加された野生型ＤＮＡ鎖の計算質量（２３３４９Ｄａ）に対応する。約２３ ０３６Ｄａの質量をもつピークは観察されなかったので、ポリメラーゼは定性的 にアデノシンを付加したと思われる。相互に近接する２つのピークは１３４５１ 及び１３１３７Ｄａの質量をもつ。これは３２ｂｐを欠失した対立遺伝子の計算 質量に対応する。質量の大きいほうのピークはアデノシンが付加された産物に対 応し、質量の小さいほうのピークは非特異的アデノシンが付加されていない産物 に対応する。どちらのピークもほぼ同一の高さであり、産物の約２分１にアデノ シンが付加されたと考えられる。質量１１６８２Ｄａのピークは２３３１９Ｄａ に対応するＤＮＡの２電荷分子である（２×１１６８２Ｄａ＝２３３６４Ｄａ） 。質量６７３２及び６５７５Ｄａのピークは質量１３４５１及び１３１３７Ｄａ のピークの２電荷分子であり、７７９４Ｄａのピークは２３３１９Ｄａの３電荷 分子に対応する。多電荷分子は計算により常法により同定される。ホモ接合個体 からの増幅ＤＮＡはスペクトログラフ（図８９Ｃ）に質量２３３４９．６の１個 のピークと質量２３０３９．９Ｄａの著しく小さいピークを示す。質量の大きい ほうのピークはアデノシンが付加された野生型対立遺伝子からの ＤＮＡに対応する（計算質量２３３４９Ｄａ）。質量の小さいほうのピークはア デノシンが付加されていない同一産物に対応する。質量１１６８６、７８０４． ６及び５８５２．５Ｄａの別の３個のピークは２、３及び４電荷分子に対応する 。 非特異的に付加されたアデニンはＤＮＡ及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの処理 により増幅ＤＮＡから除去することができる。ヘテロ接合及びホモ接合個体から のＤＮＡをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理後に分析した。図８９Ｂはヘテロ接合 ＤＮＡからのスペクトログラフを示す。野生型鎖に対応するピークは質量２３０ ０８Ｄａであり、付加されたアデニンが完全に除去されていることを示す。質量 １３１４０Ｄａの鎖も同様である。 他の３個のピークは親ピークの多電荷分子である。ホモ接合ＤＮＡの質量スペ クトログラフはアデニンが付加されていない野生型ＤＮＡ鎖に対応する分子量２ ３００４Ｄａの１個のピークを示す。他の全ピークはこのＤＮＡの多電荷分子に 由来する。増幅産物は上述のようにその質量の直接測定により分析することもで きるし、その後の反応で増幅産物から得られる産物の質量を測定して分析するこ ともできる。この「プライマーオリゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）」反応では、停止 ヌクレオチドが取り 込まれる前にプライマーが数塩基分だけ伸長し、プライマーは入れ子ＰＣＲの場 合には内部プライマーであり、あるいはＰＣＲプライマーの１個と同一である。 伸長する長さに応じて遺伝子型を特定することができる。ＣＫＲΔ−ＦをＰＲＯ ＢＥプライマーとして使用し、ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰをヌクレオチ ドとして使用した。プライマー伸長は野生型鋳型の場合にはＡＧＴであり、欠失 の場合にはＡＴである（図８７）。対応する質量は野生型では６６０４Ｄａであ り、欠失では６２７５Ｄａである。ＰＲＯＢＥを２種の標準ＤＮＡに適用した。 スペクトログラフ（図９０Ａ）は野生型ＤＮＡに対応する質量６６０４ＤａとＣ ＫＲ−５欠失対立遺伝子に対応する質量６２７５Ｄａのピークを示す（表ＶＩＩ Ｉ）。質量５６７３ＤａのピークはＣＫＲΔ−Ｆに対応する（計算質量５６７４ Ｄａ）。他の試料も同様に分析した（図９０Ｂ）。質量６６０７Ｄａのピークは 野生型対立遺伝子に対応し、質量５６７７Ｄａのピークは未伸長プライマーに対 応するので、これは明白にホモ接合ＤＮＡと同定される。その他のピークは観察 されなかった。 本実施例から明らかなように、マススペクトロメトリーによ り欠失分析を実施することができる。本実施例に示すように、欠失は１本鎖増幅 産物の直接欠失により分析することもできるし、特異的に生成した診断産物によ り分析することもできる(ＰＲＯＢＥ)。更に、後記実施例２６に示すように、２ 本鎖ＤＮＡ増幅産物も分析できる。全質量はダルトンで表す。 実施例２４ ペンタプレクスｔｃ−ＰＲＯＢＥ 要約 動脈硬化症の病因に関与すると思われる３種の異なるアポリポタンパク質遺伝 子中の５個の多型性部位を使用してサーモサイクリングプライマーオリゴ塩基伸 長（ｔｃ−ＰＲＯＢＥ）の 多重化を実施した。アポリポタンパク質ＡＩＶ遺伝子（コドン３４７及び３６０ ）、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子（コドン１１２及び１５８）及びアポリポタン パク質Ｂ遺伝子（コドン３５００）を試験した。全質量スペクトルは５個の多型 性部位に関して容易に解読できた。 材料と方法 ＰＣＲ増幅 ヒト白血球ゲノムＤＮＡをＰＣＲに使用した。アポＡＩＶ、アポＥ及びアポＢ 遺伝子の部分の各増幅に使用したプライマーは下記の通りである。 アポＡＩＶ： Ａ３４７Ｆ：５’−ＣＧＡ ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＡＡ ＧＧＣ ＣＡＧ ＡＡＴ −３’（配列番号７５） Ａ３６０Ｒ−２−ｂｉｏ：＊５’−ＣＡＧ ＧＧＧ ＣＡＧ ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＣＴ Ｃ−３’（配列番号７６） アポＥ： アポＥ−Ｆ：５’−ＧＧＣ ＡＣＧ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＧＧＡ−３’（ 配列番号７７） アポＥ−Ｒ ｂｉｏ：＊５’−ＡＧＧ ＣＣＧ ＣＧＣ ＴＣ Ｇ ＧＣＧ ＣＣＣ ＴＣ−３’（配列番号７８） アポＢ： アポＢ−Ｆ２ ｂｉｏ：＊５−ＣＴＴ ＡＣＴ ＴＧＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＡＧ Ａ ＧＣ−３’（配列番号７９） アポＢ−Ｒ：５’−ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＴＧＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＣＧＧ Ａ−３’（配列番号８０） ＊ビオチン化。 Ｔａｑ−ポリメラーゼと１０×緩衝液はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ（ドイツ）から購入し、ｄＴＮＰはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ ，ドイツ）から購入した。総ＰＣＲ反応容量は５０μｌとし、各プライマー１０ ｐｍｏｌ、１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａ）（アポＢ遺伝 子のＰＣＲにはＤＭＳＯは使用しない）、鋳型として使用したゲノムＤＮＡ〜２ ００ｎｇ及び最終濃度２００μＭのｄＮＴＰを含むものとした。Ｔａｑポリメラ ーゼ１Ｕを加える前に溶液を８０℃まで加熱した。ＰＣＲ条件は５分間９５℃の 後、３０秒間９４℃、３０秒間６２℃、３０秒間７２℃を２サイクル、３０秒間 ９４℃、３０秒間５８℃、３０秒間７２℃を２サイクル、３０秒間９４℃、３０ 秒間５６℃、３０秒間７２℃を ３５サイクル繰り返し、７２℃で２分間の最終伸長時間とした。取り込まれなか ったプライマーとヌクレオチドを除去するために、増幅産物を“ＱＩＡｑｕｉｃ ｋ”（Ｑｉａｇｅｎ、ドィッ）キットで精製し、精製産物をＴＥ緩衝液（１０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０、５０μＬで溶離した。 増幅産物のビーズ結合 Ｄｙｎａｌのプロトコールに従って各精製増幅産物１０μｌをＤｙｎａＢｅａ ｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）５μｌに結合し、 変性させた。ペンタプレクスｔｃ−ＰＣＲ反応のために、（ビーズに結合した） ３種の異なる増幅産物をプールした。 ｔｃ−ＰＣＲ ＰＣＲ反応には次のプライマーを使用した。 （アポＡ）Ｐ３４７：５’−ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＡＡＧ −３’（配列番 号８１） （アポＡ）Ｐ３６０：５’−ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＧＡ ＡＣＡ ＧＣＡ−３’（ 配列番号８２） （アポＥ）Ｐ１１２：５’−ＧＣＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＴＧ−３’（配列番号８３） （アポＥ）Ｐ１５８：５’−ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ−３’（配列番号８４） （アポＢ）Ｐ３５００：５’−ＧＴＧ ＣＣＣ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＴＣ ＡＣ Ｔ ＧＡＡ ＧＡＣ−３’（配列番号８５） ｔｃ−ＰＲＯＢＥは上記各プライマー１０ｐｍｏｌ、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅ ｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）２．５Ｕ、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝 液２．５μＬ、並びに夫々ｄＴＴＰ ５０μＭ（終濃度）及びｄｄＡ／Ｃ／ＧＴ Ｐ ２００μＭを含む総容量２５μｌ中で実施した。混合物を入れたチューブを サーモサイクラーに入れ、変性（９４℃）のサイクリング条件にかけた。上清を ビーズから注意深く取り出し、エタノール沈殿により「脱塩」し、Ｎａ⁺やＫ⁺等 の不揮発性カチオンをＮＨ₄ ⁺に交換してイオン化プロセス中に蒸発させ、３Ｍ酢 酸アンモニウム（ｐＨ６．５）５μＬ、グリコーゲン（１０ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇ ｍａ）０．５μＬ、Ｈ₂Ｏ ２５μＬ及び無水エタノール１１０μＬをＰＲＯＢ Ｅ上清２５μＬに加え、１時間４℃でインキュベートした。１３，０００ｇで１ ０分間遠心分離後、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、１８Ｍｏｈｍ／ ｃｍＨ₂Ｏ１μＬに再懸濁した。再懸濁したＤＮＡの０．３５μＬアリコートを ステンレス鋼試料ターゲットディスク上でマトリックス溶液（１：１Ｈ₂Ｏ：Ｃ Ｈ₃ＣＮ中０．７Ｍ ３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）、０．０７Ｍク エン酸アンモニウム）０．３５μｌと混合し、風乾後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｉｏａ ｎａｌｙｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２０００ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用し、タ ーゲット及び変換ダイノード夫々５及び２０ｋＶのリフレクトロンモードで運転 してスペクトルを獲得した。フラグメントの理論平均分子量（Ｍ_r（ｃａｌｃ） ）は原子組成から計算した。合成（ＡＴＣＧ）_n、オリゴヌクレオチド（３．６ 〜１８ｋＤａ）から生成した外部較正を使用した。１〜３７５００Ｄａからの陽 イオンスペクトルを集めた。 結果 表ＶＩＩＩは可能な全伸長産物のプライマー自体の質量を含む計算分子量を示 す。図９１は３種の異なる鋳型と５種の異なるＰＲＯＢＥプライマーを１つの反 応で同時に使用したｔｃ−ＰＲＯＢＥの各ＭＡＬＤＩ−ＴＯＰ ＭＳスペクトル を示す。実測質量と計算質量（表ＶＩＩＩ参照）を比較すると、個々のＤＮＡ試 料中の種々の多型性部位を迅速に遺伝子分析できる。 図９１に示す試料はアポリポタンパク質ＡＩＶ遺伝子の夫々３４７及び３６０位 のトレオニンとグルタミンに関してホモ接合であり、アポリポタンパク質Ｅ遺伝 子にホモ接合のε３対立遺伝子をもち、更にアポリポタンパク質Ｂ遺伝子ではコ ドン３５００でアルギニンに関してホモ接合である。実施例２５ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによるｐ５３遺伝子のエキソン５〜 ８のシーケンシング 材料と方法 ゲノムＤＮＡ２００ｎｇ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１単位、ＭｇＣｌ₂ １．５ｍＭ、ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、順プライマー１０ｐｍｏｌ及びビオチン化 逆プライマー６又は８を含む総容量５０μｌを９６穴マイクロタイタープレート の各ウェルに加え、ＰＣＲ反応を３５サイクル実施した。確立化学（Ｎ．Ｄ．Ｓ ｉｎｈａ，Ｊ．Ｂｉｅｒｎａｔ，Ｈ．Ｋｔｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ． ２４：５８４３−５８４６（１９８３））に従って調製したＰＣＲプライマーの 配列は、エキソン５：ｄ（ビオチン−ＴＡＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＴＧＴＧＣＣＣ 、配列番号１０１）及びｄ（ビオチン−ＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＣＣＴ Ｇ、配列番号１０２）；エキソン６：Ｄ（ＡＣＧＡＣＡＧＧＧＣＴＧＧＴＴＧＣ Ｃ、配列番号１０３）及びｄ（ビオチン−ＡＣＴＧＡＣＡＡＣＣＡＣＣＣＴＴＡ ＡＣ、配列番号１０４）；エキソン７：ｄ（ＣＴＧＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＧＴＣ ＴＣ、配列番号１０５）及びｄ（ビオチン−ＣＡＣＡＧＣＡ ＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣ、配列番号１０６）；エキソン８：ｄ（ＧＧＡＣＣＴＧ ＡＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＧ、配列番号１０７）及びｄ（ビオチン−ＴＧＡＡＴＣ ＴＧＡＧＧＣＡＴＡＡＣＴＧ、配列番号１０８）である。 ９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに未精製増幅産物を加え、５×結 合溶液（５Ｍ ＮＨ₄ＯＨ）１０μｌ中の常磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｄ ｙｎａｌ）０．１ｍｇを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。 次にビーズを０．１Ｍ ＮａＯＨで室温で５分間処理した後、室温で５分間５ ０ｍＭ ＮＨ₄ＯＨで１回、次いで５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌで１回洗浄した。 マイクロタイタープレートの各ウェルでジデオキシターミネーション反応を４ 回ずつ実施した。１個のマイクロタイタープレートで合計８４回の反応（２１プ ライマー×４回反応／プライマー）を実施することができる。固定化１本鎖鋳型 を含む各ウェルに、１×反応緩衝液、シーケンシングプライマー１０ｐｍｏｌ、 ｄＮＴＰ ２５０ｍＭ、ｄｄＮＴＰの１種２５ｍＭ及びＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅ ｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）１〜２単位を含む総容量１０μｌの反応混合物を 加えた。シーケン シング反応は８０℃１分間、５０℃１分間、０．１℃／秒の勾配で５０℃→７２ ℃及び７２℃５分間の非サイクリング条件を使用してサーマルサイクラーで実施 した。次にビーズを０．７クエン酸アンモニウム、次いで０．０５Ｍクエン酸ア ンモニウムで洗浄した。次にビーズを５０ｍＭ ＮＨ₄ＯＨ ２μｌ中で２分間 ８０℃まで加熱することによりシーケンシング産物を除去した。上清をＭＡＬＤ Ｉ−ＴＯＦ ＭＳ分析に使用した。 マトリックスはＫｔｅｒら（Ｋｔｅｒ，Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌ．１４：１１２３−１１２８（１９９６））に記載されているように調 製した。その後、この飽和マトリックス溶液を使用前に純水で１．５２倍に希釈 した。希釈マトリックス溶液０．３μｌを試料ターゲットに加え、結晶化させた 後、分析物水溶液０．３μｌを加えた。Ｐｅｒ−ｓｅｐｔｉｖｅ Ｖｏｙａｇｅ ｒ ＤＥマススペクトロメーターを実験に使用し、試料を一般にマニュアルモー ドで分析した。ターゲット及び中間プレートを各レーザー照射後２００ナノ秒間 ＋１８．２ｋＶに維持し、その後、ターゲット電圧を＋２０ｋＶまで上げた。飛 行チューブ内のイオンガイドワイヤーは−２Ｖに維持した。一般に、各試料に２ ５０回レーザー照射した。初期スペクトル は５００ＭＨｚディジタル化速度で獲得し、最終スペクトルは４５５点平均によ り平滑化した（ＳａｖｉｔｓｋｙとＧｏｌａｙ，(１９６４)Ａｎａｌｙｔｉｃａ ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１６２７）。マススペクトロメーターのデフォ ルト較正を使用して各ピークを同定し、配列を帰属させた。２個のシーケンシン グピークの理論質量値を使用して各スペクトルを再較正した（Ｄ．Ｐ．Ｌｉｔｔ ｌｅ，Ｔ．Ｊ．Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｍ．Ｊ．Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌ，Ａ．Ｂｒａｕｎ， Ｒ．Ｊ．Ｃｏｔｔｅｒ，Ｈ．Ｋｔｅｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，寄稿中）。 結果 ｐ５３遺伝子の変異は多数のヒト癌の発生で危険段階であるとみなされている （Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４，４８５５ −４８７８；Ｃ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓ，（１９９６）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７３，２ ６１−２６９；及びＤ．ＳｉｄｒａｎｓｋｙとＭ．Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ，（１９ ９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｓ．Ｍｅｄ．，４７，２８５−３０１）。突然変異はクロ ーン産生能の分子インジケーターの役割をもち、一次腫瘍に既に突然変異が検出 されている患者では再発の初期マーカーの役割をもつと考えられる（Ｈａｉｎａ ｕｔ ら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２５，１５１−１５７ ）。癌の予後は存在するｐ５３突然変異の種類によって異なると思われる（Ｈ． Ｓ．Ｇｏｈら，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５５，５２１７−５２２１ ）。ｐ５３遺伝子の発見以来、６０００種を越える突然変異が検出されている。 エキソン５〜８には突然変異の大半が集まっているので、シーケンシングターゲ ットとして選択した（Ｈａｉｎａｕｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓ Ｒｅｓ．，２５，１５１−７）。 図９６は材料と方法の項に詳細に記載したように実施したシングルチューブタ ーゲット増幅及びシーケンシング法を模式的に示す。イントロン領域にフランキ ングプライマーを使用し、下流プライマーはビオチン化し、ｐ５３遺伝子のエキ ソン５〜８の各々をＰＣＲ増幅した。同一サイクリングプロフィルを使用するよ うに種々のエキソンの増幅を至適化し、それ以上精製せずに産物を使用した。Ｐ ＣＲ反応は９６穴マイクロタイタープレートで実施し、１個のウェルで生成した 産物を１回のシーケンシング反応の鋳型として使用した。ストレプトアビジンを コートした磁性ビーズを同一マイクロタイタープレートに加え、 増幅産物を固定化した。その後、ビーズをＮａＯＨで処理し、シーケンシング鋳 型として固定化１本鎖ＤＮＡを生成した。残留塩基はシーケンシング酵素の活性 を減じるのでビーズをＴｒｉｓ緩衝液で十分に洗浄した。 合計２１個のプライマーを選択してプライマーウォーキングによりｐ５３遺伝 子のエキソン５〜８をシーケンシングした。既知突然変異が存在しない部位に全 プライマーの３’末端を配置した。ターミネーション反応を４回別々に実施し、 同一ＰＣＲマイクロタイタープレートで合計８４回のシーケンシング反応を実施 した。ストレプトアビジンをコートしたビーズは高温の反復使用に耐えられない ので、シーケンシングには非サイクリング条件を採用した。シーケンシング反応 は末端に突然変異もつフラグメントが７０ヌクレオチド未満となるようにデザイ ンし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより容易に測定可能でありながら次のプライ マー結合部位をシーケンシングするのに十分長い寸法範囲となるようにした。Ｔ ｈｅｒｍｅｑｕｅｎａｓｅは所望質量範囲で高収率のシーケンシング産物を再現 可能に生成することができたのでこれを選択酵素とした。シーケンシング反応後 、ビーズをアンモニウムイオン緩衝液で洗浄し、他の 全カチオンを交換した。その後、水酸化アンモニウム溶液中又は単に水中で加熱 することによりシーケンシングラダーをビーズから除去した。 先に加えたマトリックスを含む１個のＭＳ試料ホルダーに８４個のシーケンシ ング反応産物各１μｌ以下のアリコートを加えた。図９４は１個のプライマーか ら生成したシーケンシングデータの１例を示し、４個のスペクトルを重ねたもの である。 全シーケンシングピークは次のシーケンシングプライマー部位を介して解読す るために必要な質量範囲で良好に分解した。２電荷ピークも観察され、１電荷イ オンと質量を相関することにより容易に同定することができた。酵素伸長の初期 停止により生じた偽停止ピークをプライマー部位の近くに検出することができる 。質量分解能が十分高いので、隣接ピークの質量差を計算し、４個のスペクトル を比較することにより真のシーケンシングピークから偽停止ピークを容易に区別 できる。更に、突然変異プライマーは下流プライマー結合部位の領域に検出可能 なデータを生じ、偽停止領域をカバーしている。 至適化増幅、シーケンシング及び条件付け手順を使用し、ｐ５３遺伝子のエキ ソン５〜８を配列決定することができた。全 質量範囲にわたって約３００〜８００の質量分解能で全エキソンから正しい野生 型配列データが得られた。総質量精度は０．０５％又はそれよりも良好であった 。ＭＳ試料ホルダーに添加された各シーケンシングフラグメントの平均量は５０ ｆｍｏｌ以下と推定される。 本実施例から明らかなように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによりヒト遺伝子の エキソンを配列決定することができる。ゲルに基づく自動蛍光ＤＮＡシーケンシ ングに比較すると、リーディング長が短い。マイクロチップ技術を組み込むと、 並行処理が可能である。マイクロタイタープレートで生成したシーケンシング産 物を直接マイクロチップに移し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析用発射パッドとし て利用することができる。ロボット駆動シリアル及びパラレルナノリットル分配 ツールを使用し、平坦又は幾何（例えばウェルを備える）表面をもつ＜１”平方 チップ上に迅速マススペクトロメトリー分析用１００〜１０００素子ＤＮＡアレ ーが製造されている。 図９４は試料をピンツールによりマイクロタイタープレートから移したチップ で得られたＭＳスペクトルを示す。各停止産物の推定添加量は５ｆｍｏｌ以下で あり、放射性標識又は蛍光 検出による慣用Ｓａｎｇｅｒシーケンシングで使用されている量（０．５〜１ｆ ｍｏｌ／フラグメント）の範囲内である。ＭＡＬＤＩ試料の堆積量が少ないと、 小型化（試薬成分数の低減）、再現性の増加及びシグナル獲得の自動化といった 利点がある。 実施例２６ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる合成及び生物生成２本鎖ＤＮＡの直接検出 序論 一般に、溶液中で２本鎖（ｄｓ）であるＤＮＡ分子をマトリックス介助レーザ ーデソープション／イオン化（Ｋａｒａｓら，（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓ ｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，Ｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，９２，２３１）飛行時間 マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）にかけると、２個の１本 鎖成分を表す分子イオンが得られ（Ｔａｎｇら（１９９４）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍ ｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．８：１８３；Ｔａｎｇら（１９９５）Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３１２６；Ｂｅｎｎｅｒら（１９９ ５）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ.Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．９：５３７；Ｌ ｉｕら（１９９５）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７： ３４８２；Ｓｉｅｇｅｒｔら（１９９６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３： ５５；及びＤｏｋｔｙｃｚら（１９９５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０： ２０５）、これはポリメラーセ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅から生物学的に生成した ＤＮＡに関する数件の報告に記載されている（Ｔａｎｇら（１９９４）Ｒａｐｉ ｄ Ｃｏｍｍｕｎ.Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．８：１８３；Ｌｉｕら（１９ ９５）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：３４８２；Ｓｉｅｇｅｒｔら（１９９６）Ａ ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３：５５；及びＤｏｋｔｙｃｚら（１９９５）Ａ ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０：２０５）。２本鎖が安定化されるのは、脱着 ／イオン化／ファンデルワールス引力と「スタッキング」安定化力を上回るに十 分なエネルギーの加速中にマトリックス環境中のｐＨが低下するためであるか、 あるいはデュプレクスにより吸収されるためであるかは不明である（Ｃａｎｔｏ ｒとＳｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８０），１７６）。分析物 が高濃度で存在する場合には、タンパク質の場合と同様に非特 異的気相ＤＮＡマルチマーが形成されることは知られている（Ｋａｒａｓら（１ ９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，Ｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｅ ｓ ９２：２３１）が、ＬｅｃｃｈｉとＰａｎｎｅｌｌ（Ｌｅｃｃｈｉら（１９ ９５）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．６：９７２）は特異的 ワトソンクリック（ＷＣ）塩基対合が気相に維持されることを立証する有力な証 拠を報告している。同氏らは、６−アザ−２−チオチミンをマトリックスとして 使用した場合にこれらの特異的二量体を検出したが、３−ヒドロキシピコリン酸 （３−ＨＰＡ）又は２，４，６−ヒドロキシアセトフェノンマトリックスを使用 した場合には検出できなかった。後述するように、低いイオン加速電圧を使用し 、低温でＭＡＬＤＩ分析用試料を調製することにより、ｄｓＤＮＡの日常検出が 可能である。 材料と方法 合成ＤＮＡ。Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡ合成器を使 用してオリゴヌクレオチドを合成し（Ｓｉｎｈａら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，４５３９）、社内で逆相ＨＰＬＣ精製した。配 列は、５０ 量体（１５３３７Ｄａ）：５’−ＴＴＧ ＣＧＴ ＡＣＡ ＣＡＣ ＴＧＧ Ｃ ＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＧＴＣ ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＧＧ Ａ ＡＡ ＡＣＣ ＣＴ−３’（配列番号１０９）；２７量体_c（相補、８３４３Ｄ ａ）：５’−ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＣＡ ＧＴＧ ＴＧＴ ＡＣ Ｇ ＣＡＡ−３’（配列番号１１０）；２７量体_nc(非相補、８２９３Ｄａ)：５ ’−ＴＡＣ ＴＧＧ ＡＡＧ ＧＣＧ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＣＡ ＡＴＣ ＡＧ Ｃ−３（配列番号１１１）であった。 １８Ｍｏｈｍ／ｃｍＨ₂Ｏを使用してストック溶液１００μＭを２０、１０、 ５及び２．５μＭまで希釈した。５０量体と２７量体_c又は２７量体_ncの等モル 溶液各２μＬを混合し、室温で１０分間アニールさせた。これらの混合物０．５ μＬを試料ターゲット上でマトリックス（５０％アセトニトリル中０．７Ｍ ３ −ＨＰＡ、０．０７Ｍクエン酸アンモニウム）１μＬと直接混合し、風乾した。 生物ＤＮＡ。白血球からのヒトゲノムＤＮＡの酵素消化を行った。アポリポタ ンパク質Ｅ遺伝子のエキソン４の一部を増幅するためのＰＣＲプライマー（順、 ５’−ＧＧＣ ＡＣＧ Ｇ ＣＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＧＧＡ Ｇ−３’（配列番号１１２）；逆、５’−ＡＧ Ｇ ＣＣＧ ＣＧＣ ＴＣＧ ＧＣＧ ＣＣＣ ＴＣ−３’（配列番号１１３） ）を公表配列（Ｄａｓら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０ ６２ ４０）から作製した。Ｔａｑポリメラーゼと１０×緩衝液はＢｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ドイツ）から購入し、ｄＮＴＰはＰｈａｒｍａｃｉａ（ Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，ドイツ）から購入した。総反応容量は５０μｌとし、各プラ イマー２０ｐｍｏｌ及び１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａ） と鋳型として使用したゲノムＤＮＡ約２００ｎｇを含むものとした。ポリメラー ゼ１Ｕを添加する前に溶液を８０℃まで加熱した。ＰＣＲ条件は２分間９４℃の 後、３０秒間９４℃、４５秒間６３℃、３０秒間７２℃を４０サイクルと、２分 間７２℃最終伸長時間とした。増幅産物の最終収率を測定するために定量的デー タは集めなかったが、−２ｐｍｏｌを酵素消化に利用可能であったと推定される 。 ＣｆｏＩ及びＲｓａＩと反応緩衝液ＬはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ ｉｍから購入した。増幅産物２０μｌを水１５μｌと緩衝液Ｌ ４μｌで希釈し 、制限酵素１０単位を添加 後、試料を６０分間３７℃でインキュベートした。消化産物を沈殿させるために 、３Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）５μｌ、グリコーゲン５μｌ（Ｂｒａｕ ｎら（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：１１５１）（１０ｍｇ／ｍｌ，Ｓ ｉｇｍａ）及び無水エタノール１１０μｌを分析物溶液５０μＬに加え、１時間 室温で保存した。１０分間１３，０００×ｇで遠心分離後、ペレットを７０％エ タノールで洗浄し、１８Ｍｏｈｍ／ｃｍ Ｈ₂Ｏ １μｌに再懸濁した。 試料調製及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分析。再懸濁したＤＮＡ０． ３５μＬをマトリックス溶液（１：１Ｈ₂Ｏ：ＣＨ₃ＣＮ中０．７Ｍ ３−ヒドロ キシピコリン酸（３−ＨＰＡ）、０．０７Ｍクエン酸アンモニウム）（Ｗｕら（ １９９３）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．７：１４ ２）０．３５〜１．３μＬとステンレス鋼試料ターゲットディスク上で混合し、 風乾後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｉｓｉｏｎ ２０００ Ｍ ＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置を使用し、ターゲット及び変換ダイノード夫々５及び２０ ｋＶの陽イオンリフレクトロンモードで運転してスペクトルを獲得した。フラグ メントの理論平均分子量（Ｍ_r（ｃａｌｃ））は原子 組成から計算し、粗データ値からプロトン質量（１．０８Ｄａ）を差し引いて中 性基準で実測分子量（Ｍ_r（ｅｘｐ））を報告した。８個のピーク（２０００〜 １８０００Ｄａ）から生成した外部較正を全スペクトルに使用した。 結果と考察 図９６Ａは合成５０量体と（非相補的）２７量体_nc（各１０μＭ、本試験で使 用した最高終濃度）の混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルであり、レー ザー出力はイオン化用閾値照射を僅かに上回るように調整した。８．３０及び１ ５．３４ｋＤａのピークは夫々２７量体及び５０量体１本鎖に由来する１電荷イ オンに相当する。−１６．６及び−３０．７ｋＤａの十分に分解していない低強 度のシグナルは夫々２７量体及び５０量体のホモダイマーに相当し、２３．６ｋ Ｄａのシグナルは２７量体鎖と５０量体鎖を１本ずつ含むヘテロダイマーに一致 する。このように、２種の非相補的オリゴヌクレオチドからの可能な全組み合わ せ（２７＋２７；２７＋５０；５０＋５０）に相当する低強度ダイマーイオンが 観察された。脱プリンピークが優勢になる点まで照射を増加しても、スペクトル のこれらのダイマーピークの強度は僅かに高くなっただけであった。ハ イブリダイゼーションは室温で非常に低い塩濃度、即ち非特異的ハイブリダイゼ ーションが生じるような条件で実施したことに留意されたい。 図９６は同一５０量体と（相補的）２７量体_cの混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ スペクトルを示し、各オリゴヌクレオチドの終濃度は同じく１０μＭとした。図 ９６Ａと同一のレーザー出力を使用した処、この場合も夫々１本鎖２７量体及び ５０量体に一致する８８．３４及び１５．３４ｋＤａに強いシグナルが観察され た。ホモダイマーピーク（２７＋２７；５０＋５０）はノイズとしてかろうじて 現れたたけであったが、１電荷（２３．６８ｋＤａ）及び２電荷（１１．８４ｋ Ｄａ）ヘテロダイマー（２７＋５０）ピークは優勢であった。２３．６８ｋＤａ ダイマーピークは全照射位置から検出できたが、モノマーピークに対するその強 度はスポット毎に少しずつ異なっていた。５、２．５及び１．２５μＭの各オリ ゴヌクレオチド濃度で実験を繰り返すと、２７及び５０量体１本鎖ピークよりも 少量の２７／５０量体ワトソン−クリックダイマーピークが得られた。最低濃度 では、ダイマーは「結晶依存性」であり、即ち照射すると、結晶によっては有意 な２７／５０量体ダイマーシグナルを 生じたが、再現可能に殆ど又は全く生じない結晶もあった。これは、ｄｓＤＮＡ のマトリックス結晶取り込み又はイオン化／脱着プロセスによるこの相互作用の 維持効果が結晶の微細性質に依存すること、及び／又は試料全体を通してデュプ レクスの急激な濃度勾配が存在することを示している。 このように、図９６のスペクトルは、この質量範囲で高いオリゴヌクレオチド 濃度で温和なレーザー条件を使用して特異的ＷＣ塩基対合ｄｓＤＮＡを観察でき ることを強く裏付けるものであり、３−ＨＰＡマトリックスを使用した最初の報 告である。本試験をアポリポタンパク質Ｅ遺伝子のエキソン４の領域の酵素消化 （ＲｓａＩ／ＣｆｏＩ）により得られるｄｓＤＮＡの複合混合物に応用した（Ｄ ａｓら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０ ６２４０）。予想フラ グメント質量を表ＩＸに示す。 ^aε３対立遺伝子は１７／１９又は１９／１９対をもたす、ε４対立遺伝子は３ ６／３８対をもたない。^b （＋）センス鎖、（−）アンチセンス鎖。 消化段階後、試料を精製し、エタノール沈殿により濃縮し、Ｈ₂Ｏ １μＬに 再懸濁した後、試料ターゲット上で室温でマトリックスと混合した。質量３．４ 〜１７．２ｋＤａの約２０個のピークが産物のＭＡＬＤＩスペクトル（図９７Ａ ）で分解され、これらは全て２本鎖の変性１本鎖成分に一致する（表ＩＸ）。 同様の生物産物を数カ月にわたって多数回このように分析した処、ごく僅かしか ｄｓＤＮＡを含まないスペクトルが得られ、従来の報告（Ｔａｎｇら（１９９４ ）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．８：１８３； Ｌ ｉｕら（１９９５）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：３４８２； Ｓｉｅｇｅｒｔら （１９９６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３：５５；及びＤｏｋｔｙｃｚら （１９９５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０：２０５）に一致したが、同様 の条件下で合成ＤＮＡには無傷の２本鎖が観察された（図９６Ａ）。生物反応後 に得られる鎖濃度を推定することは困難であるか、合成試料の二量化が生じた濃 度よりは著しく低かったと予想される。更に、２成分合成混合物内で特異的ハイ ブリッドを維持するほうが消化産物からの１本鎖ＤＮＡ成分２０個の著しく複雑 な混合物よりも反応速度の点で好ましいと思われる。 ｄｓＤＮＡの維持に及ぼす低温の効果を試験した。消化ＤＮＡ溶液のアリコー ト、マトリックス、ピペット、ピペットチップ及びステンレス鋼試料ターゲット を４℃「冷蔵室」に１５分間保存し、通常の調製物と同様にマトリックス、次い で分析物をターゲットにスポットし、風乾しながら同時結晶させた。３ ＨＰＡ（５０％アセトニトリル）３００ｎＬと分析物３００ｎＬの混合物は室温 では〜１分で結晶したが、低温では〜１５分かかった。冷蔵室環境で調製した試 料スポットは一般に高い割合で大きい透明結晶を含んでいた。 低温で調製したアポＥ消化産物アリコートのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、図９ ７Ｂのスペクトルを生じた。低質量範囲は定性的に図９７Ａと似ているが、８ｋ Ｄａを越えると著しい相違が観察された。図９７Ａでは１本鎖に一致するシグナ ルは１個しか観察されなかった（表ＩＸ）が、冷蔵室で調製した図９７Ｂの試料 は８ｋＤａ未満を除いて同一質量のシグナルを生じなかった。更に、図９７Ｂに は付加的な高質量ピークがあり、これらは明らかに低質量成分を含むダイマーピ ークに相当する。合成ＤＮＡの場合と同様に、これらが非特異的ヘテロダイマー 、特異的ＷＣヘテロダイマー又は非特異的ホモダイマーのいずれに相当するかを 決定することが重要であった。まず３３．３５ｋＤａフラグメントについて考察 する。この高質量フラグメントがトライマー以上のマルチマーであるという可能 性はあり得ないので問題外とすると、このフラグメントはダイマーとして最高質 量即ち＞１６ｋＤａのｓｓＤＮＡ成分を含んでいるはず である。１５．２４及び１７．１８ｋＤａフラグメントのホモダイマー化は夫々 ３２．４９及び３４．３５ｋＤａピークを生じ、実測値３３．３５ｋＤａに対す るこれらの不正確な帰属の対応する質量誤差は夫々−２．６％及び＋３．０％で ある。このピークが２個の最高質量１本鎖フラグメントのヘテロダイマーに由来 するならば著しく良好な対合が達せられ、質量の和（１６．２４＋１７．１８＝ ３３．４２ｋＤａ）は実測ダイマー質量３３．３５ｋＤａと０．２％の差であり 、これは外部較正を使用して大きいＤＮＡフラグメントをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分 折するのに許容可能な質量誤差である。同様に、２９．６６ｋＤａフラグメント は４８量体のヘテロダイマーの予想値２９．７０ｋＤａより僅かに０．１３％低 い測定値であり、他の可能なホモダイマー又はヘテロダイマーの和のうちでこの 質量の妥当範囲内のものはなかった。夫々３６／３８量体及び３１／２９量体ヘ テロダイマーに相当する２２．８９及び１８．８３ｋＤａフラグメントについて も同じことが言え、１４．８６ｋＤａのシグナルは１電荷１本鎖と２電荷２本鎖 の４８量体に一致する。>１５ｋＤａの図９７Ｂの質量がこの消化産物から予想 されるｄｓＤＮＡの質量に一致しており、ランダム質量ではホモダ イマーと非特異的ヘテロダイマーが存在しないことから、塩基対合は確かに高特 異性であることが判明し、ＭＡＬＤＩにより生成されるイオンで気相ＷＣ相互作 用を維持できることが更に裏付けられた。 図９８はε４対立遺伝子のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示し、ε３とは異 なり、ＣｆｏＩ／ＲｓａＩ消化により３６／３８量体対を生じないと予想された 。ε３及びε４の質量スペクトルは、図９７Ｂの主要な２２．８９ｋＤａフラグ メントが図９８には存在しない点を除いて同様であり、この情報だけ（表ＩＸ） でε３及びε４対立遺伝子は容易に区別され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる ｄｓＤＮＡの直接測定により遺伝子型別できることが立証された。同様に、ｄｓ ＤＮＡをイオン化し、気相に移し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより検出するこ とができた。本装置で一般に使用した加速電圧は−５ｋＶに過ぎず、試料ターゲ ットから−２ｍｍまでで１．５ｋＶ．ｍｍに対応し、電界強度は試料ターゲット からの距離と共に迅速に低下した。大半の従来の研究は少なくとも２０ｋＶの加 速を使用しており（Ｌｅｃｃｈｉら（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．６：９７２）、唯一の例外として凍結マト リックス溶液と１００Ｖ加速を使用して２７量体ｄｓＤＮＡが検出されている（ Ｎｅｌｓｏｎら（１９９０）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔ ｒｏｍ．４：３４８）。理論の裏付けはないが、ＭＡＬＤＩにより誘導されるｄ ｓＤＮＡの「変性」は、高加速磁場を使用する場合に気相衝突活性化がＷＣ対合 を妨げるために生じると思われ、エレクトロスプレーイオン化を使用してｄｓＤ ＮＡの１本鎖成分を配列決定するために使用される断片化の第１段階と予想され る変性に似ている（ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙら（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，Ｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）。溶液中でＷＣ対合ｄｓ ＤＮＡを安定化するために必要な高い塩濃度（一般に＞１０ｍＭ ＮａＣｌ又は ＫＣｌ）はＭＡＬＤＩ分析には適していないと思われ（Ｎｏｒｄｈｏｆｆら（１ ９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３３４７）、カチオンに より付加されるＭＡＬＤＩシグナルを避けるためにはこのような不揮発性カチオ ンの濃度を下げる必要があるが、その結果、溶液中の２本鎖は不安定になる。マ トリックス環境の低ｐＨ条件もデュプレクスを不安定にすると思われる。図９７ Ｂ及び９８に示すように、特に長い鎖の場合には水素結合網目 構造が広範囲であるために融点が高いので、低濃度の生物試料でも低温で保存及 び調製するとこれらの変性効果を少なくとも部分的に回避できる。本実施例で使 用した条件は非常に非ストリンジェントなアニーリング条件であると認められる 。 高質量ｄｓＤＮＡピーク（例えば図９７Ｂ、２３２ｋＤａ）の低質量テールは １本鎖の各々からの脱プリンの合計よりも高度まで生じた脱プリンに一致する。 溶液中の脱プリンは酸触媒反応であるか、３−ＨＰＡ中の弱酸性条件は有意脱プ リンを誘導せず、Ｄｅ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで測定した混合塩基５０量体からの 分子イオンシグナルに占める脱プリンピークの割合はほんの僅かであった（Ｊｕ ｈａｚら（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：９４１）。気相ｄｓＤＮＡの １本鎖成分からの脱プリンが観察され、これらの塩基はその１本鎖の相補的塩基 に結合した水素であるとも予想されるが、これは鎖が変性される前に共有結合が 切断されていることを暗示している。 実施例２７ 塩基特異的リボヌクレアーゼの効率及び特異性アッセイ 選択した合成２０〜２５量体の消化中に等時間間隔で抽出したアリコートをマ ススペクトロメトリーにより分析した。ＲＮ アーゼの３種は効率的且つ特異的であることが判明した。これらはＧ特異的Ｔ₁ 、Ａ特異的Ｕ₂及びＡ／Ｕ特異的ＰｈｙＭであった。Ｃ特異的であると予想され るリボヌクレアーゼは信頼性が低いことが判明し、例えば全てのＣを開裂した訳 でなく、予想外にＵも開裂した。これらの３種の有望なＲＮアーゼはいずれも全 予想位置で開裂を生じ、完全な配列カバーが得られた。更に、１又は数個の非開 裂位置（短いインキュベーション時間）を含む開裂産物の存在は開裂産物の整列 を可能にした。合成２０量体（配列番号１１４）ＲＮＡのＴ₁消化後に抽出した アリコートのＭＡＬＤＩスペクトルの１例を図１００に示す。 実施例２８ 増幅ＤＮＡターゲットのシリコンウェーハ固定化 シリコン表面調製 シリコンウェーハをエタノールで洗浄し、ブンゼンバーナーで殺菌し、トルエ ン中２５（容量）％３−アミノプロピルトリエトキシシランの無水溶液に３時間 浸漬した。次にシラン溶液を除去し、ウェーハをトルエンで３回、ジメチルスル ホキシド（ＤＭＳＯ）で３回洗浄した。次にウェーハを無水ＤＭＳＯ中Ｎ−スク シンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエ ート（ＳＴＡＢ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ ）の１０ｍＭ無水溶液中でインキュベートした。反応後、ＳＩＡＢ溶液を除去し 、ウェーハをＤＭＳＯで３回洗浄した。全ての場合に、ヨードアセトアミド官能 化ウェーハをすぐに使用し、レービルヨードアセトアミド官能基の加水分解を最 小限にした。更に、ヨードアセトアミド官能基は感光性であるため、その後の全 ウェーハ操作は暗所で実施した。 増幅チオール含有核酸の固定化 ＳＩＡＢを結合したシリコンウェーハを使用して特定増幅ＤＮＡターゲット配 列の特異的遊離チオール含有ＤＮＡフラグメントを分析した。１１２ｂｐヒトゲ ノムＤＮＡ鋳型（Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｚ５２２５９；配列番号 １１８）の３’領域に相補的な５’−ジスルフィド結合を含む２３量体オリゴヌ クレオチド（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入；配列番号１１ ７）をプライマーとして使用し、ゲノムＤＮＡの５’末端の一部に相補的な市販 ４９量体プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入；配列 番号１１９）をＰＣＲで併用し、ＤＮＡブュプレクスの一方の鎖のみに結合した ５’−ジスルフィド結合を含む１３５ｂｐＤ ＮＡ産物（配列番号１２０）を増幅した。 ＰＣＲ増幅反応はＡｍｐｌｉｔａｑ ＧｏｌｄＫｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ ｅｒ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｎ８０８−０２４９）を使用して実施した。要約 すると、１１２ｂｐヒトゲノムＤＮＡ鋳型２００ｎｇを２３量体プライマー１０ μＭ及び市販４９量体プライマー８μＭ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ、製造業者により 提供される緩衝液中のＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ１単位 と共にインキュベートし、サーモサイクラーでＰＣＲを実施した。 得られた増幅産物の５’−ジスルフィド結合を１０ｍＭトリス−（２−カルボ キシメチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏ ｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で完全に還元し、遊離５’−チオール基を生成した。修飾 オリゴヌクレオチドのジスルフィド還元は逆相ＦＰＬＣで保持時間のシフトを観 察することによりモニターした。１０ｍＭ ＴＣＥＰの存在下で５時間後に、ジ スルフィドは完全に遊離チオールに還元されることが判明した。ジスルフィド開 裂直後に、修飾オリゴヌクレオチドをヨードアセトアミドで官能化したウェーハ と共にインキュベートし、ＳＩＡＢリンカーを介してシリコン ウェーハの表面に結合した。完全なチオール脱プロトン化を確保するために、結 合反応はｐＨ８．０で実施した。ジスルフィドを開裂するために１０ｍＭ ＴＣ ＥＰを使用し、他の上記反応条件を使用すると、２５０ｆｍｏｌ／ｍｍ²表面の 表面密度を再現可能に得ることができた。 ハイブリダイゼーション及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー １３５ｂｐチオール含有ＤＮＡと結合したシリコンウェーハを相補的１２量体 オリゴヌクレオチド（配列番号１２１）と共にインキュベートし、特異的にハイ ブリダイズしたＤＮＡフラグメントをＭＡＬＤＴ−ＴＯＦ ＭＳ分析により検出 した。１２量体配列の理論質量対電荷比は３６２２．４Ｄａであるが、質量スペ クトルは３６１８．３３の実測質量対電荷比でシグナルを生じた。 このように、５’−ジスルフィド結合を含む特定ＤＮＡターゲット分子を増幅 することができる。本実施例に記載する方法を使用して、ＳＩＡＢを結合したシ リコンウェーハに分子を高密度で固定化し、特定相補的オリゴヌクレオチドをこ れらのターゲット分子にハイブリダイズすると、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析により検出することができる。 実施例２９ 核酸アレーを作製するための高密度核酸固定化の使用 実施例２８に記載した高密度結合手順を使用し、その表面に例えば凹部やパッ チ等の複数のロケーションをもつシリコンウェーハ上にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス スペクトロメトリー分析可能なＤＮＡオリゴマーのアレーを作製した。アレーを 作製するために、ウェーハの選択ロケーションのみに遊離チオール含有オリゴヌ クレオチドプライマーを固定化した（例えば実施例２８参照）。アレーの各ロケ ーションに３種の異なるオリゴマーの１種を配置した。各固定化オリゴマーを別 々に検出及び区別できることを立証するために、３種のオリゴマーの１種に相補 的な異なる長さの３種の異なるオリゴヌクレオチドをウェーハ上のアレーにハイ ブリダイズし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより分析した。 オリゴヌクレオチド 相補的オリゴヌクレオチド対の一方が３’又は５’−ジスルフィド結合を含む ３組の相補的オリゴヌクレオチド対を合成した（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｉｅｓ又はＯｌｉｇｏｓ 等から購入）。例えば、オリゴマー１［ｄ（ＣＴＧＡＴＧＣＧＴＣＧＧＡＴＣＡ ＴＣＴＴＴＴＴＴ−ＳＳ）；配列番号１２２］は３’−ジスルフィド結合を含み 、オリゴマー２［ｄ（ＳＳ−ＣＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＣＴＧＴＧＴＡＧＴＡＴＴ ）；配列番号１１７の５’−ジスルフィド誘導体］とオリゴマー３［ｄ（ＳＳ− ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧ）；配列番号１１５の５’−ジス ルフィド誘導体］は各々５’−ジスルフィド結合を含む。 オリゴマー1〜３に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ Ｍ Ｓ分析中に相互に容易に分解可能な異なる長さとなるようにデザインした。例え ば、オリゴマー１の一部に相補的な２３量体オリゴヌクレオチド（配列番号１２ ３）を合成し、オリゴマー２の一部に相補的な１２量体オリゴヌクレオチド（配 列番号１２１）を合成し、オリゴマー３の一部に相補的な２１量体オリゴヌクレ オチド（配列番号１１６）を合成した。更に、３種のオリゴマーのいずれにも相 補性をもたない第４の２９量体オリゴヌクレオチド（配列番号１２４）を合成し た。この第４のオリゴヌクレオチドは陰性対照として使用した。 シリコン表面化学及びＤＮＡ固定化 （ａ）４×４（１６ロケーション）アレー １６×１６ウェルアレー形態の２５６個の別個の凹部又はウェルをもつ２×２ ｃｍ²シリコンウェーハを業者（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ Ｃｏｒｐ．，Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘａｓ）から購入した 。ウェルは８００×８００μｍ²、深さ１２０μｍ、１．１２５ピッチであった 。シリコンウェーハを３−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させ、表面 に第１級アミンの均質層を生成した後、ヘテロ２官能性架橋剤ＳＩＡＢに暴露し 、表面にヨードアセトアミド官能基を付けた（例えば実施例２８参照）。 シリコンアレーの各ロケーションに結合するオリゴマーを調製するために、実 施例２８に記載したように１０ｍＭ ＴＣＥＰを使用して各オリゴマーのジスル フィド結合を完全に還元し、ＤＮＡを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に １０μＭの終濃度で再懸濁した。ジスルフィド結合還元の直後に、ほぼ上記実施 例２８に記載したようなプローブ結合条件を使用してウェーハ上の１６個のロケ ーションのヨードアセトアミド官能基にオリゴマーの遊離チオール基を結合した 。ウェーハの１６個 の異なるロケーションに別々に結合するために、ウェーハの表面全体をオリゴヌ クレオチド溶液でフラッシュするのでなく、ロボットピンツールを使用してウェ ーハ上の２５６個のウェルの１６個のロケーション（即ち凹部）の各々に所定修 飾オリゴマーの〜３０ｎｌアリコートを並行して添加し、固定化ＤＮＡの４×４ アレーを作製した。 ロボットピンツールはプローブブロックに収容してＸ、Ｙ及びＺロボット段に 取り付けた１６個のプローブから構成される。ロボット段はガントリーシステム とし、ロボットのアームの下に試料トレーを配置できるようにした。ガントリー ユニット自体は、リニアオプティカルエンコーダーにより位置フィードバック可 能なブラシレスリニアサーボモーターの案内下に夫々２５０及び４００ｍｍ移動 するＸ及びＹアームから構成される。ガントリーユニットのｘｙ軸スライドには リードスクリュー駆動Ｚ軸（５０ｍｍ鉛直移動）が取り付けられており、モータ ー搭載ロータリーオプティカルエンコーダーにより位置フィードバック可能なオ ンラインロータリーサーボモーターにより制御される。システムの作業領域はマ イクロタイタープレート５枚（大抵の場合は洗浄溶液プレート２枚と、最大１１ ５２種の異 なるオリゴヌクレオチド溶液の試料プレート３枚）と２０×２０ｍｍウェーハ１ ０枚までを保持するスライドアウトツーリングプレートを備える。ウェーハは２ 本のバンキングピンでプレートに精密に配置され、真空により固定される。シス テム全体は安全のためにプレキシガラスハウジングに収容され、熱及び振動緩衝 用スチール支持フレームに取り付けられる。運動制御は３軸サーボコントローラ ーとした市販運動コントローラーにより行い、コンピューターに組み込み、必要 に応じて特定アプリケーション用プログラミングコードを書き込む。 ＤＮＡアレーを作製するために、オリゴマー１〜３の溶液を加えた多重ウェル ＤＮＡ源プレートの１６個のウェルに、ソリッドピンエレメントをもつアセンブ リを備えるピンツールを浸してピンの遠端を湿し、ロボットアセンブリによりピ ンアセンブリをシリコンウェーハに移動し、表面接触により試料をスポットした 。こうして、シリコンウェーハ上の２５６個のウェルのうちの１６個の別個のウ ェルの各々に修飾オリゴマー１〜３の１種を共有的に固定化し、固定化ＤＮＡの ４×４アレーを形成した。 ハイブリダイゼーション反応の実施にあたっては、１Ｍ ＮａＣｌを加えたＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ）１ｍｌ中各オリゴヌクレオチド１０μＭの終濃度で３種の相補的 オリゴヌクレオチドと陰性対照オリゴヌクレオチドを混合し、溶液を６５℃に１ ０分間加熱した。直後にシリコンウェーハの表面全体を加熱オリゴヌクレオチド 溶液８００μｌでフラッシュした。シリコンアレーを周囲温度で１時間、次いで ４℃で少なくとも１０分間インキュベートすることにより、相補的オリゴヌクレ オチドを固定化オリゴマーにアニールした。あるいは、オリゴヌクレオチド溶液 をウェーハに加えた後に加熱し、放冷させてハイブリダイズさせてもよい。 ハイブリダイズしたアニールを次に５０ｍＭクエン酸アンモニウム緩衝液で洗 浄し、カチオン交換してＤＮＡ主鎖上のナトリウム及びカリウムイオンを除去し た（Ｐｉｅｌｅｓら（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３１９ １−３１９６）。ロボット圧電シリアルディスペンサー（即ち圧電ピペットシス テム）を使用してアレーの各ロケーションに３−ヒドロキシピコリン酸のマトリ ックス溶液（５０％アセトニトリル中０．７Ｍ ３−ヒドロキシピコリン酸−１ ０％クエン酸アン モニウム；Ｗｕら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ７：１４２−１４６（１９９３））の６ｎｌアリコートを順次加えた。 圧電ピペットシステムはＭｉｃｒｏｄｒｏｐ ＧｍｂＨ，Ｎｏｒｄｅｒｓｔｅ ｄｔ、ドイツから購入したシステムを改造し、分配しようとする溶液を保持する ガラスキャピラリーを包囲するようにこれに結合した圧電エレメントにパルス信 号を送る圧電エレメントドライバーと、キャピラリーに（負圧により）添加又は （正圧により）排出するための圧力トランスデューサーと、添加、排出、分配及 び洗浄のためにキャピラリーを操作するロボットｘｙｚ段及びロボットドライバ ーと、「懸濁」液滴特性を検査できるように圧電エレメントの周波数でパルスさ れるストロボスコープ及びドライバーと、ソース及び指定プレート又は試料ター ゲットのための別個の段（即ちＳｉチップ）と、指定プレートへの添加を検査す るためにロボットアームに搭載されたカメラと、圧力ユニット、ｘｙｚロボット 及び圧電ドライバーを制御するデータステーションを含む。 ３−ＨＰＡ溶液を周囲温度で乾燥させた後、圧電ピペットを使用して水の６ｎ ｌアリコートを各ロケーションに加え、乾燥 マトリックス−ＤＮＡ複合体を再懸濁し、マトリックス−ＤＮＡ複合体を周囲温 度で乾燥すると各ロケーションの底面に均質結晶表面を形成するようにした。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析 図６に示すハイブリダイゼーションアレーの１６個のロケーションの各々でほ ぼ実施例２８に記載したようにＭＡＬＤＩーＴＯＦ ＭＳ分析を実施した。ＤＮ Ａハイブリダイゼーションの１６個のロケーションの各々に特異的にハイブリダ イズしたオリゴヌクレオチドの質量スペクトルは、特定相補的ヌクレオチド配列 に対応する実測質量対電荷比を表す特異的シグナルを各ロケーションに示した。 例えば、オリゴマー１を結合したロケーションのみで質量スペクトルは２３量 体にほぼ等しい７０７２．４の実測質量対電荷比をもつ主要シグナルを示した（ ２３量体の理論質量対電荷比は７０７２．６Ｄａ）。同様に、オリゴマー２を結 合したロケーションのみに実測質量対電荷比３６１８．３３Ｄａ（理論値３６２ ２．４Ｄａ）で１２量体オリゴヌクレオチドの特異的アレーハイブリダイゼーシ ョンが検出され、オリゴマー３を結合したアレーのロケーションのみにＭＪＭ６ の特異的ハイブリ ダイゼーション（実測質量対電荷比６４１５．４）が検出された（理論値６４０ ７．２Ｄａ）。 アレーのロケーションのうちで陰性対照２９量体オリゴヌクレオチドに対応す るシグナル（理論質量対電荷比８９７４．８）を示したものは皆無であり、シリ コンアレーの表面上の特定ロケーションに共有的に固定化したオリゴマーに特定 ターゲットＤＮＡ分子をハイブリダイズできると考えられ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を使用して複数のハイブリダイズアッセイを個々にモニターできると 考えられる。 （ｂ）８×８（６４ロケーション）アレー １６×１６ウェルアレー形態の２５６個の別個の凹部又はウェルをもつ２× ２ｃｍ²シリコンウェーハを業者（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ Ｃｏｒｐ．，Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘａｓ）から購入し た。ウェルは８００×８００μｍ²、深さ１２０μｍ、１．１２５ピッチであっ た。シリコンウェーハを上述のように３−アミノプロピルトリエトキシシランと 反応させ、表面に第１級アミンの均質層を生成した後、ヘテロ２官能性架橋剤Ｓ ＩＡＢに暴露し、表面にヨードアセトアミド官能基を付けた。 ６４素子アレーを作製するために、上記手順に従ってピンツールを使用した。 オリゴマー１〜３の溶液を加えた３８４ウェルＤＮＡソースプレートの１６個の ウェルにピンツールを浸し、シリコンウェーハに移動し、表面接触により試料を スポットした。次に、ツールを洗浄溶液に浸し、ソースプレートの同一の１６個 のウェルに浸し、第１組の１６個のスポットから２．２５ｍｍ離してターゲット にスポットし、完全なサイクルを繰り返し、各ピンから２×２アレーを作製し、 スポットの８×８アレーを形成した（２×２エレメント／ピン×ピン１６本＝合 計６４エレメントにスポット）。 ６４個のロケーションに固定化したオリゴマー１〜３を相補的オリゴヌクレオ チドにハイブリダイズさせ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析により分析した。１ ６ロケーションアレーの場合と同様に、ＤＮＡアレーのロケーションの各々で固 定化チオール含有オリゴマーの各々に相補的オリゴヌクレオチドが特異的にハイ ブリダイズしていることが判明した。 実施例３０ シリコンウェーハに固定化したＤＮＡ鋳型に結合したハイブリダイズしたＤＮＡ プライマーの伸長 ＳＩＡＢを結合したシリコンウェーハを使用して、ほぼ実施例７に記載した手 順に従って固定化ＤＮＡ鋳型のプライマー伸長反応を行うこともできる。 ３’遊離チオール基を含む２７量体オリゴヌクレオチド（配列番号１２５）を ＳＩＡＢ結合シリコンウェーハに例えば実施例２８に記載したように結合した。 １２量体オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１２６）を固定化オリゴヌク レオチドにハイブリダイズし、市販キット（例えばＳｅｑｕｅｎａｓｅ又はＴｈ ｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ，Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ）を 使用してプライマーを伸長させた。製造業者の指示に従って緩衝液中で３種のデ オキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ；ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ） とジデオキシリボヌクレオシドチミジン三リン酸（ｄｄＮＴＰ）の存在下にＳｅ ｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼ又はＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｄ ＮＡポリメラーゼを加えると、１２量体プライマーはシリコンウェーハに結合し たまま３塩基伸長した。次に、ウェーハを上述のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス スペクトロメトリーにより分析した。質量スペクトル結果は元の未伸長１２量体 から１５量体（配列番号１２７） をはっきりと区別し、シリコンウェーハの表面で特異的伸長を実施でき、ＭＡＬ ＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析により検出できることが分かった。 実施例３１ シリコンウェーハに固定化したＤＮＡ鋳型に結合したハイブリダイズしたＤＮＡ プライマーのポリメラーゼ伸長に及ぼすリンカー長の効果 ＳＩＡＢを結合したシリコン表面とターゲットＤＮＡを固定化オリゴマー鋳型 にハイブリダイズすることにより形成されるデュプレクスＤＮＡの間の距離の効 果と酵素の選択を検討した。 ３’末端に加えた３塩基ポリｄＴスペーサー配列以外は同一のＤＮＡ配列の２ 種の遊離チオール含有オリゴヌクレオチド：ＣＴＧＡＴＧＣＧＴＣ ＧＧＡＴＣ ＡＴＣＴＴ ＴＴＴＴ（配列番号１２２）及び ＣＴＧＡＴＧＣＧＴＣ ＧＧＡＴＣＡＴＣＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１２ ５）の３’末端に２種のＳＩＡＢ結合シリコンウェーハを結合した。これらのオ リゴヌクレオチドは合成し、各々別々にＳＩＡＢ架橋剤によりシリコンウェーハ の表面に固定化した（例えば実施例２８参照）。両オリゴヌクレオチドに 共通のヌクレオチド配列の部分に相補的な１２量体オリゴヌクレオチド：ＡＡＡ ＡＡＡＧＡＴＧ ＡＴ（配列番号１２６）、ＧＡＴＧＡＴＣＣＧＡ ＣＧ（配列 番号１２８）、ＧＡＴＣＣＧＡＣＧＣ ＡＴ（配列番号１２９）と共に各ウェー ハをインキュベートし、シリコンウェーハを７５℃で変性させ、ゆっくりと冷却 した。次にウェーハを上述のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー により分析した。 上記実施例３０に記載したように、デュプレクスと表面の間に９塩基スペーサ ーを加えたオリゴマープライマー（配列番号１２５）を使用すると、結合１２量 体オリゴヌクレオチドの３塩基特異的伸長が観察された。ＳＴＡＢ部分とＤＮＡ デュプレクスの間のＤＮＡスペーサー長が０．３、６及び１２の場合にも同様の 結果が観察された。更に、ＳｅｑｕｅｎａｓｅやＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａ ｓｅ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）等の種々のＤＮＡポリメラーゼを使用し て伸長反応を実施することもできる。例えば、ＳＩＡＢリンカーをＤＮＡ鋳型に 直接結合してもよいし、ハイブリダイズしたＤＮＡのプライマー伸長を実施せず にリンカーを加えてもよい。 実施例３２ アポＥ遺伝子におけるスペクトロチップ突然変異検出 本実施例は診断目的で野生型及び突然変異アポリポタンパク質Ｅ遺伝子を検出 するための固定化鋳型のハイブリダイゼーション、プライマー伸長及びマススペ クトロメトリーに関する。本実施例は、未標識対立遺伝子特異的プライマーのプ ライマー伸長とマススペクトロメトリーによる伸長産物の分析を使用して、特定 配列を含む固定化ＤＮＡ分子を検出及び区別できることを立証する。 ３’−遊離チオール基を含む野生型アポリポタンパク質Ｅ遺伝子の対立遺伝子 ３のコーディング配列：５’−ＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＴ ＴＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＧＣＧＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号 ２８０）又はコドン１５８にＧ→Ａ転位をもつ突然変異アポリポタンパク質Ｅ遺 伝子：５’−ＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧ ＴＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＧＣＧＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号２８１）に相補的 な５０塩基合成ＤＮＡ鋳型を実施例２８に記載したように別々のＳＩＡＢ結合シ リコンウェーハに結合した。 ２１量体オリゴヌクレオチドプライマー：５’−ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＡＴ Ｇ ＡＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ−３’（配列 番号２８２）を固定化鋳型の各々にハイブリダイズし、市販キット（例えばＳｅ ｑｕｅｎａｓｅ又はＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ，Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ Ｃｏｒｐ）を使用してプライマーを伸長させた。製造業者の指示に従 って緩衝液中で３種のデオキシリホヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ；ｄＡＴＰ 、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）とジデオキシリボヌクレオシドシトシン三リン酸（ｄｄ ＣＴＰ）の存在下にＳｅｑｕｅｎａｓｅＤＮＡポリメラーゼ又はＴｈｅｒｍｏｓ ｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼを加えると、野生型アポリポタンパク質 Ｅ遺伝子をコードする固定化鋳型に結合した２１量体プライマーは１塩基伸長し 、突然変異形態のアポリポタンパク質Ｅ遺伝子をコードする固定化鋳型に結合し た２１量体プライマーは３塩基伸長した。 本明細書に記載するようにマススペクトロメトリーによりウェーハを分析した 。野生型アポリポタンパク質Ｅ配列は、質量対電荷比６７７１．１７Ｄａ（理論 質量対電荷比６７５３．５Ｄａ）をもつ１塩基伸長したプライマー（２２量体） を質量対電荷比６４９９．６４Ｄａの元の２１量体プライマーから区別する質量 スペクトルを生じた。突然変異アポリポタンパク質Ｅ 配列は、質量対電荷比７３８６．９Ｄａ（理論質量対電荷比７３８６．９Ｄａ） をもつ３塩基伸長したプライマー（２４量体）を質量対電荷比６４９９．６４Ｄ ａの元の２１量体プライマーから区別する質量スペクトルを生じた。 実施例３３ 鎖置換及び固定化相補的核酸へのハイブリダイゼーションによる２本鎖核酸分子 の検出 本実施例は、２４量体プライマーの固定化とデュプレクスＤＮＡ分子の一方の 鎖の特異的ハイブリダイゼーションに関し、選択されたターゲット分子を溶液相 で増幅すると共に、２本鎖分子の検出を可能にする。この方法は単塩基変異の検 出、特に２本鎖フラグメントのゲノムライブラリーのスタリーニングに有用であ る。 ３’−遊離チオール基を含む２４量体プライマーＣＴＧＡＴＧＣＧＴＣ ＧＧ ＡＴＣＡＴＣＴＴ ＴＴＴＴ（配列番号１２２）を実施例２９に記載したように ＳＩＡＢ結合シリコンウェーハに結合した。 １８量体合成オリゴヌクレオチド：５’−ＣＴＧＡＴＧＣＧＴＣＧＧＡＴＣＡ ＴＣ−３（配列番号２８６）を、この１８量 体の１２塩基部分に相補的な配列をもつ１２量体：５’−ＧＡＴＧＡＴＣＣＧＡ ＣＧ−３’（配列番号２８５）とプレミックスした。オリゴヌクレオチドミック スを７５℃まで加熱し、室温までゆっくりと冷却し、デュプレクス分子： の形成を助長した。 実施例３０に記載したハイブリダイゼーション条件を使用してデュプレクス分 子１μＭを混合することにより、デュプレクス分子の１２量体鎖と固定化２４量 体プライマーの特異的ハイブリダイゼーションを実施した。 ウェーハを上述のようにマススペクトロメトリーにより分析した。１２量体の 質量スペクトルには質量対電荷比３６８２．７８Ｄａで特異的ハイブリダイゼー ションが検出された。 実施例３４ １−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチルプロポキシ） フェニル）−１−Ｏ−（（２−シアノエトキシ）−ジイソプロピルアミノホスフ ィノ）エタン Ａ．２−ニトロ−５−（３−ヒドロキシプロポキシ）ベンズアルデヒド ３−ブロモ−１−プロパノール（３．３４ｇ，２４ｍｍｏｌ）を無水アセトニ トリル８０ｍｌ中で５−ヒドロキシ−２−ニトロベンズアルデヒド（３．３４ｇ ，２０ｍｍｏｌ）、Ｋ₂ＣＯ₃（３．５ｇ）及びＫＩ（１００ｍｇ）の存在下に一 晩（１５時間）還流させた。反応混合物を室温まで冷却し、塩化メチレン１５０ ｍｌを加えた。混合物を濾過し、固体残渣を塩化メチレンで洗浄した。有機溶液 をあわせて蒸発乾涸し、塩化メチレン１００ｍｌに再溶解した。得られた溶液を 飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶剤の減圧除去後に所 望生成物４．３１ｇ（９６％）が得られた。 Ｒ_f＝０．３３（ジクロロメタン／メタノール，９５／５）。 ＵＶ（メタノール）最大：３１３，２４０（ショルダー），２１５ｎｍ；最小： ２６６ｎｍ。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１０．２８（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｄ，１Ｈ ），７．３５（ｄ，１Ｈ），７．２２（Ｓ，１Ｈ），４．２２（ｔ，２Ｈ），３ ．５４（ｔ，２Ｈ），１．９０（ｍ，２Ｈ）。¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１８９．９，１５３．０，１４１．６，１３ ４．３，１２７．３，１１８．４， １１４．０，６６．２，５６．９，３１．７。 Ｂ．２−ニトロ−５−（３−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルプロポキシ）ベン ズアルデヒド ２−ニトロ−５−（３−ヒドロキシプロポキシ）ベンズアルデヒド（１ｇ，４ ．４４ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル５０ｍｌに溶かした。この溶液にトリエ チルアミン１ｍｌ、イミダゾール２００ｍｇ及びｔＢＤＭＳＣｌ ０．８ｇ（５ ．３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。メタノール（１ｍｌ ）を加えて反応を停止した。溶剤を減圧除去し、固体残渣を塩化メチレン１００ ｍｌに再溶解した。得られた溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄後、水洗し た。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶剤を減圧除去した。塩化メチレンを用 いて粗混合物をクイックシリカゲルカラムで精製すると、２−ニトロ−５−（３ −Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルプロポキシ）ベンズアルデヒド１．４４ｇ（９ ６％）が得られた。 Ｒ_f＝０．６７（ヘキサン／酢酸エチル，５／１）。 ＵＶ（メタノール）最大：３１７，２４３，２１５ｎｍ；最小：２３５，２６７ ｎｍ。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１０．２８（ｓ，１Ｈ），． ８．１４（ｄ，１Ｈ），７．３２（ｄ，１Ｈ），７．２０（ｓ，１Ｈ），４．２ ０（ｔ，２Ｈ），３．７５（ｔ，２Ｈ），１．９０（ｍ，２Ｈ），０．８５（ｓ ，９Ｈ），０．０２（ｓ，６Ｈ）。¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１８９．６，１６２，７，１４１．５，１３ ４．０，１２７．１，１１８．２，１１３．８，６５．４，５８．５，３１．２ ，２５．５，-３．１，−５．７。 Ｃ．１−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルプロポキシ ）フェニル）エタノール 高減圧乾燥した２−ニトロ−５−（３−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルプロポ キシ）ベンズアルデヒド（１．０２ｇ，３ｍｍｏｌ）を無水塩化メチレン５０ｍ ｌに溶かした。トルエン（３ｍｌ）中２Ｍトリメチルアルミニウムを１０分以内 で滴下し、反応混合物を室温に維持した。更に１０分間撹拌し、混合物を氷冷水 １０ｍｌに注いだ。水相からエマルションを分離し、硫酸ナトリウム１００ｇで 乾燥し、残留水を除去した。溶剤を減圧除去し、塩化メチレン中勾配メタノール を使用して混合物をシリカゲルカラムで精製した。０．９４ｇ（８６％）の所望 生 成物が単離された。 Ｒ_f＝０．３７５（ヘキサン／酢酸エチル，５／１）。 ＵＶ（メタノール）最大：３０６，２３３，２０６ｎｍ；最小：２５５，２２０ ｎｍ。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ８．００（ｄ，１Ｈ），７．３６（ｓ，１Ｈ） ，７．００（ｄ，１Ｈ），５．４９（ｂ，ＯＨ），５．３１（ｑ，1Ｈ），４． １９（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｔ，２Ｈ），１．９５（ｍ，２Ｈ），１．３７（ ｄ，３Ｈ），０．８６（ｓ，９Ｈ），０．０４（ｓ，６Ｈ）。¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１６２．６，１４６．２，１３９．６，１２ ６．９，１１２．９，１１２．５，６４．８，６３．９，５８．７，３１．５， ２５．６，２４．９，−３．４，−５．８。 Ｄ．１−（２−ニトロ−５−（３−ヒドロキシプロポキシ）フェニル）エタノ ール １−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルプロポキシ）フ ェニル）エタノール（０．８９ｇ，２．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ３０ｍｌに溶かし 、ｎＢｕ₄ＮＦ ０．５ｍｍ ｏｌを撹拌下に加えた。混合物を室温で５時間撹拌し、溶剤を減圧除去した。塩 化メチレン中勾配メタノールを使用して残渣をシリカゲルカラムで精製した。１ −（２−ニトロ−５−（３−ヒドロキシプロポキシ）フェニル）エタノール０． ６ｇ（９９％）が得られた。 Ｒ_f＝０．１７（ジクロロメタン／メタノール，９５／５）。 ＵＶ（メタノール）最大：３０４，２３２，２１０ｎｍ；最小：２５５，２１９ ｎｍ。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ８．００（ｄ，１Ｈ），７．３３（ｓ，１Ｈ） ，７．００（ｄ，１Ｈ），５．５０（ｄ，ＯＨ），５．２８（ｔ，ＯＨ），４． ５９（ｔ，１Ｈ），４．１７（ｔ，２Ｈ），３．５７（ｍ，２Ｈ），１．８９（ ｍ，２Ｈ），１．３６（ｄ，２Ｈ）。¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１６２．８，１４６．３，１３９．７，１２ ７．１，１１３．１，１１２．６，６５．５，６４．０，５７．０，３１．８， ２５．０。 Ｅ．１−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチルプロポ キシ）フェニル）エタノール １−（２−ニトロ−５−（３−ヒドロキシプロポキシ）フェ ニル）エタノール（０．４８２ｇ，２ｍｍｏｌ）を無水ピリジンと２回共蒸発さ せ、無水ピリジン２０ｍｌに溶かした。溶液を氷水浴で冷却し、ＤＭＴＣｌ ７ ５０ｍｇ（２．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、メタノ ール０．５ｍｌを加えて反応を停止した。溶剤を減圧除去し、残渣をトルエンと ２回共蒸発させ、ピリジンを完全に除去した。トリエチルアミン数滴を含む塩化 メチレン中勾配メタノールを使用して最終残渣をシリカゲルカラムで精製すると 、所望生成物１−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチル プロポキシ）フェニル）エタノール０．９６ｇ（８９％）が得られた。 Ｒ_f＝０．５０（ジクロロメタン／メタノール，９９／１）。 ＵＶ（メタノール）最大：３５０（ショルダー），３０５，２８３，２７６（シ ョルダー），２３３，２０８ｎｍ；最小：２９０，２５８，２２０ｎｍ。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ８．００（ｄ，１Ｈ），６．８２−７．４２（ ＡｒＨ），５．５２（ｄ，ＯＨ），５．３２（ｍ，１Ｈ），４．２３（ｔ，２Ｈ ），３．７１（ｓ，６Ｈ），３．１７（ｔ，２Ｈ），２．００（ｍ，２ Ｈ），１．３７（ｄ，３Ｈ）。¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１６２．５，１５７．９，１５７．７，１４ ６．１，１４４．９，１４０．１，１３９．７，１３５．７，１２９．５，１２ ８．８，１２７．６，１２７．５，１２７．３，１２６．９，１２６．４，１１ ３．０，１１２．８，１１２．６，８５．２，６５．３，６３．９，５９．０， ５４．８，２８．９，２４．９。 Ｆ．１−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチルプロポ キシ）フェニル）−１−Ｏ−（（２−シアノエトキシ）−ジイソプロピルアミノ ホスフィノ）エタン １−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチルプロポキシ） フェニル）エタノール（４００ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）を高減圧下に乾燥し、 無水塩化メチレン２０ｍｌに溶かした。この溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチ ルアミン０．５ｍｌと２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホ ロアミダイト０．３ｍｌ（１．３４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３ ０分間撹拌し、メタノール０．５ｍｌを加えて反応を停止した。混合物を飽和重 炭酸ナトリウム溶 液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶剤を減圧除去し、トリエチルアミン 数滴を含む塩化メチレン中１％メタノールを使用してクイックシリカゲルカラム で精製すると、所望のホスホロアミダイト５１０ｍｇ（９３％）が得られた。 Ｒ_f＝０．８７（ジクロロメタン／メタノール，９９／１）。 実施例３５ １−（４−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチルプロポキシ）−３−メトキ シ−６−ニトロフェニル）−１−Ｏ−（（２−シアノエトキシ）ジイソプロピル アミノホスフィノ）エタン Ａ．４−（３−ヒドロキシプロポキシ）−３−メトキシアセトフェノン ３−ブロモ−１−プロパノール（５３ｍｌ，３３ｍｍｏｌ）を無水アセトニト リル１００ｍｌ中で４−ヒドロキシ−３−メトキシアセトフェノン（５ｇ，３０ ｍｍｏｌ）、Ｋ₂ＣＯ₃（５ｇ）及びＫＩ（３００ｍｇ）の存在下に一晩（１５時 間）還流させた。室温まで冷却後、反応混合物に塩化メチレン（１５０ｍｌ）を 加えた。混合物を濾過し、固体残渣を塩化メチレンで洗浄した。有機溶液をあわ せて蒸発乾涸し、塩化メチレン１００ｍｌに再溶解した。得られた溶液を飽和Ｎ ａＣｌ溶液で洗浄し、 硫酸ナトリウムで乾燥した。溶剤の減圧除去後に所望生成物６．５ｇ（９６．４ ％）が得られた。 Ｒ_f＝０．４１（ジクロロメタン／メタノール，９５／５）。 ＵＶ（メタノール）最大：３０４，２７３，２２７，２１０ｎｍ；最小：２９１ ，２４４，２１４ｎｍ。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ７．６４（ｄ，１Ｈ），７．４６（ｓ，１Ｈ） ，７．０４（ｄ，１Ｈ），４．５８（ｂ，ＯＨ），４．１２（ｔ，２Ｈ），３． ８０（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｔ，２Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ），１．８８（ ｍ，２Ｈ）。¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１９６．３，１５２．５，１４８．６，１２ ９．７，１２３．１，１１１．５，１１０．３，６５．４，５７．２，５５．５ ，３１．９，２６．３。 Ｂ．４−（３−アセトキシプロポキシ）−３−メトキシアセトフェノン ４−（３−ヒドロキシプロポキシ）−３−メトキシアセトフェノン（３．５ｇ ，１５．６ｍｍｏｌ）を乾燥し、無水アセトニトリル８０ｍｌに溶かした。この 混合物にトリエチルアミン ６ｍｌと無水酢酸６ｍｌを加えた。４時間後にメタノール６ｍｌを加え、溶剤を 減圧除去した。固体残渣をジクロロメタン１００ｍｌに再溶解し、溶液を希重炭 酸ナトリウム溶液で洗浄後、水洗した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶剤 を除去した。塩化メチレンを使用して固体残渣をシリカゲルカラムで精製すると 、４−（３−アセトキシプロポキシ）−３−メトキシアセトフェノン４．１ｇ（ ９８．６％）が得られた。 Ｒ_f＝０．２２（ジクロロメタン／メタノール，９９／１）。 ＵＶ（メタノール）最大：３０３，２７３，２２７，２１０ｎｍ；最小：２９０ ，２４３，２１４ｎｍ。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ７．６２（ｄ，１Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ） ，７．０８（ｄ，１Ｈ），４．１２（ｍ，４Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），２． ５４（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｍ，２Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ）。¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１９６．３，１７０．４，１５２．５，１４ ８．６，１３０．０，１２３．０，１１１．８，１１０．４，６５．２，６０． ８，５５．５，２７．９，２６．３，２０．７。 Ｃ．４−（３−アセトキシプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロアセトフ ェノン ４−（３−アセトキシプロポキシ）−３−メトキシアセトフェノン（３．９９ ｇ，１５ｍｍｏｌ）を水浴中７０％ＨＮＯ₃１５ｍｌに滴下し、反応温度を室温 に維持した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、砕氷３０ｇを加えた。この混 合物をジクロロメタン１００ｍｌで抽出し、有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液 で洗浄した。溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶剤を減圧除去した。塩化メチレ ン中勾配メタノールを使用して粗混合物をシリカゲルカラムで精製すると、所望 生成物４−（３−アセトキシプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロアセトフ ェノン３．８ｇ（８１．５％）とイプソ置換生成物５−（３−アセトキシプロポ キシ）−４−メトキシ−１，２−ジニトロベンゼン０．３８ｇ（８％）が得られ た。 イプソ置換副生物５−（３−アセトキシプロポキシ）−４−メトキシ−１，２− ジニトロベンセン： Ｒ_f＝０．４７（ジクロロメタン／メタノール，９９／１）。 ＵＶ（メタノール）最大：３３４，３３０，２７０，２４０，２１Ｉｎｍ；最小 ：３１０，２８２，２６３，２２３ｎｍ。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ７．３６（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｓ，１Ｈ），４ ．２８（ｔ，２Ｈ），４．１８（ｔ，２Ｈ），４．０２（ｓ，３Ｈ），２．２０ （ｍ，２Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ）。¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１７０．９，１５２．２，１５１．１，１１７． ６，１１１．２，１０７．９，１０７．１，６６．７，６０．６，５６．９，２ ８．２，２０．９。 所望生成物４−（３−アセトキシプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロアセ トフェノン： Ｒ_f＝０．２９（ジクロロメタン／メタノール，９９／１）。 ＵＶ（メタノール）最大：３４４，３００，２４６，２１３ｎｍ；最小：３２０ ，２７０，２２７ｎｍ。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ７．６２（ｓ，１Ｈ），６．７４（ｓ，１Ｈ），４ ．２８（ｔ，２Ｈ），４．２０（ｔ，２Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），２．４８ （ｓ，３Ｈ），２．２０（ｍ，２Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ）。¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２００．０，１７１．０，１５４．３，１４８． ４，１３８．３，１３３．０， １０８．８，１０８．０，６６．１，６０．８，５６．６，３０．４，２８．２ ，２０．９。 Ｄ．１−（４−（３−ヒドロキシプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロフ ェニル）エタノール ４−（３−アセトキシプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロアセトフェノ ン（３．７３ｇ，１２ｍｍｏｌ）にエタノール１５０ｍｌとＫ₂ＣＯ₃ ６．５ｇ を加えた。混合物を室温で４時間撹拌し、ジクロロメタン中５％メタノールを用 いてＴＬＣにかけると反応が完了したことを示した。この同一反応混合物にＮａ ＢＨ₄ ３．５ｇを加え、混合物を室温で２時間撹拌した。アセトン（１０ｍｌ ）を加え、残りのＮａＢＨ₄と反応させた。溶剤を減圧除去し、残渣をシリカゲ ル５０ｇに吸収させた。塩化メチレン中５％メタノールを使用してシリカゲルカ ラムの頂部にシリカゲル混合物を加えると、所望生成物１−（４−（３−ヒドロ キシプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロフェニル）エタノール３．１５ｇ （９７％）が得られた。 脱保護後の中間生成物（４−（３−ヒドロキシプロポキシ）−３−メトキシ−６ −ニトロアセトフェノン： Ｒ_f＝０．６０（ジクロロメタン／メタノール，９５／５）。 最終生成物１−（４−（３−ヒドロキシプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニト ロフェニル）エタノール： Ｒ_f＝０．５０（ジクロロメタン／メタノール，９５／５）。 ＵＶ（メタノール）最大：３４４，３００，２４３，２１９ｎｍ；最小：３１７ ，２６４，２３３ｎｍ。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ７．５４（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｓ，１Ｈ） ，５．４７（ｄ，ＯＨ），５．２７（ｍ，１Ｈ），４．５５（ｔ，ＯＨ），４． ０５（ｔ，２Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），３．５５（ｑ，２Ｈ），１．８８（ ｍ，２Ｈ），１．３７（ｄ，３Ｈ）。¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１５３．４，１４６．４，１３８．８，１３ ７．９，１０９．０，１０８．１，６８．５，６５．９，５７．２，５６．０， ３１．９，２９．６。 Ｅ．１−（４−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチルプロポキシ）−３− メトキシ−６−ニトロフェニル）エタノール １−（４−（３−ヒドロキシプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロフェニ ル）エタノール（０．３２５ｇ，１．２ｍｍｏｌ）を無水ピリジンと２回共蒸発 させ、無水ピリジン１５ｍｌ に溶かした。溶液を氷水浴で冷却し、ＤＭＴＣｌ ４５０ｍｇ（１．３３ｍｍｏ ｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、メタノール０．５ｍｌを加えて 反応を停止した。溶剤を減圧除去し、残渣をトルエンと２回共蒸発させ、ピリジ ンを完全に除去した。トリエチルアミン数滴を含む塩化メチレン中勾配メタノー ルを使用して最終残渣をシリカゲルカラムで精製すると、所望生成物１−（４− （３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチルプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニ トロフェニル）エタノール６０５ｍｇ（８８％）が得られた。 Ｒ_f＝０．５０（シクロロメタン／メタノール，９５／５）。 ＵＶ（メタノール）最大：３５４，３０２，２８２，２７４，２３３，２０９ｎ ｍ；最小：３２２，２９２，２６３，２２２ｎｍ。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ７．５４（ｓ，１Ｈ），６．８−７．４（Ａｒ Ｈ），５．４８（ｄ，ＯＨ），５．２７（ｍ，１Ｈ），４．１６（ｔ，２Ｈ）， ３．８５（ｓ，３Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），３．１５（ｔ，２Ｈ），１．９ ８（ｔ，２Ｈ），１．３７（ｄ，３Ｈ）。¹³ Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１５７．８，１５３．３， １４６．１，１４４．９，１３８．７，１３７．８，１３５．７，１２９．４， １２８．７，１２７．５，１２７．４，１２６．３，１１２．９，１１２．６， １０８．９，１０８．２，８５．１，６５．７，６３．７，５９．２，５５．８ ，５４．８，２９．０，２５．０。 Ｆ．１−（４−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチルプロポキシ）−３− メトキシ−６−ニトロフェニル）−１−Ｏ−（（２−シアノエトキシ）ジイソプ ロピルアミノホスフィノ）エタン １−（４−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチルプロポキシ）−３−メト キシ−６−ニトロフェニル）エタノール（２００ｍｇ，３．５ｍｍｏｌ）を高減 圧下に乾燥し、無水塩化メチレン１５ｍｌに溶かした。この溶液にＮ，Ｎ−ジイ ソプロピルエチルアミン０．５ｍｌと２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ ルクロロホスホロアミダイト０．２ｍｌ（０．８９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混 合物を室温で３０分間撹拌し、メタノール０．５ｍｌを加えて反応を停止した。 混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶剤 を減 圧除去し、トリエチルアミン数滴を含む塩化メチレン中１％メタノールを使用し てクイックシリカゲルカラムで精製すると、所望のホスホロアミダイト１−（４ −（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチルプロポキシ）−３−メトキシ−６− ニトロフェニル）−１−Ｏ−（（２−シアノエトキシ）ジイソプロピルアミノホ スフィノ）エタン２４７ｍｇ（９１．３％）が得られた。 Ｒ_f＝０．８７（ジクロロメタン／メタノール，９９／１）。 実施例３６ オリゴヌクレオチド合成 標準条件下で固相核酸合成（Ｓｉｎｈａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ ｔ.１９８３,２４,５８４３−５８４６；Ｓｉｎｈａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８４，１２，４５３９−４５５７；Ｂｅａｕｃａｇｅら， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ９９３，４９，６１２３−６１９４；及びＭａｔｔｅ ｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８１，１０３，３１８５−３１ ９１参照）により光開裂性リンカーを含むオリゴヌクレオチド結合体を調製した 。更に、より長い結合時間を使用して光開裂性単位と５’末端アミノ基を取 り込ませた。遊離したＤＭＴカチオンの吸光度を測定することにより結合効率を 検出した結果、ホスホロアミダイト１−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−４，４’ −ジメトキシトリチルプロポキシ）フェニル）−１−Ｏ−（（２−シアノエトキ シ）−ジイソプロピルアミノホスフィノ）エタン又は１−（４−（３−Ｏ−４， ４’−ジメトキシトリチルプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロフェニル） −１−Ｏ−（（２−シアノエトキシ）ジイソプロピルアミノホスフィノ）エタン の結合効率は慣用ヌクレオシドホスホロアミダイトと同等であることが判明した 。塩基保護の脱保護と、固体支持体からの結合体の遊離は濃アンモニウムを用い て５５℃で一晩行った。他の結合体の塩基保護の脱保護はＡＭＡ試薬による迅速 脱保護により行った。０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）とア セトニリル勾配（２０分間で５％→２５％）を使用してＨＰＬＣ（トリチル−ｏ ｎ）によりＭＭＴ−ｏｎ結合体上のを精製した。ＭＭＴ又はＣＭＴ保護結合体を 集めて減量し、８０％酢酸水溶液で脱トリチル化（４０分間、０℃）し、脱塩し 、−２０℃で保存した。 実施例３７ 光分解試験 典型例では、蒸留水２００μｌ中に光開裂性リンカーを含むオリゴヌクレオチ ド結合体２ｎｍｏｌに長波長ＵＶランプ（Ｂｌａｋ Ｒａｙ，ＸＸ−１５ＵＶラ ンプ、Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓａｎ Ｇａｂｒｉｅｌ， ＣＡ）で１０ｃｍの距離で照射した（放射ピーク３６５ｎｍ，距離３１ｃｍのラ ンプ強度＝１．１ｍＷ／ｃｍ²）。０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ ７．０）とアセトニリル勾配を使用するＨＰＬＣ（トリチル−ｏｆｆ）により、 得られた混合物を分析した。分析の結果、結合体はＵＶ照射数分以内にリンカー から開裂することが判明した。 等価物 当業者は単に日常実験を使用して本明細書に記載した特定方法の多数の等価物 を認識又は確認することができよう。このような等価物は本発明の範囲に含まれ るとみなされ、以下の請求の範囲により保護される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年１月２８日（１９９９．１．２８） 【補正内容】 ｆ）試料をイオン化／揮発させる段階と、 ｇ）伸長ＤＮＡの質量を検出し、質量によって野生型対立遺伝子が存在するか又 は突然変異対立遺伝子が存在するかを判断し、コドンに突然変異対立遺伝子が存 在する場合には新形成であると診断する段階を含む。１態様では、伸長−ＭＳ分 析を使用してレトロウイルス（ＲＥＴ）癌原遺伝子における突然変異コドン６３ ４の存在を検出する。 別の態様では、形質転換細胞で発現される遺伝子の逆転写と増幅を使用して疾 患を診断する方法を提供する。特に、腫瘍細胞では発現されるが、正常骨髄細胞 等の正常細胞では発現されないカテコールアミン生合成酵素であるチロシンヒド ロキシラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）−ＭＳを使用して神経芽細胞腫を診断する方 法を提供する。本方法は、 ａ）組織試料を得る段階と、 ｂ）試料からポリＡ ＲＮＡを単離する段階と、 ｃ）逆転写を使用してｃＤＮＡライブラリーを調製する段階と、 ｄ）１個のオリゴプライマーがリンカー部分をもつようにして選択した遺伝子の ｃＤＮＡ産物又はその一部を増幅する段階と、 ｅ）リンカー部分を介してＤＮＡを固体支持体に固定化するこ とにより増幅産物を単離する段階と、 ｆ）場合によりＤＮＡを条件付けする段階と、 ｇ）試料をイオン化／揮発させ、選択した遺伝子の発現を表すＤＮＡピークの存 在を検出する段階を含む。例えば、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子の発現は神 経芽細胞腫を表す。 別の態様では、ターゲット核酸から特定末端をもつフラグメントを生成し、マ ススペクトロメトリーにより各フラグメントの質量を測定し、フラグメントを並 べてより大きいターゲット核酸の配列を決定することにより、比較的大きいター ゲット核酸の正確な配列決定が得られる。好ましい態様では、特定末端をもつフ ラグメントは特定塩基を末端にもつ部分又は完全フラグメントである。 特定塩基を末端にもつフラグメントを生成する方法の１例は、例えば転写反応 後に塩基特異的リボヌクレアーゼを使用する。好ましい塩基特異的リボヌクレア ーゼはＴ₁−リボヌクレアーゼ（Ｇ特異的）、Ｕ₂−リボヌクレアーゼ（Ａ特異的 ）、ＰｈｙＭ−リボヌクレアーゼ（Ｕ特異的）及びリボヌクレアーゼＡ（Ｕ／特 異的）から選択される。他の有効な塩基特異的リボヌクレアーゼは実施例２１に 記載するアッセイを使用して同定することができる。修飾ヌクレオチドを未修飾 ヌクレオチドと転写反応させることが好ましい。修飾ヌクレオチドと未修飾ヌク レオチドを約１：１の好ましい比率で組み込むように適当な濃度で転写反応に加 えると最も好ましい。あるいは、修飾ヌクレオチドと未修飾ヌクレオチドで２回 別々にターゲットＤＮＡの転写 を行い、結果を比較してもよい。好ましい修飾ヌクレオチドとしては、ホウ素又 は臭素修飾ヌクレオチド（Ｐｏｒｔｅｒら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ ３４：１１９６３−１１９６９；Ｈａｓａｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：２１５０−２１５７；Ｌｉら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉ ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４４９５−４５０１）、α−チオ修飾ヌクレオ チド及び上述のような質量改変ヌクレオチドが挙げられる。 特定塩基を末端にもつフラグメントを生成する別の方法は、増幅と塩基特異的 ターミネーション反応を併用実施する。例えば、連鎖停止ヌクレオチドに対して 比較的親和性をもつ酵素による重合が指数的増幅を生じ、連鎖停止ヌクレオチド に対して比較的高い親和性をもつ酵素が重合を停止してシーケンシング産物を生 じるように、連鎖停止ヌクレオチドに対して各々異なる親和性をもつ少なくとも ２種の異なるポリメラーゼ酵素を使用して増幅とターミネーション反応を併用実 施することができる。 捕獲は１個の反応チューブ／ウェルから異なるシーケンシングプライマーの分離 、特異的多重増幅産物、ＰＲＯＢＥ産物の単離等に使用することができる。サイ クルシーケンシング等の慣用方法と慣用容量を使用することができる。汎用チッ プデザインにより多種多様のアプリケーションを利用できる。更に、この方法は 高スループットを得るために自動化することができる。 実施例２３ マススペクトロメトリーによる欠失検出 種々のフォーマットを利用して遺伝子内の欠失をマススペクトロメーターによ り検出することができる。例えば、上記実施例に記載したように２本鎖増幅産物 の分子量を測定したり、２本鎖産物の一方又は両方の鎖を単離して質量を測定す ることができる。 あるいは、本実施例に記載するように、特異的酵素反応を実施し、対応する産 物の質量をマススペクトロメトリーにより測定することもできる。欠失寸法は数 十塩基長までとすることができ、この場合も野生型と突然変異対立遺伝子の同時 検出が可能である。特異的産物の同時検出により、個体が特異的対立遺伝子又は 突然変異のホモ接合であるかヘテロ接合であるかを１ 回の反応で同定することが可能である。 材料と方法 ゲノムＤＮＡ 白血球ゲノムＤＮＡは無関係の健康個体から得た。 ＰＣＲ増幅 ターゲットＤＮＡのＰＣＲ増幅は、ストレプトアビジンをコートしたビーズを 捕獲する後期精製段階を実施せずに反応産物を使用できるように設定及び至適化 した。ターゲット増幅及びＰＲＯＢＥ反応用プライマーは、請求の範囲 １．ターゲット核酸分子の特定塩基を末端にもつ核酸フラグメントの並び方の決 定方法であって、 ａ）ターゲット核酸配列と一方の末端にタグを含む核酸分子を得る段階と、 ｂ）ターゲット核酸から特定塩基を末端にもつ核酸フラグメントを生成する段階 と、 ｃ）フラグメントをマススペクトロメトリーフォーマットにより分析し、ターゲ ット核酸分子中の特定塩基を末端にもつ核酸フラグメントの並び方を決定する段 階を含む前記方法。 ２．段階ｂ）においてヌクレアーゼをターゲット核酸と接触させ、特定塩基末端 をもつ核酸フラグメントを生成する請求項１に記載の方法。 ３．ヌクレアーゼがターゲット核酸中の少なくとも１個の制限部位を認識し、こ れを開裂することが可能な制限酵素である請求項２に記載の方法。 ４．ターゲット核酸がデオキシリボ核酸であり、ヌクレアーゼがデオキシリボヌ クレアーゼである請求項２に記載の方法。 ５．ターゲット核酸がリボ核酸であり、ヌクレアーゼがリボヌクレアーゼである 請求項２に記載の方法。 ６．リボヌクレアーゼがＧ特異的Ｔ₁リボヌクレアーゼ、Ａ特異的Ｕ₂リボヌクレ アーゼ、Ａ／Ｕ特異的ＰｈｙＭリボヌクレアーゼ、Ｕ／Ｃ特異的リボヌクレアー ゼＡ、Ｃ特異的ニワトリ肝リボヌクレアーゼ及びクリサビチンから構成される群 から選択される請求項５に記載の方法。 ７．段階ｂ）において増幅と特定塩基ターミネーション反応の併用実施により特 定塩基を末端にもつフラグメントを生成する請求項１に記載の方法。 ８．増幅と特定塩基ターミネーション反応の併用が、少なくとも１種の連鎖停止 ヌクレオチドに対して比較的低い親和性をもつ第１のポリメラーゼと、少なくと も１種の連鎖停止ヌクレオチドに対して比較的高い親和性をもつ第２のポリメラ ーゼを使用して実施される請求項７に記載の方法。 ９．第１及び第２のポリメラーゼが熱安定ＤＮＡポリメラーゼである請求項８に 記載の方法。 １０．熱安定ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴ ａｑ ＦＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ^-）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖ ｅｎｔ（ｅｘｏ^-）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅ ｎｔ（ｅｘｏ^-）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラー ゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ｅｘｏ（−）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕ ｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｕｌ ｔｍａｎ、９ ｄｅｇｒｅｅ Ｎｍ、Ｔｔｈ、Ｈｏｔ Ｔｕｂ、Ｐｙｒｏｃｏｃ ｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ （Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼから構成される群から選択される請求項９に記載 の方法。 １１．段階ｂ）で生成される特定塩基を末端にもつ核酸フラグメントが質量改変 ヌクレオチドを含む請求項１に記載の方法。 １２．タグが３’タグを含む請求項１に記載の方法。 １３．タグが５’タグを含む請求項１に記載の方法。 １４．タグが非天然タグである請求項１２又は１３に記載の方法。 １５．非天然タグがアフィニティタグ及び質量マーカーから構成される群から選 択される請求項１４に記載の方法。 １６．アフィニティタグが核酸の固体支持体固定化を助長する 請求項１５に記載の方法。 １７．アフィニティタグがビオチン又は固体支持体に結合した捕獲核酸配列に結 合することが可能な核酸配列である請求項１６に記載の方法。 １８．生物試料中に存在するターゲット核酸の検出方法であって、 ａ）ターゲット核酸を含む核酸の一部を増幅することが可能な第１組のプライマ ーを使用し、核酸又は第１組のプライマー中のプライマーを請求項９２から１０ ３のいずれか一項に記載の光開裂性リンカーを介して固体支持体に固定化し、生 物試料から得られた核酸で第１回目のポリメラーゼ連鎖反応を実施し、増幅産物 を生成する段階と、 ｂ）増幅産物をマススペクトロメトリーにより検出し、増幅産物が検出された場 合には生物試料中にターゲット核酸が存在すると判断する段階を含む前記方法。 １９．生物試料中に存在するターゲット核酸の検出方法であって、 ａ）ターゲット核酸を含む核酸の一部を増幅することが可能な第１組のプライマ ーを使用し、生物試料から得られた核酸で第 １回目のポリメラーゼ連鎖反応を実施し、第１の増幅産物を生成する段階と、 ｂ）ターゲット核酸を含む第１の増幅産物の少なくとも一部を増幅することが可 能な第２組のプライマーを使用し、第１の増幅産物で第２回目のポリメラーゼ連 鎖反応を実施し、第２の増幅産物を生成する段階と、 ｃ）第２の増幅産物をマススペクトロメトリーにより検出し、第２の増幅産物が 検出された場合には生物試料中にターゲット核酸が存在すると判断する段階を含 み、核酸又は第１組のプライマー中のプライマーもしくは第２組のプライマー中 のプライマーは請求項９２から１０３のいずれか一項に記載の光開裂性リンカー を介して固体支持体に固定化する前記方法。 ２０．ターゲット核酸を固体支持体に固定化し、固定化したターゲット核酸をマ ススペクトロメトリー中に支持体から開裂する請求項１８又は１９に記載の方法 。 ２１．固体支持体がビーズ、平坦表面、チップ、キャピラリー、ピン、コーム及 びウェーハから構成される群から選択される請求項１８又は１９に記載の方法。 ２２．マススペクトロメトリーの前にターゲット核酸を精製す る請求項１８又は１９に記載の方法。 ２３．プライマー又は増幅産物を条件付けする請求項１８又は１９に記載の方法 。 ２４．プライマー又は増幅産物をホスホジエステル主鎖修飾により条件付けする 請求項２３に記載の方法。 ２５．ホスホジエステル主鎖修飾がカチオン交換である請求項２４に記載の方法 。 ２６．プライマー又は増幅産物をアルキル化剤又は塩化トリアルキルシリルとの 接触により条件付けする請求項２３に記載の方法。 ２７．プライマー又は第１もしくは第２の増幅産物の脱プリン感度を低下させる 少なくとも１種のヌクレオチドを加えることにより条件付けを行う請求項２３に 記載の方法。 ２８．ヌクレオチドがＮ７−デアザプリンヌクレオチド、Ｎ９−デアザプリンヌ クレオチド又は２’−フルオロ−２’−デオキシヌクレオチドである請求項２７ に記載の方法。 ２９．組織又は細胞試料中の新形成／悪性の検出方法であって、テロメラーゼを コードするか又は癌原遺伝子の突然変異に特異的であるか又は腫瘍特異的遺伝子 をコードする核酸をマススペ クトロメトリーにより検出することにより試料中のテロメラーゼ活性、癌原遺伝 子の突然変異、腫瘍特異的遺伝子の発現を検出することを特徴とする前記方法。 ３０．組織又は細胞試料中の新形成／悪性の検出方法であって、 ａ）試料からテロメラーゼを単離し、合成ＤＮＡのテロメラーゼ特異的伸長を生 じる条件下で、場合により固定化したテロメア反復に相補的な合成ＤＮＡプライ マーと全４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を加える段階と、 ｂ）テロメラーゼ伸長ＤＮＡ産物を増幅する段階と、 ｃ）ＤＮＡ産物をマススペクトロメトリーにより検出し、テロメラーゼ特異的伸 長が検出された場合には新形成／悪性と判断する段階を含む請求項２９に記載の 方法。 ３１．プライマーが支持体に固定化するためのリンカー部分を含み、リンカー部 分を固体支持体に結合することにより増幅プライマーを単離する請求項３０に記 載の方法。 ３２．生物試料中のテロメラーゼ活性の検出方法であって、 ａ）生物試料と、テロメラーゼ活性により伸長することが可能な基質プライマー と、完全な１組のデオキシヌクレオシド三リン酸をインキュベートする段階と、 ｂ）テロメラーゼ伸長基質プライマーをマススペクトロメトリーにより検出し、 生物試料中のテロメラーゼ活性を検出する段階を含む前記方法。 ３３．基質プライマーを固体支持体に固定化する請求項３２に記載の方法。 ３４．基質プライマーを固体支持体にアレー状に固定化する請求項３３に記載の 方法。 ３５．テロメラーゼ伸長基質プライマーをマススペクトロメトリーの前に増幅す る段階を更に含む請求項３２に記載の方法。 ３６．突然変異癌原遺伝子により形質転換した細胞又は組織の同定方法であって 、 ａ）１個のプライマーが固定化のためのリンカー部分を含むようにして細胞又は 組織試料中で形質転換を表すコドンを含む癌原遺伝子の一部を増幅する段階と、 ｂ）場合によりアレーの形態で固体支持体にリンカー部分を介してＤＮＡを固定 化する段階と、 ｃ）コドンの上流の癌原遺伝子配列に相補的なプライマーをハイブリダイズする 段階と、 ｄ）３ｄＮＴＰ／１ｄｄＮＴＰとＤＮＡポリメラーゼを加え、 ハイブリダイズしたプライマーを次のｄｄＮＴＰロケーションまで伸長する段階 と、 ｅ）試料をイオン化／揮発させる段階と、 ｆ）突然変異癌原遺伝子を表す伸長したＤＮＡの質量を検出し、突然変異癌原遺 伝子により形質転換した細胞又は組織を同定する段階を含む請求項２９に記載の 方法。 ３７．癌原遺伝子がＲＥＴ癌原遺伝子である請求項３６に記載の方法。 ３８．形質転換を表すコドンがＲＥＴ癌原遺伝子のコドン６３４である請求項３ ７に記載の方法。 ３９．腫瘍特異的遺伝子の発現の検出方法であって、 ａ）ポリＡ ＲＮＡを試料から単離する段階と、 ｂ）逆転写を使用してｃＤＮＡライブラリーを調製する段階と、 ｃ）１個がリンカー部分を含む１組のプライマーを使用して腫瘍特異的遺伝子の ｃＤＮＡ産物又はその一部を増幅する段階と、 ｄ）リンカー部分を介してＤＮＡを固体支持体に固定化することにより増幅産物 を単離する段階と、 ｅ）場合によりＤＮＡを条件付けする段階と、 ｆ）試料をイオン化／揮発させ、遺伝子の発現を表すＤＮＡピ ークの存在を検出する段階を含む請求項２９に記載の方法。 ４０．細胞が骨髄細胞であり、遺伝子がチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子であり 、遺伝子の発現が神経芽細胞腫を表す請求項３９に記載の方法。 ４１．マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤ Ｉ−ＴＯＦ）マススペクトロメトリーを使用する２本鎖核酸の直接検出方法であ って、 ａ）細胞又は組織試料から２本鎖ＤＮＡフラグメントを単離する段階と、 ｂ）ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ比を増加する条件として、約４℃以下の温度で分析 用試料を調製することと、マトリックス中で高いＤＮＡ濃度を使用してデュプレ クス形成を誘導することのうちの一方又は両方を含む条件下で分析用２本鎖ＤＮ Ａを調製する段階と、 ｃ）低い加速電圧を使用して段階ｂ）のＤＮＡをイオン化／揮発させる段階と、 ｄ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより２本鎖ＤＮＡの存在を検 出する段階を含む前記方法。 ４２．血縁関係を認識又は突然変異を検出するためのＤＮＡ試 料の比較方法であって、 ａ）複数の生物試料を得る段階と、 ｂ）２個以上のマイクロサテライトＤＮＡ反復配列を含む各試料からのＤＮＡ領 域を増幅する段階と、 ｃ）増幅したＤＮＡの存在をマススペクトロメトリーにより各試料から検出し、 増幅したＤＮＡの分子量を比較し、分子量が異なる場合には試料間に不一致又は 突然変異が存在すると判断する段階を含む前記方法。 ４３．不一致が１個の試料中のＤＮＡにおける突然変異の存在、試料を採取した 個体間の非血縁関係又はＨＬＡ不適合性を表す請求項４２に記載の方法。 ４４．複数のマーカーを同時に試験する請求項４２又は４３に記載の方法。 ４５．核酸配列中のターゲットヌクレオチドの同定方法であって、 ａ）（ｉ）ターゲットヌクレオチドのすぐ下流の核酸配列の一部に一致する５’ 末端と、唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位をコードする配列と、自己相補的な ３’末端をもつ第１のプライマーと、 （ｉｉ）リンカー部分を含む第２の下流プライマーを使用してターゲットヌクレ オチドを含む核酸配列の少なくとも一部を増幅し、ターゲットヌクレオチドを含 む核酸配列の少なくとも一部を含む増幅２本鎖核酸を生成する段階と、 ｂ）リンカー部分を介して増幅２本鎖核酸を固体支持体に固定化する段階と、 ｃ）固定化核酸を変性させ、非固定化鎖を単離する段階と、 ｄ）３’末端をポリメラーゼにより伸長できるように、単離した非固定化鎖の３ ’末端の内部相補的配列をアニールし、自己アニールした核酸を生成する段階と 、 ｆ）ポリメラーセと３ｄＮＴＰと欠損ｄＮＴＰに対応する１ｄｄＮＴＰと共にイ ンキュベートすることにより、自己アニールした核酸を伸長し、伸長核酸を生成 する段階と、 ｇ）伸長した核酸を前記唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位に特異的な制限エン ドヌクレアーゼで間裂する段階と、 ｈ）ターゲットヌクレオチドを同定する段階を含む前記方法。 ４６．ターゲットヌクレオチドの同定が核酸配列中の突然変異を表す請求項４５ に記載の方法。 ４７．伸長した核酸の質量に基づいてターゲットヌクレオチド を同定する請求項４５に記載の方法。 ４８．伸長した核酸の質量をマススペクトロメトリーにより測定する請求項４６ に記載の方法。 ４９．ＲＮＡ増幅を使用して生物試料中のターゲット核酸を検出する方法であっ て、 ａ）ターゲット配列又はその補体に相補的な配列とＲＮＡポリメラーゼプロモー ターをコードする配列を含むプライマーを使用してターゲット核酸を増幅する段 階と、 ｂ）プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡを合成する段 階と、 ｃ）マススペクトロメトリーを使用して得られたＲＮＡを検出し、生物試料中の ターゲット核酸配列の存在を検出する段階を含む前記方法。 ５０．ターゲット核酸配列の存在の検出方法であって、 ａ）ｉ）ＲＮＡポリメラーゼと、 ｉｉ）ヌクレオシド三リン酸と、 ｉｉｉ）ターゲット核酸配列又はその補体とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター とを含む核酸分子を反応混合物中でインキュベートし、ターゲット核酸配列又は その補体を含むＲＮＡ分子 を生成する段階と、 ｂ）マススペクトロメトリーによりＲＮＡ分子を検出し、ターゲット核酸配列の 存在を検出する段階を含む前記方法。 ５１．ターゲット核酸配列を含む核酸分子がＤＮＡであり、ＲＮＡポリメラーゼ がＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである請求項５０に記載の方法。 ５２．段階ａ）の後で段階ｂ）の前に、 ＲＮＡポリメラーゼを不活化する段階と、 ＲＮアーゼフリーのＤＮアーゼＩを使用してＤＮＡを消化する段階を更に含む請 求項５１に記載の方法。 ５３．ターゲット核酸配列の一部に相補的なデテクターオリゴヌクレオチドを、 ターゲット核酸配列を含むＲＮＡ分子にハイブリダイズする段階と、 ハイブリダイズしなかったデテクターオリゴヌクレオチドを除去する段階を更に 含み、 段階ｂ）において、ハイブリダイズしたデテクターオリゴヌクレオチドを検出す ることによりターゲット核酸配列を含むＲＮＡ分子を検出する請求項５０に記載 の方法。 ５４．ターゲット核酸配列の存在の検出方法であって、 ａ）ターゲット配列又はその補体の少なくとも一部に相補的な配列とＲＮＡポリ メラーゼプロモーターをコードする配列を含むプライマーを使用してターゲット 核酸配列を増幅し、ターゲット核酸又はその補体とＲＮＡポリメラーゼプロモー ターを含む増幅核酸分子を生成する段階と、 ｂ）プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸と共 に増幅核酸分子をインキュベートし、ターゲット核酸配列に対応するＲＮＡを生 成する段階と、 ｃ）マススペクトロメトリーを使用してＲＮＡを検出し、ターゲット核酸配列の 存在を検出する段階を含む前記方法。 ５５．生物試料中に存在するターゲット核酸配列の検出方法であって、 ａ）生物試料からターゲット核酸配列を含む核酸分子を得る段階と、 ｂ）マススペクトロメトリーを使用して検出するに十分な密度でターゲット核酸 配列が存在するように、チオール結合を介してターゲット核酸配列を固体支持体 に固定化する段階と、 ｃ）デテクターオリゴヌクレオチドをターゲット核酸配列とハイブリダイズする 段階と、 ｄ）ハイブリダイズしなかったデテクターオリゴヌクレオチドを除去する段階と 、 ｅ）段階ｃ）の産物をイオン化及び揮発させる段階と、 ｆ）デテクターオリゴヌクレオチトをマススペクトロメトリーにより検出し、デ テクターオリゴヌクレオチドが検出される場合には生物試料中にターゲット核酸 配列が存在すると判断する段階を含む前記方法。 ５６．ターゲット核酸配列を固定化前に増幅する請求項５５に記載の方法。 ５７．デテクターオリゴヌクレオチド又はターゲット核酸配列の少なくとも一方 を条件付けしておく請求項５５又は５６に記載の方法。 ５８．固体支持体がビーズ、平坦表面、ピン及びコームから構成される群から選 択される請求項５５から５７のいずれか一項に記載の方法。 ５９．ターゲット核酸をアレーの形態で固定化する請求項５５から５８のいずれ か一項に記載の方法。 ６０．支持体がシリコンウェーハである請求項５５から５９のいずれか一項に記 載の方法。 ６１．クローニング、転写、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応及び鎖置 換増幅から構成される群から選択される増幅法によりターゲット核酸配列を増幅 する請求項５５から６０のいずれか一項に記載の方法。 ６２．マススペクトロメーターがマトリックス介助レーザーデソープション／イ オン化飛行時間、エレクトロスプレー、イオンサイクロトロン共鳴及びフーリエ 変換から構成される群から選択される請求項５５から６１のいずれか一項に記載 の方法。 ６３．少なくとも２種のデテクターオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド 模擬体に質量差をつけ、少なくとも２種のターゲット核酸配列を同時に検出及び 区別することにより試料を条件付けする請求項５５から６２のいずれか一項に記 載の方法。 ６４．少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの長さ又は配列の相違により質量差 をつける請求項６３に記載の方法。 ６５．デテクターオリゴヌクレオチドの塩基、糖又はリン酸部分に質量改変官能 基を導入することにより質量差をつける請求項６４に記載の方法。 ６６．ホスホジエステル結合におけるカチオン交換により質量差をつける請求項 ６３に記載の方法。 ６７．マススペクトロメトリー検出前に質量改変ジデオキシヌクレオシド三リン 酸とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、生物試料から得た核酸分子を ＤＮＡに増幅する請求項５５から６６のいずれか一項に記載の方法。 ６８．マススペクトロメトリー検出前に質量改変リボヌクレオシド三リン酸とＤ ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、生物試料から得た核酸分子をＲＮＡ に増幅する請求項５５から６７のいずれか一項に記載の方法。 ６９．ターゲット核酸配列が遺伝病、染色体異常、遺伝素因、ウイルス感染、真 菌感染及び細菌感染から構成される群から選択される疾患又は症状を表す請求項 ５５から６８のいずれか一項に記載の方法。 ７０．デテクターオリゴヌクレオチドがペプチド核酸である請求項５０から６９ のいずれか一項に記載の方法。 ７１．核酸の配列の決定方法であって、 ａ）配列決定しようとする核酸の多重コピーを得る段階と、 ｂ）多重コピーを第１の末端から第２の末端に向かってエキソヌクレアーゼで開 裂し、個々のヌクレオチドを逐次遊離させる段階と、 ｃ）逐次遊離したヌクレオチドの各々をマススペクトロメトリーにより同定する 段階と、 ｄ）同定したヌクレオチドから核酸の配列を決定する段階を含み、請求項９２か ら１０３のいずれか一項に記載の光開裂性リンカーを介して共有結合により核酸 を固体支持体に固定化する前記方法。 ７２．核酸の配列の決定方法であって、 ａ）配列決定しようとする核酸の多重コピーを得る段階と、 ｂ）多重コピーを第１の末端から第２の末端に向かってエキソヌクレアーゼで開 裂し、複数の組の入れ子核酸フラグメントを生成する段階と、 ｃ）核酸フラグメントの組の各々の分子量をマススペクトロメトリーにより測定 する段階と、 ｄ）核酸フラグメントの組の分子量から核酸の配列を決定する段階を含み、請求 項９２から１０３のいずれか一項に記載の光開裂性リンカーを介して共有結合に より核酸を固体支持体に固定化する前記方法。 ７３．核酸を少なくとも２０ｆｍｏｌ／ｍｍ²の密度で支持体の表面に共有結合 する請求項７１又は７２に記載の方法。 ７４．共有結合がＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエ ートを介して行われる請求項７１から７３のいずれか一項に記載の方法。 ７５．核酸が２’−デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である請求項７１又は７２に記 載の方法。 ７６．核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である請求項７１又は７２に記載の方法。 ７７．エキソヌクレアーゼがヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステ ラーゼ、Ｂａｌ−３１ヌクレアーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌エキ ソヌクレアーゼＶＩＩ、マングマメヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、大腸菌Ｄ ＮＡポリメラーゼ１のエキソヌクレアーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ１のＫｌｅ ｎｏｗフラグメントのエキソヌクレアーゼ活性、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼのエ キソヌクレアーゼ活性、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩ Ｉ、λエキソヌクレアーゼ及びＶＥＮＴ_RＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレア ーゼ活性から構成される群から選択 される請求項７１から７６のいずれか一項に記載の方法。 ７８．核酸が質量改変ヌクレオチドを含む請求項７１から７７のいずれか一項に 記載の方法。 ７９．質量改変ヌクレオチドがエキソヌクレアーゼ活性の程度を変更する請求項 ７８に記載の方法。 ８０．逐次遊離されるヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ遊離後でマススペクト ロメトリー同定の前に質量改変する請求項７８に記載の方法。 ８１．逐次遊離されるヌクレオチドをアルカリホスファターゼと接触させて質量 改変する請求項８０に記載の方法。 ８２．マススペクトロメトリーフォーマットがマトリックス介助レーザーデソー プションマススペクトロメトリー又はエレクトロスプレーマススペクトロメトリ ーである請求項７１から８１のいずれか一項に記載の方法。 ８３．ａ）支持体の表面を３−アミノプロピルトリエトキシシランの溶液と反応 させ、支持体の表面に第１級アミンの均質層を生成する段階と、 ｂ）第１級アミンの均質層をＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミ ノベンゾエートの溶液と反応させることによ り支持体の表面にヨードアセトアミド官能基を付ける段階を含む方法により固定 化を実施する請求項７１から８２のいずれか一項に記載の方法。 ８４．配列番号３２〜３８、４１〜８６、８９、９２、９５、９８、１０１〜１ １０、１１２〜１２３、１２６、１２８及び１２９に記載のヌクレオチド配列の 配列のいずれかの少なくとも約２０、好ましくは約１６個の塩基を含むプライマ ー。 ８５．配列番号１〜２２、２４及び２７〜３２に記載のヌクレオチド配列の配列 のいずれかの少なくとも約２０、好ましくは約１６個の塩基を含むプライマー。 ８６．標識されておらず、場合により、好ましくは５’末端に付けた質量改変部 分を含む請求項８４又は８５に記載のプライマー。 ８７．選択的に開裂可能なリンカーを介して核酸を固体支持体に固定化する請求 項１から１７及び２６から６９のいずれか一項に記載の方法。 ８８．リンカーが熱開裂性、酵素開裂性、光開裂性又は化学開裂性である請求項 ８７に記載の方法。 ８９．リンカーがトリチルリンカーである請求項８７に記載の 方法。 ９０．リンカーが１−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリ チルプロポキシ）フェニル）−１−Ｏ−（（２−シアノエトキシ）ジイソプロピ ルアミノホスフィノ）エタンと１−（４−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリ チルプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロフェニル）−１−Ｏ−（（２−シ アノエトキシ）ジイソプロピルアミノホスフィノ）エタンから構成される群から 選択される請求項８９に記載の方法。 ９１．プライマーがペプチド核酸である請求項１から９０のいずれか一項に記載 の方法。 ９２．式Ｉ： ［式中、Ｒ²⁰はω−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）アルキル及びω− ヒドロキシアルキルから構成される群から選択され、Ｒ²¹は水素、アルキル、ア リール、アルコキシカルボ ニル、アリールオキシカルボニル及びカルボキシから構成される群から選択され 、Ｒ²²は水素及び（ジアルキルアミノ）（ω−シアノアルコキシ）Ｐ−から構成 される群から選択され、ｔは０〜３であり、Ｒ⁵⁰はアルキル、アルコキシ、アリ ール及びアリールオキシから構成される群から選択される］の化合物を含む光感 受性リンカー。 ９３．リンカーが式ＩＩ： ［式中、Ｒ²⁰はω−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）アルキル、ω−ヒ ドロキシアルキル及びアルキルから構成される群から選択され、Ｒ²¹は水素、ア ルキル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル及びカル ボキシから構成される群から選択され、Ｒ²²は水素及び（ジアルキルアミノ）（ ω−シアノアルコキシ）Ｐ−から構成される群から選択され、Ｘ²⁰は水素、アル キル又はＯＲ²⁰から構成される群 から選択される］で表される請求項９２に記載の光開裂性リンカー。 ９４．Ｒ²⁰が３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピル、３−ヒド ロキシプロピル及びメチルから構成される群から選択され、Ｒ²¹が水素、メチル 及びカルボキシから構成される群から選択され、Ｒ²²が水素及び（ジイソプロピ ルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−から構成される群から選択され、Ｘ²⁰が 水素、メチル又はＯＲ²⁰から構成される群から選択される請求項９３に記載の光 開裂性リンカー。 ９５．Ｒ²⁰が３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルであり、Ｒ²¹ がメチルであり、Ｒ²²が（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ −であり、Ｘ²⁰が水素である請求項９３に記載の光開裂性リンカー。 ９６．Ｒ²⁰がメチルであり、Ｒ²¹がメチルであり、Ｒ²²が（ジイソプロピルアミ ノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−であり、Ｘ²⁰が３−（４，４’−ジメトキシト リチルオキシ）プロポキシである請求項９３に記載の光開裂性リンカー。 ９７．式ＩＩＩ： [式中、Ｒ²³は水素及び（ジアルキルアミノ）（ω−シアノアルコキシ）Ｐ−か ら構成される群から選択され、Ｒ²⁴はω−ヒドロキシアルコキシ、ω−（４，４ ’−ジメトキシトリチルオキシ）アルコキシ、ω−ヒドロキシアルキル及びω− （４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）アルキルから構成される群から選択さ れ、アルキル又はアルコキシ鎖上で１個以上のアルキル基により置換されていて もいなくてもよく、ｒ及びｓは各々独立して０〜４であり、Ｒ⁵⁰はアルキル、ア ルコキシ、アリール又はアリールオキシである]の化合物を含む光開裂性リンカ ー。 ９８．Ｒ²⁴がω−ヒドロキシアルキル又はω−（４，４’−ジメトキシトリチル オキシ）アルキルであり、アルキル鎖上でメチル基により置換されている請求項 ９７に記載の光開裂性リンカー。 ９９．Ｒ²³が水素及び（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノ エトキシ）Ｐ−から構成される群から選択され、Ｒ²⁴が３−ヒドロキシプロポキ シ、３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシ、４−ヒドロキシ ブチル、３−ヒドロキシ−１−プロピル、１−ヒドロキシ−２−プロピル、３− ヒドロキシ−２−メチル−１−プロピル、２−ヒドロキシエチル、ヒドロキシメ チル、４−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ブチル、３−（４，４’− ジメトキシトリチルオキシ）−１−プロピル、２−（４，４’−ジメトキシトリ チルオキシ）エチル、１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−２−プロ ピル、３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−２−メチル−１−プロピ ル及び４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチルから構成される群から選択さ れる請求項９７に記載の光開裂性リンカー。 １００．ｒとｓが両方とも０である請求項９９に記載の光開裂性リンカー。 １０１．Ｒ²³が（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−であり、 Ｒ²⁴が３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシ、４−（４，４ ’−ジメトキシトリチルオキシ）ブチル、３−（４，４’−ジメトキシトリチル オキシ） プロピル、２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）エチル、１−（４，４ ’−ジメトキシトリチルオキシ）−２−プロピル、３−（４，４’−ジメトキシ トリチルオキシ）−２−メチル−１−プロピル及び４，４’−ジメトキシトリチ ルオキシメチルから構成される群から選択される請求項１００に記載の光開裂性 リンカー。 １０２．Ｒ²⁴が３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシである 請求項１０１に記載の光開裂性リンカー。 １０３．リンカーが１−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシト リチルプロポキシ）フェニル）−１−Ｏ−（（２−シアノエトキシ）ジイソプロ ピルアミノホスフィノ）エタンと１−（４−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシト リチルプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロフェニル）−１−Ｏ−（（２− シアノエトキシ）ジイソプロピルアミノホスフィノ）エタンから構成される群か ら選択される請求項１０２に記載の光開裂性リンカー。 【手続補正書】 【提出日】平成１３年２月１６日（２００１．２．１６） 【補正内容】 （１）明細書 i) ３頁２行目の「感染性生物」を「感染性微生物」と、同頁１０行目から１３ 行目にかけての「核酸フラグメントの移動度を…同定することができる。」 を「核酸フラグメントの移動度を既知標準と比較することによるゲル電気 泳動により又は同定しようとする配列に相補的なプローブとのハイブリダ イゼーションにより核酸配列を同定することができる。」と訂正する。 ii) ８頁下から４行目の「ｂｕ」を「ｂｙ」と訂正する。 iii) １７頁９行目の「固定化した」を「固定化し」と訂正する。 iv) １８頁１０行目から１１行目にかけての「リンカー部分をもつようにして …癌源遺伝子」を「リンカー部分をもつようにして、形質転換を示唆する コドンを含む選択源癌遺伝子」と、同頁１６行目の「する段階」を「させる 段階」と訂正する。 v) １９頁１行目から２０頁５行目にかけての「ｆ）試料をイオン化／…の発 現は神経芽細胞腫を表す。」を「ｆ）試料をイオン化／揮発させる段階と、 ｇ）伸長ＤＮＡの質量を検出し、質量によって野生型対立遺伝子が存在す るか又は突然変異対立遺伝子が存在するかを判断する段階を含み、コドン に突然変異対立遺伝子が存在する場合には新形成であると診断される。１ 態様では、伸長−ＭＳ分析を使用してレトロウイルス（ＲＥＴ）癌原遺伝 子における突然変異コドン６３４の存在を検出する。 別の態様では、形質転換細胞で発現される遺伝子の逆転写と増幅を使用 して疾患を診断する方法を提供する。特に、腫瘍細胞では発現されるが、 正常骨髄細胞等の正常細胞では発現されないカテコールアミン生合成酵素 であるチロシンヒドロキシラーゼの逆転写酵素（ＲＴ）−ＭＳを使用して 神経芽細胞腫を診断する方法を提供する。本方法は、 ａ）組織試料を得る段階と、 ｂ）試料からポリＡ ＲＮＡを単離する段階と、 ｃ）逆転写を使用してｃＤＮＡライブラリーを調製する段階と、 ｄ）１個のオリゴプライマーがリンカー部分をもつようにして、選択遺伝 子のｃＤＮＡ産物又はその一部を増幅する段階と、 ｅ）リンカー部分を介してＤＮＡを固体支持体に固定化することにより増 幅産物を単離する段階と、 ｆ）場合によりＤＮＡを条件付けする段階と、 ｇ）試料をイオン化／揮発させ、選択遺伝子の発現を表すＤＮＡピークの 存在を検出する段階を含む。例えば、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子の 発現は神経芽細胞腫を表す。」と訂正する。 vi) ２１頁９行目から１１行目にかけての「産物は多数の…長さが異なる。」 を「産物は多数の反物単位に特異的であるか又は反復領域内の第２の部位 突然変異に特異的な塩基の数だけ長さが異なる。」と訂正する。 vii) ２２頁下から３行目の「する５’末端と」を「し、その一部に」と、同頁下 から１行目の「る配列と」を「る配列が続く５’末端と」と訂正する。 viii) ２３頁３行目の「使用して試料中」を「使用して、試料中」と訂正する。 ix) ２６頁２行目の「捕獲配列は」を「その捕獲配列は」と訂正する。 x) ２７頁５行目の「更に、捕獲配列は」を「更に、その捕獲配列は」と、同 頁下から１行目「ａｐｐと検出しようとするＤ^mut」を「同時に検出するａ ｐｐとＤ^mut」と訂正する。 xi) ３６頁下から３行目の「図２５Ｂは…ＨＢＶ陰性の」を「図２５Ｂは核酸 （即ちＰＣＲ）、血清学的及びドットブロットアッセイに対しＨＢＶ陰性 である、」と訂正し、同頁下から２行目の「核酸（即ちＰＣＲ）に対応す る」を削除する。 xii) ３７頁１１行目の「リゴＢとＴ−Ｇミスマッチ」を「リゴＢとともにＴ−Ｇ ミスマッチ」と、同頁同行の「オリゴＣとＡ−Ｃミスマッチ」を「オリゴ ＣとともにＡ−Ｃミスマッチ）」と訂正する。 xiii) ４０頁２行目の「反応混合物で」を「反応混合物中で」と訂正する。 xiv) ５２頁３行目の「選択したＲＮアーゼ」を「選択ＲＮアーゼ」と、同頁６ 行目の「合計約２０ｐｍｏｌ」を「各酵素に関し、合計約２０ｐｍｏ ｌ」と、同頁８行目の「に固定して各酵素を分析」を「に分析用に固定」と 、同頁下から２行目の「開裂の不在」を「開裂しないところ」と訂正する。 xv) ５６頁６行目の「もつ遺伝子」を「ともなう遺伝子」と、同頁８行目の「 にからの」を「から得た」と訂正する。 xvi) ６１頁３行目および５行目（５行目には２箇所）の「上添」を「上付き」と 訂正する。 xvii) ６２頁下から８行目の「レービル」を「レービル（labile）」と、同頁下から ２行目の「を除いて」を「だけをともなう」と訂正する。 xviii)６６頁下から８行目の「樹脂）」を「樹脂」と訂正する。 xix) ９２頁６行目の「シリルヌクレオシド間橋」を「シリルヌクレオシド間橋 （silyl internucleoside bridges）」と訂正する。 xx) ９４頁下から１行目および９５頁下から９行目の「ヌクレオ塩基」を「核 酸塩基」と訂正する。 xxi) １１６頁２行目から１１７頁１８行目にかけての「別の態様では、…併用 実施することができる。」を「別の態様では、ターゲット核酸から特定末端 をもつフラグメントを生成し、マススペクトロメトリーにより各フラグメ ントの質量を測定し、フラグメントを並べてより大きいターゲット核酸の 配列を決定することにより、比較的大きいターゲット核酸の正確な配列決 定が得られる。好ましい態様では、特定末端をもつフラグメントは特定塩 基を末端にもつ部分又は完全フラグメントである。 特定塩基を末端にもつフラグメントを生成する方法の１例は、例えば転 写反応後に塩基特異的リボヌクレアーゼを使用する。好ましい塩基特異的 リボヌクレアーゼはＴ₁−リボヌクレアーゼ（Ｇ特異的）、Ｕ₂−リボヌク レアーゼ（Ａ特異的）、ＰｈｙＭ−リボヌクレアーゼ（Ｕ特異的）及びリ ボヌクレアーゼＡ（Ｕ／特異的）から選択される。他の有効な塩基特異的 リボヌクレアーゼは実施例２１に記載するアッセイを使用して同定するこ とができる。修飾ヌクレオチドを未修飾ヌクレオチドと転写反応させるこ とが好ましい。修飾ヌクレオチドと未修飾ヌクレオチ ドを約１：１の好ましい比率で組み込むように適当な濃度で転写反応に加 えると最も好ましい。あるいは、修飾ヌクレオチドと未修飾ヌクレオチド で２回別々にターゲットＤＮＡの転写を行い、結果を比較してもよい。好 ましい修飾ヌクレオチドとしては、ホウ素又は臭素修飾ヌクレオチド（Ｐ ｏｒｔｅｒら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１９６３ −１１９６９；Ｈａｓａｎら（１９９６）Ｎｕｃ１．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．２４：２１５０−２１５７；Ｌｉら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４４９５−４５０１）、α−チオ修飾ヌクレオチ ド及び上述のような質量改変ヌクレオチドが挙げられる。 特定塩基を末端にもつフラグメントを生成する別の方法は、増幅と塩基 特異的ターミネーション反応を併用実施する。例えば、連鎖停止ヌクレオ チドに対して比較的低い親和性をもつ酵素による重合が指数的に増幅し、 連鎖停止ヌクレオチドに対して比較的高い親和性をもつ酵素が重合を停止 してシーケンシング産物を生じるように、連鎖停止ヌクレオチドに対して 各々異なる親和性をもつ少なくとも２種の異なるポリメラーゼ酵素を使用 して増幅とターミネーション反応を併用実施することができる。」と訂正 する。 xxii) １２０頁４行目から５行目にかけての「をニックする」を「にニックを入れ る」と、同頁１３行目および１４行目の「単位」を「ユニット」と訂正する 。 （２）請求の範囲 別紙の通り （別紙） 請求の範囲 １．ターゲット核酸分子の特定塩基を末端にもつ核酸フラグメントの並び方の決 定方法であって、 ａ）ターゲット核酸配列と一方の末端にタグを含む核酸分子を得る段階と、 ｂ）ターゲット核酸から特定塩基を末端にもつ核酸フラグメントを生成する段階 と、 ｃ）フラグメントをマススペクトロメトリーフォーマットにより分析し、ターゲ ット核酸分子中の特定塩基を末端にもつ核酸フラグメントの並び方を決定する段 階を含む前記方法。 ２．段階ｂ）においてヌクレアーゼをターゲット核酸と接触させ、特定塩基末端 をもつ核酸フラグメントを生成する請求項１に記載の方法。 ３．ヌクレアーゼがターゲット核酸中の少なくとも１個の制限部位を認識し、こ れを開裂することが可能な制限酵素である請求項２に記載の方法。 ４．ターゲット核酸がデオキシリボ核酸であり、ヌクレアーゼがデオキシリボヌ クレアーゼである請求項２に記載の方法。 ５．ターゲット核酸がリボ核酸であり、ヌクレアーゼがリボヌクレアーゼである 請求項２に記載の方法。 ６．リボヌクレアーゼがＧ特異的Ｔ₁リボヌクレアーゼ、Ａ特異的Ｕ₂リボヌクレ アーゼ、Ａ／Ｕ特異的ＰｈｙＭリボヌクレアーゼ、Ｕ／Ｃ特異的リボヌクレアー ゼＡ、Ｃ特異的ニワトリ肝リボヌクレアーゼ及びクリサビチンから構成される群 から選択される請求項５に記載の方法。 ７．段階ｂ）において増幅と特定塩基ターミネーション反応の併用実施により特 定塩基を末端にもつフラグメントを生成する請求項１に記載の方法。 ８．増幅と特定塩基ターミネーション反応の併用が、少なくとも１種の連鎖停止 ヌクレオチドに対して比較的低い親和性をもつ第１のポリメラーゼと、少なくと も１種の連鎖停止ヌクレオチドに対して比較的高い親和性をもつ第２のポリメラ ーゼを使用して実施される請求項７に記載の方法。 ９．第１及び第２のポリメラーゼが熱安定ＤＮＡポリメラーゼである請求項８に 記載の方法。 １０．熱安定ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴ ａｑ ＦＳ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ^-）ＤＮＡポリメ ラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ^-）ＤＮＡポリメラ ーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ^-）ＤＮＡポリメラーゼ 、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ ）ｅｘｏ（−）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡ ポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｕｌｔｍａｎ、９ ｄｅｇｒｅｅ Ｎｍ、Ｔ ｔｈ、Ｈｏｔ Ｔｕｂ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）及 びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼから構成 される群から選択される請求項９に記載の方法。 １１．段階ｂ）で生成される特定塩基を末端にもつ核酸フラグメントが質量改変 ヌクレオチドを含む請求項１に記載の方法。 １２．タグが３’タグを含む請求項１に記載の方法。 １３．タグが５’タグを含む請求項１に記載の方法。 １４．タグが非天然タグである請求項１２又は１３に記載の方法。 １５．非天然タグがアフィニティタグ及び質量マーカーから構成される群から選 択される請求項１４に記載の方法。 １６．アフィニティタグが核酸の固体支持体固定化を助長する請求項１５に記載 の方法。 １７．アフィニティタグがビオチン又は固体支持体に結合した捕獲核酸配列に結 合することが可能な核酸配列である請求項１６に記載の方法。 １８．生物試料中に存在するターゲット核酸の検出方法であって、 ａ）ターゲット核酸を含む核酸の一部を増幅することが可能な第１組のプライマ ーを使用し、核酸又は第１組のプライマー中のプライマーを請求項９２から１０ ３のいずれか一項に記載の光開裂性リンカーを介して固体支持体に固定化し、生 物試料から得られた核酸で第１回目のポリメラーゼ連鎖反応を実施し、 増幅産物を生成する段階と、 ｂ）増幅産物をマススペクトロメトリーにより検出し、増幅産物が検出された場 合には生物試料中にターゲット核酸が存在すると判断する段階を含む前記方法。 １９．生物試料中に存在するターゲット核酸の検出方法であって、 ａ）ターゲット核酸を含む核酸の一部を増幅することが可能な第１組のプライマ ーを使用し、生物試料から得られた核酸で第１回目のポリメラーゼ連鎖反応を実 施し、第１の増幅産物を生成する段階と、 ｂ）ターゲット核酸を含む第１の増幅産物の少なくとも一部を増幅することが可 能な第２組のプライマーを使用し、第１の増幅産物で第２回目のポリメラーゼ連 鎖反応を実施し、第２の増幅産物を生成する段階と、 ｃ）第２の増幅産物をマススペクトロメトリーにより検出し、 第２の増幅産物が検出された場合には生物試料中にターゲット核酸が存在すると 判断する段階を含み、核酸又は第１組のプライマー中のプライマーもしくは第２ 組のプライマー中のプライマーは請求項９２から１０３のいずれか一項に記載の 光開裂性リンカーを介して固体支持体に固定化する前記方法。 ２０．ターゲット核酸を固体支持体に固定化し、固定化したターゲット核酸をマ ススペクトロメトリーの間に支持体から開裂する請求項１８又は１９に記載の方 法。 ２１．固体支持体がビーズ、平坦表面、チップ、キャピラリー、ピン、コーム及 びウェーハから構成される群から選択される請求項１８又は１９に記載の方法。 ２２．マススペクトロメトリーの前にターゲット核酸を精製する請求項１８又は １９に記載の方法。 ２３．プライマー又は増幅産物を条件付けする請求項１８又は１９に記載の方法 。 ２４．プライマー又は増幅産物をホスホジエステル主鎖修飾により条件付けする 請求項２３に記載の方法。 ２５．ホスホジエステル主鎖修飾がカチオン交換である請求項２４に記載の方法 。 ２６．プライマー又は増幅産物をアルキル化剤又は塩化トリアルキルシリルとの 接触により条件付けする請求項２３に記載の方法。 ２７．プライマー又は第１もしくは第２の増幅産物において脱プリン化の感度を 低下する少なくとも１種のヌクレオチドを加えることにより条件付けを行う請求 項２３に記載の方法。 ２８．ヌクレオチドがＮ７−デアザプリンヌクレオチド、Ｎ９−デアザプリンヌ クレオチド又は２’−フルオロ−２’−デオキシヌクレオチドである請求項２７ に記載の方法。 ２９．組織又は細胞試料中の新形成／悪性の検出方法であって、テロメラーゼを コードするか又は癌原遺伝子の突然変異に特異的であるか又は腫瘍特異的遺伝子 をコードする核酸をマススペクトロメトリーにより検出することにより試料中の テロメラーゼ活性、癌原遺伝子の突然変異、腫瘍特異的遺伝子の発現を検出する ことを特徴とする前記方法。 ３０．組織又は細胞試料中の新形成／悪性の検出方法であって、 ａ）試料からテロメラーゼを単離し、合成ＤＮＡのテロメラーゼ特異的伸長を生 じる条件下で、場合により固定化したテロメア反復に相補的な合成ＤＮＡプライ マーと全４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を加える段階と、 ｂ）テロメラーゼ伸長ＤＮＡ産物を増幅する段階と、 ｃ）ＤＮＡ産物をマススペクトロメトリーにより検出し、テロメラーゼ特異的伸 長が検出された場合には新形成／悪性と判断する段階を含む請求項２９に記載の 方法。 ３１．プライマーが支持体に固定化するためのリンカー部分を含み、リンカー部 分を固体支持体に結合することにより増幅プライマーを単離する請求項３０に記 載の方法。 ３２．生物試料中のテロメラーゼ活性の検出方法であつて、 ａ）生物試料と、テロメラーゼ活性により伸長することが可能な基質ブライマー と、完全な１組のデオキシヌクレオシド三リン酸をインキュベートする段階と、 ｂ）テロメラーゼ伸長基質プライマーをマススペクトロメトリーにより検出し、 生物試料中のテロメラーゼ活性を検出する段階を含む前記方法。 ３３．基質プライマーを固体支持体に固定化する請求項３２に記載の方法。 ３４．基質プライマーを固体支持体にアレー状に固定化する請求項３３に記載の 方法。 ３５．テロメラーゼ伸長基質プライマーをマススペクトロメトリーの前に増幅す る段階を更に含む請求項３２に記載の方法。 ３６．突然変異癌原遺伝子により形質転換した細胞又は組織の同定方法であって 、 ａ）１個のプライマーが固定化のためのリンカー部分を含むようにして細胞又は 組織試料中で形質転換を表すコドンを含む癌原遺伝子の一部を増幅する段階と、 ｂ）場合によりアレーの形態で固体支持体にリンカー部分を介してＤＮＡを固定 化する段階と、 ｃ）コドンの上流の癌原遺伝子配列に相補的なプライマーをハイブリダイズさせ る段階と、 ｄ）３ｄＮＴＰ／１ｄｄＮＴＰとＤＮＡポリメラーゼを加え、 ハイブリダイズしたプライマーを次のｄｄＮＴＰロケーションまで伸長する段階 と、 ｅ）試料をイオン化／揮発させる段階と、 ｆ）突然変異癌原遺伝子を表す伸長したＤＮＡの質量を検出し、突然変異癌原遺 伝子により形質転換した細胞又は組織を同定する段階を含む請求項２９に記載の 方法。 ３７．癌原遺伝子がＲＥＴ癌原遺伝子である請求項３６に記載の方法。 ３８．形質転換を表すコドンがＲＥＴ癌原遺伝子のコドン６３４である請求項３ ７に記載の方法。 ３９．腫瘍特異的遺伝子の発現の検出方法であつて、 ａ）ポリＡ ＲＮＡを試料から単離する段階と、 ｂ）逆転写を使用してｃＤＮＡライブラリーを調製する段階と、 ｃ）一組のプライマーのうち一方のプライマーがリンカー部分を含む１組のプラ イマーを使用して腫瘍特異的遺伝子のｃＤＮＡ産物又はその一部を増幅する段階 と ｄ）リンカー部分を介してＤＮＡを固体支持体に固定化することにより増幅産物 を単離する段階と、 ｅ）場合によりＤＮＡを条件付けする段階と、 ｆ）試料をイオン化／揮発させ、遺伝子の発現を表すＤＮＡピークの存在を検出 する段階を含む請求項２９に記載の方法。 ４０．細胞が骨髄細胞であり、遺伝子がチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子であり 、遺伝子の発現が神経芽細胞腫を表す請求項３９に記載の方法。 ４１．マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤ Ｉ−ＴＯＦ）マススペクトロメトリーを使用する２本鎖核酸の直接検出方法であ って、 ａ）細胞又は組織試料から２本鎖ＤＮＡフラグメントを単離する段階と、 ｂ）ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ比を増加する条件として、約４℃以下の温度で分析 用試料を調製することと、マトリックス中で高いＤＮＡ濃度を使用してデュプレ クス形成を誘導することのうちの一方又は両方を含む条件下で分析用２本鎖ＤＮ Ａを調製する段階と、 ｃ）低い加速電圧を使用して段階ｂ）のＤＮＡをイオン化／揮発させる段階と、 ｄ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより２本鎖ＤＮＡの存在を検 出する段階を含む前記方法。 ４２．血縁関係を認識又は突然変異を検出するためのＤＮＡ試料の比較方法であ って、 ａ）複数の生物試料を得る段階と、 ｂ）２個以上のマイクロサテライトＤＮＡ反復配列を含む各試料からのＤＮＡ領 域を増幅する段階と、 ｃ）増幅したＤＮＡの存在をマススペクトロメトリーにより各試料から検出し、 増幅したＤＮＡの分子量を比較し、分子量が異なる場合には試料間に不一致又は 突然変異が存在すると判断する段階を含む前記方法。 ４３．不一致が１個の試料中のＤＮＡにおける突然変異の存在、試料を採取した 個体間の非血縁関係又はＨＬＡ不適合性を表す請求項４２に記載の方法。 ４４．複数のマーカーを同時に試験する請求項４２又は４３に記載の方法。 ４５．核酸配列中のターゲットヌクレオチドの同定方法であって、 ａ）（ｉ）ターゲットヌクレオチドのすぐ下流の核酸配列の一部に一致し、その 一部に、特有の制限エンドヌクレアーゼ部位をコードする配列が続く５’末端と 、自己相補的な３’末端をもつ第１のプライマーと、 （ｉｉ）リンカー部分を含む第２の下流プライマーを使用してターゲットヌクレ オチドを含む核酸配列の少なくとも一部を増幅し、ターゲットヌクレオチドを含 む核酸配列の少なくとも一部を含む増幅２本鎖核酸を生成する段階と、 ｂ）リンカー部分を介して増幅２本鎖核酸を固体支詩体に固定化する段階と、 ｃ）固定化核酸を変性させ、非固定化鎖を単離する段階と、 ｄ）３’末端をポリメラーゼにより伸長できるように、単離した非固定化鎖の３ ’末端の内部相補的(intracomplementary)配列をアニールし、自己アニールした 核酸を生成する段階と、 ｆ）ポリメラーゼと３ｄＮＴＰと欠損ｄＮＴＰに対応する１ｄｄＮＴＰと共にイ ンキュベートすることにより、自己アニールした核酸を伸長し、伸長核酸を生成 する段階と、 ｇ）伸長した核酸を前記特有の制限エンドヌクレアーゼ部位に特異的な制限エン ドヌクレアーゼで開裂する段階と、 ｈ）ターゲットヌクレオチドを同定する段階を含む前記方法。 ４６．ターゲットヌクレオチドの同定が核酸配列中の突然変異を表す請求項４５ に記載の方法。 ４７．伸長した核酸の質量に基づいてターゲットヌクレオチドを同定する請求項 ４５に記載の方法。 ４８．伸長した核酸の質量をマススペクトロメトリーにより測定する請求項４６ に記載の方法。 ４９．ＲＮＡ増幅を使用して生物試料中のターゲット核酸を検出する方法であっ て、 ａ）ターゲット配列又はその相補体に相補的な配列とＲＮＡポリメラーゼプロモ ーターをコードする配列を含むプライマーを使用してターゲット核酸を増幅する 段階と、 ｂ）プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡを合成する段 階と、 ｃ）マススペクトロメトリーを使用して得られたＲＮＡを検出し、生物試料中の ターゲット核酸配列の存在を検出する段階を含む前記方法。 ５０．ターゲット核酸配列の存在の検出方法であって、 ａ）ｉ）ＲＮＡポリメラーゼと、 ｉｉ）ヌクレオシド三リン酸と、 ｉｉｉ）ターゲット核酸配列又はその相補体とＲＮＡポリメラーゼのプロモータ ーとを含む核酸分子を反応混合物中でインキュベートし、ターゲット核酸配列又 はその相補体を含むＲＮＡ分子を生成する段階と、 ｂ）マススペクトロメトリーによりＲＮＡ分子を検出し、ターゲット核酸配列の 存在を検出する段階を含む前記方法。 ５１．ターゲット核酸配列を含む核酸分子がＤＮＡであり、ＲＮＡポリメラーゼ がＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである請求項５０に記載の方法。 ５２．段階ａ）の後で段階ｂ）の前に、 ＲＮＡポリメラーゼを不活化する段階と、 ＲＮアーゼフリーのＤＮアーゼＩを使用してＤＮＡを消化する段階を更に含む請 求項５１に記載の方法。 ５３．ターゲット核酸配列の一部に相補的なデテクターオリゴヌクレオチドを、 ターゲット核酸配列を含むＲＮＡ分子にハイブリダイズさせる段階と、 ハイブリダイズしなかったデテクターオリゴヌクレオチドを除去する段階を更に 含み、 段階ｂ）において、ハイブリダイズしたデテクターオリゴヌクレオチドを検出す ることによりターゲット核酸配列を含むＲＮＡ分子を検出する請求項５０に記載 の方法。 ５４．ターゲット核酸配列の存在の検出方法であって、 ａ）ターゲット配列又はその相補体の少なくとも一部に相補的な配列とＲＮＡポ リメラーゼプロモーターをコードする配列を含むプライマーを使用してターゲッ ト核酸配列を増幅し、ターゲット核酸又はその相補体とＲＮＡポリメラーゼプロ モーターを含む増幅核酸分子を生成する段階と、 ｂ）プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸と共 に増幅核酸分子をインキュベートし、ターゲット核酸配列に対応するＲＮＡを生 成する段階と、 ｃ）マススペクトロメトリーを使用してＲＮＡを検出し、ターゲット核酸配列の 存在を検出する段階を含む前記方法。 ５５．生物試料中に存在するターゲット核酸配列の検出方法であつて、 ａ）生物試料からターゲット核酸配列を含む核酸分子を得る段階と、 ｂ）マススペクトロメトリーを使用して検出するに十分な密度でターゲット核酸 配列が存在するように、チオール結合を介してターゲット核酸配列を固体支持体 に固定化する段階と、 ｃ）デテクターオリゴヌクレオチドをターゲット核酸配列とハイブリダイズさせ る段階と、 ｄ）ハイブリダイズしなかったデテクターオリゴヌクレオチドを除去する段階と 、 ｅ）段階ｃ）の産物をイオン化及び揮発させる段階と、 ｆ）デテクターオリゴヌクレオチドをマススペクトロメトリーにより検出し、デ テクターオリゴヌクレオチドが検出される場合には生物試料中にターゲット核酸 配列が存在すると判断する段階を含む前記方法。 ５６．ターゲット核酸配列を固定化前に増幅する請求項５５に記載の方法。 ５７．デテクターオリゴヌクレオチド又はターゲット核酸配列の少なくとも一方 を条件付けしておく請求項５５又は５６に記載の方法。 ５８．固体支持体がビーズ、平坦表面、ピン及びコームから構成される群から選 択される請求項５５から５７のいずれか一項に記載の方法。 ５９．ターゲット核酸をアレーの形態で固定化する請求項５５から５８のいずれ か一項に記載の方法。 ６０．支持体がシリコンウェーハである請求項５５から５９のいずれか一項に記 載の方法。 ６１．クローニング、転写、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応及び鎖置 換増幅から構成される群から選択される増幅法によりターゲット核酸配列を増幅 する請求項５５から６０のいずれか一項に記載の方法。 ６２．マススペクトロメーターがマトリックス介助レーザーデソープション／イ オン化飛行時間、エレクトロスプレー、イオンサイクロトロン共鳴及びフーリエ 変換から構成される群から選択される請求項５５から６１のいずれか一項に記載 の方法。 ６３．少なくとも２種のデテクターオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド 摸擬体に質量差をつけ、少なくとも２種のターゲット核酸配列を同時に検出及び 区別することにより試料を条件付けする請求項５５から６２のいずれか一項に記 載の方法。 ６４．少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの長さ又は配列の相違により質量差 をつける請求項６３に記載の方法。 ６５．デテクターオリゴヌクレオチドの塩基、糖又はリン酸部分に質量改変官能 基を導入することにより質量差をつける請求項６４に記載の方法。 ６６．ホスホジエステル結合におけるカチオン交換により質量差をつける請求項 ６３に記載の方法。 ６７．マススペクトロメトリー検出前に質量改変ジデオキシヌクレオシド三リン 酸とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、生物試料から得た核酸分子を ＤＮＡに増幅する請求項５５から６６のいずれか一項に記載の方法。 ６８．マススペクトロメトリー検出前に質量改変リボヌクレオシド三リン酸とＤ ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、生物試料から得た核酸分子をＲＮＡ に増幅する請求項５５から６７のいずれか一項に記載の方法。 ６９．ターゲット核酸配列が遺伝病、染色体異常、遺伝素因、ウイルス感染、真 菌感染及び細菌感染から構成される群から選択される疾患又は症状を表す請求項 ５５から６８のいずれか一項に記載の方法。 ７０．デテクターオリゴヌクレオチドがペプチド核酸である請求項５０から６９ のいずれか一項に記載の方法。 ７１．核酸の配列の決定方法であって、 ａ）配列決定しようとする核酸の多重コピーを得る段階と、 ｂ）多重コピーを第１の末端から第２の末端に向かってエキソヌクレアーゼで開 裂し、個々のヌクレオチドを逐次遊離させる段階と、 ｃ）逐次遊離したヌクレオチドの各々をマススペクトロメトリーにより同定する 段階と、 ｄ）同定したヌクレオチドから核酸の配列を決定する段階を含み、請求項９２か ら１０３のいずれか一項に記載の光開裂性リンカーを介して共有結合により核酸 を固体支持体に固定化する前記方法。 ７２．核酸の配列の決定方法であって、 ａ）配列決定しようとする核酸の多重コピーを得る段階と、 ｂ）多重コピーを第１の末端から第２の末端に向かってエキソヌクレアーゼで開 裂し、複数の組の入れ子核酸フラグメントを生成する段階と、 ｃ）核酸フラグメントの組の各々の分子量をマススペクトロメトリーにより測定 する段階と、 ｄ）核酸フラグメントの組の分子量から核酸の配列を決定する段階を含み、請求 項９２から１０３のいずれか一項に記載の光開裂性リンカーを介して共有結合に より核酸を固体支持体に固定化する前記方法。 ７３．核酸を少なくとも２０ｆｍｏｌ／ｍｍ²の密度で支持体の表面に共有結合 させる請求項７１又は７２に記載の方法。 ７４．共有結合がＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエ ートを介して行われる請求項７１から７３のいずれか一項に記載の方法。 ７５．核酸か２’−デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である請求項７１又は７２に記 載の方法。 ７６．核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である請求項７１又は７２に記載の方法。 ７７．エキソヌクレアーゼがヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステ ラーゼ、Ｂａｌ−３１ヌクレアーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌エキ ソヌクレアーゼＶＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼ１のエキソヌクレアーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ１のＫ１ ｅｎｏｗフラグメントのエキソヌクレアーゼ活性、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのエ キソヌクレアーゼ活性、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩ Ｉ、λエキソヌクレアーゼ及びＶＥＮＴ_RＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレア ーゼ活性から構成される群から選択される請求項７１から７６のいずれか一項に 記載の方法。 ７８．核酸が質量改変ヌクレオチドを含む請求項７１から７７のいずれか一項に 記載の方法。 ７９．質量改変ヌクレオチドがエキソヌクレアーゼ活性の程度を変更する請求項 ７８に記載の方法。 ８０．逐次遊離されるヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ遊離後、マススペクト ロメトリー同定前に質量改変する請求項７８に記載の方法。 ８１．逐次遊離されるヌクレオチドをアルカリホスファターゼと接触させて質量 改変する請求項８０に記載の方法。 ８２．マススペクトロメトリーフォーマットがマトリックス介助レーザーデソー プションマススペクトロメトリー又はエレクトロスプレーマススペクトロメトリ ーである請求項７１から８１のいずれか一項に記載の方法。 ８３．ａ）支持体の表面を３−アミノプロピルトリエトキシシランの溶液と反応 させ、支持体の表面に第１級アミンの均質層を生成する段階と、 ｂ）第１級アミンの均質層をＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミ ノベンゾエートの溶液と反応させることにより支持体の表面にヨードアセトアミ ド官能基を付ける段階を含む方法により固定化を実施する請求項７１から８２の いずれか一項に記載の方法。 ８４．配列番号３２〜３８、４１〜８６、８９、９２、９５、９８、１０１〜１ １０、１１２〜１２３、１２６、１２８及び１２９に記載のヌクレオチド配列の 配列のいずれかの少なくとも約２０、好ましくは約１６個の塩基を含むプライマ 。 ８５．配列番号１〜２２、２４及び２７〜３２に記載のヌクレオチド配列の配列 のいずれかの少なくとも約２０、好ましくは約１６個の塩基を含むプライマー。 ８６．標識されておらず、場合により、好ましくは５’末端に付けた質量改変部 分を含む請求項８４又は８５に記載のプライマー。 ８７．選択的に開裂可能なリンカーを介して核酸を固体支持体に固定化する請求 項１から１７及び２６から６９のいずれか一項に記載の方法。 ８８．リンカーが熱開裂性、酵素開裂性、光開裂性又は化学開裂性である請求項 ８７に記載の方法。 ８９．リンカーがトリチルリンカーである請求項８７に記載の方法。 ９０．リンカーが１−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリ チルプロポキシ）フェニル）−１−Ｏ−（（２−シアノエトキシ）ジイソプロピ ルアミノホスフィノ）エタンと１−（４−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリ チルプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロフェニル）−１−Ｏ−（（２−シ アノエトキシ）ジイソプロピルアミノホスフィノ）エタンから構成される群から 選択される請求項８９に記載の方法。 ９１．プライマーがペプチド核酸である請求項１から９０のいずれか一項に記載 の方法。 ９２．式Ｉ：［式中、Ｒ²⁰はω−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）アルキル及びω− ヒドロキシアルキルから構成される群から選択され、Ｒ²¹は水素、アルキル、ア リール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル及びカルボキシから 構成される群から選択され、Ｒ²²は水素及び（ジアルキルアミノ）（ω−シアノ アルコキシ）Ｐ−から構成される群から選択され、ｔは０〜３であり、Ｒ⁵⁰はア ルキル、アルコキシ、アリール及びアリールオキシから構成される群から選択さ れる］の化合物を含む光感受性リンカー。 ９３．リンカーが式ＩＩ： ［式中、Ｒ²⁰はω−（４，４）−ジメトキシトリチルオキシ）アルキル、ω−ヒ ドロキシアルキル及びアルキルから構成される群から選択され、Ｒ²¹は水素、ア ルキル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル及びカル ボキシから構成される群から選択され、Ｒ²²は水素及び（ジアルキルアミノ）（ ω−シアノアルコキシ）Ｐ−から構成される群から選択され、Ｘ²⁰は水素、アル キル又はＯＲ²⁰から構成される群から選択される］で表される請求項９２に記載 の光開裂性リンカー。 ９４．Ｒ²⁰が３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピル、３−ヒド ロキシプロピル及びメチルから構成される群から選択され、Ｒ²¹が水素、メチル 及びカルボキシから購成される群から選択され、Ｒ²²が水素及び（ジイソプロピ ルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−から構成される群から選択され、Ｘ²⁰が 水素、メチル又はＯＲ²⁰から構成される群から選択される請求項９３に記載の光 開裂性リンカー。 ９５．Ｒ²⁰が３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルであり、Ｒ²¹ がメチルであり、Ｒ²²が（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ −であり、Ｘ²⁰が水素である請求項９３に記載の光開裂性リンカー。 ９６．Ｒ²⁰がメチルであり、Ｒ²¹がメチルであり、Ｒ²²が（ジイソプロピルアミ ノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−であり、Ｘ²⁰が３−（４，４’−ジメトキシト リチルオキシ）プロポキシである請求項９３に記載の光開裂性リンカー。 ９７．式ＩＩＩ： ［式中、Ｒ²³は水素及び（ジアルキルアミノ）（ω−シアノアルコキシ）Ｐ−か ら構成される群から選択され、Ｒ²⁴はω−ヒドロキシアルコキシ、ω−（４，４ ’−ジメトキシトリチルオキシ）アルコキシ、ω−ヒドロキシアルキル及びω− （４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）アルキルから構成される群から選択さ れ、アルキル又はアルコキシ鎖上で１個以上のアルキル基により置換されていて もいなくてもよく、ｒ及びｓは各々独立して０〜４であり、Ｒ⁵⁰はアルキル、ア ルコキシ、アリール又はアリールオキシである］の化合物を含む光開裂性リンカ ー。 ９８．Ｒ²⁴がω−ヒドロキシアルキル又はω−（４，４’−ジメトキシトリチル オキシ）アルキルであり、アルキル鎖上でメチル基により置換されている請求項 ９７に記載の光開裂性リンカー。 ９９．Ｒ²³が水素及び（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−か ら構成される群から選択され、Ｒ²⁴が３−ヒドロキシプロポキシ、３−（４，４ ’−ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシ、４−ヒドロキシブチル、３−ヒド ロキシ−１−プロピル、１−ヒドロキシ−２−プロピル、３−ヒドロキシ−２− メチル−１−プロピル、２−ヒドロキシエチル、ヒドロキシメチル、４−（４， ４’−ジメトキシトリチルオキシ）ブチル、３−（４，４’−ジメトキシトリチ ルオキシ）−１−プロピル、２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）エチ ル、１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−２−プロピル、３−（４， ４’−ジメトキシトリチルオキシ）−２−メチル−１−プロピル及び４，４’− ジメトキシトリチルオキシメチルから構成される群から選択される請求項９７に 記載の光開裂性リンカー。 １００．ｒとｓが両方とも０である請求項９９に記載の光開裂性リンカー。 １０１．Ｒ²³が（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−であり、 Ｒ²⁴が３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシ、４−（４，４ ’−ジメトキシトリチルオキシ）ブチル、３−（４，４’−ジメトキシトリチル オキシ）プロピル、２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）エチル、１− （４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−２−プロピル、３−（４，４’−ジ メトキシトリチルオキシ）−２−メチル−１−プロピル及び４，４’−ジメトキ シトリチルオキシメチルから構成される群から選択される請求項１００に記載の 光開裂性リンカー。 １０２．Ｒ²⁴が３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシである 請求項１０１に記載の光開裂性リンカー。 １０３．リンカーが１−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシト リチルプロポキシ）フェニル）−１−Ｏ−（（２−シアノエトキシ）ジイソプロ ピルアミノホスフィノ）エタンと１−（４−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシト リチルプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロフェニル）−１−Ｏ−（（２− シアノエトキシ）ジイソプロピルアミノホスフィノ）エタンから構成される群か ら選択される請求項１０２に記載の光開裂性リンカー。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ０８／７４６，０３６ (32)優先日 平成８年11月６日(1996．11．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７４６，０５５ (32)優先日 平成８年11月６日(1996．11．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７８６，９８８ (32)優先日 平成９年１月23日(1997．1．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７８７，６３９ (32)優先日 平成９年１月23日(1997．1．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／９３３，７９２ (32)優先日 平成９年９月19日(1997．9．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／９４７，８０１ (32)優先日 平成９年10月８日(1997．10．8) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ブラウン，アンドレアス アメリカ合衆国、カリフオルニア・92030、 サン・デイエゴ、カーメル・クリーク・ロ ード・11237―６ (72)発明者 ラフ，デイビツド・エム イギリス国、ベリツクシヤー・テイー・デ イー・14・55・エイ、アイマス、デイーン ヘツド・ロード・32 (72)発明者 シヤン，コービン アメリカ合衆国、カリフオルニア・92121、 サン・デイエゴ、アンドロメダ・ロード・ 8655 (72)発明者 フアン・デン・ボーム，デイルク ドイツ国、20253・ハンブルク、エツペン ドルフアー・ベーク・205・デー (72)発明者 ユリンケ，クリスチアン ドイツ国、20255・ハンブルク、ロームベ ルクシユトラーセ・22 (72)発明者 ルーペルト，アンドレアス ドイツ国、デー―35440・リンデン、ハウ プトシユトラーセ・10

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ターゲット核酸分子の配列の決定方法であって、 ａ）ターゲット核酸から少なくとも２個の核酸フラグメントを生成する段階と、 ｂ）少なくとも２個のフラグメントをマススペクトロメトリーフォーマットによ り分析し、ターゲット核酸分子の配列を決定する段階を含む前記方法。 ２．段階ａ）においてエンドヌクレアーゼをターゲット核酸と接触させ、少なく とも２個の核酸フラグメントを生成する請求項１に記載の方法。 ３．エンドヌクレアーゼがターゲット核酸中の少なくとも１個の制限部位を認識 し、これを開裂することが可能な制限酵素である請求項２に記載の方法。 ４．ターゲット核酸がデオキシリボ核酸であり、ヌクレアーゼがデオキシリボヌ クレアーゼである請求項２に記載の方法。 ５．ターゲット核酸がリボ核酸であり、ヌクレアーゼがリボヌクレアーゼである 請求項２に記載の方法。 ６．リボヌクレアーゼがＧ特異的Ｔ₁リボヌクレアーゼ、Ａ特異 的Ｕ₂リボヌクレアーゼ、Ａ／Ｕ特異的ＰｈｙＭリボヌクレアーゼ、Ｕ／Ｃ特異 的リボヌクレアーゼＡ、Ｃ特異的ニワトリ肝リボヌクレアーゼ及びクリサビチン から構成される群から選択される請求項５に記載の方法。 ７．段階ａ）において増幅と特定塩基ターミネーション反応の併用実施により核 酸フラグメントを生成する請求項１に記載の方法。 ８．増幅と特定塩基ターミネーション反応の併用が、少なくとも１種の連鎖停止 ヌクレオチドに対して比較的低い親和性をもつ第１のポリメラーゼと、少なくと も１種の連鎖停止ヌクレオチドに対して比較的高い親和性をもつ第２のポリメラ ーゼを使用して実施される請求項７に記載の方法。 ９．第１及び第２のポリメラーゼが熱安定ＤＮＡポリメラーゼである請求項８に 記載の方法。 １０．熱安定ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴ ａｑ ＦＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ^-）ＤＮＡポリ メラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ^-）ＤＮＡポリメ ラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ^-）ＤＮＡポリメ ラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅ ｎａｓｅ、ｅｘｏ（−）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｕｌｔｍａｎ、９ ｄｅｇｒｅｅ Ｎｍ、Ｔｔｈ、Ｈｏｔ ＴＵｂ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐ ｆｕ）及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ から構成される群から選択される請求項９に記載の方法。 １１．段階ａ）で生成される少なくとも２個の核酸フラグメントが質量改変ヌク レオチドを含む請求項１に記載の方法。 １２．少なくとも２個のフラグメントが３’タグを含む請求項１に記載の方法。 １３．少なくとも２個のフラグメントが５’タグを含む請求項１に記載の方法。 １４．タグが非天然タグである請求項１２又は１３に記載の方法。 １５．非天然タグがアフィニティタグ及び質量マーカーから構成される群から選 択される請求項１４に記載の方法。 １６．アフィニティタグが核酸の固体支持体固定化を助長する 請求項１５に記載の方法。 １７．アフィニティタグがビオチン又は固体支持体に結合した捕獲核酸配列に結 合することが可能な核酸配列である請求項１６に記載の方法。 １８．少なくとも２個の核酸フラグメントを並べてターゲット核酸の配列を決定 する段階を更に含む請求項１に記載の方法。 １９．生物試料中に存在するターゲット核酸の検出方法であって、 ａ）ターゲット核酸を含む核酸の一部を増幅することが可能な第１組のプライマ ーを使用し、生物試料から得られた核酸で第１回目のポリメラーゼ連鎖反応を実 施し、第１の増幅産物を生成する段階と、 ｂ）第１の増幅産物をマススペクトロメトリーにより検出し、ターゲット核酸が 検出された場合には生物試料中にターゲット核酸が存在すると判断する段階を含 む前記方法。 ２０．段階ｂ）の前に、ターゲット核酸を含む第１の増幅産物の少なくとも一部 を増幅することが可能な第２組のプライマーを使用し、第１の増幅産物で第２回 目のポリメラーゼ連鎖反応を実施する請求項１９に記載の方法。 ２１．段階ｂ）の前にターゲット核酸を固体支持体に固定化する請求項１９又は ２０に記載の方法。 ２２．ターゲット核酸を可逆的に固定化する請求項２１に記載の方法。 ２３．ターゲット核酸が化学的、酵素的又は物理的方法により固体支持体から開 裂可能である請求項２２に記載の方法。 ２４．光開裂性結合により固定化を行う請求項２３に記載の方法。 ２５．ターゲット核酸を段階ｂ）中に支持体から開裂する請求項２２に記載の方 法。 ２６．固体支持体がビーズ、平坦表面、チップ、キャピラリー、ピン、コーム及 びウェーハから構成される群から選択される請求項２１に記載の方法。 ２７．固体支持体に固定化した相補的捕獲核酸分子と、ターゲット核酸配列と異 なる核酸分子の一部のハイブリダイゼーションにより固定化を行う請求項２１に 記載の方法。 ２８．段階ｂ）の前にターゲット核酸を精製する請求項１９又は２０に記載の方 法。 ２９．プライマー又は第１もしくは第２の増幅産物を条件付け する請求項１９又は２０に記載の方法。 ３０．プライマー又は第１もしくは第２の増幅産物をホスホジエステル主鎖修飾 により条件付けする請求項２９に記載の方法。 ３１．ホスホジエステル主鎖修飾がカチオン交換である請求項３０に記載の方法 。 ３２．プライマー又は第１もしくは第２の増幅産物をアルキル化剤又は塩化トリ アルキルシリルとの接触により条件付けする請求項２９に記載の方法。 ３３．プライマー又は第１もしくは第２の増幅産物の脱プリン感度を低下させる 少なくとも１種のヌクレオチドを加えることにより条件付けを行う請求項２９に 記載の方法。 ３４．ヌクレオチドがＮ７もしくはＮ９−デアザプリンヌクレオチド又は２’− フルオロ−２’−デオキシヌクレオチドである請求項３３に記載の方法。 ３５．組織又は細胞試料中の新形成／悪性の検出方法であって、テロメラーゼを コードするか又は癌原遺伝子の突然変異に特異的であるか又は腫瘍特異性遺伝子 をコードする核酸をマススペクトロメトリーにより検出することにより試料中の テロメラーゼ活性、癌原遺伝子の突然変異、腫瘍特異的遺伝子の発現を検 出することを特徴とする前記方法。 ３６．組織又は細胞試料中の新形成／悪性の検出方法であって、 ａ）試料からテロメラーゼを単離し、合成ＤＮＡのテロメラーゼ特異的伸長を生 じる条件下で、場合により固定化したテロメア反復に相補的な合成ＤＮＡプライ マーと全４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を加える段階と、 ｂ）テロメラーゼ伸長ＤＮＡ産物を増幅する段階と、 ｃ）ＤＮＡ産物をマススペクトロメトリーにより検出し、テロメラーゼ特異的伸 長が検出された場合には新形成／悪性と判断する段階を含む請求項３５に記載の 方法。 ３７．プライマーが支持体に固定化するためのリンカー部分を含み、リンカー部 分を固体支持体に結合することにより増幅プライマーを単離する請求項３６に記 載の方法。 ３８．形質転換細胞又は組織の同定方法であって、 ａ）１個のプライマーが固定化のためのリンカー部分を含むようにして細胞又は 組織試料中で形質転換を表すコドンを含む癌原遺伝子の一部を増幅する段階と、 ｃ）場合によりアレーの形態で固体支持体にリンカー部分を介してＤＮＡを固定 化する段階と、 ｄ）コドンの上流の癌原遺伝子配列に相補的なプライマーをハイブリダイズする 段階と、 ｅ）３ｄＮＴＰ／１ｄｄＮＴＰとＤＮＡポリメラーゼを加え、ハイブリダイズし たプライマーを次のｄｄＮＴＰロケーションまで伸長する段階と、 ｆ）試料をイオン化／揮発させる段階と、 ｇ）伸長したＤＮＡの質量を検出し、質量によって野生型対立遺伝子が存在する か又は突然変異対立遺伝子が存在するかを判断し、コドンに突然変異対立遺伝子 が存在する場合には新形成であると診断する段階を含む請求項３５に記載の方法 。 ３９．癌原遺伝子がＲＥＴ癌原遺伝子である請求項３８に記載の方法。 ４０．腫瘍特異的遺伝子の発現の検出方法であって、 ａ）ポリＡ ＲＮＡを試料から単離する段階と、 ｃ）逆転写を使用してｃＤＮＡライブラリーを調製する段階と、 ｄ）１個のオリゴプライマーがリンカー部分を含むようにして腫瘍特異的遺伝子 のｃＤＮＡ産物又はその一部を増幅する段階と、 ｅ）リンカー部分を介してＤＮＡを固体支持体に固定化するこ とにより増幅産物を単離する段階と、 ｆ）場合によりＤＮＡを条件付けする段階と、 ｇ）試料をイオン化／揮発させ、遺伝子の発現を表すＤＮＡピークの存在を検出 する段階を含む請求項３５に記載の方法。 ４１．細胞が骨髄細胞であり、遺伝子がチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子であり 、遺伝子の発現が神経芽細胞腫を表す請求項４０に記載の方法。 ４２．マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化(ＭＡＬＤＩ)−飛行 時間（ＴＯＦ）マススペクトロメトリーを使用する２本鎖核酸の直接検出方法で あって、 ａ）細胞又は組織試料から２本鎖ＤＮＡフラグメントを単離する段階と、 ｂ）ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ比を増加する条件として、低温（即ち４℃）で分析 用試料を調製することと、マトリックス中で高いＤＮＡ濃度を使用してデュプレ クス形成を誘導することのうちの１つ又は全部を含む条件下で分析用２本鎖ＤＮ Ａを調製する段階と、 ｃ）低いイオン加速電圧を使用して段階ｂ）の試料をイオン化／揮発させる段階 と、 ｄ）２本鎖ＤＮＡの存在を検出する段階を含む前記方法。 ４３．血縁関係を認識又は突然変異を検出するためのＤＮＡ試料の比較方法であ って、 ａ）複数の生物試料を得る段階と、 ｂ）２個以上のマイクロサテライトＤＮＡ反復配列を含む各試料からのＤＮＡ領 域を増幅する段階と、 ｃ）増幅したＤＮＡをイオン化／揮発させる段階と、 ｄ）増幅したＤＮＡの存在を検出し、増幅したＤＮＡの分子量を比較し、分子量 が異なる場合には試料間に不一致が存在すると判断する段階を含む前記方法。 ４４．不一致が１個の試料中のＤＮＡにおける突然変異の存在、試料を採取した 個体間の非血縁関係又はＨＬＡ不適合性を表す請求項４３に記載の方法。 ４５．複数のマーカーを同時に試験する請求項４３又は４４に記載の方法。 ４６．試料中のターゲット核酸の検出方法であって、 ａ）（ｉ）ターゲットコドンのすぐ下流のターゲットＤＮＡの一部に一致する５ ’末端と、唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する配列と、自己相補的な ３’末端をもつ第１のプラ イマーと、 （ｉｉ）タグを含む第２の下流プライマーを使用してターゲット核酸配列を増幅 する段階と、 ｂ）リンカー部分を介して２本鎖増幅ＤＮＡを固体支持体に固定化する段階と、 ｃ）固定化ＤＮＡを変性させ、非固定化ＤＮＡ鎖を単離する段階と、 ｄ）３’末端をポリメラーゼにより伸長できるように、単離した非固定化ＤＮＡ 鎖の３’末端の内部相補的配列をアニールする段階と、 ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ、３ｄＮＴＰ／１ｄｄＮＴＰを加えてアニールしたＤＮ Ａを伸長する段階と、 ｇ）伸長した２本鎖ステムループＤＮＡを前記唯一の制限エンドヌクレアーゼで 開裂し、開裂したステムループＤＮＡを除去する段階と、 ｉ）伸長産物をイオン化／揮発させる段階と、 ｊ）伸長したターゲット核酸の存在を検出し、野生型と質量の異なるＤＮＡフラ グメントが存在する場合にはターゲットコドンに突然変異が存在すると判断する 段階を含む前記方法。 ４７．ＲＮＡ増幅を使用して生物試料中のターゲット核酸を検出する方法であっ て、ターゲット配列に相補的な領域とプロモータ−をコードする領域を含むプラ イマーを使用してターゲット核酸を増幅する段階と、プロモーターを認識するＲ ＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡを合成する段階と、マススペクトロメトリー を使用して得られたＲＮＡを検出する段階を含む前記方法。 ４８．配列番号１〜２２、２４、２７〜３８、４１〜８６、８９、９２、９５、 ９８、１０１〜１１０、１１２〜１２３、１２６、１２８及び１２９に記載のヌ クレオチド配列の配列のいずれかの全塩基又は少なくとも約２０、好ましくは約 １６個の塩基を含み、プライマーが標識されていないマススペクトロメトリー分 析用プライマー。 ４９．質量改変部分を更に含む請求項４８に記載のプライマー。 ５０．生物試料中に存在するターゲット核酸配列の検出方法であって、 ａ）生物試料からターゲット核酸配列を含む核酸分子を得る段階と、 ｂ）マススペクトロメトリーを使用して検出するに十分な密度 でターゲットが存在するように、チオール結合を介してターゲット配列を支持体 に固定化する段階と、 ｃ）デテクターオリゴヌクレオチドをターゲット核酸配列とハイブリダイズする 段階と、 ｄ）ハイブリダイズしなかったデテクターオリゴヌクレオチドを除去する段階と 、 ｅ）段階ｃ）の産物をイオン化及び揮発させる段階と、 ｆ）デテクターオリゴヌクレオチドをマススペクトロメトリーにより検出し、デ テクターオリゴヌクレオチドが検出される場合には生物試料中にターゲット核酸 配列が存在すると判断する段階を含む前記方法。 ５１．ターゲット核酸分子を固定化前に増幅する請求項５０に記載の方法。 ５２．デテクターオリゴヌクレオチド又はターゲット核酸配列の少なくとも一方 を条件付けしておく請求項５０又は５２に記載の方法。 ５３．固体支持体がビーズ、平坦表面、ピン及びコームから構成される群から選 択される請求項５０から５２のいずれか一項に記載の方法。 ５４．ターゲット核酸をアレーの形態で固定化する請求項５０から５３のいずれ か一項に記載の方法。 ５５．支持体がシリコンウェーハである請求項５０から５４のいずれか一項に記 載の方法。 ５６．クローニング、転写、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反 応（ＬＣＲ）及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）から構成される群から選択される増幅法 によりターゲット核酸分子を増幅する請求項５１から５５のいずれか一項に記載 の方法。 ５７．マススペクトロメーターがマトリックス介助レーザーデソープション／イ オン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）、イオン サイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）及びフーリエ変換から構成される群から選択され る請求項５０から５６のいずれか一項に記載の方法。 ５８．少なくとも２種のデテクターオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド 模擬体に質量差をつけることにより試料を条件付けして、少なくとも２種のター ゲット核酸配列を同時に検出及び区別する請求項５０から５７のいずれか一項に 記載の方法。 ５９．少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの長さ又は配列の 相違により質量差をつける請求項５８に記載の方法。 ６０．デテクターオリゴヌクレオチドの塩基、糖又はリン酸部分に質量改変官能 基を導入することにより質量差をつける請求項５９に記載の方法。 ６１．ホスホジエステル結合におけるカチオン交換により質量差をつける請求項 ５８に記載の方法。 ６２．マススペクトロメトリー検出前に質量改変ジデオキシヌクレオシド三リン 酸とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、生物試料から得た核酸分子を ＤＮＡに増幅する請求項５０から６１のいずれか一項に記載の方法。 ６３．マススペクトロメトリー検出前に質量改変リボヌクレオシド三リン酸とＤ ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、生物試料から得た核酸分子をＲＮＡ に増幅する請求項５０から６２のいずれか一項に記載の方法。 ６４．ターゲット核酸配列が遺伝病、染色体異常、遺伝素因、ウイルス感染、真 菌感染及び細菌感染から構成される群から選択される疾患又は症状を表す請求項 ５０から６３のいずれか一項に記載の方法。 ６５．核酸の配列の決定方法であって、 （ｉ）配列決定しようとする核酸の多重コピーを得る段階と、 （ｉｉ）多重コピーを第１の末端から第２の末端に向かってエキソヌクレアーゼ で開裂し、個々のヌクレオチドを逐次遊離させる段階と、 （ｉｉｉ）逐次遊離したヌクレオチドの各々をマススペクトロメトリーにより同 定する段階と、 （ｉｖ）同定したヌクレオチドから核酸の配列を決定する段階を含み、少なくと も１個の硫黄原子を介して共有結合により核酸を固体支持体に固定化する前記方 法。 ６６．核酸の配列の決定方法であって、 （ｉ）配列決定しようとする核酸の多重コピーを得る段階と、 （ｉｉ）多重コピーを第１の末端から第２の末端に向かってエキソヌクレアーゼ で開裂し、複数の組の入れ子核酸フラグメントを生成する段階と、 （ｉｉｉ）核酸フラグメントの組の各々の分子量をマススペクトロメトリーによ り測定する段階と、 （ｉｖ）核酸フラグメントの組の分子量から核酸の配列を決定する段階を含み、 少なくとも１個の硫黄原子を介して共有結合により核酸を固体支持体に固定化す る前記方法。 ６７．核酸を少なくとも２０ｆｍｏｌ／ｍｍ²の密度で支持体の表面に共有結合 する請求項６５又は６６に記載の方法。 ６８．共有結合が形成されるような条件下でチオール反応性基を含む核酸とチオ ール含有不溶性支持体を反応させ、不溶性支持体に核酸を固定化する方法により 固定化を実施する請求項５０から６７のいずれか一項に記載の方法。 ６９．不溶性支持体をチオール含有試薬で修飾し、チオール含有不溶性支持体を 形成する段階を更に含む請求項６８に記載の方法。 ７０．チオール反応性架橋剤がＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）ア ミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）である請求項６８又は６９に記載の方法。 ７１．核酸が２’−デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である請求項６５又は６６に記 載の方法。 ７２．核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である請求項６５又は６６に記載の方法。 ７３．エキソヌクレアーゼがヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステ ラーゼ、Ｂａｌ−３１ヌクレアーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌エキ ソヌクレアーゼＶＩＩ、マ ングマメヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１のエキ ソヌクレアーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ１のＫｌｅｎｏｗフラグメントのエキ ソヌクレアーゼ活性、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ のエキソヌクレアーゼ活性、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼのエキソ ヌクレアーゼ活性、大腸菌エキソヌタレアーゼＩＩＩ、λエキソヌクレアーゼ及 びＶＥＮＴ_RＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性から構成される群か ら選択される請求項６５から７１のいずれか一項に記載の方法。 ７４．核酸が質量改変ヌクレオチドを含む請求項６５から７４のいずれか一項に 記載の方法。 ７５．質量改変ヌクレオチドがエキソヌクレアーゼ活性の程度を変更する請求項 ７４に記載の方法。 ７６．逐次遊離されるヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ遊離後でマススペクト ロメトリー同定の前に質量改変する請求項７４に記載の方法。 ７７．逐次遊離されるヌクレオチドをアルカリホスファターゼと接触させて質量 改変する請求項７６に記載の方法。 ７８．マススペクトロメトリーフォーマットがマトリックス介助レーザーデソー プション（ＭＡＬＤＩ）マススペクトロメトリー又はエレクトロスプレー（ＥＳ ）マススペクトロメトリーである請求項６５から７７のいずれか一項に記載の方 法。 ７９．支持体の表面を３−アミノプロピルトリエトキシシランの溶液と反応させ 、支持体の表面に第１級アミンの均質層を生成する段階と、第１級アミンの均質 層をＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＴＡ Ｂ）の溶液と反応させることにより支持体の表面にヨードアセトアミド官能基を 付ける段階を含む方法により固定化を実施する請求項６５から７９のいずれか一 項に記載の方法。 ８０．配列番号１〜２２、２４、２７〜３８、４１〜８６、８９、９２、９５、 ９８、１０１〜１１０、１１２〜１２３、１２６、１２８及び１２９に記載のヌ クレオチド配列の配列のいずれかの少なくとも約２０、好ましくは約１６個の塩 基を含むプライマー。 ８１．標識されておらず、場合により、好ましくは５’末端に付けた質量改変部 分を含む請求項８０に記載のプライマー。 ８２．選択的に開裂可能なリンカーを介して核酸を固体支持体 に固定化する請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。 ８３．リンカーが熱開裂性、酵素開裂性、光開裂性又は化学開裂性である請求項 ８２に記載の方法。 ８２．リンカーがトリチルリンカーである請求項８２に記載の方法。 ８３．リンカーが１−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリ チルプロポキシ）フェニル）−１−Ｏ−（（２−シアノエトキシ）ジイソプロピ ルアミノホスフィノ）エタンと１−（４−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリ チルプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロフェニル）−１−Ｏ−（（２−シ アノエトキシ）ジイソプロピルアミノホスフィノ）エタンから構成される群から 選択される請求項８２に記載の方法。 ８４．式Ｉ： ［式中、Ｒ²⁰はω−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）アルキル及びω− ヒドロキシアルキルから構成される群から選 択され、Ｒ²¹は水素、アルキル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオ キシカルボニル及びカルボキシから構成される群から選択され、Ｒ²²は水素及び （ジアルキルアミノ）（ω−シアノアルコキシ）Ｐ−から構成される群から選択 され、ｔは０〜３であり、Ｒ⁵⁰はアルキル、アルコキシ、アリール及びアリール オキシから構成される群から選択される］の化合物を含む光感受性リンカー。 ８５．リンカーが式ＩＩ： ［式中、Ｒ²⁰はω−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）アルキル、ω−ヒ ドロキシアルキル及びアルキルから構成される群から選択され、Ｒ²¹は水素、ア ルキル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル及びカル ボキシから構成される群から選択され、Ｒ²²は水素及び（ジアルキルアミノ）（ ω−シアノアルコキシ）Ｐ−から構成される群から選択され、Ｘ²⁰は水素、アル キル又はＯＲ²⁰から構成される群 から選択される］で表される請求項８４に記載の光開裂性リンカー。 ８６．Ｒ²⁰が３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピル、３−ヒド ロキシプロピル及びメチルから構成される群から選択され、Ｒ²¹が水素、メチル 及びカルボキシから構成される群から選択され、Ｒ²²が水素及び（ジイソプロピ ルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−から構成される群から選択され、Ｘ²⁰が 水素、メチル又はＯＲ²⁰から構成される群から選択される請求項８５に記載の光 開裂性リンカー。 ８７．Ｒ²⁰が３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルであり、Ｒ²¹ がメチルであり、Ｒ²²が（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ −であり、Ｘ²⁰が水素である請求項８５に記載の光開裂性リンカー。 ８８．Ｒ²⁰がメチルであり、Ｒ²¹がメチルであり、Ｒ²²が（ジイソプロピルアミ ノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−であり、Ｘ²⁰が３−（４，４’−ジメトキシト リチルオキシ）プロポキシである請求項８６に記載の光開裂性リンカー。 ８８．式ＩＩＩ： ［式中、Ｒ²³は水素及び（ジアルキルアミノ）（ω−シアノアルコキシ）Ｐ−か ら構成される群から選択され、Ｒ²⁴はω−ヒドロキシアルコキシ、ω−（４，４ ’−ジメトキシトリチルオキシ）アルコキシ、ω−ヒドロキシアルキル及びω− （４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）アルキルから構成される群から選択さ れ、アルキル又はアルコキシ鎖上で１個以上のアルキル基により置換されていて もいなくてもよく、ｒ及びｓは各々独立して０〜４であり、Ｒ⁵⁰はアルキル、ア ルコキシ、アリール又はアリールオキシである］の化合物を含む光開裂性リンカ ー。 ８９．Ｒ²⁴がω−ヒドロキシアルキル又はω−（４，４’−ジメトキシトリチル オキシ）アルキルであり、アルキル鎖上でメチル基により置換されている請求項 ８８に記載の光開裂性リンカー。 ９０．Ｒ²³が水素及び（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノ エトキシ）Ｐ−から構成される群から選択され、Ｒ²⁴が３−ヒドロキシプロポキ シ、３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシ、４−ヒドロキシ ブチル、３−ヒドロキシ−１−プロピル、１−ヒドロキシ−２−プロピル、３− ヒドロキシ−２−メチル−１−プロピル、２−ヒドロキシエチル、ヒドロキシメ チル、４−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ブチル、３−（４，４’− ジメトキシトリチルオキシ）−１−プロピル、２−（４，４’−ジメトキシトリ チルオキシ）エチル、１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−２−プロ ピル、３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−２−メチル−１−プロピ ル及び４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチルから構成される群から選択さ れる請求項８８に記載の光開裂性リンカー。 ９１．ｒとｓが両方とも０である請求項９０に記載の光開裂性リンカー。 ９２．Ｒ²³が（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）Ｐ−であり、Ｒ²⁴ が３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシ、４−（４，４’ −ジメトキシトリチルオキシ）ブチル、３−（４，４’−ジメトキシトリチルオ キシ）プロピ ル、２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）エチル、１−（４，４’−ジ メトキシトリチルオキシ）−２−プロピル、３−（４，４’−ジメトキシトリチ ルオキシ）−２−メチル−１−プロピル及び４，４’−ジメトキシトリチルオキ シメチルから構成される群から選択される請求項９１に記載の光開裂性リンカー 。 ９３．Ｒ²⁴が３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシである請 求項９２に記載の光開裂性リンカー。 ９４．リンカーが１−（２−ニトロ−５−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリ チルプロポキシ）フェニル）−１−Ｏ−（（２−シアノエトキシ）ジイソプロピ ルアミノホスフィノ）エタンと１−（４−（３−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリ チルプロポキシ）−３−メトキシ−６−ニトロフェニル）−１−Ｏ−（（２−シ アノエトキシ）ジイソプロピルアミノホスフィノ）エタンから構成される群から 選択される請求項８４に記載の光開裂性リンカー。