KR20010043409A - 거대분자의 적외선 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화질량 분석법 - Google Patents

거대분자의 적외선 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화질량 분석법 Download PDF

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Abstract

핵산 분자 또는 폴리펩타이드 등의 생물학적 거대분자, 및 적외선(IR)을 흡수하는 액체 매트릭스를 포함하는 혼합물이 제공된다. 이들 혼합물은 IR 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화(IR-MALDI) 질량 분석법에 의한 생물학적 거대분자의 분석에 유용하다. 또한, IR-MALDI 질량 분석법을 사용하여 생물학적 거대분자를 분석하는 방법이 제공된다. 예를 들면, 샘플에서 생물학적 거대분자의 존재 또는 동일성을 검출하는 방법 또는 생물학적 거대분자를 서열 분석하는 방법이 제공된다.

Description

거대분자의 적외선 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분석법{Infrared matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of macromolecules}
관련 출원
미국에 있어서, 본 출원은, 발명의 명칭이 "액체 매트릭스를 사용한 핵산의 IR-MALDI 질량 분석법"인, 프란쯔 힐렌캄프(Franz Hillenkamp)가 1998년 5월 7일자로 출원한 미국 특허원 제09/074,936호의 부분 계속 출원이다. 가능하다면, 상기 출원의 내용은 본원에서 이의 전체가 참조로서 도입된다.
최근 들어, 다수의 인간 유전자 질병에 대한 분자 생물학이 재조합 DNA 기술의 적용에 의해 밝혀졌다. 예를 들어, 유방암과 같은 각종 암 뿐만 아니라 혈우병, 지중해빈혈, 뒤시엔느 근경직증, 헌팅톤 질환, 알츠하이머 질환 및 낭포성 섬유증을 포함하여, 3000종 이상의 질병이 유전적인 기원[참조: Cooper and Krawczak, "Human Genome Mutations"(BIOS Publ. 1993)]인 것으로 알려져 있다. 유전적 질병을 일으키는 돌연변이 유전자 이외에도, 예를 들어 삼체성 21(다운 증후군), 삼체성 13(파타우 증후군), 삼체성 18(에드워드 증후군), 단체성(터너 증후군) 및 기타 성 염색체 이수성(예: 클리네펠터 증후군(XXY))을 포함하여, 염색체 이상을 일으키는 특정한 선천성 결함이 있다.
기타 유전적 질병은 유전자 내에 비정상적인 트리뉴클레오타이드 반복체 수에 의해 유발된다. 이들 질병에는 헌팅톤 질환, 전립선암, 척수 소뇌성 운동실조 1(SCA-1), 취약 X 증후군[참조: Kremer et al., Science 252: 1711-14(1991); Fu et al., Cell 67: 1047-58(1991); Hirst et al., J. Med. Genet. 28: 824-29(1991)]; 위축성 근경직증 유형 I[참조: Mahadevan et al., Science 255: 1253-55(1992); Brook et al., Cell 68: 799-808(1992)], 신장 질환[또한 척수 및 연수 근경직증(La Spada et al., Nature 352: 77-79(1991))], 마카도-요셉(Machado-Joseph) 질병, 및 치아적색 및 담창구 위축증이 포함된다. 비정상적인 삼중선 반복체 수는 암호화 영역, 엑손의 비암호화 영역, 인트론 또는 프로모터와 같은 조절 인자를 포함하는 모든 유전자 영역에 존재할 수 있다. 전립선암과 같은 특정한 질병에 있어서, 삼중선 반복체 수는 실질적으로 질병의 예후와 상호관련된다.
이러한 증거는, 트리뉴클레오타이드 반복체의 증폭이 상술된 질병 각각에서 분자 병변에 관여함을 나타낸다. 이들 트리뉴클레오타이드 반복체중 일부는 비-암호화 DNA에 존재하는 것 같지만, 이들은 궁극적으로 유전자 발현에 영향을 미치는 게놈 영역의 변화와 명백히 관련된다. 종양 세포에서 체세포 돌연변이를 유발하는, 각종 디뉴클레오타이드 및 트리뉴클레오타이드 반복체의 변화는 또한 유전자 발현 또는 유전자 조절에 영향을 미칠 수 있다.
또다른 증거는, 특정한 DNA 서열이 당뇨병, 아테롬성 동맥경화증, 비만, 각종 자가면역 질환 및 암(예: 결장암, 유방암, 난소암 및 폐암)을 포함하는 다수의 기타 질병을 개체에서 발병시킴을 나타낸다. 유전자 질병을 유발하거나 이에 관여하는 유전적 병변에 대한 지식은 개인이 당해 질병 또는 상태를 갖고 있거나 발병 위험이 있는지를 예상할 수 있게 하고, 적어도 일부 경우에는 당해 질병의 예후를 결정할 수 있게 한다.
다수의 유전자는 다형성 영역을 갖는다. 개체는 다형성 영역의 몇몇 대립인자 변이체중 하나를 갖기 때문에, 각각은 다형성 유전자 영역의 대립인자 변이체 유형에 따라 동정할 수 있다. 이러한 동정은 예를 들어 토론을 위해 이용될 수 있다. 다른 상황하에서는 개체내의 대립인자 변이체의 동일성을 아는 것이 중요하다. 예를 들면, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 유전자와 같은 특정한 유전자에 있어서 대립인자의 차이는 골수 이식에 있어서 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 질병에 관여한다. 따라서, 유전자의 다형성 영역의 대립인자 변이체 또는 유전자 병변의 동일성을 측정하는, 신속하고 민감하며 정확한 방법을 개발하는 것이 매우 바람직할 것이다.
몇몇 방법이 대립인자 변이체 또는 유전적 병변을 동정하기 위해 사용되고 있다. 예를 들면, 대립인자 변이체의 동일성 또는 유전적 병변의 존재는 증폭된 핵산 단편의 이동성을 겔 전기영동에 의해 공지된 표준과 비교하거나, 동정되는 서열에 상보성인 프로브와 하이브리드화하여 측정할 수 있다. 그러나, 핵산 단편이 감수성 리포터 기능, 예를 들어 방사성(32P,35S), 형광성 또는 화학발광성 리포터로 표지되는 경우에만 동정할 수 있다. 방사성 표지는 위험할 수 있고, 이들이 생성하는 시그날은 실질적으로 시간이 경과함에 따라 붕괴될 것이다. 형광성 표지와 같은 비-방사성 표지는 고강도 레이저가 사용되는 경우 감수성이 부족하고 시그날이 소실될 것이다. 또한, 표지화, 전기영동 및 후속적인 검출은 지루하고, 시간-소비적이며 과오를 범하기 쉬운 공정이다. 특히 전기영동은 과오를 범하기 쉬운데, 이는 서열 특이적 효과, 2차 구조 및 겔 매트릭스와의 상호작용이 겔을 통한 이들의 이동중에 인위구조를 유발하기 때문에 핵산의 크기 및 분자량을 겔 매트릭스내의 이동성과 직접 상호관련시킬 수 없기 때문이다.
생체고분자의 질량 분석 방법[참조: Hillenkamp et al.(1990) Anal. Chem. 63: 1193A-1202A] 및 생체고분자 래더의 제조 및 분석 방법[참조: International Publ. WO 96/36732; US Patent No. 5,792,664]을 포함하여, 생물과학에 있어서 질량 분석법에 대한 출원은 보고되어 있다[참조: Meth. Enzymol., Vol. 193, Mass Spectrometry(McCloskey, ed.; Academic Press, NY 1990); McLaffery et al., Acc. Chem. Res. 27: 297-386(1994); Chait and Kent, Science 257: 1885-1894(1992); Siuzdak, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 11290-11297(1994)].
질량 분석법은 핵산의 분석을 위해 사용된다[참조: Schram, Mass Spectrometry of Nucleic Acid Components, Biomedical Applications of Mass Spectrometry 34: 203-287(1990); Crain, Mass Spectrom. Rev. 9: 505-554(1990); Murray, J. Mass Spectrom, Rev. 31: 1203(1996); Nordhoff et al., Mass Spectrom. Rev. 15: 67-138(1997); U.S. Patent No. 5,547,835; U.S. Patent No. 5,605,798; PCT Application Publication No. WO94/16101; PCT Application Publication No. WO 96/29431].
매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화(MALDI) 및 전기분무 이온화(ESI)를 포함하여 소위 "연성 이온화" 질량 분광 방법은 질량이 300kDa를 초과하는 거대 분자의 완전한 이온화, 검출 및 질량 측정을 가능케 한다[참조: Fenn et al., Science 246: 64-71(1989); Karas and Hillenkamp, Anal. Chem. 60: 2299-3001(1988)]. MALDI 질량 분석법(MALDI-MS; Nordhoff et al., Mass Spectrom. Rev. 15: 67-138(1997)] 및 ESI-MS는 핵산의 분석에 사용된다. 핵산은 휘발하기 어려운, 극성인 높은 생체분자이며, 따라서 확실하고 정확한 분해를 위한 질량의 상한치가 있다.
ESI는 메가달톤 질량 범위에서도 거대 핵산의 완전한 탈착을 위해 사용된다[참조: Ferstenau and Benner, Rapid Commun. Mass Spectrom. 9: 1528-1538(1995); Chen et al., Anal. Chem. 67: 1159-1163(1995)]. ESI를 사용한 질량 할당은 매우 불량하고, 약 10%의 불확실성을 가질 수 있다. ESI-MS에 의해 측정되는 정확한 질량의 가장 큰 핵산은 질량이 약 65kDa인 114개 염기쌍 이본쇄 PCR 생성물[참조: Muddiman et al., Anal. Chem. 68: 3705-3712(1996)] 및 질량이 약 39kDa인 120개 뉴클레오타이드 이. 콜라이 5S rRNA[참조: Limbach et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 6: 27-39(1995)]이다. 또한, ESI는 고가의 샘플 정제를 필요로 한다.
MALDI-MS는 분석되는 거대분자의 매트릭스내 도입을 필요로 하며, 고체(즉, 결정질) 매트릭스에서 혼합된 폴리펩타이드 및 핵산에 대해 수행되어 왔다. 이들 방법에 있어서, 레이저는 프로브 팁 위에 결정화되는 생체고분자/매트릭스 혼합물을 박리하기 위해 사용되는데, 이는 생체고분자의 탈착 및 이온화에 영향을 미친다. 또한, MALDI-MS는 매트릭스로서 수화 물(즉, 아이스) 또는 글리세롤을 사용하여 폴리펩타이드에 대해 수행된다. 수화 물을 매트릭스로서 사용하는 경우, MALDI-MS를 수행하기 전에 먼저 단백질을 동결건조시키나 공기 건조시켜야 한다[참조: Berkenkamp et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7003-7007]. 이러한 방법을 위한 질량 상한치는 감수성이 제한된 30KDa인 것으로 보고되었다(즉, 단백질 10pmol 이상이 요구된다). 보고된 바에 따르면, 단백질의 적외선 MALDI-MS는 UV MALDI-MS와 비교하여 스펙트럼당 100배 내지 1000배 이상의 물질을 소비하고, 글리세롤과 같은 매트릭스와 함께 높은 질량 부분에 대한 피크를 확장하는 부가물을 형성할 수 있다[참조: Hillenkamp et al. (1995) 43rd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, p. 357]. 추가로, IR-MALDI MS는 UV-MALDI MS와 비교하여 보다 적은 대사가능한 단편화에 기인하여 질량 분해의 증가를 제공하지만, 이러한 대사가능한 붕괴 감소는 단편화의 증가로 달성되는 것으로 보고되었다.
UV-MALDI-MS는 분석될 수 있는 생물학적 거대분자의 크기가 제한된다. 예를 들면, UV-MALDI-MS에 의해서는 약 100개 뉴클레오타이드(100-머) 이상의 핵산 분자를 분석하기가 어렵다.
따라서, 핵산 분자의 분석에 질량 분석법을 적용하려는 시도에도 불구하고, 핵산의 물리적 및 화학적 특성에 부분적으로 기인하는 한계가 여전히 존재한다. 예를 들면, 핵산 생체고분자의 극성 성질은 이들이 휘발하기 어렵게 한다.
UV-MALDI-MS를 사용하는 거대 DNA 분자의 분석은 보고되어 있다[참조: Ross and Belgrader, Anal. Chem. 69: 3966-3972(1997); Tang et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 8: 727-730(1994); Bai et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 9: 1172-1176(1995); Liu et al., Anal. Chem. 67: 3482-3490(1995); Siegert et al., Anal. Biochem. 243: 55-65(1997)]. 이들 보고서에 기초하여, 질량이 30kDa를 초과하는 (약 100-머) 핵산을 UV-MALDI-MS에 의해 분석하는 것은 현재 약 90kDa의 질량 상한치와 함께 점차적으로 어려워지고 있음이 명백하다[참조: Ross and Belgrader, Anal. Chem. 69: 3966-3972(1997)]. DNA UV-MALDI 스펙트럼의 열등한 정도는 이온 단편화와 포스페이트 주쇄의 복합 염 형성의 배합에 기여한다. RNA는 UV-MALDI 조건하에 DNA보다 더욱 현저히 안정하기 때문에, RNA에 대한 접근가능한 질량 범위는 약 150kDa 이하이다[참조: Kirpekar et al., Nucl. Acids Res. 22: 3866-3870(1994)].
고체 매트릭스내의 핵산(대부분 석신산 및, 보다 적게는 우레아와 니코틴산)은 IR-MALDI로 분석되었다[참조: Nordhoff et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 6: 771-776(1992); Nordhoff et al., Nucl. Acids Res. 21: 3347-3357(1993); Nordhoff et al., J. Mass Spec. 30: 99-112(1995)]. 노르드호프 등[참조: Nordhoff et al. (1992)]는 20머의 DNA와 80머의 RNA가 최대의 분해 한계인 것으로 최초로 보고하였다. 이후, 노르드호프 등(Nordhoff et al., (1993))은 26머의 DNA 및 104머의 tRNA에 대한 독특한 스펙트럼을 제공하였고, 재생가능한 시그날이 142개 뉴클레오타이드 이하의 RNA에서 수득됨을 보고하였다. 노르드호프 등(Nordhoff et al., (1995))은 또한 석신산을 사용한 IR-MALDI보다는 고체 매트릭스, 3-하이드록시 피콜산을 사용한 UV-MALDI로 40머를 분석하는 스펙트럼이 실질적으로 더욱 우수하지만, IR-MALDI는 실질적인 단편화 정도가 신속함을 보고하였다.
예를 들면, 생물학적 샘플에서 거대분자의 분석은 샘플이 수득되는 개체의 상태에 대한 정보를 제공한다. 예를 들어, 개체로부터 수득한 생물학적 샘플의 핵산 분석은 유전적 질병 또는 염색체 이상의 존재, 질병 또는 상태에 대한 예후, 또는 병변성 유기체에 의한 감염을 진단하는데 유용하거나, 동일성, 유전성 및 적합성에 관한 정보를 제공할 수 있다. 질량 분석법은 비교적 신속하게 수행될 수 있고 자동적으로 보정할 수 있기 때문에, 생물학적 거대분자, 특히 DNA의 경우 약 90kDa 및 RNA의 경우 150kDa 이상의 거대한 핵산 분자에 대한 정확한 질량 스펙트럼을 수득하기 위한 개선된 방법이 요망되고 있다.
따라서, 핵산 분자내의 유전적 병변을 검출하는 방법을 포함하여, 핵산 분자와 같은 생물학적 거대분자를 검출 및 특성화하는 방법이 요구되고 있다. 특히, 상태, 질병 및 질환의 진단과 관련하여, 생물학적 거대분자를 검출 및 특성화하기 위한 정확하고 감수성이며 정밀하고 신뢰가 가는 방법이 요구된다. 따라서, 본 발명의 목적은 이들 요건을 충족시키고 추가의 잇점을 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명에서는 적외선 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화(IR-MALDI) 질량 분석법 및 액체 매트릭스를 사용하여 생물학적 거대분자의 질량 및 동일성을 측정하는 방법이 제공된다. 특히, 액체 매트릭스에서, DNA 및 RNA를 포함하는 핵산의 적외선 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화(IR-MALDI) 질량 분석법이 제공된다. 액체 매트릭스(실온 및 대기압에서 액체)는 유리 또는 유리질 고체를 형성할 수 있는 IR-흡수성 생물적합성 물질, 예를 들어 폴리글리콜, 특히 글리세롤이다. IR-MALDI 및 이러한 액체 매트릭스의 사용은 지금까지 IR-MALDI로 수행된 모든 방법, 특히 진단 방법 및 서열 분석 방법에서 사용될 수 있다. 이와 같은 방법, 특히 핵산 또는 단백질에 대한 진단 방법은, 이로써 제한하고자 하는 것은 아니지만, 미국 특허 제5,547,835호, 제5,691,141호, 제5,605,798호, 제5,622,824호, 제5,777,324호, 제5,830,655호, 제5,700,642호, 허여된 미국 특허원 제08/617,256호, 제08/746,036호, 제08/744,481호, 제08/744,590호, 제08/647,368호, 공개된 국제 PCT 특허원 제WO 96/29431호, 제WO 99/12040호, 제WO 98/20019호, 제WO 98/20166호, 제WO 98/20020호, 제WO 97/37041호, 제WO 99/14375호, 제WO 97/42348호, 제WO 98/54751호 및 제WO 98/26095호가 포함된다.
핵산 분석 방법의 양태를 실시하는데 있어서, 핵산과 액체 매트릭스를 함유하는 IR-MALDI 조성물은, 일반적으로 고체 지지체인 기질 위에 침착되어 핵산 혼합물의 균질하고 투명한 박층을 형성한다. 이 혼합물은 핵산 용액이 탈착 및 이온화되도록 적외선으로 조사됨으로써 이온 입자를 방사하고, 질량 분석기로 분석하여 핵산 질량을 측정한다. 바람직하게는, 샘플 제조 및 침착은 자동화 장치를 사용하여 수행한다.
IR-MALDI 질량 분석법을 사용하여 샘플에서 생물학적 거대분자의 존재 또는 부재를 검출하는 방법이 또한 본원에서 제공된다. 특정한 양태에 있어서, 생물학적 거대분자와 액체 매트릭스를 함유하는 IR-MALDI 조성물을 적외선으로 조사하고, 탈착 및 이온화시킴으로써 이온 입자를 방사시키고, 이를 분석하여 핵산이 존재하는지를 측정한다.
IR-MALDI 질량 분석법을 사용하여 샘플에서 핵산의 존재 또는 부재를 검출하는 방법이 또한 본원에서 제공된다. 특정한 양태에 있어서, 샘플과 액체 매트릭스를 함유하는 IR-MALDI 조성물을 적외선으로 조사하고, 탈착 및 이온화시켜 이온 입자를 방사시키고, 이를 분석하여 핵산이 존재하는지를 측정한다.
본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 액체 매트릭스는 탈착 및 이온화를 수행하는데 사용되는 레이저의 파장에서 충분히 흡수되며, 실온(20℃)에서 액체이고, 유리질 또는 유리 고체를 형성할 수 있다. 액체는 이러한 포맷에 적합한 모든 IR-MALDI 포맷 및 모든 온도, 전형적으로 약 -200℃ 내지 80℃, 바람직하게는 60℃ 내지 약 40℃에서 사용된다.
흡수를 위해, 액체 매트릭스는 적외선을 강력히 흡수하는 하나 이상의 발색단 또는 관능 그룹을 함유할 수 있다. 바람직한 관능 그룹에는 니트로, 설포닐, 설폰산, 설폰아미드, 니트릴 또는 시아나이드, 카보닐, 알데하이드, 카복실산, 아미드, 에스테르, 무수물, 케톤, 아민, 하이드록실, 방향족 환, 디엔 및 기타 공액 시스템이 포함된다.
액체 매트릭스로서는 치환되거나 비치환된 (1) 알콜(예: 글리세롤, 당, 다당류, 1,2-프로판디올, 1,3-프로판디올, 1,2-부탄디올, 1,3-부탄디올, 1,4-부탄디올 및 트리에탄올아민); (2) 카복실산(예: 포름산, 락트산, 아세트산, 프로피온산, 부탄산, 펜탄산 및 헥산산) 또는 이의 에스테르; (3) 직쇄 또는 측쇄의 1급 또는 2급 아미드(예: 아세트아미드, 프로판아미드, 부탄아미드, 펜탄아미드 및 헥산아미드); (4) 1급 또는 2급 아민(예: 프로필아민, 부틸아민, 펜틸아민, 헥실아민, 헵틸아민, 디에틸아민 및 디프로필아민) 및 (5) 니트릴, 하이드라진 및 하이드라지드가 바람직하다. 액체는 결정화되지 않지만, 건조, 냉각 또는 액체상으로부터의 전이를 유도하는 기타 조건하에 유리 또는 유리질 상을 형성할 수 있다. IR-MALDI 방법중에서 진공 조건하에 신속한 증발을 피하기 위해서는 휘발성이 비교적 낮은 물질이 바람직하다.
바람직하게는, 본원에서 사용되는 액체 매트릭스는 핵산 상용성 용매와 혼화성이다. 언급된 바와 같이, 액체 매트릭스는 진공 안정한, 즉 샘플이 질량 분석기에서 빠르게 증발하지 않도록 증발압이 낮은 것이 바람직하다. 바람직하게는, 액체는 단독으로 또는 핵산 상용성 용매와 함께 마이크로리터 내지 나노리터 용적의 매트릭스의 분산을 촉진시키기에 적합한 점도를 갖는다. 상이한 액체 매트릭스 및 이러한 매트릭스에 대한 첨가제의 혼합물은 상술된 특성 하나 이상을 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 혼합물을 2종의 액체 매트릭스 물질(즉, 2성분 혼합물), 3종(3성분 혼합물) 또는 그 이상의 액체 매트릭스 물질을 함유할 수 있다.
IR-MALDI의 핵산/매트릭스 조성물은 바람직하게는 진공 챔버에 함유된 기질 위에 박층으로서 침착된다. 핵산/매트릭스 용액을 보유하기 위한 바람직한 기질는 여과 플레이트를 갖거나 갖지 않는 고체 지지체, 예를 들어 비이드, 모세관, 플랫 표면, 핀 또는 웨이퍼일 수 있다. 바람직하게는, 기질의 온도는 핵산/매트릭스 조성물을 냉각시키기 위해 실온 이하의 온도까지 조절할 수 있다.
바람직한 적외선은 파장 영역이 약 2.5㎛ 내지 약 12㎛인 중간-IR이다. 특히 바람직한 조사 공급원은 CO, CO2및 Er 레이저이다. 특정한 양태에 있어서, 레이저는 광섬유 레이저이거나, 레이저 조사를 섬유 광으로 질량 분광계에 커플링시킬 수 있다.
추가의 바람직한 양태에 있어서, 액체 매트릭스에서 분석물의 적외선에 의해 생성된 이온 입자는 질량 분석기에서 분리 및 검출하기 전에 질량 분석기에 의한 분석을 위해 지연된 방식으로 추출한다. 바람직한 분리 포맷에는 선형 및 비선형 전계를 갖는 선형 또는 반사기, 예를 들어 곡선 전계 반사기; 흐름 시간(TOF); 단일 또는 다중 4극자; 단일 또는 다중 자기 섹터; 푸리에르 전환 이온 사이클로트론 공명(FTICR); 또는 이온 트랩 질량 분광계가 포함된다.
생물학적 샘플에서 표적 핵산의 존재를 동정하기 위해 IR-MALDI을 사용하는 방법이 제공된다. 이와 같은 방법은 예를 들어 생물학적 샘플에서 핵산 분자를 증폭시키고; 증폭된 핵산 분자를 검출기 올리고뉴클레오타이드와 접촉시켜 이를 증폭된 핵산 분자중에 존재하는 표적 핵산 서열과 하이브리드화시키며; 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 반응 생성물을 혼합함으로써 IR-MALDI 조성물을 제조하고; IR-MALDI 질량 분석법으로 조성물내의 이중가닥 핵산 분자를 동정(여기서, 이중가닥 핵산 분자의 존재는 생물학적 샘플내에 표적 핵산의 존재를 동정시켜 준다)함으로써 수행할 수 있다.
또한, 생물학적 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 동정하는 방법은 생물학적 샘플로부터 수득한 핵산 분자를 증폭시키고; 하나 이상의 적절한 뉴클레아제를 사용하여 증폭된 핵산 분자를 특이적으로 분해시켜 분해된 단편을 제조하며; 분해된 단편을 상보성 포획 핵산 서열(이는 고체 지지체상에 고정화되고 표적 핵산의 분해된 단편과 하이브리드화하여 고정화된 단편을 생성할 수 있다)과 하이브리드화하고; 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 고정화된 단편을 함유하는 IR-MALDI 조성물을 제조하며; IR-MALDI 질량 분석법에 의해 고정화된 단편을 동정하여 생물학적 샘플에서 표적 핵산의 존재를 검출함으로써 수행할 수 있다.
또한, 생물학적 샘플에서 표적 핵산의 존재는 생물학적 샘플로부터 수득된 핵산 분자에 대해 먼저 제1 프라이머 세트(이는 표적 핵산을 함유하는 핵산 부분을 증폭시킬 수 있다)를 사용하여 제1 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하고; 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 제1 증폭 산물을 함유하는 조성물을 제조하며; IR-MALDI 질량 분석법에 의해 조성물내의 제1 증폭 산물을 검출하여 생물학적 샘플에서 표적 핵산의 존재를 검출함으로써 수행할 수 있다. 경우에 따라, 이러한 방법은 IR-MALDI 조성물을 제조하기 전에, 표적 핵산을 함유하는 제1 증폭 산물의 적어도 일부분을 증폭시킬 수 있는 제1 프라이머 세트를 사용하여 제1 증폭 산물에 대해 제2 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
본원에는 또한 조성물, 특히 IR-MALDI 조성물이 기술되어 있으며, 이러한 조성물은 IR-MALDI에 의한 분석에 적합할 수 있는 생물학적 거대분자와 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유한다. IR-MALDI에 의한 분석에 적합한 생물학적 거대분자는 예를 들어 핵산, 폴리펩타이드 또는 탄수화물이거나, 핵단백질 복합체, 단백질-단백질 복합체 등과 같은 거대분자 복합체일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 IR-MALDI 조성물은 일반적으로 생물학적 거대분자, 예를 들어 핵산 및 액체 매트릭스를 약 10-4내지 10-9의 비율로 함유하며, 분석하고자 하는 약 10pmol 이하의 생물학적 거대분자, 예를 들어 약 100attomol 내지 약 1pmol의 생물학적 거대분자를 함유할 수 있다. 단백질의 경우, 분석물 대 매트릭스의 비율은 전형적으로 약 2×10-4내지 2×10-5의 보다 좁은 범위이다. 또한, 본원에 기술된 IR-MALDI 조성물은 첨가제를 함유할 수 있는데, 이러한 첨가제는 IR-MALDI에 의한 생물학적 거대분자의 검출을 촉진시키고, 액체 매트릭스내의 생물학적 거대분자의 혼화성을 개선시킨다. 한가지 양태에 있어서, IR-MALDI 조성물은 기질 위에 침착되는데, 이러한 기질은 IR-MALDI 조성물의 침착을 위한 표면(예: 스테인레스 강 표면)을 제공하는 고체 지지체(예: 실리콘 웨이퍼 또는 기타 물질)일 수 있다.
IR-MALDI 질량 분석법에 의해 생물학적 거대분자를 특성화하는 방법이 제공된다. 예를 들면, 생물학적 거대분자의 질량은 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 분석하고자 하는 생물학적 거대분자를 함유하는 IR-MALDI 조성물을 제조하고; IR-MALDI 질량 분석법으로 조성물내의 생물학적 거대분자를 분석하여 생물학적 거대분자의 질량을 측정함으로써 측정할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 방법은 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 표적 생물학적 거대분자를 함유하는 IR-MALDI 조성물을 제조하고; 상기 조성물에 대해 IR-MALDI 질량 분석법을 수행하여 조성물내의 표적 생물학적 거대분자를 동정하여 표적 생물학적 거대분자를 검출함으로써 표적 생물학적 거대분자를 검출하는데 사용될 수 있다. 경우에 따라, 표적 생물학적 거대분자는 생물학적 샘플내에 존재하거나 이로부터 수득할 수 있다. 따라서, 생물학적 샘플에서 표적 생물학적 거대분자의 존재를 동정하는 방법에 제공된다. 예를 들면, 표적 핵산의 존재는 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 핵산 분자(또는 생물학적 샘플로부터 분리된 핵산 분자)를 함유하는 생물학적 샘플을 함유하는 IR-MALDI 조성물을 제조하고; IR-MALDI 질량 분석법으로 상기 조성물을 분석함으로써 동정할 수 있다(여기서, 표적 핵산 서열의 분자량을 갖는 핵산 분자의 검출은 생물학적 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 동정시켜 준다).
또한, 개체로부터 수득되고 질병 또는 예후와 관련된 생물학적 거대분자의 특성을 검출함으로써 질병 또는 질병에 대한 예후를 갖는 개체를 동정하기 위한 IR-MALDI 질량 분석법의 사용 방법이 제공된다. 이러한 방법은 특히 유전적 질병, 또는 박테리아 감염과 관련된 질병, 또는 이러한 질병에 대한 예후를 동정하는데 유용하며, 동일성, 유전성 또는 적합성을 측정하는데 유용하다.
본원에 기술된 방법은 예를 들어 각각 하나 이상의 표적 생물학적 거대분자를 함유하는 복수의 조성물을 고체 지지체(예: 칩)상에 배열 형태로 침착시킴으로써 하나 이상의 표적 생물학적 거대분자, 특히 다수의 표적 생물학적 거대분자의 분석에 적합하다. 기술된 방법은 액체 매트릭스를 포함하는 단일 조성물에 함유된 복수의 생물학적 거대분자의 다중 분석에 적합하다(각 경우 복수의 생물학적 거대분자는 상이하게 질량 변형되어 다중 분석을 촉진시킬 수 있다). 따라서, 본원에 기술된 방법은 고도의 처리량 분석 포맷에 용이하게 적용할 수 있다.
핵산 분자에 의해 암호화된 표적 폴리펩타이드의 동일성을 측정함으로써 핵산 분자의 서열에 대한 정보를 수득하는 방법이 제공된다. 이들 방법을 실시하는데 있어서, 표적 폴리펩타이드(또는 이의 혼합물)은 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자로부터 제조되며, 표적 폴리펩타이드의 분자량은 폴리펩타이드의 혼합물을 액체 매트릭스, 또는 몇몇 양태에서는 물 또는 석신산과 함께 제공하여 IR-MALDI를 실시함으로써 측정된다. 표적 폴리펩타이드의 동일성은 표적 폴리펩타이드의 분자량을 동일성이 공지된 참조 폴리펩타이드의 분자량과 비교하여 측정한다. 이에 의해, 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자에서 뉴클레오타이드 서열에 대한 정보, 예를 들어 돌연변이의 존재를 수득할 수 있다.
IR-MALDI 질량 분광법에 의한 분석에 특히 적합한 생물학적 거대분자는 핵산, 핵산 동족체 또는 유사체, 3중 나선, 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 동족체 또는 유사체, 탄수화물, 지질 또는 프로테오글리칸이거나, 단백질-단백질 복합체 또는 핵단백질 복합체 또는 기타 복합체일 수 있다. 본원에 기술된 방법에 의한 분석을 위해, 표적 생물학적 거대분자는 기질, 특히 고체 지지체, 예를 들어 비이드, 편평한 표면, 칩, 모세관, 핀, 콤브 또는 웨이퍼, 및 금속, 세라믹, 플라스틱, 수지, 겔 및 막을 포함하는 각종 물질에 고정화될 수 있다. 고정화는 가역적 결합(즉, 이온 결합, 예를 들어 비오틴/스트렙트아비딘), 공유결합, 예를 들어 광절단가능한 결합 또는 티올 결합 또는 수소 결합을 통해 이루어질 수 있고, 결합은 예를 들어 IR-MALDI 질량 분석법 공정중에 화학적 방법, 효소적 방법 또는 물리적 방법을 사용하여 절단할 수 있다.
분석하고자 하는 생물학적 거대분자를 IR-MALDI 질량 분석 전에 조절하여, IR-MALDI 질량 분석법에 의한 특정한 생물학적 거대분자의 분석력을 개선시키고 예를 들어 질량 스펙트럼의 분해를 개선시킬 수 있다. 표적 생물학적 거대분자는 예를 들어 이온 교환, 알킬화제 또는 트리알킬실릴 클로라이드와의 접촉, 또는 생물학적 거대분자의 하나 이상의 질량 변형된 아단위의 도입에 의해 조절할 수 있다. 경우에 따라, 생물학적 거대분자는 조절 전에 또는 IR-MALDI 질량 분석법 전에 분리할 수 있다.
생물학적 거대분자의 단편일 수 있는 복수의 표적 생물학적 거대분자에서 각 표적 생물학적 거대분자의 동일성을 측정하는 방법은 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 복수의 상이하게 질량 변형된 표적 생물학적 거대분자를 함유하는 IR-MALDI 조성물을 제조하고; 각각 상이하게 질량 변형된 복수의 표적 생물학적 거대분자의 분자량을 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정하며; 각각 상이하게 질량 변형된 복수의 표적 생물학적 거대분자를 상응하는 공지된 생물학적 거대분자의 분자량과 비교하여 수행할 수 있다. 이러한 방법은 보다 큰 생물학적 거대분자인 복수의 표적 생물학적 거대분자를 사용하여 수행되는데, 여기서 단편은 생물학적 거대분자의 형성에 관여하는 결합, 특히 생물학적 거대분자의 단량체 아단위 사이의 결합을 절단하는 하나 이상의 제제에 생물학적 거대분자를 접촉시켜 제조할 수 있다.
또한, IR-MALDI 질량 분석법을 사용하여 생물학적 거대분자에서 하나 이상의 아단위를 동정하는 방법, 특히 뉴클레오타이드 서열내의 돌연변이를 검출하는 방법이 제공된다. 표적 뉴클레오타이드의 동일성은 예를 들어 표적 뉴클레오타이드를 함유하는 핵산 분자를 프라이머 올리고뉴클레오타이드(이는 표적 뉴클레오타이드에 인접한 부위에서 핵산 분자와 상보성이다)와 하이브리드화시켜 하이브리드화된 핵산 분자를 제조하고; 하이브리드화된 핵산 분자를 완전한 세트의 디데옥시뉴클레오사이드 또는 3'-데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 의존성 DNA 폴리머라제와 접촉시켜 표적 뉴클레오타이드에 상보성인 디데옥시뉴클레오사이드 또는 3'-데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트를 프라이머로 신장시키며; 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 신장된 프라이머를 함유하는 조성물을 제조하고; IR-MALDI 질량 분석법으로 조성물내의 신장된 프라이머를 검출하여 표적 뉴클레오타이드의 동일성을 측정함으로써 동정할 수 있다.
표적 핵산 서열내의 돌연변이 존재 또는 부재를 검출하는 방법은 표적 핵산 서열을 함유하는 핵산 분자를 하나 이상의 프라이머(이는 표적 핵산 서열과 3' 말단 염기 상보성을 갖는다)와 하이브리드화시켜 하이브리드화된 산물을 제조하고; 하이브리드화된 산물을 적절한 폴리머라제 효소 및 연속적으로 4개의 뉴클레오사이드 트리포스페이트중 하나와 접촉시킨 다음 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 반응 산물을 함유하는 조성물을 제조하며; 상기 조성물내의 산물을 IR-MALDI 질량 분석법으로 검출(여기서, 상기 산물의 분자량은 표적 핵산 분자에서 프라이머의 3' 말단과 인접한 돌연변이의 존재 또는 부재를 나타낸다)함으로써 수행할 수 있다. 또한, 핵산 분자내의 돌연변이는 예를 들어 핵산 분자를 올리고뉴클레오타이드 프로브와 하이브리드화시켜 하이브리드화된 핵산을 제조(여기서, 미스매치는 돌연변이 부위에서 형성된다)하고; 하이브리드화된 핵산을 일본쇄 특이적 엔도뉴클레아제와 접촉시킨 다음 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 반응 산물을 함유하는 조성물을 제조하며; IR-MALDI 질량 분석법으로 상기 조성물을 분석(여기서, 조성물내에 하나 이상의 핵산 단편의 존재는 핵산 분자가 돌연변이를 함유한다는 것을 나타낸다)함으로써 검출할 수 있다.
또한, 표적 핵산 서열내의 돌연변이 존재 또는 부재를 동정하는 방법은 예를 들어 표적 핵산 서열을 결합 추출물 세트 및 DNA 리가제와 함께 함유하는 핵산 분자에 대해 1회 이상의 하이브리드화를 수행하고; 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 반응 산물을 함유하는 조성물을 제조하며; IR-MALDI 질량 분석법으로 조성물을 분석함으로써 수행할 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 조성물에서 결합 산물의 검출은 표적 핵산 서열내의 돌연변이 부재를 동정시켜 주며, 조성물에서 결합 추출물 세트는 표적 핵산 서열내의 돌연변이 존재를 동정시켜 준다. 또한, 상술된 바와 같이 결합 산물의 존재를 검출하는 방법은 표적 뉴클레오타이드를 결합 추출물 세트 및 열안정성 DNA 리가제와 함께 함유하는 핵산 분자에 대해 1회 이상의 하이브리드화를 수행하고; 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 반응 산물을 함유하는 조성물을 제조하며; IR-MALDI 질량 분석법으로 상기 조성물내의 결합 산물을 동정하여 핵산 서열내의 표적 뉴클레오타이드 존재를 검출함으로써 표적 뉴클레오타이드 또는 표적 핵산을 검출하는 데에 유용할 수 있다.
또한, 생물학적 거대분자의 아단위 서열을 측정하는 방법이 제공된다. 하나 이상의 표적 생물학적 거대분자 종의 아단위 서열(i)은 예를 들어 표적 생물학적 거대분자의 형성에 관여하는 각각의 결합을 절단시키기에 충분한 하나 이상의 제제를 표적 생물학적 거대분자와 접촉시켜 중복 생물학적 거대분자 단편의 세트를 제조한 다음 상기 세트의 하나 이상의 생물학적 거대분자 단편과 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 조성물을 제조하며; IR-MALDI 질량 분석법으로 하나 이상의 생물학적 거대분자 단편의 분자량을 측정하고; 상기 세트내에서 각 생물학적 거대분자 단편의 분자량이 측정될 때까지 상기 단계를 반복하여 표적 생물학적 거대분자의 아단위 서열을 측정함으로써 측정할 수 있다. 이러한 방법은 표적 생물학적 거대분자의 복수의 (i+1) 종의 다중 분석에 특히 적합한데, 여기서 표적 생물학적 거대분자의 각 종은 상이하게 질량 변형되어 표적 생물학적 거대분자의 각 종의 생물학적 거대분자 단편을 IR-MALDI 질량 분석법으로 각각 상이한 종의 생물학적 거대분자로부터 구별할 수 있다.
하나 이상의 핵산 종의 뉴클레오타이드 서열을 측정하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 출발하여, 서열 분석되는 핵산 종에 상보성인 상보성 핵산을 쇄 종결 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에 합성하여 염기-특이적으로 종결된 상보성 폴리뉴클레오타이드 단편의 4개 세트를 제조하고; 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 폴리뉴클레오타이드 단편의 4개 세트를 함유하는 IR-MALDI 조성물을 제조하며; IR-MALDI 질량 분석법으로 각 폴리뉴클레오타이드 단편의 분자량 값을 측정하고; 분자량에 따라 분자량 값을 정렬하여 핵산 종의 뉴클레오타이드 서열을 측정함으로써 수행할 수 있다. 이러한 방법은 (i+1) 프라이머[여기서, (i+1) 프라이머중 하나는 변형되지 않은 프라이머 또는 질량 변형된 프라이머이고, 다른 i 프라이머는 질량 변형된 프라이머이며, 각각의 (i+1) 프라이머는 IR-MALDI 질량 분석법으로 서로 구별할 수 있다]을 사용하여 현재 서열 분석할 수 있는 복수의 (i+1) 핵산 종의 다중 분석에 특히 적합하다.
또한, 표적 핵산의 서열은 하나 이상의 부분적 일본쇄의 표적 핵산을 하나 이상의 핵산 프로브(여기서, 각 프로브는 이본쇄 부분, 일본쇄 부분 및 일본쇄 부분내의 측정가능한 가변 서열을 함유한다)와 하이브리드화하여 하나 이상의 하이브리드화된 표적 핵산을 제조한 다음 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 하이브리드화된 핵산을 함유하는 조성물을 제조하고; 표적 핵산이 하이브리드화되는 프로브의 측정가능한 가변 서열에 기초하여 IR-MALDI 질량 분석법으로 하이브리드화된 표적 핵산의 서열을 측정함으로써 측정할 수 있다. 경우에 따라, 이 방법 단계는 표적 핵산의 전체 서열을 측정하기에 충분한 시간 동안 반복할 수 있고, 복수의 표적 핵산이 서열 분석되는 경우 하나 이상의 핵산 프로브가 배열로 고정화될 수 있다. 경우에 따라, 하이브리드화된 표적 핵산은 IR-MALDI 조성물을 제조하기 전에 측정가능한 가변 서열에 결합시킬 수 있다.
또한, 표적 생물학적 거대분자의 서열을 측정하는 방법은 표적 생물학적 거대분자로부터 2개 이상의 생물학적 거대분자 단편을 제조한 다음 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 생물학적 거대분자를 함유하는 조성물을 제조하고; IR-MALDI 질량 분석법으로 상기 조성물내의 생물학적 거대분자 단편을 분석하여 표적 핵산 분자의 서열을 측정함으로써 수행할 수 있다. 이러한 방법은 보다 거대한 서열내에 생물학적 거대분자 서열의 2개 이상의 부분을 정렬하는데 특히 유용하다.
또한, 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 생물학적 거대분자를 함유하는 IR-MALDI 조성물이 제공된다. 특히, 생물학적 거대분자와 액체 매트릭스는 조성물내에 약 10-4내지 10-9의 생물학적 거대분자 대 액체 매트릭스 비율로 존재한다. 또한, 생물학적 거대분자가 약 10pmol 이하, 바람직하게는 약 100attomol 내지 약 1pmol의 양으로 존재하는 조성물이 제공된다. 이들 조성물은 또한 IR-MALDI에 의한 핵산 검출을 촉진시키는 첨가제를 포함할 수 있다. 조성물이 침착되는 지지체(또는 기질)가 제공된다.
본원에 기술된 방법은 일반적으로 게놈, 단백질 및 분자 의학 분야, 및 특히 생물학적 거대분자를 분석하거나, 이의 존재를 검출하거나 이의 동일성을 측청하기 위해 적외선 매트릭스 보조된 레이저 탈착-이온화 질량 분석법을 사용하는 방법에 관한 것이다.
도 1A 내지 1C는 합성 DNA 70머의 질량 스펙트럼을 나타낸다. 도 1A는 지연된 추출 및 3-하이드록시피콜린산(3HPA) 매트릭스(20개 단발 질량 스펙트럼의 합계)를 사용하는 선형 흐름 시간(TOF) 장치에 의한 자외선 매트릭스 보조된 레이저 탈착 이온화(UV-MALDI) 및 검출을 나타내고; 도 1B는 지연된 추출 및 3HPA 매트릭스(25개 단발 스펙트럼의 합계)을 사용하는 UV-MALDI 반사(ref) TOF 스펙트럼을 나타내며; 도 1C는 지연된 추출 및 글리세롤 매트릭스(15개 단발 질량 스펙트럼의 합계)을 사용하는 IR-MALDI-refTOF 스펙트럼을 나타낸다.
도 2A 내지 2D는 2.94㎛ 파장 및 글리세롤 매트릭스를 사용하는 IR-MALDI refTOF 질량 스펙트럼을 나타낸다. 이 스펙트럼은 다음과 같다: 도 2A는 합성 DNA 21머(10개 단발 스펙트럼의 합계)이고, 도 2B는 280머(87kDA), 360머(112kDa), 920머(285kDa) 및 1400머(433kDa)의 제한 효소 산물을 함유하는 DNA 혼합물(10개 단발 스펙트럼의 합계)이며, 도 2C는 DNA 혼합물, 130머(약 40kDa), 640머(198kDa) 및 2180머(674kDa)의 제한 효소 산물(20개 단발 스펙트럼의 합계)이고, 도 2D는 RNA 1206머(약 387kDa)(15개 단발 스펙트럼의 합계)이다. 배향 규모는 상호비교가능하다.
도 3A 내지 도 3C는 515머 이본쇄 PCR DNA 산물의 스펙트럼을 나타낸다. 샘플의 총량을 다음과 같이 적재한다: 도 3A-300fmol(단발 스펙트럼); 도 3B-3fmol(단발 스펙트럼); 도 3C-300attomol(25개 단발 스펙트럼의 합계). IR-MALDI refTOF를 사용하여 수득하는데, 여기서 레이저는 글리세롤 매트릭스를 사용하여 2.94㎛의 파장에서 방사한다.
정의
본원에서 인용된 모든 특허, 특허원 및 공보는 참조로서 본원에 도입된다. 명세서 및 특허청구범위에 사용된 특정한 용어 및 문구의 의미는 다음과 같다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 내용이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련가에게 통상 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 거대분자는 전형적으로 생물학적 공급원에서 발견될 수 있는 분자를 의미한다. 생물학적 거대분자는 생체고분자일 수 있으며, 이는 아단위가 동일하거나 상이할 수 있는 단량체성 아단위를 함유하는 분자이다. 따라서, 거대분자에는 펩타이드, 단백질, 소형 유기물, 올리고뉴클레오타이드 또는 펩타이드, 유기물, 핵산 및 기타 거대분자의 단량체 단위를 포함한다. 단량체 단위는 수득되는 분자가 제조되는 구성성분중 하나를 의미한다. 따라서, 단량체 단위에는 뉴클레오타이드, 아미노산 및 소형 분자가 합성되는 약물작용 발색단이 포함된다.
생체고분자는 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 천연 분자인 핵산, 폴리펩타이드 및 탄수화물이 포함된다. 그러나, 본 발명의 목적상, 생체고분자와 같은 생물학적 거대분자는 천연 분자에 기초하거나 이로부터 유도된 합성 분자이거나, 핵단백질 복합체, 단백질-단백질 복합체 등과 같은 거대분자 복합체일 수 있다. 이러한 분자가 생체고분자인 경우, 이는 단량체 아단위를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 제2 분자와 함께 단량체 아단위를 함유하는 하나 이상의 분자를 함유한다. 따라서, 생체고분자는 예를 들어 2개 이상의 뉴클레오타이드 사이에 포스포디에스테르 결합 이외의 결합을 함유하는 핵산 서열; 또는 하나 이상의 질량 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드, 또는 DNA 결합 단백질 인지 부위를 함유하는 핵산 서열과 결합된 DNA 결합 단백질 또는 이의 변이체일 수 있다. 생체고분자의 단량체 아단위는 예를 들어 일반적으로 DNA를 포함하는 4개의 뉴클레오타이드, 또는 일반적으로 폴리펩타이드를 포함하는 20개의 아미노산, 또는 탄수화물을 포함하는 각종 당류 또는 이러한 천연 단량체 아단위의 유도체, 동족체 또는 유사체일 수 있다. 기타 생물학적 거대분자에는 지질, 글리코폴리펩타이드, 포스포폴리펩타이드, 펩티도글리칸, 올리고뉴클레오타이드, 다당류, 펩타이드유사체, 펩타이드 동족체, 핵산 동족체 및 기타 3중 나선을 포함하는 기타 핵산 구조물이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질과 관련하여 거대한 생물학적 거대분자는 대략적으로 소 혈청 알부민보다 큰 단백질을 의미한다(즉, 약 65kD 이상).
본원에 사용된 바와 같이, 분석은 샘플에서 표적 분자를 동정 또는 검출하거나, 돌연변이의 존재 또는 뉴클레오타이드의 질량과 같은 물리적 특성 또는 구조적 특성을 측정 또는 동정하는 것을 의미하거나, IR-MALDI를 사용하여 생물학적 거대분자의 특성을 평가하는 모든 방법을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"은 생물 공급원, 예를 들어 사람 또는 기타 포유류와 같은 동물, 식물, 박테리아, 진균, 원생동물 또는 바이러스로부터 수득된 모든 물질을 의미한다. 생물학적 샘플은 조직, 세포, 세포 펠렛과 같은 고체 물질; 뇨, 혈액, 타액, 양수, 감염 또는 염증 영역으로부터의 추출물과 같은 생물학적 유체; 구강 세포를 함유하는 구강 세척물; 세포 추출물 또는 생검 샘플을 포함하는 모든 형태로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다형성"은 모집단내 하나 이상의 대립인자 형태의 공존을 의미한다. 다형성은 유전자와 결합되지 않은 염색체 영역에서 발생하거나, 예를 들어 유전자의 대립인자 변이체 또는 이의 일부로서 발생할 수 있다. 2개 이상의 상이한 형태, 예를 들어 2개의 상이한 뉴클레오타이드 서열에 존재하는 유전자 부분은 "유전자의 다형성 영역"으로 언급된다. 유전자의 다형성 영역은 단일 뉴클레오타이드로 국지화될 수 있으며, 여기서 상이한 대립인자의 동일성은 상이하고, 몇개의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 본원에서 특히 중요한 것은 단일 뉴클레오타이드 염기의 변화와 관련하여 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)로서 언급되는 다형성이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "액체 분산 시스템"은 예정된 양의 액체를 표적 부위로 전달할 수 있는 장치를 의미한다. 분산된 액체의 양, 및 액체 분산 시스템이 반응 혼합물을 함유할 수 있는 액체를 표적 부위로 분산시키는 속도는 수동 또는 자동으로 조절할 수 있으며, 이에 의해 예정된 용적의 액체가 표적 부위에서 유지되게 된다. 바람직한 분산 시스템은 nL 용적(즉, 약 1 내지 100nL의 용적) 의 물질을 분산시키도록 고안된다. 이러한 시스템은 공지되어 있다[참조: 미국 특허원 제08/786,988호 뿐만 아니라 미국 특허원 제08/787,639호에 기초하는 공개된 PCT 특허원 제WO 98/20200호].
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "액체"는 용해 또는 현탁되거나 달리는 혼합된 하나 이상의 고체 또는 기체 물질을 함유할 수 있는, 실온 및 1기압에서 비-고체성 및 비-기체성 물질을 의미하는데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 부위"는 액체를 함유할 수 있는 고체 지지체 위의 특정한 위치를 의미한다.
고체 지지체는 무작위적으로 또는 정렬된 배열로 또는 기타 패턴으로 배열될 수 있는 하나 이상의 표적 부위를 함유한다. 특히, 표적 부위는 액체의 성장을 xyz 배위의 "z" 방향으로 제한한다. 따라서, 표적 부위는 예를 들어 웰 또는 핀 또는 비이드, 또는 고체 지지체의 표면에 위치하는 물리적 배리어, 또는 이의 조합, 예를 들어 칩상의 비이드, 웰내의 칩 등일 수 있다. 표적 부위는 지지체 위에 물리적으로 위치할 수 있고, 지지체 표면에 에칭될 수 있으며, 특정한 위치 주변의 에칭후에 잔류하는 "타워"일 수 있거나, 상대적인 친수성, 소수성 또는 주로 z 방향으로 액체를 성장시키는 다른 모든 표면 화학과 같은 물리-화학적 파라미터에 의해 정의될 수 있다. 고체 지지체는 단일 표적 부위이거나, 동일하거나 상이할 수 있는 다수의 표적 부위를 함유할 수 있는데, 여기서 고체 지지체는 하나 이상의 표적 부위를 함유하고 표적 부위는 예를 들어 각각의 표적 부위의 위치가 정의되는 배열을 포함하는 모든 패턴으로 정렬될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 생물학적 거대분자"는 IR-MALDI 질량 분석법으로 분석되는, 생물학적 거대분자의 단편을 포함하는, 목적하는 모든 생물학적 거대분자를 의미한다. 예를 들면, 표적 생물학적 거대분자는 핵산(예: 유전자 또는 mRNA), 또는 핵산의 관련 부분(예: 제한 단편 또는 핵산의 결실 단편)일 수 있다. 표적 핵산은 염색체 핵산의 다형성 영역(예: 유전자), 또는 잠재적으로 돌연변이를 갖는 유전자 영역일 수 있다. 표적 핵산에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 특정한 질병 및 이의 유인에 특이적인 뉴클레오타이드 서열 모티브 또는 패턴, 및 당해 질병 또는 상태의 필수 유인은 아니지만 당해 질병의 마커로서 특이적인 뉴클레오타이드 서열이 포함된다. 또한, 표적 핵산은 연구 목적에 중요하지만 당해 질병과는 직접적으로 관련이 없거나, 아직 입증되지는 않았으나 당해 질병 또는 상태와 관련될 수도 있는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
또한, 표적 생물학적 거대분자는 예를 들어 다형성 또는 돌연변이의 존재를 동정하기 위해 IR-MALDI 질량 분석법으로 처리되는 폴리펩타이드 또는 이의 관련 부분일 수 있다. 표적 폴리펩타이드는, 특정한 질병 또는 상태와 관련될 수 있는 단백질 또는 단백질 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나, 통상 해독된 폴리펩타이드를 암호화하지 않는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 또한, 표적 폴리펩타이드는 예를 들어 디뉴클레오타이드 반복체 또는 트리뉴클레오타이드 반복체 등의 서열로부터 암호화될 수 있는데, 이들은 염색체 핵산(예: 유전자의 암호화 또는 비암호화 영역), 예를 들어 염색체의 텔로머 영역에 존재할 수 있다. 표적 폴리펩타이드는 천연 단백질로부터 수득하거나, 시험관내 방법에 의해 핵산으로부터 제조할 수 있다.
표적 생물학적 거대분자의 동일성은 분자량 또는 서열을 상응하는 공지된 생물학적 거대분자의 것과 비교하여 측정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상응하는 공지된 생물학적 거대분자"는 공지된 특징을 갖는 생물학적 거대분자를 의미하며, 이러한 특징은 예를 들어 단편화 제제로 처리한 후의 질량 또는 전하, 단편화 패턴, 생물학적 거대분자가 자연에서 통상적으로 발견되는 조직 또는 세포의 유형 등을 포함하는 모든 관련된 특징일 수 있다. 상응하는 공지된 생물학적 거대분자는 일반적으로 제2 생물학적 거대분자, 특히 표적 생물학적 거대분자와의 비교를 위한 대조군으로서 사용된다. 표적 생물학적 거대분자의 스펙트럼을 상응하는 공지된 생물학적 거대분자와 비교함으로써, 표적 생물학적 거대분자에 대한 정보를 수득할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 상응하는 공지된 생물학적 거대분자는 표적 생물학적 거대분자와 실질적으로 동일한 아단위 서열을 가질 수 있거나, 실질적으로 상이할 수 있다. 예를 들면, 표적 폴리펩타이드가 단일 아미노산 차이에 의해 상응하는 공지된 폴리펩타이드와는 상이한 대립인자 변이체인 경우, 당해 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 단일 차이에 대한 예외일 수 있다. 비교에 있어서, 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산내의 돌연변이가 변화하는 경우 예를 들어 암호화 핵산의 판독 프레임이 STOP 코돈을 도입 또는 결실하는 경우, 표적 폴리펩타이드의 서열은 실질적으로 상응하는 공지된 폴리펩타이드의 서열과 상이할 것이다.
핵산과 관련하여, 표적 핵산은 예를 들어 개체(전립선암 환자)로부터 수득한 DNA 분자일 수 있고 전립선암과 관련된 트리뉴클레오타이드 서열의 증폭을 입증하는 다형성 영역을 포함하며, 상응하는 공지된 핵산은 전립선암을 갖지 않는 개체로부터 수득한 동일한 다형성 영역일 수 있다. 증폭의 양에 따라, 표적 핵산은 상응하는 공지된 핵산보다 실질적으로 클 수 있다. 또한, 표적 핵산은 다형성 또는 돌연변이 유전자를 갖지 않는 개체와 비교하여 개체의 표현형을 변화시킬 수 있는 다형성 또는 돌연변이 유전자일 수 있고, 상응하는 공지된 핵산은 관련 모집단에서 대다수의 개체에 존재하는 대립인자의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
표적 생물학적 거대분자는 보다 거대한 생물학적 거대분자의 단편일 수 있고, 보다 거대한 생물학적 거대분자를 적절한 단편화 제제와 접촉시켜 제조할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단편화 제제"는 생물학적 거대분자와의 접촉에 의해 생물학적 거대분자를 2개 이상의 분리된 부분으로 파괴하는 물리적, 화학적 또는 생화학적 제제를 의미한다. 일반적으로, 단편화 제제는 특정한 유형의 생물학적 거대분자, 예를 들어 폴리펩타이드를 절단하는 펩티다제; 핵산 분자를 절단하는 뉴클레아제; 또는 탄수화물을 절단하는 글리코시다제에 특이적이다. 또한, 비-특이적 단편화 제제는 공지되어 있으며, 예를 들어 이온화 조사 또는 초음파와 같은 물리적 제제가 포함된다. 생물학적 거대분자를 단편화 제제와 접촉시킴으로써 생물학적 거대분자의 단편이 생성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단편"은, 생물학적 거대분자와 관련하여 사용되는 경우, 전체 생물학적 거대분자보다 분자량이 작은 생물학적 거대분자 부분을 의미한다. 생물학적 거대분자의 단편은 생물학적 거대분자를 포함하는 하나 이상의 아단위이거나, 결실 단편을 포함하여, 하나 이상의 아단위를 결실한 생물학적 거대분자 부분일 수 있다.
폴리펩타이드의 단편은, 예를 들어 폴리펩타이드의 특이적 화학적 또는 효소적 분해에 의해 일반적으로 생성된다. 화학적 또는 효소적 절단을 서열 특이적 방식으로 발생시키는 경우, 폴리펩타이드의 단편 생성은 폴리펩타이드의 1차 아미노산 서열에 의해 정의된다. 폴리펩타이드의 단편은 예를 들어 고체 지지체에 고정화될 수 있는 폴리펩타이드를, Asp-Gly 펩타이드 결합을 절단할 수 있는 높은 pH에서, 메티오닌 잔기에서 폴리펩타이드를 절단하는 화학제(예: 시아노겐 브로마이드, 또는 하이드록실아민)와 접촉시키거나; 펩티다제, 예를 들어 Lys 또는 Arg 잔기에서 폴리펩타이드를 절단하는 트립신 등의 엔도펩티다제, 또는 폴리펩타이드의 카복시 말단으로부터 방출된 하나 이상의 유리 아미노산 및 하나 이상의 아미노산을 결실하는 폴리펩타이드의 결실 단편을 생성하는 카복시펩티다제 등의 엑소펩티다제와 접촉시켜 생성할 수 있다.
용어 "결실 단편"은 생물학적 거대분자의 말단으로부터 아단위를 연속적으로 절단한 후에 잔류하는 생물학적 거대분자의 단편을 의미한다. 용어 "결실 단편의 중복 세트"는 생물학적 거대분자로부터 아단위의 순차적 절단으로부터 유래되는 결실 단편의 모집단을 의미한다. 결실 단편의 중복 세트는 일반적으로 생물학적 거대분자의 일부분 이상의 각 아단위에서 종결되는 하나 이상의 결실 단편을 함유함으로써 생물학적 거대분자를 서열 분석하게 한다. 따라서, "N"이 생물학적 거대분자의 아단위 수인 경우, N 결실 단편이 생물학적 거대분자로부터 많이 생성될수록, N 결실 단편은 적게 생성될 수 있다. 또한, 핵산 단편의 "중복 세트"가 예를 들어 디데옥시 서열 분석 방법 등의 쇄-종결 폴리머라제 반응을 수행함으로써 생성될 수 있음을 인지하여야 한다.
말단으로부터 생물학적 거대분자를 절단하는 단편화 제제를 사용하는 결실 단편의 생성과 비교하여, 생물학적 거대분자에서 특이적 부위를 인지하는 단편화 제제로 생물학적 거대분자를 처리하는 것은 생물학적 거대분자의 (M+1) 단편(여기서, "M"은 생물학적 거대분자에서 특이적 절단 부위의 수이다)을 생성시킨다. 예를 들면, 시아노겐 브로마이드를 사용하여 내부 및 산재된 메티오닌 잔기가 4개인 폴리펩타이드를 처리함으로써 5개의 폴리펩타이드 단편이 생성된다.
핵산, 탄수화물, 또는 기타 생물학적 거대분자의 단편을 또한 생성할 수 있다. 예를 들면, DNAses 및 RNAses 등의 엑소뉴클레아제 및 제한 엔도뉴클레아제 등의 엔도뉴클레아제를 사용하여 핵산 분자의 단편을 생성할 수 있다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), listing nucleic acid fragmenting agents]. 핵산 단편을 생성하기 위한 뉴클레아제의 선택은 수행되는 방법 및 핵산 분자의 특성, 예를 들어 DNA 또는 RNA인지의 여부, 및 DNA인 경우에는 경우에 따라 뉴클레아제 작용에 대한 인지 부위를 함유하는지의 여부에 따라 달라질 것이다. 유사하게는, 탄수화물 단편은 엑소글리코시다제 또는 엔도글리코시다제 등의 효소, 예를 들어 α-1,4-글리코시딕 결합을 함유하는 탄수화물의 단편을 생성할 수 있는 아밀라제를 사용하여 생성할 수 있다(미국 특허 제5,821,063호).
표적 생물학적 거대분자의 결실 단편의 중복 세트는 말단으로부터 생물학적 거대분자를 절단하는 제제를 사용하여 생성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "말단으로부터 한쪽 방향으로 생물학적 거대분자를 절단하는 제제"는 생물학적 거대분자의 한쪽 말단으로부터 아단위를 연속적으로 제거하기 위한 물리적, 화학적 또는 생물학적 제제를 의미한다. 말단으로부터 한쪽 방향으로 생물학적 거대분자를 절단하는 생물학적 제제의 예는 폴리펩타이드의 카복실 말단으로부터 아미노산을 연속적으로 절단하는 카복시펩티다제 Y 등의 엑소펩티다제(참조: 미국 특허 제5,792,664호; 국제 공개 공보 제WO 96/36732호) 또는 이본쇄 DNA의 3'-하이드록실 말단으로부터 뉴클레오타이드를 연속적으로 절단하는 엑소뉴클레아제 III 등의 엑소뉴클레아제(참조: 국제 공개 공보 제WO 94/21822호)이다. 물리적 제제의 예는 광 공급원, 특히 아단위가 광안정성인 결합을 통해 생물학적 거대분자에 결합된 경우에 생물학적 거대분자로부터 말단 아단위를 절단할 수 있는 레이저이다. 화학적 제제의 예는 산의 존재하에 폴리펩타이드로부터 아미노 말단 아미노산을 절단하는 페닐이소티오시아네이트(Edman's 시약)이다.
본원에 사용된 바와 같이, 천연 α-아미노산의 잔기는 이의 배위 mRNA와 함께 하전된 tRNA 분자의 특이적 인지에 의해 단백질에 도입되는, 자연에서 발견되는 20개 α-아미노산의 잔기이다.
본원에 사용된 바와 같이, 비-천연 아미노산은 유전적으로 암호화되지 않은 아미노산을 의미한다. 본원에서 바람직한 비-천연 아미노산은 불포화 측쇄를 갖는 것들이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 2개 이상의 아미노산 또는 아미노산 유도체를 의미하며, 이는 변형된 펩타이드 결합일 수 있는 펩타이드 결합으로 결합되는 질량 변형된 아미노산 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 폴리펩타이드의 예에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 천연 단백질, 유전자 산물, 단백질 접합체, 돌연변이체 또는 다형성 폴리펩타이드, 해독후 변형된 단백질, 화학적 합성 산물을 포함하는 유전적으로 조작된 유전자 산물; 시험관내 해독 기본된 발현 시스템(이는 벡터 혼합, 랜덤 또는 지시된 돌연변이 유발 및 펩타이드 서열 랜덤화를 수반하는 신속한 진화 시스템을 포함함), 올리고펩타이드, 항체, 효소, 수용체, 조절 단백질, 핵산 결합 단백질, 호르몬, 또는 파지 또는 박테리아 표시 방법 등의 표시 방법의 단백질 산물이 포함된다.
폴리펩타이드는 암호화 서열의 적어도 일부분인 뉴클레오타이드 서열, 또는 예를 들어 암호화 프레임 이외의 판독 프레임내에 이들의 존재 또는 인트론 서열의 존재에 기인하는 자연적으로 해독되지 않는 뉴클레오타이드 서열, 3' 또는 5' 비해독된 서열 또는 조절 서열(예: 프로모터)로부터 해독될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드는 화학적으로 합성할 수 있고, 해독 또는 화학적 합성후에 화학적 또는 효소적 방법에 의해 변형시킬 수 있다. 용어 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는, "펩타이드"가 "폴리펩타이드"보다 일반적으로 작을 수 있지만, 해독된 핵산, 예를 들어 유전자 산물을 언급하는 경우에는 본원에서 교대로 사용될 수 있으며, "단백질"은 종종 해독후 변형될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 2개 이상의 공유 결합된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 동족체 아단위를 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 핵산은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 또는 PNA와 같은 DNA 또는 RNA의 동족체일 수 있고, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오타이드 동족체, 또는 포스포디에스테르 결합 이외의 공유 결합(주쇄), 예를 들어 티오에스테르 결합, 포스포트리에스테르 결합 또는 펩타이드 결합(펩타이드 핵산; PNA; 참조: Tam et al., Nucl. Acids Res. 22: 977-986(1994); Ecker and Crooke, BioTechnology 13: 351360(1995)), 3중 나선을 또한 고려할 수 있다. 핵산은 일본쇄, 이본쇄 또는 이의 혼합물일 수 있다. 본원의 목적상, 달리 명시되지 않는 한, 핵산은 이본쇄이거나 문맥상 자명하다. 뉴클레오타이드 동족체는 상업상 입수가능하고, 이러한 뉴클레오타이드 동족체를 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법은 공지되어 있다[참조: Lin et al., Nucl. Acids Res. 22: 5220-5234(1994); Jellinek et al., Biochemistry 34: 11363-11372(1995); Pagratis et al., Nature Biotechnol. 15: 68-73(1997)].
핵산은 예를 들어 DNA-RNA 하이브리드를 포함하는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다. 핵산은 또한 보다 긴 핵산 분자 부분, 예를 들어 다형성 영역을 함유하는 유전자 부분일 수 있다. 핵산의 분자 구조, 예를 들어 유전자 또는 이의 부분은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실물, 치환물 또는 부가물; 뉴클레오타이드 서열; 메틸화 상태; 또는 뉴클레오타이드 서열의 임의의 기타 변형을 포함하는 이의 뉴클레오타이드 내용물에 의해 정의된다. 일본쇄 또는 이본쇄 분자를 포함하여, 핵산은 2개 이상의 뉴클레오타이드 또는 공유 결합으로 결합된 뉴클레오타이드 동족체를 함유할 수 있지만, 이는 상기 언급된 바와 같이 생성될 수 있는 핵산의 "단편"은 단일 뉴클레오타이드와 같이 작을 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 또한 본원에서 공유 결합으로 결합된 2개 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 동족체를 의미하는 것으로 사용되지만, PCR 프라이머와 같은 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 뉴클레오타이드의 길이가 약 50개 미만 내지 100개이다.
본원에 사용된 바와 같이, 문구 "표적 생물학적 거대분자의 동일성을 측정하는"은 핵산, 폴리펩타이드 또는 기타 생물학적 거대분자일 수 있는 생물학적 거대분자의 하나 이상의 특징을 측정하는 것을 의미한다. 생물학적 거대분자의 동일성을 측정하는 것의 예에는 생물학적 거대분자의 분자량 또는 전하를 측정하는 것; 생물학적 거대분자의 하나 이상의 아단위 또는 아단위 서열의 동일성을 측정하는 것; 또한 생물학적 거대분자 단편의 특정한 패턴을 측정하는 것이 포함된다. 예를 들면, 생물학적 거대분자가 핵산인 경우, 표적 핵산의 동일성을 측정하는 것에는 표적 핵산의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 측정하거나, 랜덤 뉴클레오타이드 반복체의 서열에 존재하는 뉴클레오타이드 반복체의 수를 측정하는 것이 포함된다. 유사하게는, 표적 생물학적 거대분자가 폴리펩타이드인 경우, 표적 폴리펩타이드의 동일성을 측정하는 것에는 하나 이상의 아미노산, 또는 예를 들어 엔도펩티다제를 사용한 폴리펩타이드의 처리후 표적 폴리펩타이드의 펩타이드 단편의 특정한 패턴을 측정하는 것이 포함된다. 표적 생물학적 거대분자의 동일성을 측정하는 것은 표적 생물학적 거대분자를 필요한 경우 적절한 특정한 반응으로 처리하고; IR 방사선을 흡수하는 액체 매트릭스와 생물학적 거대분자 또는 이의 반응 산물을 함유하는 조성물을 제조하며; 표적 생물학적 거대분자 또는 이의 반응 산물을 IR-MALDI 질량 스펙트럼으로 분석함으로써 수행할 수 있다.
용어 "적외선" 및 "적외선 파장"은 가시 범위내의 적색광 파장보다는 길고 레이다 파장보다는 짧은 전자기 파장, 일반적으로 약 760nm 내지 약 50nm 범위내의 파장을 의미한다. 적절한 적외선 파장은 본원에 기술된 바와 같이 레이저를 사용하여 발생시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "액체 매트릭스"는 탈착 및 이온화의 수행에 사용되는 레이저(즉, IR 방사 레이저) 파장에서의 흡수가 충분하고 실온(약 20℃, 1기압)에서 액체인 물질을 의미한다. 고려되는 액체는 결정질 구조와는 대조적으로 고체 상태에서 유리질 고체 또는 유리를 형성할 수 있는 액체, 예를 들어 피콜산 또는 3HPA와 같은 매트릭스를 건조시킬 경우에 형성하는 액체이다. 유리질 고체 및 유리는 불균질 구조의 고체 결정질을 형성하지 않지만, 정렬된 구조의 결핍으로부터 유래되는 액체 특성을 보유한다. 또한, 이러한 액체 매트릭스는 기질 또는 지지체 표면에 적용되는 경우 균질한 층을 형성한다. 따라서, 본 발명의 목적상, 액체 매트릭스는 생물적합성, 특히 핵산 및/또는 단백질과 적합성인 비교적 비-휘발성의 물질이며, 이로써 제한되지는 않지만, 글리콜 및 폴리올을 포함하는 알콜(예: 글리세롤), 당(예: 슈크로즈, 만노즈, 갈락토즈 및 기타 당류) 및 중합 당류, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리메틸올프로판, 펜타에리트리톨, 덱스트로즈, 메틸글리코사이드 또는 솔비톨, 슈크로즈, 만노즈 및, 고체 상태에서 결정질 구조보다는 유리질을 형성할 수 있는 기타 물질이 포함된다. 또한, 매우 작은 용적, 즉 마이크로리터 이하, 특히 나노리터 미만의 용적이 분산되어 있는 조건하에 발생하는 "유리질" 물 상태가 포함된다. 기타 액체 매트릭스에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 트리에탄올아민, 락트산, 3-니트로벤질알콜, 디에탄올아민, DMSO, 니트로페닐옥틸에테르(3-NPOE), 2,2'-디티오디에탄올, 테트라에틸렌글리콜, 디티오트레이톨/에리트리톨(DTT/DTE), 2,3-디하이드록시-프로필-벤질 에테르, α-토코페롤 및 티오글리세롤이 포함된다. 기타 적합한 "액체" 매트릭스는 하기에 기재되어 있다.
흡수 목적상, 액체 매트릭스는 적외선을 강력히 흡수하는 하나 이상의 발색단 또는 관능 그룹을 함유할 수 있다. 적절한 관능 그룹의 예에는 니트로, 설포닐, 설폰산, 설폰아미드, 니트릴 또는 시아나이드, 카보닐, 알데하이드, 카복실산, 아미드, 에스테르, 무수물, 케톤, 아민, 하이드록실, 방향족 환, 디엔 및 기타 공액 시스템이 포함된다. IR 방사선을 흡수하는 액체 매트릭스는 IR-MALDI 및 액체 매트릭스에 의해 분석되는 생물학적 거대분자를 함유하는 조성물을 포함하여, 생물학적 거대분자의 IR-MALDI 분석을 촉진시키는 첨가제를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 적절한 점도는 유리-형 액체 매트릭스를 분산시키기 위한 점도를 의미하며, 이는 소량으로서 분산될 수 있고 박층에서 작은 표면적위에 균일하게 분산된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "첨가제"는 생물학적 거대분자의 IR-MALDI를 촉진시키는 물질을 의미한다. 예를 들면, 첨가제는 액체 매트릭스를 함유하는 조성물에서 생물학적 거대분자의 용해도를 촉진시킬 수 있다. 첨가제는 또한 탈착 및 이온화에 사용된 레이저 파장에서 높은 흡광 계수(E)를 갖는 화합물(들), 예를 들어 디니트로벤젠 또는 폴리엔일 수 있다. 첨가제는 또한 매트릭스/샘플 또는 매트릭스의 이온 강도를 변화시키는 화합물을 포함한다. 염 첨가제의 예에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 암모늄 염 및 아민 염이 포함된다. 본 발명의 목적상 염 첨가제의 예에는 NH4-아세테이트 및 트리스-HCl이 포함된다.
IR-MALDI로 분석되는 생물학적 거대분자가 핵산인 경우, 첨가제는 예를 들어 액체 매트릭스를 산성화시켜 이본쇄 핵산의 분해를 유도하거나 tRNA와 같은 핵산 또는 기타 일본쇄 핵산의 2차 구조를 변성시킬 수 있는 화합물이다. 첨가제는 또한 매트릭스와 생물학적 거대분자 사이의 염 형성을 최소화시킬 수 있고, 예를 들어 생물학적 거대분자를 조절하는 물질일 수 있다. IR-MALDI로 이본쇄 핵산을 분석 또는 검출할 경우, 첨가제는 이본쇄 분자를 안정화시키고 이본쇄 핵산의 변성을 감소시키면서 일반적으로 질량 분석법에 적합성인 물질일 수 있다. 이러한 첨가제에는, 이로써 제한되지는 않지만, 염이 포함된다. 바람직한 염 첨가제에는 암모늄 염 및 아민 염이 포함된다. 본 발명의 목적상 예시적인 염 첨가제는 NH4-아세테이트 및 트리스-HCl이다.
매트릭스는 추가의 정제로 처리하여, 유해한 유도체 및 반응 공정중의 기타 부산물을 포함하는 기타 유기 오염물을 제거할 수 있다.
생물학적 거대분자 또는 이의 단편, 특히 표적 생물학적 거대분자는 IR-MALDI 질량 분석법 전에 조절할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 거대분자와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "조절된" 또는 "조절하는"은 생물학적 거대분자를 이온화시키거나 휘발시키는데 요구되는 IR 방사선의 양을 감소시키고 생물학적 거대분자의 바람직하지 않은 단편화 가능성을 최소화시키거나, 생물학적 거대분자 또는 이의 단편의 질량 스펙트럼의 분해능을 증가시키기 위해 생물학적 거대분자가 변형되는 것을 의미한다. 표적 생물학적 거대분자 또는 이의 단편의 질량 스펙트럼의 분해능은 IR-MALDI 질량 분석법을 수행하기 전에 생물학적 거대분자를 조절함으로써 증가시킬 수 있다. 조절은 IR-MALDI 질량 분석법 전의 모든 단계, 특히 생물학적 거대분자를 기질 위에 고정화시키면서 수행할 수 있다. 조절 방법은 이러한 결과를 달성하는 모든 방법을 포함하며, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 거대분자를 이온 교환, 또는 균일한 전하 분포, 질량 변형, 핵산의 포스포디에스테르 주쇄의 변형, 포스포디에스테르 주쇄로부터 네가티브 전하의 제거, 양이온 교환, 추가의 정제를 제공하는 기타 방법, 및 조절을 달성하는 것으로 당업자에게 공지된 기타 방법으로 처리하는 방법이 포함된다.
생물학적 거대분자의 조절은 생물학적 거대분자의 생화학적 정도에 따라 부분적으로 달라질 수 있다. 예를 들면, 생물학적 거대분자는 생물학적 거대분자의 전하 이종성을 감소시키는 양이온 교환 물질 또는 음이온 교환 물질로 처리함으로써 표적 생물학적 거대분자에 결합된 양이온(또는 음이온) 수의 불일치에 기인하는 피크 확장을 제거하여 조절할 수 있다. 폴리펩타이드는 예를 들어 디설파이드 결합의 형성을 억제하는, 알킬요오다이드, 요오도아세트아미드, 요오도에탄올 또는 2,3-에폭시-1-프로판올 등의 알킬화제로 처리하여 조절할 수 있다. 이러한 알킬화제는 또한 모노티오포스포디에스테르 결합을 포스포트리에스테르 결합으로 전환시켜 핵산을 조절하기 위해 사용할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 트리알킬실릴 클로라이드와의 접촉에 의해 하전된 아미노산 측쇄를 비하전된 유도체로 전환시켜 조절할 수 있으며, 이는 또한 포스포디에스테르 결합을 비하전된 유도체로 전환시켜 핵산을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 생물학적 거대분자는 또한 상응하는 비변형된 아단위보다 더욱 안정한 변형된 아단위를 도입함으로써, 예를 들어 표적 핵산에서 N7- 또는 N9-데아자푸린 뉴클레오타이드를 치환시켜 생물학적 거대분자의 단편화 가능성을 최소화시킴으로써 조절할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 하나 또는 수개의 샘플링으로 복수의 생물학적 거대분자를 예를 들어 다중 분석으로 분석하는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다중"은 2개 이상의 표적 생물학적 거대분자의 동일성을 IR-MALDI 질량 분석법으로 동시에 측정하는 것을 의미한다. 예를 들면, 상이한 표적 생물학적 거대분자의 모집단이 마이크로칩 또는 기타 기질 위에 배열로 존재하는 경우, 다중은 복수의 표적 생물학적 거대분자의 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 다중은 예를 들어 목적하는 각각의 상이한 생물학적 거대분자를 상이하게 질량 변형시킨 다음 IR-MALDI 질량 분석법을 사용하여 각각의 상이한 생물학적 거대분자의 동일성을 측정함으로써 수행할 수 있다. 다중 분석은 각각의 개개 표적 생물학적 거대분자에 대한 별도의 질량 분석법을 수행하는 것과 비교하여 복수의 표적 생물학적 거대분자를 단일 IR-MALDI 질량 스펙트럼과 같이 소수의 스펙트럼으로 동정할 수 있다는 잇점을 제공한다.
"다중"은 몇가지의 상이한 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들면, 상응하는 검출기(프로브) 분자(예: 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 유사체)를 사용함으로써 몇개의 돌연변이체를 하나의 표적 서열상에서 동시에 검출할 수 있다. 검출기 올리고뉴클레오타이드 D1, D2 및 D3 사이의 분자량 차이는 동시의 검출(다중)이 가능하도록 충분히 커야 한다. 이는 서열 자체(조성 또는 길이) 또는 검출기 올리고뉴클레오타이드내로 질량-변형 관능기의 도입에 의해 달성할 수 있다. 질량 변형 잔기는 예를 들어 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단, 뉴클레오염기(또는 염기), 포스페이트 주쇄 및 뉴클레오사이드)의 2'-위치 및/또는 말단 3'-위치에 결합할 수 있다. 질량 변형 잔기의 예에는 예를 들어 할로겐, 아지도, 또는 XR 유형(여기서, X는 결합 그룹이고, R은 질량 변형 관능기이다)이 포함된다. 따라서, 질량-변형 관능기는 정의된 질량 증가물을 올리고뉴클레오타이드 분자에 도입하기 위해 사용될 수 있다.
질량-변형 잔기(M)는 뉴클레오염기(예를 들면, C7-데아자뉴클레오사이드의 경우 C-7에)에, 알파 포스페이트의 트리포스페이트 그룹에, 또는 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 당 환의 2'-위치에 결합할 수 있다. 또한, 질량-변형 관능기는, 뉴클레오사이드 트리포스페이트에서 당 환의 3'-위치에 이를 결합시키는 것과 같이, 쇄 종결에 영향을 미치도록 부가할 수 있다. 또다른 예시적 양태로서, 올리고/폴리에틸렌 글리콜 이외의 각종 질량-변형 관능기(R)가 선택되어 적절한 결합 화학물(X)을 통해 결합될 수 있다. 단순한 질량-변형은 할로겐(예: F, Cl, Br 및/또는 I) 또는 유사할로겐(예: SCN, NCS)을 H로 치환시키거나 상이한 알킬, 아릴 또는 아르알킬 잔기(예: 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 3급-부틸, 헥실, 페닐, 치환된 페닐, 벤질), 또는 관능 그룹(예: CH2F, CHF2, CF3, Si(CH3)3, Si(CH3)2(C2H5), Si(CH3)(C2H5)2, Si(C2H5)3)을 사용하여 달성할 수 있다. 또다른 질량-변형은 핵산 분자(예: 검출기(D)) 또는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 통해 호모- 또는 헤테로펩타이드를 결합시킴으로써 달성할 수 있다. 질량이 57배 증대된 질량-변형된 종의 제조에 유용한 한가지 예는 올리고글리신의 결합이며, 예를 들어 74배(r=1, m=0), 131배(r=1, m=2), 188배(r=1, m=3), 245배(r=1, m=4)의 질량-변형물이 수득된다. 또한 단순한 올리고아미드를 사용하여 74배(r=1, m=0), 88배(r=2, m=0), 102배(r=3, m=0), 116배(r=4, m=0) 등의 질량-변형물을 수득할 수 있다. 질량 변형물은 다중화를 보조할 뿐만 아니라, 단편의 질량 분석법 분해능을 보조하기 위해 사용된다(즉, 질량 변형은 분석용 핵산의 "조절"을 보조한다). 기타 화학물질, 예를 들어 문헌[참조: Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein, editor, IRL Press, Oxford, 1991]에 기술되고 질량 분광학 분야에 공지된 화학물질을 질량-변형된 화합물에 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 거대분자와 관련하여 사용되는 경우 용어 "복수"는 각각 상이한 아단위 서열을 갖는 2개 이상의 생물학적 거대분자를 의미한다. 서열의 차이는 서열중의 자연 발생 변이, 예를 들어 뉴클레오타이드 또는 암호화된 아미노산의 대립인자 변이에 기인하거나, 특정한 변형물의 다양한 서열내로의 도입, 예를 들어 각각 질량 변형된 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 각 핵산 또는 폴리펩타이드내로의 복수의 상이한 도입에 기인할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 분리된 생물학적 거대분자를 사용하여 수행할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분리된"은 생물학적 거대분자가 이의 자연 상태로 생물학적 거대분자와 통상적으로 결합된 거대분자로부터 실질적으로 분리된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 분리된 핵산 분자는 세포에서 통상 이와 결합된 세포 물질로부터 실질적으로 분리되거나, 세포 또는 바이러스 물질; 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 배양 배지; 또는 핵산이 화학적으로 합성되는 화학적 전구체 또는 기타 화학물질로부터 실질적으로 분리될 수 있다. 일반적으로, 보다 거대한 핵산의 단편일 수 있는 분리된 핵산 분자는 이의 천연 상태에 대해 약 50% 이상 풍부하며, 일반적으로 약 70 내지 약 80% 풍부하고, 특히 약 90% 또는 95% 또는 그 이상 풍부하다. 바람직하게는, 분리된 핵산은 핵산을 함유하는 샘플의 약 50% 이상을 구성하며, 샘플내의 약 70% 또는 80% 이상의 물질, 특히 샘플의 약 90% 내지 95% 또는 그 이상일 수 있다.
유사하게는, 분리된 폴리펩타이드는 상기 정의된 바와 동일한 정도로 폴리펩타이드를 함유하는 샘플의 분획과 통상적으로 결합되거나 이를 구성하는 물질과 결합하여, 즉 이의 천연 상태와 대해 약 50% 이상 풍부해지거나 폴리펩타이드를 함유하는 샘플의 약 50% 이상을 구성하는 것에 기초하여 동정할 수 있다. 예를 들면, 분리된 폴리펩타이드는 통상적으로 폴리펩타이드를 발현하는 세포 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조할 수 있는 세포로부터 정제할 수 있고, 보다 거대한 폴리펩타이드의 단편일 수 있다.
생물학적 거대분자는 생물학적 거대분자 또는 생물학적 거대분자에 결합된 태그와 특이적으로 상호작용하는 시약을 사용하여 분리할 수 있다. 예를 들면, 표적 폴리펩타이드는 표적 폴리펩타이드, 표적 펩타이드와 융합된 펩타이드 태그(즉, 컬럼 등의 시약에 특이적으로 결합시키기 위해 사용될 수 있는 펩타이드), 또는 표적 폴리펩타이드에 접합된 펩타이드 태그를 사용하여 분리할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "시약"은 각각 특정한 리간드 결합 분자 또는 리간드와 특이적으로 상호작용하는 리간드 또는 리간드 결합 분자를 의미한다. 용어 "태그 펩타이드" 또는 "펩타이드 태그"는 질량 태그와 혼동되지 않아야 하며, 본원에서는 시약이 이용가능한 펩타이드를 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "태그"는 일반적으로 시약이 이용가능한 모든 분자를 의미하며, 따라서 태그 펩타이드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 시약은 표적 생물학적 거대분자(예: 폴리펩타이드)의 에피토프 또는 표적 생물학적 거대분자에 결합된 태그의 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 항체일 수 있다. 예를 들면, 시약은 표적 폴리펩타이드에 융합된 myc 에피토프와 특이적으로 상호작용할 수 있는 항-myc 에피토프 항체일 수 있다. 또한, 시약은 예를 들어 폴리히스티딘과 특이적으로 상호작용하는 금속 이온(예: 니켈 이온 또는 코발트 이온); 또는 폴리아르기닌 또는 폴리리신 태그 펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 아연, 구리 또는 예를 들어 아연 핑거 도메인; 또는 비오틴 또는 이의 유도체 등의 태그와 특이적으로 상호작용하는 분자(예: 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 이의 유도체)(예를 들면, 아비딘 및 스트렙트아비딘을 포함하는 비오틴 결합 화합물로부터 아민, 특히 암모니아를 사용하여, 폴리펩타이드에 접합된 비오틴 및 비오틴 동족체를 포함하는 비오틴 화합물을 분리하는 방법을 기술하는 국제 공보 제WO 97/43617호 참조)일 수 있다.
또한, 비오틴과 같은 태그를 표적 핵산에 도입하여, 아비딘 또는 스트렙트아비딘 등의 시약을 사용하여 표적 핵산을 분리할 수 있다. 또한, 표적 핵산은 경우에 따라 비이드(예: 자기 비이드) 등의 고체 지지체에 고정화시킬 수 있는 상보성 핵산 서열을 함유하는 시약과의 하이브리드화에 의해 분리할 수 있다.
시약 및 표적 생물학적 거대분자 서열 또는 시약이 결합하는 태그와 관련하여 사용되는 경우 용어 "특이적으로 상호작용하는"은 결합이 비교적 높은 친화성으로 발생한다는 것을 의미한다. 자체로서, 시약은 특정한 생물학적 거대분자 서열 또는 태그에 대해 약 1×106M-1이상, 일반적으로 약 1×107M-1이상, 및 특히 약 1×108M-1이상의 친화성을 갖는다. 예를 들어, 특정한 태그 펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 시약은 기타 무관한 분자가 존재하는지의 여부에 관계없이 주로 태그 펩타이드와 결합하며, 따라서 표적 폴리펩타이드를 함유하는 샘플, 예를 들어 시험관내 해독 반응으로부터, 태그 펩타이드에 융합된 표적 폴리펩타이드를 포함하는 태그 펩타이드를 분리하는데 유용하다. 유사하게는, 표적 핵산과 특이적으로 상호작용하는 시약 상보성 핵산 서열은 표적 핵산과 선택적으로 결합하지만, 무관한 핵산 분자와는 결합하지 않는다.
일반적으로 올리고뉴클레오타이드인 하이브리드화 핵산 서열은 뉴클레오타이드 길이가 9개 이상(이러한 서열은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 위한 프라이머로서 특히 유용하다)이며, 14개 이상의 뉴클레오타이드 길이, 또는 경우에 따라 17개 이상의 뉴클레오타이드 길이(이러한 뉴클레오타이드 서열은 PCR 뿐만 아니라 하이브리드화 프로브로서 특히 유용하다)일 수 있다. 핵산 서열(예: 표적 핵산)과 올리고뉴클레오타이드(예: PCR 프라이머)의 특이적 하이브리드화에 요구되는 조건은 서열 사이에 공유된 상보성 정도, 하이브리드화 분자의 GC 함량, 및 안티센스 핵산 서열의 길이에 따라 부분적으로 달라지며, 특이적 하이브리드화를 수득하는데 적합한 조건은 용이하게 입수가능한 방정식에 기초하여 계산하거나 경험적으로 측정할 수 있는 것으로 인지되어야 한다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(Green Publ., NY 1989)].
상술된 방법은 생물학적 분자(예: 표적 핵산 또는 표적 폴리펩타이드)를 기질, 특히 고체 지지체(예: 비이드, 마이크로칩, 유리 또는 플라스틱 모세관), 또는 웰, 핀 또는 표적 거대분자가 당해 부위에 포획되는 기타 수단 등의 구조를 함유할 수 있는 임의의 표면, 특히 편평한 표면에 고정화시켜 수행하는 것이 유리할 수 있다. 생물학적 거대분자는 각종 수단, 예를 들어 스트렙트아비딘 또는 비오틴-비오틴 상호작용에 의해; 소수성 상호작용에 의해; 예를 들어 스트렙트아비딘 피복된 자기 비이드(Dynal Inc.; Great Neck NY)인 DYNABEADS와 같은 작용화된 자기 비이드를 사용하는 자기 상호작용에 의해; 2개의 극성 표면 사이 또는 올리고/폴리에틸렌 글리콜 사이의 "습윤화" 결합 등의 극성 상호작용에 의해; 아미드 결합, 디설파이드 결합, 티오에테르 결합 등의 공유 결합의 형성에 의해; 가교결합제를 통해; 및 산-불안정성 또는 광절단가능한 링커를 통해 고체 지지체에 접합될 수 있다[참조: Hermanson, Bioconjugate Techniques(Academic Press 1996)]. 또한, 태그는 당해 생물학적 거대분자, 특히 표적 생물학적 거대분자에 접합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접합된" 또는 "고정화된"은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있고 정의된 조건하에 안정한 결합을 의미한다. 본원에 기술된 바와 같이, 생물학적 거대분자는 기질에 고정화될 수 있고, 또는 제1 기질는 제2 기질에 접합될 수 있다. 기질에 대한 생물학적 거대분자의 고정화는 직접 수행되거나 링커를 통해 간접적으로 수행될 수 있고, 가역적으로 수행될 수 있다. 가역적 고정화는 예를 들어 광을 사용하여 결합을 절단하여 광절단가능한 결합을 분리하거나 결합을 반전시키는 조건, 예를 들어 디설파이드 결합을 반전시키는 환원 조건으로 결합을 처리하여 반전시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기질" 또는 "고체 지지체"는 편평한 표면, 또는 반응성 그룹을 함유하는 생물학적 거대분자를 포함하는 관능 그룹이 접합될 수 있는 구조를 갖는 표면을 의미한다. 용어 "구조를 갖는 표면"은 예를 들어 반응성 그룹을 함유하는 생물학적 거대분자를 포함하는 관능 그룹이 결합할 수 있는 웰, 핀 등을 함유하는 기질을 의미한다. 고체 지지체(기질)의 다수의 예는 본원에 기재되거나 본 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 기술된 방법은 질병 또는 상태를 갖거나 이에 노출된 개체를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "질병"은 개체의 병변 상태에 대한 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 발명의 목적상, 질병은 예를 들어 유전적 돌연변이, 염색체 결손 또는 감염성 유기체에 기인할 수 있다. 생물학적 거대분자의 조절로부터 구별되어야 하는 용어 "상태"는 예를 들어 개체가 자극에 반응하는 방법을 부분적으로 결정하는 상태 또는 병변 상태를 포함하는 모든 개체 상태를 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 개체의 상태는 개체가 반응하는 방법에 대한 징후, 예를 들어 이식 또는 특정 의약을 사용한 치료를 제공할 수 있는 개체의 유전형의 특징을 측정하거나, 개체로부터 수득된 생물학적 샘플내의 특정한 생물학적 거대분자, 예를 들어 특정한 질병과 관련된 탄수화물의 발현을 검출함으로써 부분적으로 측정할 수 있다. 따라서, 상태에 노출되는 개체의 관련성은 예를 들어 개체가 유전형을 갖는지를 지시해줄 수 있으며, 이는 개체가 특정한 의약에 대해 바람직하게 반응하지 않거나 개체가 특정한 이식편을 거부할 수 있음을 나타낸다.
질병 또는 상태와 "관련"되는 대립인자 또는 대립인자 변이체에 대한 본원의 관련성은 특정한 유전형이, 적어도 부분적으로, 당해 질병 또는 상태에 노출되었거나 노출되는 개체의 모집단이 나타내는 유전형의 특징이라는 것을 의미한다. 예를 들면, BRCA1 유전자내의 돌연변이 등의 대립인자 변이체는 유방암과 관련되고, 특정한 유전자에 있어서 정상보다 높은 뉴클레오타이드 반복체 수와 같은 대립인자 변이체는 전립선암과 관련된다. 숙련가들은 특정한 질병 또는 상태와 대립인자 변이체의 관련성이 모집단의 샘플링 또는 분석을 위한 공지된 통계학적 방법을 사용하여 동정될 수 있음을 인지할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 물질의 혼합물 및 뿐만 아니라 용액을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 기술된 방법의 실시는 당업자의 기술내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자전이 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다[참조: DNA Cloning, Volumes I and II(D.N. Glover, ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed., 1984); Mullis Et al., U.S. Patent No: 4,683,194; Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins, eds., 1984); Transcription and Translation (Hames and Higgins eds., 1984); Culture of Animal Cells(R.I. Freshney; Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.; Cold Spring Harbor Laboratory 1987); Methods in Enzymology, Vols. 154 and 155(Wu et al., eds., Academic Press, NY), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.; Academic Press London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I to IV(Weir and Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1986)].
IR MALDI를 사용하기 위한 방법 및 조성물
본원에 기술된 방법 및 조성물은, 적외선(IR) 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화(MALDI) 질량 분광학에 의한 거대분자 복합체(예: 단백질 복합체 및 핵단백질 복합체) 뿐만 아니라 핵산, 폴리펩타이드 및 탄수화물을 포함하는 생물학적 거대분자의 검출, 동정 또는 특성화를 가능케 한다. IR-MALDI 조성물은 IR-MALDI 질량 분광학으로 분석되는 하나 이상의 생물학적 거대분자와, 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 조성물을 제공한다. 기질 위에 침착될 수 있는 이러한 조성물은 IR-MALDI 질량 분광학에 의한 생물학적 거대분자의 특징을 측정하는데 유용하다.
또한, 예를 들어 샘플, 특히 생물학적 샘플에서 표적 생물학적 거대분자를 검출하는 방법; 핵산내의 돌연변이 또는 기타 유전자 변화의 존재 또는 유전자 변화를 갖는 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드에서 아미노산 변화의 존재와 같은 생물학적 거대분자의 동일성을 동정하는 방법; 생물학적 거대분자의 서열을 결정하는 방법을 포함하여, IR-MALDI 질량 분석법을 사용하여 표적 생물학적 거대분자를 분석하는 방법이 제공된다. 본원에 기술된 방법은, 생물학적 거대분자가 연속적으로 분석되거나 실리콘 웨이퍼상에 배열로 정렬되고 나란히 분석될 경우에 산출량이 높은 방법과 같은 별개의 관련된 방법, 또는 생물학적 거대분자의 상이한 질량 변형에 기인하여 복수의 각 생물학적 거대분자가 상이하게 동정가능한 경우에 다중 포맷을 사용하는 단일 방법으로, 하나 이상의 표적 생물학적 거대분자를 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 분석하게 한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은, 적어도 부분적으로, 적외선 전자기 파장에서 방사하는 레이저를 사용하여 액체 매트릭스내의 핵산을 탈착 및 이온화시킴으로써 보다 거대한 핵산 분자(DNA 및 RNA)의 고 분해능 질량 스펙트럼이 수득될 수 있다는 발견에 기초한다. 따라서, 핵산 조성물을 액체 매트릭스와 혼합하여 매트릭스/핵산 조성물을 형성하고, 상기 조성물을 기질 위에 침착시켜 매트릭스/핵산 조성물의 균질한 박층을 형성하는 방법이 IR-MALDI 질량 분석법의 수행에 제공된다. 이어서, 핵산을 함유하는 기질을 핵산이 탈착 및 이온화되도록 매트릭스에 의해 흡수되는 적절한 파장의 적외선으로 조하하고, 이에 의해 질량 분석기로 추출(분리) 및 분석될 수 있는 이온 입자를 방사시켜 핵산의 질량을 측정할 수 있다. 질량 분석법에 의한 핵산의 분석 방법은 핵산과 액체 매트릭스를 함유하는 조성물을 기질 위에 침착시켜 핵산/액체 매트릭스 조성물의 균일한 박층을 형성하고; 침착된 조성물을 함유하는 기질을 핵산이 탈착 및 이온화되도록 적외선 레이저로 조사하며; 적절한 질량 분리 및 분석 포맷을 사용하여 이온화된 핵산을 질량 분리 및 검출함으로써 수행할 수 있다.
표적 생물학적 거대분자와 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 조성물을 제조하고, 조성물에서 표적 생물학적 거대분자를 IR-MALDI 질량 분석법으로 분석함으로써 표적 생물학적 거대분자, 특히 표적 핵산을 분석하는 방법이 제공된다. 본원에 기술된 각종 방법은 표적 생물학적 거대분자의 분자량 측정, 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 표적 생물학적 거대분자의 검출 또는 동정, 또는 표적 생물학적 거대분자의 아단위 서열의 측정을 가능케 한다. 표적 생물학적 거대분자의 공급원에 따라, 본원에 기술된 방법은 예를 들어 개체가 질병 또는 질병의 예후를 갖는지의 여부를 측정하거나, 개체의 유전성, 동일성 또는 적합성을 측정하는데 유용하다(국제 공보 제WO 98/20019호).
표적 생물학적 거대분자, 예를 들어 표적 핵산 분자는 개체, 특히 개체의 세포 또는 조직 또는 생물학적 유체(즉, 생물학적 샘플)로부터 수득할 수 있다. 표적 생물학적 거대분자는 표적 핵산 분자이거나, 예를 들어 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자의 시험관내 해독에 의해 또는 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 시험관내 전사(여기서, 전사되는 핵산은 개체로부터 수득할 수 있다)후 시험관내 또는 세포내에서 수행될 수 있는 해독에 의해 수득될 수 있는 표적 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 기술된 방법은 표적 생물학적 거대분자에 대한 정보를 동정 또는 수득하는 신속하고 신뢰할 만한 방법을 제공한다.
생물학적 샘플로부터 수득한 표적 분자의 검출에 있어서 IR-MALDI의 예시적인 잇점
일부 정제된 표적 분자를 함유하는 생물학적 샘플은 표적 분자의 순수한 샘플에 존재하지 않는 외래 오염물(즉, 표적 분자 이외의 물질)을 함유한다. 예를 들면, 외래 단백질 및 염이 부분적으로 정제된 제제에 존재하여, 순수한 샘플과는 달리 이러한 제제를 실질적인 "혼합물"로 만든다. 따라서, 질량 분해능, 정밀성, 감수성 및 시그날-대-노이즈 비율은 생물학적 샘플로부터 수득한 표적 분자의 존재를 검출하기 위해 고안된 질량 분석법에서 매우 중요한 파라미터가 된다. 질량 분석법 기술은 오염 물질로부터, 유효 양으로 존재하지 않을 수도 있는 표적 분자를 명백히 용해시킬 수 있어야 한다.
따라서, 특정한 질량 분석법을 사용하여 상대적으로 순수한 생물학적 분자의 질량을 측정한다는 사실은 생물학적 샘플로부터 수득한 표적 분자의 검출에 적용할 수 있음을 보장하는 것은 아니다. 또한, 상이한 유형의 질량 분석법(예: 상이한 레이저 및/또는 매트릭스를 사용하는 ESI 및 MALDI)에서의 고유한 차이로 인해, 특정한 질량 분석법 기술이 생물학적 샘플로부터 수득한 표적 분자의 검출에 유용할 수 있다는 사실은 또다른 유형이 상기 목적에도 또한 적합할 수 있다는 것을 보장하지는 않는다. 또한, 특정한 유형의 표적 분자를 생물학적 샘플로부터 검출하기 위해 특정한 분광법 또는 조건 세트를 사용할 수 있다는 사실은 생물학적 샘플로부터 또다른 유형의 표적 분자를 검출하기 위해 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 보장하지는 않는다. 예를 들면, 생물학적 샘플로부터 상이한 크기 및 유형의 한 부류의 표적 분자(예: 일본쇄 대 이본쇄 DNA)는 상이한 질량 분석법 및 분석법 조건에 의해 검출되거나 검출되지 않을 수도 있는데, 이는 생물학적 샘플로부터 완전히 상이한 부류의 표적 분자(예: 핵산 대 단백질)가 상이한 질량 분석법 및 분석법 조건에 의해 검출되거나 검출되지 않을 수 있기 때문이다.
단백질과 핵산의 비교는 질량 분석법에 의한 분석에 대한 이들의 적합성에 직접적으로 영향을 미치는 수개의 차이를 나타낸다. 예를 들면, 핵산은 전형적으로 상이한 염기 및 데옥시리보즈 잔기 사이의 불안정한 N-글리코사이드 결합에 의한 뉴클레오염기의 소실 및 탈푸린화에 기인하여 단백질보다는 더욱 더 단편화에 감수성이다. 핵산의 스펙트럼은 단백질보다 부가물 형성 경향이 큰 것으로 나타난다. 또한, 탈착/이온화의 상대적인 용이성은 핵산과 비교하여 단백질이 더욱 큰 것으로 나타났는데, 이는 단백질은 특정한 구조로 폴딩하는 경향이 있는 반면에 핵산은 단백질보다 3차 구조를 덜 갖기 때문이다.
본원에 기술된 바와 같이, IR-MALDI 질량 분석법은 생물학적 샘플로부터 수득한 표적 분자, 특히 거대한 표적 분자의 검출 방법에서 효과적이고 유리한 것으로 밝혀졌다. 이는 생물학적 샘플로부터 수득한 표적 분자의 검출에 요구되는 분해능, 감수성, 시그날-대-노이즈 수준 등을 제공하는 최적 파라미터(예: 레이저의 특정한 조합, 파장, 매트릭스, 첨가물, 펄스 폭, 빔 프로파일, 온도 및/또는 플루언스)을 정의하는 중요성의 인지에 부분적으로 기인한다.
예를 들면, 보다 짧은 펄스 폭은, 특히 광전자 스위치를 갖는 레이저를 사용하는 표적 분자의 IR-MALDI 질량 분석법 검출에 사용될 수 있다. 전형적으로, 약 90ns 이하 및 일반적으로 약 80ns 이하의 펄스 폭은 IR-MALDI 질량 분석법 검출 방법에 사용될 수 있다.
또한, 이온 추출을 위해 보다 낮은 전기장 강도가 표적 분자의 IR-MALDI 질량 분석법 검출에 사용될 수 있다. 약 1000V/mm 내지 약 200V/mm의 자장력이 전형적으로 표적 분자의 IR-MALDI 질량 분석법 검출에 사용될 수 있다. 또한, 단발 이온 시그날은 UV-MALDI 질량 분석법으로 수득한 것보다 3 내지 5배 더 강한 인자이며, 적절한 시그날-대-노이즈 비율을 수득하기 위해서는 보다 적은 단발이 요구될 수 있다.
이러한 개선에 따라, 레이저 플루언스(샘플에 대한 단위 면적당 에너지)의 선택은 덜 중요할 수 있다. 반면, UV-MALDI 질량 분석법에서 실질적인 이온 단편화 위험성을 피하기 위해, 표적 분자를 검출하는 기술된 IR-MALDI 질량 분석법에 있어서 플루언스 값을 H0내지 1.5H0으로 제한하여야 하며, 글리세롤을 매트릭스로 사용하는 경우에는 3H0또는 5H0의 플루언스 값을 사용할 수 있다.
또한, IR-MALDI 질량 분석법에서 매트릭스로서 사용되는 글리세롤은 표적 분자의 존재 또는 부재에 대해 분석되는 샘플에 있어서 염, 완충액, 세정제 등의 오염물에 특히 내성이 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 생물학적 샘플로부터 수득한 폴리펩타이드가 이러한 오염물을 함유할 수 있기 때문에, 글리세롤을 매트릭스로서 사용하는 IR-MALDI 질량 분석법으로 표적 분자, 특히 거대한 폴리펩타이드를 검출하는데 매우 유리하다. 이러한 오염물(예: 염)은 보다 전통적인 염 고체상 매트릭스를 사용하는 폴리펩타이드의 UV-MALDI 측정을 간섭할 수 있다. 따라서, 생물학적 샘플로부터 표적 분자의 정제는 샘플을 제조하는데 있어서 UV-MALDI에 의한 분석보다는 글리세롤 매트릭스를 사용하는 IR-MALDI에 의한 분석에 적게 요구된다.
IR-MALDI 질량 분석법에 사용되는 글리세롤 매트릭스의 경우, 분석물-대-매트릭스의 몰비는 결정질 매트릭스의 경우보다 훨씬 덜 중요하다. 약 5×10-3내지 1×10-6범위의 분석물-대-매트릭스가 실질적인 이온 시그날의 분해 없이 표적 분자의 IR-MALDI 질량 분석법 검출에서 사용될 수 있다. 이는 표적 분자의 농도가 공지되지 않은 경우에 생물학적 샘플의 분석에 특히 유리하다.
본원에 기술된 바와 같은 개선된 조건 및 기타 조건 및 방법에 따라, 생물학적 샘플로부터 보다 거대한 표적 분자, 예를 들어 500kDa 이상의 단백질 및 700kDa 이상의 핵산에 대한 명백한 이온 시그날을 IR-MALDI 질량 분석법을 사용하여 수득할 수 있다. 따라서, 혼합물, 오염물 및 불순물의 존재로 인해 분석이 어려운 것으로 알려진 생물학적 샘플로부터 수득한 표적 분자, 특히 거대한 표적 분자의 검출이 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 가능해졌으며, 또한 대규모 진단 및 스크리닝 공정에 요구되는 자동화에 적용할 수 있게 되었다.
생물학적 거대분자의 IR-MALDI 분석을 위한 조성물
IR-MALDI에 적합한 조성물이 본원에서 제공된다. 본원에서 "IR-MALDI 조성물"으로 언급되는 이러한 조성물은 IR-MALDI에 의해 분석되는 생물학적 거대분자, 및 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 액체 혼합물이다. IR-MALDI에 의한 분석에 적합한 생물학적 거대분자는 예를 들어 핵산, 폴리펩타이드 또는 탄수화물이거나, 거대분자 복합체, 예를 들어 핵단백질 복합체, 단백질-단백질 복합체, 다당류, 올리고당류, 예를 들어 덱스트란 및 덱스트린, 지질, 지다당류 및 기타 거대분자일 수 있다.
IR-MALDI 조성물은 생물학적 거대분자, 예를 들어 핵산과 지질 매트릭스를 일반적으로 약 10-4내지 10-9의 비율로 함유한다. IR-MALDI 조성물은 약 10pmol 이하의 분석되는 생물학적 거대분자, 예를 들어 약 100attomol 내지 약 1pmol의 생물학적 거대분자를 함유할 수 있다. IR-MALDI 조성물은 IR-MALDI에 의한 생물학적 거대분자의 검출을 촉진시키는 첨가제를 함유할 수 있다. 예를 들면, 첨가제는 액체 매트릭스내의 생물학적 거대분자의 혼화성을 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 조성물은 IR-MALDI에 의해 분석되는 생물학적 거대분자로서 핵산과 액체 매트릭스로서 글리세롤을 함유할 수 있다. 액체 매트릭스는 경우에 따라 핵산과 혼합하기 전에 양이온 교환 물질로 처리하여 포스페이트 주쇄와의 알칼리 염 형성을 감소시킬 수 있다.
IR-MALDI 조성물은 기질, 예를 들어 실리콘 웨이퍼, 비이드 또는 당업자에게 공지된 기타 지지체와 같은 고체 지지체에 침착될 수 있으며, 이에 의해 IR-MALDI 조성물이 그 위에 침착되어 있는 고체 지지체를 제공한다.
특히, 고체 지지체는 실리콘 웨이퍼일 수 있고 복수의 IR-MALDI 조성물은 지정된 배열로 웨이퍼상에 침착될 수 있다. 경우에 따라, IR-MALDI 조성물은 분석되는 2개 이상의 상이한 생물학적 거대분자를 함유할 수 있는데, 단 생물학적 거대분자는 예를 들어 질량 변형에 기인하여 상이하게 동정될 수 있다.
액체 매트릭스
상기 정의된 바와 같이, 액체 매트릭스는 당해 거대분자와 적합성이고 IR을 흡수하며 유리(결정질 구조가 아닌)를 형성할 수 있는 물질을 의미한다. 액체 매트릭스는 탈착 및 이온화의 수행에 사용되는 레이저 파장에서 흡수가 충분하며, 실온(1기압)에서 액체(고체 또는 기체가 아님)이다.
또한, IR-MALDI을 수행하는 본원의 목적상, 단백질 및 핵산의 진단 및 검출 방법을 위한 양태에 있어서 고려되는 매트릭스는 결정질 구조를 형성하는 물질이 포함될 수 있다. 이러한 물질에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 물, 아이스 및 석신산, 및 피콜산 및 기타 산이 포함된다. 이들 유형의 물질에는 냉각, 건조 및/또는 감압하에 정렬된 구조를 형성하는 것들이 포함된다. 이러한 유형의 매트릭스는 IR-MALDI를 사용하는 단백질의 검출에 사용될 것이다. 석신산이 IR-MALDI를 위해 선택된 기질(또는 지지체)에 분산되는 경우, 바람직하게는, 핵산은 분산전에 첨가되어야 한다. 기질 위에서 건조되는 기타 매트릭스의 경우, 핵산은 건조된 매트릭스 물질에 첨가될 수 있다.
흡수 목적을 위해, 액체 매트릭스는 적외선을 강력히 흡수하는 하나 이상의 발색단 또는 관능 그룹을 함유할 수 있다. 적절한 관능 그룹의 예에는 니트로, 설포닐, 설폰산, 설폰아미드, 니트릴 또는 시아나이드, 카보닐, 알데하이드, 카복실산, 아미드, 에스테르, 무수물, 케톤, 아민, 하이드록실, 방향족 환, 디엔 및 기타 공액된 시스템이 포함된다.
바람직한 액체 매트릭스에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 치환되거나 비치환된 (1) 알콜, 바람직하게는 비-휘발성 액체(또는 저휘발성 액체)(예: 글리세롤, 당, 다당류, 1,2-프로판디올 또는 1,3-프로판디올, 1,2-부탄디올, 1,3-부탄디올, 1,4-부탄디올 및 트리에탄올아민 등의 글리콜, 슈크로즈, 만노즈 및 기타 폴리올); (2) 카복실산(예: 포름산, 락트산, 아세트산, 프로피온산, 부탄산, 펜탄산 및 헥산산) 및 이의 에스테르; (3) 분지되거나 분지되지 않은 1급 또는 2급 아미드(예: 아세트아미드, 프로판아미드, 부탄아미드, 펜탄아미드 및 헥산아미드); (4) 1급 또는 2급 아민(예: 프로필아민, 부틸아민, 펜틸아민, 헥실아민, 헵틸아민, 디에틸아민 및 디프로필아민) 및 (5) 니트릴, 하이드라진 및 하이드라지드가 포함된다.
특히 바람직한 화합물은 8개 이하의 탄소 원자를 함유한다. 예를 들면, 특히 바람직한 카복실산 및 아미드는 6개 이하의 탄소 원자를 함유하며, 바람직한 아민은 약 3개 내지 약 7개의 탄소 원자 및 바람직한 니트릴은 8개 이하의 탄소를 함유한다. 어느 정도 불포화된 화합물은 보다 많은 탄소 원자를 함유할 수 있는데, 이는 불포화가 화합물에 액체 특성을 부여하기 때문이다. 액체 매트릭스로서 사용된 특정한 화합물이 관능 그룹을 함유할 수 있지만, 매트릭스는 바람직하게는 분석되는 핵산을 손상시키거나 단편화시키지 않을 정도로 반응성이어야 한다.
적절한 액체 매트릭스는 핵산 상용성 용매와 혼화성이어야 한다. 바람직하게는, 액체 매트릭스는 또한 적절한 점도, 예를 들어 실온에서 글리세롤의 점도인 약 1.5s/m2이하, 바람직하게는 약 1s/m2내지 약 2s/m2의 범위를 가져, 단독으로 또는 핵산 상용성 용매와 혼합하여 마이크로리터 또는 나노리터 용적의 매트릭스의 분산을 촉진시킬 수 있다.
본원에서 사용하기 위해, 액체 매트릭스는 또한 진공하의 분석기, 전형적으로 약 10-10mbar 범위의 압력하에 적절한 잔류 시간을 지녀 분석을 완료시켜야 한다. 적절한 잔류 시간을 갖는 액체는 매트릭스의 증발압을 엄격하게 작용시키고 차례로 샘플 온도에 강력히 의존성인 "진공 안정성"이다. 바람직한 매트릭스는, 역압이 10-5mbar 이하인 질량 분석기에서 약 50% 이하의 샘플이 모든 샘플의 분석에 요구되는 시간, 예를 들어 약 10분 내지 약 2시간내에 도입되도록 실온에서 낮은 증발압을 갖는다. 예를 들어, 단일 샘플의 경우, 분석은 수분내에 수행될 수 있는 반면, 다중 샘플의 경우 분석은 완결을 위해 수시간이 요구될 수 있다.
예를 들면, 글리세롤은 실온에서 약 10 내지 15분 동안 진공하에 매트릭스로서 사용될 수 있다. 글리세롤이 단일 진공하에 다중 샘플의 분석에 사용되는 경우, 진공은 냉각되어, 분석의 완결에 요구되는 시간 동안 약 -50℃ 내지 약 -100℃(약 173°K 내지 약 223°K) 범위의 온도에서 샘플을 유지시켜야 한다. 약 -200℃와 같이 낮은 온도를 포함하여 보다 낮은 온도를 또한 사용할 수 있다. 대조적으로, 트리에탄올아민은 글리세롤보다 훨씬 낮은 증발압을 가지며, 실온에서도 약 1시간 이상 동안 진공하에 유지될 수 있다.
상이한 액체 매트릭스 및 이러한 매트릭스에 대한 첨가제의 혼합물은 상술된 특성중 하나 이상을 제공하는데 요구될 수 있다. 예를 들면, 적절한 액체 매트릭스는 IR 흡수 발색단을 함유하는 소량의 조성물, 및 예를 들어 핵산이 가용성인 대량의 IR 비가시성(비흡수성) 물질을 함유할 수 있다. 또한, 소량의 화합물 또는 탈착 및 이온화에 사용된 레이저 파장에서 흡광 계수(E)가 높은 화합물, 예를 들어 디니트로벤젠 또는 폴리엔으로 "처리"된 매트릭스를 사용하는 것이 유용할 수도 있다. 액체 매트릭스를 산성화시키는 첨가제를 첨가하여 이본쇄 핵산을 해리시키거나, tRNA 또는 기타 RNA와 같은 2차 구조의 핵산을 변성시킬 수 있다. 추가의 첨가제는 매트릭스와 핵산의 포스페이트 주쇄 사이에 염 형성을 최소화시키는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 첨가제는 매트릭스로부터 알칼리 이온을 제거하는 암모늄 염 또는 암모늄 적재된 이온 교환 비이드를 함유할 수 있다. 또는, 액체 매트릭스는 핵산 조성물과의 혼합전에 증류시켜 매트릭스와 핵산의 포스페이트 주쇄 사이의 염 형성을 최소화시킬 수 있다.
또한, 액체 매트릭스는 적절한 용적의 물 또는 기타 액체와 혼합하여 샘플의 점도 및 증발 속도를 조절할 수 있다. 모든 물이 질량 분석중에 증발되기 때문에, 용이하게 조작되는 용적(예: 1㎕)이 샘플의 제조에 유용할 수 있지만, 극소량의 액체 매트릭스를 전달 및 생성시킬 것이다. 그 결과, 최종 액체 매트릭스 소적으로 약 10-16내지 약 10-12mol(약 100attomol 내지 약 1pmol)의 핵산을 수득하기 위해 소량의 핵산 샘플만이 요구된다.
본원에 기술된 바와 같이, 글리세롤을 매트릭스로 사용하는 경우, 최종 분석물-대-매트릭스 몰비(농도)는, 약 104달톤 내지 약 106달톤 또는 그 이상의 범위일 수 있는 핵산의 질량 및 이용가능한 핵산의 총량에 따라 약 10-4내지 약 10-9의 범위이어야 한다. 예를 들면, 본원에 기술된 감수성 시험을 위해, 사용된 핵산의 비교적 높은 농도는 표준 UV 분광법에 의해 측정된다. 실제적으로 말하자면, 예를 들어 PCR 또는 전사 반응으로부터 생성된 핵산의 적절한 양은 일반적으로 공지되어 있다. 넓은 범위의 특정은 분석된 핵산의 실제량이 매우 중요한 것은 아니라는 것을 나타낸다. 전형적으로, 핵산의 양이 많을수록, 스펙트럼이 보다 우수하다. 핵산 샘플이 희석을 필요로 하는 경우가 그 예일 것이다.
기타 액체 매트릭스에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 트리에탄올아민, 락트산, 3-니트로벤질알콜, 디에탄올아민, DMSO, 니트로페닐옥틸에테르(3-NPOE), 2,2'-디티오디에탄올, 테트라에틸렌글리콜, 디티오트레이톨/에리트리톨(DTT/DTE), 2,3-디하이드록시-프로필-벤질 에테르, α-토코페롤 및 티오글리세롤이 포함된다.
고체 지지체 또는 기질에 대한 생물학적 거대분자의 고정화
IR-MALDI 질량 분석법을 위해, 목적하는 표적 생물학적 거대분자 또는 기타 생물학적 거대분자를 기질, 특히 고체 지지체에 고정화시켜 생물학적 거대분자의 조작을 용이하게 할 수 있다. 고체 지지체는 본 기술분야에 공지되어 있으며, 핵산, 단백질, 탄수화물 등을 결합시키기 위한 고체 지지체로서 사용되는 모든 물질이 포함된다(예: 국제 공보 제WO 98/20019).
기질은 IR-MALDI 질량 분석법의 조건이 손상되지 않도록 선택되며, 생물학적 거대분자의 고정화를 위해 작용하거나 경우에 따라 제2 고체 지지체에 결합될 수 있다. 예를 들어 비이드와 같은 기질이 제2 고체 지지체에 접합되는 경우, 생물학적 거대분자는 제2 지지체와 접합되기 전, 접합하는 동안 및 접한된 후에 관능화된 비이드에 고정화될 수 있다.
생물학적 거대분자는 고체 지지체에 직접 접합되거나, 지지체, 또는 지지체에 결합된 링커, 또는 생물학적 거대분자 또는 이둘 모두에 존재하는 관능 그룹을 통해 간접적으로 고정화될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 지지체와 폴리펩타이드 사이의 소수성, 친수성 또는 이온 상호작용을 통해 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 이러한 방법이 IR-MALDI 질량 분석법 전에 생물학적 거대분자의 조절과 같은 특정한 조작에 유용할 수 있지만, 이와 같은 직접적인 상호작용은 생물학적 거대분자의 배향이 공지되어 있지 않고 상호작용하는 아단위의 위치, 예를 들어 폴리펩타이드내의 소수성 아미노산에 기초하여 랜덤일 수 있다는 점에서 제한된다. 따라서, 폴리펩타이드 또는 기타 생물학적 거대분자는 일반적으로 고체 지지체 또는 생물학적 거대분자 또는 이둘 모두에 관능 그룹을 통한 접합에 의해 특정한 배향으로 고정화된다.
생물학적 거대분자는 생물학적 거대분자의 말단, 예를 들어 핵산의 5' 또는 3', 또는 폴리펩타이드의 카복실 말단 또는 아미노 말단, 또는 생물학적 거대분자내의 반응성 그룹, 예를 들어 뉴클레오타이드의 반응성 그룹 또는 핵산의 포스포디에스테르 주쇄, 또는 아미노산의 반응성 측쇄 또는 폴리펩타이드의 펩타이드 주쇄에 적절한 관능 그룹을 부가함으로써 변형시킬 수 있다. 핵산내의 천연 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드내의 천연 아미노산은 또한 폴리펩타이드를 고체 지지체에 접합시키기에 적합한 관능 그룹을 함유할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드에 존재하는 시스테인 잔기를 사용하여, 설프하이드릴 그룹을 함유하는 기질, 예를 들어 시스테인 잔기가 결합된 고체 지지체에 폴리펩타이드를 디설파이드 결합을 통해 고정화시킬 수 있다. 2개의 아미노산 사이에 형성될 수 있는 다른 결합에는, 예를 들어 폴리펩타이드내로 도입될 수 있는 비-천연 아미노산인 2개의 란티오닌 잔기 사이의 모노설파이드 결합; 산성 아미노산과 염기성 아미노산의 측쇄, 예를 들어 Glu의 γ-카복실 그룹(또는 Asp의 β-카복실 그룹)과 Lys의 ε-아미노 그룹 사이의 전환아미드화 반응; 예를 들어 Ser의 하이드록시 그룹과 Glu의 γ-카복실 그룹(또는 Asp의 β-카복실 그룹) 사이의 가교결합이 포함된다. 따라서, 고체 지지체는 목적하는 아미노산 잔기, 예를 들어 Glu 잔기를 함유하도록 변형시킬 수 있고, Ser 잔기를 갖는 폴리펩타이드, 특히 카복실 말단 또는 아미노 말단에 Ser 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 락톤 결합의 형성을 통해 고체 지지체에 접합시킬 수 있다. 그러나, 폴리펩타이드내에 Ser과의 락톤-유사 결합을 형성하여야 하는 경우, 특정한 아미노산, 예를 들어 Glu를 함유하도록 지지체를 변형시킬 필요는 없으나, 대신에 접근가능한 카복실 그룹을 함유하도록 변형시켜 Glu의 γ-카복실 그룹에 상응하는 작용을 제공할 수 있다.
생물학적 거대분자는 예를 들어 생물학적 거대분자내의 적절한 위치, 일반적으로 생물학적 거대분자의 말단에 화학적 또는 물리적 잔기를 도입함으로써 고체 지지체에 대한 고정화를 촉진시키기 위해 변형시킬 수 있다. 그러나, 당업자는 이러한 변형, 예를 들어 비오틴 잔기의 도입이 생물학적 거대분자와 특이적으로 상호작용하는 특정 시약의 능력에 영향을 미칠 수 있음을 인지할 것이고, 따라서 목적하는 생물학적 거대분자를 변형시키기 위한 최상의 방법을 선택하는데 있어서 이러한 인자를 고려할 것이다.
본원에서 제공되는 방법의 한가지 양태에 있어서, 목적하는 폴리펩타이드는 고체 지지체에 공유결합에 의해 접합시킬 수 있고, 고정화된 폴리펩타이드를 사용하여 고정화된 폴리펩타이드에 결합하는 표적 폴리펩타이드를 포획할 수 있다. 이어서, 표적 폴리펩타이드는 IR-MALDI 질량 분석법을 위한 이온화 또는 휘발에 의해 고정화된 폴리펩타이드로부터 방출되는 반면, 공유 결합에 의해 접합된 폴리펩타이드는 지지체에 결합한 상태로 잔류한다.
따라서, 본원에 기술된 방법은 IR-MALDI를 이용하여 목적하는 폴리펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 폴리펩타이드의 동일성을 측정할 수 있다. 예를 들면, 목적하는 고정화된 폴리펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 하나 이상의 생물학적 샘플로부터 수득한 표적 폴리펩타이드의 동일성을 측정하거나, 목적하는 고정화된 폴리펩타이드 항원에 결합하는 항체 또는 목적하는 고정화된 폴리펩타이드 리간드에 결합하는 수용체 등의 결합 단백질의 동일성을 측정할 수 있다. 이러한 방법은 고정화된 폴리펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 표적 폴리펩타이드의 동일성을 측정하기 위해 예를 들어 변형된 항체, 항원, 수용체, 호르몬 또는 기타 폴리펩타이드의 배합 라이브러리를 스크리닝하는데 유용할 수 있다.
고체 지지체는 이것이 제공할 수 있는 잇점에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체는 비교적 거대한 표면적을 제공하여, 비교적 다수의 생물학적 거대분자를 고정화시킨다. 비이드와 같은 고체 지지체는 생물학적 거대분자, 관능 그룹 또는 기타 분자가 결합될 수 있는 표면을 포함하여 임의의 3차원 구조를 가질 수 있다.
기질은 또한 생물학적 거대분자의 고정화를 촉진시키기 위해 변형시킬 수 있다. 티올-반응성 관능기는 고체 지지체에 폴리펩타이드를 고정화시키는데 특히 유용하다(국제 공보 제WO 98/20166호). 티올-반응성 관능기는 친핵성 티올 잔기와 신속히 반응하여 공유 결합, 예를 들어 디설파이드 결합 또는 티오에스테르 결합을 생성할 수 있다. 다양한 티올-반응성 관능기는 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 요오도아세틸과 같은 할로아세틸; 디아조케톤; 에폭시 케톤; α- 및 β-불포화된 카보닐(예: α-에논 및 β-에논); 및 말레이미드와 같은 기타 반응성 미하엘 수용체; 산 할라이드; 벤질 할라이드 등이 포함된다. 디설파이드의 유리 티올 그룹은 예를 들어 디설파이드 교환을 포함하는 디설파이드 결합 형성에 의해 제2 유리 티올 그룹과 반응할 수 있다. 티올 그룹 또는 기타 관능 그룹의 반응은 적절한 보호 그룹으로 차단시켜 일시적으로 방지할 수 있다[참조: Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis 2nd ed. (John Wiley ＆ Sons 1991)].
3-머캅토프로필트리에톡시실란과 같은 티올-반응성 관능기는 규소 표면으로 티올 그룹을 작용시키기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 아미노 작용화된 규소 표면을 헤테로이작용성 시약, 예를 들어 N-석신이미딜(4-요오드아세틸) 아미노벤조에이트(SIAB; Pierce; Rockford IL)과 반응시킬 수 있다. 경우에 따라, 티올 그룹은 광절단가능한 보호 그룹으로 차단한 다음 예를 들어 사진평판에 의해 선택적으로 절단하여 목적하는 폴리펩타이드의 고정화를 위해 활성화된 표면 부분을 제공할 수 있다. 광절단가능한 보호 그룹은 본 기술분야에 공지되어 있고[참조: 국제 공보 제WO 92/10092호; McCray et al., Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18: 239-270(1989)], 예를 들어 사진평판 마스크를 사용하여 표면의 선택된 면적을 조사함으로써 선택적으로 탈차단할 수 있다.
고체 지지체(기질)
고체 지지체는 합성 반응 및 분석을 수행하기 위한 매트릭스로서 본 기술분야에 공지되어 있다. 이는 규소, 유리, 규소 물질, 금속, 복합물, 중합체성 물질(예: 플라스틱), 중합체-그래프트된 물질(예: 금속-그래프트된 중합체), 또는 본원에 기술된 기타 물질로부터 제조할 수 있다. 이 물질은 필요한 경우 예를 들어 화학적으로 작용화시켜 목적하는 분자 또는 기타 입자(예: 세포 또는 세포막) 또는 생물학적 물질과 같은 바이러스 엔벨로프의 결합을 증진시키거나 허용할 수 있다. 지지체의 표면은 분자 또는 입자(예: 세포)를 포획하는 결합에 적합하게 되도록 표면에 적합한 중합체를 조사 그래프팅하고 이를 유도체화시키는 방법 등으로 변형시킬 수 있다. 지지체는 또한 여기에 결합된 비이드를 포함할 수 있다(공동 계류중인 미국 특허원 제08/746,036호, 공동 계류중인 미국 특허원 제08/933,792호 및 미국 특허원에 대한 우선권을 주장하는 국제 특허원 제PCT/US97/20194호). 또한, 포획된 물질의 수지상 트리 또는 이러한 추가 성분의 배합물을 포함할 수 있다. 고체 지지체는 각각이 액체 용량을 함유하거나 보유할 수 있는 하나 이상의 표적 부위를 가질 수 있다.
예를 들면, 고체 지지체는 유리 섬유 필터, 유리 표면, 규소 또는 이산화규소 표면, 복합 표면 등의 편평한 표면, 또는 강, 금, 은, 알루미늄 또는 구리 표면 등의 금속 표면, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드 또는 폴리비닐리덴디플루오라이드 등의 플라스틱 물질일 수 있고, 또한 다중웰 플레이트 또는 막의 형태로 존재할 수 있으며; 실리카 겔, 조절된 세공 유리, 마그네틱 또는 셀룰로즈 비이드 등의 비이드(또는 기타 기하) 또는 입자의 형태로 존재할 수 있고, 웨이퍼(예: 규소 웨이퍼) 등의 편평한 표면에 존재할 수 있으며; 또는 배합 합성 또는 분석에 적합한 핀(예: 국제 PCT 특허원 제WO98/20019호)을 포함하는 핀, 콤브, 마이크로칩의 배열로 존재할 수 있다. 당업자에게는 기술된 시스템 또는 방법에 사용하기 위한 특정한 고체 지지체를 선택함에 있어서 지지체의 크기와 형상 및 노출 조건에 대한 지지체의 화학적 및 물리적 안정성을 포함하는 각종 인자가 고려된다는 것이 자명할 것이다.
또한, 기질 또는 지지체로서 섬유 광 케이블 또는 플레이트의 사용이 고려된다(참조: 섭생 또는 잔류하는 얇은 투명한 플레이트에 인접할 수 있는, 전자기 조사가 섬유 광 케이블을 통해 전달되는 양태를 기술하는 미국 특허 제5,826,214호).
고체 지지체는 액체 용적을 함유할 수 있는 하나 이상의 표적 부위를 함유한다. 표적 부위는, 예를 들어 웰, 피트, 채널 또는 고체 지지체의 표면상에 가장자리가 존재하거나 존재하지 않는 기타 함요부일 수 있고, 고체 지지체의 표면에 위치할 수 있는 핀, 비이드 또는 기타 물질일 수 있거나, 고체 지지체의 표면에 위치되는 물리적 배리어, 예를 들어 실린더, 원추체 등일 수 있다.
또한, 표적 부위는 예를 들어 고체 지지체에 결합되는 저장기 또는 반응 챔버일 수 있다[참조: Walters et al., Anal. Chem. 70: 5172-5176(1998)]. 또한, 표적 부위는 예를 들어 사진평판 방법[참조: Woolley et al. (Anal. Chem. 68: 4081-4086(1996)]을 사용하여 규소 웨이퍼 표면에 에칭할 수 있다. 사진평판은 웰 또는 타워를 포함하는 매우 작은 표적 부위를 구성하며, 예를 들어 습윤 화학적-에칭과 배합 사용하여 마이크로칩상에 "피코리터 바이알"을 구성한다[참조: Clark et al., CHEMTECH 28: 20-25(1998)].
지지체는 또한 레이저 광 등의 목적하는 파장의 전자기 조사에 대해 투명한 매우 얇은 기재를 갖는 웰을 함유하는 유리 또는 규소 표면일 수 있고, 이에 의해 용적과 같은 파라미터의 측정 또는 형광 측정을 위한 여기 파장의 측정을 가능케 한다.
표적 부위는 또한 친수성, 소수성, 산성 또는 염기성 그룹의 존재, 염 브릿지를 형성할 수 있는 그룹 등의 물리-화학적 파라미터, 또는 액체를 주로 z 방향으로 성장하게 하는 특정한 표면 화학에 의해 정의할 수 있다. 예를 들면, 표적 부위에 위치하는 액체가 물 또는 수성 조성물인 경우, 표적 부위는 고체 지지체 표면상의 소수성 부분에 의해 둘러싸인 친수성 부분에 의해, 또는 보다 적은 소수성 행 및 보다 많은 소수성 행을 갖는 일련의 행에 의해 정의되어 수성 혼합물을 보다 적은 소수성 행으로 구속한다. 이러한 표적 부위와 관련하여, 수성 조성물은 예를 들어 친수성 부분으로 분산되고, 인접한 주변의 소수성 부분에 기인하여 표적 부위로부터의 확산이 구속된다. 바꾸어 말하면, 액체가 비극성 액체인 경우, 이는 소수성 영역으로 분산되고, 인접한 영역 또는 덜 소수성인 영역에 기인하여 당해 영역 또는 액체가 적용되는 영역에서 구속된다.
고체 지지체는 단일 표적 부위이거나 다수의 표적 부위, 예를 들어 2개의 부위, 10개의 부위, 16개의 부위, 100개의 부위, 144개의 부위, 384개의 부위, 1000개의 부위 또는 그 이상일 수 있으며, 이들중 일부 또는 모두는 동일하거나 상이할 수 있다. 고체 지지체가 하나 이상의 표적 부위, 따라서 예를 들어 하나 이상의 반응 혼합물을 함유하는 경우, 각 표적 부위를 정의하는 특징은 반응 혼합물을 구속할 뿐만 아니라, 상이한 반응 혼합물 또는 지지체상의 다른 액체의 혼합을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 고체 지지체가 하나 이상의 표적 부위를 함유하는 경우, 표적 부위는 모든 패턴, 예를 들어 선형, 나선형, 동심원, 열, 또는 열과 컬럼의 배열로 배열될 수 있다. 추가로, 지지체상의 다수의 표적 부위중 각 표적 부위의 위치가 정의될 수 있다. 고체 지지체상에 이와 같은 지정가능한 표적 부위의 이용성은 다중 반응을 병행하여 수행할 수 있게 하고, 예를 들어 다중 반응을 수행하는데 편리하고, 모든 반응이 동일한 조건하에 수행되도록 대조군 반응을 시험 반응에 포함시키는데 편리하며, 상이한 조건하에 유사한 반응을 수행하는데 편리하고, 또는 상이한 반응을 수행하는데 편리하다.
따라서, 핵산의 탈착 및 이온화를 위해 핵산/액체 매트릭스가 침착 및 보유될 수 있는 모든 기질이 본원에서 제공된 방법에 사용될 수 있다. 바람직한 기질은, 비이드로써 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 실리카 겔, 조절된 세공 유리, 자기, 가교-결합된 덱스트란(예: 상표명 Sephadex(Pharmacia)하에 시판), 및 수소 결합된 다당류-형 아가로즈 겔(에피클로르하이드린)인 아가로즈 겔(예: 상표명 Sepharose(Pharmacia)하에 시판) 또는 셀룰로즈; 모세관; 편평한 지지체, 예를 들어 여과지, 플레이트 또는 유리로 제조된 막, 금속 표면(예: 강, 금, 은, 알루미늄, 구리 또는 규소), 또는 플라스틱(예: 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드); 핀, 예를 들어 여과 플레이트의 존재 또는 부재하에 웨이퍼와 같은 편평한 표면중의 비이드를 조합 합성하거나 분석하는데 적합한 핀의 배열이 포함된다.
바람직하게는, 상기 기술된 바와 같이 소수성 또는 친수성 상호작용의 측면에서 침착된 물질을 보유하는 칩과 같은 선택된 기질 및 포맷은 소형화되기 쉬우며, 여기서 표적 부위는 고체 지지체의 표면상의 소수성 부분에 의해 둘러싸여 있는 친수성 부분에 의해 정의될 수 있다.
바람직하게는, 핵산 샘플은, 다중 샘플이 분석기 용적으로의 이동을 사용하고 비교적 단시간의 분석만을 요구하는 단일 샘플 지지체 플레이트상에서 제조 및 분석될 수 있도록, 수동 또는 자동화 장치를 사용하여 박층, 예를 들어 약 100㎛의 단층, 바람직하게는 약 0.1㎛ 내지 약 100㎛의 단층, 더욱 바람직하게는 1㎛ 내지 10㎛의 단층으로서 기질 위에 제조 및 침착된다. 본 방법에 사용하기 위한 적절히 자동화된 샘플 조작 시스템은 예를 들어 미국 특허 제5,705,813호; 제5,716,825호 및 제5,498,545호, 공동 계류중인 미국 특허원 제09/285,481호 뿐만 아니라 허여된 미국 특허원 제08/787,639호 및 공개된 국제 PCT 특허원 제WO 98/20166호에 기재되어 있다.
고정화 및 활성화
단백질, 핵산 및 기타 생체분자를 고체 또는 액체 지지체에 고정화시키는 다수의 방법이 개발되어 있다[참조: Mosbach (1976) Methods in Enzymology 44; Weetall (1975) Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptides; and Kennedy et al. (1983) Solid Phase Biochemistry, Analytical and Synthetic Aspects, Scouten, ed., pp. 253-291; Affinity Techniques. Enzyme Purification: Part B. Methods in Enzymology, Vol. 34, ed. W. B. Jakoby, M. Wilchek, Acad. Press, N. Y. (1974); Immobilized Biochemicals and Affinity Chromatography, Advances in Experimental Medicine and Biology, vol. 42, ed. R. Dunlap, Plenum Press, N. Y. (1974)].
가장 통상적으로 사용되는 방법은 탈착 및 흡수이거나, 본 기술분야에 공지된, 유리 반응성 그룹(예: 아민 및 티올 그룹) 사이의 다수의 디설파이드 결합, 티오에테르 결합, 장애된 디설파이드 결합 및 공유 결합 등과 같이 직접 또는 링커를 통한 지지체로의 공유 결합이다[참조: PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog ＆ Handbook, 1992-1993(이는 상기 시약의 제조 및 용도를 기술하며, 이러한 시약에 대한 상업적 공급원을 제공한다); Wong(1993) Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press; DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Zuckermann et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 10646; Kurth et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 2661; Ellman et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 4708; Sucholeiki (1994) Tetrahedron Lttrs. 35: 7370; and SuSun Wang (1976) J. Org. Chem. 41: 3258; Padwa et al. (1971) J. Org. Chem. 41: 3550 and Vedejs et al. (1984) J. Org. Chem. 49: 575(이는 감광성 링커를 기술한다)].
고정화를 수행하기 위해, 단백질 또는 기타 생체분자의 조성물을 본원에 기술된 지지체 물질, 예를 들어 알루미나, 탄소, 이온-교환 수지, 셀룰로즈, 유리 또는 세라믹에 접촉시킨다. 탈착에 의해 생체분자를 결합시키는 지지체로서는 플루오로카본 중합체가 사용되었다[참조: 미국 특허 제3,843,443호; 공개된 국제 PCT 특허원 제WO/86 03840호].
고체 지지체에 단백질 및 핵산 분자 등의 생물학적 분자를 결합시키기 위한 다수의 방법이 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제5,451,683호]. 이러한 결합은 공유 결합, 이온 결합 및 기타 상호작용에 의해 수행할 수 있다. 결합은 특정한 EM 진동과 같은 특정한 조건에 대해 가역적이거나 불안정할 수 있다.
예를 들면, 미국 특허 제4,681,870호는 실리카 지지체내로 유리 아미노 또는 카복실 그룹을 도입하는 방법을 기술한다. 이들 그룹은 연속적으로 카보디이미드의 존재하에 다른 그룹, 예를 들어 단백질 또는 기타 항-리간드에 공유 결합시킬 수 있다. 또는, 실리카 지지체는 알칼리 조건하에 시아노겐 할라이드로 처리하여 활성화시킬 수 있다. 항-리간드는 활성화된 표면에 첨가시 표면에 공유 결합한다. 또다른 방법은 비오틴, 아비딘 및 신장제의 다중 층을 연속 적용하여 중합체 표면을 변형시키고[참조: 미국 특허 제4,282,287호]; 다른 방법은 광-감수성 비천연 아미노산 그룹을 폴리펩타이드 쇄에 도입하고 생성물을 저-에너지 자외선에 노출시킴으로써 폴리펩타이드 쇄를 고체 기질에 결합시키는 광활성화를 수반한다[참조: 미국 특허 제4,762,881호].
또한, 올리고뉴클레오타이드는 소랄렌 화합물 등의 광화학적 활성 시약, 및 광시약을 기질에 결합시키는 커플링제를 사용하여 결합시킨다[참조: 미국 특허 제4,542,102호 및 미국 특허 제4,562,157호]. 광시약의 광활성화는 핵산 분자를 기질에 결합시켜 표면-결합된 프로브를 제공한다.
화학적으로 활성화된 고체 지지체(예: 유리, 합성 중합체 및 가교-결합된 다당류)에 대한 단백질 또는 기타 생체분자 또는 유기 분자 또는 생물학적 입자의 공유 결합은 보다 빈번히 사용되는 고정화 기술이다. 분자 또는 생물학적 입자는 지지체에 직접 결합되거나 금속과 같은 링커를 통해 결합될 수 있다[참조: 미국 특허 제4,179,402호; 및 Smith et al. (1992) Methods: A Companion to Methods in Enz. 4: 73-78]. 이러한 방법의 예로는 아가로즈 등의 다당류 지지체의 시아노겐 브로마이드 활성화가 있다. 효소 고정화 및 친화성 크로마토그래피를 위한 퍼플루오로카본 중합체-기본된 지지체의 용도는 미국 특허 제4,885,250호에 기재되어 있다. 이 방법에 있어서, 생체분자는 먼저 미국 특허 제4,954,444호에 기재된 바와 같이 퍼플루오로옥틸프로필이소시아네이트 등의 퍼플루오로알킬화제와 반응시켜 변형시킨다. 이어서, 변형된 단백질을 플루오로카본 지지체상에 흡수시켜 고정화를 수행한다.
지지체의 활성화 및 용도는 공지되어 있고, 임의의 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다[참조: Hermanson et al. (1992) Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, Inc., San Diego]. 예를 들면, 아미노산의 커플링은 본 기술분야에 공지된 기술과 유사한 기술에 의해 달성할 수 있고, 예를 들면 문헌[참조: Stewart and Young, 1984, Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford]에서 제공된다.
분자는 예를 들어 IgG 결합 서열 등과 같이 분자상의 천연 금속 결합 부위를 사용하여 동역학적으로 불활성인 금속 이온 결합 Co(III)을 통해, 또는 금속 이온에 결합하는 유전적으로 변형된 단백질을 통해 지지체에 결합할 수 있다[참조: Smith et al. (1992) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4, 73(1992); III et al. (1993) Biophys J. 64: 919; Loetscher et al. (1992) J. Chromatography 595: 113-199; 미국 특허 제5,443,816호; Hale (1995) Analytical Biochem. 231: 46-49].
고체 지지체에 분자 및 생물학적 입자를 결합시키기 위한 기타 적합한 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제5,416,193호]. 이들 링커는 지지체에 화학적으로 결합하는 분자에 적합한 링커, 예를 들어 단백질 및 핵산을 포함하며, 이의 예로는 이로써 제한되지는 않지만, 유리 반응성 그룹(예: 아민 및 티올 그룹) 사이의 디설파이드 결합, 티오에테르 결합, 장애된 디설파이드 결합 및 공유 결합이 포함된다. 이들 결합은 하나 또는 둘 모두의 잔기상에 반응성 티올 그룹을 생성하기 위해 헤테로이작용성 시약을 사용한 다음, 반응성 말레이미도 그룹 또는 티올 그룹이 서로 결합할 수 있는 반응성 티올 그룹 또는 아민 그룹과 한쪽 잔기상의 티올 그룹을 반응시킴으로써 생성할 수 있다. 다른 링커에는 더욱 산성의 세포내 구획에서 절단될 수 있는 산절단가능한 링커(예: 비스말레이미데오톡시 프로판, 산 불안정성-트랜스페린 접합체 및 아디프산 디하이드라지드); 자외선 또는 가시광선에의 노출시 절단되는 가교 링커 및 사람 IgG1의 동일한 영역으로부터의 링커(예: 다양한 도메인, 예를 들어 CH1, CH2 및 CH3)가 포함된다[참조: Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30: 379-386]. 현재 바람직한 결합은 분자 또는 생물학적 입자를 지지체 표면에 흡수함으로써 수행된 직접 결합이다. 다른 바람직한 결합은 광에의 노출에 의해 활성화될 수 있는 광절단가능한 결합이다[참조: Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107, 이 링커는 본원에서 참조로서 도입된다]. 광절단가능한 링커는 절단 파장이 결합된 링커를 손상하지 않도록 선택된다. 광절단가능한 링커는 광에의 노출에 의해 절단되는 링커이다[참조: Hazum et al. (1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt, K (Ed), pp. 105-110, 이는 시스테인에 대한 광절단가능한 그룹으로서 니트로벤질 그룹의 용도는 기술한다; Yen et al. (1989) Makromol. Chem 190: 69-82, 이는 하이드록시프로필메타크릴아미드 공중합체, 글리신 공중합체, 형광 공중합체 및 메틸로다민 공중합체를 포함하여 수용성 광절단가능한 공중합체를 기술한다; Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107, 이는 약 UV 광에의 노출에 의해 광분해되는 가교-링커 및 시약을 기술한다; 및 Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol 42: 231-237, 이는 광절단가능한 결합을 생성하는 니트로벤질옥시카보닐 클로라이드 가교 결합 시약을 기술한다]. 선택된 링커는 특정한 용도에 따라 달라질 것이며, 경우에 따라 경험적으로 선택될 수도 있다.
링커
생물학적 거대분자는 기질에 직접 고정화되거나, 결합 잔기 또는 잔기들을 통해 고정화될 수 있다. 고정화는 공유 결합, 이온 결합, 물리적 결합 및 공지된 모든 다른 결합에 의해 수행할 수 있다. 결합은 가역적 및/또는 절단가능할 수 있다. 직접 또는 스페이서를 통해 기질에 핵산, 폴리펩타이드, 탄수화물 또는 기타 생물학적 거대분자를 고정화하는데 적합한 것으로 본 기술분야에 공지된 모든 링커를 사용할 수 있다[참조: 국제 공보 제WO 98/20019호]. 그 중에서, 바람직한 링커는 IR에의 노출시 절단 또는 방출되는 링커이다.
생물학적 거대분자는 링커를 통해 지지체에 직접 고정화되거나, 다양한 스페이서를 통해 고정화될 수 있다. 또한, 접합은 예를 들어 레이저에 의해 절단할 수 있는 광절단가능한 결합(예: 비오틴 상호작용에 대한 스트렙트아비딘 또는 아비딘)을 통해 직접 절단할 수 있거나, 광절단가능한 링커(미국 특허 제5,643,722호) 또는 산 불안정성 링커, 열 감수성 링커, 효소에 의해 절단가능한 링커 또는 기타 그와 같은 링커를 통해 간접적으로 절단할 수 있다. 따라서, 링커는 IR-MALDI 질량 분석법 공정 중과 같이 특정한 조건하에 절단되도록 절단가능한 링커를 제공할 수 있다. 이러한 링커는 예를 들어 광절단가능한 결합(예: 전하 이동 복합체) 또는 비교적 안정한 유기 라디칼 사이에 형성된 불안정한 결합일 수 있다.
생물학적 거대분자에 대한 링커(L)은 일반적으로 고체 지지체상의 제2 관능 그룹(L')와 일시적 결합을 형성할 수 있다. 또한, 생물학적 거대분자가 네트 네가티브 전하를 갖거나 이러한 전하를 갖도록 조절되는 경우, 결합은 L'(예: 4급 암모늄 그룹)로 형성할 수 있다. 이 경우, 고체 지지체의 표면은 네가티브 하전된 생물학적 거대분자에 반발하는 네가티브 전하를 포함하여, IR-MALDI 질량 분석법을 위한 생물학적 거대분자의 탈착을 촉진시킨다. 탈착은 IR 조사에 의해 생성된 열, 또는 L'가 발색단인 경우 발색단에 의한 IR 조사의 특이적 흡수로 발생할 수 있다.
결합(L-L')은 예를 들어 머캅토에탄올 또는 디티오에리트롤에 의해 화학적으로 절단할 수 있는 디설파이드 결합; 광절단할 수 있는 비오틴/스트렙트아비딘 결합; 산성 조건에의 노출에 의해 절단될 수 있는 트리틸 에테르 그룹의 헤테로이작용성 유도체[참조: Koster et al., Tetrahedron Lett. 31: 7095(1990)]; 하이드라지늄/아세테이트 완충제를 포함하는 대략 중성 조건하에 절단될 수 있는 류비닐-매개된 결합; 트립신과 같은 엔도펩티다제에 의해 절단될 수 있는 아르기닌-아르기닌 또는 리신-리신 결합; 피로포스파타제에 의해 절단될 수 있는 피로포스페이트 결합; 또는 리보뉴클레아제를 사용하거나 알칼리 조건에의 노출에 의해 절단될 수 있는 리보뉴클레오타이드 결합일 수 있다.
작용기(L 및 L')은 또한 전하 이동 복합체를 형성하여 일시적인 L-L' 결합을 형성할 수 있다. IR 레이저 에너지는 전하-이동 파장의 상응하는 에너지로 반환될 수 있고, 고체 지지체로부터의 특이적 흡수가 개시될 수 있다. L 및 L'의 몇개의 조합이 이러한 목적에 사용될 수 있고, 공여체 작용기가 고체 지지체에 존재하거나 검출하고자 하는 생물학적 거대분자에 커플링되거나, 역으로 IR 조사를 흡수하는 액체 매트릭스가 존재할 수 있음이 인지될 것이다.
본원에 기술된 바와 같은 공정에서 특히 유용한 선택적으로 절단가능한 링커에는 광절단가능한 링커, 산 절단가능한 링커, 산-불안정성 링커 및 열 감수성 링커가 포함된다. 산 절단가능한 링커에는 예를 들어 비스-말레이미도에톡시 프로판, 아디프산 디하이드라지드 링커[참조: Fattom et al., Infect. Immun. 60: 584-598(1992)], 및 충분한 트랜스페린 부분을 함유하여 세포내 트랜스페린 사이클링 경로로 도입되는 산 불안정성 트랜스페린 접합체[참조: Welhoner et al., J. Biol. Chem. 266: 4309-4314 (1991)]이 포함된다. 또한, 광절단가능한 링커에는 제WO 98/20019호에 기술된 링커가 포함된다.
예를 들어, 지지체에 화학적으로 결합하는 폴리펩타이드에 적합한 링커에는 아민 및 티올 그룹 등의 유리 반응성 그룹 사이의 디설파이드 결합, 티오에테르 결합, 장애된 디설파이드 결합 및 공유 결합이 포함된다.
결합을 발생시키는데 유용한 제제에는 예를 들어 디말레이미드, 디티오-비스-니트로벤조산(DTNB), N-설신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC) 6-하이드라지노 니코트이미드(HYNIC)가 포함된다. 고체 지지체에 폴리펩타이드를 접합시키는데 사용하기 위한, 가교결합제일 수 있는 적합한 링커에는 지지체 표면에 존재하는 관능 그룹과 반응하거나 폴리펩타이드와 반응할 수 있는 다양한 제제가 포함된다. 유용한 가교결합제에는 호모이작용성 또는 헤테로이관능 그룹을 함유하는 제제가 포함된다. 유용한 이작용성 가교결합제에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, N-석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB), 디말레이미드, 디티오-비스-니트로벤조산(DTNB), N-석신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC) 및 6-하이드라지노-니코티미드(HYNIC)가 포함된다.
또한, 가교결합제를 사용하여 생물학적 거대분자 및 고체 지지체 사이에 선택적으로 절단가능한 결합을 형성할 수 있다. 예를 들면, 3-아미노-(2-니트로페닐)프로피온산 등의 광불안정한 가교결합제[참조: Brown et al., Molec. Divers. 4-12(1995); Rothschild et al., Nucl. Acids Res. 24: 351-66 (1996); 미국 특허 제5,643,722호)은 고체 지지체로부터 폴리펩타이드를 절단하는 수단으로서 사용될 수 있다. 기타 가교결합제는 본 기술분야에 공지되어 있다[참조: Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press 1996)].
예를 들면, 하이드록시아세테이트(글리콜레이트), α-, β-, γ-, ..., ω-하이드록시알카노에이트, ω-하이드록시(폴리에틸렌 글리콜)COOH, 하이드록시벤조에이트, 하이드록시아릴알카노에이트 및 하이드록시알킬벤조에이트를 포함하는 하이드록시에스테르 링커가 생물학적 거대분자의 고정화에 유용할 수 있다. 또한, 광절단가능한 링커는 생물학적 거대분자의 고정화에 유용하며, 이러한 링커를 제조하는 방법은 국제 공보 제WO 98/20019호에 제공되어 있다. 또한, 이작용성 트리틸 링커를 고체 지지체, 예를 들어 아미노 수지를 경유하여 수지상의 아미노 그룹 또는 카복실 그룹을 통해 Wang 수지 등의 수지상에 4-니트로페닐 활성 에스테르에 결합시킬 수 있다. 이작용성 트리틸 방법을 사용하면, 고체 지지체는 포름산 또는 트리플루오로아세트산 등의 휘발성 산으로 처리하여 생물학적 거대분자를 제거시켜야 한다. 이 경우, 생물학적 거대분자는 고체 지지체 웰의 바닥 또는 고체 기지체의 편평한 표면상에 비이드가 아닌 팻치로서 침착될 수 있다. 매트릭스 조성물을 첨가한 후, 생물학적 거대분자는 IR-MALDI 질량 분석법 중에 탈착될 수 있다.
또한, 소수성 트리틸 링커는 액체 매트릭스를 산성화시켜 생물학적 거대분자로부터 아미노 결합된 트리틸 그룹을 절단시키는 첨가제를 함유하거나 산성인 휘발성 산 또는 적절한 매트릭스 조성물을 사용함으로써 산-불안정성 링커로서 개발할 수 있다. 산 불안정성은 또는 변화될 수 있다. 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 또는 트리메톡시트리틸은 적절한 p-치환된, 또는 더욱 산-불안정성 트리틸아민 유도체로 변화될 수 있다.
기타 링커에는 예를 들어 링크(Rink) 아미드 링커[참조: Rink, Tetrahedron Letters 28: 3787(1976)], 트리틸클로라이드 링커[참조: Leznoff, Ace. Chem. Res. 11: 327(1978)], 메리필드 링커[참조: Bodansky et al., Peptide Synthesis 2d ed., Academic Press; Nuw York, 1986]; 트리틸 링커(미국 특허 제5,410,068 및 제5,612,474) 및 아미노 트리틸 링커(미국 특허 제5,198,531호)가 포함된다.
기타 링커는 더욱 산성인 세포내 구획으로 절단될 수 있는 비스-말레이미드에톡시 프로판, 산 불안정성 트랜스페린 접합체 및 아디프산 디하이드라지드 링커 등의 산 절단가능한 링커; IR, 가시광선 또는 UV 광에 의해 절단되는 광절단가능한 링커; 리보자임 또는 기타 RNA 효소에 의해 절단될 수 있는 RNA 링커; 및 사람 IgG1의 동일한 영역으로부터의 각종 도메인(CH1, CH2 및 CH3을 포함함) 등의 링커[참조: Batra et al., Mol. Immunol. 30: 379-386(1993)]이 포함된다. 어떤 링커의 배합도 유용할 수 있으며, 예를 들어 실릴 결합 광절단가능한 결합 등의 IR-MALDI 질량 분석법 조건하에 절단할 수 있는 링커를, IR-MALDI 질량 분석법 조건하에 절단되지는 않지만 기타 조건하에 절단되는 아비딘 비오틴 결합 등의 링커와 조합할 수 있다.
목적하는 생물학적 거대분자는 비이드 등의 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 또한, 비이드 등의 제1 고체 지지체를 모든 적합한 수단에 의해 또한 제2 비이드 또는 기타 기질일 수 있는 제2 고체 지지체에 접합시킬 수 있다. 특히, 고체 지지체에 생물학적 거대분자의 접합과 관련하여 본원에 기술된 모든 접합 방법 및 수단은 또한 제1 및 제2 고체 지지체가 동일하거나 상이할 수 있는 제2 지지체에 제1 지지체를 접합시키기 위해 적용할 수 있다. 또한, 이작용성 링커의 사용은 지지체로부터 생물학적 거대분자 또는 제2 지지체로부터 제1 지지체의 직교 절단을 가능케 한다.
본원에 기술된 모든 결합 구성원 또는 본 기술분야에 공지된 기타 구성원은 본원에 제공된 예와 관련하여 상반될 수 있음을 인지하여야 한다. 따라서, 예를 들어 비오틴은 생물학적 거대분자 또는 고체 지지체에 도입될 수 있고, 역으로 아비딘 또는 기타 비오틴 결합 잔기는 지지체 또는 폴리펩타이드에 각각 도입될 수 있다. 본원에 사용되는 것으로 고려되는 기타 특이적 결합쌍은 호르몬과 이들의 수용체, 효소와 이들의 기질, 뉴클레오타이드 서열과 이의 상보성 서열, 특이적으로 상호작용하는 항체와 항원 및 당업자에게 공지된 기타 이러한 쌍이 예시될 수 있다.
표적 생물학적 거대분자, 특히 복수의 표적 생물학적 거대분자내의 각 표적 생물학적 거대분자는 생물학적 거대분자를 질량 변형, 조절 또는 기타 조작하기 전에 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 특히, 고체 지지체는, 복수의 표적 생물학적 거대분자 각각이 각각 특정한 위치에서 배열로 위치될 수 있도록 편평한 표면, 또는 웰 등의 구조를 갖는 표면일 수 있다. 일반적으로, 표적 생물학적 거대분자는 산 불안정성 링커, 화학적으로 절단가능한 링커 또는 광절단가능한 링커 등의 절단가능한 링커를 통해 고체 지지체에 고정화된다. 상술된 공정에서 표적 생물학적 거대분자를 반응시킨 후, 목적하지 않는 반응 생성물은 반응물로부터 세척할 수 있으며, 잔류하는 고정화된 표적 생물학적 거대분자는 예를 들어 화학적 절단 또는 광절단에 의해 방출시킬 수 있고, 적합한 경우 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 분석할 수 있다. 그러나, 화학적 또는 효소적 분해 또는 기타 반응을 수행하기 전에 질량 변형에 의한 생물학적 거대분자의 조작은 반응 속도 또는 반응 정도에 영향을 미칠 수 있음을 인지하여야 한다. 따라서, 당업자는 반응 정도에 대한 조절, 질량 변형 등의 영향이 상기 공정의 시작 전에 특성화되어야 함을 인지할 것이다.
몇몇 경우에 있어서, 이것은 생물학적 거대분자의 양쪽 말단, 예를 들어 하나의 말단에서 화학적으로 절단가능한 링커 및 다른 말단에서 광절단가능한 링커를 사용하여 폴리펩타이드의 아미노 말단 및 카복실 말단을 통해 특정한 표적 생물학적 거대분자를 지지체에 고정화시키는데 유용할 수 있다. 이러한 방법에 있어서, 예를 들어 웰내에 배열로 고정화될 수 있는 표적 생물학적 거대분자는 예를 들어 생물학적 거대분자내의 단량체 아단위를 결합시키는 하나 이상의 결합을 절단하는 하나 이상의 제제와 접촉시킬 수 있고, 내부 생물학적 거대분자 단편을 웰내의 제제 및 모든 시약과 함께 웰로부터 세정한 다음, 광절단가능한 링커를 통해 고정화된 표적 생물학적 거대분자의 반대편 말단으로부터, 화학적으로 절단가능한 링커 및 제2 생물학적 거대분자 단편을 통해 고체 지지체에 고정화된 표적 생물학적 거대분자의 특정한 생물학적 거대분자가 잔류한다. 이어서, 각 단편은 본원에 기술된 방법을 사용하여 추가로 조작하거나, 단편을 연속적으로 절단한 다음, 예를 들어 화학적으로 절단가능한 링커를 절단한 다음 광절단가능한 링커를 절단한 후에 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 분석할 수 있다. 이러한 방법은 생물학적 거대분자의 양쪽 말단을 분석하여 표적 생물학적 거대분자의 분석을 촉진시키는 편리한 수단을 제공한다.
양쪽 말단에서 표적 생물학적 거대분자의 고정화는 생물학적 거대분자의 양쪽 말단, 예를 들어 고체 지지체와 화학적으로 절단가능한 결합을 형성하도록 변형된 한쪽 말단 및 고체 지지체와 광절단가능한 결합을 형성하도록 변형된 다른쪽 말단을 변형시킴으로써 수행할 수 있다. 또는, 생물학적 거대분자는 두개의 부분으로 분할할 수 있는데, 여기서 하나의 부분은 예를 들어 화학적으로 절단가능한 결합을 형성시키는 한쪽 말단에서 변형되고, 두번째 부분은 예를 들어 광절단가능한 결합을 형성시키는 다른쪽 말단에서 변형된다. 이어서, 변형된 생물학적 거대분자의 2개의 모집단을 함께, 고정화를 완결시키기 위한 적절한 관능 그룹을 함유하는 고체 지지체상에 고정화시킬 수 있다.
생물학적 거대분자의 IR-MALDI 질량 분석법
본원에 기술된 방법은 IR선을 흡수하는 액체 매트릭스와 생물학적 거대분자를 함유하는 조성물을 IR-MALDI 질량 분석법으로 처리함으로써 생물학적 거대분자를 분석하는데 유용하다. 선택된 방법에 따라, 생물학적 거대분자의 존재가 예를 들어 생물학적 샘플에서 검출되거나, 특정한 생물학적 거대분자가 예를 들어 상응하는 공지된 생물학적 거대분자와의 비교에 의해 또는 이의 분자량 또는 이의 아단위 서열중 적어도 일부분을 측정함으로써 동정될 수 있다[참조: 미국 특허 제5,503,980호; 제5,547,835호; 제5,605,798호 및 제5,691,194호; 국제 공보 제WO 94/16101호; 제WO 94/21822호; 제WO 96/29431호; 제WO 97/37041호; 제WO 97/42348호 및 제WO 98/20019호].
IR 레이저를 사용하는 질량 분석법
샘플을 함유하는 지지체를 질량 분석기의 진공 챔버에 넣어 샘플내의 핵산을 동정 또는 검출할 수 있다. 바람직하게는, 질량 분석기는 샘플 제조, 침착 및/또는 분석중에 미리 선택된 값의 샘플 온도, 예를 들어 약 -200℃ 내지 약 80℃, 바람직하게는 약 -60℃ 내지 약 40℃, 더욱 바람직하게는 약 -200℃ 내지 약 20℃, 및 가장 바람직하게는 약 -60℃ 내지 약 20℃ 범위의 온도에서 유지할 수 있다. 예를 들면, 개선된 스펙트럼은 예를 들어 샘플을 샘플 제조 및 질량 분석중에 실온 이하의 온도로 냉각시킴으로써 수득할 수 있다. 추가로, 상술된 바와 같이, 매트릭스의 진공 안정성은 냉각에 의해 증가될 수 있다. 또는, 이본쇄 핵산을 일본쇄로 변성시키거나 샘플 제조중에 점도를 증가시키기 위해 샘플을 가열하는 것이 유용할 수 있다.
샘플의 탈착 및 이온화는 적외선을 사용하여 질량 분석기에서 수행한다. 바람직한 적외선 파장은 중간-IR 파장 영역, 즉 약 2.5㎛ 내지 약 12㎛의 범위내이다. 적외선의 바람직한 공급원은 약 6㎛에서 방사하는 CO 레이저; 약 9.2㎛ 내지 11㎛에서 방사하는 CO2레이저; 약 3㎛의 파장에서 방사하는, 다양한 결정(예: Er-YAG(이트륨-알루미늄-가닛), Er-YILF 또는 Er-YSGG)을 갖는 Er 레이저 및 약 2.5㎛ 내지 약 12㎛의 범위에서 방사하는 광학 상자성 발진기 레이저이다.
펄스 기간, 자기장 강도 및 기타 파라미터
펄스 폭이 약 100s인 고체상 에르븀 레이저가 적외선 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분석법(IR-MALDI MS)[참조: Overberg et al, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1990, 4, 293-296; Berkenkamp et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 1997, 11, 1399-1406]에 사용될 수 있다. 펄스 기간이 몇 나노초인 광학 상자성 발진기(OPO)가 또한 IR-MALDI MS에서 사용될 수 있다. 몇 나노초의 OPO 시스템의 고정화된 펄스 폭은 펌프 레이저에 의해 측정한다. 조사된 부분(스폿 사이즈)의 펄스 기간 및/또는 크기는 다중 하전된 이온을 생성하기 위해 달라질 수 있다. 바람직한 펄스 기간은 약 100psec 내지 약 500ns의 범위이다.
Er:YAG- 및 OPO 레이저는 5 내지 200ns 펄스 폭 및 3㎛ 파장 영역에서 IR-MALDI-MS의 펄스 폭 및 파장 의존성을 조사하기 위해 사용된다. 90 내지 185ns의 레이저 펄스 기간의 경우, Er:YAG 레이저(Spektrum GmbH, Berlin, Germany, 파장 λ=2.94㎛)가 사용된다. 펄스 기간은 Q-스위치 지연 시간을 변화시켜 달리한다. Nd:YAG 펌핑된 OPO 레이저(Mirage 3000B, Continuum, Santa Clara, CA, USA)의 경우에는 펄스 파장이 6ns로 고정화되는 반면, 이 시스템은 2.2㎛ 내지 4.0㎛로 조절할 수 있다. 파장 눈금은 ±5nm의 정밀도로 조절된다. 선형(2.2m) 및 리플렉트론 포트(3.5m 등가의 플라이트 길이)를 갖는 사내의 TOF 장치가 사용된다. 질량 분광기는 정적 또는 지연된 이온 추출로 작동시킬 수 있다. 특별한 광학을 실시하여 2개의 레이저 빔의 신속한 상호교환을 가능케 하였다. 150㎛ 핀홀은 가우시안(Gaussian) 빔의 중심 부분에 의해 조사하고, 샘플내로 영상화시켜 2개의 레이저에 대한 균일하고 동등한 샘플 조사를 확보한다. 모든 스펙트럼은 동일한 장치 조건하에 동일한 샘플로부터 수득한다.
결과: a) 최초의 근사치에 대해 시토크롬 C 질량 스펙트럼의 생성에 대한 역치 플루언스는 6 내지 185ns 범위에서 펄스 기간과는 독립적이다.
레이저 시스템 H0/Jm-2
석신산 티오우레아 글리세롤
OPO(τ=6ns) 3564±695 2053±296 4186±143
Er:YAG(τ=98ns) 4304±538 3433±127 4992±118
Er:YAG(τ=185ns) 4591±532 3398±398 4941±730
OPO-시스템의 경우, 역치 플루언스는 Er:YAG 레이저와 비교하여 1.5배까지 일정하고 통계학상 유의적으로 낮았다. 그러나, OPO 시스템의 경우 약 50MW/cm2(τ=6ns) 및 Er:YAG 레이저의 경우 약 2MW/cm2(τ=18.5ns)의 발광은 약 25의 인자까지 상이하다. 따라서, IR-MALDI에서의 탈착은 200ns 이하의 펄스 기간에 대한 피크력 또는 발광에 의한 것이라기 보다는 단위 용적당 침착된 에너지에 의해 생성되었다고 결론지을 수 있다.
b) 실험 오차내에서, 석신산 매트릭스 중에서 탈착된 펩타이드 시그날에 대한 질량 분해능은 정적 및 지연된 이온 추출에 대한 6 내지 100ns 범위내의 펄스 폭과는 독립적인 것으로 관찰되었다. 200ns 이하의 펄스 및 정적 이온 추출이 길수록, 분해는 2배까지 감소되었다. 그라미시딘 S의 피크 분해에 대한 레이저 펄스 폭의 영향을 분석함에 있어서, m/Δm=11000의 최적 분해는 질량 분광기의 선형 모드에 있어서 100ns 에르븀 레이저 펄스에서 뿐만 아니라 지연된 이온 추출을 사용한 6ns OPO 레이저 펄스에서 관찰되었다.
c) 6ns 펄스의 경우, 100ns 펄스와 비교하여 다중으로 하전된 이온의 풍부함 증가 및 올리고머 시그날의 감소가 관찰되었다.
d) IR-MADLI 스펙트럼의 생성을 위한 역치 플루언스는 OPO 레이저 시스템을 사용한 몇몇 고체 및 액체 매트릭스에 대해 2.6㎛ 내지 3.6㎛의 파장 범위에서 관찰되었다. 이들은 매트릭스의 상응하는 전달 스펙트럼과 비교된다[참조: Merke, R., Langenbucher, F., Infrared Spetra, Heyden ＆ Co., Freiburg, 1964]. 이들의 (역전) 전달에 대한 석신산 및 글리세롤 역치 플루언스 사이의 명백한 상관관계가 시토크롬 C의 역치 플루언스 H0에 대한 레이저 파장 λ의 영향 연구에서 관찰되었다. 글리세롤의 경우 2중 피크 구조가 명백히 재생된다. 유사한 행태가 트리에탄올아민에서 관찰되었다. 석신산의 경우, 역치 플루언스는 3.2 내지 3.6㎛ 범위에서 흡수 스펙트럼을 허용한다. 놀랍게도, 2.8 내지 3.2㎛의 낮은 역치는 석신산 미세결정질에서 잔류하는 물의 강력한 흡수를 반영하는 것 같다.
특히 단백질의 경우, 전형적으로 1000V/mm, 바람직하게는 200V/mm와 같이 낮은 자기장 세기가 사용된다.
바람직한 스폿 크기는 직경 약 50㎛ 내지 약 1mm의 범위이다. IR-MALDI는 선형 및 비선형 자기장, 예를 들어 곡선 자기장 리플렉트론, 흐름 시간(TOF), 단일 또는 다중 사중선, 단일 또는 다중 자기 섹터, 푸리에 전환 이온 사이클로트론 공명 또는 이온 트랩을 갖는, 선형(lin) 또는 반사(ref)를 포함하는 적절한 질량 분석기에 적합할 수 있다. 바람직하게는, 검출은 포지티브 또는 네가티브 방식으로 lin TOF 또는 refTOF 방식 장치를 사용하여 수행되어, 이온은 정적 또는 지연된 이온 추출(DE)를 사용하는 분할 추출 공급원에서 약 3kV 내지 약 30kV의 전체 전위차를 통해 가속화된다. TOF 질량 분석기는 생성된 이온이 검출기로 이동하는데 걸리는 시간을 측정함으로써 질량-대-전하 비율에 따라 이온을 분리한다. TOF 질량 분광기 이외의 기술은 문헌[참조: 미국 특허 제5,627,369호; 제5,625,184호; 제5,498,545호; 제5,160,840호 및 제5,045,694호]에 기재되어 있다. 지연 시간이 약 50nsec 내지 약 5μsec 범위인 지연된 추출은 액체 또는 고체 매트릭스를 사용하는, 일부 핵산, 예를 들어 질량 범위가 약 30kDa 내지 약 50kDa인 핵산의 질량 분해를 개선시킬 수 있다. 지연된 추출을 위해, 조건은 보다 긴 최적 추출 지연 및 따라서 보다 긴 체류 시간을 허용하여 분해를 증가시키도록 선택된다[참조: Juhasz et al., Anal. Chem. 68: 941-946(1996); Vestal et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 9: 1044-1050(1995); 미국 특허 제5,777,325호; 제5,742,049호; 제5,654,545호, 제5,641,959호; 제5,654,545호 및 제5,760,393호, MALDI 및 지연된 추출 프로토콜의 경우]. 지연된 이온 추출에 있어서, 시간 지연은 이온의 형성과 가속 자기장의 적용 사이에 도입된다. 시간 지연 중에, 이온은 이들의 초기 속도에 따라 새로운 위치로 이동한다. 지연 시간 및 가속 영역내의 전자기장을 적절히 선택함으로써, 이온의 흐름 시간은 초기 속도와는 독립적인 흐름 시간이 처음 순서로 되도록 조절할 수 있다.
IR-MALDI에 의한 핵산의 분석
UV MALDI를 사용하는 핵산의 서열 분석, 진단 및 검출 방법 및 공정은 개발되어 당업자에게 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제5,605,798호, 제5,830,655호, 제5,700,642호, 허여된 미국 특허원 제08/617,256호, 공개된 국제 PCT 특허원 제WO 96/29431호, 제WO 98/20019호, 제WO 99/14375호, 제WO 97/03499호, 제WO 98/26095호 등].
액체 매트릭스에서 핵산을 분석하기 위한 IR-MALDI의 사용 방법이 제공된다. 본원에서 제공된 방법에 따라 분석되는 핵산은 일본쇄 또는 이본쇄 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 게놈 DNA 및 cDNA를 포함하는 DNA; RNA; 또는 RNA 또는 DNA의 동족체 뿐만 아니라 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 및 이의 유도체가 포함될 수 있다. 핵산은 일본쇄 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 크기가 수십 내지 수천 염기쌍 범위일 수 있다. 본원의 분석을 위해, 바람직한 핵산은 약 1천개 뉴클레오타이드 이하를 함유한다.
핵산은 생물학적 샘플로부터 수득할 수 있으며, 이는 본 기술분야에 공지된 다수의 공정을 사용하여 사람, 동물, 식물, 박테리아, 진균, 원생 생물 또는 바이러스를 포함하는 모든 살아있는 공급원으로부터 수득한 모든 물질일 수 있다. 생물학적 샘플로부터 핵산을 수득하는 특정한 분리 공정은 특정한 생물학적 샘플에 적합하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 동결-해동 또는 알칼리 용해 공정은 고체 물질로부터 핵산 분자를 수득하는데 유용하며; 열 및 알칼리 용해 공정은 혈액으로부터 핵산을 수득하는데 유용할 수 있다[참조: Rolff et al., PCR: Clinical Diagnostic and Research (Springer Verlag 1994)].
액체 매트릭스와 혼합하기 전에, 분석하고자 하는 특정한 핵산은 추가로 처리하여 비교적 순수한, 분리된 핵산 샘플을 수득할 수 있다. 예를 들면, 표준 에탄올 침전법을 제한 효소 분해된 DNA에 대해 수행할 수 있다. 또는, PCR 생성물은 분석전에 프라이머 제거를 필요로 할 것이다. 마찬가지로, RNA 스트랜드는 시험관내 전사 반응물에 항상 존재하는 과량의 조숙 종결 생성물로부터 분리할 수 있다.
서열 분석
실험 포맷 및 전략
생거, 엑소뉴클레아제 및 하이브리드화 방법을 포함하여, 본 기술분야에 공지된 모든 서열 분석 전략을 액체 매트릭스 및 IR MALDI에 의한 본원에서 제공된 IR MALDI에 사용할 수 있다. 예를 들면, 생거 서열 분석 방법은 IR-MALDI를 사용하여 측정할 수 있는 상이한 분자량을 통해 염기-특이적 쇄 종결에 의해 수득한 중복 단편의 분석에 의한 서열 정보를 조합한다. 경우에 따라, 산출물의 증가는 핵산 단편을 조절함으로써, 예를 들어 질량 변형을 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 쇄-종결 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및/또는 쇄-신장 뉴클레오사이드 트리포스페이트에 도입함으로써, 또는 질량 분화된 분자량으로 태그 특이적 프로브와의 하이브리드화에 의해 배가시키는 삽입된 태그 서열을 사용함으로써 수득할 수 있다.
엑소뉴클레아제-기본된 서열 분석 프로토콜을 또한 수행할 수 있다. IR-MALDI에의 사용에 적용된 미국 특허 제5,622,824호에 기술된 방법을 포함하는 이들 방법은 직접적인 서열 분석 방법을 수반하며, 통상적인 클로닝 벡터에 클로닝된 DNA 단편으로 시작할 수 있다. 이 DNA는 보호, 효소 활성의 특이성, 또는 고정화에 의해 엑소뉴클레아제 분해 또는 질량 분석법에 의해 검출된 뉴클레오타이드 또는 유도체를 통해 단계적 방식으로 한쪽으로 분해된다. 효소 분해전에, 클론된 DNA 단편의 전체 서열을 신장시키는 정렬된 결실 세트가 생성된다. 이러한 방식에 있어서, 질량-변형된 뉴클레오타이드는 엑소뉴클레아제 및 DNA/RNA 폴리머라제의 조합을 사용하여 도입될 수 있다. 이는 다중 질량 분석법 검출, 또는 엑소뉴클레아제의 활성 조절을 가능케 하여 분해 방법이 동시에 발생되도록 한다.
하이브리드화에 의해 서열 분석하는 방법에는 하이브리드화에 의한 위치 서열 분석 방법(참조: 미국 특허 제5,503,980호, 제5,795,714호 및 제5,631,134호)이 포함된다. 요약하면, 하이브리드화에 의한 서열 분석은, 당해 세트의 일본쇄 부분이 바람직하게는 예정된 범위에 걸쳐 서열의 모든 가능한 조합을 포함하는 경우 이본쇄 부분에 인접한 일본쇄 부분내에 측정가능한 랜덤 서열을 함유하는 핵산 프로브 세트와 핵산을 하이브리드화하여 핵산을 서열 분석하는 방법을 의미한다. 하이브리드화는 프로브의 일본쇄 부분에 의한 표적의 일본쇄 부분의 상보성 인지에 의해 발생하며, 열역학적으로 인접한 이본쇄성 프로브의 존재에 의해 유리해진다. 특히, 하이브리드화에 의해 핵산 표적의 뉴클레오타이드 서열을 측정하는 방법은 각각의 프로브가 바람직하게는 약 14개 내지 50개 뉴클레오타이드 길이를 갖고 측정할 수 있는 일본쇄 부분내에 이본쇄 부분, 일본쇄 부분 및 가변 서열을 갖는 핵산 프로브 세트를 제조하는 단계; 적어도 부분적으로 일본쇄인 표적을 하나 이상의 핵산 프로브와 하이브리드화하는 단계; 및 특정한 프로브의 일본쇄 부분과 하이브리드화하는 표적의 뉴클레오타이드 서열을 측정하는 단계를 포함한다. 프로브를 검출하기 위해, 표적은 말단 부위에 1차 검출가능한 표지 및 내부 부위에 상이한 2차 검출가능한 표지로 표지할 수 있다. 표지는 IR 질량 분석법에 의해 검출할 수 있도록 선택된다.
상기 포맷의 실시예
직접 서열 분석하는 양태의 한 가지 예에 있어서, 서열 분석 방법은 4개의 가능한 뉴클레오타이드 염기중 하나에 상응하는 표적 핵산의 다중 핵산 카피(여기서, 다중 카피는 하나 이상의 질량 변형된 뉴클레오타이드를 함유한다)를 수득하는 단계; 질량-변형된 뉴클레오타이드에 의해 억제되는 활성을 갖는 엑소뉴클레아제로 제1 말단으로부터 제2 말단으로 다중 핵산 카피를 절단하여 염기 종결된 핵산 단편을 생성하는 단계; IR-MALDI에 의해 중복 핵산 단편을 동정하는 단계 및 동정된 중복 핵산 단편으로부터 표적 핵산 서열을 측정하는 단계를 포함한다.
모든 포맷에 있어서, 핵산은 배열 포맷으로 고정화될 수 있다. 고정화는 IR 레이저에 의해 방사된 IR선에 의한 것과 같이 절단가능한 링커로 수행할 수 있다. 결합은 가역적이거나 비가역적일 수 있다.
표적 생물학적 거대분자의 아단위 서열을 측정하는 방법이 제공된다. 표적 생물학적 거대분자의 서열은 생물학적 거대분자의 말단으로부터 한쪽 방향으로 생물학적 거대분자를 절단하는 제제에 생물학적 거대분자를 접촉시켜 결실 단편의 중복 세트를 제조하고; 중복 세트의 생물학적 거대분자 단편과 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 조성물을 제조하며; 조성물내의 각 생물학적 거대분자 단편의 분자량 값을 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정하고 당해 세트내의 생물학적 거대분자 단편의 분자량 값으로부터 핵산 서열을 측정함으로써 측정할 수 있다.
예를 들면, 표적 핵산의 서열은 표적 핵산을 엑소뉴클레아제로 다양한 시간 동안 처리하여 표적 핵산 서열을 함유하는 결실 단편의 중복 세트를 제조하고(국제 공보 제WO 94/21822호), 이어서 결실 단편의 중복 세트를 IR-MALDI로 분석함으로써 측정할 수 있다. 유사하게는, 표적 폴리펩타이드 서열은 카복시펩티다제 Y, 카복시펩티다제 P, 카복시펩티아제 A, 카복시펩티다제 G 또는 카복시펩티다제 P 등의 카복시펩티다제; 또는 알라닌 아미노펩티다제, 루신 아미노펩티다제, 피로글루타메이트 펩티다제, 디펩티딜 펩티다제 및 미립체 펩티다제 등의 아미노펩티다제; 또는 페닐이소티오시아네이트 등의 화학적 폴리펩타이드 단편화제일 수 있는 엑소펩티다제로 폴리펩타이드를 다양한 시간 동안 처리하여 생물학적 거대분자 단편의 중복 세트를 제조하고, 이를 IR-MALDI 질량 분석법으로 분석하여 표적 생물학적 거대분자의 서열을 측정[참조: Protein LabFax, pages 273-276(ed., N.C. Price; Bios Scientific Publ., 1996); listing polypeptide fragmenting agents]함으로써 측정할 수 있다. 엑소뉴클레아제, 엑소펩티다제 및 엑소글리코시다제는 본 기술분야에 공지되어 있고[참조: 미국 특허 제5,821,063호], 이러한 제제의 활성을 변형시키는 방법도 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제5,792,664호; 국제 공보 제WO 96/36732호].
또한, 표적 생물학적 거대분자의 서열은 말단으로부터 한쪽 방향으로 생물학적 거대분자를 절단하는 제제로 생물학적 거대분자를 시간-제한된 방식으로 처리하고, 방출된 단량체 아단위를 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 동정함으로써 측정할 수 있다. 경우에 따라, 표적 생물학적 거대분자의 분해는, 생물학적 거대분자가 조성물에 없고 절단하는 제제가 고정화될 수 있거나, 절단하는 제제가 조성물에 없고 생물학적 거대분자가 고정화될 수 있는 반응기 장치[참조: 국제 공보 제WO 94/21822호]에서 수행할 수 있다. 시간 간격에서 또는 연속 스트림으로서, 방출된 아단위를 함유하는 반응 혼합물은 IR-MALDI 질량 분석법에 의한 분석을 위해 반응기로부터 전달될 수 있다. IR-MALDI 질량 분석법 전에, 방출된 아단위는 조절을 위해 반응 용기에 전달될 수 있는데, 이는 질량 변형에 의할 수 있다.
또한, 표적 생물학적 거대분자의 서열은 표적 생물학적 거대분자로부터 2개 이상의 생물학적 거대분자를 생성하고; 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 생물학적 거대분자 단편을 함유하는 조성물을 제조하며; 조성물내의 생물학적 거대분자 단편을 IR-MALDI 질량 분석법으로 분석하여 표적 핵산 분자의 서열을 결정함으로써 측정할 수 있다. 특히, 이러한 방법은 거대한 생물학적 거대분자 서열내의 아단위 서열의 순서를 측정하는데 유용할 수 있다(국제 공보 제WO 98/20019호).
표적 생물학적 거대분자의 1종 이상의 아단위 서열(i)을 측정하는 방법이 또한 제공된다. 이러한 방법은 예를 들어 표적 생물학적 거대분자내의 각 단량체 아단위 사이의 각각의 결합을 절단하기에 충분한 하나 이상의 제제와 표적 생물학적 거대분자의 종을 접촉시켜 결실 단편의 중복 세트를 제조하고; 상기 세트의 하나 이상의 생물학적 거대분자 단편과 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 조성물을 제조하며; 하나 이상의 생물학적 거대분자 단편의 분자량을 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 측정하고; 상기 세트내의 각 생물학적 거대분자의 분자량이 측정될 때까지 상기 단계를 반복하여 표적 생물학적 거대분자 종의 아단위 서열을 측정함으로써 수행할 수 있다. 이러한 방법은 표적 생물학적 거대분자의 복수의 (i+1) 종의 다중 분석에 특히 적합하다. 다중 분석을 위해, 표적 생물학적 거대분자의 각각의 종은, 표적 생물학적 거대분자의 각 종의 생물학적 거대분자 단편이 모든 다른 생물학적 거대분자 종으로부터 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 구별될 수 있도록 상이하게 질량 변형될 수 있다.
또한, 표적 핵산 서열은 또한 하나 이상의 부분적인 일본쇄 표적 핵산을 하나 이상의 핵산 프로브(여기서, 각각의 프로브는 이본쇄 부분, 일본쇄 부분, 일본쇄 부분내의 측정가능한 가변 서열을 함유한다)와 하이브리드화하여 하나 이상의 하이브리드화된 표적 핵산을 제조하고; 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 하이브리드화된 표적 핵산을 함유하는 조성물을 제조하며; 표적 핵산이 하이브리드화하는 프로브의 측정가능한 가변 서열에 기초하여 하이브리드화된 표적 핵산 서열을 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정함으로써 측정할 수 있다(미국 특허 제5,503,980호). 임의로, 하이브리드화된 표적 핵산을 측정가능한 가변 서열에 결합시킬 수 있다. 경우에 따라, 이러한 방법 단계를 충분한 횟수로 반복하여 표적 핵산의 전체 서열을 측정할 수 있다. 복수의 표적 핵산을 서열 분석하는 경우, 하나 이상의 프로브를 배열로 고정화시킬 수 있다.
IR-MALDI 질량 분석법은 또한 핵산에 의해 암호화된 표적 폴리펩타이드를 분석함으로써 핵산 서열을 측정하는데 사용될 수 있다. 폴리펩타이드 질량은 이의 암호화 핵산 질량의 단지 약 10%이기 때문에, 해독된 폴리펩타이드는 질량 분석법 검출을 더욱 용이하게 할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드의 IR-MALDI 질량 분석법 검출은 고도의 감수성 및 분해의 분석 시그날을 나타낼 수 있다[참조: Berkenkamp et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 11: 1399-1406(1997)].
IR-MALDI 질량 분석법 및 고정화된 절단가능한 프라이머를 사용한 올리고뉴클레오타이드 사이징, 핑거프린트 및 서열 분석
IR-MALDI 질량 분석법은 또한 미국 특허 제5,830,655호 및 미국 특허 제5,700,642호에 기술된 고정화된 절단가능한 프라이머, 또는 기타 이러한 프라이머와 함께 사용하여 프라이머 신장 산물의 크기를 측정할 수 있다. 특정한 한가지 양태에 있어서, 프라이머 신장 산물의 크기를 측정하는 방법이 제공된다. 여기에는 (i) 표적 핵산과 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 선택된 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 표적 핵산 부위와 하이브리드화하는 단계(a),
프라이머를 효소에 의해 신장시켜, 프라이머와 신장 절편으로 이루어진 신장 산물을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 혼합물을 제조하는 단계(b),
신장 산물을 절단가능한 부위에서 절단하여 신장 절편을 방출시키는 단계(c) 및
액체 매트릭스와 함께 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 신장 절편을 사이징하는 단계(여기서, 절단은 단계 (b)의 산물의 판독 길이에 대해 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이다)를 포함한다.
한가지 양태에 있어서, 표적 핵산은 고정화 결합 부위를 함유하고, 이에 의해 고체 지지체에 결합하여 고정화된다. 표적 핵산은 신장 전에 고정화시킬 수 있다. 또한, 바람직하게는, 표적 핵산은 절단 전에 고정화된다. 더욱 바람직하게는, 고정화된 표적 핵산으로부터 단계 (b)의 산물은 절단 단계 전에 분리된다.
또다른 양태에 있어서, 절단 부위는 5' 내지 3' 효소-촉진된 분해를 차단할 수 있는 뉴클레오타이드이고, 여기서 절단은 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소로 프라이머의 제1 영역을 분해함으로써 수행된다. 또다른 양태에 있어서, 절단가능한 부위는 프라이머의 3' 말단으로부터 약 5개의 뉴클레오타이드에 또는 그 안에 위치한다. 더욱 바람직하게는, 프라이머의 제2 영역은 절단가능한 부위, 예를 들어, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 리보뉴클레오타이드, 디알콕시실란, 3'-(S)-포스포로티오에이트, 5'-(S)-포스포로티오에이트, 3'-(N)-포스포르아미데이트, 5'-(N)-포스포르아미데이트, 우라실 또는 리보즈를 함유하는 일본쇄 뉴클레오타이드이다. 단계 (b)에서 프라이머를 신장시키는 효소는 DNA 폴리머라제일 수 있다.
또다른 양태에 있어서, 신장은 고정화 결합 부위(i) 및 방출가능한 부위(ii)를 함유하는 뉴클레오타이드의 존재하에 수행되며, 이에 의해 신장 단편내로 도입된다. 더욱 바람직하게는, 고정화 결합 부위에 신장 절편을 고정화시키고, IR-MALDI 질량 분석법에 의한 사이징 전에 방출가능한 부위에서 신장 산물을 방출시키는 단계가 포함된다.
또다른 특정한 양태에 있어서, (i) 표적 핵산과 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며(여기서, 프라이머의 고정화 결합 부위는 중간 올리고뉴클레오타이드에 상보성인 일련의 염기로 구성되어 있다), (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 선택된 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 표적 핵산과 하이브리드화하는 단계(a),
프라이머를 효소에 의해 신장시켜, 프라이머와 신장 절편으로 이루어진 신장 산물을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 혼합물을 제조하는 단계(b),
신장 산물을 절단가능한 부위에서 절단하여 신장 절편을 방출시키는 단계(여기서, 절단 전에 프라이머는 고체 지지체에 결합된 중간 올리고뉴클레오타이드에 고정화 결합 부위의 특이적 하이브리드화에 의해 고정화된다)(c) 및
신장 절편을 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 사이징함으로써 절단이 단계 (b)의 산물의 판독 길이에 비례하여 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(d)를 포함하여, 프라이머 신장 산물의 크기를 측정하는 방법이 제공된다.
또다른 특정한 양태에 있어서, (i) 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, (ii) 표적 핵산과 상보성이며, (iii) 제1 프라이머의 5' 말단을 함유하는 제1 영역을 가지며, (iv) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 제1 프라이머와, (i) 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, (ii) 표적 핵산에 상보성이며, (iii) 제2 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제1 절편을 갖고, (iv) 제2 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제2 절편을 갖는 제2 프라이머를, 핵산과 프라이머와의 하이브리드화를 촉진하는 조건하에 표적 핵산과 배합하는 단계(a),
프라이머/핵산 복합체를 DNA 폴리머라제 및 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에 이본쇄 단편으로 전환시키는 단계(b),
이본쇄 단편을 변성시켜 일본쇄 단편을 생성하는 단계(i), 일본쇄 단편을 제1 및 제2 프라이머와 하이브리드화시켜 스트랜드/프라이머 복합체를 형성하는 단계(ii), DNA 폴리머라제 및 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에 스트랜드/프라이머 복합체로부터 증폭 산물을 제조하는 단계(iii); 및 목적하는 증폭이 달성될 때까지 단계 (i) 내지 (iii)을 반복하는 단계(iv)를 연속적으로 반복하여 프라이머-함유 단편을 증폭시키는 단계(c),
제2 프라이머를 함유하는 증폭 산물을 고정화 결합 부위를 통해 고정화시키는 단계(d),
고정화되지 않은 증폭 단편을 제거하는 단계(e),
고정화된 증폭 산물을 절단가능한 부위에서 절단하여 이본쇄 산물을 함유하는 혼합물을 제조하는 단계(f),
이본쇄 산물을 변성시켜 신장 절편을 방출시키는 단계(g) 및
신장 절편을 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법으로 사이징함으로써 절단이 단계 (c)의 증폭된 스트랜드-프라이머 복합체의 판독 길이에 비례하여 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(g)를 포함하여, 프라이머 신장 산물의 크기를 측정하는 방법이 제공된다.
또다른 양태에 있어서, (i) 표적 핵산에 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iv) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 선택된 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 표적 핵산과 하이브리드화하는 단계(a),
프라이머를 효소에 의해 신장시켜, 프라이머와 신장 절편으로 이루어진 신장 산물을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 혼합물을 제조하는 단계(b),
절단가능한 부위에서 신장 산물을 절단하여 신장 절편을 방출시키는 단계(여기서, 절단하기 전에 프라이머는 고정화 결합 부위에 고정화된다)(c) 및
신장 절편을 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법으로 사이징함으로써 절단이 단계 (b)의 산물의 판독 길이에 비례하여 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(d)를 포함하여, 프라이머 신장 산물의 크기를 측정하는 방법이 제공된다. 단계 (b)에서 프라이머를 신장시키기 위한 효소는 DNA 폴리머라제이다.
한가지 양태에 있어서, 절단가능한 부위는 프라이머의 3' 말단으로부터 약 5개의 뉴클레오타이드에 또는 그 안에 위치한다. 더욱 바람직하게는, 프라이머의 제2 영역은, 이로써 제한되지는 않지만, 리보뉴클레오타이드, 디알콕시실란, 3'-(S)-포스포로티오에이트, 5'-(S)-포스포로티오에이트, 3'-(N)-포스포르아미데이트, 5'-(N)-포스포르아미데이트 또는 리보즈 등의 절단가능한 부위를 함유하는 일본쇄 뉴클레오타이드이다.
또다른 양태에 있어서, 절단 단계 전에 고정화된 생성물을 세척하는 단계가 포함된다. 또다른 양태에 있어서, 프라이머는 고체 지지체에 결합된 개재 스페이서 암(arm)에 고정화 결합 부위에서 결합함으로써 고체 지지체에 고정화된다. 더욱 바람직하게는, 개재 스페이서 암은 6개 이상의 원자 길이이다. 고정화 결합 부위는 바람직하게는 DNA 프라이머의 염기 또는 당중 하나에 대한 치환체로서 발생한다. 또다른 양태에 있어서, 고정화 결합 부위는 비오틴 또는 디곡시게닌이다. 또다른 양태에 있어서, 프라이머는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 유리, 규소, 폴리스티렌, 알루미늄, 강, 철, 구리, 니켈 또는 금을 포함하는 고체 지지체에 고정화된다.
또다른 양태에 있어서, 프라이머의 크기를 측정하는 방법은, (i) 표적 핵산과 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 제1 프라이머와 표적 핵산에 상동성인 제2 프라이머를, 핵산과 프라이머와의 하이브리드화를 촉진하는 조건하에 표적 핵산과 배합하여 프라이머/핵산 복합체를 제조하는 단계(a),
적합한 폴리머라제 및 모든 4개의 dNTP의 존재하에 프라이머/핵산 복합체를 이본쇄 단편으로 전환시키는 단계(b),
이본쇄 단편을 변성시켜 일본쇄 단편을 생성하는 단계(i), 일본쇄를 프라이머와 하이브리드화시켜 스트랜드/프라이머 복합체를 형성하는 단계(ii), DNA 폴리머라제 및 모든 4개의 dNTP의 존재하에 스트랜드/프라이머 복합체로부터 이본쇄 단편을 제조하는 단계(iii) 및 목적하는 증폭이 달성될 때까지 단계 (i) 내지 (iii)을 반복하는 단계(iv)를 연속적으로 반복하여 프라이머-함유 단편을 증폭시키는 단계(c),
증폭된 단편을 변성시켜 제1 프라이머와 신장 절편으로 이루어진 산물을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계(d),
고정화 결합 부위를 사용하여 제1 프라이머를 함유하는 증폭된 단편을 고정화시키고 고정화되지 않은 증폭된 단편을 제거하는 단계(e),
고정화된 단편을 절단가능한 부위에서 절단하여 신장 절편을 방출하는 단계(f) 및
신장 절편을 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법으로 사이징함으로써 절단이 단계 (d)의 산물의 판독 길이에 비례하여 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(g)를 포함한다.
또다른 양태에 있어서, 표적 DNA 서열의 단일 염기 핑거프린트를 측정하는 방법이 제공된다. 이 방법은 (i) 표적 DNA와 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 선택된 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 표적 DNA와 하이브리드화하는 단계(a),
프라이머를 단일 염기에 상응하는 디데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에 효소로 신장시켜 각각 프라이머와 신장 절편을 함유하는 프라이머 신장 산물의 폴리뉴클레오타이드 혼합물을 제조하는 단계(b),
신장 산물을 절단가능한 부위에서 절단시켜 신장 절편을 방출시키는 단계(여기서, 프라이머는 절단 전에 고정화 결합 부위에서 고정화된다)(c),
신장 절편을 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법으로 사이징함으로써 절단이 단계 (b)의 상응하는 프라이머 신장 산물의 판독 길이에 비례하여 임의의 주어진 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(d), 및
신장 절편의 크기를 비교하여 표적 DNA내의 단일 염기의 위치를 측정하는 단계(e)를 포함한다.
또다른 양태에 있어서, 표적 DNA 서열의 아데닌 핑거프린트 방법은, (i) 표적 DNA와 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 선택된 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 DNA 표적과 하이브리드화하는 단계(a),
프라이머를 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP)의 존재하에 효소로 신장시켜 표적내의 dATP에 상응하는 위치에 dUTP를 함유하는 프라이머 신장 산물(여기서, 각각의 산물은 프라이머와 신장 절편을 함유한다)의 폴리뉴클레오타이드 혼합물을 제조하는 단계(b),
프라이머 신장 산물을 단편에 대한 우라실 DNA-글리코실라제로 dUTP 위치에서 특이적으로 처리하여 프라이머 신장 분해 산물의 세트를 제조하는 단계(c),
프라이머 신장 분해 산물을 세척하는 단계(여기서, 프라이머 신장 분해 산물은 세척 전에 고정화 결합 부위에 고정화되고, 각각의 고정화된 프라이머 신장 분해 산물은 프라이머와 신장 절편을 함유하며, 세척은 고정화되지 않은 종을 제거하기에 효과적이다)(d),
고정화된 프라이머 신장 분해 산물을 절단가능한 부위에서 절단하여 신장 절편을 방출하는 단계(e),
신장 절편을 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법으로 사이징함으로써 절단이 이의 상응하는 프라이머 신장 분해 산물의 판독 길이에 비례하여 주어진 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(f) 및
방출된 신장 절편의 크기를 비교하여 표적 DNA내의 아데닌의 위치를 측정하는 단계(g)를 포함한다.
또다른 특정한 양태에 있어서, (i) 표적 DNA와 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 표적 DNA와 하이브리드화하는 단계(a),
4개의 상이한 디데옥시뉴클레오타이드중 제1 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이머를 효소로 신장시켜 프라이머와 신장 절편을 함유하는 각각의 프라이머 신장 산물의 혼합물을 제조하는 단계(b),
절단가능한 부위에서 절단하여 신장 절편을 방출시키는 단계(여기서, 절단 전에 프라이머는 고정화 결합 부위에 고정화된다)(c),
신장 절편을 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법으로 사이징함으로써 절단이 단계 (b)의 산물의 판독 길이에 비례하여 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(d),
단계 (a) 내지 단계 (d)를 4개의 상이한 디데옥시뉴클레오타이드중 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드로 반복하는 단계(e) 및
4개의 신장 반응 각각으로부터 수득한 신장 절편의 크기를 비교하여 표적 DNA의 DNA 서열을 결정하는 단계(f)를 포함하여, 표적 DNA 서열의 DNA 서열을 결정하는 방법이 제공된다.
또다른 양태에 있어서, (i) 표적 DNA와 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 표적 DNA와 하이브리드화하는 단계(a),
4개의 상이한 데옥시뉴클레오사이드 α-티오트리포스페이트 동족체(dNTPαS)중 제1 뉴클레오사이드의 존재하에 프라이머를 효소로 신장시켜 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 프라이머 신장 산물의 혼합물을 제조하는 단계(b),
포스포로티오에이트 결합을 특이적으로 절단하는 시약으로 프라이머 신장 산물을 처리하여 프라이머 신장 분해 산물의 그룹을 제조하는 단계(여기서, 처리는 특정한 절단을 발생시키는 조건하에 수행한다)(c),
프라이머 신장 분해 산물을 세척하는 단계(여기서, 프라이머 신장 분해 산물은 세척전에 고정화 결합 부위에 고정화되고, 각각의 고정화된 프라이머 신장 분해 산물은 프라이머와 신장 절편을 함유하며, 세척은 고정화되지 않은 종을 제거하기에 효과적이다)(d),
절단가능한 부위를 절단하여 신장 절편을 방출하는 단계(e),
신장 절편을 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법으로 사이징함으로써 절단이 이의 상응하는 프라이머 신장 분해 산물의 판독 길이에 비례하여 임의의 주어진 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(f),
단계 (a) 내지 단계 (f)를 4개의 상이한 dNTPαS중 제2, 제3 및 제4 뉴클레오사이드로 반복하는 단계(g) 및
4개의 신장 반응 각각으로부터 수득한 신장 절편의 크기를 비교하여 표적 DNA의 DNA 서열을 결정하는 단계(h)를 포함하여, 표적 DNA 서열의 DNA 서열을 결정하는 방법이 제공된다.
진단 및 검출
진단
본원에 기술된 방법을 사용하여, DNA 샘플의 정확한(약 1% 이상 정확) 질량을 약 2000-머 이상의 DNA(약 650kDa 이상의 질량) 및 약 1200-머 이상의 RNA(약 400kDa 이상의 질량; 실시예 1)에 대해 수득할 수 있다. 또한, 일본쇄 및 이본쇄 핵산의 시그날을 스펙트럼에서 수득할 수 있다(도 3). IR-MALDI 질량 분석법(약 1% 이상의 정확성)에 의해 DNA 질량을 측정하는 개선된 방법은 핵산의 표준 아가로즈 겔 사이징(약 5%의 정확성)에 의해 수득한 것보다 우수하다. IR-MALDI 질량 스펙트럼(약 0.5% 이상의 정확성)에 의한 RNA 질량 측정의 정확성은 더욱 현저한데, 이는 겔 분석에 의한 RNA의 정확한 크기 측정이 곤란하고, 가능하지는 하지만, 부분적으로, 적합한 크기 마커의 부재 및 충분하게 적합한 겔 매트릭스의 부재에 기인한다.
본원에 기술된 방법을 사용하여 수득한 질량 범위내의 신장 이외에, 질량 스펙트럼을 위한 샘플의 제조에 요구되는 분석물 양은 본질적으로 단순한 제조 방법에 의해서도 낮은 펨토몰(fmol) 또는 아토몰(attomol) 범위 이하로 현저히 감소한다. 또한, 고체 매트릭스보다는 액체 매트릭스를 사용함으로써, 생성된 이온 시그날은 충분히 더욱 재생할 수 있다. 또한, 액체 매트릭스의 사용은 예를 들어 칩 배열의 다양한 부분내로 샘플 분산을 촉진시킨다. 더욱이, 액체 매트릭스를 IR-MALDI 질량 분석법과 함께 사용함으로써, IR-MALDI 분석 후에 표적상에 잔류하는 실질적으로 모든 샘플을 추가의 사용을 위해 회수할 수 있다.
진단 및 검출
IR-MALDI 질량 분석법에 의한 표적 생물학적 거대분자의 분자량을 측정하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 예를 들어, 분석하고자 하는 생물학적 거대분자, 및 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 IR-MALDI 조성물을 제조하고; IR-MALDI 질량 분석법에 의해 조성물에서 생물학적 거대분자를 분석함으로써 수행할 수 있다[참조: 실시예 1; 또한 Berkenkamp et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 11: 1399-1406(1997); Berkenkamp et al., Science 281: 260-262(1998)]. 표적 생물학적 거대분자의 분자량은 공지된 분자량을 갖는 하나 이상의 대조군 생물학적 거대분자를 나란히 또는 별도의 스펙트럼으로 작동시키고, 표적 스펙트럼을 대조군 생물학적 거대분자의 스펙트럼과 비교함으로써 측정한다. 상응하는 공지된 생물학적 거대분자일 수 있는 대조군 생물학적 거대분자는 일반적으로 표적 생물학적 거대분자와 동일한 유형의 분자이고, 예를 들어 핵산 또는 폴리펩타이드이다. 대조군 생물학적 거대분자는 표적 생물학적 거대분자의 분자량을 측정하기 위해 표적 생물학적 거대분자와 동일한 유형의 분자일 필요는 없다(실시예 1).
IR-MALDI 질량 스펙트럼은 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 생물학적 거대분자를 함유하는 조성물을 제조하고; 조성물에 대해 IR-MALDI 질량 분석법을 수행하여 조성물내의 표적 생물학적 거대분자를 동정하며, 이에 의해 표적 생물학적 거대분자를 검출함으로써 표적 생물학적 거대분자를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 경우에 따라, 표적 생물학적 거대분자는 생물학적 샘플에 존재하거나, 생물학적 샘플로부터 분리할 수 있다. 따라서, 생물학적 샘플에서 표적 생물학적 거대분자의 존재를 동정하는 방법이 또한 제공된다.
생물학적 샘플에서 표적 생물학적 거대분자(예: 핵산)의 존재는 핵산 분자(또는 생물학적 샘플로부터 분리된 핵산 분자)를 함유하는 생물학적 샘플과 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 IR-MALDI 조성물을 제조하고; IR-MALDI 질량 분석법으로 조성물을 분석함으로써 동정할 수 있다. 표적 핵산의 분자량을 갖는 핵산 분자의 검출은 생물학적 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 동정시켜 준다. 표적 생물학적 거대분자의 분자량은 대조군 스펙트럼과의 비교에 의해 측정되거나, 상응하는 공지된 생물학적 거대분자에 의해 생성된 스펙트럼을 기초로 하여 측정될 수 있다. 또는, 생물학적 거대분자의 서열을 측정함으로써 생물학적 거대분자의 존재를 동정할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 생물학적 샘플로부터 수득된 표적 생물학적 거대분자의 특성화를 가능케 하기 때문에, IR-MALDI 질량 분석법은 당해 질병 또는 당해 상태와 관련되는 표적 생물학적 거대분자의 특징을 검출함으로써 질병 또는 상태, 또는 질병 또는 상태에 대한 징후를 갖는 개체를 동정하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 시험하고자 하는 개체로부터 수득한 생물학적 거대분자와 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 IR-MALDI 조성물을 제조하고; 조성물에서 생물학적 거대분자 또는 생물학적 거대분자의 관련된 부분을 IR-MALDI 질량 분석법으로 분석함으로써 수행할 수 있다. 표적 생물학적 거대분자의 특정한 질량의 측정은 개체가 당해 질병 또는 상태, 또는 당해 질병이나 상태에 대한 징후를 갖는다는 것을 동정시켜 준다. 이러한 방법은 유전적 질병, 또는 박테리아 감염과 관련된 질병, 또는 이러한 질병에 대한 징후를 동정하는데 특히 유용하며, 또한 동일성, 유전성 또는 적합성을 측정하는데 유용하다. 본원에 기술된 추가의 방법은 예를 들어 개체로부터 수득한 표적 생물학적 거대분자의 서열을 측정하거나, 표적 생물학적 거대분자를 상응하는 공지된 생물학적 거대분자와 비교함으로써 이러한 진단에 유용하다.
IR-MALDI를 사용하는 상술된 방법은 예를 들어 칩과 같은 고체 지지체상에, 각각 하나 이상의 생물학적 거대분자를 함유하는 복수의 조성물을 침착시켜 배열을 형성함으로써 생물학적 거대분자의 하나 이상의 샘플, 특히 다수의 샘플을 분석하는데 적합하다. 또한, 상술된 방법은 액체 매트릭스를 함유하는 하나 또는 수개의 조성물에 함유된 복수의 생물학적 거대분자의 다중 분석에 적합하다. 복수의 각 생물학적 거대분자는 예를 들어 상이하게 질량 변형되어 다중 분석을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 당해 방법은 처리량이 많은 분석 포맷에 용이하게 적용할 수 있다.
IR-MALDI 방법에 의한 분석에 특히 적합한 생물학적 거대분자는 핵산, 폴리펩타이드, 탄수화물 또는 프로테오글리칸이거나, 단백질-단백질 복합체 또는 핵단백질 복합체 등의 거대분자 복합체일 수 있다. 분석을 위해, 표적 생물학적 거대분자는 예를 들어, 비이드, 편평한 표면, 칩, 모세관, 핀, 콤브 또는 웨이퍼일 수 있고 금속, 세라믹, 플라스틱, 수지, 겔 및 막을 포함하는 각종 물질일 수 있는 기질, 특히 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체는 규소 웨이퍼 또는 스테인레스 강의 편평한 표면일 수 있다. 본원에 기술된 방법은 처리량이 많은 분석물에서 다수의 표적 생물학적 거대분자를 분석하는데 특히 유용하기 때문에, 고체 지지체상에 배열로 복수의 표적 생물학적 거대분자를 고정화시키는데 특히 유용할 수 있다. 고정화는 광절단가능한 결합 또는 티올 결합 또는 수소 결합 등의 가역적 결합을 통해 이루어질 수 있고, 결합은 예를 들어 화학적 방법, 효소적 방법 또는 질량 분석법 공정을 포함하는 물리적 방법을 사용하여 절단할 수 있다.
표적 생물학적 거대분자가 핵산일 경우, 예를 들어 표적 핵산은 고체 지지체에 고정화되는 상보성 포획 핵산 분자와, 표적 핵산 분자를 함유하는 핵산 분자의 일부 사이의 하이브리드화(수소 결합)에 의해 고정화될 수 있다. 그러나, 본원에 기술된 일부 방법에 있어서, 표적 핵산을 함유하는 서열중 적어도 일부는, 포획 핵산과의 하이브리드화를 통해 고정화되는 경우, 예를 들어 검출기 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산 서열과 하이브리드화되는 경우, 표적 핵산의 하이브리드화 부분과 달라야 된다는 것을 인지해야 한다.
표적 생물학적 거대분자가 폴리펩타이드인 경우, 이는 고체 지지체에 접합되고 표적 폴리펩타이드의 적어도 일부 또는 표적 폴리펩타이드에 결합된 태그와 특이적으로 상호작용하는 시약에 결합시킴으로써 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 이러한 시약은 예를 들어 표적 폴리펩타이드의 에피토프에 결합하는 항체이거나, 예를 들어 표적 폴리펩타이드에 함유된 폴리히스티딘 서열 태그에 결합하는 니켈 이온일 수 있다. 폴리히스티딘 태그와 같은 태그 펩타이드는 예를 들어 시험관내 전사 또는 해독 방법에 의해 제조되는 표적 폴리펩타이드내로 편리하게 도입할 수 있다.
분석하고자 하는 생물학적 거대분자는 IR-MALDI 질량 분석법 전에 조절할 수 있다. 조절은 예를 들어 질량 스펙트럼의 분해를 개선시킴으로써 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 특정한 생물학적 거대분자를 분석하는 능력을 개선시킨다. 경우에 따라, 생물학적 거대분자는 조절 전에 또는 질량 분석법 전에 분리할 수 있다.
표적 생물학적 거대분자는 예를 들어 알킬화제 또는 트리알킬실릴 클로라이드와 접촉시키거나 생물학적 거대분자내로 하나 이상의 질량 변형된 아단위를 도입함으로써 이온 교환에 의해 조절할 수 있다. 예를 들면, 생물학적 거대분자가 핵산인 경우, 표적 핵산은 양이온 교환 등의 포스포디에스테르 주쇄 변형에 의해; N7-데아자푸린 뉴클레오타이드, N9-데아자푸린 뉴클레오타이드 또는 2'-플루오로-2'-데옥시뉴클레오타이드(이들은 각각 탈푸린화에 대한 핵산의 감수성을 감소시킬 수 있다) 등의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 도입함으로써; 하나 이상의 질량 변형된 뉴클레오타이드의 도입에 의해 또는 표적 핵산을 함유하는 핵산 분자의 부분과 태그 프로브의 하이브리드화에 의해 조절할 수 있다(미국 특허 제5,547,835호).
복수의 표적 생물학적 거대분자에서 각 표적 생물학적 거대분자의 동일성을 측정하는 방법은 예를 들어 복수의 상이하게 질량 변형된 표적 생물학적 거대분자, 및 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 조성물을 제조하고; 각각 상이하게 질량 변형된 표적 생물학적 거대분자의 분자량을 IR-MALDI 질량 분석법으로 복수로 측정하며; 복수의 상이하게 질량 변형된 표적 생물학적 거대분자의 분자량을 상응하는 공지된 생물학적 거대분자 또는 이의 단편의 분자량과 비교하여 수행할 수 있다. 이러한 방법을 생물학적 거대분자의 단편인 복수의 표적 생물학적 거대분자를 사용하여 수행하는 경우, 상기 단편은 생물학적 거대분자의 형성에 관여하는 결합, 특히 생물학적 거대분자의 단량체 아단위 사이의 결합을 절단하는 하나 이상의 단편화제에 생물학적 거대분자를 접촉시켜 단편 표적 생물학적 거대분자를 제조함으로써 제조할 수 있다.
IR-MALDI 질량 분석법으로 분석되는 표적 핵산은 생물학적 샘플내에 존재하거나, 경우에 따라, 분석 전에 증폭시킨 다음 IR-MALDI 질량 분석법으로 직접 분석할 수 있다. 또는, 증폭된 핵산 분자는 증폭된 핵산에 존재하는 표적 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있는 검출기 올리고뉴클레오타이드에 접촉시킬 수 있고; IR-MALDI 조성물은 반응 산물을 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 혼합하여 제조할 수 있으며; IR-MALDI 질량 분석법을 수행할 수 있다. 검출기 올리고뉴클레오타이드와 증폭된 표적 핵산과의 하이브리드화에 의해 형성되는 이중나선 핵산 분자의 검출은 생물학적 샘플에서 표적 핵산의 존재를 동정시켜 준다.
표적 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자의 증폭은 공지된 방법 및 상업적으로 이용가능한 키트를 사용하여 수행할 수 있다. 증폭은 열안정성 폴리머라제일 수 있는 폴리머라제, 예를 들어 Taq DNA 폴리머라제, AmpliTaq FS DNA 폴리머라제, Deep Vent(exo-) DNA 폴리머라제, Vent DNA 폴리머라제, Vent (exo-) DNA 폴리머라제, Deep Vent DNA 폴리머라제, Thermo Sequenase, exo(-) 슈도모나스 푸리오수스(Pseudococcus furiosus) (Pfu) DNA 폴리머라제, AmpliTaq, Ultman, 9°Nm, Tth, Hot Tub, 피로콕쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)(Pfu) 또는 피로콕쿠스 우에세이(Pyrococcus woesei) (Pwo) DNA 폴리머라제를 사용할 수 있다. 증폭 방법에는, 역전사 PCR(RT-PCR; Higuchi et al., Bio/Technology 11: 1026-1030(1993)] 및 대립인자-특이적 증폭을 포함하여, 폴리머라제 연쇄 반응[참조: Newton and Graham, PCR(BIOS Publ. 1994)]; 핵산 서열 기본된 증폭; 전사-기본된 증폭 시스템; 자가-지연된 서열 복제; Q-베타 리플리카제 기본된 증폭; 결합 증폭 반응; 리가제 연쇄 반응[참조: Wiedmann et al., PCR Meth. Appl. 3: 57-64(1994); Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88, 189-93(1991)]; 스트랜드 치환 증폭[참조: Walker et al., Nucl. Acids Res. 22: 2670-77(1994)] 및 이들 방법의 변형이 포함된다.
표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열이 PCR에 의해 증폭되는 경우, 공지된 반응 조건이 사용된다. 증폭 반응의 최소 성분에는 주형 DNA 분자; 각각 주형 DNA 분자 또는 이에 결합된 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화할 수 있는 전방 프라이머 및 후방 프라이머; 각각의 4개의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 또는 이의 적합한 동족체; DNA 폴리머라제와 같은 중합용 제제; 및 적절한 pH, 이온 강도, 보조인자 등을 갖는 완충제가 포함된다. 일반적으로, 각각 변성 단계, 어닐링 단계 및 신장 단계를 포함하는 약 25 내지 30사이클의 증폭이 수행되지만, 반응에 존재하는 주형 DNA 분자의 양에 따라 보다 적은 사이클로 충분하거나 보다 많은 사이클이 요구될 수 있다. PCR 반응 조건의 예는 미국 특허 제5,604,099호에 기술되어 있다.
핵산 서열은 미국 특허 제5,545,539호에 기재된 PCR을 사용하여 증폭시킬 수 있는데, 이는 증폭 반응 혼합물에 유효량의 글리신계 삼투물을 포함시킴으로써 표적 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 기본적인 공정을 개선시킨다. 글리신계 삼투물의 사용은 G 및 C 잔기가 풍부한 서열의 증폭을 개선시키며, 따라서 예를 들어 취약 X 증후군(CGG 반복체) 및 후천성 근경직증(CTG 반복체)와 관련된 것과 같은 트리뉴클레오타이드 반복체 서열을 증폭시키는데 유용할 수 있다.
생물학적 샘플내의 표적 핵산 서열의 존재는 표적 핵산을 함유하는, 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 핵산 분자를 하나 이상의 뉴클레아제로 특이적으로 분해시키고; 고체 지지체에 고정화될 수 있고 표적 핵산의 분해된 단편과 하이브리드화할 수 있는 상보성 포획 핵산 서열과 분해된 핵산 분자를 하이브리드화하며; 고정화된 단편과 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 IR-MALDI 조성물을 제조하고; 고정화된 단편을 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 동정함으로써 동정될 수 있다[참조: 국제 공보 제WO 96/29431호 및 제WO 98/20019호]. 상보성 포획 핵산 서열과의 하이브리드화에 의해 고정화된 핵산 단편의 검출은 생물학적 샘플에서 표적 핵산 서열의 존재를 동정시켜 준다. 핵산 단편의 고정화는 IR-MALDI를 수행하기 전에, 또는 예를 들어 IR-MALDI중에 IR 절단가능한 결합의 절단에 기인하여 IR-MALDI 질량 분석법의 결과로서 전환될 수 있다.
생물학적 샘플내의 표적 핵산 서열의 존재는 표적 핵산을 함유하는 핵산 분자의 일부를 증폭시킬 수 있는 제1 프라이머 세트를 사용하여, 생물학적 샘플로부터 수득한 핵산 분자에 대해 제1 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하고; 제1 증폭 산물과 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 조성물을 제조하며; 조성물내의 제1 증폭 산물을 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 검출하여 생물학적 샘플내의 표적 핵산의 존재를 검출함으로써 수행할 수 있다. 이러한 방법은, 표적 핵산을 함유하는 제1 증폭 산물의 일부분 이상을 증폭시킬 수 있는 제2 프라이머 세트를 사용하여 IR-MALDI를 수행하기 전에 제1 증폭 산물에 대해 제2 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하는 것을 포함할 수 있다(국제 공보 제WO 98/20019호).
예를 들면, 뉴클레오타이드 서열내의 돌연변이를 검출하기 위해 생물학적 샘플에서 아단위의 동일성을 측정하는 방법이 제공된다. 표적 뉴클레오타이드의 동일성은, 표적 뉴클레오타이드를 함유하는 핵산 분자를, 표적 뉴클레오타이드에 인접한 부위에서 핵산 분자에 상보성인 프라이머 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하고; 하이브리드화된 핵산 분자를 완전한 세트의 디데옥시뉴클레오사이드 또는 3'-데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 의존성 DNA 폴리머라제와 접촉시켜, 표적 뉴클레오타이드에 상보성인 단지 디데옥시뉴클레오사이드 또는 3'-데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트만을 프라이머로 신장시키며; 신장된 프라이머와 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 포함하는 IR-MALDI 조성물을 제조하고; 조성물내의 신장된 프라이머를 IR-MALDI 질량 분석법으로 검출함으로써 측정할 수 있다. 표적 뉴클레오타이드의 동일성은 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정된 바와 같이, 신장된 프라이머에 존재하는 디데옥시뉴클레오사이드 또는 3'-데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트에 기초하여 측정된다.
표적 핵산 서열내의 돌연변이의 존재 또는 부재는, 표적 핵산 서열을 함유하는 핵산 분자를 하나 이상의 프라이머(여기서, 프라이머는 표적 핵산 서열에 상보성인 3' 말단 염기를 갖는다)와 하이브리드화시키고; 하이브리드화된 핵산을 적절한 폴리머라제 효소 및 연속적으로 4개의 뉴클레오사이드 트리포스페이트중 하나의 뉴클레오사이드 트리포스페이트와 접촉시키며; 반응 산물과 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 조성물을 제조하고; 조성물내의 산물을 IR-MALDI 질량 분석법으로 검출함으로써 측정할 수 있다. 산물의 분자량에 기초하여, 표적 핵산 분자에서 프라이머의 3' 말단에 인접한 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정할 수 있다(국제 PCT 특허원 제WO 98/20019호).
표적 핵산 분자내의 돌연변이는 또한, 표적 핵산 분자를 올리고뉴클레오타이드 프로브와 하이브리드화시켜 하이브리드화된 핵산을 제조하고(여기서, 미스매치는 돌연변이 부위에서 형성된다); 하이브리드화된 핵산을 일본쇄 특이적 엔도뉴클레아제와 접촉시키며; 반응 산물과 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 조성물을 제조하고; 상기 조성물을 IR-MALDI 질량 분석법으로 분석함으로써 검출할 수 있다. 이 방법에서 사용된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 표적 핵산에 상응하는 정상 (돌연변이되지 않은) 핵산 서열내에 예상된 서열을 갖는다. 조성물에서 하나 이상의 핵산 단편의 IR-MALDI 질량 분석법에 의한 검출은 미스매치가 표적 핵산과 올리고뉴클레오타이드 프로브 사이에서 형성된 하이브리드화 산물에 존재하고, 따라서 표적 핵산 분자가 돌연변이를 함유한다는 것을 나타낸다(국제 공보 제WO 98/20019호).
표적 핵산 서열내의 돌연변이의 존재 또는 부재는 또한, 표적 핵산 서열을 연결 추출물 세트 및 DNA 리가제와 함께 함유하는 핵산 분자에 대해 1회 이상의 하이브리드화를 수행하고; 반응 산물과 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 조성물을 제조하며; 조성물을 IR-MALDI 질량 분석법으로 분석함으로써 동정할 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 조성물에서 결합 산물의 검출은 표적 핵산 서열내의 돌연변이의 부재를 동정시켜 주며, 조성물에서 연결 추출물 세트의 검출은 표적 핵산 서열내의 돌연변이의 존재를 동정시켜 준다.
상술된 바와 같이, 결합 산물의 존재를 IR-MALDI 질량 분석법으로 검출하는 방법은 또한, 표적 핵산을 연결 추출물 세트 및 열안정성 DNA 리가제와 함께 함유하는 핵산 분자에 대해 1회 이상의 하이브리드화를 수행하고; 반응 산물과 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 조성물을 제조하며; 상기 조성물내의 결합 산물을 IR-MALDI 질량 분석법으로 동정함으로써 표적 핵산의 존재를 검출할 수 있다. 결합 산물의 형성은 표적 핵산의 존재를 나타낸다.
본원에 기술된 방법은 표적 폴리펩타이드의 특정한 펩타이드 단편의 질량과 상응하는 공지된 폴리펩타이드의 상응하는 펩타이드 단편의 질량을 비교함으로써 표적 폴리펩타이드의 동일성을 측정하기 위한 IR-MALDI 질량 분석법의 사용 방법을 제공한다. 이러한 방법은 예를 들어 시험관내 해독, 또는 시험관내 해독후 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 해독에 의해 표적 폴리펩타이드를 수득하고; 해독된 폴리펩타이드를, 당해 폴리펩타이드내의 하나 이상의 펩타이드 결합을 절단하는 하나 이상의 단편화제와 접촉시키며; 펩타이드 단편과 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 함유하는 IR-MALDI 조성물을 제조하고; 하나 이상의 펩타이드 단편의 분자량을 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정하며; 펩타이드 단편의 분자량을 상응하는 공지된 폴리펩타이드의 펩타이드 단편의 분자량과 비교함으로써 수행할 수 있다. 상응하는 공지된 폴리펩타이드의 펩타이드 단편의 질량은 표적 폴리펩타이드와의 병해 반응(여기서, 상응하는 공지된 폴리펩타이드는 또한 상기 제제와 접촉된다)으로 측정할 수 있고; 특정한 절단제와 접촉된 상응하는 공지된 폴리펩타이드의 펩타이드 단편의 공지된 질량과 비교할 수 있거나; 폴리펩타이드의 펩타이드 단편의 분자량을 측정하는 알고리즘을 사용하여 폴리펩타이드 서열 정보의 데이타베이스로부터 수득할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 돌연변이의 동정, 따라서 특정한 유전적 질병, 예를 들어 이러한 돌연변이가 조숙 단백질 절단을 유발하기 때문에 유전자의 개방 판독 프레임내로 STOP 코돈을 도입하는 단일 염기 돌연변이; 또는 상이한 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드가 이들의 질량에 기초하여 구별될 수 있기 때문에 다형성 유전자의 대립인자 변이체에서 암호화된 아미노산의 변화, 예를 들어 아미노산 알라닌을 글리신으로 변화시키는 단일 염기 변화의 스크리닝에 특히 유용하다.
표적 폴리펩타이드를 분석하여 암호화 핵산에 관한 정보를 수득하기 위해 IR-MALDI을 사용하는 방법은 이러한 반복체에 의해 암호화된 표적 폴리펩타이드의 동일성을 측정함으로써 뉴클레오타이드 반복체의 존재, 특히 비정상적인 뉴클레오타이드 반복체 수를 동정하는데 사용될 수 있다. 비정상적인 뉴클레오타이드 수는 IR-MALDI 질량 분석법을 사용하여 표적 폴리펩타이드의 질량과 상응하는 공지된 폴리펩타이드의 질량을 비교함으로써 동정할 수 있다.
표적 폴리펩타이드는 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자를 시험관내에서 해독함으로써 수득할 수 있다. 경우에 따라, RNA 분자는 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 시험관내에서 전사함으로써 수득할 수 있다. 표적 폴리펩타이드의 해독은 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자를 시험관내 해독 반응에 도입하거나, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자를 시험관내 전사/해독 반응 또는 시험관내 전사 반응에 도입한 다음 RNA를 시험관내 해독 반응으로 이동시킴으로써 수행할 수 있다.
시험관내 전사 및 시험관내 해독은 본 기술분야에 공지되어 있고, 상업상 이용가능하다. 시험관내 해독 시스템은 래빗 망상적혈구 용해질, 래빗 난모세포 용해질, 사람 세포 용해질, 곤충 세포 용해질 및 밀 배아 추출물 등과 같은 진핵세포 용해질이 포함된다. 이러한 용해질 및 추출물은 제조할 수 있거나 상업상 입수할 수 있다[참조: Promega Corp.; Stra태그ene, La Jolla CA; Amersham, Arlington Heights IL; and GIBCO/BRL, Grand Island NY]. 시험관내 해독 시스템은 일반적으로 효소 등의 분자; 해독, 개시 및 신장 인자; 화학적 시약 및 리보솜을 함유한다. 정제된 해독 인자의 혼합물 뿐만 아니라, 개시 인자-1(IF-1), IF-2, IF-3(알파 또는 베타), 신장 인자 T(EF-Tu) 또는 종결 인자 등의 정제된 해독 인자가 보충된 용해질의 배합물 또는 용해질을 시험관내 mRNA 해독을 위해 또한 사용할 수 있다. 경우에 따라, 배양은 연속 방식으로 수행함으로써, 문헌[참조: Spirin et al. (Science 242: 1162-64(1988)]에 기술된 바와 같이 연속 유동 시스템을 사용하여, 시약을 시스템내로 유동시키고 미완성 폴리펩타이드를 제거하거나 축적시킨다. 이러한 방법은 미완성 폴리펩타이드의 대규모 제조에 바람직할 수 있다.
망상적혈구를 사용하는 시험관내 해독 반응은 예를 들어 망상적혈구 용해질 10㎕를 스페르미딘, 크레아틴 포스페이트, 아미노산, HEPES 완충제(pH 7.4), KCl, MgAc 및 해독되는 RNA와 혼합하고, 적절한 시간, 일반적으로 1시간 동안 30℃에서 배양하여 수행할 수 있다. 효율적인 해독을 수득하기 위한 MgAc의 최적량은 망상적혈구 용해질의 제조에 따라 달라지며, RNA의 표준 제조 및 약 1mM 이하의 MgAc 농도를 사용하여 측정할 수 있다. 또한, KCl의 최적 농도는 특정한 반응에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 70mM KCl은 일반적으로 캡핑된 RNA의 해독에 가장 적합한 반면, 40mM KCl은 일반적으로 캡핑되지 않은 RNA의 해독에 가장 적합하다.
밀 배아 추출물은 문헌[참조: Roberts and Paterson (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 70: 2330-2334(1973)]에 기술된 바와 같이 제조할 수 있고, 경우에 따라 문헌[참조: Anderson, Meth. Enzymol. 101: 635(1983)]에 기술된 바와 같이 변형시킬 수 있다. 이 프로토콜은 또한 제조 프로토콜 L418(Promega Corp.)에 따라 변형시킬 수 있다. 일반적으로, 밀 배아 추출물은 추출 완충제에서 밀 배아를 연마한 다음 원심분리하여 세포 단편을 제거함으로써 제조한다. 상청액은 내생 아미노산 및 해독을 억제하는 식물 안료로부터 크로마토그래피에 의해 분리한다. 추출물은 또한 마이크로콕칼 뉴클레아제로 처리하여 내생 mRNA를 파괴시킴으로써 배경 해독을 최소한으로 감소시킨다. 밀 배아 추출물은 tRNA, rRNA 및 개시, 신장 및 종결 인자를 포함하여 단백질 합성에 필요한 세포 성분을 함유한다. 추출물은 또한 포스포크레아틴 키나제 및 포스포크레아틴 등의 에너지 발생 시스템을 가하여 최적화시킬 수 있으며; MgAc는 대부분의 mRNA 종의 경우 일반적으로 약 6.0 내지 7.5mM 마그네슘이 권장되며[참조: Erickson and Blobel Meth. Enzymol. 96:38(1982)], 예를 들어 최종 이온 농도를 2.6mM 마그네슘 및 140mM 칼륨으로 조절하고 조성물을 pH 7.5로 조절함으로써 변형시킬 수 있다(미국 특허 제4,983,521호). 또한, 밀 배아 추출물내의 해독은 미국 특허 제5,492,817호에 기술된 바와 같이 수행한다. 최적 시험관내 조건 또는 반응 정도를 측정하기 위해, 시험관내 시스템에서의 mRNA 해독을 예를 들어 질량 분석법에 의해 모니터할 수 있다. 또한, 예를 들어35S-메티오닌 등과 같은 하나 이상의 방사성 아미노산을 가하고, TCA 등으로 용해질내의 단백질을 침전시켜 해독 산물내로 방사표지의 도입을 측정하며, 배양중 각종 시간에서 침전물내에 존재하는 방사능 양을 계수함으로써 모니터링을 수행할 수 있다. 또한, 해독 산물은 면역침강 또는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988)]에 의해 분석할 수 있다. 또한, 표지된 비방사성 아미노산을 미완성 폴리펩타이드내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 해독 반응은 미스-아미노아크릴화 tRNA를 함유할 수 있다(미국 특허 제5,643,722호). 비-방사성 마커는 tRNA 분자로 미스-아미노아크릴화될 수 있고, tRNA 아미노산 복합체는 해독 시스템에 첨가된다. 이 시스템을 항온처리하여 비-방사성 마커를 미완성 폴리펩타이드내로 도입하고, 마커를 함유하는 폴리펩타이드는 마커에 적절한 검출 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 폴리펩타이드의 분리를 촉진시키기 위해 tRNA 분자의 미스-아미노아크릴화를 사용하여 마커를 폴리펩타이드에 가할 수 있다. 이러한 마커에는 예를 들어 비오틴, 스트렙트아비딘 및 이의 유도체가 포함된다(미국 특허 제5,643,722호).
시험관내 전사 및 해독 반응은 또한 예를 들어 커플링된 전사/해독 시스템(Promega Corp, catalog # L4606, # 4610 또는 # 4950) 등의 상업상 입수가능한 시스템을 사용하여 동시에 수행할 수 있다. RNA 폴리머라제 및 진핵 용해질을 사용하는 커플링된 전사 및 해독 시스템은 미국 특허 제5,324,637호에 기술되어 있다. 커플링된 시험관내 전사 및 해독은 또한 박테리아 시스템, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) S30 세포-비함유 추출물[참조: Zubay, Ann. Rev. Genet. 7: 267(1973)] 등의 원핵세포 시스템을 사용하여 수행할 수 있다.
또한, 표적 폴리펩타이드는 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로 형질전환되고 이를 발현하는 숙주 세포로부터 수득할 수 있다. 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 예를 들어 PCR에 의해 증폭시켜 발현 벡터내로 삽입할 수 있고, 발현 벡터는 표적 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 발현시키기에 적합한 숙주 세포내로 도입할 수 있다. 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 포유류 세포(예: 사람 세포), 또는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이일 수 있다. 진핵세포 및 원핵세포 발현 벡터는 본 기술분야에 공지되어 있고, 상업상 공급원으로부터 수득할 수 있다. 숙주 세포를 발현시킨 후, 표적 폴리펩타이드는 본원에 기술된 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 예를 들면, 표적 폴리펩타이드가 폴리히스티딘 태그 펩타이드와 융합되는 경우, 표적 폴리펩타이드는 킬레이트화된 니켈 이온 컬럼상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
표적 폴리펩타이드는 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 증폭된 핵산으로부터 제조할 수 있다. 표적 폴리펩타이드가 예를 들어 증폭된 핵산으로부터 제조되는 경우, 하나 이상의 전사 또는 해독 조절 인자를 핵산 또는 암호화된 폴리펩타이드에 작동적으로 결합시킬 수 있다. 따라서, 전방향 또는 역방향 PCR 프라이머는 경우에 따라 프로모터의 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 박테리오파지 프로모터(예: SP6, T3 또는 T7 프로모터)를 함유할 수 있다. 이러한 프라이머를 사용하는 핵산의 증폭은 프로모터에 작동적으로 결합된 증폭된 핵산을 생성하며, 즉 프로모터는 프로모터의 작용을 수행하도록 증폭된 핵산내에 위치한다. 이러한 핵산을 시험관내 전사 반응에 사용하여 증폭된 표적 핵산 서열을 전사시킬 수 있다.
프라이머, 예를 들어 전방향 프라이머는 또한 원핵세포 또는 진핵세포 시스템에서 RNA의 해독에 필요한 조절 서열 인자를 함유할 수 있다. 특히, 원핵세포 해독 시스템에서 해독 반응을 수행하는데 바람직한 경우, 프라이머는 프로모터 서열의 하부에 및 개시 코돈의 상부 약 5 내지 10개 뉴클레오타이드에 위치하는 작동적으로 결합된 원핵세포 리보솜 결합 서열(Shine-Dalgarno 서열)을 함유할 수 있다.
프라이머는 또한 적합한 경우, 목적하는 판독 프레임과 함께 프레임내에 존재하는 작동적으로 결합된 ATG 코돈을 함유하는 증폭된 표적 서열이 표적 핵산의 증폭에 의해 생성되도록, 프로모터의 하부에 위치된 개시 (ATG) 코돈 또는 이의 보체를 함유할 수 있다. 판독 프레임은 천연 판독 프레임일 수 있거나, 기타 다른 판독 프레임일 수 있다. 표적 폴리펩타이드가 천연 폴리펩타이드가 아닌 경우, 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 개시 코돈을 작동적으로 결합시킴으로써 목적하는 판독 프레임에서 표적 폴리펩타이드가 해독된다.
프라이머, 일반적으로 역방향 프라이머는 하나 이상의 판독 프레임내에 STOP 코돈을 암호화하는 서열을 함유하여 표적 폴리펩타이드의 적절한 종결을 보장할 수 있다. 추가로, 3개의 STOP 코돈을 암호화하는 역방향 프라이머 서열내로 도입함으로써, 임의로 몇개의 잔기에 의해 분리된 3개의 가능한 판독 프레임내의 하나, 즉 폴리펩타이드의 조기 종결을 발생시키는 돌연변이의 하부(3')에서 발생하는 추가의 돌연변이를 검출할 수 있다.
또한, 전방향 또는 역방향 프라이머는 뉴클레오타이드 서열, 또는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 보체(존재하는 경우, 역방향 프라이머내에)를 함유할 수 있다. 제2 폴리펩타이드는 특정한 시약과 특이적으로 상호작용하는 태그 펩타이드, 예를 들어 항체일 수 있다. 제2 폴리펩타이드는 또한 차단되지 않은 및 반응성의 아미노 말단 또는 카복시 말단일 수 있다.
목적하는 표적 폴리펩타이드 또는 기타 폴리펩타이드와 태그 펩타이드를 융합시키면, 폴리펩타이드가 검출되고 분리된다. 태그 펩타이드를 암호화하는 서열에 프레임내에서 결합된 핵산에 의해 암호화된 표적 폴리펩타이드는 태그 펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 시약을 사용하여 시험관내 해독 반응 혼합물로부터 분리한 다음, 분해된 표적 폴리펩타이드를 본원에 기술된 바와 같이 IR-MALDI 질량 분석법으로 처리할 수 있다. 태그 펩타이드 또는 기타 제2 폴리펩타이드와 융합된 분리된 표적 폴리펩타이드는 충분히 정제된 형태로 존재하여 IR-MALDI 질량 분석법을 가능케 하는데, 이는 태그 펩타이드의 질량이 공지되어 결정시 고려될 수 있다는 것을 인지해야 한다.
일반적으로 플라스미드내에 함유된, 이러한 태그 펩타이드를 암호화하는 다수의 태그 펩타이드 및 핵산 서열은 공지되어 있고 상업상 입수가능하다(NOVAGEN). 임의의 펩타이드를 태그로서 사용할 수 있고, 단 태그 펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 항체 등의 시약은 입수가능하거나 제조할 수 있고, 동정할 수 있다. 빈번히 사용되는 태그 펩타이드는 c-myc로부터 10개의 아미노산 서열을 포함하는 myc 에피토프[참조: Ellison et al., J. Biol. Chem. 266: 21150-21157(1991)]; pFLAG 시스템(International Biotechnologies, Inc.), pEZZ-단백질 A 시스템(Pharmacia); 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) 헤마글루티닌 단백질의 16개 아미노산 펩타이드 부분; GST 폴리펩타이드; 및 폴리히스티딘 펩타이드가 포함되는데, 이들은 일반적으로 약 4개 내지 12개 또는 그 이상의 연속하는 His 잔기, 예를 들어 6개의 His 잔기를 포함하는 His-6를 함유한다. 태그 펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 시약은 본 기술분야에 공지되어 있고 상업상 입수할 수 있으며, 태그에 따라 항체 및 각종 기타 분자, 예를 들어 His-6 펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 니켈 또는 코발트 이온 등의 금속 이온; 또는 아가로즈 등의 고체 지지체에 접합하고 GST와 특이적으로 상호작용하는 글루타티온이 포함된다.
제2 폴리펩타이드는 표적 핵산에 의해 암호화된 표적 폴리펩타이드의 질량 변형제로서 사용하기 위해 고안될 수 있다. 따라서, 표적 폴리펩타이드는, 질량 변형 서열이 융합 폴리펩타이드의 아미노 말단 또는 카복실 말단에 존재할 수 있는 경우, 질량 변형 아미노산 말단에 작동적으로 결합된 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA를 해독함으로써 질량 변형시킬 수 있다. 이러한 재조합체 핵산으로부터 유도된 폴리펩타이드의 질량 변형은, 이러한 질량 변형이 질량 스펙트럼의 분해능을 증가시키고 다중화에 의한 2개 이상의 상이한 표적 폴리펩타이드의 분석을 가능하게 하기 때문에 예를 들어 몇개의 폴리펩타이드가 단일 IR-MALDI 질량 분석법으로 분석되는 경우에 유용하다.
태그된 펩타이드
폴리펩타이드는 표적 펩타이드에 펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편을 부가함으로써 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 표적 폴리펩타이드는 표적 폴리펩타이드를 해독하여 폴리히스티딘, 폴리리신 또는 폴리아르기닌 등의 추가의 아미노산을 포함시킴으로써 변형시킬 수 있다. 이들 변형은 정제, 동정 및 고정화(및 또한 IR 질량 분석법)을 보조하기 위해 사용한다. 변형은 또한 해독후 부가되거나, 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵의 서열을 함유하는 재조합 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
복수의 표적 폴리펩타이드가 상이하게 질량 변형되는 경우, 복수의 각 표적 폴리펩타이드는 예를 들어 상이한 폴리히스티딘 서열, 예를 들어 His-4, His-5, His-6 등을 사용하여 질량 변형될 수 있다. 이러한 질량 변형 잔기의 사용은 예를 들어 당해 잔기가 이에 결합된 표적 폴리펩타이드를 분리하는데 유용할 수 있는 태그 펩타이드로서 작용한다는 점에서 추가의 잇점을 제공한다. 따라서, 기술된 방법은 다중화를 복수의 폴리펩타이드에 대해 수행되도록 하며, 따라서 복수의 폴리펩타이드, 특히 복수의 표적 폴리펩타이드의 각 아미노산 서열을 측정하는데 유용하다.
증폭용 프라이머는, 증폭 반응이 전사 및 해독시 비-천연 폴리펩타이드, 예를 들어 천연 폴리펩타이드를 암호화하는 판독 프레임이 아닌 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 발생시키는 핵산을 생성하도록 선택될 수 있다. 따라서, 적절한 프라이머 설계, 특히 목적하는 판독 프레임내에 개시 코돈 및 경우에 따라 프라이머내에 하부 프라이머를 포함시킴으로써, 표적 핵산으로부터 생성된 폴리펩타이드는 핵산의 2개 비-암호화 프레임중 하나에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 방법은, 단백질을 조기에 절단하고 관련된 아미노산을 제거하여 아미노산 반복체를 함유하는 폴리펩타이드를 더욱 가용성으로 만드는 프레임 STOP 코돈 외부로 이동시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기술된 변형을 수행하는데 유용한 프라이머는 상업적 공급원으로부터 수득하거나, 예를 들어 포스포디에스테르 방법[참조: Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90(1979); 미국 특허 제4,356,270호; 미국 특허 제5,547,835호; 제5,605,798호 및 제5,622,824호]를 사용하여 합성할 수 있다.
비-천연 표적 폴리펩타이드는 또한 핵산의 엑손 영역의 5' 또는 3' 비-암호화 영역; 인트론; 또는 6개 프레임중 하나(스트랜드당 3개 프레임)에 개방 판독 프레임의 적어도 일부를 함유하는 프로모터 서열 등의 조절 인자에 의해 암호화될 수 있다. 이들 상황하에서, 표적 핵산의 증폭을 위한 특정한 프라이머는 프로모터 및 개시 코돈을 함유하여, 증폭된 핵산은 시험관내에서 전사 및 해독될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 표적 폴리펩타이드의 동일성을 측정하는 방법은 염색체의 모든 영역에 위치하는 뉴클레오타이드 서열의 동일성을 측정할 수 있게 하며, 단 2개 이상의 아미노산, 일반적으로 3개 또는 4개 이상의 아미노산, 특히 5개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드는 폴리뉴클레오타이드의 6개 프레임중 하나에 의해 암호화된다. 따라서, 본원에 기술된 방법은 공지되지 않은 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 측정하기 위해 직접적으로 사용되거나, 공지되지 않은 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 아미노산을 상응하는 공지된 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 비교함으로써 간접적으로 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열이 공지되지 않은 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 기초하여 측정되는 경우, 공지되지 않은 폴리뉴클레오타이드의 측정된 뉴클레오타이드 서열은 폴리펩타이드를 암호화하는 천연 뉴클레오타이드 서열과 동일할 수 있거나, 유전자 코드의 축퇴에 기인하여 천연 서열과 상이할 수 있다.
고안된 프라이머 올리고 염기 신장 방법(PROBE)을 본원에서 사용할 수 있다. 이 방법은 단일 검출 프라이머를 사용한 다음, IR-MALDI 질량 분석법에 의해 용이하게 분해될 수 있는 주어진 산물에 대한 올리고뉴클레오타이드 신장 단계를 사용한다. 이 산물은 다수의 반복 단위 또는 반복된 영역내에 2차 부위 돌연변이에 특이적인 다수의 염기에 의해 길이가 상이하다. 이 방법은 마이크로위성 DNA의 PROBE-MS 분석을 사용하여 예를 들어 동일성 측정, 돌연변이, 가족성 관계, HLA 적합성 및 기타 이러한 마커의 동정을 위해 유리하게 사용된다. 바람직한 양태에 있어서, 이 방법은 a) 2개의 개체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, b) 2개 이상의 마이크로위성 DNA 반복 서열을 함유하는 각 개체로부터 DNA의 영역을 증폭시키는 단계, c) 증폭된 DNA를 이온화/휘발시키는 단계, d) 증폭된 DNA의 존재를 검출하고 증폭된 DNA의 분자량을 비교하는 단계를 포함한다.
상이한 크기는 비-동일성(즉, 야생형 대 돌연변이), 비-유전성 또는 비-적합성을 나타내고; 유사한 크기의 단편은 가족성 관계의 가능한 동일성, 또는 HLA 적합성을 나타낸다. 하나 이상의 마커가 동시에 검사될 수 있으며, 상이한 링커 잔기를 갖는 프라이머가 고정화에 사용될 수 있다.
돌연변이 또는 통상의 다형성을 유발하는 질병에서 특히 우세한 돌연변이의 검출을 위해, LOOP-PROBE로 명명된 또다른 루프-프라이머 올리고 염기 신장 방법을 본원에 제공된 IR-MALDI 포맷에 사용할 수 있다. 특정한 양태에 있어서, 샘플내에서 표적 핵산을 검출하는 이 방법은 (i) 5' 말단이 표적화된 코돈으로부터 바로 하부에 있고, 이어서 β-글로빈의 경우에 Cfol 등의 독특한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 앰플리콘내로 도입하는 서열이 있는 표적 DNA의 부분과 동일성을 공유하고, 3'-말단 프라이머가 자가 복제성인 제1 프라이머, 및 (ii) 스트렙트아비딘 비이드 등의 고체 지지체에 DNA를 고정화시키기 위한 비오틴 등의 태그를 함유하는 제2 하부 프라이머를 사용하여 샘플에서 β-글로빈 등의 표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계(a);
링커 잔기를 통해 이본쇄 증폭된 DNA를 고체 지지체에 고정화시키는 단계(c);
고정화된 DNA를 변성시키고 고정화되지 않은 DNA 스트랜드를 분리하는 단계(d);
분리된 고정화되지 않은 DNA 스트랜드의 3'-말단에서 내부상보성 서열을 어닐링하여 3'-말단을 폴리머라제에 의해 신장시키는 단계(여기서, 어닐링은 예를 들어 가열한 다음 약 37℃로 냉각시키거나 기타 적합한 방법에 의해 수행할 수 있다)(e);
DNA 폴리머라제, 3dNTP/1 ddNTP를 부가하여 어닐링된 DNA를 신장시킴으로써 DNA 스트랜드의 3'-말단을 인접한 ddNTP 부위의 위치(즉, 돌연변이 부위)로 DNA에 의해 신장시키는 단계(f);
신장된 이본쇄 스템 루프 DNA를 독특한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 절단된 스템 루프 DNA를 제거하는 단계(g);
신장된 산물을 이온화/휘발시키는 단계(임의로 매트릭스, 특히 본원에 정의된 액체 매트릭스를 가한다)(i);
신장된 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계(여기서, 야생형과 상이한 질량의 DNA 단편의 존재는 표적 코돈(들)에서 돌연변이를 나타낸다)(j)를 포함한다.
이 방법은 MS 돌연변이 분석의 다른 방법과 비교하여 검출을 위한 한가지 특정한 시약을 제거함으로써, 당해 방법을 단순화시키고 자동화를 용이하게 한다. 또한, 분석되는 특정한 신장 산물이 프라이머로부터 절단되고, 따라서 다른 방법과 비교하여 더욱 짧아진다. 또한, 어닐링 효능은 부가된 프라이머의 어닐링과 비교하여 더욱 높고, 따라서 더욱 많은 산물을 생성시킨다. 이 방법은 다중화 및 각종 검출 도식에 적합하다(예를 들어, 단일 염기 신장, 올리고 염기 신장 및 서열 분석). 예를 들면, 루프-프라이머의 신장은 예를 들어 종 유형 뿐만 아니라 HLA 유형 또는 내성을 수행하기 위해 고도의 다형성 영역내에 짧은 진단 서열 분석 래더의 생성에 사용될 수 있다.
유전형 및 표현형
유전자, 특히 사람 유전자의 다형성 영역의 대립인자 변이체의 동일성을 측정하는 방법이 제공된다. 대립인자 변이체는 예를 들어 특정한 뉴클레오타이드의 치환에 의한 단일 뉴클레오타이드 또는 염기쌍의 동일성에서; 2개 이상의 뉴클레오타이드 또는 염기쌍에서; 또는 예를 들어 뉴클레오타이드 또는 트리뉴클레오타이드 반복체의 부가 또는 결실 또는 전좌와 같은 염색체 재배열에 기인하는 다수의 뉴클레오타이드에서 상이할 수 있다. 다형성 영역의 특이적 대립인자 변이체는 특정한 질병과 관련되고, 몇몇 경우에 당해 질병의 예후와 상호관련된다.
표현형의 유전적 정도를 측정하거나 당해 표현형의 소인을 동정하는 방법이 제공된다. 예를 들면, 이는 개체가 특정한 질병 또는 상태에 대한 소인을 갖는지의 여부, 즉 개체가 유전자의 다형성 영역의 특이적 대립인자 변이체와 관련된 질병 또는 상태를 갖거나 발병 위험이 있는지의 여부를 측정할 수 있다. 이러한 개체는 개체가 특정한 질병 또는 상태와 관련된 대립인자 변이체를 포함하는지의 여부를 측정함으로써 동정할 수 있다. 또한, 당해 질병이 휴지 질병인 경우, 개체가 특정한 질병 또는 상태와 관련된 유전자의 휴지 대립인자의 캐리어인지의 여부를 측정할 수 있다.
다수의 질병 또는 상태는 특정한 유전자, 및 더욱 특히 유전자의 특이적 돌연변이 또는 유전자 병변에 유전적으로 결합된다. 예를 들면, 암과 같은 과증식성 질병은 특이적 유전자의 돌연변이와 관련된다. 이러한 암에는, BRCA1 또는 BRCA2내의 돌연변이에 결합된 유방암이 포함된다. BRCA1의 돌연변이체 대립인자는 예를 들어 미국 특허 제5,622,829호에 기술되어 있다. 돌연변이되는 경우 암의 발병과 관련되는 종양 억제 유전자 등의 기타 유전자에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, p53(다양한 형태의 암과 관련됨); Rb(망막모세포종); WT1(빌름 종양) 및 c-myc 및 c-fos 등과 같은 각종 프로토-온코진[참조: Thompson and Thompson, Genetics in Medicine 5th ed.; Nora et al., Medical Genetics 4th ed. (Lea and Febiger, eds.]이 포함된다.
본원에 기술된 방법은, 또한 예를 들어 BRCA1 및 BRCA2에 의해 절단된 폴리펩타이드를 절단하는 DNA 돌연변이를 검출하는데 사용될 수 있다. 한가지 양태에 있어서, 이러한 돌연변이를 함유하는 핵산의 해독은 절단된 폴리펩타이드를 생성시키는데, 이는 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 상응하는 절단되지 않은 폴리펩타이드와 용이하게 구별할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 또한 개체, 예를 들어 기관 또는 골수 이식의 수용체 또는 공여체로서 간주되는 개체의 유전자형을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 개체내의 MHC 대립인자, 특히 HLA 대립인자의 동일성을 측정할 수 있다. 이러한 방법을 사용하여 수득한 정보는 이식편보다 상이한 이식 항원을 갖는 수용체에 대한 이식편의 이식이 이식편의 거부반응을 일으킬 수 있고 골수 이식후의 이식 대 숙주 질병을 일으킬 수 있기 때문에 유용하다.
의약에 대한 개체의 반응은 발색단 P450 시스템 등의 약물 변형 시스템내의 변화에 영향을 받을 수 있고, 특정한 감염성 질병에 대한 감수성은 유전적 상태에 의해 영향을 받을 수 있다. 약유전학에 관여하는 유전자는 공지되어 있다[참조: Nora et al., Medical Genetics 4th ed. (Lea and Febiger, eds.)]. 따라서, 특정한 대립인자 변이체의 동정은 특정한 약물에 대한 개체의 잠재적 반응성 또는 감염성 질병에 대한 개체의 감수성을 예상하는데 사용될 수 있다.
일부 다형성 영역은 특정한 질병 또는 상태와 무관할 수 있다. 예를 들면, 사람 게놈내의 많은 부위는 짧은 탠덤 반복체(STR) 영역을 함유한다. STR 부위는 길이가 3 내지 7개 염기쌍인 짧은 반복성 서열 요소를 함유한다. 200,000개의 예상된 삼량체 및 사량체 STR이 존재하는 것으로 평가되며, 이는 사람 게놈내에 15kb당 1회와 같이 빈번히 존재한다[참조: 국제 공보 제WO 92/13969호; Edwards et al., Nucl. Acids Res. 19: 4791 (1991); Beckmann et al., Genomics 12: 627-631 (1992)]. 이들 STR 부위중 거의 절반은 다형성인데, 이는 유전자 마커의 풍부한 공급원을 제공한다. 특정한 부위에서 다수의 반복체 단위의 변화는 가변 뉴클레오타이드 탠덤 반복체(VNTR) 부위[참조: Nakamura et al., Science 235: 1616-1622(1987)]; 보다 긴 반복체 단위를 함유하는 미니위성 부위[참조: Jeffreys et al., Nature 314: 67-73(1985)]; 및 미니위성 또는 디뉴클레오타이드 반복 부위[참조: Luty et al., Nucl. Acids Res. 19: 4308(1991); Litt et al., Nucl. Acids Res. 18: 4301(1990); Litt et al., Nucl. Acids Res. 18: 5921(1990); Luty et al., Amm. J. Hum. Genet. 46: 776-783(1990); Tautz, Nucl. Acids Res. 17: 6463-6471(1989); Weber et al., Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396(1989); Beckmann et al., Genomics 12: 627-631(1992)]의 관찰된 다형성 기억에 기인한다.
유전자의 다형성 STR 부위 및 기타 다형성 영역은 사람 동정, 부계 및 모계 시험, 유전자 맵핑, 이입 및 유전질 논쟁, 쌍생아의 접합자 시험, 사람의 동계교배 시험, 사람의 배양된 세포의 성질 조절, 사람 유족의 동정, 및 법의학에 있어서 정액 샘플, 혈액 오염 및 기타 물질의 시험을 위한 매우 유용한 마커이다. 이러한 부위는 또한 상업적 동물 육종 및 가계 분석에 있어서 및 상업적 식물 육종에 있어서 유용한 마커이다. 식물 작물 및 동물에 있어서 경제적으로 중요한 특질을 또한 다형성 DNA 마커를 사용하여 결합 분석을 통해 동정할 수 있다.
STR 부위는 표적화되는 탠덤 반복체를 플랭킹하는 영역에서 동정된 특이적 프라이머 서열을 사용하는 PCR에 의해 증폭시킬 수 있다. 이들 부위의 대립인자 형태는 증폭된 영역내에 함유된 반복 서열의 다수의 카피에 의해 구별된다. STR 부위의 예에는 사람 CD4 부위내의 펜타뉴클레오타이드 반복체[참조: Edwards et al., Nucl. Acids Res. 19: 4791(1991)]; 사람 아로마타제 세포질 P-450 유전자내의 테트라뉴클레오타이드 반복체[참조: CYP19; Polymeropoulos et al., Nucl. Acids Res. 19: 195(1991)]; 사람 응고 인자 XIII A 아단위 유전자내의 테트라뉴클레오타이드 반복체[참조: F13A1; Polymeropoulos et al., Nucl. Acids Res. 19: 4306(1991)]; F13B 부위내의 테트라뉴클레오타이드 반복체[참조: Nishimura et al., Nucl. Acids Res. 20: 1167(1992)]; 사람 c-les/fps, 프로토-온코진내의 테트라뉴클레오타이드[참조: FES; Polymeropoulos et al., Nucl. Acids Res. 19: 4018(1991)]; LFL 유전자내의 테트라뉴클레오타이드 반복체[참조: Zuliani et al., Nucl. Acids Res. 19: 4958(1990)]; 사람 췌장 포스포리파제 A-2 유전자내의 트리뉴클레오타이드 반복체 다형성[참조: PLA2; Polymeropoulos et al., Nucl. Acids Res. 18: 7468(1990)]; VWF 유전자내의 테트라뉴클레오타이드 반복체 다형성[참조: Ploos et al., Nucl. Acids Res. 18: 4957(1990)] 및 사람 티로이드 퍼옥시다제(hTPO) 부위내의 테트라뉴클레오타이드 반복체[참조: Anker et al., Hum. Mol. Genet. 1: 137(1992)]가 포함된다.
유전적 질병 및 감염성 질병의 진단
검출되는 표적 생물학적 거대분자에 따라, 본원에 기술된 방법은 유전자 질병 또는 염색체 이상의 진단; 비만, 아테롬성 동맥경화증, 당뇨병 또는 암 등의 유전자 영향 질병 또는 상태의 초기 징후의 예후; 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 진균을 포함하는 병원성 생물체에 의한 감염을 진단하게 하거나, 예를 들어 미니-위성 및 마이크로-위성의 분석에 기초하는 동일성 또는 유전성; 또는 예를 들어 HLA 표현형에 기초하는 조직적합성에 관한 정보를 제공한다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 IR-MALDI 질량 분석법을 사용하여 암호화 표적 핵산 또는 암호화된 표적 폴리펩타이드를 분석함으로써 비-발병된 개체의 유전자내의 반복체 수와 비교하여 10개 이상 내지 100개 이상의 추가의 트리뉴클레오타이드 반복체 범위일 수 있는 비정상적인 트리뉴클레오타이드 반복체 수를 특징으로 하는 유전적 병변을 검출하는 방법이 제공된다.
뉴클레오타이드 반복체에 의해 특징되는 유전적 병변과 관련된 질병에는 예를 들어 헌팅톤 질병, 전립선암, SCA-1, 취약 X 증후군[참조: Kremer et al., Science 252: 1711-14(1991); Fu et al., Cell 67: 1047-58(1991); Hirst et al., J. Med. Genet. 28: 824-29(1991)], 근긴장성 이영양증 유형 I[참조: Mahadevan et al., Science 255: 1253-55(1992); Brook et al., Cell 68: 799-808(1992)], 케네디 질병[참조: 또한 척수 및 구근 위축으로 불리움; La Spada et al., Nature 352: 77-79(1991)]; 마카도-요셉 질병 및 치아적색섬유 및 담창구 위축증이 포함된다. 비정상적인 삼중선 반복체 수는 암호화 영역, 엑손의 비-암호화 영역, 인트론 또는 프로모터 또는 기타 조절 인자를 포함하는 모든 유전자 영역에 위치할 수 있다. 예를 들면, 근긴장성 이영양증과 관련된 신장된 트리뉴클레오타이드 반복체는 염색체 19상의 MtPK 유전자의 3' 비해독된 영역(UTR)에서 발생한다. 이들 질병중 일부, 예를 들어 전립선암에 있어서, 트리뉴클레오타이드 반복체 수는 다수의 트리뉴클레오타이드 반복체가 불량한 예후와 관련되도록 질병의 예후와 긍정적으로 관련된다.
따라서, IR-MALDI 질량 분석법에 의해 핵산을 검출하는 방법은 예를 들어 혈우병, 지중해빈혈, 뒤시엔느 근경직증, 헌팅톤 질환, 알츠하이머 질환 및 낭포성 섬유증을 포함하여, 3000개 이상의 공지된 유전적 질병[참조: Cooper and Krawczak, "Human Genome Mutations"(BIOS Publ. 1993)] 또는 동정되는 기타 유전적 질병의 존재를 진단하는데 유용할 수 있다. 또한, 이 방법은 삼체성 21(다운 증후군), 삼체성 13(파타우 증후군), 삼체성 18(에드워드 증후군), 단체성 X(터너 증후군) 및 기타 성 염색체 이수성(예: 클리네펠터 증후군(XXY)) 등의 염색체 이상을 일으키는 특정한 선천성 결함을 진단하는데 유용할 수 있다. 이 방법은 또한 예를 들어 당뇨병, 아테롬성 동맥경화증, 비만, 각종 자가면역 질환 및 암(예: 결장암, 유방암, 난소암 및 폐암)을 포함하는 다수의 기타 질병에 대해 개체를 진단하거나, 특정한 의학적 치료에 대해 개체를 적합하게 하거나 부적합하게 할 수 있는 특정한 DNA 서열을 검출하는데 사용될 수 있다.
또는, 이 방법은 숙주 세포에 정상적으로 함유된 서열과 상이한 핵산 서열을 갖는, 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기타 감염성 생물체의 특징인 핵산을 검출하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 또한 동일성, 유전성 또는 적합성에 관한 정보를 제공하는 특징적인 핵산 서열을 검출하는데 사용될 수 있다.
사람 및 동물을 감염시키고 상술된 방법에 의해 검출할 수 있는 질병-유발 바이러스에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 레트로비리다에(Retroviridae), 예를 들어 사람 면역결핍 바이러스[예: HIV-1(또한 HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV로서 언급된다; Ratner et al., Nature 313: 227-284(1985); Wain Hobson et al., Cell 40: 9-17(1985)), HIV-2(Guyader et al., Nature 328: 662-669(1987); European Patent Publication No. 0 269 520; Chakrabarti et al., Nature 328: 543-547(1987); European Patent Application No. 0 655 501) 및 HIV-LP(국제 공보 제WO 94/00562호) 등의 기타 분리물]; 피코르나비리다에(Picornaviridae)[예: 폴리오바이러스, 간염 A 바이러스, (Gust et al., Intervirology 20: 1-7(1983); 엔테로바이러스, 사람 콕사키에 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스]; 칼시비리다에(Calciviridae)(예: 위장염을 유발하는 균주); 토가비리다에(예: 에퀸 엔세팔리티스 바이러스, 루벨라 바이러스); 플라비리다에(예: 덴구에 바이러스, 엔세팔리티스 바이러스, 황열병 바이러스, 코로나비리다에(coronaviridae)(예: 코로나바이러스), 라브도비리다에(예: 소포 위장 바이러스, 라비에스 바이러스); 필로비리다에(Filoviridae)(예: 에볼라 바이러스); 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae)(예: 파라인플루엔자 바이러스, 멈푸스 바이러스, 에아슬레스 바이러스, 호흡 합포체 바이러스); 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae)(예: 인플루엔자 바이러스); 분가비리다에(Bungaviridae)(예: 한타안 바이러스, 분가 바이러스, 플레보바이러스 및 나이로 바이러스); 아레나비리다에(Arenaviridae)(출혈열 바이러스); 레오비리다에(Reoviridae)(예: 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나비리다에(Birnaviridae); 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae)(간염 B 바이러스); 파르보비리다에(Parvoviridae)(파르보바이러스); 파포바비리다에(Papovaviridae); 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae)(간염 B 바이러스); 파르보비리다에(Parvoviridae)(대부분의 아데노바이러스); 파포바비리다에(Papovaviridae)(파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리다에(Adenoviridae)(대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리다에(Herpesviridae)(헤르페스 심플렉스 바이러스 유형 1(HSV-1) 및 HSV-2, 비리셀라 조스터 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 헤르페스 바이러스); 폭스비리다에(Poxviridae)(바리올라 바이러스, 백시나아 바이러스, 폭스 바이러스); 이리도비리다에(Iridoviridae)(예: 아프리카 돼지열 바이러스); 및 분류되지 않은 바이러스[예: 해면체성 뇌병증의 병인학적 제제, 델타 간염(간염 B 바이러스의 결손 위성인 것으로 생각됨)의 제제, 비-A형, 비-B형 간염의 제제(부류 1=내부적으로 전염됨; 부류 2=비경구적으로 전염됨, 즉 간염 C); 노르워크 및 관련된 바이러스 및 아스트로바이러스]가 포함된다.
감염성 바이러스의 예는 헬리코박터 피롤리스(Helicobacter pyloris), 보렐리아 부르그도르페리(Borelia burgdorferi), 레기오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 미코박테리아 종(Mycobacteria sp.)[예: 엠. 투베르쿨로시스(tuberculosis), 엠. 아비움(avium), 엠. 인트라셀룰라레(intracellulare), 엠. 칸사이(kansaii), 엠. 고르도나에(gordonae)], 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 네이쎄리아 고노르헤아에(Neisseria gonorrheae), 네이쎄리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(그룹 A 스트렙토콕쿠스), 스트렙토콕쿠스 아갈락티아에(agalactiae)(그룹 B 스트렙토콕쿠스), 스트렙토콕쿠스 종(비리단스 그룹), 스트렙토콕쿠스 파에칼리스(faecalis), 스트렙토콕쿠스 보비스(bovis), 스트렙토콕쿠스 종(아나에로빅 종), 스트렙토콕쿠스 뉴모니아에(pneumoniae), 병리학적 캄필로박터 종(Campylobacter sp.), 엔테로콕코스 종(Enterococcus sp.), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 바실루스 안트라시스(Bacillus antracis), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp.), 에리시펠로트릭스 루시오파티아에(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 파스투렐라 물토시다(Pasturella multocida), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실루스 모니리포르미스(Streptobacillus monoliformis), 트레포네마 팔리디움(Treponema pallidium), 트레포네마 퍼르테누에(Treponema pertenue), 레프토스피라(Leptospira) 및 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelli)가 포함된다.
감염성 진균의 예에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 크립토콕쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 카프술라툼(Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 클라마이디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)가 포함된다. 기타 감염성 생물체에는 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 및 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)가 포함된다.
방출가능한 질량-표지 분자
IR-MALDI MS는 표적 분자의 검출 및 동정을 위한 질량-표지 분자와 함께 사용될 수 있다. 방출가능한 질량-표지 분자는 PCT 특허 공보 제WO 98/26095호에 기술되어 있으며, 이는 본원에 참조로서 삽입된다. 이들 방법에 있어서, 표적 분자는 표적에 특이적인 인자를 통해 질량-표지에 결합된다. 표적은 표적 분자로부터 질량-표지의 방출 및 IR-MALDI MS에 의한 질량-표지의 검출 후에 "간접적으로" 검출된다. 표지의 질량 값은 표적에 특이적인 인자를 동정시켜 주며, 이를 특성화한다. 따라서, 표적 분자 자체 대신에, 질량-표지의 검출은 샘플에서 표적 분자의 존재를 나타낸다.
본원에 기술된 바와 같이 IR-MALDI 질량 분석법을 수행하는 방법은 질량 표지를 검출하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 질량 표지는 본원에 기술되고 IR-MALDI 질량 분석법으로 처리되는 매트릭스와 혼합할 수 있다. 특정한 양태에 있어서, 질량 표지는 IR-MALDI 질량 분석법을 수행하기 전에 글리세롤 매트릭스와 혼합한다.
질량 표지는 하나 이상의 반응성 그룹 및 하나 이상의 방출 그룹을 추가로 함유하는 방출 tag 화합물내에 포함된다. 반응성 그룹은 표적 분자와 반응한다. 질량 표지는 방출가능한 결합을 통해 반응성 그룹에 결합 또는 부착된다. 전형적으로, 질량 표지는 질량 스펙트럼 분석 전에 반응성 그룹 모두 또는 일부로부터 방출된다. 이러한 방출가능한 부착은 전형적으로 방출 그룹의 사용을 통해 발생하는데, 이는 질량 표지와 반응성 그룹 사이의 결합이거나, 반응성 그룹내에 함유될 수 있는 반응성 그룹의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
전형적인 표적 분자는 폴리뉴클레오타이드, 유전자 서열, 유전자 또는 단백질 서열내의 돌연변이, 독소, 금속, 수용체, 항원, 리간드, 폴리펩타이드, 탄수화물 및 지질을 포함한다.
질량 표지
질량 표지(또한 태그로서 언급된다)는 질량 분석법에 의해 검출될 수 있는 임의의 화합물일 수 있고, 합성 고분자 및 생체고분자를 포함한다. 합성 고분자에는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 페놀, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리메틸 메타크릴레이트 및 이의 유도체가 포함된다. 합성 고분자는 전형적으로 에틸렌 글리콜, 비닐 페놀, 프로필렌 글리콜, 메틸 메타크릴레이트 및 유도체 및 이의 배합물을 포함하는 단량체 단위를 함유한다. 생체고분자에는, 아미노산, 비-천연 아미노산, 펩타이드 유사체, 핵산, 핵산 유사체 및 동족체, 및 당류 및 이의 배합물 등의 단량체 단위를 포함하는 것들이 포함된다. 특정한 양태에 있어서, 질량 표지는 약 500달톤 이상의 분자량을 갖는다. 일부 양태에 있어서, 질량 표지는 불휘발성(비휘발성)일 수 있는 반면, 다른 양태에서는 휘발성 질량 표지를 사용할 수 있다. 기타 질량 표지에는 헴 그룹, 염료, 유기금속성 화합물, 스테로이드, 풀레렌스, 레티노이드, 카로테노이드 및 폴리방향족 탄화수소가 포함된다.
반응성 그룹
반응성 그룹은 이의 존재가 검출되는 분자와 반응할 수 있는 그룹을 의미한다. 예를 들면, 반응성 그룹은 특이적 분자를 인지할 수 있는 생체분자일 수 있다. 특이적 분자를 인지할 수 있는 생체분자는 전형적으로 독특한 분자 또는 분자 부류와 특이적 결합 상호작용할 수 있는 분자일 수 있으며, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 폴리헥산이 포함된다. 폴리펩타이드는 2개 이상의 천연 또는 비-천연 아미노산 단량체, 예를 들어 천연 단백질, 유전자 산물, 단백질 접합체, 돌연변이체 또는 다형성 폴리펩타이드, 해독후 변형된 단백질; 화학적 합성 산물, 시험관내 해독, 벡터 혼합을 수반하는 신속한 진화 시스템을 포함하는 세포-기본된 발현 시스템, 랜덤 또는 지시된 돌연변이유발 및 펩타이드 서열 랜덤화를 포함하는 유전적으로 조작된 유전자 산물; 올리고펩타이드, 항체, 효소, 수용체, 조절 단백질, 핵산-결합 단백질, 호르몬, 또는 파지 박테리아 표시 방법 등의 표시 방법의 단백질 산물을 포함하는 펩타이드가 포함된다.
핵산에는 표준 또는 천연 핵산 뿐만 아니라, 핵산 유사체 또는 유사체들로서 알려져 있는 변형된/비천연 핵산이 포함된다. 따라서, 뉴클레오타이드에는 폴리핵산 또는 올리고뉴클레오타이드내에 존재하는 모노포스페이트 단량체 뿐만 아니라 뉴클레오사이드 트리-, 디- 및 모노포스페이트를 포함하여 천연 및 변형된/비천연 뉴클레오타이드가 포함된다. 뉴클레오타이드는 리보, 2'-데옥시, 2',3'-데옥시 뿐만 아니라 본 기술분야에 공지된 기타 뉴클레오타이드 유사체의 광대한 배열일 수 있다. 유사체는 쇄-종결 뉴클레오타이드, 예를 들어 3'-O-메틸, 할로겐화 염기 또는 당 치환체, 또는 비당을 포함하는 당 구조, 알킬 환 구조, 또는 이노신을 포함하는 염기, 데아자-변형된, chi 및 psi 링커-변형된, 질량 표지-변형된, 포스포디에스테르 변형물 또는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 보라노포스페이트, 아미드, 에스테르, 에테르 및 염기성 또는 완전한 인터뉴클레오타이드 치환을 포함하는 치환, 광절단가능한 니트로페닐 잔기 등의 절단 결합이 포함된다. 이들 변형체는 본 기술분야에 공지되어 있고, 문헌[참조: Saenger (1983) Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, NY]에 기술된 바와 같은 기초 원리에 근거한다.
폴리핵산은 하나 이상의 핵산을 함유하는 분자를 포함한다. 폴리핵산은 2개 이상의 뉴클레오타이드 단량체 길이를 포함하며, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 올리고스, 폴리뉴클레오타이드, DNA, 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 카피 DNA, 박테리아 DNA, 바이러스 DNA, 바이러스 RNA, RNA, 메신저 RNA, 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 촉매 RNA, 클론, 플라스미드, M13, P1, 코스미드, 박테리아 합성 염색체, 효모 합성 염색체, 포유동물 합성 염색체, 증폭된 핵산, 앰플리콘, PCR 산물 및 기타 유형의 증폭된 핵산이 포함된다.
반응성 그룹은 반응성 그룹을 상보성 핵산 서열과 하이브리드화시킨 후에 부가된 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 하이브리드화 후에 부가된 뉴클레오타이드는 쇄-종결 변형, 예를 들어 쇄-종결 디데옥시 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 부가된 뉴클레오타이드는 또한 고체 지지체상에 고정화될 수 있는 관능 그룹, 예를 들어 비오틴 또는 디곡시게닌을 함유할 수 있다. 일반적으로, 이러한 관능 그룹 또는 결합 그룹 또는 잔기는 태그 화합물을 고체 지지체에 부착 또는 결합시킬 수 있다. 결합 잔기는 부가된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 개재 결합 그룹을 통해 또는 고체 지지체에 자체로 결합되는 매개 올리고뉴클레오타이드와의 특이적 하이브리드화에 의해 직접적으로 부착할 수 있다. 결합 잔기는 고체 지지체에 공유 결합시키기 위한 관능 그룹, 고친화성 비공유 상호작용(스트렙트아비딘과 비오틴 등)을 통해 고체 지지체에 부착하는 리간드, 고체 지지체에 자체로 부착되는 중간 올리고뉴클레오타이드에 상보성인 일련의 염기 뿐만 아니라 예를 들어 본원 및 PCT 공보 제WO 96/37630호, 제WO96/29431호, 제WO98/20019호, 제WO94/16101호, 제WO98/20166호(이들 각각은 본원에서 전체 내용이 참조로서 삽입된다)에 기술된 것과 같이 당업자에 공지된 기타 수단이 포함된다.
반응성 그룹은 또한 엑소뉴클레아제 등의 뉴클레아제에 의한 올리고뉴클레오타이드의 분해를 차단하기 위해 사용되는 뉴클레아제 차단 잔기를 함유할 수 있다. 전형적인 뉴클레아제 차단 잔기에는, 포스포로티오에이트, 알킬실릴디에스테르, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트 및 펩타이드 핵산이 포함된다.
방출가능한 부착
질량 표지는 방출가능한 부착을 통해 반응성 그룹에 결합 또는 부착된다. 방출 그룹은 이러한 방출가능한 부착을 제공하는 모든 안정한 그룹일 수 있다. 방출 그룹은 화학적으로 절단가능한 결합 또는 안정한 화학적 결합일 수 있다. 이러한 결합은 전형적으로 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 산, 염기, 산화, 환원, 가열, 광, 또는 금속 이온 촉매된, 치환 또는 제거 화학에 의해 절단될 수 있다. 예를 들면, 화학적으로 절단가능한 결합은 변형된 염기, 변형된 당, 디설파이드 결합, 포스페이트 주쇄내로 도입된 화학적으로 절단가능한 그룹 또는 화학적으로 절단가능한 링커를 함유할 수 있다. 이들 결합의 몇몇 예는 PCT 공보 제WO96/37630호에 기술되어 있다. 포스페이트 주쇄내로 도입될 수 있는 화학적으로 절단가능한 그룹은 당업자에게 공지되어 있고, 디알콕시실란, 3'-(S)-포스포로티오에이트, 5'-(S)-포스포로티오에이트, 3'-(N)-포스포로아미데이트 또는 5'-(N)-포스포로아미데이트가 포함된다. 화학적으로 절단가능한 링커는 변형된 당, 예를 들어 리보스일 수 있거나, 결합은 디설파이드 결합일 수 있다.
방출가능한 부착이 반응성 그룹내에 함유되는 경우, 방출가능한 부착의 방출은 선택적 방식에 의해 활성화될 수 있다. 예를 들면, 선택적 방출은 이본쇄 또는 일본쇄 DNA에 특이적인 엑소뉴클레아제 등의 효소에 의해 매개될 수 있다. 일반적으로, 방출가능한 부착이 반응성 그룹내에 함유되는 경우, 반응성 그룹은 태그 성분으로부터 질량 표지의 분리를 유발할 수 있는 특정한 방출 그룹을 이의 구조내에 함유한다.
방출 그룹은 효소에 의해 절단가능한 그룹 또는 결합을 포함한다. 효소에 의해 절단가능한 방출 그룹에는 포스포디에스테르 또는 아미드 결합 뿐만 아니라 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위를 포함한다. 방출 그룹을 절단하는 뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 및 제한 엔도뉴클레아제를 포함한다. 전형적인 엑소뉴클레아제는 이본쇄 및 일본쇄 폴리핵산 모두에 특이적인 엑소뉴클레아제를 포함한다. 또한, 제한 엔도뉴클레아제는 유형 IIS 및 유형 II 제한 엔도뉴클레아제를 포함한다. 방출 그룹은 엔도프로테이나제를 포함하는 프로테아제에 의해 절단가능하다.
추가로, 반응성 그룹은 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 함유하거나, 질량-표지된 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 사용하여 합성할 수 있다. 표지된 프로브는 2개 이상의 독특한 질량 표지를 포함할 수 있다.
예시적인 방출 태그 화합물
예시적인 방출 태그 화합물에는 반응성 그룹이 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위를 함유하는 이본쇄 올리고뉴클레오타이드이고, 방출가능한 부착이 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는 포스포디에스테르 결합을 함유하며 질량 표지가 질량 분석법에 의해 검출할 수 있는 표지인 것이 포함된다. 반응성 그룹은 또한 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 질량 표지는 반응성 그룹의 일부를 포함할 수 있다. 이본쇄 올리고뉴클레오타이드는 수소 결합 상호작용에 의해 서로 하이브리드화된 2개의 상보성 스트랜드를 함유할 뿐만 아니라, 스트랜드의 부분이 일본쇄이고 스트랜드의 부분이 이본쇄인 뉴클레오타이드의 일본쇄를 포함한다. 예를 들면, 반응성 그룹의 일부분 또는 모두는 반응성 그룹의 부분이 반응성 그룹의 또다른 부분과 상보성인 자가-상보성 올리고뉴클레오타이드 헤어핀을 포함할 수 있다. 이 경우, 특정한 조건이 이들 2개의 반응성 그룹 부분 사이의 이본쇄 이중사슬을 형성시킨다. 반응성 그룹 모두가 이본쇄일 필요는 없으며, 일본쇄 영역을 함유하는 방출 태그 화합물이 또한 포함된다.
추가의 예시적인 방출 태그 화합물은 반응성 그룹이 이본쇄 올리고뉴클레오타이드이고 방출가능한 부착이 화학적으로 절단가능한 방출 그룹이며 질량 표지가 질량 분석법에 의해 검출할 수 있는 표지인 화합물을 포함한다. 이러한 예에 있어서, 방출가능한 부착은 전형적으로 반응성 그룹내에 위치한다. 화학적으로 절단가능한 방출 그룹에서의 절단은 이러한 측면에서 일반적으로 방출 그룹에서 이본쇄 올리고뉴클레오타이드의 존재에 의해 억제된다. 화학적으로 절단가능한 방출 그룹, 예를 들어 3'-(S)-포스포로티오에이트, 5'-(S)-포스포로티오에이트, 3'-(N)-포스포로아미데이트, 5'-(N)-포스포로아미데이트 또는 리보즈가 이들 양태에 사용된다. 반응성 그룹의 부분은 표적 핵산에 대한 반응성 그룹 부분의 하이브리드화에 의해 방출 그룹에서 일본쇄화될 수 있다.
방출 태그 세트(즉, 2개 이상의 방출 태그 화합물의 그룹)이 또한 표적 핵산을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 예에 있어서, 표적 핵산은 전형적으로 하나 이상의 방출 태그 화합물을 포함한다. 각각의 방출 태그 화합물은 반응성 그룹, 방출가능한 결합 및 질량 표지를 포함한다. 반응성 그룹은 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 올리고뉴클레오타이드일 수 있고, 방출가능한 부착은 방출 그룹이며, 질량 표지는 질량 분석법에 의해 검출할 수 있는 표지이다. 불변 및 가변 영역은 표적 핵산과 반응한다. 일반적으로, 각각의 방출 태그 화합물 세트는 당해 그룹의 다른 구성원 모두와 상이할 것이다. 즉, 각각의 구성원은 반응성 그룹, 방출 그룹 및 질량 표지의 상이한 조합을 포함할 것이다. 전형적으로, 하나 이상의 구성원 세트의 질량 표지는 가변 영역내에서 특이적 서열을 동정시켜 줄 것이다. 일부 예에 있어서, 각 구성원 세트의 질량 표지는 가변 영역내에서 각각의 상이한 서열을 유일하게 동정시켜 줄 것이다. 다른 예에 있어서, 2개 이상의 방출 태그 화합물의 조합은 가변 영역내에서 각각의 상이한 서열을 동정시켜 줄 것이다.
질량-표지 프로브의 제조
질량-표지된 프로브를 제조하는 방법은 중합화시키는 조건하에 뉴클레오사이드 또는 아미노산 단량체를 하나 이상의 질량-표지된 단량체와 배합하는 것을 포함한다. 중합화는 예를 들어 효소 또는 화학적 합성에 의해 매개될 수 있다. 질량-표지 프로브를 제조하는 합성 방법은 실질적으로 표준 펩타이드 및 DNA 합성을 위한 방법이다.
질량-표지된 프로브를 사용하여 표적 분자를 검출하는 방법
일반적으로, 표적 분자를 검출하는 한가지 방법은 본원에 기술되고 PCT 공보 제WO98/26095호에 기술된 바와 같이 각각 반응성 그룹, 방출 그룹 및 질량 표지를 포함하는 복수의 프로브를 수득하는 것을 포함한다. 전형적으로, 복수의 프로브내의 각 프로브는 독특한 질량-표지를 함유한다. 이어서, 표적 분자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 샘플을, 프로브:표적 분자 복합체를 형성시키기에 적합한 조건하에 복수의 프로브와 접촉시킨다. 질량 표지는 프로브로부터 방출되고, 질량-표지의 질량은 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 측정된다. 바람직한 양태에 있어서, 질량 표지는 IR-MALDI 질량 분석법용 제제내의 액체 매트릭스와 혼합한다. 특히 바람직한 액체 매트릭스는 글리세롤이다. 전형적으로, 질량은 특이적 표적 분자를 나타낸다. 이러한 방법에 있어서, 표적 분자는 질량 표지의 독특한 배합에 따라 동정할 수 있다.
표적 분자를 검출하는 또다른 방법에 있어서, 표적 분자를 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 증폭시켜 증폭된 표적 분자를 제조한다. 이어서, 증폭된 표적 분자를 본원 및 PCT 특허 공개공보 제WO98/26095호에 기술된 바와 같이 프로브와 하이브리드화시켜 프로브:증폭된 표적 분자 복합체를 제조한다. 이어서, 증폭된 표적 분자 복합체상에서 질량 표지가 방출되며, 질량 표지의 질량은 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정한다. 바람직한 양태에 있어서, 질량 표지는 IR-MALDI 질량 분석법을 위한 제제내의 액체 매트릭스와 혼합한다. 특히 바람직한 액체 매트릭스는 글리세롤이다. 증폭된 표적 분자는 또한 고체 지지체에 고정화될 수 있으며, 프로브:증폭된 표적 분자 복합체의 부분이 아닌 모든 프로브는 세척에 의해 제거된다.
표적 분자가 복수의 프로브와 접촉되는 다중화 방법이 또한 제공된다. 프로브의 각각의 반응성 그룹은 독특한 질량 표지와 결합하거나 질량 표지의 독특한 세트와 결합할 수 있다. 따라서, 표적 분자는 특정한 질량 표지 또는 특정한 질량 표지 세트의 질량 스펙트럼 검출에 의해 검출할 수 있다. 질량 스펙트럼 검출은 IR-MALDI 질량 분석법을 사용하여 수행된다. 바람직한 양태에 있어서, 질량 표지 또는 표지들은 IR-MALDI 질량 분석법을 수행하기 전에 액체 매트릭스와 혼합된다. 특히 바람직한 액체 매트릭스는 글리세롤이다. 질량 표지 세트가 사용되는 경우, 질량 표지 세트는 동일한 프로브에 부착될 수 있다. 또는, 세트의 각 구성원이 상이한 프로브에 부착될 수 있다.
표적 분자를 검출하는 또다른 방법에 있어서, 반응성 그룹, 방출 그룹 및 휘발성 질량 표지를 포함하는 프로브를 수득하는 단계(a),
표적 분자를 프로브와 하이브리드화하여 프로브:표적 분자 복합체를 제조하는 단계(b),
질량 표지를 프로브:표적 분자 복합체로부터 선택적으로 방출시켜 방출된 질량 표지를 제조하는 단계(c) 및
방출된 질량 표지의 질량을 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정하는 단계(d)가 포함된다. 추가의 방법에 있어서, 단계(d) 전에 질량 표지는 액체 매트릭스, 바람직하게는 글리세롤과 혼합된다.
표적 분자를 검출하는 또다른 방법에 있어서, 반응성 그룹, 방출 그룹 및 질량 표지를 포함하는 프로브를 수득하는 단계(a),
표적 분자를 프로브와 하이브리드화하여 프로브:표적 분자 복합체를 제조하는 단계(b),
프로브:표적 분자 복합체로부터 질량 표지를 방출시켜 방출된 질량 표지를 제조하는 단계(c) 및
방출된 질량 표지의 질량을 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정하는 단계(d)가 포함된다. 추가의 방법에 있어서, 단계(d) 전에 질량 표지는 액체 매트릭스, 바람직하게는 글리세롤과 혼합된다.
표적 분자의 검출을 다중화하는 방법은 각각 반응성 그룹, 방출 그룹 및 질량 표지를 포함하는 복수의 프로브를 수득하는 단계(a),
표적 분자를 복수의 프로브와 접촉시켜 프로브:표적 분자 복합체를 제조하는 단계(b),
프로브:표적 분자 복합체에 포함되는 프로브로부터 질량 표지를 방출시켜 방출된 질량 표지를 제조하는 단계(c) 및
방출된 질량 표지의 질량을 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정하는 단계(d)를 포함한다. 이러한 관점에서, 특이적 표적 분자를 인지하는 각각의 반응성 그룹은 질량 표지의 독특한 세트와 결합된다. 복수의 표적 분자는 또한 복수의 프로브로 검출할 수 있다. 추가의 양태에 있어서, 단계(d) 전에 질량 표지는 액체 매트릭스, 바람직하게는 글리세롤과 혼합한다.
유전자 발현을 모니터하는 방법은 각각 반응성 그룹, 방출 그룹 및 질량 표지를 포함하는 복수의 프로브를 수득하는 단계(a),
복수의 표적 분자를 복수의 프로브와 접촉시켜 프로브:표적 핵산 복합체를 제조하는 단계(b),
프로브:표적 핵산 복합체에 포함되는 프로브로부터 질량 표지를 선택적으로 방출시켜 방출된 질량 표지를 제조하는 단계(c) 및
방출된 질량 표지의 질량을 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정하는 단계(d)를 포함한다. 추가의 양태에 있어서, 질량 표지는 단계(d) 전에 액체 매트릭스, 바람직하게는 글리세롤과 혼합한다.
표적 핵산은 단계(a) 전에 증폭시킬 수 있다.
표적 분자를 검출하는 추가의 방법은 하나 이상의 표적 핵산을 증폭시켜 증폭된 핵산 산물을 수득하는 단계(a),
반응성 그룹, 방출 그룹 및 질량 표지를 증폭 공정중에서 증폭된 핵산 산물에 도입하는 단계(b),
증폭된 핵산 산물내로 도입된 질량 표지를 선택적으로 방출시켜 방출된 핵산 표지를 제조하는 단계(c) 및
방출된 질량 표지의 질량을 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정하는 단계(d)를 포함한다. 추가의 양태에 있어서, 질량 표지는 단계(d) 전에 액체 매트릭스, 바람직하게는 글리세롤과 혼합한다.
표적 분자를 검출하는 또다른 방법은 반응성 그룹, 방출 그룹 및 질량 표지를 포함하는 프로브를 수득하는 단계(a),
프로브를 표적 핵산과 접촉시켜 프로브:핵산 분자 복합체를 제조하는 단계(b),
뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 프로브에 부착시킴으로써 프로브:핵산 분자 복합체를 질량 변형시켜 질량 변형된 질량 표지를 제조하는 단계(c),
질량 변형된 표지를 방출시키는 단계(d) 및
질량 변형된 표지의 질량을 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정하는 단계(e)를 포함한다. 추가의 양태에 있어서, 질량 표지는 단계(e) 전에 액체 매트릭스, 바람직하게는 글리세롤과 혼합한다.
질량-표지된 분자를 사용하여 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)를 검출하는 방법
질량-표지 분자를 이용하는 방법은 또한 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 검출에 사용될 수 있다. 다형성 부위에 바로 인접하여 하이브리드화하는 질량 표지 프로브가 제조되며, 이어서 폴리머라제를 사용하여 다형성의 부위에 특정한 염기를 부가할 수 있다. 예를 들면, 단일 프로브가 사용되는 경우, 각각 독특한 질량 표지가 부착된 4개의 쇄-종결 트리포스페이트의 혼합물을 부가할 수 있다. 동형접합성 SNP의 경우에 있어서, 4개의 쇄-종결 뉴클레오타이드중 단지 하나의 뉴클레오타이드를, 프로브에 결합된 질량 표지를 커플링하는 프로브의 말단에 부가할 수 있다. 프로브로부터 질량 표지를 방출하는 방법에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 종결 뉴클레오타이드에 질량 표지를 결합시키는 화학적으로 불안정한 관능 그룹, 즉 신장된 프라이머 또는 쇄-종결 뉴클레오타이드의 주쇄내에 화학적으로 불안정한 관능 그룹을 사용하는 방법 또는 프라이머 신장 산물내의 하나 이상의 포스포디에스테르 또는 글리코시드 결합을 절단하는 효소를 사용하는 방법이 포함된다. 질량 표지 방출 지점이 신장 산물의 주쇄내에 존재하는 경우, 방출된 질량 표지는 말단 뉴클레오타이드 또는 이의 일부 질량-변형된 이형을 포함할 수 있다. 방출 지점이 프라이머 신장 산물의 내부에 존재하는 또다른 이형에 있어서, 천연 쇄-종결 뉴클레오타이드 자체는 질량 표지의 모두 또는 일부로서 사용될 수 있는데, 이는 각각의 염기가 독특한 질량을 갖기 때문이다. 질량 표지가 프로브로부터 화학적으로 절단되는 경우, 임의의 비삽입된 뉴클레오타이드는 이들이 질량 분광계에 의해 가시화되지 않도록 먼저 제거 또는 세척할 수 있다.
하이브리드화된 질량-표지된 쇄-종결 트리포스페이트의 분배는 질량 차이에 기초하여 수행될 수 있는데, 이는 표적-하이브리드화된 프로브와 하이브리드화된 표지된 트리포스페이트가 그렇지 않은 표지된 트리포스페이트보다 분자량이 클 수 있기 때문이다. 프로브 또는 표적은 비오틴/스트렙트아비딘 또는 화학적 커플링 또는 UV 가교-결합을 포함하는 다수의 수단을 통해 고체-상에 부착될 수 있다. 또한, 뉴클레아제를 사용하여 질량 표지된 프로브를 분해할 수 있다. 뉴클레아제를 사용하여, 질량-표지된 쇄-종결 뉴클레오타이드는 모노포스페이트로서 방출될 것이다. 삽입되지 않은 질량-표지된 쇄-종결 뉴클레오타이드는 트리포스페이트로서 잔류할 것이며, 모노포스페이트에 대해 생성되는 질량 이동은 뉴클레오타이드가 삽입되었음을 나타낼 것이다. 이 방법은 분석 전에 삽입되지 않은 뉴클레오타이드를 제거해야 하는 것으로 생각된다.
많은 SNP는 다수의 프로브를 다중화함으로써 동시에 검출될 수 있다. 질량 표지는 풀을 포함하는 프로브의 독특한 태그 각각에 제시될 수 있다. 또한 점 다형성 부위에 비오티닐화된 쇄-종결 뉴클레오타이드의 부가를 사용하여, 프로브가 특이적 비오티닐화된 쇄-종결 뉴클레오타이드를 삽입하는지 또는 그렇지 않은지에 따라 프로브 모집단을 분리할 수 있다. 예로서, 표적으로 질량-표지된 프로브의 풀은 4개의 반응으로 나눌 수 있다. 제1 반응은 단지 비오티닐화된 디데옥시 아데노신 트리포스페이트를 함유할 것이고, 제2 반응은 단지 비오티닐화된 디데옥시 시티딘 트리포스페이트를 함유할 것이며, 제3 반응은 단지 비오티닐화된 디데옥시 구아니딘 트리포스페이트를 함유할 것이고, 제4 반응은 단지 비오티닐화된 디데옥시 티미딘 트리포스페이트를 함유할 것이다. 적절한 뉴클레오타이드의 존재하에 단일 염기 신장 폴리머라제-의존성 반응을 수행한 후, 신장된 산물을 포획하고 세척하며, 질량 표지를 IR-MALDI 질량 분석법에 의한 질량 분석을 위해 방출시킨다. 제1 반응에 있어서, A를 삽입한 이들 질량-프로브만이 가시화될 것이다. 제2 반응에 있어서, C를 삽입한 질량-표지된 프로브만이 가시화될 것이다. 제3 및 제4 반응에 있어서, 각각 G 또는 T를 삽입한 프로브가 가시화될 것이다.
질량 표지내의 질량 변화의 또다른 예는 질량 표지가 프로브의 3' 말단에 존재하는 경우이다. 폴리머라제-의존성 기본된 신장을 수행한 후, 페눌티메이트 염기 뿐만 아니라 쇄-종결 염기 부가를 포함하는 질량 표지가 방출될 것이다. 질량 표지 및 방출 부위의 치환은 3' 말단에 인접한 치환에 우선하여 다른 염기에 존재할 것이다. 모든 경우에, 질량 표지는 바람직하게는 방출 그룹 및 3' 말단에 위치한다. 다른 양태에 있어서, 디데옥시뉴클레오타이드 이외에 약간의 정상 데옥시뉴클레오타이드가 존재하는 경우, 단쇄 종결된 서열 분석 반응을 효과적으로 수행하는 것이 바람직할 것이다. 프라이머의 신장은 산물의 중복 세트(이는 각각 주형 스트랜드상의 이의 상보성 염기와 관련되는 디데옥시뉴클레오타이드에 의해 종결된 쇄이다)를 생성할 것이다. 바람직한 형태에 있어서, 질량 표지는 화학적 방출 그룹을 함유하는 3' 말단에 인접한 프라이머내에 위치할 것이다. 이러한 방법은 하나 이상의 SNP의 검출 뿐만 아니라 짧은 서열 판독을 위한 별도의 양태를 제공한다. 모든 SNP 검출 방법은 상이한 가능한 산물 사이의 질량 차이를 증가시키기 위해 질량-변형된 형태의 상이한 뉴클레오타이드의 사용을 수반할 것이다.
SNP는 또한 매치하거나 매치하지 않는 올리고뉴클레오타이드 프로브의 존재하에 식별 엑소뉴클레아제 사건의 수행에 의해 검출될 것이다. 이러한 방법의 한가지 예는 방출가능한 질량 표지를 닉(nick) 해독 PCR과 배합 사용하는 것이다. 이의 폴리머라제 활성 이외에, 태그 DNA 폴리머라제는 5'에서 3'로의 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성 모두를 가진다. 완전한 상보성 올리고뉴클레오타이드 프로브가 예를 들어 핵산 증폭중에 중합화 경로에 위치하는 경우, 폴리머라제는 너무 작아서 하이브리드화하지 않을 때까지 분자를 분해하는 이의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 프로브의 5' 말단을 공격할 것이다. 그러나, 올리고뉴클레오타이드가 5' 말단에 인접하여 완전히 상보성이 아닌 경우, 예를 들어 이에 의해 미스매치가 존재하는 경우, 프로브의 말단은 소모되고, 엑소뉴클레아제 활성보다는 오히려 폴리머라제의 엔도뉴클레아제 활성에 의해 공격받을 것이다. 바람직하게는 질량 표지를 함유하는, 뉴클레오타이드 분해에 의해 절단된 산물은, 미스매치가 존재하는지의 여부 및 이러한 미스매치에 대한 반응에서 뉴클레아제가 절단하는 방법에 따라 상이한 최종 질량을 가질 것이다. 엔도뉴클레아제 분해 활성의 개시는 하이브리드화 프로브내의 미스매치의 존재 및 치환에 의해 영향받을 수 있는 것으로 입증되었다. 예상된 미스매치 부위와 비교하여 올리고뉴클레오타이드 프로브내의 질량 표지의 선택적 치환은 실질적인 미스매치가 존재하는지의 여부에 따라 상이한 시그날을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 분석은 다중 SNP의 동시 검출로 확대될 수 있다. 특정한 SNP를 표적화하는 프로브 각각은 다형성 부위를 보충하기 위해 4개의 가능한 염기중 하나를 함유한다. 질량 표지의 치환은 프로브가 주형에 대한 완전한 매치를 함유하도록 존재하며, 질량 표지는 주로 단일 뉴클레오타이드를 포함하는 형태로 태그 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 방출될 것이다. 다른 프로브는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 방식으로 프로브의 절단을 개시할 것이다. 질량 표지 절단 산물의 질량 이동은 미스매치가 발생하는지의 여부의 특징이다.
질량-표지된 프로브를 사용하는 짧은 서열을 동정하는 방법
질량-표지된 프로브는 짧은 서열을 동정하는데 사용할 수 있다. 특히, 하이브리드화 및 효소적(폴리머라제 또는 리가제) 신장의 배합은 표지된 프로브와 함께 사용되어 "프라이밍" 또는 앵커 영역에 인접한 짧은 서열을 동정할 수 있다. 이를 수행하는 데에는 몇가지의 방법이 있다. 한가지 방법에 있어서, 2개의 도메인, 즉 전형적으로 단지 하나 또는 소수의 서열을 함유하는 고정된 서열 인지 도메인, 및 모든 가능한 서열의 완전한 세트(또는 일부 서브세트)를 포함하는 랜덤화된 도메인을 함유하는 프로브의 혼합물이 합성된다. 프로브의 고정된 서열을 사용하여 특정한 표적 핵산내의 단일 부위와의 프로브 하이브리드화를 표적화한다. 이 표적 부위는 전형적으로 불변성이다. 불변 서열에 인접한 서열은 가변성이며, 특정한 표적에 따라 서열의 전체 조합중 어느 하나를 가질 수 있다. 모든 가능성을 검출하기 위해, 모든 가능한 제2 도메인 서열 조합물을 함유하는 프로브를 합성하여야 한다. 예를 들면, 제2 프로브 영역이 4개의 염기 길이인 경우, 합성을 위해 256개의 상이한 프로브가 필요하다. 이 프로브는 개별적으로 합성될 수 있으며, 이들 각각은 방출가능한 질량 표시로서 질량 표지의 독특한 조합을 보유한다. 또는, 프로브는 조합 합성 방법을 사용하여 독특한 질량 표시와 함께 합성할 수 있다.
식별 수준을 증가시키고 짧은 서열 판독을 위한 판독 길이를 신장시키기 위해, 폴리머라제 또는 리가제 등의 효소를 사용하고, 임의로 이들 부가물에 대한 서열을 동정할 수 있는 부가된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드상에 질량 표지를 포함하는 고정된 프로브의 가변 영역의 말단에 단일 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 부가할 수 있다. 효소에 의한 염기의 부가는 효소 작용을 가능하게 하기 위해 완전한 하이브리드인 가변 영역에 대해 보다 엄격한 요건을 제공한다. 폴리머라제의 경우, 부가는 프로브의 3' 말단에 존재하여야 하며, 결합은 3' 또는 5' 부위에서 발생할 수 있다.
질량-표지된 프로브를 사용하여 미스매치를 검출하는 방법
미스매치를 검출하는 한 가지 방법에 있어서, 증폭된 핵산 산물은 미스매치를 함유하는 이본쇄 분자, 및 스트랜드의 3' 말단에 엑소뉴클레아제-차단 관능기를 함유한다. 전형적으로, 이 방법은 미스매치 부위에서 이본쇄 분자의 하나 이상의 스트랜드의 절단 및 질량 표지의 선택적 방출을 추가로 포함한다. 질량 표지의 선택적 방출은 전형적으로 엑소뉴클레아제 III 등의 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제에 의한 절단된 스트랜드의 분해에 의해 달성할 수 있다. 선택적 방출에 있어서, 질량 표지는 2가지 프로브 유형을 물리적으로 분배시키지 않고서 이러한 복합체를 포함하지 않는 프로브로부터 질량 표지를 방출시키지 않으면서 프로브:표적 분자 복합체에 포함되는 프로브로부터 방출된다. 미스매치는 효소, 예를 들어 mutHLS, T4 엔도뉴클레아제 VII, mutY DNA 글리코실라제, 티민 미스매치 DNA 글리코실라제 또는 엔도뉴클레아제 V에 의해 절단할 수 있다. 미스매치는 또한 화학물질, 예를 들어 OsO4, HONH2또는 KMnO4에 의해 절단될 수 있다.
IR-MALDI 질량 분석법을 사용하는 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 대립인자의 분석
1. DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 대립인자의 분석
IR-MALDI 질량 분석법은 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 대립인자를 분석하고 하나 이상의 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 위치로부터 하나 이상의 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 영역의 동정을 다중화하기 위해 사용할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 이러한 분석을 위해 UV 질량 분석법을 사용하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이들 방법은 IR-MALDI에 사용하기 위해 본원에서 변형된다.
한가지 양태에 있어서, IR-MALDI에 의해 표적 핵산내의 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 위치에서 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 대립인자를 분석하는 방법이 제공된다. 이 방법은 하나 이상의 프라이머를 사용하여 표적 핵산을 신장시켜 핵산 신장 산물의 특정한 크기 범위를 수득하는 단계(여기서, 하나 이상의 프라이머는 당해 위치의 DNA 탠덤 뉴클레오타이드를 플랭킹하는 서열에 상보성이다); 및 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 액체 매트릭스로 핵산 신장 산물의 질량을 측정하는 단계를 포함한다.
한가지 양태에 있어서, 하나 이상의 프라이머의 3' 말단은 즉시 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 영역을 플랭킹한다. 또다른 양태에 있어서, 하나 이상의 프라이머는 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 위치 또는 위치들의 1개, 2개 또는 3개의 탠덤 반복체에 상보성인 서열을 포함한다. 또다른 양태에 있어서, 하나 이상의 프라이머는 절단가능한 부위를 포함한다. 절단가능한 부위는 바람직하게는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 부위, 엑소뉴클레아제 차단 부위, 또는 화학적으로 절단가능한 부위를 포함한다. 또다른 양태에 있어서, 하나 이상의 프라이머는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 부착 방법은 비오틴 또는 디곡시게닌을 포함한다.
또다른 양태에 있어서, 하나 이상의 프라이머의 신장은 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 등의 쇄 종결 시약을 사용하여 종결된다. 하나 이상의 표적 핵산을 신장시켜 하나 이상의 핵산 신장 산물을 생성함으로써 복수의 핵산을 분석할 수 있다. 예를 들면, 한가지 양태에 있어서, 하나 이상의 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 위치에서 하나 이상의 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 대립인자의 질량을 동시에 측정한다. 또다른 양태에 있어서, DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 위치는 중첩 대립인자 질량 범위를 갖는다. 또다른 양태에 있어서, 핵산 신장 산물은 삽입 질량 스펙트럼 피크를 갖는다. 또다른 바람직한 양태에 있어서, 하나 이상의 핵산 신장 산물은 질량 변형된 뉴클레오타이드를 함유한다.
또다른 바람직한 양태에 있어서, 하나 이상의 핵산 신장 산물의 길이는 절단가능한 부위에서 핵산 신장 산물을 절단함으로써 감소된다. 더욱 바람직하게는, 절단가능한 부위는 제한 엔도뉴클레아제 부위, 엑소뉴클레아제 차단 부위 또는 화학적으로 절단가능한 그룹을 포함한다.
2. 하나 이상의 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 위치로부터 하나 이상의 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 영역의 동정의 다중화
하나 이상의 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 위치로부터 질량 분석법에 의해 하나 이상의 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 영역의 동정을 다중화하는 방법이 제공된다. 이들 방법은 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 영역을 플랭킹하는 서열에 상보성인 하나 이상의 프라이머를 신장시킴으로써 하나 이상의 핵산 신장 산물을 수득하는 단계(a) 및 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 하나 이상의 핵산 신장 산물의 질량을 동시에 측정하는 단계(여기서, 핵산 신장 산물은 중첩 대립인자 질량 범위를 갖는다)를 포함한다.
한가지 양태에 있어서, 하나 이상의 프라이머의 3' 말단은 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 영역을 즉시 플랭킹한다. 또다른 양태에 있어서, 하나 이상의 프라이머는 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 위치 또는 위치들의 1개, 2개 또는 3개의 탠덤 반복체에 상보성인 서열을 포함한다. 또다른 양태에 있어서, 하나 이상의 프라이머의 신장은 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 등의 쇄 종결 시약을 사용하여 종결한다.
또다른 양태에 있어서, 하나 이상의 표적 핵산 신장 산물은 질량 변형 그룹을 함유한다. 더욱 바람직하게는, 질량 변형 그룹은 질량 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 또한, 더욱 바람직하게는, 질량 변형 그룹은 비표준 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 또다른 양태에 있어서, 절단가능한 부위는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 부위, 엑소뉴클레아제 차단 부위 또는 화학적으로 절단가능한 부위를 포함한다. 또다른 양태에 있어서, 질량 변형 그룹은 핵산 신장 산물의 신장 중에 또는 신장 후에 삽입된다.
또다른 양태에 있어서, 질량 분석법에 의해 하나 이상의 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 위치 또는 위치들로부터 하나 이상의 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 영역의 동정을 다중화하는 방법이 제공된다. 이 방법은 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 영역을 플랭킹하는 서열에 상보성인 2개 이상의 프라이머를 증폭시킴으로써 하나 이상의 핵산 증폭 산물을 수득하는 단계 및 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 하나 이상의 핵산 증폭 산물의 질량을 동시에 측정하는 단계(여기서, 핵산 신장 산물은 중첩 대립인자 질량 범위를 갖는다)를 포함한다.
이러한 양태에 있어서, 하나 이상의 프라이머의 3' 말단은 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 영역을 즉시 플랭킹한다. 또다른 양태에 있어서, 하나 이상의 프라이머는 DNA 탠덤 뉴클레오타이드 반복체 위치 또는 위치들의 1개, 2개 또는 3개의 탠덤 반복체에 상보성인 서열을 포함한다.
또다른 양태에 있어서, 하나 이상의 핵산 증폭 산물은 바람직하게는 비표준 데옥시리보뉴클레오타이드 등의 질량 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 질량 변형 그룹을 함유한다. 질량 변형 그룹은 증폭 전에, 증폭 중에 또는 증폭 후에 삽입될 수 있다. 또다른 양태에 있어서, 절단가능한 부위는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 부위, 엑소뉴클레아제 차단 부위, 또는 화학적으로 절단가능한 부위를 포함한다.
3. IR-MALDI 질량 분석법을 사용하는 표적 핵산내의 돌연변이 검출
본원에 언급된 바와 같이, IR-MALDI 질량 분석법을 사용하여 표적 핵산내의 돌연변이를 검출할 수 있다. 한가지 양태에 있어서, 표적 핵산내의 돌연변이를 검출하는 방법이 제공된다. 이 방법은 표적 핵산으로부터 비랜덤 길이 단편(NLF)의 세트를 일본쇄 형태로 수득하는 단계(여기서, 상기 세트는 표적 핵산의 포지티브 또는 네가티브 스트랜드중 하나로부터 유도된 NLF를 포함하거나, 표적 핵산의 포지티브 및 네가티브 스트랜드로부터 유도된 일본쇄 NLF의 서브세트이다)(a) 및
상기 세트의 구성원 질량을 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 측정하는 단계(b)를 포함한다.
한가지 양태에 있어서, 일본쇄 NLF 세트의 하나 이상의 구성원은 임의로 질량-변형된 뉴클레오타이드로 치환된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 갖는다. 또다른 양태에 있어서, 측정 단계는 임의로 내부 자가-검사기를 사용하여 개선된 질량 정확성을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 또다른 양태에 있어서, 표적 핵산은 일본쇄이며, 수득되는 단계는 단편화 프로브의 하나 이상의 세트와 일본쇄 표적 핵산을 하이브리드화하여 하이브리드 표적 핵산/단편화 프로브 복합체를 형성하는 단계를 포함한다. 이 복합체는 하나 이상의 이본쇄 영역 및 하나 이상의 일본쇄 영역을 함유한다. 이어서, 표적 핵산 분자는 모든 일본쇄 영역에서 하이브리드 표적 핵산/단편화 프로브 복합체를 하나 이상의 일본쇄 특이적 절단 시약으로 절단함으로써 비랜덤으로 단편화하여 NLF의 세트를 형성한다. 바람직하게는, 단편 프로브의 세트는 표적 핵산과 단편화 프로브의 세트를 하이브리드화하여 형성된 이본쇄 영역 사이에 일본쇄 갭을 잔류시킨다. 하이브리드화 단계는 일본쇄 표적 핵산의 2개 세트를 제공하고, 별도로 일본쇄 표적 핵산의 제1 세트와 제1 단편화 프로브 세트를 하이브리드화시키고 일본쇄 표적 핵산의 제2 세트를 제2 단편화 프로브 세트와 하이브리드화시키는 단계(여기서, 제2 단편화 프로브 세트의 구성원은 제1 단편화 프로브 세트의 임의의 구성원에서 임의의 뉴클레오타이드 서열과 상보성이지 않는 표적 핵산의 영역에 상보성인 하나 이상의 일본쇄 뉴클레오타이드 서열을 포함한다)를 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 제1 단편화 프로브 세트의 구성원은 제2 단편화 프로브 세트의 구성원의 뉴클레오타이드 서열과 중첩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
또다른 양태에 있어서, 일본쇄 특이적 절단 시약은 일본쇄 특이적 엔도뉴클레아제 또는 일본쇄 특이적 화학 절단 시약이며, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 절단 시약 등의 시약은 하이드록실아민, 과산화수소, 삼산화오스뮴 및 과망간산칼륨이다.
또다른 양태에 있어서, 표적 핵산이 일본쇄인 경우, 비랜덤 단편화 단계 후에 추가의 단계가 포함된다. 이 단계는 하나 이상의 포획 프로브와 하나 이상의 NLF를 하이브리드화하는 단계(여기서, 포획 프로브는 하나 이상의 NLF 및 제1 결합 잔기에 상보성인 일본쇄 영역을 함유한다), 제1 결합 잔기를 고체 지지체에 부착된 제2 결합 잔기에 결합시키는 단계(여기서, 결합은 하나 이상의 포획 프로브에 NLF를 하이브리드화하기 전에 또는 후에 발생한다) 및 일본쇄 NLF 세트를 분리하는 단계를 수반한다.
또다른 양태에 있어서, 표적 핵산이 일본쇄이고 단편화 프로브가 사용되는 경우, 단편화 프로브는 일본쇄 부분 및 제1 결합 잔기를 포함한다. 이 방법은 비랜덤화 단편화 단계 후에, 제1 결합 잔기를 고체 지지체에 부착된 제2 결합 잔기에 결합시키고 일본쇄 NLF 세트를 분리하는 단계를 추가로 수반한다.
또다른 양태에 있어서, 수득하는 단계는 표적 핵산을 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 비랜덤으로 단편화시켜 NLF의 세트를 형성하는 단계; 하나 이상의 NLF 세트 또는 이의 서브세트를 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브와 하이브리드화하는 단계(여기서, 각각의 올리고뉴클레오타이드 프로브는 일본쇄 영역 및 제1 결합 잔기를 포함한다); 하이브리드화 단계 전에 또는 후에 고체 지지체에 부착된 제2 결합 잔기에 제1 결합 잔기를 결합시키는 단계; 및 일본쇄 NLF의 세트 또는 서브세트를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 모든 올리고뉴클레오타이드 프로브는 표적 핵산의 전체 길이의 포지티브 또는 전체 길이의 네가티브 일본쇄 및 제1 결합 잔기를 포함하거나, 제1 결합 잔기와 제2 결합 잔기 사이의 결합은 공유 결합이거나, 하나의 결합 잔기는 항체, 호르몬, 억제제, 보조인자 부분, 결합 리간드 및 폴리뉴클레오타이드 서열이고, 다른 결합 잔기는 항체를 인지할 수 있는 항원, 호르몬을 인지할 수 있는 수용체, 억제제를 인지할 수 있는 효소, 보조인자 부분을 인지할 수 있는 보조인자 효소 결합 부위, 결합 리간드를 인지할 수 있는 기질 또는 상보성 폴리뉴클레오타이드 서열의 상응하는 구성원이거나; 분리는 중탄산암모늄, 디메틸 중탄산암모늄 및 트리메틸 중탄산암모늄 등의 휘발성 염을 포함하는 조성물을 사용하여 고체 지지체에 결합된 NLF의 세트를 세척하는 단계를 추가로 포함한다.
또다른 양태에 있어서, 표적 핵산이 일본쇄인 경우, 수득하는 단계는 일본쇄 표적 핵산을 하나 이상의 제한 부위 프로브와 하이브리드화하여 이본쇄 영역을 갖는 하이브리드화된 표적 핵산을 형성하는 단계(여기서, 제한 부위 프로브는 일본쇄 표적 핵산 및 하나 이상의 일본쇄 영역에 하이브리드화된다); 이본쇄 영역내의 제한 부위를 절단하는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 하이브리드화된 표적 핵산을 랜덤으로 단편화하는 단계를 추가로 포함한다. 비랜덤으로 단편화 단계 후에 추가의 단계가 포함될 수 있다. 이러한 추가의 단계는 NLF를 하나 이상의 포획 프로브와 하이브리드화하는 단계(여기서, 포획 프로브는 하나 이상의 NLF에 상보성인 일본쇄 영역 및 제1 결합 잔기를 포함한다); 제1 결합 잔기를 고체 지지체에 부착된 제2 결합 잔기에 결합시키는 단계(여기서, 결합은 NLF를 하나 이상의 포획 프로브와 하이브리드화하기 전에 또는 후에 발생한다); 일본쇄 NLF의 세트를 분리하는 단계를 포함한다. 또한, 바람직하게는, 절단된 제한 부위 프로브는 제한 엔도뉴클레아제 부위의 절반에 상보성인 일본쇄 영역 및 제1 결합 잔기를 포함하고, 이 방법은 비랜덤 단편화 단계 후에, 제1 결합 잔기를 고체 지지체에 부착된 제2 결합 잔기에 결합시키고 일본쇄 NLF의 세트를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
또다른 양태에 있어서, 표적 핵산이 일본쇄인 경우, 수득하는 단계는 일본쇄 표적 핵산의 포접 조건하에 상기 방법을 수행하여 세포내 2차 및 3차 상호작용을 갖는 3차원 구조를 형성하는 단계; 포접된 표적 핵산을 하나 이상의 구조-특이적 엔도뉴클레아제로 비랜덤 단편화시켜 일본쇄 NLF 세트를 형성하는 단계; 일본쇄 NLF의 세트 구성원이 일본쇄 뉴클레오타이드 서열 및 하나 이상의 제1 결합 잔기를 포함하도록 표적 핵산 또는 일본쇄 NLF 세트를 변형시키는 단계; 제1 결합 잔기를 고체 지지체에 부착된 제2 결합 잔기에 결합시키는 단계 및 일본쇄 NLF 세트를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
또다른 양태에 있어서, 표적 핵산이 일본쇄인 경우, 수득하는 단계는 일본쇄 표적 핵산의 포접 조건을 제공하여 세포내 2차 및 3차 상호작용을 갖는 3차원 구조를 형성하는 단계; 포접된 표적 핵산을 하나 이상의 구조-특이적 엔도뉴클레아제로 비랜덤 단편화시켜 일본쇄 NLF 세트를 형성하는 단계; 일본쇄 NLF의 하나 이상의 세트를 하나 이상의 포획 프로브와 하이브리드화하는 단계(여기서, 포획 프로브는 일본쇄 뉴클레오타이드 서열 및 제1 결합 잔기를 함유한다); 하이브리드화 단계 전에 또는 후에 제1 결합 잔기를 고체 지지체에 부착된 제2 결합 잔기에 결합시키는 단계 및 일본쇄 NLF 세트를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게는, 이본쇄 NLF의 분리된 세트는 표적 핵산의 5' 및/또는 3' 말단을 갖는 모든 NLF를 포함한다. 또한 바람직하게는, 구조-특이적 엔도뉴클레아제는 T4 엔도뉴클레아제 VII, RuvC, MutY, 또는 열-안정성 폴리머라제의 5'-3' 엑소뉴클레아제로부터의 엔도뉴클레오분해 활성이다.
또다른 양태에 있어서, 표적 핵산이 일본쇄인 경우, 수득하는 단계는 일본쇄 표적 핵산을 하나 이상의 야생형 프로브와 하이브리드화하는 단계, 및 표적 핵산과 특정한 야생형 프로브 사이에 형성하는 뉴클레오타이드 미스매치의 임의의 영역을 특이적으로 절단하는 하나 이상의 돌연변이-특이적 절단 시약으로 표적 핵산을 비랜덤 단편화하는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게는, 비랜덤 단편화 단계는 비랜덤 길이 단편의 제1 세트를 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 분해하거나, 비랜덤 길이 단편의 제1 세트를 하나 이상의 일본쇄-특이적 절단 시약으로 절단하는 단계를 추가로 포함한다. 또한, 바람직하게는, 일본쇄 NLF 세트의 구성원은 일본쇄 영역 및 하나 이상의 제1 결합 잔기를 포함하며, 상기 방법은 랜던 단편화 단계 후에, 제1 결합 잔기를 고체 지지체에 부착된 제2 결합 잔기에 결합시키고 일본쇄 NLF의 세트를 분리하는 단계를 포함한다. 추가로, 수득하는 단계는 NLF 세트의 구성원을 하나 이상의 포획 프로브와 하이브리드화시키는 단계(여기서, 포획 프로브는 일본쇄 부분 및 하나 이상의 제1 결합 잔기를 포함한다)를 추가로 포함할 수 있고, 상기 방법은 제1 결합 잔기를 고체 지지체에 부착된 제2 결합 잔기에 결합시키고 일본쇄 NLF의 세트를 분리하는 단계를 포함한다. 수득하는 단계는 표적 핵산의 5' 말단을 갖는 임의의 NLF를 함유하는 일본쇄 NLF의 세트를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
또다른 양태에 있어서, 표적 핵산내의 돌연변이를 검출하는 방법이 제공된다. 이 방법은 바람직하게는 휘발성 염을 함유하는 제한 완충제 중에서 표적 핵산을 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 비랜덤 단편화하여 이본쇄 NLF 세트를 형성하는 단계 및 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 이본쇄 NLF 세트의 구성원 질량을 측정하는 단계를 포함한다.
또다른 특정한 양태에 있어서, 표적 핵산내의 돌연변이를 검출하는 방법은 표적 핵산을 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 비랜덤 단편화하여 비랜덤 길이의 단편(NLF)의 제1 세트를 형성하는 단계,
제1 NLF 세트의 구성원을 야생형 프로브 세트와 하이브리드화하는 단계,
NLF 세트의 하나 이상의 구성원을, 제1 NLF 세트의 구성원과 야생형 프로브 세트의 상보성 구성원 사이에 형성하는 뉴클레오타이드 미스매치의 임의의 영역에서 특이적으로 절단하는 하나 이상의 돌연변이-특이적 절단 시약으로 비랜덤 단편화하는 단계(여기서, 비랜덤 단편화 단계는 제2 NLF 세트를 형성한다) 및
제2 NLF 세트의 구성원 질량을 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법에 의해 측정하는 단계를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 야생형 핵산의 비랜덤 단편화에 의해 수득된 야생형 프로브 세트는 제1 NLF 세트를 형성하기 위해 사용된 동일한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 수득한다. 더욱 바람직하게는, 표적 핵산의 비랜덤 단편화 단계 및 야생형 단편화 프로브 세트의 수득 단계는 단일 조성물에서 동시에 수득한다. 더욱 바람직하게는, 측정 단계 전에 추가의 단계가 포함된다. 이러한 추가의 단계는 NLF의 제2 세트를 분리하는 단계(여기서, 제2 세트의 구성원은 이본쇄 영역 및 제1 결합 잔기를 포함한다) 및 제1 결합 잔기를 고체 지지체에 부착된 제2 결합 잔기에 결합시키는 단계를 포함한다. 측정 단계 전에 추가의 단계가 포함될 수 있다. 이 단계는 제2 NLF 세트의 구성원을 하나 이상의 포획 프로브와 하이브리드화하고(여기서, 포획 프로브는 일본쇄 영역 및 제1 결합 잔기를 포함한다) 제1 결합 잔기를 고체 지지체에 부착된 제2 결합 잔기에 결합시킴으로써 제2 NLF 세트를 분리하는 단계를 포함한다.
또다른 양태에 있어서, 표적 핵산내의 돌연변이를 검출하는 방법은, 하나 이상의 휘발성 염을 함유하는 조성물에서 표적 핵산을 랜덤 단편화하여 비랜덤 길이 단편(NLF)의 세트를 형성하는 단계 및 액체 매트릭스로 IR-MALDI 질량 분석법을 사용하여 NLF 세트의 구성원 질량을 측정하는 단계를 포함한다.
또다른 양태에 있어서, 배경 노이즈를 감소시키는 방법이 제공된다. 이 방법에 있어서, 샘플을 휘발성 염의 조성물로 세척한 다음 샘플로부터 증발시킨다.
IR-MALDI를 사용하는 이본쇄 핵산의 분석
IR-MALDI는 이본쇄 핵산의 분석에 유리하게 사용된다. 본원에 제시된 바와 같이, 보다 긴 단편을 분석하기 위해 액체 매트릭스는 핵산의 질량 분석법에 적합성인 염, 예를 들어 아민염(암모늄 염 또는 기타 염을 포함함)을 포함하여 이온 강도를 증가시킨다[참조: Nordhoff et al. Mass Spectrom. Rev. 1996, 15, 67-138].
본원에 예시된 바와 같이(실시예), 9kDA 내지 500kDA 범위의 이본쇄 DNA 분자가 MALDI TOF 질량 분석법에 의해 탈착 및 분석된다. 매트릭스로서 글리세롤을 사용한 IR-MALDI는 염의 첨가를 통해 이온 강도를 조절함으로써 보다 거대한 이본쇄 DNA에 대해 우수한 결과를 나타냈다. 70개 염기쌍 이상을 포함하는 이본쇄 분석물을 프로빙하는 경우, 매우 적은 단편화 및 피코몰 이하의 통상적인 감수성이 IR-MALDI에 의해 관찰되었다. 낮은 질량 범위(약 70bp 이하)에 있어서, 매트릭스로서 6-아자-2-티오티민(ATT)를 사용한 UV-MALDI가 사용된다. 이본쇄 형태의 실질적인 정량 검출이 70머에 대해 관찰되었다. 그러나, 보다 거대한 단편을 사용한 UV-MALDI는 현저한 단편화에 의해 달성되었으며, 그 결과는 감수성 및 질량 분해능을 감소시켰다.
자동화 분석
본원에 기술된 방법은 자동화 공정의 일부로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허원 제09/285,481호는 샘플 제조, 장치사용 및 생체고분자 샘플의 분석을 통합하는 완전한 자동화 척도 분석 시스템을 제공한다. 이 시스템은 검출 및 분석의 분석학적 방법, 예를 들어 질량 분석법, 방사표지, 질량 태그, 화학적 태그, 형광 화학발광 및 이러한 표지 잔기를 로보트 기술 및 자동화 화학 반응 시스템에 통합시켜 처리량이 높은 정확한 자동화 공정 라인을 제공한다. 본원에 기술된 장치사용 및 공정은 자동화 공정 및 임의의 자동화 분석 시스템 또는 프로토콜에서 수행 및 통합될 수 있다.
완전한 자동화 척도 분석 시스템은 장치사용을 통합하여 생체고분자 샘플의 분석을 가능케 한다. 샘플은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 모든 생체고분자, 예를 들어 핵산, 단백질, 펩타이드 및 탄수화물이 포함된다. 시스템은 로보트 기술 및 자동화 화학 반응 시스템에 검출 및 분석의 분석학적 방법, 예를 들어 질량 분석법, 방사표지, 질량 태그, 화학적 태그, 형광 및 화학발광을 통합시켜 산출량이 높은 정확한 자동화 공정 라인(APL)을 제공한다.
키트
본원에는 액체 매트릭스를 사용하여 IR-MALDI를 수행하기 위한 키트가 제공된다. 이 키트는 특정한 조건 뿐만 아니라 IR-MALDI를 수행하기 위한 액체 및 지지체 및 임의의 장치를 포함한다. 이 키트는 또한 지지체상에 배열로 정의된 위치에서 고정화된 하나 이상의 표적 생물학적 거대분자를 포함하는 배열을 포함하는 지지체를 함유할 수 있다.
하기 실시예는 단지 설명을 위해 포함된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
70 내지 2180개 뉴클레오타이드를 함유하는 핵산 분자의 MALDI 질량 분석법
본 실시예는 액체 매트릭스내에 핵산 분자의 삽입이 핵산 분자의 정확한 질량 측정을 가능케 함을 증명한다.
A. 재료 및 방법
1. 샘플
합성 올리고데옥시뉴클레오타이드는 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech)(Uppsala, Sweden)로부터 구입한다. 70머는 공급자에 의해 FPLC-정제되었고; 보다 작은 올리고뉴클레오타이드는 추가의 정제없이 사용된다. 플라스미드 DNA는 제조업자의 권장사항에 따라 퀴아겐(Qiagen) 미니프렙 키트(QIAGEN GmbH; Hilden, Germany)를 사용하여 이. 콜라이 균주 DH5α로부터 정제한다. 제한 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 게엠베하(New England Biolabs GmbH)(Schwalbach/Taunus, Germany)로부터 구입하고; 플라스미드 DNA의 제한 효소 분해는 공급자의 프로토콜에 따라 수행한다. MALDI 질량 분석법을 위해 의도된 샘플은 10mM EDTA 및 2M NH4아세테이트로 조절하고, 2용적의 에탄올로 침전시킨다. 펠렛을 70% 에탄올로 1회 세척하고, 대략 0.5pmol/㎕의 농도까지 물에 용해시킨다.
1206개 뉴클레오타이드 시험관내 전사물을 합성하고, T3 RNA 폴리머라제(MBI Fermentas; Vilnius, Lithuania)에 대한 주형으로서 Sca l 분해된 플라스미드 pBluescript KS+를 사용하여 표준 공정[참조: Kirpekar et al., Nucl. Acids Res. 22: 3866-3870(1994)]에 따라 침전시킨다. 10㎕ 포로스 50 R2(PerSeptive Biosystems; Framingham, MA) 역상 컬럼을 제조하고, 문헌[참조: Kussman et al., J. Mass. Spectrom. 32: 593-6010(1997)]에 기술된 바와 같이 3% 아세토니트릴/10mM 트리에틸 암모늄 아세테이트(TEAA)로 평형화시킨다. RNA 샘플을 0.3M TEAA로 조절하고, 컬럼상에 적재한다. 컬럼을 200㎕ 3% 아세토니트릴/10mM TEAA로 세척하고, 샘플을 10㎕ 25% 아세토니트릴/10mM TEAA로 용출시킨다.
연속하여 동결건조시키고, 용출물을 5㎕ 물에 용해시키며, 계산된 샘플 농도는 1pmol/㎕이었다. 미코플라스마-감염된 HeLa 세포로부터 조 DNA 제제를 제조하고, PCR은 프라이머 5'-CGC CTG AGT AGT ACG TTC GC-3'(서열 1) 및 5'-GCG GTG TGT ACA AGA CCC GA-3'(서열 2) 및 재조합 Taq DNA 폴리머라제(MBI Fermentas)를 사용하여 실질적으로 문헌[참조: Hopert et al., J. Immunol. Meth. 164:91-100(1993)]에 기술된 바와 같이 수행한다. PCR은 미코플라스마(Hopert et al., J. Immunol. Meth. 164: 91-100(1993)]의 16S rRNA로부터 기원하는 대략 515bp DNA 단편을 생성하지만, PCR 산물의 정확한 길이는 미코플라스마 종이 알려져 있지 않기 때문에 예상할 수 없다.
PCR에 의해 재증폭은 동일한 프라이머 세트를 사용하여 동일한 조건하에 수행하며, 최종 산물은 4mM EDTA/2M NH4아세테이트로 조절하며, 제한 효소 분해에 대해 기술된 바와 같이 침전시킨다. 펠렛을 200㎕ 물에 용해시키고, 제조업자에 의해 권장된 바와 같이 100㎕ 물을 사용한 3회 연속 디아필트레이션에 의해 마이크로콘-100(Amicon GmbH; Witten, Germany) 미세농축기상에서 정제한다. 보유물을 동결건조시키고, UV 분광계측법에 의해 측정한 농도가 0.6pmol/㎕로 될 때까지 물에 재용해시킨다.
2. 샘플 제조
IR-MALDI를 위해 글리세롤을 매트릭스로서 사용한다. 글리세롤을 동일한 용적의 H+ 양이온 교환 비이드 현탁액(Dowex 50W-X8; Biorad AG; Munich, Germany)와 함께 항온처리하여 핵산 주쇄 포스페이트의 연속적인 알칼리 염 형성을 감소시킨다. 전형적으로, 0.5 내지 1㎕의 글리세롤을 표적상의 동일한 양의 수성 분석 조성물과 혼합하여, 분석물 질량에 따라 약 10-4내지 10-7의 샘플의 최종 분석물 대 글리세롤 몰비를 수득한다. 혼합물을 약 1 내지 2mm2의 면적에 걸쳐 균일하게 염색하여 스테인레스 강 기질 위에 균일하고 투명한 박층을 형성한다. 샘플을 질량 분광계에 도입하기 전에, 물을 약 10-2-1 Pa의 압력에서 증발시킨다.
UV-MALDI 질량 분석법을 위한 샘플은 20% 아세토니트릴중의 50g/L 3-하이드록시피콜산(3HPA) 조성물 0.7㎕와 10-5내지 10-6M 수성 분석 조성물 1㎕를 표적 혼합하여 제조한다. 약 10개 암모니아-적재된 양이온 교환 비이드를 차가운 공기 스트림에서 건조시키기 전에 샘플에 첨가한다[참조: Nordhoff et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 6: 771-776(1992)].
3. 장치
실험은 3.5m 등량의 흐름 길이의 사내 MALDI 일단계 리플렉트론 흐름 시간(refTOF) 질량 분광계를 사용하여 수행한다[참조: Berkenkamp et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 11: 1399-1406(1997)]. 질량 분광계는 또한 선형 TOF(linTOF) 방식으로 사용할 수 있다. 특별히 언급되지 않는 한, 실험은 리플렉트론- 및 포지티브 이온 방식으로 수행한다.
이온은 정적 또는 지연된 이온 추출(DE)을 사용하여 분리된 추출 공급원에서 약 16 내지 25kV의 전체 전위차에 의해 가속화된다. 쉐브론(Chevron) 마이크로-채널 플레이트(Galileo Co.; Sturbridgem MA)상에 양극 앞에 10mm 적재된(이온 질량에 따라 약 20 내지 40kV의 이온 충격 에너지), 전환 디노드를 갖는 베네티안 블라인드 제2 전극 증폭기(EMI 9643)가 이온 검출에 사용된다. 고도의 질량 이온의 경우, 전환 디노드와 전극 증폭기 양극 사이의 전위는 제2 이온을 효율적으로 사용함으로써 이온 시그날을 증가시키기 위해 수천 볼트로 설정된다. 최대 질량 분해능이 수천 달톤 이하의 질량 범위에서 발견되는 경우, 2개의 전극 사이의 전위는 제2 전극을 검출하고 제2 이온의 시간(및 질량) 분산을 피하기 위해 약 500V 이하로 유지한다(실시예, 도 2A 참조). 시그날은 약 0.5ns(LeCroy 9350)의 시간 분해능으로 일과성 기록기에 의해 처리된다. 디지탈화된 데이타는 저장 및 추가의 평가를 위해 PC로 옮긴다.
IR-MALDI 실험을 위해, 2.94㎛에서 방사하는 Er-YAG-레이저(Spectrum GmbH; Berlin, Germany; τ=80-90ns, 발포당 에너지 안정성 약 ±2-4%)가 사용된다. 35nm(τz=6ns)에서 UV를 방사하는 진동 삼중선 Nd-YAG 레이저가 IR-MALDI 및 UV-MALDI 사이의 직접적인 비교를 위해 사용된다. 단일 레이저 펄스는 45°각도하에 샘플상에서 대략 150㎛(IR) 또는 100㎛(UV)의 스폿 직경에 집중된다. 샘플은 약 5㎛ 분해능을 갖는 CCD 카메라로 동일계 내에서 관찰된다.
B. 결과
약 50개 이상의 뉴클레오타이드를 상당한 양으로 포함하는 DNA의 UV-MALDI 스펙트럼은 단지 linTOF, DE 모드에서만 관찰할 수 있다. 도 1A 및 1B는 합성 DNA 70머(약 21.5kDA) 및 3HPA 매트릭스(355nm)에 대한 2개의 작동 모드에 대한 스펙트럼 질의 현저한 차이를 입증한다. 리플렉트론 방식으로 수득된, 도 1B의 스펙트럼 질은 몇몇 관점에서 도 1A의 질보다 매우 열등하다. 시그날 강도 및 시그날-대-노이즈 비율은 질량 분해능이 도 1A의 스펙트럼에서 65에서 15로 저하(M/Δm; FWHM)되었기 때문에 현저히 저하되었다. 도 2B에서 대략 2000Da 이하의 질량 범위내의 포화된 시그날은 제시된 강도의 분석물 시그날을 수득하는데 필요한 증가된 레이저 플루언스를 반영한다. 질량 분해능의 손실은, 대부분의 경우 피크의 낮은 질량 경사 모서리의 결과로서, 풍부한 대사가능한 작은 중성 손실을 신호한다. 정확한 질량 측정은 스펙트럼 질의 손실이 대단히 예상된다.
매트릭스로서 글리세롤과 동일한 DNA 70머의 IR-MALDI 스펙트럼(refTOF, DE 모드)은 도 1C에 제시되어 있다. 이 스펙트럼 질은 시그날 강도 및 질량 분해능과 관련하여 선형 모드에서 관찰된 UV-MALDI 분석(도 1A)과 비교할 만하다. 염기 피크는 가파르게 상승하는 낮은 질량 모서리를 갖는데, 이는 특정한 대사가능한 작은 중량 손실의 실질적인 부재를 입증한다. 이러한 행태는, 매우 유연한 탈착 방법이 높은 이온 안정성의 핵산 이온을 형성하기 때문에 이를 정성화하는 매트릭스로서 글리세롤을 사용한 핵산의 IR-MALDI의 경우 일관되게 관찰된다. 이는 매트릭스로서 석신산에 의해 수득된 핵산의 IR-MALDI 스펙트럼과 엄격하게 대조된다[참조: Nordhoff et al., Nucl. Acids Res. 21: 3347-3357(1993), 도 1d 및 1e]. 따라서, 글리세롤에 대한 사실상의 모든 대사안정한 중성 손실의 부재는 선행 경험에 의해서는 예상되지 않는, 매우 예상치 못한 결과이다.
IR-MALDI 질량 분석법에 의한 핵산의 분석은 광범위한 질량 범위의 핵산, 즉 소형 올리고뉴클레오타이드 내지 2000개 이상의 뉴클레오타이드를 갖는 분자에 유용하다(도 2). 합성 21머 DNA의 refTOF IR-MALDI 질량 스펙트럼은 도 2A에 제시되어 있다. 지연된 이온 추출을 사용하면, 이러한 질량 범위에서 단백질에 대한 장치로 수득한 분해능과 비교할 수 있는 1050(FWHM)의 질량 분해능이 수득되었다. 스펙트럼내에 나타난 분석물 피크의 고도의 질량 부분상의 몇몇 불량하게 분해된 피크는, 이온 검출 시스템에 의한 질량 분해를 저하시키지 않기 위해 단지 제2 전자만을 우선적으로 검출하기 위한 모드에서 작동된, 전환 디노드에서 생성된 잔류하는 제2 이온의 검출 유사물이다.
도 2B는 280bp, 360bp, 920bp 및 1,400bp의 4개 단편을 생성하는, 플라스미드(BglI 및 RsaI으로 분해된 pBluescript-KS+)의 제한 효소 분해에 따른 높은 질량 범위를 입증한다. 모든 4개의 시그날은 일본쇄를 나타내며, 2개의 상보성 스트랜드의 복합 시그날이다. 경우에 따라, 이본쇄 올리고머의 매우 약한 시그날이 이 스펙트럼에서 뚜렷하다. 정제된 글리세롤로 제조된 샘플에서 이본쇄의 해리는 H+ 이온 교환 수지에 의한 산성화에 관여한다. 모든 높은 질량 이온 시그날의 질량 분해는 약 50(FWHM)이고, 이온 질량과 상대적으로 독립적인 것으로 나타난다.
도 1C의 IR-MALDI 질량 스펙트럼은 제한 효소 분해(130bp, 640bp 및 2,180bp)에 대해 측정된 질량 상한치를 나타낸다. 2,180개 뉴클레오타이드 일본쇄 단편의 시그날은 95℃의 온도로 5분 동안 제한 분해물을 가열시킨 후에만 수득되는데, 이는 이러한 거대한 DNA 단편이 1400bp 이하의 DNA 단편과는 대조적으로 사용된 조건하에 일본쇄 내로 분리되지 않기 때문이다. 이 스펙트럼에서 2,180개 뉴클레오타이드에 대한 약 30의 비교적 불량한 질량 분해능 및 강력한 배경 시그날은 현재의 조건하에 대략 700kDa의 핵산의 IR-MALDI 질량 분석법에 대한 질량 상한치를 나타낸다. 따라서, 이본쇄 2,180개 뉴클레오타이드 단편은 검출할 수 없다.
1206개 뉴클레오타이드 RNA 시험관내 전사체를 포함하는 거대한 RNA 분자의 IR-MALDI 질량 분석법이 또한 가능하다(도 2D). UV-MALDI에 대해 잘 기록되어 있는, DNA와 비교된 RNA의 이온 안정성 증가는 검사된 질량 범위에서 IR-MALDI의 경우 관찰되지 않았다. 거대한 RNA 이온 뿐만 아니라 거대한 DNA 이온은 반사 모드에서 TOF 분석의 경우에도 충분히 안정한, 비교가능한 안정성이 있는 것으로 나타났다. 약 50kDa에 집중된 거대한 혹은 대사가능한 단편보다는 샘플의 불순물을 반영하는 것으로 생각된다. 낮은 질량 부분에서 피크의 비교가능한 가파른 상승은 단일 염기 등의 작은 중성의 매우 제한된 손실로 증명한다.
매트릭스로서 글리세롤의 한가지 잇점은 우수한 발포당 재생산성 및 질량 정확성이다[참조: 200 내지 400ppm; Nordhoff et al., Nucl. Acids Res. 21: 3347-3357(1993)]. 단백질에 대해 최초로 측정된 이들 값은 또한 보다 작은 올리고뉴클레오타이드의 분석에 효과적이다. 질량 정확성은 질량 의존적이다. 안지오텐신 II(1047Da) 및 소 인슐린(5743Da)에 의한 외부 2점 교정을 사용하여, 21머(6398Da)의 질량을 공지된 질량의 ±2Da, 즉 0.003%의 정확성(도 2A 참조)내에서 측정한다. 70머의 분자량(이론적 질량 21517Da)은 ±25Da, 즉 발색단 C 올리고머(M+, 2M+, 3M+)으로 교정된, 도 1C의 스펙트럼으로부터 0.1%의 질량 정확성내에서 측정한다.
분석된 높은 질량 DNA의 상이한 샘플 각각에 대해, 측정된 질량은 서열로부터 유도된 이론적 질량의 약 1% 이하였다(예를 들어, 도 2B 및 2C). 2개의 일본쇄의 평균 질량은 DNA 제한 효소 단편의 경우에 이론적 질량으로서 사용된다. 2개의 일본쇄의 질량은 약 1% 이상으로 상이하지는 않았다. 단지 하나의 거대한 질량 RNA가 측정되었다(도 2D). 이 RNA의 측정된 질량은 388,270Da인 반면, 유전자 서열로부터 계산된 질량은 386,606Da이었다. 샘플이 3개의 외부 뉴클레오타이드중 하나에 의해 신장된 산물이 덜 풍부한 유전자 서열로부터 예상된 종의 이종성 혼합물인 경우[참조: Melton et al., Nucl. Acids Res. 12:7035-7056(1984)], RNA 샘플의 실질적인 질량은 서열로부터 계산된 질량보다 큰 약 500Da일 것이다. 따라서, DNA에 대해 관찰된 바와 같이 약 1% 이상의 질량 정확성이 RNA의 경우에 달성될 수 있을 것이다.
분자량이 100 내지 400kDa인 거대한 DNA 또는 RNA의 외부 4점 교정의 경우, 발색단 C, 예를 들어 10M+, 20M+, 30M+, 40M+의 세포집단 또는 IgG 모노클로날 항체, 예를 들어 2M+, 3M+, 4M+의 다량체가 사용된다. 500kDa를 초과하는 분석물의 경우, IgG 모노클로날 항체를 사용한 교정은 더욱 정확하다. DNA 또는 RNA 교정물을 사용하는 비공지된 DNA 단편의 교정이 더욱 바람직할 수 있는데, 이는 더욱 정확한 질량 측정을 유도한다.
매트릭스로서 글리세롤을 사용한 거대한 핵산의 IR-MALDI 질량 분석법 감수성을 평가하기 위한 실험은 대략 515개 뉴클레오타이드를 갖는 비공지된 서열의 PCR 산물로 수행하며, 질량은 318,480Da인 것으로 측정되었다. 이들 측정치의 경우, 이온 교환 정제하지 않은 글리세롤이 사용된다. 스펙트럼은 이본쇄 잔기의 우세한 시그날을 나타낸다. 임시로 정제된 글리세롤로 제조된 샘플에서 이본쇄의 해리는, 추가의 파라미터가 IR-MALDI 조건하에 이본쇄 해리에 관여할 수 있으나, 양이온이 교환된 양성자에 의한 글리세롤의 산성화에 관여한다.
UV 분광계측에 의해 측정된 희석 실험에 대한 출발 농도는 0.6pmol/L이었다. 질량 스펙트럼은 상이한 양의 샘플을 표적에 적재하여 수득한다(도 3). 도 3A에 제공된 단발 질량 스펙트럼의 경우, 300pmol의 PCR 산물이 적재된다. 이본쇄에 대한 S/N 비율이 100이상이고 질량 분해능이 65(FWHM)인 이러한 스펙트럼의 질은 약 10-7의 분석물 대 매트릭스 비율(A/M)이 이러한 크기의 분석물(약 320kDa)에 적합함을 나타낸다.
도 3B내의 질량 스펙트럼은 3fmol 총 적재를 사용하여 수행한다(A/M 약 2×10-9). 강력한 배경은 낮은 질량 범위에서 우세하였다. 전체 시그날 강도, 질량 분해능(ds-이온 시그날의 경우 약 25FWHM) 및 S/N 비율은 도 3A와 비교하여 현저히 저하되었다. 질량 측정은 여전히 약 1%의 정확성으로 측정할 수 있다. 도 3C내의 스펙트럼은 표적상에 약 270㎛ 직경 샘플 및 단지 300attomol(A/M 약 8×10-10)의 전체 샘플 적재를 형성하는, 매우 작은 샘플 용적으로부터 수득한다. 이러한 작은 샘플 용적은 마이크로피펫[참조: Little, Anal. Chem. 69: 4540-4546(1997)]을 사용하여 소량을 분배시키거나, 적합한 글리세롤/물 혼합물의 표준 ㎕ 용적으로 분석물을 제조함으로써 실현될 수 있다. 후자의 경우, 물은 진공내로 샘플을 삽입하기 전에 또는 삽입 중에 증발시킨다. 단지 약 10의 불량한 질량 분해능은 약 3% 이상의 질량 정확성을 위해 사용된 특정한 장치 및 검출 시스템에 대한 한계로서 분석물 300attomol을 분류한다. UV-MALDI 질량 분석법에 대해 보고된 값과 비교하여[참조: Tang et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 8: 727-730(1994); 도 5 및 6 참조], IR-MALDI 질량 분석법에 대해 본원에서 수득된 감수성은 이러한 크기의 핵산에 대해 약 2 내지 3배 이상의 개선을 입증한다.
실시예 2
IR 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분석법의 실행
생물학적 거대분자의 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분석법(IR-MALDI-MS)에 있어서 중간 적외선, Er-YAG(2.94㎛ 파장, 80 내지 90ms 펄스 폭) 및 Er-YSGG 적외선 레이저(2.79㎛ 파장, 80ns 펄스 폭)에서 방사하는 2개의 레이저의 실행 특징을 연구한다. 매트릭스로서 글리세롤 및 석신산을 사용한다. IR-MALDI 에 있어서, 레이저 발포당 샘플 소비는 전형적으로 UV-MALDI의 소비를 약 2배수까지 초과한다. 매트릭스로서 글리세롤을 사용하면, 발포당 이온 시그날의 재생산성은 UV-MALDI에서 수득된 최적 값에 필적할 수 있다. 질량 측정의 정밀성 및 정확성에 있어서도 동일하다. 석신산의 경우, 이들 모든 값은, 건조된 소적 제제에서 전형적으로 발견된 바와 같이 강력한 샘플 이종성으로 인해 현저히 나빠진다. 대사가능한 단편화는 원료 질량 범위에서 UV- 및 IR-MALDI를 비교할 수 있지만, 약 20kDA 이상의 질량 범위에서 IR의 경우에 현저히 적은데, 이는 IR-MALDI의 경우 개선된 질량 분해능 및 연장된 높은 질량 한계를 유도한다.
이러한 예에 있어서, 2.94㎛ 및 2.79㎛에서 방사하는 ER 레이저로 수득한 IR-MALDI 분석에 대한 결과 및 실행 데이타가 제시된다. 특히, 대사가능한 단편화 정도는 높은 분자량 분석물의 질량 분해능을 위해 상이한 것으로 입증되었다.
실험
실험은 3.5m 등량의 흐름 길이의 사내 일단계 리플렉트론 TOF 질량 분광계로 수행한다. 질량 분광계는 또한 선형 모드로 사용될 수 있다. 구체적으로 언급되지 않는 한, 여기에 보고된 실험은 리플렉트론 방식으로 수행한다. 분리된 추출 공급원에 있어서, 이온은 정적 또는 지연된 추출을 이용하여 12 내지 20kV의 전체 전위차를 통해 가속화된다. 지연된 모드 추출에 있어서, 8kV의 최대 전위차가 스위칭될 수 있고, 이온 추출을 위한 최소 지연은 120ns이다. 사용된 모든 매트릭스에 대한 포지티브 또는 네가티브 이온 모드에서는 이들 작동 조건하에 어떠한 아크도 관찰되지 않는다. 쉐브론(Chevron) 마이크로-채널 플레이트 검출기(Galileo Co.; Sturbridgem, MA, USA)상에 양극 앞에 10mm 적재된(이온 질량에 따라 약 20 내지 27kV의 이온 충격 에너지), 전환 디노드를 갖는 베네티안 블라인드 제2 전극 증폭기(EMI R2362)가 이온 검출에 사용된다. 시그날은 대다수의 실험에 있어서 2.5ns의 시간 분해능(LeCroy 9450A)를 갖는 임시 기록기에 의해 처리된다. 높은 질량-분해능 실험의 경우, 시간 분해능이 0.5ns인 LeCroy 기록기가 사용된다. 데이타를 저장 및 추가의 실험을 위해 PC로 옮긴다. 장치는 2개의 적외선 레이저가 장착되어 있는데, 하나는 2.94㎛(Er-YAG:Fa.Spectrum GmhH, Berlin, Germany: τ=80-90ns, 발포당 에너지 안정성 약 ±2-4%)에서 방사하고, 두번째는 2.79㎛(Er-YSGG: Schwartz Electro Optics. USA: τ=80ns; 에너지 안정성 약 ±2%)에서 조사한다. 355nm(τ=16ns)에서 UV를 방사하는 주파수 삼중선 Nd-YAG 레이저가 IR-MALDI 및 UV-MALDI 사이의 직접적인 비교를 위해 사용된다. 단일 레이저 펄스는 45°각도하에 샘플상에서 대략 200㎛(IR) 또는 100㎛(UV)의 스폿 직경에 집중된다. 샘플은 약 5㎛ 분해능을 갖는 CCD 카메라로 동일계 내에서 관찰된다. 스테인레스 강 기질을 약 150 내지 170K의 온도까지 액체 질소로 냉각시킬 수 있다. 이의 온도는 ±5K의 정확성으로 열-커플에 의해 모니터한다.
샘플 제조
각종 소형 분자를 상술된 바와 같이 IR-MALDI에서 매트릭스로서 사용한다. 석신산(고체 매트릭스) 및 글리세롤(유체 또는 동결, 고체)이 바람직하다. UV-MALDI에서 통상적인 매트릭스인 DHB(10% 2-하이드록시-5-메톡시벤조산과 혼합된 2,5-데하이드록시벤조산)이 또한 IR-MALDI에서 작용하며, 일부 경우에 비교를 위해 사용된다. 추가로, 화합물의 혼합물, 예를 들어 석신산/DBH 또는 석신산/TRIS(트리스-하이드록시메틸아미노메탄)이 적합한 것으로 밝혀졌다. 고체 매트릭스 샘플은 약 1 내지 3㎕의 104-10-5M 수성 분석물 용액을 표적에 대한 1 내지 5㎕의 30g/L 매트릭스 용액과 혼합한 다음 차가운 공기 스트림하에 건조시킴으로써 표준 건조된 소적 방법을 사용하여 제조한다.
글리세롤의 경우, 분석물을 0.5 내지 10g/L의 농도로 직접 용해시키거나, 글리세롤을 수성 분석물 용액과 혼합하여 분석물의 질량에 따라 최종 분석물-대-글리세롤 몰 비가 2×10-4-1×10-5가 되도록 한다. 전형적으로 1㎕의 용적을 스테인레스 강 기질 위에 적용하고, 약 3 내지 4mm2의 부분에 걸쳐 균일하게 염색하여 균일하고 투명한 박층을 형성한다. 수성 분석물 용액을 글리세롤과 혼합하는 경우, 샘플을 질량 분광계에 도입하기 전에, 물을 통상적으로 약 10-2-1 Pa의 압력에서 증발시킨다. 샘플을 질량 분광계에 직접 삽입하거나, 삽입 전에 액체 질소중에서 약 150 내지 170K의 온도까지 냉각시킨다.
조사된 매트릭스의 경우, IR-MALDI는 염 및 완충제와 관련하여 매우 내성이 있는 것으로 밝혀졌다. 200mM 이하의 농도의 NaCl, 20%(w/v) 이하의 사카로즈 또는 100mM 이하의 트리스/HCl 완충제를 함유하는 샘플의 스펙트럼은 예를 들어 글리세롤 뿐만 아니라 석신산에 의해 스펙트럼 질의 현저한 손실 없이 수득되었다.
결과
샘플 소비 및 분석 감수성
MALDI의 분석 감수성은 분석에 사용된 분석물 용액의 최소 농도 또는 이용가능한 분석물의 전체 양에 의해 제한될 수 있다. 실질적인 측정을 위해, 제조에 사용된 전체 샘플 용적 및 샘플중의 분석물-대-매트릭스는 제공된 상황에 적응시키기 위해 특정한 범위내로 조절할 수 있다. 이러한 제한 뿐만 아니라 전형적인 부분에 있어서, IR-MALDI에서 이들 정량 값이 제시되고, 상응하는 UV-MALDI 값과 비교된다. 서문으로서 IR- 및 UV-MALDI 사이의 약간의 일반적 차이가 언급될 것이다.
샘플에 대한 비교가능한 레이저 스폿 크기가 제공되면, UV 레이저 빔과 비교하여 IR에 의해 100 내지 1000배 많은 물질이 흡수되는데, 이는 샘플내로의 흡수율이 더욱 작아지고 투과 심도가 더욱 높아지기 때문이다. 본원에 기술된 실험 조건하에, IR 및 UV내의 단발 이온 시그날은 전형적으로 비교가능한 강도를 갖는다. IR-MALDI에서 레이저 펄스당 제거된 재료가 많을 수록, 당해 재료는 실질적으로 실험에 의해 관찰되는 바와 같이 보다 큰 세포집단 및 소형 입자로서 주로 제거되고/되거나, 이온 수율은 2배 내지 3배까지 적어진다.
낮은 질량 시그날의 강도, 시그날-대-노이즈 비율 및 질량 분해능은 기록된 질량 스펙트럼 질에 대한 주요 표준이다. 스펙트럼의 시그날 강도 및 질에 대한 표적상의 최적 분석물-대-매트릭스 몰 비율은 분석물의 분자량에 따라 달라진다. 분자량이 약 50kDa 이하인 분석물의 경우, 2×10-4내지 2×10-5의 비율인 최적인 것으로 밝혀졌다. 10-5의 비율은 질량이 50kDa를 초과하는 분석물에서 가장 적합한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 특히 낮은 질량 범위에 있어서, IR-MALDI내의 최적 분석물 농도는 UV-MALDI에서 전형적으로 사용된 것보다 대략 1 내지 2배수까지 초과한다. 현저한 질의 스펙트럼은 분석물의 분자량에 따라 2×10-6-10-7이하의 분석물-대-매트릭스 비율에 대해 수득할 수 있다. 이는 1 내지 50pmol의 레이저 발포당 샘플 소비에 상응한다. 통상적인 적용에 있어서, IgG 모노클로날 항체(약 150kDa)의 스펙트럼은 매트릭스로서 석신산 또는 글리세롤을 사용하는 10-7M 수용액을 사용하여 상당한 질로 수득되었다. 이는 UV-MALDI에서 단지 몇 attomol의 값과 비교한다.
이 결과는 리소자임/글리세롤 제제에 대한 수득가능한 감수성을 입증하였다. 여기서, 약 0.7fmol의 제조된 리소자임의 전체 양에 상응하는, 1.2×10-7mol/L 동결된 글리세롤 용액중 5.5×10-3㎕를 제조에 사용한다. 이는 약 10-8의 몰 A/M-비율에 상응한다. 표적상의 동결된 샘플은 샘플상의 레이저 스폿 직경의 약 1.5배의 직경을 갖는다. 스펙트럼에 대한 총 10회의 레이저 노출후, 일부 샘플은 여전히 표적상에 잔류한다. 결과적으로, 평균 샘플 소비는 단일 스펙트럼당 70attomol 이하이다. 그러나, 이와 같이 낮은 A/M 비율을 사용하는 경우, 질량 분해능은 m/Δm=10-20으로 낮아진다. 시그날-대-노이즈(S/N) 비율이 또한 실질적으로 저하되었고, 낮은 질량 배경 시그날은 과다하게 되었다. UV-MALDI의 경우, 높은 젭토몰 범위내의 샘플 소비가 보고되었다[참조: Jespersen et al. (1996) p. 217 in Mass Spectrom. in Biol. Sci, Burlingame, Ed.].
IR-MALDI에 있어서, 또한 (비-특이적) 분석물 올리고머의 수율 또는 다중 하전된 이온의 A/M 비율에 대한 현저한 의존성이 있다. 이들 경향은 UV-MALDI와 비교하여 IR-MALDI에 있어서 더욱 현저하다. 2×10-4의 A/M-비율을 갖는 제제로부터 암탉 리소자임의 질량 스펙트럼이 수득되었다. 이 스펙트럼에서 25머 이하의 리소자임의 호모-올리고머(약 500kDA)가 동정되었다. 역으로, 다중 하전된 분석물 이온의 시그날은 약 10-6값 이하의 A/M-비율에 대한 스펙트럼에서 우세한 반면, 올리고머 시그날은 노이즈 수준 이하의 값으로 감소된다. 이들 경향은 매트릭스로서 석신산 및 수화 물에 의해 수득되었고[참조: Sadeghi (1997) Rapid Commun. Mass. Spectrom. 11: 393], 50kDa를 초과하는 분자량을 갖는 분석물에서 특히 현저하였다. 고수율의 분석물 호모-올리고머가 관찰되면, 분산의 세목, 특히 가장 풍부한 올리고머 시그날은 이온 추출 조건의 변화, 예를 들어 2단계 이온 공급원에서 낮은(연성 또는 온화한) 또는 높은(경성 또는 거친) 이온 추출 자기장을 사용함으로써 현저히 영향을 받을 수 있다. 낮은 추출 자기장은 고도의 올리고머화 방향으로 분산을 이동시킬 것이다. 이러한 관찰은 상이한 추출 조건하에 분광계의 인수에 있어서 가능한 반영 차이 이외에 신장 탈착 징후에 있어서 기체상 공정의 강력한 징후이다.
재생산성
현재 사용된 Er-YAG 레이저의 경우, 펄스 발포당 안정성은 최상의 UV 레이저의 값에 완전히 필적할 수 있는 값인 약 ±2%이고, 따라서 시그날 변화에 실질적으로 관여하지 않는다. 따라서, 발포당 레이저 에너지 변동은 이들 레이저에서 미약한 역할만을 담당한다. 발포당 시그날 변화의 또다른 공급원은 매트릭스 및 제조 기술에 따라 달라지는 샘플 균질성이다. 석신산 등의 고체 매트릭스는 전형적으로 이종성 미세결정질 패턴을 형성한다. 높은 질 질량 스펙트럼은 "스위트 스폿"으로부터만 달성될 수 있다. DHB(10% 2-하이드록시-5-메톡시벤조산과 혼합된 2,5-디하이드록시벤조산) 등의 일부 매트릭스의 경우, 이는 또한 UV-MALDI에서도 그러하다. UV-MALDI의 경우, 50 내지 100개 스펙트럼은 모든 "스위트 스폿"으로부터 수득할 수 있고, 대조적으로 IR-MALDI에서는 제공된 "스위트 스폿"으로부터 단지 3 내지 4개의 스펙트럼만이 수득될 수 있는데, 이는 노출당 너무 많은 샘플이 소비되기 때문이다.
글리세롤 등의 액체 매트릭스는 매우 균질한 층을 형성하며, 비교가능한 질의 스펙트럼은 샘플 전체의 모든 위치로부터 수득할 수 있다. 또한, 이들 액체 샘플의 표면은 모든 레이저 발포 후에 회수되고, 거의 동일한 질을 갖는 500개 스펙트럼이 전형적인 투과의 동일한 스폿으로부터 수득될 수 있다. 난 리소자임의 스펙트럼은 2Hz의 레이저 반복 속도에서 동일한 위치상의 250개 이상의 발포후에 수득된다. 초기 및 후기 노출 사이에는 시그날 강도, 질량 분해능 또는 S/N 비율에 있어서 현저한 차이가 관찰되지 않았다. 결과적으로, IR-MALDI 스펙트럼의 재생산성은 매트릭스로서 글리세롤이 사용되는 경우, UV-MALDI 제제의 스펙트럼보다 우수하지는 않지만, 이에 필적하는 것으로 밝혀졌다. 석신산 등의 고체 매트릭스이 경우, 발포당 이온 시그날의 재생산성은 문제가 될 수 있으며, 우수한 결과를 위해서는 작업자의 상당한 경력을 필요로 한다.
단편화
단편화는 또한 MALDI-MS에 있어서 중요한 파라미터이다. 일반적으로, 이온 추출 시간과 비교하여 시간 규모 단축에 대한 탈착 및 이온화 공정중에 생성된 소위 "즉발" 단편의 수율은 UV- 뿐만 아니라 IR-MALDI에 있어서 매우 낮다. 이들 단편은 흐름 시간(TOF) 분광계를 반영할 뿐만 아니라 선형으로 이들의 진실의 (단편) 질량에서 검출된다. 이는 또한 지연 시간이 약 1μs 이하인 지연된 추출하에서도 그러하다. IR-MALDI에 있어서는 올리고뉴클레오타이드의 이와 같은 즉발 단편의 다소 증가된 수율이 관찰되지만, 전반적인 수율은 매우 낮았다. TOF 질량 분광계의 자기장 유리 영역에 있어서 ms 내지 수백 ms 시간 규모에 대한 대사가능한 이온 자연붕괴는 훨씬 더 중요하다. 한편, 이는 리플렉트론 (reTOF) 장치에 있어서 질량 분해능을 저하시키지만, 다른 한편으론 후-공급원 자연붕괴(PSD) 모드에서 구조적 분석에 사용될 수 있다. 질량 범위가 약 20kDa 이하인 펩타이드 및 단백질의 대사가능한 단편화의 경우에는 UV- 및 IR-MALDI 사이에서 어떠한 현저한 차이도 관찰되지 않았다. 20kDa 이상의 분자량을 갖는 분석물의 경우, 현저하게 상이한 대사가능한 단편화가 관찰되었다. UV-(매트릭스: DHB) 및 IR-MALDI(매트릭스: 석신산; 매트릭스: 글리세롤)로 수득한 IgG 모노클로날 항체(마우스, MW 약 150kDa)의 reTOF 스펙트럼이 수득되었다. 모 이온의 염기 피크는 IR-MALDI 스펙트럼에 있어서 오히려 대칭 형상을 가지는 반면, UV-MALDI 스펙트럼에서는 낮은 질량 부분상에 강력한 꼬리를 나타냈는데, 이는 대사가능한 자연붕괴의 현저한 양으로 증명된다. 절반 최대에서의 피크 폭 전폭(FWHM)은 매트릭스로서 석신산을 사용하는 경우 UV 스펙트럼에서 2000Da의 값으로부터 IR 스펙트럼에서 1000Da의 값으로 감소하며, 매트릭스로서 글리세롤을 사용하는 경우에는 단지 700Da의 값으로 감소한다. 또한, 분석물 시그날은 이온 공급원의 지연된 단편화로부터 발생하는 UV-MALDI 스펙트럼에 있어서 실질적으로 상승된 기준선위에 존재한다는 것을 주목하여야 한다. 탈착 플루언스가 약 1 내지 1.5배 이온 검출 역치 플루언스 범위내에 잔류하는 경우, IR-MALDI 스펙트럼에서는 어떠한 기준선 왜곡도 관찰되지 않았다.
UV-MALDI에 있어서 대사가능한 자연붕괴의 정도는 공급원 역압의 저하에 따라 현저히 증가하는 것으로 문헌에 보고되어 있다. IgG 모노클로날 항체(마우스)의 2개의 스펙트럼은 상술된 스펙트럼을 수득하기 위해 사용된 4×10-4Pa의 역압과 비교하여 4×10-3Pa의 공급원 역압에서 (a) UV- 및 (b) IR-MALDI로 수득되었다. UV-MALDI 스펙트럼은 낮은 질량 부분에 대한 테일링이 실질적으로 증가된 시그날을 나타냈으며, 특히 올리고머 2M-및 3M2-에 대해 가시적인데 반해, IR-MALDI 스페트럼에서는 이러한 테일링이 관찰되지 않았다.
또다른 관찰은 분석물-대-매트릭스 비율에 대한 대사가능한 단편화의 의존성이다. reTOF UV-MALDI에 있어서, 너무 높은 A/M 비율은 통상적으로 S/N 비율을 감소시키고 질량 분해능을 소실시킬 것이다. 이는 매트릭스로서 발색단 c 및 DHB에 대한 스펙트럼으로 밝혀졌다. 스펙트럼을 수득하기 위해 사용된 10-3의 보다 높은 A/M-비율은 피크의 모 이온 피크와 비교하여 이량체에 대해 더욱 강력한, 강력한 낮은-질량 테일을 생성하였지만, 10-4의 A/M 비율을 갖는 샘플로부터 수득한 스펙트럼에서는 관찰되지 않았다. 사용된 동일한 샘플에서 밝혀진 IR-MALDI 스펙트럼은 이러한 테일링을 나타내지 않았는데, 이는 실질적으로 더 적은 대사가능한 단편화를 나타낸다. "고유한" 매트릭스로서 수화 물을 사용하는 발색단 c의 IR-MALDI의 경우, 몰 A/M 비율은 훨씬 높았는데(약 5×10-3), 현저한 대사가능한 자연붕괴는 관찰되지 않았다[참조: Berkenkamp et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 7003].
일반적으로, 징후내의 매트릭스 중성 및 분광계내의 잔류 기체 분자와 이온의 충돌은 대사가능한 단편의 주요 원인이라는 것을 주목하여야 한다[참조: Spengler et al. (1992) J. Phys. Chem. 96: 9678]. 보다 많은 재료가 IR 대 UV-MALDI에서 탈착되어 더욱 신장된 징후를 나타내고 또한 비례적으로 더욱 많은 흡수된 레이저 에너지가 IR에서 분석물 분자로 된다는 것을 고려하면, 상기 제시된 모든 상이한 조건하에 IR-MALDI에서 보다 적은 대사가능한 단편의 발견이 예상되지 않는다. 직관과는 대조적으로, IR-MALDI는 UV-MALDI보다 더욱 온화한 방법인 것 같다.
접근가능한 질량 범위
보다 낮은 정도의 단편화는, 특히 이온 미러가 사용되는 경우, UV-MALDI에 비해 IR-MALDI에게 매우 높은 질량 분석물의 분석을 위한 잇점을 제공한다. 이는 거대한 모 분자 이온의 강력한 시그날을 유도할 뿐만 아니라, 더욱 중요하게는 이러한 조건하에 UV-MALDI에서와 같이 스펙트럼 질의 손상 없이 이온 검출 역치 플루언스를 약 2배까지 보다 높은 레이저 플루언스를 사용하게 한다. 이는 더욱이 높은 질량 시그날을 증가시킨다.
완전히 접근가능한 S/N 비율 및 m/Δm=50의 질량 분해능을 갖는, 50mM Tris/HCl, 18%(w/v) 당류 및 5mM 디티오트레이톨을 함유하는 수용액으로부터 글리세롤 매트릭스에서 제조된 질량 510kDa의 그라미시딘-S-신세타제의 스펙트럼이 수득된다. 시도된 각종 조건하에 UV-MALDI에 의해서는 이러한 분석물의 어떠한 시그날도 수득할 수 없었다.
IgG 모노클로날 항체(마우스)의 질량 스펙트럼은 TOF 질량 분석기와 조합한 IR-MALDI가 분자량 1MDa를 초과하는 생체분자의 분석에 사용될 수 있음을 입증하였다. 약 2MDa 질량의 13머 호모-올리고머의 다중 하전된 이온은 스펙트럼에서 명백하게 확인할 수 있고, 900,000과 같이 높은 m/z 값을 갖는 다른 올리고머의 이온 시그날은 스펙트럼에서 명백히 확인되었다.
질량 분해능
지연된 이온 추출(DE)가 UV-MALDI-TOF-MS에서 질량 분해능의 증가를 위해 사용된다. 매우 많은 탈착된 샘플 양 및 가능하게는 실질적으로 상이한 징후 신장 역학을 고려하면, DE가 IR-MALDI에서도 유리할 수 있는지는 직접적으로 명백하지는 않다. 사실, 1000Da 질량 범위의 펩타이드의 경우, 질량 분해능은 단지 약 200(FWHM)이고, 다른 비교가능한 조건하의 UV-MALDI의 경우에는 약 1000으로 저하되는데, 이는 이온 발생 과정에서의 차이를 나타낸다. 그럼에도 불구하고, DE는 측정의 정확성내에서 IR- 및 UV-MALDI에 대한 동일한 질량 분해능을 제공한다. 이는 2.94㎛의 Er-YAG 레이저 및 80ns 펄스폭 및 매트릭스로서 석신산에 의해 수득된 reTOF 스펙트럼(음파처리된 그라미시딘-s, MW 1164.5Da)로 입증되었다. 이 스펙트럼내의 질량 분해능은 1000인데, 이는 이중 MCP 검출기(3.0ns)의 시간 분해에 의해 제한된, 3.5ns의 개개 피크의 폭에 상응한다. 멜리틴(2846Da)에 대해 reTOF를 사용하면, 9500의 질량 분해능 및 발색단 c(12360Da)에 대해 1500의 질량 분해능이 수득되었다. 따라서, 펩타이드의 경우 약 50 및 발색단 c의 경우 4의 분해능 향상이 달성되었다.
높은 질량 범위에 있어서, 20kV에서 정적 이온 추출을 갖는 선형 TOF내의 질량 분해능은 IR- 및 UV-MALDI에서 동일하게 약 50의 값으로 제한된다. 두 경우, 질량 분해능은 초기 이온 속도 및 동역학 에너지의 분산에 의해 측정한다. DE를 사용하면, 질량 분해능은 UV-MALDI 뿐만 아니라 IR-MALDI에서 3 내지 약 150의 계수까지 개선될 수 있다.
그러나, 50kDa를 초과하는 분석물의 경우, IR-MALDI에서의 질량 분해능은 UV-MALDI와는 대조적으로 reTOF 분석기에 의해 더욱 개선될 수 있다. 상기 언급된 스펙트럼(IgG 모노클로날 항체의 reTOF 스펙트럼)에 의해 입증된 바와 같이, IR-MALDI에서 강력하게 감소된 대사가능한 단편화는, UV-MALDI 스펙트럼이 약 2000Da의 피크폭인 것과 비교하여, 글리세롤 매트릭스중의 IR-레이저로 탈착된 모노클로날 항체의 모 이온 피크의 경우 단지 700Da의 피크폭을 나타냈다. 약 200의 분해능에 상응하는 700Da의 피크폭은 시험된 모든 실험 조건에서 수득된 최상이었다. 글리세롤 이외의 매트릭스, 또는 보다 긴 펄스폭(≤90ns 대신에 ≥120ns)을 갖는 Er-YAG 레이저, 또는 2.79㎛의 파장 및 80ns의 펄스폭에서 Er-YSGG 레이저에 대한 스위칭을 사용하는 것은 약간 큰 피크폭을 유도하였다. 거대한 질량에 대해 DE를 사용하는 IR-MALDI reTOF 스펙트럼의 경우에는 UV-MALDI에서 수행된 관찰과 일치하게 질량 분해능의 현저한 개선이 관찰되지 않았다. IgG 모노클로날 항체의 전기분무 질량 스펙트럼은 700Da의 피크폭이 분자의 다양한 글리코실화 상태의 피크 외피를 반영함을 나타낸다. 따라서, 장치 질량 분해능은 다소 높아졌다. 이러한 가정은 단일 하전된 이량체의 피크가, 300의 질량 분해능에 상응하는, 700Da의 피크폭으로 질량 224kDa에서 관찰된 콘드로이티나제의 스펙트럼에 의해 지지된다.
질량 정확성 및 정밀성
IR-MALDI에서 이온 시그날 강도의 재생산성과 유사하게, 순차 측정의 표준 편차에 의해 제공된 바와 같은 질량 측정의 정확성은 레이저 펄스 에너지의 발포당 편차 뿐만 아니라 매트릭스(샘플 형태)에 따라 달라진다.
석신산 및 건조된 소적 제제 등의 즉발 이온 추출 및 고체 매트릭스의 경우, 질량 정확성은 150kDa의 분자량에서 전형적으로 400 내지 500ppm이다. 이는 상술된 바와 같이 샘플 형태의 강력한 이종성 및 샘플상의 탈착 위치의 빈번한 변화의 필요성에 의해 제한된다. 즉발 추출 및, 매우 균질한 층을 형성하는 글리세롤 등의 액체 매트릭스의 경우, 레이저 펄스 에너지의 변화로부터 생성되는 전체 흐름 시간의 변화는 질량 측정의 정확성을 결정한다. 예를 들면, 레이저 에너지가 의도적으로 역치(/0)로부터 1.51/0로 상승되면, 발색단 c(전체 흐름 시간 약 253μs)의 경우 약 0.1%의 흐름 시간 증가가 관찰된다. 따라서, 글리세롤의 경우 질량 측정 정확성은 레이저 산출 에너지의 안정성에 따라 달라진다. 매트릭스로서 글리세롤을 사용하여 고안된 현재의 IR 레이저의 경우, 200 내지 400ppm의 질량 측정 정확성이 약 150kDa의 질량 이하에서 수득될 수 있다. 30kDa 이하의 분석물의 경우, 이러한 정확성은 즉발 추출 UV-MALDI에서 전형적으로 수득된 값보다 약 1배 정도 낮아진다. 높은 질량 섭생에 있어서, IR-MALDI의 정확성은 이 질량 범위에서 IR-MALDI의 증가된 질량 분해능으로 인해 적어도 2배 우수한 것으로 밝혀졌다.
즉발 추출 IR-MALDI에 대한 질량 정밀성은 3개의 공지된 표준물과 외부 교정에 의해 측정한다. (낮은 질량 범위: 안지오텐신(사람), 멜리틴, 소 인슐린; 높은 질량 범위: 발색단 c(말 심장), 아포-미오글로빈(말), 섭틸리신 칼스버그(바실루스 섭틸리스)). 30kDa 이하의 질량 범위에 있어서, 15개의 단일 발포중 총 5개의 스펙트럼을 사용하여 교정 스펙트럼으로부터의 교정율 및 제2 스펙트럼에서 비공지된 질량을 수득한다. 두 매트릭스, 석신산 및 글리세롤의 경우, 절대 질량 정밀성은 분자량에 따라 102-5×103ppm인 것으로 밝혀졌다. 40kDa 이하의 단백질의 경우, 100 내지 500ppm의 질량 정밀성은 UV-MALDI(정적 추출)에 대해 상술된 수치와 일치한다. 40kDa를 초과하는 분석물의 경우에는 정밀성이 1-5×103ppm이다.
결론
UV와 비교하여 보다 낮은 정도의 대사가능한 단편화에 의해 판단하면, IR-MALDI는 생체분자 이온을 생성하는 2가지 기술의 "중간"인 것으로 보인다. 글리세롤 또는 동등한 재료는 고체 매트릭스와 비교하여 우수한 재생산성으로 인해 많은 분야를 위해 선택되는 매트릭스이다. 본 연구에서 시험된 2가지 레이저 중에서, Er-YAG 레이저는 글리세롤에 대해 Ef-YSGG 레이저보다 약간 더 우수하게 실행되며, 매트릭스로서 석신산에 대해 실질적으로 우수하게 실행된다. 보다 적은 대사가능한 단편화는 reTOF 모드에서 IR-MALDI를 높은 질량 분석물의 분석에 특히 적합하게 한다. 지연된 이온 추출은 UV-MALDI와 비교가능한 결과로서 IR-MALDI와 잘 작동한다.
실시예 3
IR-MALDI 질량 분석법에 의한 이본쇄 DNA의 검출
본 실시예에 있어서, 매트릭스로서 글리세롤 및 ATT를 각각 사용하여 ds-DNA의 분석을 위한 IR- 및 UV-MALDI-MS의 용도가 기술된다. 본 실시예는 IR-MALDI가 진단 도구로서 효과적으로 사용될 수 있음을 보여준다. 글리세롤 매트릭스 등의 글리콜 매트릭스를 사용하는 IR-MALDI는 거대한 이본쇄 DNA에 대해 우수한 결과를 나타냈다. 이들 결과는 염의 첨가를 통해 이온 강도를 조절하여 달성한다. 피코몰 이하의 범위에서 거의 없는 단편화 및 통상적인 감수성은 70개 염기쌍 이상을 포함하는 이본쇄 분석물이 프로빙되는 경우 IR-MALDI에서 관찰되었다.
9kDa 내지 500kDa 범위의 이본쇄 DNA 분자는 MALDI TOF 질량 분석법에 의해 탈착 및 분석된다. 매트릭스로서 글리세롤을 사용하는 IR-MALDI는 염의 첨가에 의해 이온 강도를 조절함으로써 보다 큰 이본쇄 DNA에 대해 우수한 결과를 나타냈다. 피코몰 이하 범위에서 거의 없는 단편화 및 통상적인 감수성은 70개 염기쌍 이상을 포함하는 이본쇄 분석물이 프로빙되는 경우 IR-MALDI에서 관찰되었다. 보다 낮은 질량 범위(약 70bp 이하)에 있어서, 매트릭스로서 6-아자-2-티오티민을 사용한 UV-MALDI는, 비교적 소수의 염기쌍을 함유하는 특이적 이본쇄 복합체가 순수한 형태로 탈착되기 때문에 선택되는 이온화 방법이다. 이러한 모드에 있어서, 이본쇄 형태의 실질적인 정량 검출은 70머에서 관찰되었다. UV-MALDI는 현저한 단편화 및 수득되는 감소된 감수성 및 질량 분해능을 수반한다.
기술된 방법은 MALDI-MS, 특히 IR-MALDI가 거대한 DNA/DNA 및 DNA-단백질 복합체의 분석에 사용될 수 있음을 입증한다.
재료 및 방법
샘플
합성 올리고데옥시뉴클레오타이드는 파마시아 바이오테그(Uppsala, Swenden)으로부터 구입한다. 이본쇄 올리고데옥시뉴클레오타이드를 형성하기 위해, 각각의 상보성 일본쇄를 1:1의 비율(전형적으로 수중 5 내지 10pmol/㎕)로 혼합하고, 75℃로 2분 동안 가열하며, 10℃로 30분에 걸쳐 냉각시킨다. 합성 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 이들의 혼합물을 5mM EDTA 및 2M NH4-아세테이트로 조절하고, 에탄올과 2-프로판올의 1:1 혼합물의 2 용적으로 침전시킨다. 샘플을 물에 재용해시켜 10 내지 20pmol/㎕의 농도를 수득한다.
DNA 플라스미드 pBR322 및 Bluescript KS+는 공급자의 프로토콜(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)에 따라 퀴아겐 미니프렙 키트에 의해 이. 콜라이 세포로부터 정제하고, 제한 효소 분해로 처리한다. 제한 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 게엠베하(Schwalbach/Tannus, Germany)로부터 구입하고, EcoRV 분해의 경우에는 소 혈청 알부민을 제외한다는 것을 제외하고는 공급자의 제안에 따라 사용한다. 제한 효소 분해된 DNA는 5mM EDTA 및 2M NH4아세테이트로 조절하고, 2용적의 에탄올로 침전시키고, 최종적으로 대략 0.5pmol/㎕로 물에 재용해시킨다. 모든 제한 효소 분해는 아가로즈 겔 전기영동에 의해 입증한다.
MALDI-MS 분석
포지티브 이온 IR-MALDI-MS 실험은 3.5m 등량의 흐름 길이(리플렉트론 모드)의 사내 선형/일단계 리플렉트론 흐름 시간(TOF) 질량 분광계로 수행한다. 분리된 추출 공급원에 있어서, 이온은 16 내지 25kV의 전체 전위차를 통해 가속화된다. 양극 앞에 전환 디노드(이온 질량에 따라 20 내지 40kV의 전체 이온 충격 에너지)를 갖는 베네티안 블라인드 제2 전극 증폭기가 이온 검출에 사용된다. 구체적으로 언급되지 않는 한, 모든 실험은 정적 이온 추출로 리플렉트론 모드에서 수행한다. 2.94㎛에서 방사하는 er-YAG-레이저(Spectrum GmHH, Berlin, Germany; τ=80-90ns, 발포당 에너지 안정성 약 ±2-4%)가 사용된다. 레이저-펄스는 45°각도하에 샘플상에 약 140㎛의 스폿 직경으로 집중된다. 장치는 본원외에 기술되어 있다[참조: Berkenkamp et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 1997, 11, 1399-1406]. IR-MALDI의 경우, 전형적으로 0.5 내지 1㎕의 글리세롤 매트릭스는 10-7내지 10-8의 분석물-대-글리세롤 몰비로 수성 분석물 약 0.5 내지 1㎕(전형적으로 0.5pmol/㎕)를 갖는 스테인레스 강 표적상에 혼합된다. ds-DNA을 안정화시키기 위해, NH4-아세테이트 또는 트리스-HCl(pH 8.0)을 최종 농도 약 40mM로 첨가한다. 질량 분광계내로 샘플을 도입하기 전, 대부분의 물을 10-2내지 1Pa의 압력에서 거친 진공하에 증발시킨다. 높은 진공 조건하에 잔류하는 물을 더욱 조절하여 점차 증발시키기 위해, 샘플을 갖는 표적은 질량 분광계내로 삽입하기 전에 액체 질소에 집어 넣음으로써 냉각시킨다.
포지티브 이온 UV-MALDI-MA 스펙트럼은 지연된 이온 추출(DE)을 사용하는 선형 TOF 모드에서 표준 비젼 2000(ThermoBioanalysis, Hemel Hempstead, UK)상에 기록한다. 이온은 이온 공급원에서 20keV로 가속화시키고, 제2 전극 증폭시 앞에 전환 디노드에 의해 10 내지 19KeV(이온 질량에 따라)를 통해 추가로 후-가속화한다. 이러한 장치는 문헌[참조: Gruic-Sovolj et al. J. of Biol. Chem. 1997, 272, 32084-91]에 상세히 기재되어 있다. UV-MALDI 매트릭스는 20% 아세토니트릴중의 50g/13-HPA 0.7㎕에 첨가된 약 10NH4-적재된 양이온 교환 비이드[참조: Nordhoff et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1992, 6, 771-6] 또는 50% 아세토니트릴중의 10g/L ATT + 10mM(NH4)2-시트레이트 1㎕로 구성된다. 두 경우에, 0.5 내지 1㎕의 분석물 수용액(10 내지 20pmol/㎕)를 매트릭스 용액과 혼합한다. 요구되지는 않지만, 높은 분석물 농도가 또한 ATT 제제와 직접적인 비교를 위해 3-HPA 제제에 사용된다. 샘플을 냉각된 공기 스트림하에 건조시킨다.
결과
IR-MALDI-MS
본원에 제시된 바와 같이, 매트릭스로서 글리세롤 및 기타 이러한 조성물을 사용한 IR-MALDI-MS는 거대한 핵산의 분석을 위한 놀라운 배합이다. 2000개 이상의 뉴클레오타이드를 함유하는 일본쇄 핵산은 성공적으로 검출되었다. 순수한 글리세롤 매트릭스내의 염의 부재 및 IR 레이저 노출에 의한 DNA 이본쇄의 탈안정화는 분석물의 일본쇄 형태의 우세한 관찰에 기인하는 것일 수 있다.
본 실시예에 있어서, 이본쇄 DNA는 염의 첨가에 의해 용액내에서 안정화된다. 특히, NH4-아세테이트 또는 트리스-HCl의 첨가(후자는 pH 8.0에서 양성자화된 1급 아민으로서 약 50%까지 용액내에 존재한다)가 사용된다.
순수한 글리세롤이 매트릭스로서 사용되는 경우, 완전히 용해된 각각의 일본쇄 70머는 스펙트럼에서 기저 피크를 형성한다. 샘플 제제에 pH 8.0에서 NH4-아세테이트 또는 트리스-HCl을 첨가한 후, 이본쇄 DNA의 시그날은 스펙트럼내에 기저 피크를 형성한다. 일본쇄의 명목상 질량에서 시그날의 실질적인 단편은 이중으로 하전된 ds-잔기로 이루어질 것이다. 비-특이적 삼량체에 상응하는 어떠한 시그날도 존재하지 않는다. 따라서, IR-MALDI 샘플 제제에 대한 염의 첨가는 특이적 이본쇄 DNA의 검출을 가능하게 하는 것이 명백하다. NH4-아세테이트 또는 트리스-HCl을 함유하는 2개의 샘플로부터 수득된 스펙트럼 사이에는 현저한 차이가 없다.
염-안정화된 ds-DNA는 여전히 산성 변성되는 경향이 있다. 한가지 실험에 있어서, 750bp 단편은 먼저 단일 하전된 이본쇄 종으로부터 강력한 시그날을 나타내는 TRIS-HCl에 의해 먼저 안정화된다. 대조적으로, 일본쇄의 단지 단일 및 이중으로 하전된 이온은 동일한 샘플을 석신산, 통상적으로 사용되는 IR-MALDI 매트릭스로 표적 산성화된다. 삼중으로 하전된 이본쇄에 상응하는 시그날은 명백하게 증명되었다. 이러한 결과는 석신산 첨가 효과가 전하 상태에서 일반적으로 증가하는 것이 아니라 사실상의 변성임을 나타낸다. 따라서, ds-DNA는 샘플 제제에서 물리화학적 수단에 의해 안정화 및 탈안정화될 수 있다. 사용된 샘플은 실질적으로, 관찰된 750bp 종과 플라스미드의 제한 효소 분해에 의해 생성된 3kbp 이상의 단편의 등몰량 혼합물이다. 보다 큰 종은 검출할 수 없는데, 이는 이러한 질량의 이온(＞2.0MDa)이 거대한 DNA의 IR-MALDI에 대한 약 700kDa의 현재의 질량 한계 이상이기 때문이다. 스펙트럼은 ds-DNA 생존 탈착 및 이온 가속화를 구별하지는 않지만 유동 튜브에서 해리되도록 선형 TOF 모드에서 지연된 이온 추출로 기록된다. 이들은 리플렉트론 TOF 배열에서 검출되지 않을 것이다. 선형 DE-TOF 모드에서 100kDa를 초과하는 샘플을 측정하는 경우, 질량 감소에 따라 강력하게 증가하는 관찰된 배경 시그날은 글리세롤 매트릭스에서 전형적이다.
이온 강도 증가를 통한 이본쇄의 안정화에 대한 이러한 관찰은 280bp, 360bp, 920bp 및 1.40kbp를 함유하는 제한 효소 분해된 플라스미드 DNA를 사용하여 신장된다. 3개의 작은 단편의 이본쇄 종에 상응하는, 175kDa, 223kDa 및 565kDa의 질량에서 피크가 스펙트럼에서 관찰된다. 87.5kDa, 112kDa 및 283kDa에서 관찰된 피크는 명목상 일본쇄를 나타낸다. 이들 결과에 기초하여, 이중으로 하전된 ds-이온은 이들 시그날에 우세하지는 않지만 현저하게 관여하는 것으로 밝혀졌다. 1.40kbp의 가장 큰 단편의 단량체/이중으로 하전된 ds 이온의 매우 작은 시그날은 질량 432kDa에서 관찰된다. 이러한 ds 종의 단일 하전된 이온의 864kDa의 m/z-값은 약 700kDa의 현재 검출 한계 이상이다. 글리세롤 샘플 제제에 안정화제, 특히 트리스-HCl의 첨가는 높은 질량 부분에 대한 신장된 피크 테일링과 같이 현저한, 순수한 글리세롤로부터 수득된 스펙트럼과 비교되는 피크 확장을 유도한다. 질량 분해능은 중간 크기의 종에 대한 리플렉트론 TOF 모드에서 2배, 즉 약 25로 감소하는 반면, 70머 ds-DNA 뿐만 아니라 920bp 단편의 질량 분해능은 약 50이다.
낮은-질량 부분에 대한 ds-이온의 피크의 관찰 단계 상승은, 본원에 제시된 바와 같이 ss-종의 시그날이 이미 관찰되었기 때문에, 매우 제한된 대사가능한 자연붕괴로 입증된다. 이와 같이 매우 낮거나 부재하는 대사가능한 단편화는, 대사가능한 (및 공급원내) 단편화가 특히 보다 거대한 DNA 단편의 분석에 대한 제한 인자인 경우, 핵산의 UV-MALDI-MS 분석과 매우 대조적이다.
ds-검출 특이성을 입증하는 실험이 또한 수행되었다. 시그날의 현저한 부분이 용액내에 또는 탈착 과정중에 형성된 일본쇄의 비-특이적 기체상 복합체 형성을 유도하는 경우, 예를 들어 280머와 360머의 일본쇄 사이의 비-특이적 복합체가 관찰될 수 있다. 단백질에서 종종 관찰되는 이러한 비-특이적 복합체는 DNA 스펙트럼에서는 관찰되지 않는다. 따라서, 최초 분석물 용액내에 존재하는 ds-DNA는 MALDI 공정 전체에서 자체로서 우세하게 보유된다.
본원에 제시된 바와 같이, 안정화 염의 부재하에 순수한 글리세롤로부터 순수한 ds-DNA를 탈착할 수 있다. 질량 범위가 넓은 DNA 단편을 안정화 없이 순수한 검출을 위해 시험한다. DNA 샘플의 조건은 이들 실험에서 매우 중요하다. 신선하게 제조된 DNA 샘플은 이본쇄 이온으로서 재생가능하게 검출된다. 염-안정화된 샘플과는 대조적으로, 레이저 플루언스는 주의깊게 조절되어야 한다. 분석물 이온의 검출을 위한 역치 플루언스(1.2H0) 근처에서 190bp 단편이 ds-이온을 우세하게 형성한다. 플루언스를 1.5H0로 증가시키면, 부분적으로 용해된 2개의 일본쇄를 갖는 ss-잔기가 유일하게 검출된다. 따라서, 레이저 조사 단독을 조절함으로써 거대한 DNA 이본쇄를 변성시킬 수 있다. 순수한 글리세롤로부터 탈착된 최대의 ds-DNA는 750bp 단편이고, 최소 ds-DNA는 100bp를 갖는다. 일반적으로, 단편이 작을 수록, 레이저 플루언스는 이본쇄 분석물의 탈착이 요구되는 경우이어야 한다. 100bp 단편은 엄격한 역치 플루언스를 요구하며, 또한 이온 추출을 위한 낮은 자기장 세기(≤150V/mm)를 요구한다. 500bp 및 750bp bs-단편의 순수한 탈착을 위해, 각각 1.7H0및 2H0와 같이 높은 플루언스를 사용할 수 있다.
UV-MALDI-MS
IR-MALDI에 의한 60개 염기쌍을 갖는 이본쇄 DNA를 분석하는 시도는 ds-형태의 검출과 관련하여 재생할 수 없으며, 보다 작은 분석물은 특이적 ds-이온의 시그날을 전혀 나타내지 않는다. 따라서, 6-아자-2-티오티민(ATT) 매트릭스를 사용하는 MALDI-MS가 비교적 작은 ds-DNA 단편을 검출하기 위해 사용된다. 문헌[참조: Lecchi ＆ Pannell(Lecchi et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1995, 6, 972-75)]에 보고된 바에 따르면, ds-종의 시그날은 완전히 상보성인 합성 12머보다 낮게 수득되었다. 대조적으로, 12머 및 완전히 상보성인 8머의 등몰량 혼합물은 ds-이온의 어떠한 시그날도 생성하지 않는데, 이는 이것이 ds-DNA의 순수한 탈착에 대한 최저 크기 한계라는 것을 나타낸다. 선형 TOF 모드에서는 이미 현저한, 과다한 단편화로 인해, ATT 매트릭스를 사용한 리플렉트론 TOF 모드에서는 어떠한 스펙트럼도 수득되지 않음에 주목하여야 한다.
ATT 매트릭스를 사용한 UV-MALDI에 의한 ds-이온의 검출을 위한 상한치가 또한 이 시스템을 위해 측정된다. IR-MALDI에 의해 조사된, 완전히 상보성인 2개의 합성 70머는 ATT/UV-MALDI 스펙트럼에서 ds-이온의 시그날을 생성한다. 각각 2개의 70머의 경우 용해된 2개의 시그날은, 매트릭스로서 3-HPA가 사용되는 경우에 스펙트럼을 지배한다. 여기서 분해능은 동일한 샘플의 글리세롤/IR-MALDI 스펙트럼에서 관찰된 분해능과 필적할 만하다. 이 실험은, 적어도 실온에서 제조되는 경우, 보다 거대한 분석물의 검출은 ATT로 용이해지고 ds-DNA의 시그날은 3-HPA로 수득할 수 없다는 것을 확인시켜 준다. 43.5kDa에서의 시그날이 부분적으로 또는 완전히 비특이적 호모이량체보다는 순수한 ds-DNA를 나타낸다는 것을 엄격하게 입증하기 위해, 합성 80머를 상보성 70머(상보성인 62개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드) 또는 비-상보성 70머에 어닐링시키고, ATT/UV-MALDI로 분석한다. 단지 상보성 70/80머 혼합물만이 ds-시그날을 생성하는 반면, 2개의 비-상보성 일본쇄는 스펙트럼에서 기저 피크를 형성한다는 것이 스펙트럼으로부터 입증된다. 이 결과는 또한 ds-잔기가 기저 피크를 형성하는 스펙트럼에서 절반의 질량을 나타내는 미약한 시그날이 단일 하전된 각각의 일본쇄보다는 이중 하전된 ds-DNA를 나타낸다는 것을 보여준다. 따라서, ATT는 상한 부분의 질량 범위에서도 UV-MALDI에 의해 ds-DNA의 검출을 위한 고도의 선택적인 매트릭스이다.
논의
본 실시예의 결과는 이본쇄 DNA의 MALDI-MS 분석이 약 12bp 내지 920bp의 크기 범위의 분석물로 수행될 수 있음을 나타낸다. 매트릭스로서 ATT를 사용한 UV-MALDI-MS가 70bp 이하의 크기 범위의 단편에 사용되며; 매트릭스로서 글리세롤 및 염 첨가를 사용한 IR-MALDI-MS가 70bp 이상의 DNA 분자에 사용된다. 70머 수준에서 ATT를 사용한 UV-MALDI-MS에서의 더욱 많은 샘플 소비(10 내지 20pmol)는, 이러한 샘플 양이 생물학적 기원의 샘플의 경우 매우 대량이기 때문에, 보다 많은 분석물에 대한 당해 방법의 사용을 제한한다. 이러한 감수성 감소에 대한 주요한 이유는 ATT 매트릭스를 사용하는 모든 스펙트럼에서 명백한, 광범위한 공급원 단편화이다. 이본쇄 종의 단편화는 일본쇄로의 해리보다는 단일 또는 다중 염기 및/또는 주쇄 절단의 손실에 의해 지배된다. 이본쇄 분석물의 단편화는 일본쇄 분석물에서 관찰된 단편화 정도에 필적할 만하다. 이는 모든 뉴클레오타이드가 염기쌍인 경우 이본쇄 70머에 대해서도 관찰된다. 이들 결과는, DNA가 최소 이온 강도로 유지되는 경우, 비-공유 ds-구조가 UV-MALDI-MS에서 공유 결합을 유도하는 조건하에 안정하다는 것을 나타낸다.
대조적으로, 거의 없는 단편화는 글리세롤을 사용한 IR-MALDI-MS에서 관찰된다. 리플렉트론 TOF 방식으로 분석하는 경우, 1ms 이상의 흐름 시간을 갖는 거대한 DNA 분자는 실질적으로 대사가능한 단편화를 나타내지 않는다. 이는 일반적으로 일본쇄 및 이본쇄 형태의 분석물에 적용된다. 또한, 매트릭스로서 순수한 글리세롤의 경우, IR-MALDI-MS에서의 과다한 레이저 에너지는 공유 결합의 절단 보다는 비-안정화된 이본쇄의 변성을 유도한다.
Ds-DNA는 염 첨가, 즉 이온 강도의 증가에 의해 수용액에서 안정화된다. 안정화는 포스페이트 주쇄에 인접하는 포지티브 이온의 축합을 유발하며, 이에 의해 네가티브 전하를 중성화시키고 2개의 스트랜드 사이의 반발성 정전기 상호작용을 감소시킨다. 본원에 제시된 결과 및 DNA가 글리세롤에 거의 불용성이라는 사실은, DNA가 분석기의 진공하에서 수시간 후에도 양이온 축합을 제공하기에 충분한 글리세롤중의 용매 물의 외피를 보유함을 시사한다.
분석물내의 이본쇄 영역의 길이와 매트릭스로서 ATT를 사용한 UV-MALDI-MS중의 ds-DNA 도 사이에는 상관관계가 관찰된다. 이는 ds-DNA를 분석하기 위한 UV-MALDI의 높은 특이성을 확증한다. 이러한 특이성은 상응하는 DNA보다 더욱 안정한 이본쇄를 형성하는 자가-상보성 RNA가 동일한 길이의 DNA보다 12머 수준에서 ds-형태의 높은 시그날을 제공한다는 관찰에 의해 입증된다.
UV- 및 IR-MALDI가 ds-DNA의 특이적 분석을 가능하게 한다는 사실은 이들 방법을 사용하여 또한 DNA와 단백질 사이의 비-공유 복합체를 연구할 수 있음을 나타낸다. 이러한 연구의 전제 조건은 이의 이본쇄 형태로 DNA를 유지하는 능력이다. IR-MALDI-MS는 고도의 감수성을 요구하는 분석, 예를 들어 진단 방법에 사용하기 위해 당해 방법을 선택하는 피코몰 이하의 감수성을 입증하였다. 더욱이, 본원에 제시된 바와 같이, 감수성은 피에조-전기 피펫을 사용하는 샘플 용적의 축소에 의해 적어도 100배 증가될 수 있다(공개된 PCT 특허원 제WO 98/20166호 및 공동 계류중인 미국 특허원 제08/787,639호). 트리스-HCl 또는 NH4-아세테이트의 첨가가 ds-DNA 스펙트럼의 재생가능한 수득에 요구된다는 사실은 잇점이 된다. 대부분의 핵산/단백질 복합체는 안정성을 위해 pH- 및 염-조절된 환경을 필요로 한다. 핵산, DNA 삼중 나선간의 상호작용 및 변형된 올리고뉴클레오타이드와 천연 DNA 사이의 하이브리드화는 추가의 적용 분야이다.
실시예 4
3㎛를 방사하는 레이저와 10.6㎛에서 전자기 조사를 방사하는 레이저를 사용한 IR MALDI의 비교
10㎛ 파장 범위에서 방사하는 작은 밀폐된 TEA-CO2-레이저는 상업상 이용가능하고, UV-MALDI-MS에 통상 사용된 질소 레이저와 크기, 가격 및 작동 용이성을 비교할 수 있다. IR-MALDI-MS에 대한 이러한 레이저의 성능 데이타를 시험한다. 여기에는 특정한 IR 적용에 대한 스펙트럼 뿐만 아니라 질량 분해능 및 정확성의 향상을 위한 지연된 이온 추출의 사용이 포함된다.
10.59㎛ 파장의 밀폐된 TEA-CO2레이저(μ-TEA, Laser Science, Inc. Franklin, MA)를 선형(2.2m) 및 리플렉트론 포트(3.5m 등량의 유동 길이)를 갖는 사내 TOF 장치에 커플링시킨다. 비교 실험을 위해, Er:YAG 레이저(λ=2.94㎛) 또는 주파수 삼중화 Nd:YAG(λ=355nm)를 동일한 장치에 대해 이용할 수 있다.
결과: 푸마르산 및 글리세롤은 10.6㎛ 파장의 경우 매트릭스로서 최상인 것으로 밝혀졌다. 푸마르산은 질량 범위 ＜40kDa에서, 특히 정적 이온 추출에 의해 최상의 질량 분해능을 나타내는 반면, 글리세롤은 높은 질량에 대해 최상의 분해능을 나타내고 우수한 재생산성을 제공한다. 분석학적 감수성을 펩타이드 및 푸마르산 매트릭스에 대해 시험한다. 스펙트럼의 생성에는 단지 몇 fmol 및 mol의 분석물-대-매트릭스 ≥10-7의 샘플 적재로 충분하다.
3㎛에서 IR-MALDI에 대해 기술된 바와 같이, 특히 질량이 100kDA를 초과하는 단백질에 대한 낮은 대사가능한 자연붕괴도는 또한 10.6㎛에서도 관찰된다. 리플렉트론 질량 분광계와 함께, 이는 보다 큰 접근가능한 질량 범위를 유도한다. 예를 들면, 125의 질량 분해능은 리플렉트론 모드로 글리세롤 매트릭스를 사용하면 마우스 모노클로날 항체(IgG)의 경우 150kDa에서 수득된다. 질량이 1.35MDa 이하인 항체의 호모-올리고머는 이러한 스펙트럼에서 명백하게 동정되었다.
지연된 이온 추출은 3㎛에서 UV- 및 IR-MALDI와 유사하게 펩타이드에 대한 분해능을 개선시킨다. 글리세롤 및 푸마르산 매트릭스를 사용한 물질 P의 스펙트럼에 있어서, 4500 및 5000-7000의 질량 분해능이 달성된다. 동위원소 분산은 스펙트럼에서 중간 및 이중 피크에 의해 다소 방해되는데, 이는 동일한 장치에 대한 UV 또는 중간-적외선 레이저 시스템과 비교하여 전반적으로 열등한 성능을 나타낸다. 이러한 피크 "단편화"는 (τ)2레이저의 이종성 빔 프로파일에 임시로 할당된다. 그러나, 질량 분해능은 여전히 펩타이드의 낮은 ppm 범위에서 질량 정확성을 수득하기에 충분하다. 예를 들면, 물질 P의 질량은 안지오텐신 및 레닌과 함께 내부 교정을 사용하여, 단지 10mDa의 오차로 측정된다.
연구는 겔 분리후 중합체 막(Immobilon P)상에 전기블롯팅된 미오글로빈(말)의 IR-CO2-MALDI-MS로 수행한다. 석신산 매트릭스가 사용된다. 3㎛에서 Er:YAG 레이저로 이러한 막으로부터 수득된 스펙트럼과의 스펙트럼 질의 비교는 후자가 바람직할 수 있음을 나타낸다.
글리세롤 매트릭스를 사용하여 질량이 300kDa 이하인 이본쇄 DNA의 분석을 또한 515bp PCR 산물에 대해 수행한다. 3 및 10.6㎛ 파장에서 IR-MALDI-MS는 매우 유사한 특징을 가지며; 3㎛ 파장의 사용이 특정한 분야에 바람직할 수 있다.
실시예 5
거대한 핵산의 IR-MALDI
3㎛ 파장 영역에서 방사하는 레이저로 약 20kD 이상의 단백질에 대한 MALDI-MS는, 특히 (액체) 매트릭스로서 글리세롤이 사용되는 경우, UV-MALDI보다 탈착된 이온의 단편화를 현저히 감소시킨다. 상이한 파장에서 방사하는 레이저 및 거대 핵산의 분석을 위한 각종 매트릭스의 시험을 수행한다. 글리세롤 매트릭스와 Er-YAG 레이저(2.94㎛)는 핵산의 순수한 탈착/이온화에 대한 온화한 조합인 것으로 밝혀졌다. 이 실험은 일단계 리플렉트론으로 수행하고, 16kV 가속 전위의 분리된 이온 추출 공급원을 갖는 흐름 시간(refTOF) 질량 분광계는 즉발 또는 지연된 이온 추출로 작동한다[참조: S. Berkenkamp, C. Menzel, M. Karns and F. Hillenkamp, Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 1399(1997)]. Er:YAG 레이저(λ=2.94㎛, τ=85ns, Spektrum GmbH, Berlin, Germany)가 탈착에 사용된다. 샘플 제조 전에, 글리세롤 매트릭스를 동일한 용적으로 H+-양이온 교환 비이드 현탁액으로 항온처리한다.
플라스미드 DNA 제한 효소 분해(1045bp 및 1913bp 단편의 혼합물, 322kDa 및 592kDa)에 의해 입증된 바와 같이, 글리세롤 매트릭스를 사용한 IR-MALDI-MS는 대략 2000nt의 올리고머에 사용될 수 있다. 측정된 모든 거대한 DNA의 경우, 이온 시그날(FWHM)의 질량 분해능은 약 50이고, 이온 질량과는 비교적 독립적인 것으로 나타났다. DNA의 IR-MALDI-MS는 대략 700kDa의 질량을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 거대한 RNA는 또한 시험관내에서 합성된 1206nt 전사체(약 388kDa)에 의해 입증된 바와 같이 IR-MALDI-MS에 의해 분석될 수 있다. 이보다 작은 질량의 RNA 및 DNA는 비교가능한 안정성을 나타낸다. 질량이 높은 DNA 및 RNA의 모든 측정된 샘플의 경우, 질량 정확성은 서열로부터 계산된 것의 0.5% 내지 1%이다. 2180nt 단편의 질량도 0.6% 정확성으로 측정된다. 잘 정의된 질량 및 이들의 올리고머의 IgG 모노클로날 항체의 시그날을 질량 교정에 사용한다. 대략 515bp의 PCR-산물에 대해 평가된, 매트릭스로서 글리세롤을 사용한 거대 핵산의 IR-MALDI-MS의 감수성은 낮은 펨토몰 범위내에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 상당한 질을 갖는 스펙트럼은 샘플의 300amol 총 적재로부터 수득할 수 있다. 상기 보고된 모든 결과는 샘플 정제에 있어서 단지 제한된 노력으로 수득되었다. 제한 효소 분해 단편의 경우, 1단계 정제(침전)이 충분한 것으로 나타났다. RNA의 경우, 추가의 역상 컬럼이 제조된다.
당업자에게는 변형이 명백할 것이기 때문에, 본 발명은 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한되는 것으로 의도된다.
＜110＞ SEQUENOM, INC.
＜120＞ Infrared matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectro metric analysis of macromolecules
＜130＞ 520000212016
＜150＞ US 09/074,936
＜151＞ 1998-05-07
＜160＞ 2
＜170＞ KOPATIN 1.5
＜210＞ 1
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Unknown
＜220＞
＜223＞ nucleic acid, single, linear, /desc="primer"
＜400＞ 1
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＜220＞
＜223＞ nucleic acid, single, linear, /desc="primer"
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Claims (226)

  1. 핵산과 액체 매트릭스를 함유하는 용액을 기질 위에 침착시켜 핵산/액체 매트릭스 용액의 균질한 박층을 형성하는 단계(a) 및
    기질을 적외선으로 조사하여 용액 중의 핵산을 탈착시키고 이온화시키는 단계(b)를 포함하여, 질량 분석법을 위한 핵산 분자의 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화(MALDI)를 수행하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 핵산의 질량을 MALDI로 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 핵산의 질량을 MALDI로 측정하여 샘플내의 핵산 존재를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 액체 매트릭스가 핵산 상용성 용매와 혼화성인 특성(i), 진공 안정성인 특성(ii) 및 매트릭스 단독 또는 핵산 상용성 용매와 혼합하여 마이크로-리터 내지 나노-리터 용적의 매트릭스의 박층을 분산시키기 위한 적절한 점도 특성(iii) 중의 하나 이상을 갖는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 액체 매트릭스가 조사, 탈착 및 이온화 단계 동안에 증발되지 않도록 충분히 비휘발성인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 액체 매트릭스가 냉각 및/또는 가압되는 경우, 유리를 형성할 수 있는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 매트릭스가 당, 단당류 또는 다당류를 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 매트릭스가 폴리글리세롤, 슈크로즈, 만노즈, 갈락토즈, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리메틸올프로판, 펜타에리트리톨, 덱스트로즈, 메틸글리코사이드 또는 솔비톨, 슈크로즈, 만노즈, 트리에탄올아민, 락트산, 3-니트로벤질알콜, 디에탄올아민, DMSO, 니트로페닐옥틸에테르(3-NPOE), 2,2'-디티오디에탄올, 테트라에틸렌글리콜, 디티오트레이톨/에리트리톨(DTT/DTE), 2,3-디하이드록시-프로필벤질 에테르, α-토코페롤 및 티오글리세롤을 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 액체 매트릭스가 적외선을 흡수하는 하나 이상의 관능 그룹을 함유하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 관능 그룹이 니트로, 설포닐, 설폰산, 설폰아미드, 니트릴, 카보닐, 알데하이드, 카복실산, 아미드, 에스테르, 무수물, 케톤, 아민, 하이드록실, 방향족 환 및 디엔을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 액체 매트릭스가 알콜, 카복실산, 1급 또는 2급 아미드, 1급 또는 2급 아민, 니트릴, 하이드라진 및 하이드라지드를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 알콜이 글리세롤, 1,2- 또는 1,3-프로판 디올, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-부탄 디올 및 트리에탄올아민을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 카복실산이 락트산, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산 및 이의 에스테르를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 아미드가 분지되거나 분지되지 않은, 아세트아미드, 프로판아미드, 부탄아미드, 펜탄아미드 및 헥산아미드를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 아민이 프로필아민, 부틸아민, 펜틸아민, 헥실아민, 헵틸아민, 디에틸아민 및 디프로필아민을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  16. 제4항에 있어서, 액체 매트릭스가, 각각 하나 이상의 특성을 제공하는 2종 이상의 액체로 이루어지는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 액체 매트릭스가 첨가제를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 첨가제가 분석에 사용된 레이저 파장에서 고도의 흡광계수를 갖는 화합물, 액체 매트릭스를 산성화시키는 첨가제, 및 액체 매트릭스와 핵산의 포스페이트 주쇄 사이의 염 형성을 최소화하는 첨가제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 첨가제가 매트릭스 조성물의 이온 강도를 증가시키는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 단계(a) 전에 액체 매트릭스를 처리하여 매트릭스와 핵산의 포스페이트 주쇄 사이의 염 형성을 최소화하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 액체 매트릭스가 증류 또는 이온 교환에 의해 처리되는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 액체 매트릭스가 추가의 정제에 의해 처리되는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 액체 매트릭스가 글리세롤, 락트산 및 트리에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 액체 매트릭스가 글리세롤이고, 최종 분석물-대-글리세롤 몰 비가 약 10-4내지 약 10-9인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 액체 매트릭스가 글리세롤이고, 핵산의 질량 범위가 약 104내지 약 106Da이며, 글리세롤을 단계(a) 전에 이온 교환시키는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 핵산이 DNA인 방법.
  27. 제26항에 있어서, DNA가 약 2000개 이하의 염기인 방법.
  28. 제1항에 있어서, 핵산이 RNA인 방법.
  29. 제28항에 있어서, RNA가 약 1200개 이하의 염기인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 핵산이 PNA를 포함하는 방법.
  31. 제1항에 있어서, 핵산이 이본쇄 핵산을 포함하는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 핵산이 일본쇄 핵산을 포함하는 방법.
  33. 제1항에 있어서, 적외선의 파장 범위가 약 2.5 내지 약 12㎛인 방법.
  34. 제1항에 있어서, 조사 펄스의 폭 범위가 약 500ps 내지 약 500ns인 방법.
  35. 제1항에 있어서, 펄스 지속 기간이 200ns 미만인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 펄스 지속 기간이 100ns 미만인 방법.
  37. 제1항에 있어서, 적외선이 약 2.5 내지 약 12㎛의 범위에서 방사하는 CO 레이저, CO2레이저, Er 레이저 및 광학 파라메트릭 진동 레이저를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  38. 제1항에 있어서, 용액이 약 10pmol 미만의 핵산을 포함하는 방법.
  39. 제1항에 있어서, 모든 공정 또는 일부 공정이 자동화되는 방법.
  40. 제1항에 있어서, 용액이 약 20℃ 미만의 온도로 냉각되는 방법.
  41. 제1항에 있어서, 용액이 약 20℃ 내지 약 80℃ 미만의 온도로 가열되는 방법.
  42. 제1항에 있어서, 용액이 냉각됨으로써 매트릭스가 유리를 형성하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 유리가 유리질 물(glassy water)인 방법.
  44. 제1항에 있어서, 매트릭스가 글리세롤을 포함하고, 글리세롤과 핵산 용액이 냉각됨으로써 글리세롤이 동결되는 방법.
  45. 제1항에 있어서, 핵산 이온이 지연된 추출에 의해 이온 공급원으로부터 추출되는 방법.
  46. 핵산과 액체 매트릭스를 함유하는 혼합물을 기질 위에 침착시켜 핵산/액체 매트릭스 혼합물의 균질한 박층을 형성하는 단계(a),
    단계(a)의 기질을 적외선 레이저로 조사하여 핵산을 탈착시키고 이온화시키는 단계(b) 및
    질량 분리 및 분석 포맷을 사용하여 이온화된 핵산을 질량 분리하고 검출하는 단계(c)를 포함하여, 핵산을 질량 분석법으로 분석하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 액체 매트릭스가 조사, 탈착 및 이온화 단계 동안에 증발되지 않도록 충분히 비휘발성인 방법.
  48. 제46항에 있어서, 액체 매트릭스가 냉각되고/되거나 가압되는 경우, 유리를 형성할 수 있는 방법.
  49. 제46항에 있어서, 매트릭스가 당, 단당류 또는 다당류를 포함하는 방법.
  50. 제46항에 있어서, 매트릭스가 폴리글리세롤, 슈크로즈, 만노즈, 갈락토즈, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리메틸올프로판, 펜타에리트리톨, 덱스트로즈, 메틸글리코사이드 또는 솔비톨, 슈크로즈, 만노즈, 트리에탄올아민, 락트산, 3-니트로벤질알콜, 디에탄올아민, DMSO, 니트로페닐옥틸에테르(3-NPOE), 2,2'-디티오디에탄올, 테트라에틸렌글리콜, 디티오트레이톨/에리트리톨(DTT/DTE), 2,3-디하이드록시-프로필벤질 에테르, α-토코페롤 및 티오글리세롤을 포함하는 방법.
  51. 제46항에 있어서, 액체 매트릭스가 핵산 상용성 용매와 혼화성인 특성(i), 진공 안정성인 특성(ii) 및 매트릭스 단독 또는 핵산 상용성 용매와 혼합하여 마이크로 리터 내지 나노 리터 용적의 매트릭스의 분산을 촉진시키기 위한 적절한 점도 특성(iii) 중의 하나 이상을 갖는 방법.
  52. 제46항에 있어서, 액체 매트릭스가 적외선을 강력히 흡수하는 하나 이상의 관능 그룹을 함유하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 관능 그룹이 니트로, 설포닐, 설폰산, 설폰아미드, 니트릴, 카보닐, 알데하이드, 카복실산, 아미드, 에스테르, 무수물, 케톤, 아민, 하이드록실, 방향족 환 및 디엔을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  54. 제46항에 있어서, 액체 매트릭스가 알콜, 카복실산, 1급 또는 2급 아미드, 1급 또는 2급 아민, 니트릴, 하이드라진 및 하이드라지드를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 알콜이 글리세롤, 1,2- 또는 1,3-프로판 디올, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-부탄 디올 및 트리에탄올아민을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  56. 제54항에 있어서, 카복실산이 락트산, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산 및 이의 에스테르를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  57. 제54항에 있어서, 아미드가 분지되거나 분지되지 않은, 아세트아미드, 프로판아미드, 부탄아미드, 펜탄아미드 및 헥산아미드를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  58. 제54항에 있어서, 아민이 폴리아민, 부틸아민, 펜틸아민, 헥실아민, 헵틸아민, 디에틸아민 및 디프로필아민을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  59. 제51항에 있어서, 액체 매트릭스가, 각각 하나 이상의 특성을 제공하는 2종 이상의 액체로 이루어지는 방법.
  60. 제46항에 있어서, 액체 매트릭스가 첨가제를 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 첨가제가 분석에 사용된 레이저 파장에서 고도의 흡광계수를 갖는 화합물, 액체 매트릭스를 산성화시키는 첨가제, 액체 매트릭스와 핵산의 포스페이트 주쇄 사이의 염 형성을 최소화하는 첨가제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  62. 제60항에 있어서, 첨가제가 매트릭스 조성물의 이온 강도를 증가시키는 방법.
  63. 제46항에 있어서, 단계(a) 전에 액체 매트릭스를 처리하여 매트릭스와 핵산의 포스페이트 주쇄 사이의 염 형성을 최소화하는 방법.
  64. 제46항에 있어서, 액체 매트릭스가 증류 또는 이온 교환에 의해 처리되는 방법.
  65. 제46항에 있어서, 액체 매트릭스가 추가의 정제에 의해 처리되는 방법.
  66. 제46항에 있어서, 액체 매트릭스가 글리세롤, 락트산 및 트리에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  67. 제46항에 있어서, 액체 매트릭스가 글리세롤이고, 최종 분석물-대-글리세롤 몰 비가 약 10-4내지 약 10-9인 방법.
  68. 제46항에 있어서, 액체 매트릭스가 글리세롤이고, 핵산의 질량 범위가 약 104내지 약 106Da이며, 글리세롤이 단계(a) 전에 이온 교환되는 방법.
  69. 제46항에 있어서, 핵산이 DNA인 방법.
  70. 제46항에 있어서, DNA가 약 2000개 이하의 염기인 방법.
  71. 제46항에 있어서, 핵산이 RNA인 방법.
  72. 제71항에 있어서, RNA가 약 1200개 이하의 염기인 방법.
  73. 제46항에 있어서, 핵산이 PNA를 포함하는 방법.
  74. 제46항에 있어서, 핵산이 이본쇄 핵산을 포함하는 방법.
  75. 제46항에 있어서, 핵산이 일본쇄 핵산을 포함하는 방법.
  76. 제46항에 있어서, 적외선의 파장 범위가 약 2.5 내지 약 12㎛인 방법.
  77. 제46항에 있어서, 조사 펄스의 폭 범위가 약 500ps 내지 약 500ns인 방법.
  78. 제46항에 있어서, 적외선이 약 2.5 내지 약 12㎛의 범위에서 방사하는 CO 레이저, CO2레이저, Er 레이저 및 광학 파라메트릭 진동 레이저를 포함하는 그룹으로부터 선택된 공급원으로부터 생성되는 방법.
  79. 제46항에 있어서, 샘플이 약 10pmol 미만의 핵산을 포함하는 방법.
  80. 제46항에 있어서, 모든 공정 또는 일부 공정이 자동화되는 방법.
  81. 제46항에 있어서, 샘플이 약 20℃ 이하의 온도로 냉각되는 방법.
  82. 제46항에 있어서, 샘플이 약 20℃ 내지 약 80℃ 미만의 온도로 가열되는 방법.
  83. 제46항에 있어서, 매트릭스 및 샘플 혼합물이 냉각됨으로써 매트릭스가 유리를 형성하는 방법.
  84. 제46항에 있어서, 유리가 유리질 물인 방법.
  85. 제46항에 있어서, 매트릭스가 글리세롤을 포함하고, 글리세롤과 샘플 혼합물이 냉각됨으로써 글리세롤이 동결되는 방법.
  86. 제46항에 있어서, 단계(c) 전에, 핵산 이온이 지연된 추출에 의해 이온 공급원으로부터 추출되는 방법.
  87. 제46항에 있어서, 질량 분리 및 분석 포맷이 흐름 시간(TOF), 4극자, 자기 섹터, 푸리에 전환 이온 사이클로트론 공명(FTICR), 이온 트랩 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  88. 제87항에 있어서, TOF가 선형이거나 TOF가 반사기를 갖는 방법.
  89. 제87항에 있어서, TOF 반사기가 선형 전계 또는 비선형 전계를 갖는 방법.
  90. 제87항에 있어서, 4극자가 단일선이거나 다중선인 방법.
  91. 제87항에 있어서, 자기 섹터가 단일선이거나 다중선인 방법.
  92. (i) 표적 핵산과 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 선택된 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 표적 핵산과 하이브리드화하는 단계(a),
    프라이머를 효소에 의해 신장시켜, 프라이머와 신장 절편으로 이루어진 신장 산물을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 혼합물을 제조하는 단계(b),
    신장 산물을 절단가능한 부위에서 절단하여 신장 절편을 방출시키는 단계(여기서, 절단 전에 프라이머는 고정화 결합 부위에 고정화시킨다)(c) 및
    신장 절편을 제1항의 방법으로 사이징함으로써, 절단이 단계(b)의 산물의 판독 길이에 비례하여 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(d)를 포함하여, 프라이머 신장 산물의 크기를 측정하는 방법.
  93. (i) 표적 핵산과 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 제1 프라이머와 표적 핵산에 상동성인 제2 프라이머를, 핵산과 프라이머와의 하이브리드화를 촉진하는 조건하에 표적 핵산과 배합하는 단계(a),
    적합한 폴리머라제 및 모든 4개의 dNTP의 존재하에 프라이머/핵산 복합체를 이본쇄 단편으로 전환시키는 단계(b),
    이본쇄 단편을 변성시켜 일본쇄 단편을 생성하는 단계(i), 일본쇄를 프라이머와 하이브리드화시켜 스트랜드/프라이머 복합체를 형성하는 단계(ii), DNA 폴리머라제 및 모든 4개의 dNTP의 존재하에 스트랜드/프라이머 복합체로부터 이본쇄 단편을 제조하는 단계(iii) 및 목적하는 증폭이 달성될 때까지 단계(i) 내지 단계(iii)을 반복하는 단계(iv)를 연속적으로 반복하여 프라이머 함유 단편을 증폭시키는 단계(c),
    증폭된 단편을 변성시켜 제1 프라이머와 신장 절편으로 이루어진 산물을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계(d),
    고정화 결합 부위를 사용하여 제1 프라이머를 함유하는 증폭된 단편을 고정화시키고, 고정화되지 않은 증폭된 단편을 제거하는 단계(e),
    고정화된 단편을 절단가능한 부위에서 절단하여 신장 절편을 방출하는 단계(f) 및
    신장 절편을 제1항의 방법으로 사이징함으로써, 절단이 단계(d)의 산물의 판독 길이에 비례하여 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(g)를 포함하여, 프라이머 신장 산물의 크기를 측정하는 방법.
  94. (i) 표적 DNA와 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 표적 DNA와 하이브리드화하는 단계(a),
    4개의 상이한 디데옥시뉴클레오타이드 중에서 제1 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이머를 효소로 신장시켜 프라이머와 신장 절편을 함유하는 각각의 프라이머 신장 산물의 혼합물을 제조하는 단계(b),
    절단가능한 부위에서 절단하여 신장 절편을 방출시키는 단계(여기서, 절단 전에 프라이머는 고정화 결합 부위에 고정화된다)(c),
    신장 절편을 제1항의 방법으로 사이징함으로써, 절단이 단계(b)의 산물의 판독 길이에 비례하여 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(d),
    단계(a) 내지 단계(d)를 4개의 상이한 디데옥시뉴클레오타이드 중에서 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드로 반복하는 단계(e) 및
    4개의 신장 반응물 각각으로부터 수득한 신장 절편의 크기를 비교하여 표적 DNA의 DNA 서열을 결정하는 단계(f)를 포함하여, 표적 DNA 서열의 DNA 서열을 결정하는 방법.
  95. (i) 표적 DNA와 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 표적 DNA와 하이브리드화하는 단계(a),
    4개의 상이한 데옥시뉴클레오사이드 α-티오트리포스페이트 동족체(dNTPαS)중 제1 뉴클레오사이드의 존재하에 프라이머를 효소로 신장시켜 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 프라이머 신장 산물의 혼합물을 제조하는 단계(b),
    포스포로티오에이트 결합을 특이적으로 절단하는 시약으로 프라이머 신장 산물을 처리(여기서, 처리는 제한된 절단을 생성하는 조건하에 수행한다)하여 프라이머 신장 분해 산물의 그룹을 제조하는 단계(c),
    프라이머 신장 분해 산물을 세척하는 단계(여기서, 세척 전에 프라이머 신장 분해 산물은 고정화 결합 부위에 고정화되고, 각각의 고정화된 프라이머 신장 분해 산물은 프라이머와 신장 절편을 함유하며, 세척은 고정화되지 않은 종을 제거하기에 효과적이다)(d),
    절단가능한 부위를 절단하여 신장 절편을 방출하는 단계(e),
    신장 절편을 제1항의 방법으로 사이징함으로써, 절단이 이의 상응하는 프라이머 신장 분해 산물의 판독 길이에 비례하여 주어진 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(f),
    단계(a) 내지 단계(f)를 4개의 상이한 dNTPαS 중에서 제2, 제3 및 제4 뉴클레오사이드로 반복하는 단계(g) 및
    4개의 신장 반응물 각각으로부터 수득한 신장 절편의 크기를 비교하여 표적 DNA의 DNA 서열을 결정하는 단계(h)를 포함하여, 표적 DNA 서열의 DNA 서열을 결정하는 방법.
  96. (i) 표적 핵산과 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단을 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 선택된 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 표적 핵산과 하이브리드화하는 단계(a),
    프라이머를 효소에 의해 신장시켜 프라이머와 신장 절편으로 이루어진 신장 산물을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 혼합물을 제조하는 단계(b),
    신장 산물을 절단가능한 부위에서 절단하여 신장 절편을 방출시키는 단계(c) 및
    신장 절편을 제1항의 방법으로 사이징함으로써, 절단이 단계(b)의 산물의 판독 길이에 비례하여 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(d)를 포함하여, 프라이머 신장 산물의 크기를 측정하는 방법.
  97. (i) 표적 핵산과 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역(여기서, 프라이머의 고정화 결합 부위는 중간 올리고뉴클레오타이드에 상보성인 일련의 염기로 이루어져 있다)을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 선택된 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 표적 핵산과 하이브리드화하는 단계(a),
    프라이머를 효소에 의해신장시켜 프라이머와 신장 절편으로 이루어진 신장 산물을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 혼합물을 제조하는 단계(b),
    신장 산물을 절단가능한 부위에서 절단하여 신장 절편을 방출시키는 단계(여기서, 절단 전에 프라이머는 고체 지지체에 결합된 중간 올리고뉴클레오타이드와 고정화 결합 부위의 특이적 하이브리드화에 의해 고정화된다)(c),
    신장 절편을 제1항의 방법으로 사이징함으로써, 절단이 단계(b)의 산물의 판독 길이에 비례하여 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(d)를 포함하여, 프라이머 신장 산물의 크기를 측정하는 방법.
  98. (i) 5' 말단 및 3' 말단을 가지고, (ii) 표적 핵산과 상보성이며, (iii) 제1 프라이머의 5' 말단을 함유하는 제1 영역을 가지고, (iv) 제1 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 제1 프라이머와, (i) 5' 말단 및 3' 말단을 가지고, (ii) 표적 핵산과 상동성이며, (iii) 제2 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제1 절편을 가지고, (iv) 제2 프라이머의 5' 말단과 고정화 결합 부위를 함유하는 제2 절편을 가지는 제2 프라이머를, 핵산과 프라이머와의 하이브리드화를 촉진하는 조건하에 표적 핵산과 배합하여 프라이머/핵산 복합체를 제조하는 단계(a),
    DNA 폴리머라제 및 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에 프라이머/핵산 복합체를 이본쇄 단편으로 전환시키는 단계(b),
    이본쇄 단편을 변성시켜 일본쇄 단편을 생성하는 단계(i), 일본쇄 단편을 제1 및 제2 프라이머와 하이브리드화시켜 스트랜드/프라이머 복합체를 형성하는 단계(ii), DNA 폴리머라제 및 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에 스트랜드/프라이머 복합체로부터 증폭 산물을 제조하는 단계(iii) 및 목적하는 증폭이 달성될 때까지 단계(i) 내지 단계(iii)을 반복하는 단계(iv)를 연속적으로 반복하여 프라이머 함유 단편을 증폭시키는 단계(c),
    제2 프라이머를 함유하는 증폭 산물을 고정화 결합 부위를 통해 고정화시키는 단계(d),
    고정화되지 않은 증폭된 단편을 제거하는 단계(e),
    고정화된 증폭 산물을 절단가능한 부위에서 절단하여 이본쇄 산물을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계(f),
    이본쇄 산물을 변성시켜 신장 절편을 방출시키는 단계(g) 및
    신장 절편을 제1항의 방법으로 사이징함으로써, 절단이 단계(c)의 증폭된 스트랜드-프라이머 복합체의 판독 길이에 비례하여 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(h)를 포함하여, 프라이머 신장 산물의 크기를 측정하는 방법.
  99. (i) 표적 DNA와 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 선택된 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 표적 DNA와 하이브리드화하는 단계(a),
    프라이머를 단일 염기에 상응하는 디데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에 효소로 신장시켜 각각 프라이머와 신장 절편을 함유하는 프라이머 신장 산물의 폴리뉴클레오타이드 혼합물을 제조하는 단계(b),
    신장 산물을 절단가능한 부위에서 절단시켜 신장 절편을 방출시키는 단계(여기서, 절단 전에 프라이머는 고정화 결합 부위에 고정화된다)(c),
    신장 절편을 제1항의 방법으로 사이징함으로써, 절단이 단계(b)의 상응하는 프라이머 신장 산물의 판독 길이에 비례하여 주어진 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(d) 및
    신장 절편의 크기를 비교하여 표적 DNA내의 단일 염기의 위치를 측정하는 단계(e)를 포함하여, 표적 DNA 서열의 단일 염기 핑거프린트를 측정하는 방법.
  100. (i) 표적 DNA와 상보성이고, (ii) 프라이머의 5' 말단 및 고정화 결합 부위를 함유하는 제1 영역을 가지며, (iii) 프라이머의 3' 말단을 함유하는 제2 영역(여기서, 3' 말단은 효소 신장을 위한 프라이밍 부위로서 작용할 수 있고, 제2 영역은 선택된 절단가능한 부위를 함유한다)을 가지는 프라이머를 DNA 표적과 하이브리드화하는 단계(a),
    프라이머를 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP) 및 데옥시우리딘 트리포스페이트(dUTP)의 존재하에 효소로 신장시켜 표적내의 dATP에 상응하는 위치에 dUTP를 함유하는 프라이머 신장 산물(여기서, 각각의 산물은 프라이머와 신장 절편을 함유한다)의 폴리뉴클레오타이드 혼합물을 제조하는 단계(b),
    프라이머 신장 산물을 단편에 대한 우라실 DNA-글리코실라제로 dUTP 위치에서 특이적으로 처리하여 프라이머 신장 분해 산물의 세트를 제조하는 단계(c),
    프라이머 신장 분해 산물을 세척하는 단계(여기서, 세척 전에 프라이머 신장 분해 산물은 고정화 결합 부위에 고정화되고, 각각의 고정화된 프라이머 신장 분해 산물은 프라이머와 신장 절편을 함유하며, 세척은 고정화되지 않은 종을 제거하기에 효과적이다)(d),
    고정화된 프라이머 신장 분해 산물을 절단가능한 부위에서 절단하여 신장 절편을 방출하는 단계(e),
    신장 절편을 제1항의 방법으로 사이징함으로써, 절단이 이의 상응하는 프라이머 신장 분해 산물의 판독 길이에 비례하여 주어진 신장 절편의 판독 길이를 증가시키기에 효과적이도록 하는 단계(f) 및
    방출된 신장 절편의 크기를 비교하여 표적 DNA내의 아데닌 위치를 측정하는 단계(g)를 포함하여, 표적 DNA 서열의 아데닌 핑거프린트를 측정하는 방법.
  101. 표적 핵산으로부터 비랜덤 길이 단편(NLF)의 세트를 일본쇄 형태로 수득하는 단계(여기서, 세트는 표적 핵산의 포지티브 스트랜드 및 네가티브 스트랜드 중의 하나로부터 유도된 NLF를 포함하거나, 표적 핵산의 포지티브 스트랜드 및 네가티브 스트랜드로부터 유도된 일본쇄 NLF의 서브세트이다)(a) 및
    위의 세트의 구성원 질량을 제1항의 방법으로 측정하는 단계(b)를 포함하여, 표적 핵산내의 돌연변이를 검출하는 방법.
  102. 표적 핵산을 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 비랜덤 단편화하여 이본쇄 NLF의 세트를 형성하는 단계(여기서, 비랜덤 단편화는 제한 완충액내의 휘발성 염의 사용을 추가로 포함한다)(a) 및
    이본쇄 NLF의 세트의 구성원 질량을 제1항의 방법으로 측정하는 단계(b)를 포함하여, 표적 핵산내의 돌연변이를 검출하는 방법.
  103. 표적 핵산을 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 비랜덤 단편화하여 비랜덤 길이 단편(NLF)의 제1 세트를 형성하는 단계(a),
    제1 NLF 세트의 구성원을 야생형 프로브의 세트와 하이브리드화하는 단계(b),
    NLF 세트의 하나 이상의 구성원을, 제1 NLF 세트의 구성원과 야생형 프로브 세트의 상보성 구성원 사이에 형성하는 뉴클레오타이드 미스매치의 임의의 영역에서 특이적으로 절단하는 하나 이상의 돌연변이-특이적 절단 시약으로 비랜덤 단편화하는 단계(여기서, 비랜덤 단편화 단계는 제2 NLF 세트를 형성한다)(c) 및
    제2 NLF 세트의 구성원 질량을 제1항의 방법으로 측정하는 단계(d)를 포함하여, 이본쇄 표적 핵산내의 돌연변이를 검출하는 방법.
  104. 표적 핵산을 하나 이상의 휘발성 염을 포함하는 혼합물로 비랜덤 단편화하여 비랜덤 길이 단편(NLF)의 세트를 형성하는 단계(a) 및
    NLF 세트의 구성원 질량을 제1항의 방법으로 측정하는 단계(b)를 포함하여, 표적 핵산내의 돌연변이를 검출하는 방법.
  105. 제1항에 있어서, 핵산 샘플을 휘발성 염의 혼합물로 세척하고, 샘플로부터 휘발성 염의 혼합물을 증발시켜 배경 노이즈를 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  106. DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 영역을 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계(a),
    표적 핵산을 하나 이상의 프라이머로 신장시켜 핵산 신장 산물의 제한된 크기 범위를 수득하는 단계(여기서, 하나 이상의 프라이머는 당해 위치의 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복체를 플랭킹하는 서열에 상보성이다)(b) 및
    핵산 신장 산물의 질량을 제1항의 방법으로 측정하는 단계(c)를 포함하여, 표적 핵산내의 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 위치에서 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 대립인자를 질량 분석법으로 분석하는 방법.
  107. DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 영역을 플랭킹(flanking)하는 서열에 상보성인 하나 이상의 프라이머를 신장시켜 하나 이상의 핵산 신장 산물을 수득하는 단계(a) 및
    하나 이상의 핵산 신장 산물의 질량을 제1항의 방법으로 동시에 측정하는 단계(여기서, 핵산 신장 산물은 중첩 대립인자 질량 범위를 갖는다)(b)를 포함하여, 질량 분석법에 의한 하나 이상의 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 위치로부터 하나 이상의 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 영역의 동정을 다중화하는 방법.
  108. DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 영역을 플랭킹하는 서열에 상보성인 2개 이상의 프라이머를 증폭시켜 하나 이상의 핵산 증폭 산물을 수득하는 단계(a) 및
    하나 이상의 핵산 증폭 산물의 질량을 제1항의 방법으로 동시에 측정하는 단계(여기서, 핵산 신장 산물은 중첩 대립인자 질량 범위를 갖는다)(b)를 포함하여, 하나 이상의 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 위치에 대한 하나 이상의 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 영역의 동정을 다중화하는 방법.
  109. DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 영역을 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계(a),
    표적 핵산을 하나 이상의 프라이머로 신장시켜 핵산 신장 산물의 제한된 크기 범위를 수득하는 단계(여기서, 하나 이상의 프라이머는 당해 위치의 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복체를 플랭킹하는 서열에 상보성이다)(b) 및
    핵산 신장 산물의 질량을 제1항의 방법으로 측정하는 단계(c)를 포함하여, 표적 핵산내의 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 위치에서 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 대립인자를 질량 분석법으로 분석하는 방법.
  110. 제109항에 있어서, 하나 이상의 프라이머의 3' 말단이 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 영역을 즉시 플랭킹하는 방법.
  111. 제109항에 있어서, 하나 이상의 프라이머가 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 위치의 하나 이하의 순차 반복체에 상보성인 서열을 포함하는 방법.
  112. 제111항에 있어서, 하나 이상의 프라이머가 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 위치의 2개 이하의 순차 반복체에 상보성인 서열을 포함하는 방법.
  113. 제112항에 있어서, 하나 이상의 프라이머가 DNA 순차 뉴클레오타이드 반복 위치의 3개 이하의 순차 반복체에 상보성인 서열을 포함하는 방법.
  114. 제109항에 있어서, 하나 이상의 프라이머가 절단가능한 부위를 포함하는 방법.
  115. 제114항에 있어서, 절단가능한 부위가 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 부위, 엑소뉴클레아제 차단 부위 또는 화학적으로 절단가능한 부위를 포함하는 방법.
  116. 제114항에 있어서, 하나 이상의 프라이머가 고체 지지체에 결합할 수 있는 방법.
  117. 제116항에 있어서, 하나 이상의 프라이머가 비오틴 또는 디곡시게닌을 포함하는 방법.
  118. 제109항에 있어서, 하나 이상의 프라이머의 신장이 쇄 종결 시약을 사용하여 종결되는 방법.
  119. 제109항에 있어서, 쇄 종결 시약이 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트인 방법.
  120. 표적 분자를 수득하는 단계(a),
    표적 분자를 증폭시켜 증폭된 표적 분자를 제조하는 단계(b),
    반응성 그룹, 방출 그룹 및 질량 표지를 포함하는 프로브를 수득하는 단계(c),
    증폭된 표적 분자를 프로브와 하이브리드화시켜 프로브:증폭된 표적 분자 복합체를 제조하는 단계(d),
    프로브:증폭된 표적 분자 복합체로부터 질량 표지를 방출시켜 방출된 질량 표지를 수득하는 단계(e) 및
    방출된 질량 표지의 질량을 제1항의 방법으로 측정하는 단계(f)를 포함하여, 표적 분자를 검출하는 방법.
  121. 제120항에 있어서, 단계(f) 전에 질량 표지를 액체 매트릭스와 혼합하는 방법.
  122. 제121항에 있어서, 액체 매트릭스가 글리세롤인 방법.
  123. 반응성 그룹, 방출 그룹 및 질량 표지를 포함하는 프로브를 수득하는 단계(a),
    표적 분자를 수득하는 단계(b),
    표적 분자를 프로브와 접촉시켜 프로브:표적 분자 복합체를 제조하는 단계(c),
    프로브:표적 분자 복합체로부터 질량 표지를 방출시키는 단계(d) 및
    질량 표지의 질량을 제1항의 방법으로 측정하는 단계(e)를 포함하여, 표적 분자를 검출하는 방법.
  124. 제123항에 있어서, 질량 표지가 비휘발성이고, 질량 표지가 프로브:표적 분자 복합체로부터 선택적으로 방출되는 방법.
  125. 제123항에 있어서, 단계(e) 전에 질량 표지를 액체 매트릭스와 혼합하는 방법.
  126. 제124항에 있어서, 매트릭스가 글리세롤인 방법.
  127. 반응성 그룹, 방출 그룹 및 질량 표지를 각각 포함하는 복수의 프로브를 수득하는 단계(a),
    표적 분자를 복수의 프로브와 접촉시켜 프로브:표적 분자 복합체를 제조하는 단계(여기서, 표적 분자는 프로브의 반응성 그룹에 결합한다)(b),
    프로브:표적 분자 복합체로부터 질량 표지를 방출시켜 방출된 질량 표지를 제조하는 단계(c) 및
    방출된 질량 표지의 질량을 제1항의 방법으로 측정하는 단계(여기서, 프로브:표적 분자 복합체내의 각각의 반응성 그룹은 질량 표지의 독특한 세트와 결합한다)(d)를 포함하여, 표적 분자의 검출을 다중화하는 방법.
  128. 제127항에 있어서, 단계(d) 전에, 질량 표지가 액체 매트릭스와 혼합되는 방법.
  129. 제127항에 있어서, 매트릭스가 글리세롤인 방법.
  130. 반응성 그룹, 방출 그룹 및 질량 표지를 각각 포함하는 복수의 프로브를 수득하는 단계(a),
    복수의 표적 분자를 복수의 프로브와 접촉시켜 프로브:표적 분자 복합체를 제조하는 단계(여기서, 표적 분자는 프로브의 반응성 그룹에 결합한다)(b),
    프로브:표적 분자 복합체로부터 질량 표지를 방출시켜 방출된 질량 표지를 제조하는 단계(c) 및
    방출된 질량 표지의 질량을 제1항의 방법으로 측정하는 단계(여기서, 특정한 표적 분자에 특이적인 각각의 반응성 그룹은 독특한 질량 표지에 결합한다)(d)를 포함하여, 복수의 표적 분자의 검출을 다중화하는 방법.
  131. 제130항에 있어서, 단계(d) 전에, 질량 표지가 액체 매트릭스와 혼합되는 방법.
  132. 제131항에 있어서, 매트릭스가 글리세롤인 방법.
  133. 생물학적 거대분자와, 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계(a) 및
    혼합물에 대해 IR-MALDI 질량 분석법을 수행하여 혼합물내의 표적 생물학적 거대분자를 동정함으로써 표적 생물학적 거대분자를 검출하는 단계(b)를 포함하여, 표적 생물학적 거대분자를 검출하는 방법.
  134. 제133항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 생물학적 샘플내에 존재하고, 표적 생물학적 거대분자의 검출이 생물학적 샘플내의 표적 생물학적 거대분자의 존재를 동정시켜 주는 방법.
  135. 제133항에 있어서, 생물학적 거대분자가 핵산인 방법.
  136. 제133항에 있어서, 생물학적 거대분자가 폴리펩타이드인 방법.
  137. 제133항에 있어서, 생물학적 거대분자가 탄수화물, 지질, 핵단백질, 프로테오글리칸 및 거대분자 복합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  138. 제133항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 고체 지지체 위에 고정화되는 방법.
  139. 제133항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 가역적 결합을 통해 고체 지지체에 고정화되는 방법.
  140. 제133항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 광절단가능한 결합을 통해 고체 지지체에 고정화되는 방법.
  141. 제139항에 있어서, 가역적 결합이 티올 결합 또는 이온 결합인 방법.
  142. 제138항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 IR-MALDI 질량 분석법을 수행하는 단계 동안에 지지체로부터 절단되는 방법.
  143. 제138항에 있어서, 고체 지지체가 비이드, 편평한 표면, 칩, 모세관, 핀, 콤브, 웨이퍼, 나노-웰 또는 피트의 화살을 갖는 웨이퍼, 섬유 광 케이블의 말단, 소수성 영역, 및 친수성 영역을 포함하는 표면을 갖는 지지체로 이루어진 그룹으로부터 선택되어 표적 분자를 지지체 위의 위치에 함유하는 방법.
  144. 제138항에 있어서, 고체 지지체가 금속, 세라믹, 플라스틱, 수지, 겔 및 막으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 물질인 방법.
  145. 제138항에 있어서, 지지체가 실리콘 웨이퍼이고, 표적 생물학적 거대분자가 배열로 고정화되는 방법.
  146. 제135항에 있어서, 표적 핵산이, 고체 지지체에 고정화된 상보성 포획 핵산 분자와의 하이브리드화에 의해 고정화되는 방법.
  147. 제133항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 IR-MALDI 질량 분석법을 수행하는 단계 전에 조절되는 방법.
  148. 제147항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 이온 교환에 의해 조절되는 방법.
  149. 제135항에 있어서, 표적 핵산이, 양이온 교환에 의해 수행된 포스포디에스테르 주쇄 변형, 알킬화제 또는 트리알킬실릴 클로라이드와의 접촉, 표적 핵산내의 탈푸린화에 대한 감수성을 감소시키는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 도입, 표적 핵산내의 하나 이상의 질량 변형된 뉴클레오타이드의 도입, 표적 핵산을 함유하지만 표적 핵산 서열과는 다른 핵산 분자의 부분과 태그 프로브와의 하이브리드화로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법에 의해 조절되는 방법.
  150. 제136항에 있어서, 표적 폴리펩타이드가, 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 시험관내 해독, 또는 시험관내 전사후 해독에 의해 수득되는 방법.
  151. 제150항에 있어서, 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 방법.
  152. 제136항에 있어서, 표적 폴리펩타이드가 태그(tag)를 포함하는 방법.
  153. 생물학적 샘플내에 존재하는 표적 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있는 검출기 올리고뉴클레오타이드를 핵산 분자와 접촉시키는 단계(a),
    적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 단계(a)의 산물을 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(b) 및
    혼합물 속의 이중가닥 핵산 분자를 IR-MALDI로 동정하여 생물학적 샘플내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 단계(c)를 포함하여, 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  154. 제153항에 있어서, 단계(a) 전에 생물학적 샘플내의 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  155. 핵산 분자를 하나 이상의 적절한 뉴클레아제를 사용하여 특이적으로 분해시킴으로써 분해된 단편을 제조하는 단계(a),
    분해된 단편을 고체 지지체 위에 고정화되고 표적 핵산의 분해된 단편과 하이브리드화할 수 있는 상보성 포획 핵산 서열과 하이브리드화하여 고정화된 단편을 제조하는 단계(b),
    적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 고정화된 단편을 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(c) 및
    고정화된 단편을 IR-MALDI 질량 분석법으로 동정하여 생물학적 샘플내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 단계(d)를 포함하여, 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  156. 제155항에 있어서, 단계(a) 전에 생물학적 샘플내의 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  157. 결합 추출물 및 열안정성 DNA 리가제의 세트와 함께 표적 핵산 서열을 함유하는 핵산 분자에 대한 1회 이상의 하이브리드화를 수행하는 단계(a),
    적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 단계(a)의 산물을 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(b) 및
    혼합물 속의 결합 산물을 IR-MALDI 질량 분석법으로 동정하여 표적 핵산 서열을 검출하는 단계(c)를 포함하여, 표적 핵산 서열을 검출하는 방법.
  158. 표적 핵산을 함유하는 핵산 분자의 일부분을 증폭시킬 수 있는 제1 프라이머 세트를 사용하여 표적 핵산 분자에 대해 제1 폴리머라제 연쇄 반응을 수행함으로써 제1 증폭 산물을 제조하는 단계(a),
    적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 제1 증폭 산물을 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(b) 및
    혼합물 속의 제1 증폭 산물을 IR-MALDI 질량 분석법으로 검출하여 생물학적 샘플내의 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계(c)를 포함하여, 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플내의 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법.
  159. 제158항에 있어서, 단계(b) 전에 표적 핵산을 함유하는 제1 증폭 산물의 일부분 이상을 증폭시킬 수 있는 제2 프라이머 세트를 사용하여 제1 증폭 산물에 대해 제2 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하는 방법.
  160. 표적 뉴클레오타이드를 함유하는 핵산 분자를, 표적 뉴클레오타이드에 인접한 부위에서 핵산 분자에 상보성인 프라이머 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하여 하이브리드화된 핵산 분자를 제조하는 단계(a),
    하이브리드화된 핵산 분자를 완전한 세트의 디데옥시뉴클레오사이드 또는 3'-데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 의존성 DNA 폴리머라제와 접촉시켜, 표적 뉴클레오타이드에 상보성인 단지 디데옥시뉴클레오사이드 또는 3'-데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트만을 프라이머로 신장시킴으로써 신장된 프라이머를 제조하는 단계(b),
    적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 신장된 프라이머를 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(c) 및
    혼합물 속의 신장된 프라이머를 IR-MALDI 질량 분석법으로 검출하여 표적 뉴클레오타이드의 동일성을 측정하는 단계(d)를 포함하여, 표적 뉴클레오타이드의 동일성을 측정하는 방법.
  161. 표적 핵산 서열을 함유하는 핵산 분자를 하나 이상의 프라이머(여기서, 프라이머는 표적 핵산 서열에 상보성인 3' 말단 염기를 갖는다)와 하이브리드화시켜 하이브리드화 산물을 제조하는 단계(a),
    하이브리드화 산물을 적절한 폴리머라제 효소 및 이어서 4개의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중의 하나의 뉴클레오사이드 트리포스페이트와 접촉시키는 단계(b),
    적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 단계(b)의 산물을 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(c) 및
    혼합물 속의 단계(b)의 산물(여기서, 산물의 분자량은 표적 핵산 분자에서 프라이머의 3' 말단에 인접한 돌연변이의 존재 또는 부재를 나타낸다)을 IR-MALDI 질량 분석법으로 검출하는 단계(d)를 포함하여, 표적 핵산 서열내의 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 방법.
  162. 제161항에 있어서, 표적 핵산 서열을 함유하는 핵산 분자가 고체 지지체에 고정화되는 방법.
  163. 제161항에 있어서, 단계(a) 전에 표적 핵산 서열을 함유하는 핵산 분자가 증폭되는 방법.
  164. 표적 핵산을 올리고뉴클레오타이드 프로브와 하이브리드화하여 하이브리드화된 표적 핵산을 제조하는 단계(여기서, 미스매치는 돌연변이 부위에서 형성된다)(a),
    하이브리드화된 표적 핵산을 일본쇄 특이적 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계(b),
    적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 단계(b)의 산물을 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(c) 및
    혼합물을 IR-MALDI 질량 분석법으로 분석하는 단계(여기서, 혼합물에서 표적 핵산의 하나 이상의 단편의 존재는 표적 핵산의 돌연변이를 검출한다)(d)를 포함하여, 표적 핵산내의 돌연변이를 검출하는 방법.
  165. 표적 핵산 서열을 결합 추출물과 DNA 리가제의 세트와 함께 함유하는 핵산 분자에 대해 1회 이상의 하이브리드화를 수행하는 단계(a),
    적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 단계(a)의 산물을 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(b) 및
    혼합물을 IR-MALDI 질량 분석법으로 분석하는 단계(여기서, 혼합물 속의 결합 산물의 검출은 표적 핵산 서열내의 돌연변이의 부재를 동정시켜 주며, 혼합물 속의 단지 결합 추출물 세트의 검출은 표적 핵산 서열내의 돌연변이의 존재를 동정시켜 준다)(c)를 포함하여, 표적 핵산 서열내의 돌연변이의 존재 또는 부재를 동정하는 방법.
  166. 적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 복수의 상이하게 질량 변형된 표적 생물학적 거대분자를 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(a),
    각각 상이하게 질량 변형된 표적 생물학적 거대분자의 분자량을 IR-MALDI 질량 분석법으로 복수로 측정하는 단계(b) 및
    각각 상이하게 질량 변형된 표적 생물학적 거대분자의 분자량을 상응하는 공지된 생물학적 거대분자의 분자량과 복수로 비교하여 복수의 표적 생물학적 거대분자 또는 이의 단편내의 각 표적 생물학적 거대분자의 동일성을 측정하는 단계(c)를 포함하여, 복수의 표적 생물학적 거대분자에서 각각의 표적 생물학적 거대분자의 동일성을 측정하는 방법.
  167. 제166항에 있어서, 복수의 각 표적 생물학적 거대분자가 생물학적 거대분자의 단편이고, 각각의 단편이 생물학적 거대분자를 생물학적 거대분자의 형성에 관여하는 결합을 절단하는 하나 이상의 제제에 접촉시킴으로써 제조되는 방법.
  168. 표적 생물학적 거대분자로부터 2개 이상의 생물학적 거대분자 단편을 제조하는 단계(a),
    적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 생물학적 거대분자 단편을 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(b) 및
    혼합물 속의 생물학적 거대분자 단편을 IR-MALDI 질량 분석법으로 분석하여 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 단계(c)를 포함하여, 표적 생물학적 거대분자의 서열을 결정하는 방법.
  169. 표적 생물학적 거대분자의 종을, 표적 생물학적 거대분자의 형성에 관여하는 각각의 결합이 절단되도록, 표적 생물학적 거대분자의 형성에 관여하는 결합을 절단하는 하나 이상의 제제와 접촉시켜 생물학적 거대분자 종의 결실 단편의 중복 세트를 제조하는 단계(a),
    적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 결실 단편의 중복 세트를 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(b) 및
    혼합물 속의 각 결실 단편의 분자량을 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정하여 표적 생물학적 거대분자 종의 아단위 서열을 결정하는 단계(c)를 포함하여, 표적 생물학적 거대분자의 하나 이상의 종(i)의 아단위 서열을 결정하는 방법.
  170. 제169항에 있어서, 절단하는 제제가 말단으로부터 한쪽 방향으로 표적 생물학적 거대분자를 절단하는 제제인 방법.
  171. 제170항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 핵산이고, 절단하는 제제가 엑소뉴클레아제인 방법.
  172. 제170항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 폴리펩타이드이고, 절단하는 제제가 엑소펩티다제인 방법.
  173. 제170항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자의 하나 이상의 종이 표적 생물학적 거대분자의 i+1 종을 포함하고, 표적 생물학적 거대분자의 각 종이 상이하게 질량 변형되어 표적 생물학적 거대분자의 각 종의 결실 단편이 모든 다른 표적 생물학적 거대분자의 결실 단편으로부터 IR-MALDI 질량 분석법으로 구별될 수 있는 방법.
  174. 서열 분석되는 핵산 종에 상보성이며, 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 출발하고 쇄의 존재하에 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 종결시키는, 상보성 핵산을 합성하여 염기 특이적으로 종결된 상보성 폴리뉴클레오타이드 단편의 4개 세트를 제조하는 단계(a),
    적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 폴리뉴클레오타이드 단편의 4개 세트를 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(b) 및
    각 폴리뉴클레오타이드 단편의 분자량 값을 IR-MALDI 질량 분석법으로 측정하는 단계(c) 및
    분자량에 따라 분자량 값을 정렬하며 핵산 종의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계(d)를 포함하여, 하나 이상의 핵산 종(i)의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법.
  175. 제174항에 있어서, 핵산 종이 RNA이고, 쇄 종결 뉴클레오사이드 트리포스페이트가 리보뉴클레오타이드 트리포스페이트 또는 이의 유도체이며, 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 개시 인자 올리고뉴클레오타이드인 방법.
  176. 제173항에 있어서, 핵산의 i+1 종이 i+1 프라이머를 사용하는 다중 질량 분석법 핵산 서열 분석에 의해 동시에 서열 분석되고, i+1 프라이머중 하나가 변형된 프라이머 또는 질량 변형된 프라이머이며, 다른 i 프라이머가 질량 변형된 프라이머이고, 각각의 i+1 프라이머가 IR-MALDI 질량 분석법으로 서로 구별될 수 있는 방법.
  177. 하나 이상의 부분적 일본쇄의 표적 핵산을 하나 이상의 핵산 프로브(여기서, 각각의 프로브는 이본쇄 부분, 일본쇄 부분 및 일본쇄 부분내의 측정가능한 가변 서열을 포함한다)와 하이브리드화하여 하나 이상의 하이브리드화된 표적 핵산을 제조하는 단계(a),
    적외선을 흡수하는 액체 매트릭스와 하이브리드화된 표적 핵산을 포함하는 IR-MALDI 혼합물을 제조하는 단계(b),
    하이브리드화된 표적 핵산의 서열을, 표적 핵산이 하이브리드화된 프로브의 측정가능한 가변 서열에 기초하여 IR-MALDI 질량 분석법으로 결정하는 단계(c) 및
    표적 핵산의 서열을 결정하기에 충분한 횟수로 단계(a) 내지 단계(c)를 반복하는 단계(d)를 포함하여, 표적 핵산의 서열을 결정하는 방법.
  178. 제177항에 있어서, 하나 이상의 핵산 프로브가 배열로 고정화되는 방법.
  179. 제177항에 있어서, 단계(b) 전에 하이브리드화된 표적 핵산을 측정가능한 가변 서열에 결합시키는 방법.
  180. 샘플을 적외선에 노출시키는 단계 및
    매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분석법을 사용하여 샘플을 분석하는 단계(여기서, 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화에 의한 질량 측정의 정밀도는 약 102내지 약 5×103ppm의 범위이다)를 포함하여, 샘플내의 생물학적 거대분자를 분석하는 방법.
  181. 제180항에 있어서, 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화에 의한 질량 측정의 정확도가 약 100 내지 약 500ppm의 범위인 방법.
  182. 제180항에 있어서, 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화에 의한 질량 측정의 정확도가 약 1×103내지 약 5×103ppm의 범위인 방법.
  183. 제180항에 있어서, 생물학적 거대분자의 분자량이 150kDa 이하이고, 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화에 의한 질량 측정의 정밀도가 약 400 내지 500ppm 범위인 방법.
  184. 제180항에 있어서, 생물학적 거대분자의 분자량이 150kDa 이하이고, 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화에 의한 질량 측정의 정밀도가 약 200 내지 400ppm 범위인 방법.
  185. 제180항에 있어서, 생물학적 거대분자의 분자량이 1MDa(메가달톤)를 초과하는 방법.
  186. 제180항에 있어서, 지연된 추출법에 의해 이온 공급원으로부터 이온을 추출하여 질량 재혼합을 향상시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  187. 제180항에 있어서, 매트릭스가 글리세롤인 방법.
  188. 제180항에 있어서, 매트릭스가 석신산인 방법.
  189. 제180항에 있어서, 생물학적 거대분자가 50kDa를 초과하는 폴리펩타이드이고, 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분석법이 리플렉트론 흐름 시간(TOF) 포맷으로 수행되는 방법.
  190. 제180항에 있어서, 샘플을 매트릭스와 혼합하여 핵산과의 균질한 혼합물을 형성하고,
    핵산이 샘플내에 존재하는지의 여부를 검출하는 것을 포함하여, 샘플에서 핵산의 존재 또는 부재를 검출하는 방법.
  191. 제190항에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플인 방법.
  192. 제190항에 있어서, 핵산이 2000개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  193. 제190항에 있어서, 핵산이 280개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  194. 제190항에 있어서, 핵산이 DNA인 방법.
  195. 제190항에 있어서, 핵산이 1200개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  196. 제190항에 있어서, 핵산이 RNA인 방법.
  197. 제190항에 있어서, 핵산의 존재 또는 부재가 유전적 질병의 존재 또는 부재를 나타내는 방법.
  198. 제190항에 있어서, 핵산의 존재 또는 부재가 선천적 결함의 존재 또는 부재를 나타내는 방법.
  199. 제190항에 있어서, 핵산의 존재 또는 부재가 감염성 유기체의 존재 또는 부재를 나타내는 방법.
  200. 제190항에 있어서, 핵산의 존재 또는 부재가 피검체의 동일성을 나타내는 방법.
  201. 제190항에 있어서, 매트릭스가 치환되거나 비치환된 알콜인 방법.
  202. 제190항에 있어서, 핵산/매트릭스 혼합물이 편평한 표면의 피트내의 칩 어레이, 핀 어레이 또는 비이드 어레이 전계에 침착되는 방법.
  203. 적외선 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분석법을 사용하여 샘플을 분석하여 표적 생물학적 거대분자가 샘플내에 존재하는지의 여부를 검출함을 포함하여, 샘플내의 표적 생물학적 거대분자의 존재 또는 부재를 측정하는 방법.
  204. 제203항에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플인 방법.
  205. 제203항에 있어서, 샘플이 표적 생물학적 거대분자 이외에 하나 이상의 생물학적 거대분자를 함유하는 방법.
  206. 제203항에 있어서, 표적 거대분자가 생체고분자인 방법.
  207. 제206항에 있어서, 표적 생체고분자가 폴리펩타이드인 방법.
  208. 제206항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 핵산인 방법.
  209. 제206항에 있어서, 표적 핵산이 이본쇄 핵산 또는 일본쇄 핵산이거나, 표적 핵산이 이본쇄 영역 및 일본쇄 영역을 포함하는 방법.
  210. 제206항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자의 존재 또는 부재가 유전적 질병의 존재 또는 부재, 또는 선천성 결함의 존재 또는 부재, 감염성 유기체의 존재 또는 부재, 피검체의 동일성 중의 하나 이상을 나타내는 방법.
  211. 제203항에 있어서, 지연된 이온 추출법이 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분석법에서 사용되는 방법.
  212. 제203항에 있어서, 생물학적 거대분자가 탄수화물, 핵단백질, 프로테오글리칸, 지질, 핵산 동족체 및 거대분자 복합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  213. 제203항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 고체 지지체에 고정화되는 방법.
  214. 제213항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 절단가능한 결합 및/또는 가역적 결합을 통해 고체 지지체에 고정화되는 방법.
  215. 제213항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분석법을 수행하는 단계 동안에 지지체로부터 절단되는 방법.
  216. 제213항에 있어서, 지지체가 하나 이상의 친수성 부분을 포함하고, 하나 이상의 부분 각각이 소수성 부분 또는 하나 이상의 소수성 부분에 의해 둘러싸여 있으며, 하나 이상의 부분 각각이 친수성 부분에 의해 둘러싸여 있거나 섬유 광 케이블의 말단인 방법.
  217. 제209항에 있어서, 표적 핵산이, 고체 지지체에 고정화되는 상보성 포획 핵산 분자와의 하이브리드화에 의해 고정화되는 방법.
  218. 제203항에 있어서, 표적 생물학적 거대분자가 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분석법을 수행하는 단계 전에 조절되는 방법.
  219. 제203항에 있어서, 표적 생체고분자가, 이온 교환; 양이온 교환에 의해 수행된 포스포디에스테르 주쇄 변형; 알킬화제 또는 트리알킬실릴 클로라이드와의 접촉; 표적 핵산내의 탈푸린화에 대한 감수성을 감소시키는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 도입; 표적 핵산내의 하나 이상의 질량 변형된 뉴클레오타이드의 도입; 표적 핵산을 함유하지만 표적 핵산 서열과는 다른 핵산 분자의 일부분과 태그 프로브와의 하이브리드화로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법에 의해 조절되는 방법.
  220. 제207항에 있어서, 표적 폴리펩타이드가 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 시험관내 해독, 또는 시험관내 전사후 해독에 의해 수득되는 방법.
  221. 제220항에 있어서, 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 방법.
  222. 제207항에 있어서, 표적 폴리펩타이드가 태그를 포함하는 방법.
  223. 제203항에 있어서, 샘플이 글리세롤인 매트릭스를 포함하고, 생물학적 거대분자가, 질량 범위가 약 1×104Da 내지 약 1×106Da인 핵산인 방법.
  224. 제203항에 있어서, 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분석법을 사용하여 샘플을 분석하기 전에 샘플을 기질 위에 침착시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  225. 제224항에 있어서, 침착이 자동화된 액체 분산 장치에 의해 수행되는 방법.
  226. 제203항에 있어서, 적외선 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분석법이 약 -80℃ 내지 20℃의 온도 범위에서 수행되는 방법.
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Families Citing this family (230)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
US5777324A (en) 1996-09-19 1998-07-07 Sequenom, Inc. Method and apparatus for maldi analysis
US7285422B1 (en) * 1997-01-23 2007-10-23 Sequenom, Inc. Systems and methods for preparing and analyzing low volume analyte array elements
AU5794498A (en) 1996-12-10 1998-07-03 Genetrace Systems, Inc. Releasable nonvolatile mass-label molecules
US20110166040A1 (en) * 1997-09-05 2011-07-07 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of strains of e. coli o157:h7
US20020009394A1 (en) 1999-04-02 2002-01-24 Hubert Koster Automated process line
US6869572B1 (en) * 1999-09-13 2005-03-22 Millipore Corporation High density cast-in-place sample preparation card
US20030190644A1 (en) * 1999-10-13 2003-10-09 Andreas Braun Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
US7917301B1 (en) 2000-09-19 2011-03-29 Sequenom, Inc. Method and device for identifying a biological sample
AU776811C (en) 1999-10-13 2005-07-28 Agena Bioscience, Inc. Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
US6824980B2 (en) 2000-06-08 2004-11-30 Xiao Bing Wang Isometric primer extension method and kit for detection and quantification of specific nucleic acid
EP1679381A1 (en) * 2000-06-08 2006-07-12 Xiao Bing Wang Isometric primers extension method and kit for detection and quantification of specific nucleic acid
DE10029914A1 (de) * 2000-06-19 2002-01-03 Epigenomics Ag Verfahren zur hochparallelen Analyse von Polymorphismen
WO2001099043A1 (en) 2000-06-19 2001-12-27 Correlogic Systems, Inc. Heuristic method of classification
US6680203B2 (en) 2000-07-10 2004-01-20 Esperion Therapeutics, Inc. Fourier transform mass spectrometry of complex biological samples
IL153856A0 (en) * 2000-07-18 2003-07-31 Correlogic Systems Inc A process for discriminating between biological states based on hidden patterns from biological data
WO2002014849A1 (en) 2000-08-16 2002-02-21 Vanderbilt University System and method of infrared matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry in polyacrylamide gels
US20020195555A1 (en) * 2000-10-11 2002-12-26 Weinberger Scot R. Apparatus and methods for affinity capture tandem mass spectrometry
CA2425434A1 (en) * 2000-10-11 2002-04-18 Tina Morris Methods for characterizing molecular interactions using affinity capture tandem mass spectrometry
EP1332000B1 (en) * 2000-10-30 2012-06-20 Sequenom, Inc. Method for delivery of submicroliter volumes onto a substrate
JP2004536276A (ja) * 2000-11-16 2004-12-02 シファーゲン バイオシステムズ， インコーポレイテッド 質量スペクトルを分析する方法
EP1356086A2 (de) * 2000-12-13 2003-10-29 Institut Für Physikalische Hochtechnologie E.V. Verfahren zum simultanen positionsspezifischen schneiden von fadenförmigen organischen molekülketten, insbesonere dna
US7609731B2 (en) 2001-01-30 2009-10-27 Board Of Trustees Operating Michigan State University Laser system using ultra-short laser pulses
US7450618B2 (en) 2001-01-30 2008-11-11 Board Of Trustees Operating Michigan State University Laser system using ultrashort laser pulses
WO2002061799A2 (en) 2001-01-30 2002-08-08 Board Of Trustees Operating Michigan State University Control system and apparatus for use with laser excitation or ionization
US7567596B2 (en) 2001-01-30 2009-07-28 Board Of Trustees Of Michigan State University Control system and apparatus for use with ultra-fast laser
GB0103516D0 (en) * 2001-02-13 2001-03-28 Cole Polytechnique Federale De Apparatus for dispensing a sample
EP1366356B1 (en) 2001-02-14 2010-07-21 Picoliter, Inc. Acoustic sample introduction for analysis and/or processing
US6707038B2 (en) * 2001-02-14 2004-03-16 Picoliter Inc. Method and system using acoustic ejection for selective fluid deposition on a nonuniform sample surface
US7026163B1 (en) 2001-02-23 2006-04-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Sulfotransferase sequence variants
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US20030027135A1 (en) * 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US20040121314A1 (en) * 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in containers
US7718354B2 (en) 2001-03-02 2010-05-18 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US20040121311A1 (en) * 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock
US20030036057A1 (en) * 2001-03-09 2003-02-20 Andreas Braun Genes and polymorphisms associated with cardiovascular disease and their use
EP1386343B1 (en) * 2001-03-19 2012-10-24 Gyros Patent Ab A microfluidic system for energy desorption / ionisation mass spectrometry
WO2002086168A1 (en) * 2001-04-19 2002-10-31 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomolecule characterization using mass spectrometry and affinity tags
US20020155587A1 (en) 2001-04-20 2002-10-24 Sequenom, Inc. System and method for testing a biological sample
GB0110030D0 (en) * 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank RNA genomics
US7056731B1 (en) 2001-06-22 2006-06-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Sulfotransferase SULT2A1 sequence variants
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
US20040151627A1 (en) * 2001-08-30 2004-08-05 Nelson Mary Anne Methods for covalently attaching nucleic acids to substrates
JP2005507074A (ja) * 2001-10-26 2005-03-10 セクエノム， インコーポレイテッド ハイスループットのサンプル取り扱いプロセスラインのための方法および装置
US7067311B1 (en) 2001-11-14 2006-06-27 Mayo Foundation For Medical Education And Research 3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate synthetase 1 (PAPSS1) sequence variants
US7186551B1 (en) 2001-11-14 2007-03-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research 3′-phosphoadenosine -5′-phosphosulfate synthetase 2 (PAPSS2) sequence variants
CA2470274A1 (en) * 2001-12-19 2003-07-03 Biogen, Inc. Methods for detecting half-antibodies using chip-based gel electrophoresis
US7288641B1 (en) 2002-01-30 2007-10-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Sulfotransferase 1E1 sequence variants
US20020193950A1 (en) * 2002-02-25 2002-12-19 Gavin Edward J. Method for analyzing mass spectra
US6881950B2 (en) * 2002-04-12 2005-04-19 University Of South Florida Method for producing a three-dimensional macro-molecular structure
US7432342B2 (en) * 2002-05-03 2008-10-07 Sequenom, Inc. Kinase anchor protein muteins, peptides thereof and related documents
US20040224329A1 (en) * 2003-05-08 2004-11-11 Gjerde Douglas T. Three-dimensional solid phase extraction surfaces
TW200407540A (en) * 2002-07-29 2004-05-16 Correlogic Systems Inc Quality assurance for high-throughput bioassay methods cross-reference to related applications
US8034567B2 (en) * 2002-09-06 2011-10-11 Trustees Of Boston University Quantification of gene expression
US7833802B2 (en) * 2002-11-21 2010-11-16 Ada Technologies, Inc. Stroboscopic liberation and methods of use
US7597936B2 (en) * 2002-11-26 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Method of producing a pigmented composite microporous material
AU2003298733B2 (en) 2002-11-27 2009-06-18 Agena Bioscience, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
JP3928043B2 (ja) * 2002-11-29 2007-06-13 独立行政法人産業技術総合研究所 生体高分子光切断装置および生体高分子光切断方法
JP2006516193A (ja) 2002-12-06 2006-06-29 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヒトおよび動物における病原体の迅速な同定方法
GB0229337D0 (en) * 2002-12-17 2003-01-22 Amersham Biosciences Ab Method and system for mass spectrometry
US7371523B1 (en) 2003-01-09 2008-05-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Phenylethanolamine-N-methyltransferase sequence variants
CA2658334C (en) 2003-01-16 2012-07-10 Caprotec Bioanalytics Gmbh Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions
US7425624B1 (en) 2003-01-21 2008-09-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Sulfotransferase 1A3 sequence variants
WO2004072268A2 (en) 2003-02-12 2004-08-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Pkhdl1, a homolog of the autosomal recessive kidney disease gene
US6956208B2 (en) * 2003-03-17 2005-10-18 Indiana University Research And Technology Corporation Method and apparatus for controlling position of a laser of a MALDI mass spectrometer
US20040183009A1 (en) * 2003-03-17 2004-09-23 Reilly James P. MALDI mass spectrometer having a laser steering assembly and method of operating the same
EP1604381A2 (en) * 2003-03-17 2005-12-14 Indiana University Research and Technology Corporation Maldi mass spectrometer having a laser steering assembly and method operating the same
US6977370B1 (en) * 2003-04-07 2005-12-20 Ciphergen Biosystems, Inc. Off-resonance mid-IR laser desorption ionization
US7250290B1 (en) 2003-04-15 2007-07-31 Mayo Foundation For Medical Education And Research Arsenic methyltransferase sequence variants
US8046171B2 (en) 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
WO2004097395A1 (ja) * 2003-04-30 2004-11-11 Sumitomo Chemical Company, Limited マトリックス支援レーザー脱離質量分析用マトリックス
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US10191028B1 (en) 2003-06-06 2019-01-29 Ionwerks Inorganic nanoparticle matrices for sample analysis
DE602004019941D1 (de) 2003-07-31 2009-04-23 Sequenom Inc Verfahren für multiplex-polymerasekettenreaktionen auf hohem niveau und homogenen massenverlängerungsreaktionen zur genotypisierung von polymorphismen
EP1649281A4 (en) * 2003-08-01 2007-11-07 Correlogic Systems Inc MULTIPLE HIGH RESOLUTION SERUM PROTEOMIC CHARACTERISTICS FOR THE DETECTION OF OVARIAN CANCER
WO2005024068A2 (en) * 2003-09-05 2005-03-17 Sequenom, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8288523B2 (en) 2003-09-11 2012-10-16 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US20100129811A1 (en) * 2003-09-11 2010-05-27 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of pseudomonas aeruginosa
US20080138808A1 (en) * 2003-09-11 2008-06-12 Hall Thomas A Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US20060240412A1 (en) * 2003-09-11 2006-10-26 Hall Thomas A Compositions for use in identification of adenoviruses
US20070275481A1 (en) * 2003-11-24 2007-11-29 Biogen Idec Ma Inc. Methods For Detecting Half-Antibodies Using Chip Based Gel Electophoresis
US8163895B2 (en) 2003-12-05 2012-04-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of orthopoxviruses
JP4774534B2 (ja) * 2003-12-11 2011-09-14 アングーク ファーマシューティカル カンパニー，リミティド 集中化適応モデル及び遠隔操作サンプルプロセッシングの使用を介した生物学的状態の診断方法
US7603240B2 (en) * 2004-01-20 2009-10-13 Mcw Research Foundation, Inc. Peptide identification
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US7588906B2 (en) * 2004-02-24 2009-09-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Hydrogels for biomolecule analysis and corresponding method to analyze biomolecules
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
WO2005098050A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Sequenom, Inc. Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis
CA2567839C (en) 2004-05-24 2011-06-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7785843B2 (en) * 2004-06-23 2010-08-31 Sequenom, Inc. Target-specific compomers and methods of use
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
US20060024725A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-02 Robert Hussa Oncofetal fibronectin as a marker for pregnancy-related indications
US7309589B2 (en) * 2004-08-20 2007-12-18 Vironix Llc Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing
CN101072882A (zh) * 2004-09-10 2007-11-14 塞昆纳姆股份有限公司 用于核酸长程序列分析的方法
WO2006037059A2 (en) * 2004-09-27 2006-04-06 The Johns Hopkins Universtiy Point-of-care mass spectrometer system
CA3079874C (en) 2004-10-22 2023-01-03 Revivicor, Inc. Ungulates with genetically modified immune systems
WO2007053170A2 (en) * 2005-02-09 2007-05-10 Correlogic Systems, Inc. Identification of bacteria and spores
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
EP1869180B1 (en) * 2005-03-03 2013-02-20 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of polyoma viruses
ATE508208T1 (de) 2005-03-08 2011-05-15 Postech Foundation Verfahren zur de-novo-peptidsequenzierung mittels maldi-massenspektrometrie
US8377711B2 (en) * 2005-04-04 2013-02-19 Ada Technologies, Inc. Stroboscopic liberation and methods of use
WO2006118566A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 Mayo Foundation For Medical Education And Research Assessing brain aneurysms
US20060252081A1 (en) * 2005-05-06 2006-11-09 Applera Corporation PNA probes, mixtures, methods and kits pertaining to the determination of Mycoplasma and related Mollicutes
WO2006124628A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Correlogic Systems, Inc. A model for classifying a biological sample in relation to breast cancer based on mass spectral data
US7390894B2 (en) 2005-07-07 2008-06-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Glutathione S-transferase sequence variants
US7858306B2 (en) 2005-07-07 2010-12-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research HSD3B1 sequence variants
US8026084B2 (en) 2005-07-21 2011-09-27 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
WO2007041067A2 (en) * 2005-09-29 2007-04-12 Children's Hospital & Research Center At Oakland Methods and compositions for kir genotyping
US7572586B2 (en) 2005-11-01 2009-08-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Identifying susceptibility to cardiac hypertrophy
US20080023630A1 (en) * 2005-11-22 2008-01-31 Ciphergen Biosystems Inc. Polymer probe doped with conductive material for mass spectrometry
WO2007115207A2 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Regents Of The University Of Minnesota Irf-5 haplotypes in systemic lupus erythematosus
EP2010679A2 (en) 2006-04-06 2009-01-07 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for the use in identification of fungi
US9018562B2 (en) 2006-04-10 2015-04-28 Board Of Trustees Of Michigan State University Laser material processing system
US8084734B2 (en) 2006-05-26 2011-12-27 The George Washington University Laser desorption ionization and peptide sequencing on laser induced silicon microcolumn arrays
US20100285973A1 (en) * 2006-05-30 2010-11-11 Synergenz Bioscience Limited of Sea Meadow House Methods and compositions for assessment of pulmonary function and disorders
JP5123936B2 (ja) 2006-05-30 2013-01-23 メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ 認知症の検出および治療
DK2037948T3 (en) 2006-05-30 2016-08-01 Mayo Foundation Detection and treatment of dementia
WO2008143627A2 (en) 2006-09-14 2008-11-27 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
EP2081686A4 (en) 2006-09-29 2010-05-05 Ge Healthcare Bio Sciences Ab METHOD AND DEVICE FOR REACTIONS IN SMALL SCALE
WO2008070314A2 (en) * 2006-10-26 2008-06-12 Integrated Dna Technologies, Inc. Fingerprint analysis for a plurality of oligonucleotides
EP1930444A1 (de) * 2006-12-08 2008-06-11 BioSpring Gesellschaft für Biotechnologie mbH Massenspektrometrisches Verfahren an Proben enthaltend Nukleinsäuren
JP5302212B2 (ja) * 2006-12-18 2013-10-02 コヴァルクス・アーゲー 治療タンパク質の凝集体の直接質量分光分析
GB0700475D0 (en) * 2007-01-10 2007-02-21 Cole Polytechnique Federale De Ionization device
WO2008092118A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Ada Technologies, Inc. Stroboscopic signal amplification and surface enhanced raman spectroscopy
EP2126132B1 (en) 2007-02-23 2013-03-20 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid foresnsic dna analysis
WO2008118809A1 (en) * 2007-03-23 2008-10-02 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of mixed populations of bioagents
US20100291544A1 (en) * 2007-05-25 2010-11-18 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of strains of hepatitis c virus
US9598724B2 (en) 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
US8278043B2 (en) 2007-06-05 2012-10-02 Melica Hb Methods and materials related to grey alleles
US20110045456A1 (en) * 2007-06-14 2011-02-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious contaminant viruses
JP2010532484A (ja) 2007-06-29 2010-10-07 コレロジック システムズ，インコーポレイテッド 卵巣癌のための予測マーカー
US20090180931A1 (en) 2007-09-17 2009-07-16 Sequenom, Inc. Integrated robotic sample transfer device
US7888127B2 (en) * 2008-01-15 2011-02-15 Sequenom, Inc. Methods for reducing adduct formation for mass spectrometry analysis
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
WO2009131728A2 (en) * 2008-01-29 2009-10-29 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of picornaviruses
DE102008007112B3 (de) * 2008-01-31 2009-08-06 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Verfahren zur Sequenzierung eines RNA-Moleküls mittels Massenspektrometrie
CA2712520A1 (en) * 2008-01-31 2009-08-06 Dh Technologies Development Pte. Ltd. High-throughput screening of metabolic disorders using a laser desorption ion source coupled to a mass analyzer
US20110177515A1 (en) * 2008-05-30 2011-07-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of francisella
WO2009155103A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-23 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of tick-borne pathogens
US20110151437A1 (en) * 2008-06-02 2011-06-23 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious viruses
WO2010033627A2 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
EP2349549B1 (en) 2008-09-16 2012-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, and system
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
EP2344893B1 (en) 2008-09-16 2014-10-15 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and methods
EP2334234A4 (en) 2008-09-19 2013-03-20 Tandem Diabetes Care Inc DEVICE FOR MEASURING THE CONCENTRATION OF A SOLVED SUBSTANCE AND CORRESPONDING METHOD
EP2344672B8 (en) 2008-09-25 2014-12-24 SureGene LLC Genetic markers for optimizing treatment for schizophrenia
US20110189687A1 (en) * 2008-10-02 2011-08-04 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of members of the bacterial genus mycoplasma
WO2010039696A1 (en) * 2008-10-02 2010-04-08 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of herpesviruses
WO2010039870A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of neisseria, chlamydia, and/or chlamydophila bacteria
WO2010039763A2 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of antibiotic-resistant bacteria
WO2010039787A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of clostridium difficile
US20110183345A1 (en) * 2008-10-03 2011-07-28 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of streptococcus pneumoniae
US20110183343A1 (en) * 2008-10-03 2011-07-28 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of members of the bacterial class alphaproteobacter
WO2010051288A1 (en) 2008-10-27 2010-05-06 Revivicor, Inc. Immunocompromised ungulates
US9202678B2 (en) 2008-11-14 2015-12-01 Board Of Trustees Of Michigan State University Ultrafast laser system for biological mass spectrometry
US8110796B2 (en) 2009-01-17 2012-02-07 The George Washington University Nanophotonic production, modulation and switching of ions by silicon microcolumn arrays
EP2394175B1 (en) * 2009-02-09 2016-02-03 caprotec bioanalytics GmbH Devices, systems and methods for separating magnetic particles
EP2396803A4 (en) 2009-02-12 2016-10-26 Ibis Biosciences Inc IONIZATION PROBE ASSEMBLIES
DE102009011653B4 (de) * 2009-03-04 2011-12-15 Bruker Daltonik Gmbh Lasersystem für MALDI-Massenspektrometrie
GB2468394B (en) * 2009-03-04 2015-05-13 Bruker Daltonik Gmbh Laser system for maldi mass spectrometry
WO2010141128A2 (en) 2009-03-05 2010-12-09 Board Of Trustees Of Michigan State University Laser amplification system
WO2010104798A1 (en) 2009-03-08 2010-09-16 Ibis Biosciences, Inc. Bioagent detection methods
DE102009013914B4 (de) * 2009-03-19 2011-05-05 Bruker Daltonik Gmbh Kalibriersubstanzen für Atmosphärendruck-Ionenquellen
WO2010114842A1 (en) 2009-03-30 2010-10-07 Ibis Biosciences, Inc. Bioagent detection systems, devices, and methods
US9490113B2 (en) 2009-04-07 2016-11-08 The George Washington University Tailored nanopost arrays (NAPA) for laser desorption ionization in mass spectrometry
CN102741965A (zh) * 2009-06-03 2012-10-17 韦恩州立大学 使用激光喷雾电离的质谱法
US20120108514A1 (en) 2009-07-09 2012-05-03 University Of Iowa Research Foundation Long acting atrial natriuretic peptide (la-anp) and methods for use thereof
US8950604B2 (en) 2009-07-17 2015-02-10 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
WO2011008972A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Systems for bioagent identification
US8758323B2 (en) 2009-07-30 2014-06-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
US9416409B2 (en) 2009-07-31 2016-08-16 Ibis Biosciences, Inc. Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests
US9080209B2 (en) 2009-08-06 2015-07-14 Ibis Biosciences, Inc. Non-mass determined base compositions for nucleic acid detection
US20110065111A1 (en) * 2009-08-31 2011-03-17 Ibis Biosciences, Inc. Compositions For Use In Genotyping Of Klebsiella Pneumoniae
US20110091882A1 (en) * 2009-10-02 2011-04-21 Ibis Biosciences, Inc. Determination of methylation status of polynucleotides
WO2011047307A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
CN101710097B (zh) * 2009-12-02 2012-11-07 中国科学院长春应用化学研究所 用基质辅助激光解吸质谱检测乌头碱体外代谢产物的方法
ES2577017T3 (es) 2009-12-22 2016-07-12 Sequenom, Inc. Procedimientos y kits para identificar la aneuploidia
WO2011100503A1 (en) 2010-02-11 2011-08-18 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Methods for predicting likelihood of responding to treatment
US9758840B2 (en) * 2010-03-14 2017-09-12 Ibis Biosciences, Inc. Parasite detection via endosymbiont detection
US8563705B2 (en) 2010-05-12 2013-10-22 Mayo Foundation For Medical Education And Research Ribonucleic acid binding motif protein 20 sequence variants
US20120021928A1 (en) 2010-06-18 2012-01-26 Kerstin Lindblad-Toh Genetic risk assessment for shar-pei fever
US10041948B2 (en) 2010-10-12 2018-08-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Materials and methods for determining cancer risk
TW201247205A (en) 2011-03-26 2012-12-01 Envivo Pharmaceuticals Inc Methods of targeted treatment of Frontotemporal Lobar degeneration
US8642951B2 (en) 2011-05-04 2014-02-04 Agilent Technologies, Inc. Device, system, and method for reflecting ions
EP2726651B1 (en) 2011-06-28 2018-11-07 Codexis, Inc. Protein variant generation by region shuffling
WO2013032784A1 (en) 2011-08-30 2013-03-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Natriuretic polypeptides
ES2574956T3 (es) 2011-09-26 2016-06-23 Preanalytix Gmbh Estabilización y aislamiento de ácidos nucleicos extracelulares
US11021733B2 (en) 2011-09-26 2021-06-01 Qiagen Gmbh Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
WO2013103896A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating cardiovascular or renal diseases
EP4155401A1 (en) 2012-03-02 2023-03-29 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US8735091B2 (en) * 2012-05-17 2014-05-27 Biomerieux, Inc. Methods for inactivation and extraction of acid-fast bacteria for characterization and/or identification using mass spectrometry
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US9238100B2 (en) 2012-06-07 2016-01-19 Tandem Diabetes Care, Inc. Device and method for training users of ambulatory medical devices
CA2878979C (en) 2012-07-13 2021-09-14 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US10724074B2 (en) 2012-09-25 2020-07-28 Qiagen Gmbh Stabilisation of biological samples
JP5999699B2 (ja) * 2012-11-16 2016-09-28 国立研究開発法人理化学研究所 タンパク質定量方法
EP2971100A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
US9305756B2 (en) 2013-03-13 2016-04-05 Agena Bioscience, Inc. Preparation enhancements and methods of use for MALDI mass spectrometry
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
EP2976425B1 (en) * 2013-03-18 2019-11-06 Qiagen GmbH Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
CN105283550A (zh) 2013-03-18 2016-01-27 凯杰有限公司 生物样品的稳定化
JP5949644B2 (ja) * 2013-04-09 2016-07-13 株式会社島津製作所 Ｍａｌｄｉ質量分析方法
CN103760184A (zh) * 2014-01-16 2014-04-30 江南大学 一种测定铅离子的磁共振成像传感器的构建方法
US11365447B2 (en) 2014-03-13 2022-06-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10428387B2 (en) 2014-05-16 2019-10-01 University Of Massachusetts Treating chronic myelogenous leukemia (CML)
SG10202101740QA (en) 2015-08-17 2021-04-29 Kura Oncology Inc Methods of treating cancer patients with farnesyl transferase inhibitors
WO2017034699A1 (en) 2015-08-24 2017-03-02 Biomerieux, Inc. Methods for inactivation and extraction of acid-fast bacteria from liquid media for characterization and/or identification using mass spectrometry
JP7166169B2 (ja) 2015-11-20 2022-11-07 キアゲン ゲーエムベーハー 細胞外核酸の滅菌のための滅菌組成物を調製する方法
CN105548340B (zh) * 2016-02-23 2018-01-23 武汉大学 黑磷在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱中的应用
GB201609952D0 (en) * 2016-06-07 2016-07-20 Micromass Ltd Combined optical and mass spectral tissue ID probes
CA2937046A1 (en) 2016-07-25 2018-01-25 Kresimir Franjic Method for preparing thin sample layers
WO2019169163A1 (en) * 2018-02-28 2019-09-06 Northeastern University Jettison-ms for nucleic acid species
US20210115419A1 (en) 2018-03-23 2021-04-22 Massachusetts Eye And Ear Infirmary CRISPR/Cas9-Mediated Exon-Skipping Approach for USH2A-Associated Usher Syndrome
US20210361655A1 (en) 2018-03-27 2021-11-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Compounds with anti-tumor activity against cancer cells bearing her2 exon 19 mutations
US20220220440A1 (en) 2019-05-09 2022-07-14 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of hepatocytes
AU2020329166A1 (en) 2019-08-09 2022-03-03 Nutcracker Therapeutics, Inc. Microfluidic apparatus and methods of use thereof
US20220380765A1 (en) 2019-11-02 2022-12-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting nonsense-mediated decay to activate p53 pathway for the treatment of cancer
JP7384358B2 (ja) * 2020-04-27 2023-11-21 株式会社島津製作所 有機化合物の構造解析方法
CN112649489A (zh) * 2020-09-27 2021-04-13 浙江迪谱诊断技术有限公司 一种核酸质谱离子净化方法
WO2023234373A1 (ja) * 2022-05-31 2023-12-07 株式会社島津製作所 核酸の構造解析方法

Family Cites Families (161)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3568735A (en) 1968-06-26 1971-03-09 Cooke Eng Co Laboratory microtitration dispensing apparatus
CH543306A (de) 1971-10-13 1973-10-31 Hoffmann La Roche Mikropipettiergerät
US3776700A (en) 1971-12-08 1973-12-04 Linbro Chem Co Inc Serial dilution apparatus
US3843443A (en) 1973-03-30 1974-10-22 J Fishman Polypeptide materials bound to fluorocarbon polymers
US5283342A (en) 1992-06-09 1994-02-01 Neorx Corporation Biotinylated small molecules
US3999689A (en) 1976-01-07 1976-12-28 Ciantro Steven V Device for simultaneously delivering equal amounts of liquid
DE2739829C2 (de) 1977-09-03 1986-04-10 Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH, 8000 München Anordnung zur Analyse einer Probenschicht durch Beschuß mit elektromagnetischer Strahlung
US4356270A (en) 1977-11-08 1982-10-26 Genentech, Inc. Recombinant DNA cloning vehicle
US4139346A (en) 1977-11-28 1979-02-13 Enzo Bio Chem Incorporated Nucleic acid and protein binding paper
US4218539A (en) 1978-03-24 1980-08-19 Weltman Joel K Enzyme conjugates and method of preparation and use
US4179402A (en) 1978-05-15 1979-12-18 Shell Oil Company Resin-metal-ligand composition
US4282287A (en) 1980-01-24 1981-08-04 Giese Roger W Biochemical avidin-biotin multiple-layer system
US4442354A (en) 1982-01-22 1984-04-10 Atom Sciences, Inc. Sputter initiated resonance ionization spectrometry
US4461328A (en) 1982-06-04 1984-07-24 Drummond Scientific Company Pipette device
DE3221681A1 (de) 1982-06-08 1983-12-08 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Massenspektrometer mit externer probenhalterung
US4994373A (en) 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4548245A (en) 1983-03-04 1985-10-22 Dynatech Laboratories Incorporated Disposable/reusable dispenser for dispensing contaminatable and noncontaminatable liquids
GB8314523D0 (en) 1983-05-25 1983-06-29 Lowe C R Diagnostic device
US4542102A (en) 1983-07-05 1985-09-17 Molecular Diagnostics, Inc. Coupling of nucleic acids to solid support by photochemical methods
DE3329892A1 (de) 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US4554839A (en) 1983-10-14 1985-11-26 Cetus Corporation Multiple trough vessel for automated liquid handling apparatus
US4983521A (en) 1983-10-26 1991-01-08 The Regents Of The University Of California Transmembrane integrator sequences
US4582789A (en) 1984-03-21 1986-04-15 Cetus Corporation Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives
US4729947A (en) 1984-03-29 1988-03-08 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska DNA sequencing
US4683194A (en) 1984-05-29 1987-07-28 Cetus Corporation Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences
US4849077A (en) 1984-08-06 1989-07-18 Akademie Der Wissenschaften Der Ddr Process for solid phase-sequencing of nucleic acid fragments
US4952518A (en) 1984-10-01 1990-08-28 Cetus Corporation Automated assay machine and assay tray
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5118605A (en) 1984-10-16 1992-06-02 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US5064754A (en) 1984-12-14 1991-11-12 Mills Randell L Genomic sequencing method
US5221518A (en) 1984-12-14 1993-06-22 Mills Randell L DNA sequencing apparatus
US4681870A (en) 1985-01-11 1987-07-21 Imre Corporation Protein A-silica immunoadsorbent and process for its production
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4797355A (en) 1985-06-13 1989-01-10 Amgen Inc. Methods for attaching polynucleotides to supports
US4948442A (en) 1985-06-18 1990-08-14 Polyfiltronics, Inc. Method of making a multiwell test plate
US5047215A (en) 1985-06-18 1991-09-10 Polyfiltronics, Inc. Multiwell test plate
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US4731335A (en) 1985-09-13 1988-03-15 Fisher Scientific Company Method for treating thin samples on a surface employing capillary flow
US5023187A (en) 1985-09-13 1991-06-11 Fisher Scientific Company Method and device for accelerated treatment of thin sample on surface
US4806546A (en) 1985-09-30 1989-02-21 Miles Inc. Immobilization of nucleic acids on derivatized nylon supports
US4855225A (en) 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
US5604099A (en) 1986-03-13 1997-02-18 Hoffmann-La Roche Inc. Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US5108703A (en) 1986-03-26 1992-04-28 Beckman Instruments, Inc. Automated multi-purpose analytical chemistry processing center and laboratory work station
FR2597260B1 (fr) 1986-04-10 1988-07-15 Univ Pasteur Procede d'introduction directe automatique d'echantillons dans un spectrometre de masse, et dispositif pour la mise en oeuvre de ce procede
GB8610665D0 (en) 1986-05-01 1986-06-04 Oxley Dev Co Ltd Filtered electrical connectors
US5000921A (en) 1986-10-24 1991-03-19 Hanaway Richard W Multiple pipette samples
GB8626075D0 (en) 1986-10-31 1986-12-03 Vg Instr Group Time-of-flight mass spectrometer
AU603617B2 (en) 1986-11-17 1990-11-22 Abbott Laboratories Apparatus and process for reagent fluid dispensing and printing
US4877745A (en) 1986-11-17 1989-10-31 Abbott Laboratories Apparatus and process for reagent fluid dispensing and printing
EP0269520A3 (fr) 1986-11-21 1988-08-24 Institut Pasteur Rétrovirus du type HIV-2 susceptible de provoquer le sida, et ses constituants antigéniques et nucléiques
US4762881A (en) 1987-01-09 1988-08-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Photoreactive benzoylphenylalanines and related peptides
US4779467A (en) 1987-01-28 1988-10-25 Rainin Instrument Co., Inc. Liquid-end assembly for multichannel air-displacement pipette
US4885250A (en) 1987-03-02 1989-12-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Enzyme immobilization and bioaffinity separations with perfluorocarbon polymer-based supports
US4954444A (en) 1987-03-02 1990-09-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Enzyme immobilization and bioaffinity separations with perfluorocarbon polymer-based supports
CA1285536C (en) 1987-03-11 1991-07-02 Akihiro Ohoka Dispensing machine
US5149625A (en) 1987-08-11 1992-09-22 President And Fellows Of Harvard College Multiplex analysis of DNA
JPS6433070U (ko) 1987-08-22 1989-03-01
US4902481A (en) 1987-12-11 1990-02-20 Millipore Corporation Multi-well filtration test apparatus
US5670381A (en) 1988-01-29 1997-09-23 Abbott Laboratories Devices for performing ion-capture binding assays
DE3809504C1 (ko) 1988-03-22 1989-09-21 Bruker - Franzen Analytik Gmbh, 2800 Bremen, De
EP0339781A3 (en) 1988-04-29 1991-09-25 Beckman Instruments, Inc. Automated capillary injector
EP0347365B1 (en) 1988-06-14 1996-08-28 QIAGEN GmbH HIV-2 virus variants
US5003059A (en) 1988-06-20 1991-03-26 Genomyx, Inc. Determining DNA sequences by mass spectrometry
US4925629A (en) 1988-07-28 1990-05-15 Bioquant, Inc. Diagnostic device
FR2636739B1 (fr) 1988-09-20 1993-02-12 Commissariat Energie Atomique Procede et installation d'identification des bases d'un adn
GB8822228D0 (en) 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
DE3930312A1 (de) 1988-10-24 1990-04-26 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur direkten sequenzierung von nukleinsaeureketten
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5082935A (en) 1988-12-15 1992-01-21 Amoco Corporation Diagnostic reagents made by attaching cytidine containing nucleic acid probes to amino functionalized solid supports by bisulfite mediated transamination
US5237016A (en) 1989-01-05 1993-08-17 Siska Diagnostics, Inc. End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids
US5077210A (en) 1989-01-13 1991-12-31 Eigler Frances S Immobilization of active agents on substrates with a silane and heterobifunctional crosslinking agent
US4920264A (en) 1989-01-17 1990-04-24 Sri International Method for preparing samples for mass analysis by desorption from a frozen solution
JP2901004B2 (ja) 1989-04-12 1999-06-02 株式会社日立製作所 Ｄｎａの塩基配列決定法
ES2099699T3 (es) 1989-05-02 1997-06-01 Abbott Lab Fijacion covalente de los miembros de union especificos a las fases solidas.
US5242974A (en) 1991-11-22 1993-09-07 Affymax Technologies N.V. Polymer reversal on solid surfaces
US5443816A (en) 1990-08-08 1995-08-22 Rhomed Incorporated Peptide-metal ion pharmaceutical preparation and method
FR2650840B1 (fr) 1989-08-11 1991-11-29 Bertin & Cie Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications
US5118937A (en) 1989-08-22 1992-06-02 Finnigan Mat Gmbh Process and device for the laser desorption of an analyte molecular ions, especially of biomolecules
US5045694A (en) 1989-09-27 1991-09-03 The Rockefeller University Instrument and method for the laser desorption of ions in mass spectrometry
US5262128A (en) 1989-10-23 1993-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Array-type multiple cell injector
US5410068A (en) 1989-10-23 1995-04-25 Perseptive Biosystems, Inc. Succinimidyl trityl compounds and a process for preparing same
US5252743A (en) 1989-11-13 1993-10-12 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces
WO1991011533A1 (en) 1990-01-26 1991-08-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for isolating primer extension products from template-directed dna polymerase reactions
US5288644A (en) 1990-04-04 1994-02-22 The Rockefeller University Instrument and method for the sequencing of genome
US5195657A (en) 1990-04-30 1993-03-23 Source Scientific Systems Manifold liquid handling device with backsip function
US5387505A (en) 1990-05-04 1995-02-07 Eastman Kodak Company Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by heat avidin-biotin cleavage
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp., Bothell, Wash. Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5135870A (en) 1990-06-01 1992-08-04 Arizona Board Of Regents Laser ablation/ionizaton and mass spectrometric analysis of massive polymers
DE4019005C2 (de) 1990-06-13 2000-03-09 Finnigan Mat Gmbh Vorrichtungen zur Analyse von Ionen hoher Masse
DE4024545A1 (de) 1990-08-02 1992-02-06 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und vorrichtung zum dosierten zufuehren einer biochemischen analysefluessigkeit auf ein target
US5234824A (en) 1990-11-13 1993-08-10 Specialty Laboratories, Inc. Rapid purification of DNA
EP0557456A4 (en) 1990-11-14 1995-11-15 Siska Diagnostics Inc Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor
WO1992013629A1 (en) 1991-01-31 1992-08-20 Wayne State University A method for analyzing an organic sample
US5210412A (en) 1991-01-31 1993-05-11 Wayne State University Method for analyzing an organic sample
IT1246676B (it) 1991-02-21 1994-11-24 Seac Srl Apparecchiatura per analisi immunologiche.
US5627066A (en) 1991-05-14 1997-05-06 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Method and apparatus for in vitro fertilization
US5198531A (en) 1991-06-14 1993-03-30 Research Diagnostic Antibodies Polymeric resin for peptide synthesis
US5492817A (en) 1993-11-09 1996-02-20 Promega Corporation Coupled transcription and translation in eukaryotic cell-free extract
EP0566714B1 (en) 1991-10-11 1997-01-02 Promega Corporation Coupled transcription and translation in eukaryotic cell-free extract
US5160840A (en) 1991-10-25 1992-11-03 Vestal Marvin L Time-of-flight analyzer and method
US5605662A (en) 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
IL103674A0 (en) 1991-11-19 1993-04-04 Houston Advanced Res Center Method and apparatus for molecule detection
DE69233087T2 (de) 1991-11-22 2003-12-24 Affymetrix Inc N D Ges D Staat Verfahren zur Herstellung von Polymerarrays
US5171989A (en) 1992-01-24 1992-12-15 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Method and apparatus for continuous sample ice matrix production for laser desorption in mass spectrometry
DE4202123C2 (de) 1992-01-27 1995-04-06 Bruker Franzen Analytik Gmbh Vorrichtung für die massenspektrometrische Untersuchung schneller organischer Ionen
US5312233A (en) 1992-02-25 1994-05-17 Ivek Corporation Linear liquid dispensing pump for dispensing liquid in nanoliter volumes
US5382793A (en) 1992-03-06 1995-01-17 Hewlett-Packard Company Laser desorption ionization mass monitor (LDIM)
US5792664A (en) 1992-05-29 1998-08-11 The Rockefeller University Methods for producing and analyzing biopolymer ladders
US5757392A (en) 1992-09-11 1998-05-26 Brother Kogyo Kabushiki Kaisha Piezoelectric type liquid droplet ejecting device which compensates for residual pressure fluctuations
US5795714A (en) 1992-11-06 1998-08-18 Trustees Of Boston University Method for replicating an array of nucleic acid probes
US5503980A (en) 1992-11-06 1996-04-02 Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
US5547835A (en) 1993-01-07 1996-08-20 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
CA2115811A1 (en) 1993-02-17 1994-08-18 Claus Krebber A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
EP0612994A3 (de) 1993-02-26 1996-03-06 Ciba Geigy Ag Matrix für die matrix-unterstützte Laserdesorptions-Massenspektroskopie.
WO1994021822A1 (en) 1993-03-19 1994-09-29 Sequenom, Inc. Dna sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
US5416193A (en) 1993-04-30 1995-05-16 Pfizer Inc. Coupling reagent and method
US5381008A (en) 1993-05-11 1995-01-10 Mds Health Group Ltd. Method of plasma mass analysis with reduced space charge effects
US5376788A (en) 1993-05-26 1994-12-27 University Of Manitoba Apparatus and method for matrix-assisted laser desorption mass spectrometry
WO1995002190A1 (en) 1993-07-09 1995-01-19 Baxter Diagnostics Inc. Fluid dispensing apparatus and method
RU2041263C1 (ru) 1993-08-11 1995-08-09 Геннадий Моисеевич Ершов Способ микродозирования водных растворов веществ на носитель и устройство для его осуществления
US5527675A (en) 1993-08-20 1996-06-18 Millipore Corporation Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues
US5439649A (en) 1993-09-29 1995-08-08 Biogenex Laboratories Automated staining apparatus
CA2205040C (en) * 1993-11-12 2006-10-17 Joseph A. Jarrell Enhanced resolution maldi tof-ms sample surface
US5622829A (en) 1993-12-08 1997-04-22 The Regents Of The University Of California Genetic markers for breast, ovarian, and prostatic cancer
US5457041A (en) 1994-03-25 1995-10-10 Science Applications International Corporation Needle array and method of introducing biological substances into living cells using the needle array
US5643722A (en) 1994-05-11 1997-07-01 Trustees Of Boston University Methods for the detection and isolation of proteins
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5612474A (en) 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
US5498545A (en) 1994-07-21 1996-03-12 Vestal; Marvin L. Mass spectrometer system and method for matrix-assisted laser desorption measurements
JP3612092B2 (ja) 1994-09-07 2005-01-19 株式会社日立製作所 Ｄｎａの分離・分取法及びその解析法
US5545539A (en) 1994-10-18 1996-08-13 Genzyme Corporation Method for nucleotide sequence amplification
US5504326A (en) 1994-10-24 1996-04-02 Indiana University Foundation Spatial-velocity correlation focusing in time-of-flight mass spectrometry
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
US5601982A (en) 1995-02-07 1997-02-11 Sargent; Jeannine P. Method and apparatus for determining the sequence of polynucleotides
JP3592780B2 (ja) 1995-02-22 2004-11-24 富士写真フイルム株式会社 液体噴射装置
CA2218188A1 (en) * 1995-04-11 1996-10-17 Trustees Of Boston University Solid phase sequencing of biopolymers
US5624711A (en) 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
US5625184A (en) 1995-05-19 1997-04-29 Perseptive Biosystems, Inc. Time-of-flight mass spectrometry analysis of biomolecules
US5827659A (en) 1995-05-19 1998-10-27 Perseptive Biosystems, Inc. Methods and apparatus for sequencing polymers using mass spectrometry
US5869240A (en) 1995-05-19 1999-02-09 Perseptive Biosystems, Inc. Methods and apparatus for sequencing polymers with a statistical certainty using mass spectrometry
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
US5830655A (en) * 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US5589136A (en) 1995-06-20 1996-12-31 Regents Of The University Of California Silicon-based sleeve devices for chemical reactions
US5869242A (en) 1995-09-18 1999-02-09 Myriad Genetics, Inc. Mass spectrometry to assess DNA sequence polymorphisms
US5654545A (en) 1995-09-19 1997-08-05 Bruker-Franzen Analytik Gmbh Mass resolution in time-of-flight mass spectrometers with reflectors
US5716825A (en) 1995-11-01 1998-02-10 Hewlett Packard Company Integrated nucleic acid analysis system for MALDI-TOF MS
US5705813A (en) 1995-11-01 1998-01-06 Hewlett-Packard Company Integrated planar liquid handling system for maldi-TOF MS
US5742049A (en) 1995-12-21 1998-04-21 Bruker-Franzen Analytik Gmbh Method of improving mass resolution in time-of-flight mass spectrometry
US5641959A (en) 1995-12-21 1997-06-24 Bruker-Franzen Analytik Gmbh Method for improved mass resolution with a TOF-LD source
US6051378A (en) * 1996-03-04 2000-04-18 Genetrace Systems Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
US5777325A (en) 1996-05-06 1998-07-07 Hewlett-Packard Company Device for time lag focusing time-of-flight mass spectrometry
AU4042597A (en) * 1996-07-19 1998-02-10 Hybridon, Inc. Method for sequencing nucleic acids using matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry
US5743960A (en) 1996-07-26 1998-04-28 Bio-Dot, Inc. Precision metered solenoid valve dispenser
AU4591697A (en) * 1996-09-19 1998-04-14 Genetrace Systems, Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
US5777324A (en) 1996-09-19 1998-07-07 Sequenom, Inc. Method and apparatus for maldi analysis
US5826214A (en) 1996-09-26 1998-10-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Hand-held probe for real-time analysis of trace pollutants in atmosphere and on surfaces
US5864137A (en) 1996-10-01 1999-01-26 Genetrace Systems, Inc. Mass spectrometer
US5885775A (en) 1996-10-04 1999-03-23 Perseptive Biosystems, Inc. Methods for determining sequences information in polynucleotides using mass spectrometry
AU735416B2 (en) * 1996-11-06 2001-07-05 Sequenom, Inc. Dna diagnostics based on mass spectrometry

Also Published As

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CA2328110A1 (en) 1999-11-11
DE19983215T1 (de) 2001-05-17
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