KR100463459B1 - 핵산 서열화를 위한 질량 분광분석 방법 - Google Patents

핵산 서열화를 위한 질량 분광분석 방법 Download PDF

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Abstract

DNA 의존적 및 RNA 의존적 RNA 폴리머라제를 포함하는 RNA 폴리머라제를 사용하여 핵산을 서열화하는 질량 분광분석 방법이 제공된다. 본 방법은 RNA 폴리머라제를 사용하여 한벌의 RNA 전사체 셋트를 생성시키고, 이를 질량 분광분석법으로 분석함을 포함한다. 전사 터미네이터 서열 또는 어태뉴에이터 서열을 확인하는 방법이 또한 제공된다.

Description

핵산 서열화를 위한 질량 분광분석 방법{Mass spectrometric methods for sequencing nucleic acids}
관련 특허원
본 발명의 우선권은 "핵산 서열화를 위한 질량 분광분석 방법"이란 표제로 1997년 12월 15일 출원된 강 창원, 권 영수, 김 영태, 쾨스터 후베르트, 리틀 다니엘, 오'도넬 매리안, 지앙 구오빙, 캔터 챨스 및 러프 데이비드의 미국 특허원 제08/990,851호로 청구되어 있다. 경우에 따라, 상기 특허원의 실체적 내용은 이의 전문이 본원에서 참조 문헌으로 인용된다.
상기 특허원의 실체적 내용은 하기 계류중인 특허원, 국제 공보 및 특허와 관련되어 있다: 미국 특허 제5,605,798호, 제5,622,824호, 제5,547,835호 및 제5,691,141호, PCT 국제 공보 제WO 98/20019호, 제WO 98/20166호 및 제WO 97/42348호. 경우에 따라, 상기한 특허원 및 특허 각각의 내용은 이의 전문이 본원에서 인용된다.
핵산 서열화 방법은 유전자 발현 및 조절을 평가하고 이해하기 위한 분자 생물학자들의 축적된 기술들중에서 중요하고 강력한 수단이다. DNA 분자의 서열화 방법에는 화학적 분해 서열화 방법[참조 문헌: Maxam et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560; Ambrose et al. (1987) Methods Enz. 152: 522] 및 쇄 종결 서열화 방법[참조 문헌: Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463]이 포함된다. 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 서열화 방법은 DNA 단편의 특이적인 분해에 의존하는 분해 방법이다. 한쪽 말단에서 방사능 표지된 DNA 단편은 5개의 개별적인 화학 반응으로 부분적으로 분해된다. 각각의 반응은 염기 유형 또는 염기에 특이적이어서 상이한 길이를 갖는 5개의 표지된 단편의 집단을 생성한다. 단편 집단은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 분리한다.
쇄 종결 방법 또는 생거 방법은 DNA 합성에 의존한다. 일본쇄 DNA를 주형으로서 사용하고 표지된 프라이머를 사용하여 상보적인 쇄 형성을 개시한다. 합성 반응은 4개의 데옥시뉴클레오타이드(dNTP)인 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP와 4개의 디데옥시뉴클레오타이드(ddNTP)인 ddATP, ddTTP, ddCTP 및 ddGTP 중 하나의 존재하에 수행한다. 성장하고 있는 쇄에 디데옥시뉴클레오타이드를 가하면 쇄에 따른 상보적인 쇄가 미숙하게 종결된다. 4개의 ddNTP 중 각각 하나씩을 포함하는 4개의 반응 혼합물을 사용하여 개시함으로써, A, C, G 및 T에서 종결된 쇄의 세트가 생성된다. 각각의 반응 혼합물은 폴리아크릴아미드 겔의 한 레인에서 전기영동시켜 단일 염기 차이로 길이가 상이한 단편을 분리한다.
상기한 방법은, 일차적으로는 DNA를 변성시키고 일본쇄를 분리시켜 생성되거나, 다른 방법(예: 일본쇄 파지 벡터로의 클로닝)에 의해 생성되는 일본쇄 DNA를 서열화하기 위해 고안되었다. 상기한 서열화 방법은, 단일 염기 차이로 길이가 상이하고 확인가능한 염기에서 종결되는 단편의 배열을 생성하는 반응에 의존한다. 단편들은 PAGE를 사용하여 크기별로 분리하고, 방사능 동위원소와 같은 표지를 사용하여 검출한다. DNA 단편의 길이가 증가함에 따라 전기영동 겔상에서의 밴드의 분리가 기하급수적으로 감소하기 때문에, 상기한 방법들로는 뉴클레오타이드가 약 300 내지 400개 이하인 DNA 단편을 서열화시키는 것만이 가능하다.
표적 DNA는 또한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 증폭시킬 수 있는데[참조 문헌: Mullis et al. (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263; U.S. Patent No. 4,683,202 to Mullis et al.], 그 결과 증폭된 농도의 이본체 표적 DNA가 생성된다. 후속적인 서열화를 위해, PCR로부터 일본쇄 주형을 직접 생성하는데 다수의 방법이 사용된다. 예를 들어, 단지 1개의 쇄에만 특이적인 방사능 표지된 프라이머를 사용할 수 있다. 선택적으로, 한개의 프라이머가 제한된 농도로 존재하는 조건하에 PCR을 수행할 수 있다. 제한된 농도의 프라이머가 일단 소비되면, 연속 사이클을 통해 일정한 비율로 두번째 쇄를 증폭시킨다[참조 문헌: Gyllenstein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 7652; Mihilovic et al. (1989) BioTechniques 7:14].
다수의 서열화 전략이 현재 사용되고 있다. 선택되는 전략은 DNA 서열화의 목적과 서열화를 수행하기 전에 이용가능한 DNA에 대한 정보량에 좌우된다. 예를 들어, 특정 돌연변이가 DNA로 도입되었는지를 확인하기 위해서 표적 DNA를 서열화하는 경우, 작은 영역의 DNA를 서열화하는 것만이 필요할 수 있다. 만일 DNA 단편이 공지되지 않은 유전자이거나 서열을 정확하게 결정해야만하는 유전자의 일부인 경우, 전체 단편을 서열화하는 것이 필요할 수 있다. 서열화될 수 있는 단편의 크기는 약 400개 염기로 제한되기 때문에, 이러한 크기를 초과하는 DNA 단편은 절단시켜야만 한다. 절단은 무작위적일 수 있으며, 이어서 표적 DNA의 절편을 서브클로닝한다. 따라서, 중복되는 단편을 포함하는 서브클로닝된 단편을 서열화한 다음, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 순서대로 배열시킨다[참조 문헌: Staden (1986) Nucl. Acids Res. 14: 217]. 중복되거나 포개어진 돌연변이체를 생성시키고 서열화하거나, 다른 정렬 방법을 사용하여 DNA를 또한 체계적으로 서브클로닝할 수 있다.
생거의 쇄 종결 방법 및 다른 서열화 방법은 표적 DNA를 일본쇄 파지 벡터로 클로닝함으로써 일본쇄 주형의 사용에 의존적이다. 그러나, 다양한 종류를 입수할 수 있고 조작이 용이하며 파지 벡터에 비해 플라스미드에 삽입된 DNA의 안정성이 보다 크다는 점을 포함한 이유로 인해, 표적 DNA용 벡터로서 플라스미드를 사용하는 것이 파지 DNA를 사용하는 것보다 바람직하다. 결과적으로, 표적 DNA를 일본쇄 파지 DNA 보다는 플라스미드 DNA내로 클로닝하는 서열화 방법이 개발되고 있다[참조 문헌: Wallace et al. (1981) Gene 16: 21-26; Guo et al. (1982) Nucl. Acids Res. 10: 2065-2084; Vieira et al. (1982) Gene 19: 259-268].
이러한 방법들은 한번에 표적 DNA의 한쪽쇄만을 서열화하도록 고안되었다[참조 문헌: Chen et al. (1985) DNA 4: 165-170; Hattori et al. (1986) Anal. Biochem. 152: 232-238; Mierendorf et al. (1987) Methods Enzymol. 152: 556; Mehra et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83: 7013-7017]. 이본쇄 DNA 서열을 사용하면, 디데옥시 쇄 터미네이터(terminator) 서열화 반응에 사용되는 일본쇄 DNA 단편을 서브클로닝하거나 분리할 필요가 없다. 그러나, 변성된 이본체 DNA 주형은 질이 불량하기 때문에, 이본쇄 DNA의 사용이 제한된다. 그 결과, 상기한 방법들은, DNA를 일본쇄 벡터내로 클로닝하는 방법에 의해 제공되는 서열 데이타의 정확도를 제공하지는 못한다.
최근, 삽입된 DNA의 상보적인 쇄에 인접한, 쇄 특이적 프라이머가 효율적으로 하이브리드화할 수 있는 부위를 포함하는 플라스미드를 사용하는 방법이 개발됨으로써 주형의 질과 관련된 문제는 해결되었다. 상기한 방법에 의해, 이본쇄 DNA의 일본쇄 각각은, 미리 파지 벡터로 서브클로닝하지 않고도 플라스미드 DNA로부터 직접 서열화할 수 있다[참조 문헌: Chen et al. (1985) DNA 4: 165-170 and Chi et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 10382]. 쇄 특이적 합성 프라이머는, 디데옥시 서열화 반응을 진행시키기 전에, 열 또는 알칼리로 변성시킨, 공유적으로 폐환된 DNA에 어닐링시킨다. 다른 방편으로, 주형으로서 알칼리로 변성시킨 개환된 이본쇄 플라스미드 DNA에 프라이머를 어닐링시킬 수 있다[참조 문헌: Hattori et al. (1986) Anal. Biochem. 152: 232-238]. 이본쇄 DNA는 37℃ 이상의 온도에서 수행되는 생거 방법을 사용하여 서열화하기 전에, 알킬리 또는 열로 변성시킨다. λgt11내로 클로닝된 DNA 각각의 쇄를 개별적으로 서열화하기 위해, λgt11내에서 EcRI 부위에 인접한 lac Z 서열에 대해 각각 상보적인, 상이한 "전방향" 및 "역방향" 프라이머를 사용하는 것이 또한 기술되어 있다[참조 문헌: Mehra et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83: 7013-7017].
전사를 수반하는 방법에서 사용되는 반대로 배향된 프로모터 영역을 갖는 플라스미드가 또한 서열화될 표적 DNA용 비히클로서 사용된다. 각각의 프로모터 영역은 삽입된 DNA를 서열화하기 위한 별개의 특이적 프라이밍 부위로서 작용한다. 상기한 플라스미드는 시판되고 있다. 예를 들어, 트윈(twin) 프로모터 플라스미드 pGEMTM은 서열화를 위한 전사체를 생성할 수 있는, 반대 배향인 박테리오파지 SP6 및 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하고 있다[참조 문헌: Mierendorf et al. (1987) Meth. Enzymol. 152: 556-562].
핵산을 서열화하는 대부분의 방법은 인공물을 서열화할 수 있는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(PAGE)의 사용 또는 검출가능한 표지(예: 방사능 동위원소, 효소, 형광성 잔기 또는 화학발광성 잔기)를 필요로한다. 질량 분광분석적 검출법을 사용하여 DNA를 서열화하는 방법이 또한 사용된다[참조 문헌: 미국 특허 제5,547,835호]. 상기 방법은 일차적으로는 DNA의 서열화에 의존적이다.
DNA 서열화 방법론을 사용하여, 궁극적으로는 사람 지놈의 전체 서열을 결정할 것이다. 사람 지놈 DNA의 완전한 서열을 인지하는 것은 사람의 질환을 이해하고 진단하고 예방하며 치료하는 것을 도울 것이다. 합리적인 시간 구성 및 경제적인 방식으로 약 30억개 염기쌍의 사람 지놈의 서열을 성공적으로 결정하기 위해서는, 신속하고 신뢰할 수 있으며 민감하고 저렴한 방법이 요구된다.
따라서, 본 발명의 목적은 추가의 서열화 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 RNA 폴리머라제를 사용하여 핵산을 서열화하는 질량 분광분석 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은, 핵산 프로브가 고밀도로 지지체에고정되어 있는 정렬 포맷(array format)으로 RNA 폴리머라제를 사용하여 질량 분광분석적 검출을 용이하게 하는, 핵산의 서열화 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 질량 분광분석 방법을 사용하여 전사 터미네이터 서열을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 RNA 전사체를 사용하여 핵산, 특히 DNA를 서열화하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 DNA 의존적 및 RNA 의존적 RNA 폴리머라제를 포함한 RNA 폴리머라제를 사용하여 핵산을 서열화하는 방법을 제공한다. RNA 전사체는 질량 분광분석법으로 분석한다.
상기 방법을 수행하는데 있어서, 프로모터와 이 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 표적 핵산 서열을 포함하는 DNA 분자는, 표적을 포함하는 RNA 전사체의 한벌의 세트를 생성시키는 조건하에 프로모터를 인지하는 RNA 폴리머라제로 전사시킨다. 전사체의 분자량은 질량 분광분석법으로 측정하고, 이에 따라 표적 서열의 핵산 서열을 결정한다. 바람직하게는, 프로모터 및 표적을 포함하는 DNA 분자를 고정화시킨다.
특정 양태에서, 상기 방법은 표적 DNA를 포함하는 분자를 포획하는, 일본쇄 영역을 한쪽 말단에 갖는 이본쇄 프로모터 함유 단편을 사용한다. 상기한 양태에서, 표적 DNA는 바람직하게는 일본쇄이다.
바람직한 양태에서, 프로모터 함유 핵산은 비암호화(안티센스) 쇄의 3'-말단 또는 암호화 쇄의 5'-말단을 통해 고체 지지체에 공유적으로 커플링시킨다. 커플링은, 티올 연결과 같은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 방법을 사용하여서도 수행할 수 있다. 예를 들어 5'- 또는 3'-티올화 DNA를 제조하고, 이를 아미노실란 처리된 고체 지지체와 연결시킨다. 연결은 직접 수행하거나 링커 그룹을 통해 수행할 수 있다. 생성된 고정화 분자는 바람직하게는 정렬 포맷으로 배열시킨다.
프로모터 서열을 암호화하는 이본쇄 핵산 분자는 박테리아, 바이러스, 박테리오파지, 식물 및 진핵 유기체와 같은 임의의 공급원으로부터 수득되거나, 합성 프로토콜에 의해 어셈블리할 수도 있다. 생성되는 단편이 암호화(센스) 쇄의 3'-말단에 뉴클레오타이드가 5개 이상인 일본쇄 영역을 포함하도록 이를 조작한다. 이러한 일본쇄 영역은 서열화될 핵산 영역 또는 통상의 중복 서열(제한 엔도뉴클레아제 부위)과 상보적이도록 디자인한다.
서열화될 핵산 영역을 포함하는 표적 핵산은 일본쇄 또는 이본쇄이지만 일본쇄 3'-말단을 포함하고, 이는 프로모터 함유 DNA의 상보적인 서열과 하이브리드화한다. 하이브리드화는 고정화 전 또는 후에 수행한다. 2개의 핵산 분자의 하이브리드화는 인접한 핵산 분자의 연결부(들)에 하나 이상의 "닉(nick)"을 도입시킨다. 특정한 양태에서, 암호화 또는 비암호화 쇄, 바람직하게는 암호화 쇄에서의 닉은, 전사를 개시하기 전에 적절한 핵산 리가제를 가함으로써 연결시킨다.
상기 방법은, 바람직하게는 한벌의 RNA 전사체를 생성하기에 적절한 임의 전략을 사용한다. 바람직한 방법은 RNA 폴리머라제를 사용하여 염기 특이적 쇄 종결화에 의해 수득되는 한벌의 RNA 전사체 세트를 생성하는, 변형된 생거 서열화 전략에 의존적이다. 이는 질량 분광분석법으로 분석한다. 변형된 길버트-막삼 전략이 또한 고려된다. 상기 방법에 있어서, 전사체는 염기 특이적 RNase로 분해시켜 염기 특이적으로 종결된 단편을 수득한 다음, 이의 분자량을 질량 분광분석법에 의해 평가한다.
리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 선택된 염기 특이적 쇄 종결 3'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에, 적절한 RNA 폴리머라제를 가함으로써 프로모터로부터 전사가 개시된다. 바람직한 양태에서, 전사 혼합물은 또한, 생성된 RNA 전사체의 2차 구조를 감소시키고/시키거나 RNA 폴리머라제 효소의 종결화 반응의 정확도 및 턴오버(turnover)를 증가시켜 분석에 유용한 RNA 전사체의 양을 증가시키는, 변형된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 리보뉴클레오타이드 유사체를 또한 포함한다. 상기한 유사체에는 2차 구조를 감소시키는 이노신 5'-트리포스페이트(IPT), 및 RNA 폴리머라제 효소의 종결화 반응의 정확도 및 턴오버를 증가시켜 분석에 유용한 RNA 전사체의 양을 증가시키는 4-티오 우리딘 5'트리포스페이트(UTP) 및 5-브로모 UTP 또는 5'-요오도 CTP가 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 생성된 RNA 전사체는 질량 분광분석법으로 분석한다.
기타 양태에서, 샘플은 또한 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화 질량 분광분석법(MALDI)으로 분석하기 위한 질량 분광분석용 매트릭스 물질을 포함하고, 바람직하게는 또한 이동시보(time-of-flight; TOF) 분석을 사용한다. 핵산 서열은각각 4개의 쇄 종결 염기를 포함하는 서열화 반응물로부터 수득되는 쇄 종결화된 RNA 전사체의 관찰된 양을 정렬시킴으로써 수득한다.
본원에서 제공되는 서열화 방법을 진단 적용에 사용할 수 있다. 진단 적용에는, 공지된 표적 핵산에서의 유전적 변화의 존재 여부를 측정하는 방법이 포함된다. 예를 들어, 표적 핵산 영역을 증폭시키고, 비암호화 쇄에 상응하는 핵산 쇄를 분리시킨다. 프로모터를 함유하는 핵산 프로브는 천연 공급원으로부터 분리시키거나, 2개의 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화시켜 프로모터 서열을 형성함으로써 합성적으로 어셈블리할 수 있다. 서열화될 핵산 영역 또는 공통 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드가 5개 이상인 일본쇄 영역은 재조합 수단에 의해 암호화 쇄의 3'-말단에 도입시킨다. 바람직한 양태에서, 프로모터 함유 핵산은 비암호화 쇄의 3'-말단 또는 암호화 쇄의 5'-말단을 통해 고체 지지체에 공유적으로 커플링시키고, 보다 바람직한 것은 아미노실란 처리된 고체 지지체에 고밀도로 연결된 5'- 또는 3'-티올화 DNA이다. 연결은 링커 그룹의 존재 또는 부재하에 수행할 수 있으며, 바람직하게는 정렬 포맷으로 배열시킨다.
일본쇄 또는 이본쇄 형태인 서열화될 핵산의 일본쇄의 3' 돌출부는 비암호화 쇄의 상보적인 서열과 하이브리드화하고, 몇몇 양태에서 하나 이상의 핵산 쇄 사이의 닉은 전사 전에 연결시킨다. 전사는, 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 선택된 염기 특이적 쇄 종결 3'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에 적절한 RNA 폴리머라제를 사용하여 개시한다. 바람직한 양태에서, 전사 혼합물은 또한 RNA 전사체의 분석을 용이하게하는 이노신 5'-트리포스페이트 및/또는하나 이상의 변형된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 포함할 수 있다. RNA 전사체는 질량 분광분석법, 바람직하게는 MALDI-TOF를 사용하여 분석한다.
정렬 포맷을 사용하는 경우, 프로모터 함유 핵산 프로브의 패널을 작제하여, 표적 핵산이 전체 서열(예: 유전자의 암호화 서열)을 따라 대체되도록하는 정렬로 연결시켜 단일 서열화 반응 동안에 전체 유전자의 핵산 서열을 결정할 수 있다.
전사 터미네이터 및 어태뉴에이터(attenuator) 서열을 확인하는 방법이 또한 제공된다. 완전한 길이의 전사체를 생성하도록 전사 조건을 변형시킴으로써, 질량 분광분석법을 사용하여 전사 터미네이터 서열(예: rho 의존적 및 rho 비의존적 터미네이터)을 확인할 수 있다. 상기 방법을 수행하는 경우, 서열화될 표적 핵산의 3'-말단의 일본쇄 영역은 프로모터 함유 핵산 프로브의 암호화 쇄의 3'-말단에 있는 상보적인 서열과 하이브리드화된다. 바람직한 양태에서, 프로모터 함유 핵산은 비암호화 쇄의 5'-말단 또는 암호화 쇄의 3'-말단을 통해 고체 지지체와 공유적으로 커플링시키는데, 보다 바람직한 것은 아미노실란 처리된 고체 지지체에 고밀도로 연결되어 있는 5'- 또는 3'-티올화 DNA이다. 연결은 링커 그룹의 존재 또는 부재하에 수행할 수 있으며, 바람직하게는 정렬 포맷으로 배열시킨다.
전사는 상기한 터미네이터 서열에서 RNA 폴리머라제의 종결화 효율을 증가시키는 변형된 RNA 트리포스페이트 유사체(예: 4-티오 UTP, 5-브로모 UTP 또는 5'-요오도 CTP)의 존재 또는 부재하에 개시한다. 특정 양태에서, 하나 이상의 쇄에서의 닉은 전사를 개시하기 전에 적절한 핵산 리가제를 가함으로써(예: DNA 또는 RNA 리가제를 가함으로써) 연결시킬 수 있다. 종결된 RNA 전사체의 양은 질량 분광분석법으로 측정한다. 관찰된 양은 전사의 터미네이터 의존적 정지 위치를 나타내고, 개별적인 지놈 위치로부터의 전사 종결 부위 직전의 서열 배열을 비교함으로서, 상이한 RNA 폴리머라제에 대한 터미네이터 및 어태뉴에이터 서열을 확인할 수 있다.
도 1은 분석용 샘플 물질의 정렬을 제조하기 위한 시스템을 도시한 것이다.
도 2는 물질을 기판의 표면에 분배시키는 병렬 공정을 실행하기 위해, 도 1에서 도시한 시스템을 사용하기에 적합한 핀 어셈블리를 도시한 것이다.
도 3은 도 2에서 나타낸 어셈블리의 기저 부분을 도시한 것이다.
도 4는 도 2에서 도시한 핀 어셈블리의 기저 부분의 다른 단면을 도시한 것이다.
도 5A 내지 5D는 샘플 물질의 정렬을 제조하는 방법을 도시한 것이다.
도 6A 및 6B는 물질을 기판의 표면에 분배시키는 다른 어셈블리를 도시한 것이다.
도 7은 본원에서 기술한 바와 같이 올리고데옥시뉴클레오타이드를 이산화규소 표면에 공유적으로 부착시키는 것을 나타낸 반응도이다. 상세하게는, 이산화규소를 3-아미노프로필트리에톡시실란과 반응시켜 표면상에 1급 아미노 그룹의 균일 층을 생성시킨다. 이어서, 헤테로이작용성 가교결합제와 1급 아민을 반응시켜 요오도아세트아미드 그룹을 혼입시킨다. 3'- 또는 5'-디설파이드(5'로 나타냄)를 함유하는 올리고데옥시뉴클레오타이드를 트리스-(2-카복시에틸) 포스핀(TCEP)으로 처리하여 디설파이드를 유리 티올로 환원시킨 다음, 이어서 이를 요오도아세트아미도 표면에 커플링시킨다.
도 8은 디설파이드 환원에 사용되는 TCEP 농도의 함수로서, 규소 표면에 대한 올리고데옥시뉴클레오타이드 프로브의 결합을 도시한 그래프이다.
도 9는 도 7에서 기술한 바와 같이 본질적으로 공유 결합된 "TCUC"로 지정된 올리고데옥시뉴클레오타이드 서열(5'-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG-3'; 서열 1) 및 이와 하이브리드화되는 "MJM6"으로 지정된 올리고데옥시뉴클레오타이드 서열(5'-CCGGGTACCGAGCTCGAATTC-3'; 서열 2)을 갖는 실리콘 웨이퍼의 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이동시보 이온화(MALDI-TOF)의 질량 스펙트럼이다.
도 10은 분석용 물질을 수용하기에 적합한, 에칭된 웰을 갖는 기판의 한가지 양태를 도시한 것이다.
도 11은 선형의 이동시보 질량 분광분석 기기 및 도 10에 도시한 기판의 표면상에 있는 샘플 물질의 대표적인 물질 조성으로부터 수득되는 스펙트럼의 한가지 예를 도시한 것이다.
도 12는 도 11에서 확인된 스펙트럼을 갖는 샘플 물질에 대해 측정한 분자량을 도시한 것이다.
도 13은 실시예 2에서 기술한 바와 같이, 본질적으로 실리콘 웨이퍼의 표면상의 16개 위치에 공유 결합되어 있는 "올리고머 1(5'-CTGGATGCGTCGGATCATCTTTTTT-(S)-3'; 서열 5)", "올리고머 2(5'-(S)-CCTCTTGGGAACTGTGTAGTATT-3'; 서열 6)" 및 "올리고머 3(서열 1; 실시예 1의 유리 티올 유도체 "TCUC" 올리고뉴클레오타이드)"으로 지정된 티올 함유 올리고뉴클레오타이드 분자들을 갖는 실리콘 웨이퍼의 표면상의 4×4(16개 위치)의 DNA 정렬의 개략도이다.
도 14는 올리고머 1에 결합되는 올리고머 1 상보적 올리고뉴클레오타이드(5'-GATGATCCGACGCATCAGAATGT-3'; 서열 7), 올리고머 2에 결합되는 올리고머 2 상보적 올리고뉴클레오타이드(5'-AATACTACACAG-3'; 서열 8) 및 올리고머 3에 결합되는 올리고머 3 상보적 올리고뉴클레오타이드(5'-CCGGGTACCGAGCTCGAATTC-3'; 서열 2)를 갖는, 도 13의 DNA 하이브리드화 정렬의 16개 위치 각각에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화의 개략도이다.
도 15는 도 15에서 개략적으로 나타낸 실리콘 웨이퍼상의 4×4(16개 위치)의 DNA 정렬의 대표적인 MALDI-TOF 질량 스펙트럼이다. 이 스펙트럼은 특이적으로 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드에 상응하는 각각의 위치에서 실험적인 질량:전하 비의 우세한 단일 시그날을 나타낸다. 2+는 MALDI-TOF MS 분석 동안에 참조 표준으로서 사용되는 이중 하전된 분자의 위치를 나타낸다.*는 세척 공정 후 칩의 표면에 잔류하는 오염 올리고뉴클레오타이드의 잔류량을 나타낸다.*시그날의 상대적인 위치는 오염 올리고뉴클레오타이드의 대략적인 크기를 나타낸다.
도 16은 8×8(64개 위치)의 DNA 정렬의 대표적인 MALDI-TOF 질량 스펙트럼이다. 스펙트럼은 예측된, 특이적으로 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드에 상응하는 실험적인 질량:전하 비의 우세한 단일 시그날을 나타낸다.*는 세척 공정 후웨이퍼의 표면에 잔류하는 오염 올리고뉴클레오타이드의 잔류량을 나타낸다.*시그날의 상대적인 위치는 오염 올리고뉴클레오타이드의 대략적인 크기를 나타낸다.
도 17은 55-머 올리고뉴클레오타이드를 상보적인 25-머 올리고뉴클레오타이드(서열 11) 및 상보적인 30-머 올리고뉴클레오타이드(서열 12)에 하이드리화함으로써 어셈블리되는 DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열(서열 10)을 나타낸 것이다. 생성된 이본쇄 DNA는 SP6 프로모터(nt 1 내지 18; 서열 10)를 암호화하고 SP6 프로모터로부터의 전사 출발점에 대해 nt +7에서 분자의 암호화 쇄에 단일 닉을 갖는다. 닉과 SP6 프로모터로부터의 전사 개시 출발점의 위치를 나타내었다.
정의
별도의 언급이 없는한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 언급되는 모든 특허 및 공보는 본원에 참조 문헌으로 인용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)뿐만 아니라 RNA 또는 DNA의 유사체(예: 일본쇄 또는 이본쇄 형태의 뉴클레오타이드 유사체) 및 또한 단백질 핵산(PNA)과 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 핵산 분자는 합성하거나, 또는 특정한 생물학적 샘플에 대해 적절하게 선택된, 당해 분야에서 익히 공지된 특정 공정을 임의의 수로 사용하여 특정한 생물학적 샘플로부터 분리시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 모노-, 디- 및 트리-포스페이트를 포함한다. 뉴클레오타이드는 또한 변형된 뉴클레오타이드(예: 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 및 데아자푸린 뉴클레오타이드)를 포함한다. 쇄 연장 뉴클레오타이드의 완전한 세트는 DNA 주형을 포함하는 4개의 상이한 염기 각각에 하이브리드화될 수 있는 4개의 상이한 뉴클레오타이드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 프로모터 함유 프로브는 프로모터를 암호화하는 이본쇄 영역과 프로모터와 연관된 암호화(센스) 쇄의 3'-말단에 5개 이상의 뉴클레오타이드를 함유하는 일본쇄 영역을 포함하는 핵산 단편을 의미한다. 5개 이상의 뉴클레오타이드는 관심있는 표적 핵산을 포함하는 핵산의 3'-말단에 있는 일본쇄 영역에 상보적이도록 선택한다. 표적이 이본쇄 분자내에 포함되어 있는 경우, 3'-말단은 안티센스 쇄를 의미한다. 표적이 이본쇄인 경우, 생성된 분자는 암호화 쇄 및 비암호화 쇄에 닉을 갖는다.
선택적으로, 핵산 프로모터 함유 프로브의 일본쇄 영역은 표적 핵산의 암호화 쇄의 5'-말단에 있는 약 5개 이상의 뉴클레오타이드에 대해 상보적인, 프로모터와 연관된 비암호화(안티센스) 쇄의 5'-말단에 약 5개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 양태에서, 표적은 이본쇄이어야만 한다. 하이브리드화 후, 생성된 분자는 암호화 쇄 및 비암호화 쇄에 닉을 갖는다.
모든 양태에서, 닉은 전사 전에 연결시킬 수 있다. 그러나, 본원에서 나타낸 바와 같이, 닉이, 바람직하게는 약 +7 이상의 뉴클레오타이드의 충분한 거리를 둔 경우, 이를 연결시킬 필요가 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 표적 핵산은 서열화될 핵산 분자이다. 이는 거대 분자의 일부일 수 있다. 표적 핵산을 포함하는 분자는 프로모터 함유 포획 프로브상에 돌출된 3' 말단(또는 선택된 배위에 따라 5' 말단)에 있는 5개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드에 대해 완전히 상보적이도록 고안된 서열인, 약 5개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 또는 이를 포함하도록 변형시킬 수 있다. 표적 핵산은 3' 또는 5' 일본쇄 돌출부를 갖는 이본쇄이거나 일본쇄일 수 있다. RNA 폴리머라제는 일본쇄 분자를 전사시킬 수 있는데, 특별하게는 3원 복합체가 형성되는 경우이다. 표적은 또한 RNA이거나 PNA(염기를 아미노산 골격에 결합시킴으로써 형성되는 단백질 핵산; 참조 문헌: Nielsen et al. (1991) Science 254: 1497)일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 합성은 이로써 제한되지는 않지만 화학적 또는 효소적 반응을 수반하는 공정을 포함하여, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 임의의 공정을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 염기 특이적으로 종결된 리보뉴클레오타이드는, 전사 동안에 혼입되어 전사를 종결시키는 뉴클레오타이드를 생성하는 것이다. 염기 특이적으로 종결된 리보뉴클레오타이드를 생성하는, 염기 특이적 종결 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트는 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 염기 특이적 종결 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 예에는 3'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(예: 3'-dGTP)와 본원에서 기술하고 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 것들이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 뉴클레오타이드 서열이 상보적이라고 언급하는 경우, 마주보는 뉴클레오타이드 사이에 바람직하게는 25% 미만, 보다 바람직하게는 15% 미만, 심지어 보다 더욱 바람직하게는 5% 미만의 미스매치율로 뉴클레오타이드의 2개의 서열이 하이브리드화될 수 있고, 가장 바람직하게는 미스매치 없이 하이브리드화될 수 있음을 의미한다. 바람직하게는 2개의 분자는 매우 엄격한 조건하에 하이브리드화된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 미스매치율을 측정하는데 있어 하이브리드화의 엄격함은 다음과 같다:
1) 매우 엄격함: 0.1×SSPE, 0.1% SDS, 65℃
2) 보통 엄격함: 0.2×SSPE, 0.1% SDS, 50℃
3) 덜 엄격함: 1.0×SSPE, 0.1% SDS, 50℃
동등한 엄격함은 다른 완충액, 염 및 온도를 사용하여 성취할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "정렬"은 구성원 또는 위치의 순차적인 배열을 의미한다. 정렬은 구성원 또는 위치를 임의의 수로 포함할 수 있으며, 다양한 형태일 수 있다. 바람직한 양태에서, 정렬은 이차원이며, n×m개의 구성원(여기서, m 및 n은 동일하거나 상이할 수 있는 정수이다)을 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, n 및 m은 각각 4이거나 이의 배수이다.
용어 "가교결합제"는 당해 기술 분야에서 공지되어 있으며, 본원에서 사용되는 바와 같이, 바람직하게는 공유 결합을 통해 핵산을 불용성 지지체에 고정화시키는 시약을 의미한다. 따라서, 본원에서 사용하기에 적절한 "가교결합제"에는 불용성 지지체의 표면상에 존재하는 작용 그룹 및 핵산 분자에 존재하는 작용 그룹과 반응할 수 있는 다양한 시약이 포함된다. 이러한 반응이 가능한 시약에는 당해 기술 분야에서 다수가 공지된, 호모- 및 헤테로-이작용성 시약이 포함된다. 헤테로이작용성 시약이 바람직하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "티올-반응성 작용 그룹"은 친핵성 티올 잔기와 신속하게 또는 바람직하게 반응하여 디설파이드 또는 티오에테르 결합과 같은 공유 결합을 생성하는 작용 그룹을 의미한다. 일반적으로, 티올 그룹은 우수한 친핵체이고, 바람직한 티올 반응성 작용 그룹은 반응성 친전자체이다. 다양한 티올 반응성 작용 그룹은 당해 기술 분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어 할로아세틸(바람직하게는 요오도아세틸), 디아조케톤, 에폭시 케톤, α,β-불포화 카보닐(예: α,β-에논) 및 기타 반응성 미하엘(Michael) 수용체(예: 말레이미드), 산 할라이드, 벤질 할라이드 등을 포함한다. 특정 양태에서, 디설파이드의 유리 티올 그룹은, 예를 들어 디설파이드 교환을 포함한 디설파이드 결합 형성에 의해 유리 티올 그룹과 반응할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "티올 반응성" 가교결합제는 하나 이상의 티올-반응성 작용 그룹을 포함하거나 이를 포함하도록 변형시킬 수 있는 가교결합제(또는 표면)를 의미한다. 티올 그룹의 반응은 당해 기술 분야에서 통상적인 바와 같이, 적절한 보호 그룹을 사용하여 차단시킴으로써 이를 일시적으로 억제할 수 있다[참조 문헌: T.W. Greene and P.G.M. Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis," 2nd ed. John Wiley & Sons, (1991)].
본원에서 사용되는 바와 같이, 선택적으로 분해가능한 링커는 선택된 조건하에 분해되는 링커, 예를 들어 광 분해가능한 링커, 화학 분해가능한 링커 및 효소 분해가능한 링커이다(즉, 제한 엔도뉴클레아제 부위 또는 리보뉴클레오타이드/RNase 분해). 링커는 지지체와 고정화된 DNA 사이에 삽입되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 해독된 핵산(예: 유전자 산물)을 언급하는 경우에 번갈아 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "샘플"은 검출할 물질을 포함하는 조성물을 의미한다. 바람직한 양태에서, 샘플은 동물, 특히 사람을 포함하는 포유류, 식물, 박테리아, 진균류, 원생생물 및 바이러스를 포함하지만 이로써 제한되지는 않는 살아있는 공급원으로부터 수득되는 임의의 물질을 의미하는 "생물학적 샘플"이다. 생물학적 샘플은 조직, 세포 및 생검 물질을 포함하는 고체 물질과 뇨, 혈액, 타액, 양수, 척수액 및 구강 세척액(구강 세포 포함)을 포함한 생물학적 유체를 포함하여 임의의 형태일 수 있다. 바람직하게, 고체 물질은 유체와 혼합된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "기판" 또는 "고체 지지체"는 본원에서 기술하는 바와 같이 샘플이 물질에 따라서 침착되는 불용성 지지체를 의미한다. 적절한 기판의 예에는 이로써 제한되지는 않지만 실리카 겔, 조절된 다공성 유리, 마그네틱, 덱스트란, 아가로스 및 셀룰로스를 포함한 비드; 모세관; 유리 섬유 필터, 유리 표면, 금속 표면(예: 강, 금, 은, 알루미늄, 구리 및 규소)과 같은 평판 지지체; 다중웰 플레이트 또는 막(예: 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리비닐리덴디플루오라이드의 막)을 포함한 가소성 물질; 조합 합성 또는 분석에 적합한 핀 정렬과 같은 핀; 또는 플레이트를 갖거나 갖지 않는 웨이퍼, 특히 실리콘 웨이퍼와 같은 평면의 피트(pit)중의 비드가 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, RNA 폴리머라제는 DNA 의존적 RNA 폴리머라제 및 RNA 의존적 RNA 폴리머라제를 의미한다. 특이적인 프로모터 서열을 인지하여 전사를 개시할 수 있고 RNA 전사체를 연장시킬 수 있는 어떠한 RNA 폴리머라제도 본 발명의 범주에서 고려된다. 본원에서 제공되는 방법에 사용할 수 있는 RNA 폴리머라제의 예로는 하기하는 공급원으로부터 수득되는 것이 포함되지만, 이로써 제한되지는 않는다: 1) 아키박테리아(archeabacteria), 예를 들어 할로박테리움(Halobacterium), 메타노박테리움(Methanobacterium), 메타노코쿠스(Methanococcus), 설폴로발레스(Sulfolobales) 및 써모플라즈마(Thermoplasma); 2) 유박테리아(eubacteria), 예를 들어 그람 음성(gram negative) 박테리아[예: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 및 살모넬라(Salmonella) 및 쉬겔라(Shigella) 균주], 그람 양성(gram positive) 박테리아[예: 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphlococcus aureus)]; 3) 박테리오파지, 예를 들어 T7, T3, SP6, 닉 형성 SP6 및 N4; 4) DNA 바이러스; 5) RNA 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스; 6) 식물, 예를 들어 밀; 및 7) 진균류[예: 사카로마이세스 세레비새(Saccharomyces cerevisae)] 및 보다 고등한 진핵 유기체(예: 포유류)로부터 분리한 진핵 세포 RNA 폴리머라제 II. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 RNA 폴리머라제의 범주에는 또한 RNA 파지 Qβ 리플리카제[참조 문헌: PCT 국제 공보 제PCT/US87/00880호 및 제5,270,184호]가 포함된다. 예를 들어, 진핵 세포를 감염시키는 바이러스로부터의 바이러스 프로모터를 포함하여, 진핵 세포 프로모터를 인지하는, 진핵 조직(식물 및 동물을 포함)으로부터 분리된 것과 같은 진핵 세포의 RNA 폴리머라제가 또한 본원에서 고려된다. T7, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제는 클로닝되었고 이의 서열과 이의 정제방법뿐만 아니라, 박테리아 RNA 폴리머라제 및 특정한 진핵 세포 DNA 의존적 RNA 폴리머라제의 정제방법도 공지되어 있다. 또한, 다수의 RNA 폴리머라제가 대량으로 시판중이며, 또한 시판중인 벡터로부터 이를 용이하게 생성시킬 수 있다. 상기 언급한 폴리머라제 및 기타 RNA 폴리머라제 각각에 대한 프로모터의 서열은 또한 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 프로모터 영역은 DNA에 작동가능하게 연결되어 이의 발현을 조절하는 유전자의 DNA의 일부를 의미한다. 프로모터 영역은 RNA 폴리머라제의 인지, 결합 및 전사 개시에 충분한, 특이적인 DNA 서열을 포함한다. 프로모터 영역의 이러한 부분을 프로모터라 한다. 또한, 프로모터 영역은 RNA 폴리머라제의 인지, 결합 및 전사 개시 활성을 조절하는 서열을 포함한다. 이러한 서열은 시스 작용(cis acting)이거나 트랜스 작용 인자(trans acting factor)에 대해 반응할 수 있다. 조절 특성에 의존적인 프로모터는 지속적(constitutive)이거나 조절될 수 있다. 지속적 프로모터는 항상 작동한다. 조절가능한 프로모터는 작동하거나 정지하는데 특이적인 시그날을 필요로한다. 발생학적으로 조절된 프로모터는 발생 작용으로서 작동하거나 정지하는 프로모터이다. 프로모터는 컨센서스(consensus) 서열 또는 변형체일 수 있다. 비야생형 프로모터가 사용되는 경우, 검출가능한 전사체를 생성시키기에 충분한 속도로 전사가 발생하는데, 야생형 또는 천연 프로모터가 RNA 폴리머라제에 의해 사용되어 시험관내에서 핵산을 전사시키는 경우, 전형적으로 전사가 발생하는 속도의 약 5 내지 10% 이상이다. 각각의 종의 RNA 폴리머라제는 특정 프로모터 서열에 대해 특이적이다. 3가지 박테리오파지 RNA 폴리머라제(T7, T3 및 SP6) 각각은 자체의 특이적인 DNA 프로모터 서열을 갖는다. RNA 폴리머라제가 주형의 프로모터 서열에 부착하여 전사를 개시한 후, 프로모터 서열은 RNA 폴리머라제를 방출시킨다. 이어서, RNA 폴리머라제는, (1) RNA 출발 물질이 소비되거나, (2) 전사 반응이 특정 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 또는 유사체에 의해 종결되거나, (3) RNA 폴리머라제 및 주형이 미숙하게 분리되는 경우 전사가 자발적으로 중지되거나 또는 (4) DNA 주형의 말단에 이를 때까지, 주형을 따라 전사를 지속시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "프로모터 함유 핵산"은 이본쇄 DNA에 결합하여 이를 용융시켜 리보뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재하에 RNA 합성을 개시할 수 있는 개방 전사 개시 복합체를 형성하는, RNA 폴리머라제 분자의 부위 특이적인 결합을 지정하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이다. 따라서, 기능성 프로모터 서열은, DNA 의존적 RNA 폴리머라제가 결합하고 용융시켜 개시 복합체를 형성하여 전사를 개시하는 뉴클레오타이드 서열이다. 프로모터 함유 핵산 포획 프로브는, 특히 매우 엄격한 조건하에 표적 핵산이 하이브리드화되는, 뉴클레오타이드가 약 5개 이상인 3' 돌출부 및 프로모터 영역을 포함하는 이본쇄 분자를 의미한다. 통상 이러한 하이브리드화는 표적과 프로모터 함유 포획 프로브 사이에 약 5쌍의 연속적 염기쌍의 존재를 필요로한다. 전사가 개시된 후, RNA 폴리머라제(또는 이의 소단위)는 폴리머라제, DNA 및 생성되는 RNA 전사체를 포함하는 3원 복합체의 일부이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "암호화 쇄"는 프로모터로부터 개시된 상응하는 mRNA 분자에 상응하는 것으로서, 동일한 극성을 갖는 프로모터 함유 핵산의 핵산 쇄를 의미한다. 따라서, 이를 센스 쇄라고 한다. 비암호화 쇄는 RNA 폴리머라제에 의해 전사되는 안티센스 쇄이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "천연 뉴클레오사이드(또는 리보뉴클레오사이드) 트리포스페이트" 또는 "천연 뉴클레오타이드" 또는 리보뉴클레오타이드 트리포스페이트는 RNA의 천연적으로 발생하는 정상의 전구체중 임의의 것, 예를 들어 ATP, GTP, CTP 또는 UTP를 의미한다. "뉴클레오사이드 트리포스페이트 유사체" 또는 "뉴클레오타이드 유사체"는 천연 뉴클레오타이드와 유사한 임의의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 유사체를 의미하지만, 이는 천연 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 비해 하나 이상의 화학적 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "매트릭스 물질"은 MALDI 동안에 용이하게 이온화될 수 있는 결정성 매트릭스-핵산 구조를 형성하는, 양성자 공여 UV 흡수 물질, 일반적으로는 유기산인, 질량 분광분석법에서 사용되는 물질을 의미한다. 예시적인 매트릭스 물질은 3-하이드록시피콜린산 용액(3-HPA, 50% 아세토니트릴중의 0.7M, 10% 암모늄시트레이트)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "조건화"(conditioning)는 질량 분광분석 전에 분석될 핵산을 변형시켜서, 예를 들어 휘발에 필요한 레이저 에너지를 감소시키고/시키거나 분획화를 최소화하는 공정을 의미한다. 조건화는 핵산상에서 바람직하게는 이를 고정화시킨 후에 수행할 수 있다. 조건화의 예로는, 뉴클레오타이드 단위당 결합된 양이온의 비균질성에 기인한 피크 확장을 제거하는, 예를 들어, 양이온 교환에 의한 핵산 분자의 포스포디에스테르 골격의 변형이 있다. 핵산 분자를 알킬화제(예: 알킬요오다이드, 요오도아세트아미드, 요오도에탄올 또는 2,3-에폭시-1-프로판올)와 접촉시킴으로써, 핵산 분자의 모노티오포스포디에스테르 결합을 포스포트리에스테르 결합으로 변형시킬 수 있다. 유사하게, 트리알킬실릴 클로라이드를 사용하여 포스포디에스테르 결합을 비하전된 유도체로 변형시킬 수 있다. 조건화는 또한 합성하는 동안에 변형된 뉴클레오타이드를 핵산으로 혼입시킴으로써 수행할 수 있다. 예를 들어, 푸린 유사체(예: N5-, N7- 또는 N9-데아자푸린 뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드)와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 사용하여 탈푸린화(MS 동안의 분획화)에 대한 감수성을 감소시킬 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 또한 RNA 빌딩 블럭, 올리고뉴클레오타이드 트리에스테르, 알킬화된 포스포로티오에이트 작용 그룹 또는 올리고뉴클레오타이드 미메틱(예: PNA)를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드를 사용하여 조건화된 RNA 전사체를 제조하는데 있어서, 선택된 RNA 폴리머라제는 변형된 뉴클레오타이드를 RNA 전사체로 혼입시킬 수 있어야만 한다.
서열화 방법
핵산을 서열화하는 질량 분광분석 방법이 제공된다. 특히, 서열화 방법은 프로모터를 암호화하는 이본쇄 영역, 및 표적 핵산상의 상보적인 영역과 하이브리드화하기 위한 일본쇄 영역을 포함하는 핵산 프로모터 함유 프로브를 사용한다. 핵산 프로모터 함유 포획 프로브는 바람직하게는 고체 지지체상에 고정화시킨다. 일본쇄 영역은, 서열화될 핵산, 및 프로브상의 5개의 연속적인 일본쇄 뉴클레오타이드와 동일한 5개 이상의 뉴클레오타이드 일본쇄 영역을 포함하는 표적 핵산상의 상보적 영역과 하이브리드화된다.
표적이 핵산 프로모터 함유 프로브와 하이브리드화한 후, 프로모터로부터 개시되고 표적 핵산을 통해 전사되는, 한벌의 염기 특이적 쇄 종결된 RNA 전사체 세트를 생성시킴으로써 핵산 서열을 결정한다. 생성된 한벌의 RNA 전사체는 질량 분광분석법을 사용하여 분석한다.
DNA가 종종 서열화를 위한 바람직한 비히클이기도 하지만, 본원의 방법은 RNA 전사체를 서열화한다. RNA 단편은 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화(MALDI) 질량 분광분석법을 수행하는 동안에 DNA 단편보다 안정하다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않는 경우, RNA의 당 잔기상의 2'-하이드록실 그룹의 존재로 안정성이 향상되어 MALDI 공정 동안에 탈푸린화의 감소를 도울 수 있다.
RNA 폴리머라제 및 프로모터
RNA 분자의 시험관내 전사를 지시할 수 있는 어떤 RNA 폴리머라제도 본원에서 기술한 방법에 사용할 수 있다. 바람직한 RNA 폴리머라제는 DNA 의존적 RNA 폴리머라제이다. RNA 폴리머라제 분자를 분리하고 정제하는 방법은 당해 기술 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다: Qβ 리플리카제[참조 문헌: 미국 특허 제5,696,249호, Re: 35,443 및 Eoyang et al. (1971) in Procedures in Nucleic Acid Research, Cantoni and Davies, eds., Volume 2, pp. 829-829, Harper and Rowe, NY]; 이 콜라이와 같은 박테리아[참조 문헌: Burgess and Jendrisak(1975) Biochemistry 14: 4634-4638 and Hager et al. (1990) Biochemistry 29: 7890-7894]; 레이쉬마니아(Leishmania)[참조 문헌: Sadhukhan et al.(1997) Mol. Cell. Biochem. 171: 105-114]; 바실러스 서브틸리스[참조 문헌: Giacomoni (1980) Eur. J. Biochem. 106: 579-591]; T7와 같은 파지[참조 문헌: McDonnell et al. (1977) J. Mol. Biol. 89: 719-736 and Studier et al. (1969) Virology 39: 562-574; He et al. (1997) Protein Expr. Purif. 9: 142-151]; 바이러스[예: 라브도바이러스(rhabdovirus)(참조 문헌: Das et al. (1996) Methods Enzymol. 275: 99-122); 순무 모자이크 바이러스(참조 문헌: Deidman et al. (1997) J. Viral Meth. 64: 184-195); 바시니아(참조 문헌: Gershon et al. (1996) Methods Enzymol. 275: 35-57)]; 포유류[예: 효모 pol II(참조 문헌: Koleske et al. (1996) Methods Enzymol. 273: 176-184); 사람 pol II(참조 문헌: Maldonado et al. (1996) Methods Enzymol. 274: 72-100)]. 또한 다수의 원핵생물, 진핵생물, 박테리오파지 및 바이러스 RNA 폴리머라제(예: T3, T7 및 SP6)[제조사: 스트라타진(Stratagene; La Jolla, CA), 베링거 만하임(Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN), 파마시아(Pharmacia; Uppsala, Sweden) 및 시그마 케미칼 코포레이션(Sigma Chemical Corp; St. Louis, Mo)]가 시판중이고/이거나 익히 공지되어 있다. 프로모터는 또한 익히 공지되어 있고 용이하게 입수할 수 있다[예: 프로메가(Promega; Madison, WI)의 pGEM 계열 플라스미드; pGEM 플라스미드의 작제를 기술하고 있는 미국 특허 제4,766,072호를 참조한다].
본 방법을 수행하는데 있어서, DNA 의존적 RNA 폴리머라제 및 RNA 의존적 RNA 폴리머라제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법에 사용할 수 있는 RNA 폴리머라제에는 다음으로부터 수득되는 것이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 1) 아키박테리아, 예를 들어 할로박테리움, 메타노박테리움, 메타노코쿠스, 설폴로발레스 및 써모플라즈마; 2) 유박테리아, 예를 들어 그람 음성 박테리아(예: 에스케리키아 콜라이, 및 살모넬라 및 쉬겔라 균주), 그람 양성 박테리아(예: 바실러스 서브틸리스 및 스타필로코쿠스 아우레우스); 3) 박테리오파지, 예를 들어 T7, T3, SP6 및 N4; 4) DNA 바이러스; 5) RNA 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스; 6) 식물 및 식물 바이러스, 예를 들어 밀 및 순무 모자이크 바이러스; 및 7) 진균류(예: 사카로마이세스 세레비새) 및 보다 고등한 진핵 유기체(예: 포유류)로부터 분리한 진핵 세포 RNA 폴리머라제 II[참조 문헌: RNA Polymerase and the Regulation of Transcription, Reznikoff et al., eds, Elsevier, NY]. 또한 Qβ RNA 파지로부터의 Qβ 리플리카제[참조 문헌: 미국 특허 제5,670,353호, 제5,696,249호 및 Re: 35,443]를 본원에서 사용한다.
서열화될 핵산 주형에 적절한 RNA 폴리머라제의 선택은 당해 기술 분야의 숙련가에 의해 좌우되고 서열화될 핵산 분자 및 선택된 프로모터 영역에 따라 다양한다. 본원에서 기술한 바를 포함한, 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 교시를 사용하여, 실험적으로 선택을 결정할 수 있다. 서열화될 바람직한 핵산 분자는 DNA 분자이다. 적절한 RNA 폴리머라제를 선택함으로써, RNA, 및 특히 PNA(단백질 핵산)를 수정하여 서열화할 수 있다.
본원에서 기술한 서열화 방법에 사용되는 핵산 프로모터 함유 프로브 각각은 프로모터를 포함한다. 본원의 방법에 사용되는 프로모터는 임의의 공급원으로부터 수득하거나, 선택된 RNA 폴리머라제에 의해 인지되는 서열을 기본으로 하여 합성적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 프로모터를 함유하는 핵산은 클로닝에 의해 상이한 유기체 종(예: 박테리아, 바이러스, 파지 및 진핵 세포)으로부터 직접 수득하거나, 시판중인 발현 벡터로부터 수득할 수 있다(예: 베링거 만하임 및 파마시아의 T7, T3, SP6 및 λPL및 λPR프로모터; 스트라타진의 bla 또는 lac 프로모터, RSV-LTR 프로모터 및 F9-1 프로모터). 적절한 프로모터의 선택은 서열화될 핵산, 서열화 조건, 및 가장 중요하게는 전사용으로 선택되는 RNA 폴리머라제에 따라 좌우된다.
프로모터는 프로모터의 암호화 및 비암호화 DNA 쇄를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화함으로써 생성될 수 있다(실시예 4를 참조한다). 핵산의 개별적인 쇄는, 바람직하게는 핵산 합성 기술에 의해 수득한다. 프로모터를 어셈블리하는데 사용되는 올리고뉴클레오타이드는, 하이브리드화 후에 암호화 쇄의 3'-말단에 표적 DNA가 하이브리드화할 수 있는 일본쇄 영역이 존재하도록 디자인한다.
핵산 프로모터 함유 프로브의 고정화
바람직한 양태에서, 핵산 프로모터 함유 프로브는 본원에서 제공되는 고체 지지체에 직접 고정화시키거나 가교결합제를 이용하여 고정화시킨다. 프로브는 하이브리드화 전 또는 하이브리드화 후에 표적에 고정화시킬 수 있다. 바람직하고 보다 편리하게는, 고체 지지체상에 고정화시킨 후에 하이브리드화를 수행한다. 프로브는 바람직하게는 암호화 쇄의 5' 말단 또는 비암호화 쇄의 3' 말단을 통해 고정화시킨다.
다른 양태에서, 프로모터 및 하부스트림 표적 핵산은, 프라이머를 사용하여 증폭시키거나 하이브리드화 클로닝 기술에 의해 지놈 DNA로부터 전사 단위로서 분리시킬 수 있다. 프로모터 및 표적을 암호화하는 DNA는 암호화 쇄(센스 쇄)의 5'-말단 또는 비암호화 쇄의 3'-말단의 종결 뉴클레오타이드를 통해 고체 지지체에 고정화시킬 수 있다. 하기에서 추가로 논의되는 바와 같이, 사용되는 프로모터 함유 핵산 주형을 분리시키는데 PCR 프라이머에 연결 그룹을 혼입시켜 지지체에 이를 직접 고정시킬 수 있다. 쇄 종결 뉴클레오타이드의 존재하에 프로모터를 인지하는 적합한 RNA 폴리머라제를 사용하여 한벌의 단편 세트를 형성하고, 이로부터 서열을 결정할 수 있다.
바람직한 고체 지지체는, 바람직하게는 공유 결합 핵산이 기판상에 약 20fmol/㎟ 이상, 바람직하게는 약 75fmol/㎟ 이상, 여전히 보다 바람직하게는 약 85fmol/㎟ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 100fmol/㎟ 이상, 가장 바람직하게는 150fmol/㎟ 이상과 같이 고밀도로 존재하여 이에 위치한 핵산의 연결을 지지할 수 있는 것이다. 본원에서 제공되는 기판에 핵산을 고정화시키는 특정 방법에 사용하기에 가장 바람직한 기판으로는 실리콘이 있지만, 보다 덜 바람직한 기판에는 폴리아크릴아미드와 같은 중합체성 물질도 포함된다. 본원에서 제공되는 정렬 생성 방법에 사용하기 위한 기판에는, 이로써 제한되지는 않지만 실리카 겔, 조절된 다공성 유리, 셀룰로스, 유리 섬유 필터, 유리 표면, 금속 표면(강, 금, 은, 알루미늄, 규소 및 구리), 가소성 물질(예: 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드 및 폴리비닐리덴 디플루오라이드) 및 실리콘을 포함한 다양한 불용성 지지체 물질들중 임의의 것이 포함된다.
가교결합제를 사용하지 않는 방법의 양태에서, 변형된 핵산은 적절하게 작용화된 표면과 직접 반응시켜 고정화된 핵산을 수득한다. 따라서, 예를 들어 요오도아세틸 변형된 표면(또는 다른 티올 반응성 표면 작용 그룹)을 티올 변형된 핵산과 반응시켜 고정화된 핵산을 제공할 수 있다.
가교결합제를 사용하는 양태에서, 가교결합제는 불용성 지지체상에 고정화된 고밀도의 핵산을 제공하도록 선택한다. 가교결합제(및 지지체 표면 또는 핵산 분자를 작용화하는데 사용되는 다른 시약)는 고체 지지체로부터 고정화된 핵산 분자에 바람직한 간격을 제공하고 고정화된 핵산 분자 서로에 대해 바람직한 간격을 제공하도록 선택할 수 있다. 따라서, 적절한 가교결합제를 선택함으로써 핵산 분자의 입체 방해를 감소시키거나 제거할 수 있다. 특정 양태에서, 가교결합제는, 다수의 핵산을 단일 가교결합 잔기에 부착시키는 덴드리머 합성에 사용되는 바와 같이, 다수의 반응성 작용 그룹을 제공하도록 선택할 수 있다. 바람직하게, 가교결합제는 핵산 분자와 아주 강하게 반응하여 신속하고 완전하며/하거나 선택적인 반응을 제공하도록 선택한다. 바람직한 양태에서, 시약의 반응 용적(예: 티올 그룹 시약 및 티올 반응성 작용 그룹)은 작다.
변형된 핵산 프로모터 함유 프로브 및 링커
본원에서 사용하기에 바람직한 핵산 프로모터 함유 프로브는 "티올 변형된 핵산", 즉 하나 이상의 반응성 티올 잔기를 포함하도록 유도체화된 핵산이다. 하기 실시예 1에서 추가로 상세히 기술하는 바와 같이, 하나 이상의 반응성 티올을 함유하는 핵산은, 바람직하게는 3' 또는 5' 디설파이드를 함유하는 핵산을 환원제로 처리하여 제조하는데, 바람직하게는 이들은 후속 반응에서 경쟁하지 않는다(즉, 요오도아세트아미도 작용 그룹과 반응하지 않는다). 디설파이드 유도체화된 핵산은 다양한 방법에 따라 합성할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 디설파이드 함유 변형제와 반응하여 3'- 또는 5'-말단에서 변형될 수 있다. 선택적으로, 티올화 프라이머를 효소적 또는 비효소적으로 핵산에 부착시킬 수 있다. 5'-포스포르아미데이트 작용 그룹은 또한 티올 또는 디설파이드 함유 시토신 또는 데옥시시토신에 대한 부착점을 제공할 수 있다. 디설파이드 변형된 핵산을 환원시키는데 적절한 환원제의 예는 다음을 포함한다: 트리스-(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)(바람직하게는 1 내지 100mM의 농도, 가장 바람직하게는 약 10mM)은 3 내지 6의 pH 범위(가장 바람직하게는 약 4.5) 및 20 내지 45℃(가장 바람직하게는 약 37℃)의 온도 범위에서 약 1 내지 약 10시간(가장 바람직하게는 약 5시간) 동안 반응시킨다; 디티오트레이톨(바람직하게는 25 내지 100mM의 농도로, 이는 반응물의 분리 여부에 좌우된다)은 6 내지 10의 pH 범위(가장 바람직하게는 약 8) 및 25 내지 45℃의 온도 범위(가장 바람직하게는 약 37℃)에서 약 1 내지 약 10시간(가장 바람직하게는 약 5시간) 동안 반응시킨다. TCEP는 낮은 pH에서 반응성이 있다는 잇점을 제공한다. 이러한 낮은 pH는 티올을 효과적으로 양성자화시켜 티올의 친핵성 반응을 억제시키며, 그 결과 보다 높은 pH에서 사용되는 다른 디설파이드 환원제보다 훨씬 적은 부반응이 발생한다.
하기 실시예 1에서 추가로 기술되는 바와 같이, 바람직한 이작용성 가교결합제는 N-석신이미딜(4-요오드아세틸) 아미노벤조에이트(SIAB)이다. 다른 가교결합제로 디말레이미드, 디티오-비스-니트로벤조산(DTNB), N-석신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC) 및 6-하이드라지노니코트이미드(HYNIC)를 신규한 공정에 또한 사용할 수 있다. 가교결합제의 또다른 예는 문헌을 참조한다[참조 문헌: Wong "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking", CRC Press (1991), and Hermanson, "Bioconjugate Techniques" Academic Press (1995)].
다른 양태에서, 핵산은 질량 분광분석 동안에 분해되는 광 분해가능한 링커 또는 광 불안정한 링커 잔기를 사용하여 고정화시킨다. 광 불안정한 가교결합 링커의 예에는 3-아미노-(2-니트로페닐)프로피온산이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다[참조 문헌: Brown et al. (1995) Molecular Diversity, pp. 4-12 and Rothschild et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 361-66]. 또한 PCT 국제 공보 제WO 98/20019호를 참조한다.
핵산 프로모터 함유 프로브는 표적 핵산 분자(T)상의 적절한 작용 그룹(L')과 포획 분자상의 적절한 작용 그룹(L) 사이의 가역적 또는 비가역적 결합을 통해 고체 지지체에 직접 결합시킬 수 있다. 이러한 형식은 미국 특허 제5,503,980호에 나타나 있는 것과 유사하다. 가역적 연결은 질량 분광분석 조건하에 분해되는 연결을 포함한다. 여기에는 광 분해가능한 결합(예: 전하 전달 복합체) 및 비교적 안정한 유기 라디칼 사이에 형성되는 불안정한 결합이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다.
또한, 4급 암모늄 그룹인 L'와 함께 연결이 형성될 수 있는데, 이 경우, 고체 지지체의 표면이 바람직하게는 음전하로 하전된 핵산 골격에 반발하는 음전하를 포함하게 되어 질량 분광분석기에 의한 분석에 요구되는 탈착이 용이해진다. 탈착은 레이저 펄스에 의해 생성되는 열에 의해 발생할 수 있고/있거나, L'에 따라서 L' 발색단과 함께 공명 상태에 있는 레이저 에너지의 특이적 흡수에 의해 발생할 수 있다.
따라서, L-L' 화학작용은 온화한 산성 조건뿐만 아니라 질량 분광분석 조건하에서 분해될 수 있는 디설파이드 결합[예를 들어, 머캅토에탄올 또는 디티오에리트롤, 바이오틴/스트렙트아비딘 시스템, 및 트리틸 에테르 그룹의 헤테로이작용성 유도체에 의해 화학적으로 분해될 수 있음; 참조 문헌: Koster et al. (1990), "A Versatile Acid-Labile Linker for Modification of Synthetic Biomolecules,"Tetrahedron Letters 31: 7095], 거의 중성인 조건하에 하이드라지늄/아세테이트 완충액하에 분해될 수 있는 레불리닐 그룹, 트립신과 같은 엔도펩티다제 효소에 의해 분해될 수 있는 아르기닌-아르기닌 또는 라이신-라이신 결합, 피로포스파타제에 의해 분해될 수 있는 피로포스페이트 결합, 또는 예를 들어 리보뉴클레아제 또는 알칼리에 의해 분해될 수 있는 올리고데옥시뉴클레오타이드 사이에 있는 리보뉴클레오타이드 결합중의 한 유형에 존재할 수 있다.
작용 그룹 L 및 L'는 또한 전하 전달 복합체를 형성하여 일시적인 L-L' 연결을 형성할 수 있다. 대다수의 경우에 "전하 전달 밴드"는 UV/vis 분광분석법[참조 문헌: Organic Charge Transfer Complexes by R. Foster, Academic Press, 1969]에 의해 측정할 수 있기 때문에, 레이저 에너지가 전하 전달 파장의 상응하는 에너지로 조정되어 고체 지지체로부터의 특이적인 탈착이 개시될 수 있다. 당해 기술 분야의 숙련가는 몇몇 혼합물이 상기 목적으로 작용할 수 있고, 공여체 작용 그룹이 고체 지지체상에 위치하거나 검출될 핵산 분자와 커플링될 수 있으며, 또는 이의 역으로 수행될 수 있음을 인지할 것이다.
다른 방법에서, 비교적 안정한 라디칼을 균형분해적으로 형성시킴으로써 가역성 L-L' 연결을 생성할 수 있다. 레이저 펄스의 영향하에, 탈착(상기한 바와 같음)뿐만 아니라 이온화가 라디칼 위치에서 발생한다. 당해 분야의 숙련가는, 다른 유기 라디칼을 선택할 수 있으며, 이들 사이의 결합을 균형적으로 분해시키는데 필요한 해리 에너지와 관련하여 상응하는 레이저 파장을 선택할 수 있음을 인지할 것이다[참조 문헌: Reactive Molecules by C. Wentrup, John Wiley & Sons, 1984].
언급한 바와 같이, 고정화를 수반하는 방법의 몇몇 양태가 본원에서 고려된다. 여기에는 하기의 것이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 1) 프라이머 핵산을 고체 지지체에 고정화시키고, 표적 핵산을 이에 하이브리드화시켜 프로모터 서열을 형성한다; 2) 프로모터를 암호화하는 이본쇄 핵산(증폭 또는 분리됨)은 연결을 통해 미리 결정되어 있는 쇄에 고정화시키고, 미리 결정된 데옥시리보뉴클레오타이드의 존재하에 시험관내 전사를 개시한다; 3) 서열 정보의 이용이 가능한 증폭시킬 수 있는 표적 핵산을, 3' 돌출부를 갖는 이본쇄 핵산 포획 프로브와 하이브리드화시키고 생성된 하이브리드를 고정화시킨다.
프라이머 핵산이 고체 지지체에 고정화되고 표적 핵산이 이와 하이브리드화하는 양태에서, 분해가능한 링커를 포함하는 것은, 5'-말단에서 프라이머 DNA를 고정시켜 표적 DNA가 유리 DNA쇄와 하이브리드화하는데 유리 3'-OH를 이용할 수 있도록 하고 전사를 개시할 수 있도록 한다.
핵산을 고체 지지체에 고정화시키기 위해, 본원에서는 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 링커를 사용하여 핵산을 고체 지지체에 연결시킬 수 있다. 본원에서 바람직한 링커는 선택적으로 분해가능한 링커, 특히 본원에서 예시한 링커이다. 다른 링커에는 산 분해가능한 링커(예: 비스말레이미데오톡시 프로판) 및 산 불안정한 트리틸 링커가 포함된다. 특히 표적화된 제제를 분해시켜 이를 반응에 보다 용이하게 이용하는 것이 필요한 경우, 산 분해가능한 링커, 광 분해가능한 링커 및 열 감수성 링커를 또한 사용할 수 있다.
산 분해가능한 링커
산 분해가능한 링커에는 비스말레이미데오톡시 프로판 및 아디프산 디하이드라지드 링커[참조 문헌: Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584-589], 및 세포내 트랜스페린 순환 경로로 도입하기에 충분한 트랜스페린 부분을 포함하는 산 불안정한 트랜스페린 접합체[참조 문헌: Welhoner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 4309-4314]가 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다.
광 분해가능한 링커
광 분해가능한 링커는 광에 노출시 분해되어[참조 문헌: Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107], 광에 노출시 표적화된 제제를 방출하는 링커이다. 광에 노출시 분해되어, 광에 노출시 표적 제제를 방출하는 광 분해가능한 링커는 공지되어 있다[참조 문헌: 시스테인용 광 분해가능한 보호 그룹으로서 니트로벤질 그룹의 사용을 기술하고 있는 Hazum et al. (1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt, K (Ed), pp. 105-110; 하이드록시프로필메타크릴아미드 공중합체, 글리신 공중합체, 플루오레세인 공중합체 및 메틸로다민 공중합체를 포함한 수용성 광 분해가능한 공중합체를 기술하고 있는 Yen et al. (1989) Makromol. Chem 190:69-82; UV 근처의 광(350㎚)에 노출시 광 분해되는 가교결합제 및 시약을 기술하고 있는 Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107; 및 광 분해가능한 연결을 생성하는 니트로벤질옥시카보닐 클로라이드 가교결합제를 기술하고 있는 Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol 42:231-237]. 바람직한 양태에서, 핵산은 질량 분광분석 동안에 분해되는 광 분해가능한 링커 잔기를 사용하여 고정화시킨다.
화학 분해가능한 링커
고정화된 핵산과 고체 지지체 사이에 분해가능한 결합을 도입시키는데 다양한 화학 분해가능한 링커를 사용할 수 있다. 산 불안정한 결합은 핵산 조건화 동안에 3-HPA 매트릭스 용액을 첨가하면 분해되기 때문에, 현재는 산 불안정한 링커가 질량 분광분석법, 특히 MALDI-TOF MS용으로 바람직한 화학 분해가능한 링커이다. 산 불안정한 결합은 개별적인 링커 그룹(예: 산 불안정한 트리틸 그룹)으로서 도입시키거나, 또는 디이소프로필실릴을 사용하여 하나 이상의 실릴 뉴클레오사이드간 브릿지를 도입하여 디이소프로필실릴 연결된 올리고뉴클레오타이드 유사체를 형성시킴으로써 합성 핵산 링커내로 혼입시킬 수 있다. 디이소프로필실릴 브릿지는 DNA 골격에 있는 포스포디에스테르 결합을 대체하여, 온화한 산성 조건(예: 1.5% 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 3-HPA/1% TFA MALDI-TOF 매트릭스 용액)하에 DNA 분자내에 하나 이상의 쇄내 분열을 도입시킨다. 디이소프로필실릴 연결된 올리고뉴클레오타이드 전구체 및 유사체의 제조방법은 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지되어 있다[참조 문헌: Saha et al. (1993) J. Org. Chem. 58: 7827-7831]. 이러한 올리고뉴클레오타이드 유사체는 디이소프로필실릴 유도체화된 데옥시리보뉴클레오사이드를 사용하는 고상 올리고뉴클레오타이드 합성법을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다.
핵산의 변형
A. 대량 변형
특정 양태에서, 3'- 또는 5'-말단 이외의 위치에서 변형시킨 핵산을 사용할 수 있다. 3' 또는 5' 위치 이외의 위치에서 뉴클레오타이드의 당 잔기를 변형시키는 것은 통상적인 방법을 통해 가능하다. 또한 핵산 염기는, 예를 들어 문헌에 기술되어 있는 방법에 따라 변형시킬 수 있다[참조 문헌: F. Eckstein, ed., "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach," IRL Press (1991)]. 이러한 링커 암(linker arm)은 티올 잔기를 포함하도록 변형시킬 수 있다. 선택적으로, 변형된 포스페이트 골격에 의해 제공되는 질소 중심에 티올 그룹이 부착될 수 있도록 골격을 변형시킨 핵산을 사용할 수 있다.
바람직한 양태에서, 상기한 바와 같은 핵산의 변형은 실질적으로 핵산 분자가 이의 상보체와 하이브리드화하는 능력을 손상시키지는 않는다. 따라서, 어떠한 변형이라도 바람직하게는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성을 책임지는 핵산의 작용성을 실질적으로 변형시키는 것을 피해야만 한다. 핵산은 비-말단 티올 그룹이 존재하도록 변형시킬 수 있고, 핵산이 지지체에 고정화되는 경우 자체로 상보적인 염기쌍 형성을 수행하여 이본체 영역을 갖는 "헤어핀(hairpin)" 구조를 형성할 수 있다.
B. 다른 RNA 유사체 변형
본원에서 기술한 방법을 수행하는데 있어서, 한벌의 염기 특이적 쇄 종결된 RNA 전사체 세트(또는 세트들)는, 변형된 염기 특이적 쇄 종결 리보뉴클레오타이드 유사체를 전사되는 동안에 혼입(또는 변형된 막삼-길버트 전략으로 RNase에 의해 특이적으로 분해)시킴으로써 생성한다. RNA 폴리머라제에 의해 RNA 분자내로 혼입되어 전사 연장을 서열 특이적으로 정지시키는 임의의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 유사체를 본 방법에 사용할 수 있다. 현재 바람직한 리보뉴클레오타이드 유사체로는 3'-데옥시리보뉴클레오타이드가 있고, 이의 사용으로 전사가 염기 특이적으로 종결된다[참조 문헌: Axelrod et al. (1985) Biochemistry 24: 5716-5723; Tyagarajan et al. (1985) Biochemistry 30: 10920-10924].
특정 양태에서, 염기 특이적 쇄 종결 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 유사체 외에도, 추가의 리보뉴클레오타이드 유사체를 가하여 생성된 RNA 전사체의 2차 구조를 감소시키고/시키거나 미숙한 전사 종결 또는 정지나 RNA 분해를 방지할 수 있다. 예를 들어, 이노신 5'-트리포스페이트를 사용하여 리보이노신을 혼입시키는 것이 RNA 생성물의 2차 구조를 감소시키는 것으로 공지되어 있다. 디뉴클레오타이드 구아닌 개시제의 존재하에, 시험관내 전사 반응에서 GTP를 이노신 5'-트리포스페이트로 효과적으로 대체시킬 수 있다[참조 문헌: Axelrod et al. (1985) Biochemistry 24: 5716-5723].
또한, 변형된 리보뉴클레오타이드 유사체를 전사 혼합물에 가하여 전사 종결 및/또는 전사체 방출 효율을 증가시켜 효소 턴오버율을 증진시키고 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 4-티오 UTP, 5-브로모 UTP 및 5-요오도 CTP를 가하여 핵산의 수소결합을 변화시켜서 적어도 몇몇 RNA 폴리머라제를 사용하여 전사 종결 및 전사체 방출을 촉진시킨다.
고체 지지체 및 기판
본원에서 사용하기 위한 불용성 지지체 및 기판의 예에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 실리카 겔, 조절된 다공성 유리, 마그네틱 비드, 덱스트란 및 아가로스(세파덱스 및 세파로스) 비드, 셀룰로스 비드 등을 포함한 비드; 모세관; 유리 섬유 필터, 유리 표면, 금속 표면(강, 금, 은, 알루미늄, 규소 및 구리)을 포함한 평판 지지체; 다중웰 플레이트 또는 막(예: 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리비닐리덴디플루오라이드의 막)을 포함한 가소성 물질; 웨이퍼; 콤; 핀(즉, 조합적 합성 또는 분석에 적합한 핀의 정렬); 또는 필터 플레이트를 갖거나 갖지 않는, 웨이퍼(예: 실리콘 웨이퍼)와 같은 평면의 피트중의 비드가 포함된다.
질량 분광분석법
전사가 완결되면, RNA 전사체는, 예를 들어 분광분석적 기술(예: UV/VIS, IR, 형광분석법, 화학발광분석법 또는 NMR 분광분석법, 질량 분광분석법, 겔 전기영동 및 당해 기술 분야에 공지된 기타 방법, 또는 이들의 조합)을 포함한 다양한 방법으로 분석할 수 있다. 본원에서는 질량 분광분석법이 바람직하다. 질량 분광분석기 포맷에는 이온화(I) 기술[예: 매트릭스 보조된 레이저 탈착(MALDI), 연속또는 펄스 전기분무(ESI) 및 관련 기술(예: 이온분무(Ionspray) 또는 써모스프레이(thermospray))] 및 매씨브 클러스터 임팩트(massive cluster impact; MCI)가 포함되고, 이러한 이온 공급원은 선형 또는 리플렉트론 이동시보(TOF), 단일 또는 4중, 단일 또는 다중 마그네틱 섹터, 푸리에 변형 이온 사이클로트론 공명(Fourier Transform ion cyclotron resonance; FTICR), 이온 트랩 및 이들의 조합을 포함하는 검출 형식과 매치시켜 하이브리드 검출기(예: 이온 트랩/이동시보)를 수득할 수 있다. 이온화를 위해, 다수의 매트릭스/파장 조합법(MALDI) 또는 용매 조합(ESI)을 사용할 수 있다.
DNA 정렬의 제조
바람직한 양태에서, 핵산 프로모터 함유 프로브는 표적 핵산에 하이브리드화하기 전 또는 후에, 정렬된 포맷으로 고체 지지체의 표면에 고정화시킨다. 이러한 DNA 정렬을 형성하는데 특히 적합한 방법은 미국 특허원 제08/746,053호, 제08/787,639호 및 제08/786,988호에 기술되어 있는 것이다. 각각의 계류중인 이들 미국 특허원의 내용은 본원에서 이의 전문이 참조 문헌으로 인용되고, 다음과 같이 요약된다.
도 1은 진단적 장치에 의해 분석하기 위한 샘플 물질의 정렬을 제조하는 한가지 시스템을 도시한 것이다. 도 1은 데이타 처리기(12), 운동 제어기(14), 로봇식 암 어셈블리(16), 모니터 요소(18A), 중앙 처리 단위(18B), 공급물의 마이크로리터 플레이트(20), 스테이지 하우징(22), 로봇식 암(24), 스테이지(26), 압력 제어기(28), 도관(30), 탑재 어셈블리(32), 핀 어셈블리(38) 및 기판 요소(34)를 포함하는 시스템(10)을 도시한 것이다. 도 1에 나타낸 단면에서는, 로봇식 어셈블리(16)이 이동가능한 탑재 요소(40) 및 수평면 그루브(42)를 포함할 수 있음을 도시하고 있다. 로봇식 암(24)는 암(24)의 이동 범위를 증가시켜 암(24)가 공급 플레이트(20)상의 핀 어셈블리(38)에 위치할 수 있도록 핀(36) 부근에서 임의로 선회할 수 있다.
도 1에 도시한 데이타 처리기(12)는, 데이타를 처리하고, 로봇식 어셈블리(16)의 운동 및 작동을 조절하기 위한 정보를 제공하는 프로그램 지시를 실행하는데 적합한, IBM PC 호환 컴퓨터 시스템과 같은 통상적인 디지털 데이타 처리 시스템일 수 있다. 데이타 처리기 단위(12)는 로봇식 하우징(16)으로 통합되는 로봇식 어셈블리를 작동시키는 지시 시그날의 프로그램을 처리하는데 적합한 임의의 시스템 유형일 수 있다. 임의적으로, 데이타 처리기(12)는 로봇식 하우징(16)으로 통합되는 마이크로-조절되는 어셈블리일 수 있다. 선택적인 추가 양태에서, 시스템(10)은 프로그램할 필요가 없으며, 로봇식 어셈블리(16)의 작동 지시를 저장하는 펌웨어(firmware) 메모리를 갖는 단일 보드의 컴퓨터일 수 있다.
도 1에 도시한 양태에서, 데이타 처리기(12)와 로봇식 어셈블리(16) 사이에 전기적으로 커플링되어 있는 제어기(14)가 있다. 도시된 제어기(14)는 선택된 위치에 로봇식 암(24)를 위치시키기 위해 로봇식 어셈블리(16)의 모터 요소를 구동시키는 이동 제어기이다. 또한, 제어기(14)는 로봇식 어셈블리(16)에 지시하여, 압력 제어기(28)이 도시된 핀 어셈블리(38)의 개별적인 핀 요소로부터 배출되는 유체의 용적을 조절하도록 한다. 도시된 운동 제어기(14)의 디자인 및 작제는 전기 공학 분야에서 익히 공지된 원리에 따르며, 로봇식 어셈블리(16)을 구동하는데 적합한 임의의 제어기 요소라면 본원의 범주를 벗어나지 않으면서 사용될 수 있다.
도 1에 도시한 로봇식 어셈블리(16)은 제어기(14)와 전기적으로 커플링되어 있다. 도시된 로봇식 어셈블리(16)은 XY 평면 주위에 로봇식 암을 이동시키기 위한 XY 테이블을 포함하고, 추가로 XY 평면에 대해 직각인, 로봇식 암을 이동시키기 위한 Z축 작동기를 포함하는 갠트리 시스템(gantry system)이다. 도 1에 도시한 로봇식 어셈블리(16)은 XY 접근에 의해 한정되는 평면내에 있는 암을 이동시키는, XY 스테이지에 탑재되어 있는 암(24)를 포함한다. 도시된 양태에서, XY 테이블은 XY 평면에 대해 직각인 Z 축을 따라 전체 테이블을 이동시키기 위해 Z 작동기에 탑재되어 있다. 이러한 방식으로 로봇식 어셈블리는, 로봇식 어셈블리(16)이 탑재되어 있는 스테이지(26)상에 안착하는 것으로 도 1에 나타낸, 기판(34) 및 공급 플레이트(20)상의 임의의 위치에 핀 어셈블리(38)를 배치시키는 것을 허용하는 3°의 자유도를 제공한다.
도시한 로봇식 어셈블리(16)은 전기공학 분야에서 익히 공지되어 있는 원리를 따르며, 도시한 기판(34) 및 공급 플레이트(20)과 같은 공급 플레이트 및 기판 위로 핀 어셈블리를 이동시키는데 적합한 로봇식 어셈블리의 한가지 예이다. 따라서, 본원의 범주를 벗어나지 않으면서 본원의 상세한 설명에 따라 선택적인 로봇식 시스템을 사용할 수 있다.
도 1은 핀 어셈블리(38)에 연결되어 있는 마운트(32)에 도관(30)을 통해 연결되어 있는 압력 제어기(28)를 포함하는 로봇식 어셈블리의 양태를 도시한 것이다. 이러한 양태에서, 마운트(32)는 핀 어셈블리(38)에 도관(30)을 유동적으로 커플링시키기 위한 내부 채널을 갖는다. 따라서, 압력 제어기(28)은 도관(30) 및 마운트(32)에 의해서 핀 어셈블리(38)과 유동적으로 커플링된다. 이러한 방식으로, 제어기(14)는 압력 제어기(28)에 시그날을 보내어 핀 어셈블리(38)로 전달되는 유체 압력을 선택적으로 조절할 수 있다.
도 2는 압력 제어기(28)을 포함하는, 도 1에 도시한 시스템을 사용하여 실시하기에 적합한 핀 어셈블리(50)의 한가지 양태를 도시한 것이다. 도시한 양태에서, 핀 어셈블리(50)은, 내부 챔버 용적(58)을 한정하는 스크류(56A 및 56B)에 의해 함께 연결되어 있는 상부(52) 및 하부(54)로부터 형성되는 하우징을 포함한다. 도 2는, 내부 챔버 용적(58)을 유동적으로 밀봉하기 위해, 상위 블럭(52)과 하위 블럭(54) 사이에 위치하고 내부 챔버 용적(58)의 주변을 완전하게 둘러싸고 있는 O-환 개스킷(O-ring gasket)(60)으로서 도 2에 도시한 밀봉 요소를 하우징이 포함할 수 있음을 도시하고 있다. 도 2는 도시된 보유 챔버(64A 내지 64D)를 형성하기 위해 이를 통해 신장되는 축 공동을 각각 포함하는, 다수의 베지클(62A 내지 62D)를 핀 어셈블리(50)이, 포함하고 있음을 도시하고 있다. 도시한 베지클 각각은 하우징의 하위 블럭(54)내에 배치된 개별적인 개구(68A 내지 68D)를 통해 신장된다.
도시한 양태에서 추가로 나타낸 바와 같이, 베지클(62A 내지 62D) 각각은, 베지클과 하위 블럭(54) 사이에 유동 방지 밀봉을 형성하여 개구(68A 내지 68D)를 통해 유체가 통과하는 것을 방지하는 밀봉 요소(70A 내지 70D)와 반대로 위치한 상위 플랜지(flange) 부분을 갖는다. 밀봉을 단단하게 유지하기 위해, 도시한 핀 어셈블리(50)은, 도시된 양태에서 이의 각각의 밀봉 요소(70A 내지 70D)에 대하여 베지클(62A 내지 62D)의 플랜지 요소를 강제로 진행시키는 압축 상태에 있는 스프링과 같은, 도 2에 도시한 바이어스 요소(74A 내지 74D) 세트를 추가로 포함한다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 바이어스 요소(74A 내지 74D)는 베지클과 상위 블럭(52) 사이를 확장시킨다. 각각의 스프링(74A 내지 74D)는, 스프링 요소가 상위 블럭(52)에 부착될 수 있는 탑재 패드(76A 내지 76D)에 단단하게 탑재될 수 있다. 상위 블럭(52)는 개구(78)내에 회전가능하게 탑재될 수 있는 스웨이지록(swagelok)(80)을 수용하기 위한 나사모양의 공동을 포함하는, 중앙 배치된 개구로서 도 2에서 도시한 개구(78)을 추가로 포함한다.
도 2에서 추가로 도시한 바와 같이, 스웨이지록(80)은 도관에 의해, 압력 공급원과 커플링될 수 있는 도관(84)에 스웨이지록(80)을 연결시킬 수 있거나, 선택적으로 내부 챔버(58)을 통기시키기 위해 제공되는 도관(86)에 스웨이지록(80)을 커플링시킬 수 있는 밸브(82)와 결합된다. 중앙 공동(88)은 스웨이지록(80)을 통해 신장되고, 밸브(82)에 추가로 결합되는 배관 요소와 커플링되어 내부 챔버 용적(58)을 압력 공급원 또는 통기 배출구와 유동적 및 선택적으로 커플링시킨다.
위에서 기술하였고 도 2에서 도시한 핀 어셈블리(50)은, 기판(90)의 상부 표면에 에칭되어 있는 다수의 웰(92)를 포함하는, 상기한 기판 요소(90)에 배치되어 있다. 도 2에서 도시한 바와 같이, 베지클(62A 내지 62D)의 피치(pitch)는, 각각의 베지클이 기판(90)의 상부 표면에 에칭되어 있는 웰(92) 사이에 빠짐없이 위치한 다수의 피치 거리에 의해 인접한 베지클과 간격을 둔다. 하기의 설명으로부터 명백한 바와 같이, 이러한 간격은, 한번의 작동으로 유체가 다수의 웰로 분배될 수 있도록 유체의 병렬 분배를 촉진시킨다. 각각의 베지클은 스테인레스 강, 실리카, 중합체성 물질, 또는 유동 샘플을 보유하는데 적합한 다른 물질로부터 제조할 수 있다. 한가지 실시예에서, 경화된 구리베릴륨 및 니켈 플레이트상에 피복된 금으로부터 제조된 16개의 베지클을 어셈블리에서 사용한다. 베지클은 길이가 43.2㎜이고, 베지클의 축은 오목한 끝을 가지며 외경은 0.46㎜로 등급화되어 있다. 지시 정확도가 대략 501㎛가 될 수 있기 때문에 이러한 핀을 선택한다. 이로써 제한되지는 않지만 평면형, 성형, 오목형, 뾰족한 고체형, 뾰족한 반공동형, 한면 또는 양면에 각이 진 것 또는 기타 기하 모양을 포함하는 임의의 적합한 핀 유형을 장치에 사용할 수 있다.
도 3은 도 2에 도시한 핀 어셈블리(50)의 하위 블럭(54)의 측면 투시도를 나타낸 것이다. 도 3은 한개의 핀 어셈블리에 대한 대략적인 차원을 나타낸 것이다. 여기에 나타낸 바와 같이, 하위 블럭(54)는 기저판(98) 및 주변 쇼울더(100)을 갖는다. 기저판(98)은 두께가 대략 3㎜이고 쇼울더(100)는 두께가 대략 5㎜이다.
도 4는 도 2에 나타낸 핀 어셈블리(50) 사용에 적합한 한가지 하위 블럭(54)에 대한 일반적인 구조 및 차원의 오버헤드 투시도를 나타낸 것이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 하위 블럭(54)는 베지클을 수용하기에 적합한, 각각 16개의 개구를 제공하는 개구(68)의 4×4의 매트릭스를 포함한다. 도 2에서 상기한 바를 참조하면, 개구(68) 사이의 간격은 통상 공급 플레이트의 웰뿐만 아니라 기판 표면상의 웰 사이에 빠짐없이 위치한 다수의 거리이다. 따라서, 도 4에서 도시한 바와 같은 하위 블럭(54)를 갖는 핀 어셈블리는 유체를 동시에 16웰까지 분배할 수 있다. 도 4는 또한, 블럭(54)의 각 측면의 길이가 일반적으로 22㎜이고, 개구(68) 사이의 피치가 약 4.5㎜인 한가지 하위 블럭(54)의 일반적인 차원을 나타낸다. 이러한 피치는, 도 2의 기판(90)에 의해 예시되는 바와 같이, 유체가 대략 500㎛ 간격의 위치로 분배되는 기판에 사용하기에 적합하다. 도 4는 또한 하위 블럭(54)가 도 2에서 도시한 밀봉 요소(60)과 같이, O-환 밀봉 요소를 수용하기에 적합한 임의의 O-환 그루브(94)를 포함할 수 있음을 나타낸다. 이러한 그루브 요소(94)는 밀봉 요소(60)에 의해 형성되는 유체 밀봉을 향상시키고 개선시킬 수 있는 것으로 이해된다.
핀블럭은 스테인레스 강이 약 +25㎛로 정확하게 드릴링될 수 있기 때문에 이로부터 제조할 수 있지만, G10 라미네이트, PMMA 또는 다른 적합한 물질과 같이 다양한 프로브 물질을 또한 사용할 수도 있다. 핀 블럭은 개구를 임의의 수로 포함할 수 있으며, 이는 16개의 핀을 제자리에 고정화시키는 16개의 리셉터클(receptacle)을 갖는다. 각 핀의 지시 정확도를 증가시키기 위해, 임의의 정렬을 블럭 아래에 위치시켜, 미세역가 플레이트의 웰로 침지될 수 있도록 핀 끝의 약 6㎜를 노출시킨다. 도시한 장치에서의 프로브의 설계는 384웰의 미세역가 플레이트와 조화되도록 디자인하여 프로브의 중앙 대 중앙의 간격은 4.5㎜이다. 4×4 프로브 정렬이 담당자에 의해 사용되는 MALDI TOF MS의 xy 스테이지의 이동 범위인 1제곱인치 미만으로 조정되는 정렬을 생성하므로 이를 선택한다. 핀장치 어셈블리는 로봇의 Z-암에 부착되어 있는 장치의 윗면을 스테인레스 강 커버로 덮어서 완성한다.
도 1 및 2를 참조하면, 로봇식 어셈블리(16)은 도 2에서 도시한 핀 장치 어셈블리(50)과 유사하게 구성되어 있는 핀 장치 어셈블리(38)을 사용한다. 압력 제어기(28)은 챔버(58)내의 압력을 선택적으로 조절한다. 이러한 양태에서, 조절 프로그램은 데이터 처리기(12)상에서 작동하여, 로봇식 어셈블리(16)이 기판(34)상에 요소 정렬을 인쇄하는 방식으로 로봇식 어셈블리(16)을 조절한다. 제1 단계에서(도 2 및 5를 또한 참조한다), 프로그램은 핀 어셈블리(38)이 이동하여 공급 플레이트(20)상에 배치되도록 로봇식 어셈블리(16)에 지시한다. 이어서, 로봇식 어셈블리(16)은 384웰 DNA 공급 플레이트일 수 있는 공급 플레이트(20)에 핀 어셈블리를 침지시킨다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 핀 어셈블리는, 핀 어셈블리(50)이 16개의 핀이 384웰 DNA 공급 플레이트(20)의 상이한 16웰로 침지되는, 16개의 상이한 핀을 포함할 수 있다. 이어서, 데이타 처리기(12)는 로봇식 어셈블리(16)을 작동시키도록 운동 제어기(14)에 지시하여 기판(34)의 표면상의 위치로 핀 어셈블리를 이동시킨다. 기판(34)는 물질 샘플을 수용하기에 적합한 임의의 기판일 수 있고, 실리콘, 플라스틱, 금속, 또는 임의의 다른 적합한 물질로부터 형성될 수 있다. 임의로, 기판은 평면을 가질 수 있지만, 선택적으로 함몰된 표면, 웰로 에칭된 표면 또는 다른 적합한 표면 형태를 포함할 수 있고, 추가로 각각의 웰 표면에 비드를 포함하는 표면을 포함할 수 있다. 데이타 처리기(12)에서 작동하는 프로그램은 운동 제어기(14)를 통해 로봇식 어셈블리가 압력 제어기(28)에 지시하여 내부 챔버 용적(58)내에 정압을 생성하도록 지시할 수 있다. 이러한 실시에서, 내부 정압은 베지클으로부터 유체를 배출시키기 위해 베지클의 보유 챔버(62)로부터 유체를 강제로 배출시키고 기판(90)의 각각의 웰(92)로 이를 도입시킨다.
데이타 처리기(12)에서 작동하는 프로그램은, 제어기(14)가 압력 제어기(28)을 조절하여 공급 플레이트(20)으로부터의 공급 물질로 보유 챔버를 충전시키는 것을 조절하도록 제어기(14)에 지시할 수 있다. 압력 제어기(28)은 핀 어셈블리의 내부 챔버 용적(58)내에 음압을 생성할 수 있다. 이는 유체가 베지클(62A 내지 62D)의 보유 챔버내로 배출되도록 한다. 압력 제어기(28)은 개방형 루프 또는 폐쇄형 루프 조절에 의해 압력을 조절하여 유체가 보유 챔버를 통해 배출되어 내부 챔버 용적(58)로 유출되는 것을 방지할 수 있다. 압력 조절용 루프 제어 시스템은 당해 분야에서 익히 공지되어 있으며, 임의의 적합한 제어기를 사용할 수 있다. 이러한 유출은, 특히 공급 플레이트(20)으로부터 배출되는 공급 물질이 웰마다 상이한 경우에 교차 오염을 야기시킬 수 있다.
또다른 양태에서, 각각의 보유 챔버(64A 내지 64D)는 충분히 작아서 모세관 작용에 의해서 챔버를 충전시킬 수 있다. 상기한 실시에 있어서, 핀 어셈블리는 하위 블럭(54)의 개구를 확장시키는 스테인레스 강 니들과 같은 협소한 공동의 니들 정렬을 포함할 수 있다. 공급액에 침지되어 있는 니들은 모세관 작용으로 충전된다. 한가지 실시에 있어서, 대기압에서 충전되는 모세관의 길이는 대략 다음식으로 계산한다.
상기식에서,
H는 높이이고,
감마는 표면 장력이고,
P는 용액 밀도이고,
G는 중력이며,
R은 니들 반경이다.
따라서, 각각의 베지클에 의해 보유되는 유체의 용적은 내부 공동의 치수를 선택하여 조절할 수 있다. 실온에서, 물은 반경이 100㎛이고 길이가 15㎝인 모세관을 충전시키는 것으로 이해된다. 따라서, 공동이 작은 나노리터 용적의 니들의 용량을 충분히 충전시키더라도 이를 초과해서는 안 되는데, 왜냐하면 니들 구멍의 상부에 메니스커스(meniscus)를 형성하기에는 모세관력이 너무 작기 때문이다. 이는 유출에 기인하는 교차 오염을 방지한다. 한가지 양태에서, 상이한 용적의 유체를 보유하고 분배하기 위해 크기가 다양한 내부 챔버를 갖는 핀 어셈블리의 베지클이 제공될 수 있다.
다른 실시에 있어서, 베지클의 보유 챔버로 배출되는 액체의 용적을 감소시키기 위해, 압력 제어기(28)에 의해 낮은 정압을 내부 챔버 용적에 제공할 수 있다. 정압에 의해 생성되는 하향력은 상향 모세관력을 되받아치는데 사용할 수 있다. 이러한 방식으로, 모세관력에 의해 베지클의 보유 챔버내로 배출되는 유체의용적을 조절할 수 있다.
도 5B는 니들의 보유 챔버내에 있는 유체가, 스웨이지록(80)을 통해 신장되는 중앙 공동(88)을 통하여 도입된 낮은 정압에 의해 분배될 수 있음을 나타낸다. 내부 챔버 용적(58)로 도입되는 압력 펄스를 조절함으로써, 유체를 분무물로서 배출시키거나 또는 니들 끝에서 적가물을 형성시켜 배출시킬 수 있다. 분무물에 대한 적가물의 분배율은 압력 제어기(28)에 의해 적용되는 압력에 일부 좌우되는 것으로 이해되고 있다. 한가지 실시에 있어서, 압력은 대기압의 10 내지 1,000Torr의 범위로 적용시킨다.
이러한 목적으로, 데이타 처리기(12)는 분배되는 유체의 용적을 제어하고 조절하는 컴퓨터 프로그램을 작동시킬 수 있다. 프로그램은, 분무물을 생성시키거나, 베지클의 말단에 위치하고 유체를 분배하기 위한 기판 표면과 접촉될 수 있는 적가물을 형성시킴으로써 한정된 용적의 유체를 배출시키도록 제어기(28)에 지시할 수 있다.
도 5C 및 5D는, 이전의 위치로부터 옵셋 인쇄되는 기판 표면상의 위치에서, 도 5A 및 5B에서 나타낸 이전 단계를 다시 수행할 수 있음을 나타낸다. 도시한 공정에 있어서, 핀 장치는 2개의 웰(92)사이의 거리와 동일한 거리로 옵셋 인쇄된다. 다른 옵셋 인쇄 기술을 사용할 수도 있다.
도 2에서 도시한 핀 어셈블리는 몇몇 잇점이 수득된다. 예를 들어, 단일 또는 다수의 핀 충전과 세정액으로의 세정만이 요구되는 세정이 분배 공정 사이에 바로 수행된다. 더욱이, 모든 보유 챔버가 용량을 충전시키기에 충분하기 때문에,분배되는 용적의 정확도는, 핀을 제조하는 동안에 주의깊게 조절할 수 있는 니들 내경에 의해서만 변화된다. 또한 니들로 인해 비용이 증가되게 되지만, 본 발명의 경우에는 니들과 표면과의 접촉이 요구되지 않아 니들이 낮은 물리적 변형 또는 응력에 노출되므로 대체율이 낮아지고 수명이 길어지기 때문에 상기 장치는 비용이 저렴하다.
선택적으로, 고체 지지체 표면상에 샘플 물질을 침착시키는 것은, 로봇식 어셈블리가 핀 어셈블리의 고체 핀 요소를 샘플 물질의 공급원에 침지시켜 핀의 말단을 샘플 물질로 습윤시키는, 블럭으로부터 신장되는 고체 핀 요소를 갖는 핀 장치 어셈블리를 사용하는 기술을 포함할 수 있다. 후속적으로, 로봇식 어셈블리는 핀 어셈블리를 표면위의 위치로 이동시킨 다음, 핀 어셈블리를 기판 표면에 대해 하위로 이동시켜 개개의 습윤화된 핀을 기판 표면의 물질 스팟팅용 표면과 접촉시킬 수 있다.
프로모터 함유 핵산이 고정되어 있는 고체 핀을 갖는 핀 장치 어셈블리는, 하이브리드화 및/또는 RNA 전사체 생성을 위한 반응 혼합물을 함유하는 웰로 침지시킬 수 있다. 전사체를 갖는 액체는, 예를 들어 기판 표면상에 샘플을 스팟팅하는 핀 장치 어셈블리의 고체 핀을 사용함으로써, 상기 논의한 바와 같은 정렬로 침착시킬 수 있다.
도 6A 및 6B는 물질을 기판 표면으로 또는 표면상에 분배하기 위한 다른 선택적인 시스템을 도시한 것이다. 특히, 도 6A는 모세관 요소(112), 변환기 요소(114) 및 공동(118, 나타내지 않음), 유체 도관(122), 및 로봇식 암 어셈블리(도 1에서 도시한 로봇식 암(24))에 연결된 마운트(124)를 포함하는 젯 프린트 장치(110)를 도시하고 있다. 도 6A에서 또한 나타낸 바와 같이, 젯 어셈블리(110)은 샘플 물질을 표면(128)에 분배하기 위해, 샘플 물질의 일련의 적가물(120)을 공동(118)로부터 배출시키는데 적합하다.
젯 어셈블리(110)의 모세관(112)는 유리 모세관, 플라스틱 모세관, 또는 유체 샘플을 운반할 수 있고 유체 샘플을 변환기 요소(예: 변환기 요소(114))의 작용에 의해 배출시키는 임의의 다른 적합한 하우징일 수 있다. 도 6A에서 도시한 변환기 요소(114)는, 모세관(112)의 대략적인 파라미터를 형성하고 로봇식 어셈블리(16)내에 있는 펄스 생성기로부터 수용되는 전기적 펄스를 변형시켜 모세관(112)의 공동(118)으로부터 유체를 배출시킬 수 있는 압전기 변환기 요소이다. 압전기 변환기 요소를 갖는 이러한 젯 어셈블리는 마이크로파브 테크놀로지 인코포레이트(MicroFab Technology, Inc.; Germany)가 제조하고 있다. 그러나, 압전기 변환기, 전기 변환기, 전기제한적 변환기, 전자제한적 변환기, 전기기계적 변환기, 또는 임의의 다른 적합한 변환기 요소를 사용하는 것을 포함하여, 한정되고 조절된 용적의 유체를 분배하는데 적합한 어떠한 젯 어셈블리도 본 발명에 사용할 수 있다. 도시한 양태에 있어서, 모세관(112)는 유체를 수용하는 유체 도관(122)를 갖는다. 한가지 임의 양태에 있어서, 공동(188)이 유체 공급원내에 침수되는 경우, 유체는 이를 배출시키는 진공 압력의 작용에 의해 공동(118)로부터 모세관내로 배출된다. 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 젯 어셈블리(110)의 다른 양태를 본 발명에서 실시할 수 있다.
도 6B는 도 1에서 도시한 어셈블리(16)과 같은 로봇식 어셈블리의 로봇식 암에서 수행하기에 적합한 또다른 선택적인 어셈블리를 도시하고 있다. 도 6B는 서로 연결되어 있는 4개의 젯 어셈블리(130A 내지 130D)를 도시하고 있다. 도 2의 핀 어셈블리와 유사하게, 도 6B에서 도시한 젯 어셈블리는 유체를 병렬로 분배하는데 사용할 수 있다. 젯 어셈블리(130A 내지 130D) 각각은 서로 독립적으로 작동하여 젯 어셈블리 중 하나를 선택함으로써 유체를 선택적으로 분배할 수 있다. 더욱이, 젯 어셈블리(130A 내지 130D) 각각은 어셈블리(130A 내지 130D)중 각각 하나로부터 분배되는 유체 용적을 선택하기 위해 독립적으로 조절할 수 있다. 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 도 6B에서 도시한 어셈블리에 대해 다른 변형 및 변화를 실시할 수 있다.
상기 논의한 기술중 어느 하나에 따라서 기판 표면상에 정렬을 형성시킬 수 있다. 질량 분광분석법에 의해 샘플 정렬을 분석한 다음, 정렬된 샘플 조성의 대표적인 스펙트럼 데이타를 수집한다. 상기한 방법은 한정되고 조절된 용적의 분석 물질을 신속하게 분배하는 공정을 제공하는 것으로 이해된다. 특히, 이러한 공정은 나노리터 용적 이하의 유체 분배를 가능하게 한다. 이러한 적은 용적의 침착 기술은 질량 분광분석에 의한 분석에 매우 적합한 샘플 정렬을 생성시킨다. 예를 들어, 적은 용적은 증발율, 및 대기 조건(예: 주위 온도 및 광)에 대한 의존성 감소와 같은 스팟 특성의 재현성을 생성한다.
도 5에 나타낸 샘플에 대해 계속 설명하면, 상이한 서열 및 농도의 올리고뉴클레오타이드(0.1 내지 50ng/㎕)를 96웰의 미세역가 공급 플레이트(20)의 웰로 적하시킴으로써 정렬을 준비할 수 있고, 제1 웰은 고정 매트릭스 용액을 보유하도록 준비할 수 있다. 함몰된 실리콘 칩 기판과 같은 기판(34)를 로봇식 어셈블리(16)의 스테이지(26)상에 위치시키고 수동으로 정렬시켜 관련 축의 셋트 부근에 웰의 매트릭스를 배향시킬 수 있다. 데이타 처리기(12)에서 실행되는 조절 프로그램은 공급 플레이트(20)의 제1 웰의 좌표를 수신할 수 있다. 로봇식 암(24)는 16개의 핀 각각이 한개의 웰에 침지되도록 핀 어셈블리(38)을 공급 플레이트(20)내에 침지시킬 수 있다. 보유 챔버의 전체 용적이 유체를 함유하도록 각각의 베지클은 모세관 작용에 의해 충전시킬 수 있다. 임의로, 데이타 처리기(12)에서 실행되는 프로그램은, 부분적으로 모세관 작용력에 반대로 작용하여, 보유 챔버로 배출되는 유체의 용적을 제한하거나 감소시키는 바이어스 정압으로 핀 어셈블리(38)의 내부 챔버(58)을 충전시키도록 압력 제어기에 지시할 수 있다.
임의로, 핀 어셈블리(38)을 공급 플레이트(20)의 동일한 16웰내로 침지시켜 제2 표적 기판에 스팟팅할 수 있다. 이러한 순환 주기는, 경우에 따라 다수의 표적 기판상에서 반복할 수 있다. 이어서, 로봇식 암(24)는 핀 어셈블리(38)을 세정액에 침지시킨 다음, 핀 어셈블리를 공급 플레이트(20)의 상이한 16웰로 침지시키고, 16개 스팟의 초기 셋트로부터 일정 거리에 있는 기판 표적상에 스팟팅시킬 수 있다. 경우에 따라, 다수의 표적 기판에 대해 이를 반복할 수 있다. 전체 순환 주기를 반복하여 각각의 베지클으로부터 2×2 정렬을 형성하여 스팟의 8×8 정렬을 생성할 수 있다(2×2 요소/베지클×16베지클=총 64개의 스팟팅된 요소). 정렬을 형성하는데 적합한 임의 공정을 사용할 수 있다.
상이한 서열 및 농도의 올리고뉴클레오타이드는 3개 이하의 상이한 384웰 미세역가 공급 플레이트의 웰로 적하시킬 수 있는데, 16웰의 한 셋트는 매트릭스 용액용으로 준비할 수 있다. 2개의 플레이트의 웰은 세정액으로 충전시킨다. 5개의 미세역가 플레이트는 로봇식 어셈블리(16)의 스테이지상에 적하시킬 수 있다. 다수의 표적 기판은 스테이지(26)상에 배치된 뱅킹(banking) 또는 기록 핀의 임의의 한 세트에 인접하게 위치시켜 한 세트의 관련 축을 따라 표적 기판의 배열을 제공할 수 있다. 매트릭스 및 올리고뉴클레오타이드를 미리 혼합하지 않는 경우, 핀 어셈블리를 사용하여 목적하는 모든 표적 기판상에 매트릭스 용액을 먼저 스팟팅시킬 수 있다. 후속적인 단계에서, 매트릭스를 재용해시키기 위한 매트릭스 물질로서 올리고뉴클레오타이드 용액을 동일한 패턴으로 스팟팅시킬 수 있다. 선택적으로, 올리고뉴클레오타이드 용액을 먼저 웨이퍼상에 위치시킨 다음, 매트릭스 용액이나 또는 미리 혼합한 매트릭스와 올리고뉴클레오타이드 용액을 위치시켜 샘플 정렬을 생성할 수 있다.
기판의 표면상에 샘플 정렬을 침착시킨 후, 다양한 수단(예: 분광분석적 기술, 예를 들어 UV/VIS, IR, 형광분석법, 화학발광분석법, NMR 분광분석법 또는 질량 분석분광법)을 사용하여 정렬을 분석할 수 있다. 예를 들어, 분배 공정 후에, 샘플이 적하된 기판을 MALDI-TOF 공급 플레이트상에 위치시켜 경사진 스크류가 탑재된 폴리카보네이트 지지체 셋트와 함께 이를 고정화시킨다. 한가지 실시에 있어서, 이동시보 질량 분광분석기의 공급 영역에 1㎛의 해상도 및 1" 이동 xy 스테이지(뉴포트; Newport)상에 고정될 프로브의 말단으로 플레이트를 이동시킬 수 있다.
본원에서 기술한 정렬과 함께 사용하기에 바람직한 질량 분광분석기 형식에는, 매트릭스 보조된 레이저 탈착(MALDI), 연속 또는 펄스 전기분무(ESI) 및 관련 기술(예: 이온분무 또는 써모스프레이)이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는 이온화(I) 기술 또는 매씨브 클러스터 임팩트(MCI)가 포함되고, 이러한 이온 공급원은 선형 또는 비선형 리플렉트론 이동시보(TOF), 단일 또는 4중, 단일 또는 다중 마그네틱 섹터, 푸리에 변형 이온 사이클로트론 공명(FTICR), 이온 트랩 및 이들의 조합(예: 이온 트랩/이동 시보)을 포함하는 검출 형식과 매치시킬 수 있다. 이온화의 경우, 다수의 매트릭스/파장 조합법(MALDI) 또는 용매 조합(ESI)을 사용할 수 있다. 아토몰 미만의 단백질 수준은, 예를 들어 ESI[참조 문헌: Valaskovic, G, A. et al., (1996) Science 273: 1199-1202] 또는 MALDI[참조 문헌: Li, L. et al., (1996) J. Am. Chem. Soc 118: 1662-1663]를 사용하여 검출한다.
따라서, 본원에서 기술한 공정에서는, 완전 비접촉의 고압 분무 또는 부분 접촉의 저압 적가물 형성 형식을 사용할 수 있는 것으로 이해된다. 후자의 경우, 접촉은 단지 적가물과 웰의 벽 또는 기판(34)의 친수성 평면 사이에서만 발생한다. 어떠한 실시에서도, 니들 끝과 표면 사이의 접촉은 필요하지 않다.
실시적 양태
한가지 바람직한 양태에서, 프로모터 서열을 암호화하는 이본쇄 핵산 서열은 천연 공급원(예: 박테리아, 바이러스, 박테리오파지, 식물 및 진핵 유기체)으로부터 분리시키거나 합성 서열로부터 어셈블리한다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된표준 방법을 사용하여 암호화 쇄의 3'-말단에 뉴클레오타이드가 5개 이상인 일본쇄 영역을 형성한다[참조 문헌: Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. 이러한 일본쇄 영역은 서열화될 핵산 영역에 상보적이거나 2개의 핵산 분자 사이에 공유되는 서열(예: 제한 엔도뉴클레아제 부위)에 상보적이도록 디자인한다.
적어도 부분적으로 일본쇄 3'-말단을 포함하는 서열화될 핵산은 본원에서 상기한 조건, 바람직하게는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 매우 엄격한 조건에 따라서 하이브리드화시켜, 프로모터 함유 DNA의 상보적인 서열과 함께 5개의 연속적인 매칭 염기쌍을 형성시킨다. 서열화될 핵산은 이본쇄일 수 있지만, 일본쇄가 바람직하다. 2개의 핵산 분자의 하이브리드화는 인접 핵산 분자의 결합점(들)에서 하이브리드중에 "닉"을 하나 이상 도입시킨다. 암호화 또는 비암호화 쇄, 바람직하게는 암호화 쇄에서의 닉은 전사를 개시하기 전에 적절한 핵산 리가제를 가하여 연결시킬 수 있다. 핵산을 연결시키는 방법은 당해 기술 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있으며[참조 문헌: Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York], DNA 및 RNA 리가제는 시판되고 있다[예: 베링거 만하임].
전사는 본원에서 상기하였고 익히 공지되어 있는 조건에 따라, 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에 적절한 RNA 폴리머라제를 가함으로써 프로모터로부터 개시된다[참조 문헌: RNA Polymerase and the Regulation of Transcription, Reznikoff et al., eds, Elsevier, NY]. 바람직한 양태에서, 전사 혼합물은 선택된 염기 특이적 쇄 종결 3'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트, 및 RNA 생성물의 2차 구조를 감소시키는 이노신 5'-트리포스페이트 또는 RNA 폴리머라제 효소의 턴오버를 촉진시켜 분석에 이용할 수 있는 RNA 전사체의 양을 증가시키기 위한 변형된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(예: 4-티오 UTP, 5-브로모 UTP 또는 5'-요오도 CTP)를 포함한다.
바람직한 양태에서, 핵산 프로모터 함유 프로브는 아미노 작용 그룹으로 지지체를 작용화시켜[예를 들어, 3-아미노프로필-트리에톡시실란(알드리히 케미칼 캄파니; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)과 같은 시약을 사용하여 지지체를 유도체화시켜, 도 7 참조] 실리카 지지체상에 공유적으로 고정화시킨다. 다른 작용화된 옥시실란 또는 오르토실리케이트를 사용할 수 있는데 이는 시판되고 있다(겔레스트 인코포레이티드; Gelest, Inc., Tullytown, PA). 예를 들어, 3-머캅토프로필-트리에톡시실란을 사용하여 실리콘 표면을 티올 그룹으로 작용화시킬 수 있다. 이어서, 아미노 작용화된 실리카를 헤테로이작용성 시약[예: N-석신이미딜(4-요오드아세틸)아미노벤조에이트(SIAB)(피어스; Pierce, Rockford, IL)]과 반응시킬 수 있다. 사용할 수 있는 다른 호모- 및 헤테로-이작용성 시약은, 예를 들어 피어스가 시판하고 있다. 최종적으로, 핵산 분자의 티올 작용 그룹과 지지체의 요오도아세틸 작용 그룹과의 반응에 의해, (예를 들어 5'-말단에서) 티올 그룹으로 작용화된 핵산을 유도체화된 실리카 지지체에 공유 결합시킨다.
특정 양태에서, 핵산을 가교결합제와 반응시켜 가교결합제/핵산 접합체를 형성한 다음, 작용화된 지지체와 반응시켜 고정화된 핵산을 제공한다. 선택적으로, 가교결합제를 한 용기내에서 핵산 및 작용화된 고체 지지체와 함께 혼합하면 핵산 및 고체 지지체와 가교결합제와의 실질적인 동시 반응을 제공할 수 있다. 이러한 양태에서는, 일반적으로 헤테로이작용성 가교결합제, 즉 핵산 및 작용화된 고체 지지체 각각과 선택적으로 반응할 수 있는 2개의 상이한 반응성 작용 그룹을 갖는 가교결합제를 사용할 필요가 있다.
본원에서 기술한 방법을 실시한 후, RNA 폴리머라제를 사용하여 핵산을 서열화하기에 적합한, 불용성 지지체상에 고정화시킨 핵산의 공간적 어드레스가능한 정렬(spatially-addressable array)을 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 정렬로 배열된 핀상에 고정화되는 상이한 핵산 정렬을 제공하는데 사용할 수 있다. 다른 양태에서, 불용성 지지체상의 광 분해가능한 보호 그룹은, (예를 들어 사진석판에 의해) 선택적으로 분해되어 핵산을 고정하기 위한 활성화된 표면의 일부를 제공할 수 있다. 예를 들어, 티올 그룹을 제공하도록 3-머캅토프로필-트리에톡시실란으로 처리하여 변형시킨 실리콘 표면은, 광 분해가능한 보호 그룹[광 분해가능한 보호 그룹의 예는 다음 문헌을 참조한다, 참조 문헌: PCT 국제 공보 제WO 92/10092호, 또는 McCray et al. (1989) Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18: 239-270]으로 차단시킬 수 있고, 예를 들어 사진석판 마스크를 사용하여 표면의 선택된 영역을 조사시킴으로써 선택적으로 탈차단시킬 수 있다. 티올 반응성 그룹을 함유하도록 변형시킨 핵산 프로모터 함유 프로브는 지지체에 직접 부착시키거나, 선택적으로 티올 반응성 가교결합제를 티올 변형된 지지체와 반응시킨 다음(또는 실질적으로 이와 동시에), 핵산과 반응시켜 고정화된 핵산을 제공한다. 본원에서 기술한 방법에 따라서 지지체상에 일단 고정화된 핵산 염기 또는 서열은 공지된 방법에 따라서 추가로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 조합 기술을 포함한 통상적인 기술에 따라서 고상 핵산 합성을 수행함으로써 신장시킬 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 하나 이상의 황원자를 통해 불용성 지지체 표면에 공유 결합되는데, 즉 핵산은 하나 이상의 황원자를 포함하는 링커 잔기를 통해 표면에 공유 결합된다. 이러한 공유 결합된 핵산은 본원에서 기술한 방법에 의해 용이하게 생성된다. 바람직한 양태에서, 공유 결합된 핵산은 불용성 지지체 표면에서 약 20fmol/㎟ 이상, 보다 바람직하게는 약 75fmol/㎟ 이상, 여전히 보다 바람직하게는 약 85fmol/㎟ 이상, 더욱 바람직하게는 약 100fmol/㎟ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 약 150fmol/㎟ 이상의 밀도로 존재한다.
적용
본원에서 기술한 핵산의 서열화 방법은 다양한 최종 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 돌연변이(변이, 역위, 결실, 삽입 등)를 확인하기 위한 진단 적용에 사용할 수 있다. 본 방법은 또한 다수의 유전자 질환 진단을 돕는데 사용할 수 있고, 혈통, 또는 조직 또는 기관의 적합성을 유전적으로 스크리닝하거나 결정하는데 사용할 수 있다.
서열화 방법은 공지된 표적 핵산에서 유전자 변화의 존재 여부를 측정하기 위한 진단 적용에 사용할 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산 영역은 PCR과 같은 표준 방법 또는 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 다른 증폭 방법을 사용하여 증폭시킬 수 있다[참조 문헌: Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. 증폭된 핵산은 변성시켜 서열화될 쇄(비암호화 쇄)를 분리시키거나, 또는 이본쇄 분자로서 사용할 수 있다.
공지된 표적 핵산에서의 유전자 변화의 존재는, 표적 핵산을 생물학적 샘플로부터 분리시키고 표적을 프로모터 함유 포획 프로브와 하이브리드화하여 프로모터 함유 주형을 생성시킴으로써 진단 적용시 측정한다. 한벌의 RNA 전사체 세트를 생성하고 표적 핵산의 서열을 결정하고, 이를 야생형 서열과 비교하여 표적 핵산에서 유전자 변화가 발생하였는지를 측정한다. 유전자 변화의 존재는 당해 기술 분야에서 공지된 다른 방법에 의해 RNA 전사체로부터 측정할 수 있다[참조 문헌: 미국 특허 제5,605,798호 및 PCT 국제 공보 제WO 98/20019].
전사 터미네이터 서열의 확인 방법
여기에서는 지금까지 공지되지 않았던 전사 터미네이터 및 어태뉴에이터 서열을 확인하는 방법을 또한 제공한다. 전사 터미네이터 서열은 RNA 연장의 서열 특이적 정지를 책임지며, 다양한 유기체로부터의 터미네이터 서열이 언급되어 있다. 예를 들어, 박테리아 rho 비의존적 터미네이터 서열은 수개의 염기쌍과 이에 따르는 5 내지 10nt의 폴리 T 신장체로 구별되는 2개의 역전된 반복체를 갖는다. 이들 서열을 통해 전사가 수행되면, 생성된 mRAN 전사체는 RNA 폴리머라제 분자 뒤에서 RNA 헤어핀 스템-루프 2차 구조를 형성하여 RNA 폴리머라제의 진행 중단을 증가시키고/시키거나 RNA 폴리머라제-DNA 주형의 상호작용을 불안정화시켜 DNA 폴리 T 신장체내에서 전사를 종결시킨다[참조 문헌: Wilson and von Hippel (19; Reynolds et al. (1992a) J. Mol. Biol. 224: 53-63; Reynolds et al. (1992b) J. Mol. Biol. 224: 31-51; Telesnitsky et al. (1989) Biochemistry 28: 5210-5218; d'Aubenton Carafa et al. (1990) J. Mol. Biol. 216: 835-858].
박테리아 rho 의존적 터미네이터는 전통적인 역전된 반복 스템-루프 구조가 결여되어 있어서 전사를 정지시키는데 추가의 인자(예: rho 단백질)를 필요로 한다[참조 문헌: Schmidt et al. (1984) J. Mol. Biol. 259: 15000-15002]. rho 의존적 종결은 전사와 해독이 커플링되지 않을 경우에 박테리아 종에서 미숙한 종결을 생성하는 것으로 여겨진다.
본원에서 기술한 표준 전사 조건을 변형시킴으로써, 질량 분광분석법을 사용하여 전사 터미네이터 서열, 즉 rho 의존적 및 rho 비의존적 터미네이터를 확인할 수 있다. 이 방법을 수행하는데 있어서, 서열화될 핵산의 3'-말단의 일본쇄 영역은 프로모터 함유 핵산 프로브의 암호화 쇄의 3'-말단에 있는 상보적인 서열과 하이브리드화한다. 바람직한 양태에서, 프로모터 함유 핵산을 비암호화 쇄의 5'-말단 또는 암호화 쇄의 3'-말단을 통해 고체 지지체와 공유적으로 커플링시키고, 보다 바람직한 것은 아미노실란 처리된 고체 지지체에 고밀도로 연결된 5'- 또는 3'-티올화 DNA이다. 연결은 링커 그룹의 존재 또는 부재하에 수행할 수 있으며, 바람직하게는 정렬 포맷으로 배열시킨다.
전사는 터미네이터 서열과 같이, RNA 폴리머라제 종결 효율을 증가시키는 변형된 RNA 트리포스페이트 유사체(예: 4-티오 UTP, 5-브로모 UTP 또는 5'-요오도CTP)의 존재 또는 부재하에 개시된다. 특이적으로 종결된 RNA 전사체의 양은, 관찰되는 RNA의 양이 전사의 터미네이터 의존적 정지 위치를 나타내는 질량 분광분석법으로 검출할 수 있다. 수개의 개별적인 지놈 위치로부터 전사 종결 위치 바로 앞의 서열의 정렬을 비교함으로써, 이전까지는 공지되지 않았던 터미네이터 서열을 상이한 RNA 폴리머라제에 대해 확인할 수 있다.
특정 양태에서, 서열화될 핵산의 하이브리드화로부터 생성되는 하나 이상의 쇄중의 닉은, 전사를 개시하기 전에 적절한 핵산 리가제(예: DNA 또는 RNA 리가제)를 가하여 연결시킬 수 있다.
본 발명은, 단지 추가로 예시하는 의도이고 본 발명을 한정하지는 않는 하기 실시예에 의해 또한 설명될 것이다. 본 특허원을 통해 인용되는 모든 참조 문헌(참조 문헌, 허여된 특허, 공개된 특허 공보 및 계류중인 특허원을 포함)의 전문은, 본원에서 명백히 참조 문헌으로 혼입된다.
실시예 1
실리콘 웨이퍼로 핵산의 고밀도 부착
재료 및 방법:
별도의 언급이 없는 한 모든 시약은 알드리히 케미칼(Aldrich Chemical; Milwaukee, WI)로부터 입수한다.
실리콘 표면 제조:
실리콘 웨이퍼는 에탄올로 세척하고 분젠 버너상에서 연소시키고, 3시간 동안 톨루엔중의 25%(용적) 3-아미노프로필트리에톡시실란의 무수 용액에 침지시킨다. 실란 용액을 제거한 다음, 웨이퍼는 톨루엔으로 3회 세척하고 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 3회 세척한다. 이어서, 웨이퍼는 무수 DMSO중의 10mM N-석신이미딜 (4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB)[피어스 케미칼(Pierce Chemical); Rockford, IL] 무수 용액중에서 항온처리한다. 반응을 수행한 후, SIAB 용액을 제거하고, 웨이퍼는 DMSO로 3회 세척한다.
웨이퍼의 고체 지지체상에서 SIAB 및 아미노 그룹의 축합을 모니터하는 것이 불가능하기 때문에, 최적 반응 시간을 측정하기 위해서는 반응을 용액중에서 수행한다. 2가지 출발 물질을 분리시킬 수 있는 박층 크로마토그래피(TLC)[254㎚의 형광 지시제를 갖는 유리 배면 실리카 플레이트; 베이커(Baker, Phillipsburg, NF)]는 95:5의 클로로포름:메탄올(베이커)을 사용하여 수행한다. 장파장의 자외선(302㎚)하에 SIAB 출발 물질을 가시화하는 것이 가능하고, 3-아미노프로필트리에톡시실란은 자외선하에서 활성이 아니기 때문에, 1급 아민과 반응하고 가열시 자주색 스팟을 나타내는 닌하이드린 용액을 플레이트에 분무시킨다. 마이크로규모의 반응은, 3-아미노프로필트리에톡시실란에 비해 약간 몰과량인 SIAB를 사용하여 클로로포름/DMSO중에서 수행하고, 상기 언급한 TLC 조건을 사용하여 이를 모니터한다.
올리고뉴클레오타이드 변형:
3'- 또는 5'-디설파이드 함유 올리고데옥시뉴클레오타이드[오페론 테크놀로지즈(Operon Technologies, Alameda, CA) 또는 올리고 엑트(Oligo Etc., Wilsonville, OR)]로부터의 디설파이드 환원을 역상 FPLC[파마시아(Pharmacia, Piscataway, NJ)]를 사용하여 모니터하면, 디설파이드 분해시 올리고데옥시뉴클레오타이드의 체류 시간이 변하는 것을 알 수 있다. 다양한 환원 방법으로 조사하여 최적 조건을 결정한다. 한가지 경우에서, 디설파이드 함유 올리고데옥시뉴클레오타이드(31.5nmol, 0.5mM)는 pH 8.0 및 37℃에서 디티오트레이톨(DTT)(피어스 케미칼)(6.2mmol, 100mM)과 함께 항온처리한다. 분해 반응이 실질적으로 완결되면, DTT가 후속 반응에서 경쟁할 수 있기 때문에, 크로마스핀-10 칼럼[Chromaspin-10 column; 클론테크(Clontech, Palo Alto, CA)]을 사용하여 유리 티올 함유 올리고데옥시뉴클레오타이드를 분리시킨다. 선택적으로, 트리스-(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)(피어스 케미칼)을 사용하여 디설파이드를 분해할 수 있다. 디설파이드 함유 올리고데옥시뉴클레오타이드(7.2nmol, 0.36mM)는 37℃에서 pH 4.5의 완충제액중에서 TCEP와 함께 항온처리한다. TCEP가 요오도아세트아미도 작용 그룹과 경쟁적으로 반응하지 않기 때문에, 반응 후에 생성물을 분리시킬 필요가 없다. 분해 반응에 사용되는 TCEP의 농도를 변화시켜 결합 반응에 대한 최적 조건을 결정한다.
프로브 커플링:
상기한 바와 같이 요오도아세트아미도 작용 그룹을 포함하도록 유도체화시킨 각각의 웨이퍼에, pH 8의 100mM 인산염 완충액중의 10mM 유리 티올 함유 올리고데옥시뉴클레오타이드 수용액을 가하고, 100%의 상대 습도 및 실온에서 최소 5시간 동안 반응을 진행시킨다. 반응을 수행한 후, 올리고데옥시뉴클레오타이드 용액을 제거하고, 웨이퍼는 50% 포름아미드(USB; Cleveland, OH)를 사용하여 65℃에서 5×SSC 완충액(75mM 나트륨시트레이트, 750mM 염화나트륨, pH 7)중에서 1시간 동안 각각 2회 세척한다.
프로브 밀도의 방사화학적 측정:
표면에 공유 부착된 DNA의 양 또는 하이브리드화된 상보적 서열의 양을 측정하기 위해, 방사능 표지된 프로브를 사용한다. 5'-디설파이드 함유 올리고데옥시뉴클레오타이드를 고정화시키는 경우에, 3'-말단은 종결 트랜스퍼라제 효소 및 방사능 표지된 디데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트를 사용하여 방사능 표지하고, 표준 반응에서 0.2mM 2-머캅토에탄올의 존재하에 5'-디설파이드 함유 올리고데옥시뉴클레오타이드 15pmol(0.6μM)은 50μCi의 (α-32P) 디데옥시아데노신-5'트리포스페이트(16.5pmol, 0.66μM)(ddATP)(애머샴; Amersham, Arlington Height, IL)와 함께 항온처리한다. 종결 데옥시뉴클레오타이딜 트랜스퍼라제 효소(USB) 40단위를 가하고, 반응을 37℃에서 1시간 동안 진행시킨다. 이 시간이 경과한 후, 75℃ 수욕중에 바이알을 10분 동안 침지시켜 반응을 정지시키고, 생성물은 크로마스핀-10 칼럼(클론테크)을 사용하여 분리시킨다. 유사하게, 5'-디설파이드 함유 올리고데옥시뉴클레오타이드를35S로 방사능 표지시킨다.
3'-디설파이드 함유 올리고데옥시뉴클레오타이드를 고정화시키는 경우, 5'-말단은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 및 방사능 표지된 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 사용하여 방사능 표지한다. 예를 들어, 50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2및 10mM 2-머캅토에탄올의 존재하에, 3'-디설파이드 함유 올리고데옥시뉴클레오타이드 15pmol(0.6μM)은 50μCi의 (λ32P) 아데노신-5'트리포스페이트(ATP)(16.5pmol, 0.66μM)(애머샴)와 함께 항온처리한다. T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 40단위를 가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응을 진행시킨다. 75℃의 수욕에 바이알을 10분 동안 침지시켜 반응을 정지시킨 다음, 생성물은 크로마스핀-10 칼럼(클론테크)을 사용하여 분리시킨다.
공유적으로 고정화시킨 프로브의 밀도를 측정하기 위해, 선택된 디설파이드 함유 올리고데옥시뉴클레오타이드를, 상기한 바와 같이 방사능 표지시킨 미량의 동종에 가한다. 디설파이드를 분해하고 프로브를 요오도아세트아미도 작용화된 웨이퍼상에 고정화시키고 웨이퍼를 세척한 다음, 포스포르이미저 스크린(phosphorimager screen)[모르큘라 다이나믹스; Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA]에 노출시킨다. 각각 상이한 올리고데옥시뉴클레오타이드를 사용하는 경우, 올리고데옥시뉴클레오타이드의 몰량이 공지되어 있는 참조 스팟을 폴리스티렌상에 준비하고, 이러한 참조 스팟을 또한 포스포르이미저 스크린에 노출시킨다. 스크린을 주사하고, 참조물의 비활성에 대한 계수치와 비교하여 각각의 칩에 결합된 올리고데옥시뉴클레오타이드의 양(몰로서)을 측정한다.
하이브리드화 및 효율:
고정화된 프로브를 사용하여 작용화시킨 웨이퍼에, 1M NaCl 및 TE 완충액중의 상보적인 서열 용액(10μM)을 가한다. 웨이퍼 및 용액을 75℃로 가열하고, 3시간에 걸쳐 실온으로 냉각시킨다. 이 시간이 경과된 후, 용액을 제거하고 웨이퍼는 TE 완충액으로 2회 세척한다.
하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드의 양을 측정하기 위해, 프로브를32P 대신에35S로 표지시키는 것을 제외하고는, 상기한 바와 같이 프로브의 고정화를 먼저 수행한다. 고정화된 프로브의 밀도는 포스포르이미저로 측정한다. 이어서, 동일한 웨이퍼를 TE 완충액, 1M NaCl, 및32P로 방사능 표지된 이의 상보적인 쇄(10μM)중에서 항온처리한다. 상기한 바와 같이 하이브리드화를 수행한다. 이를 세척하여 비특이적 결합을 제거한 다음, 웨이퍼 및 참조물은, 스크린과 웨이퍼 사이의 구리박 조각을 갖는 포스포르이미저 스크린에 노출시킨다. 구리박은,32P 시그날은 자유로이 통과시키지만,35S로부터의 시그날은 차단시키는 작용을 한다. 하이브리드화된 올리고뉴클레오타이드의 몰량을 측정하면, 하이브리드에 이용할 수 있는 공유적으로 고정화된 프로브의 퍼센트가 수득된다.
MALDI-TOF 질량 분광분석적 분석:
상기한 바와 같이 비방사능 표지된, 고정화된 올리고데옥시뉴클레오타이드(명칭: TCUC, 서열: GAATTCGAGCTCGGTACCCGG, 분자량: 6455Da, 서열 1)를 함유하는 웨이퍼를 합성하고, 상보적인 서열(명칭: MJM6, 서열: CCGGGTACCGAGCTCGAATTC, 분자량: 6415Da, 서열 2)을 하이브리드화한다. 웨이퍼를 이온 교환용 50mM 암모늄시트레이트 완충액으로 세척하여 DNA 골격상의 나트륨 및 칼륨 이온을 제거한다[참조 문헌: Pieles, U. et al., (1993) Nucl. Acids Res. 21: 3191-3196]. 3-하이드록시피콜린산[3-HPA, 50% 아세토니트릴중의 0.7M, 10% 암모늄시트레이트; 참조 문헌: Wu, K.J., et al. (1993) Rapid Commun. Mass Spectrom. 7: 142-146]의 매트릭스 용액을 웨이퍼상에 스팟팅하고, 주위 온도에서 방치하여 건조시킨다. 웨이퍼는 전도 테이프를 사용하는 핀니간 MAT[브레먼; Bremen, Germany] 비젼 2000 리플렉트론 TOF 질량 분광분석기의 샘플 프로브에 직접 부착시킨다. 리플렉트론은 5keV의 이온 공급원 및 20keV의 후기 가속도를 가지고, 질소 레이저를 사용하며, 모든 스펙트럼은 양이온 형식으로 취해진다.
표면 화학반응:
표준 이산화규소 변형 화학반응을 사용하여, 실리콘 웨이퍼와 3-아미노프로필트리에톡시실란을 반응시켜 표면상에 1급 아미노 그룹의 일정 층을 생성시킨다. 도 7에서 나타낸 바와 같이, 표면을 헤테로이작용성 가교결합제에 노출시켜 표면상에 요오도아세트아미도 그룹을 생성시킨다. TLC를 사용하여 용액중에서 상기 반응의 최적 반응 시간을 측정할 수 있다. SIAB 가교결합제는 장파장 자외선(302㎚)의 존재하에 가시화되어 Rf값이 0.58인 스팟을 나타낸다. 3-아미노프로필트리에톡시실란은 자외선하에서 활성이 아니기 때문에, 기준으로 1급 아민의 존재를 지시하는 자주색 스팟을 나타내는 닌하이드린을 사용한다. 마이크로규모의 반응은 3-아미노프로필트리에톡시실란에 비해 약간 몰과량인 SIAB를 사용하여 수행한다. 대략 1분 후의 TLC 분석으로, 장파장 자외선하에서 가시화될 수 있는, Rf값이 0.28인 새로운 스팟이 나타난다. 닌하이드린으로 분무시 자주색 스팟이 나타나지 않으므로, 모든 3-아미노프로필트리에톡시실란 출발 물질이 반응으로 소비되었다. UV 선은 또한 반응 후에 과량의 SIAB가 잔류한다는 것을 나타낸다. 이러한 결과로부터, 대략 1분 후에 반응이 완결되는 것으로 측정된다. 모든 경우에 있어서, 요오도아세트아미도 작용화 웨이퍼를 바로 사용하여 불안정한 요오도아세트아미도 작용 그룹의 가수분해를 최소화한다. 또한, 모든 추가적인 웨이퍼 조작은, 요오도아세트아미도 작용 그룹이 광에 민감하기 때문에 암실에서 수행한다.
변형된 올리고뉴클레오타이드의 디설파이드 환원은 역상 FPLC상에서 체류 시간의 변화를 관찰함으로써 모니터한다. DTT(100mM) 또는 TCEP(10mM)의 존재하에서 5시간 후에 디설파이드가 유리 티올로 완전하게 환원되는 것으로 측정되었다. DTT 반응이 보다 장시간 동안 진행되는 경우, 한쌍의 유리 티올의 반응으로 올리고뉴클레오타이드 이량체가 형성된다. 분해 반응이 완결된 후 DTT가 제거되는 경우에 이러한 이량체화가 또한 관찰된다. TCEP가 분해 시약으로서 사용되는 경우, 이러한 반응이 pH 4.5에서 수행되어 이량체화를 억제하면서 유리 티올이 완전하게 양성자화되기 때문에, 상기한 이량체화가 관찰되지 않는다.
디설파이드 분해를 수행한 즉시, 변형된 올리고뉴클레오타이드를 요오드아세트아미도 작용화된 웨이퍼와 함께 항온처리한다. 완전한 티올 탈양성자화를 보장하기 위해, 커플링 반응은 pH 8.0에서 수행한다. 실리콘 웨이퍼의 상기한 화학반응에 의해 수득되는 프로브 표면 밀도는 방사능 표지된 프로브 및 포스포르이미저를 사용하여 분석한다. 프로브 표면 밀도는 또한 디설파이드 분해 반응에 사용되는 TCEP 농도의 함수(도 8)로서 모니터한다. 디설파이드를 분해하기 위해 10mM TCEP와 상기한 기타 반응 조건을 사용하면, 표면 제곱 ㎜당 250fmol의 표면 밀도를 재현적으로 수득할 수 있었다. 올리고뉴클레오타이드 프로브의 티올 변형이 결여되어 있는 점을 제외하고는 상기한 바와 동일하게 실험을 수행하고, 표면 제곱 ㎜당 5fmol 미만의 표면 밀도는, 비특이적 결합이 최소이고 프로브 커플링이 도 7에서 제안한 것과 거의 유사하게 발생됨을 입증한다.
하이브리드화:
웨이퍼의 표면에35S 표지된 프로브를 부착시키고 상기한 바와 같이 결합 밀도를 측정한 후,32P 표지된 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 수행하고, 하이브리드화 효율 및 밀도는 포스포르이미저 및 구리박을 사용하여 측정한다. 구리박은, 검출될32P 시그날은 완전히 통과시키지만35S 시그날은 98.4% 차단시키는 것으로 실험적으로 측정되었다. 상보적인 서열은 재현적으로 하이브리드화되어 표면의 제곱 ㎜당 105fmol을 생성하는데, 이는 하이브리드화에 유용한 결합된 프로브의 약 40%에 상응한다. 유사하게 비상보적 서열을 상기 반응식에 사용하여 표면의 제곱 ㎜당 5fmol 미만의 비특이적 결합이 수득된다.
평면상에 단단하게 충진된 올리고뉴클레오타이드 사이의 입체 장애가, 하이브리드화 효율이 40%를 초과하는 것을 억제하는 것으로 추측된다. 이를 염두에 두어, 스페이서 분자를 올리고뉴클레오타이드 및 지지체의 하이브리드화 영역의 말단 사이에 혼입시킨다. 선택된 스페이서는 길이가 3 내지 25의 범위인 폴리 dT 서열 시리즈이다. 방사능 표지된 상기 샘플을 포스포르이미저를 사용하여 조사하면, 성취될 수 있는 최대 하이브리드화가 여전히 40%인 것으로 측정되었다.
MALDI-TOF MS 분석:
웨이퍼는 프로브를 사용하여 작용화시키고 상보적인 서열을 하이브리드화하고, 샘플은 상기한 바와 같은 표준 MALDI 조건하에 분석한다. 분석은 어닐링된 쇄(MJM6)만이 실험적인 질량:전하 비가 6415.4이고 이론적인 질량:전하 비가 6415인 질량 스펙트럼으로 관찰된다는 것을 나타낸다(도 9). 질량:전하 비가 6455인 경우에는 시그날이 없기 때문에, 웨이퍼 결합된 쇄(TCUC)가 탈착되지 않아 요오도아세트아미도 연결이 레이저에 견딜만큼 충분히 안정적이므로 원형 그대로 유지되는 것으로 측정되었다. 6262.0의 질량:전하 비에서는 추가 시그날이 관찰되었다. DNA는 MALDI 공정 동안에 푸린 염기가 소실될 수 있는 것으로 공지되어 있기 때문에, 상기 시그날은 구아노신의 탈푸린화로부터 생성된 것이다[참조 문헌: Nordhoff, E., et al., (1992) Rapid Commun. Mass. Spectrom. 6: 771-776]. 웨이퍼상에 샘플 결정이 균질하게 분포되어 있지 않기 때문에, 우수한 스팟을 선별하는 것이 필요하다. 이러한 비균질성 때문에, 질량 분해가 다양하지만, 일반적으로 질량 스펙트럼에서 탈착된 올리고뉴클레오타이드의 경우 이는 200 내지 300의 범위이다. 한가지 실험 세트에서, 비상보적인 서열을 웨이퍼와 하이브리드화하고, 상기한 바와 같이 세척한 다음, MALDI-TOF MS로 분석하면, 시그날이 검출되지 않기 때문에 최소한의 비특이적 어닐링이 발생되는 것을 알 수 있다.
실시예 2
연속식 및 병렬식 분배 장치를 사용한 DNA 정렬의 제조
매트릭스 보조된 레이저 탈착 이온화 질량 분광분석적 분석을 위해, 로봇식으로 구동되는 연속식 및 병렬식 pL-nL 분배 장치를 사용하여 평면 또는 기하적으로 변화된 표면(예: 웰)을 갖는 1" 제곱 미만의 칩상에 10 내지 103요소의 DNA 정렬을 생성시킨다. 전자에서, 압전기 피펫(내경이 70㎛인 모세관)으로 칩상에 매트릭스 한방울 또는 다수 내지 0.2nL의 적가물을 분배한 다음, 분석물을 분배하고, 다음 공정을 사용하여 0.2fmol만큼 적은 36-머 DNA로부터 스펙트럼을 수득한다. 신속한 증발(5초 미만)에도 불구하고, 분석물을 함유하는 3-하이드록시피콜린산 매트릭스의 미세 결정은, 용적이 보다 큰 제제로 통상 수득되는 것보다 높은 재현률로 통상 수득된다. 800㎛ 웰중의 23-머의 5fmol 스팟 100개 모두는 시그날:노이즈 비가 5를 초과하는 99/100 모 이온 시그날을 갖는, 용이하게 해석되는 질량 스펙트럼을 생성한다. 두번째 방법으로, 384웰의 미세역가 플레이트로부터의 프로브를 칩 웰로 한번에 16개를 분배하거나, 표면 접촉에 의해 칩에 약 20nL를 전달하는 스프링 하중 핀의 정렬을 사용하여 평면상에 분배한다. 병렬식 방법을 사용하여 침착시킨 정렬 요소의 MS 분석은 감수성 및 해상도의 측면에서 연속식 방법으로 수득한 것과 비교할 수 있다.
압전기 연속식 분배기의 설명:
실험 시스템은 마이크로드롭 게엠베하(Microdrop GmbH, Norderstedt Germany)로부터 구입한 시스템으로부터 개발하였는데, 이는 분배될 용액을 보유하는 유리 모세관에 결합되어 이를 둘러싸고 있는 압전기 요소로 펄스화된 시그날을 전달하는 압전기 요소 구동기; 모세관을 채우거나(반압에 의함) 이를 비우기 위한(정압에 의함) 압력 변환기; 모세관 충전, 충전물 제거, 분배 및 세정을 위해 모세관을 이동시키기 위한 로봇식 xyz 스테이지 및 로봇식 구동기, '현탁된' 적가물의 특성 조명을 가능하게 하는, 압전기 요소의 진동수에서 진동하는 스트로보스코프 및 구동기; 공급원 및 지정 플레이트 또는 샘플 표적용 분리 스테이지(즉, Si 칩); 지정 플레이트에 대한 적하를 조명하기 위해 로봇식 암에 탑재된 카메라; 및 압력 단위, xyz 로봇 및 압전기 구동기를 조절하는 데이타 스테이션을 포함할 수 있다.
병렬식 분배기의 설명:
로봇식 핀 장치는, 프로브 블럭에 하우징되어 있고 X, Y 및 Z 로봇식 스테이지상에 탑재되어 있는 16개의 프로브를 포함한다. 로봇식 스테이지는 로봇의 암 하부에 샘플 트레이를 위치시킬 수 있는 갠트리 시스템이다. 갠트리 단위 자체는 선형 광학 해독기에 의해 제공되는 위치 피드백을 갖는 브러쉬없는 선형 서보 모터에 의해 인도되는, 각각 250 및 400㎜ 이동하는 X 및 Y 암으로 구성되어 있다. Z 축을 구동하는 리드 스크류(50㎜ 수직 이동)는 갠트리 단위의 xy 축 측면에 탑재되어 있고, 이는 모터 탑재된 회전식 광학 해독기에 의해 위치 피드백을 갖는 인라인 회전식 서보 모터에 의해 조절된다. 이 시스템의 작업 영역에는, 5개의 미세역가 플레이트(보다 빈번하게는 2개의 세척액 플레이트와 최대 1152개의 상이한 올리고뉴클레오타이드 용액에 대한 3개의 샘플 플레이트)를 보유하는 슬라이드 아웃 장치 플레이트 및 10개 이하의 20×20㎜ 웨이퍼가 장착되어 있다. 웨이퍼는 플레이트상에서 2개의 뱅킹 핀과 마주하여 정확하게 위치시키고 진공에 의해 안전하게 고정화시킨다. 전체 시스템은 안전을 위해 플렉시-글라스(plexi-glass) 하우징에 밀폐시키고, 열 및 진동 제동을 위해 강 지지체 프레임상에 탑재시킨다. 3축 서보 제어기로 컴퓨터에 통합되어 있는, 시판중인 운동 제어기를 사용하여 운동을 조절하고, 필요한 경우, 특별 적용을 위해 프로그래밍 코드를 기입한다.
샘플은, (1) 통상의 용도로 써모 바이오어낼러시스 비젼 2000(Thermo Bioanalysis Vision 2000)으로 공급되는 평면 스테인레스 강 샘플 표적; (2) 마이크로기계화된 나노피트를 갖는 동일한 디자인의 스테인레스 강 표적; (3) 평면 실리콘(Si) 웨이퍼; (4) 연마된 평면 Si 웨이퍼; (5) 조악한(3 내지 6pLm 크기) 피트를 갖는 Si 웨이퍼; (6) 각각 깊이가 99 내지 400(또는 120(b))㎛의 범위이고 피치가 1.0(a)(또는 1.125(b))mm인, 측면에서 각각 800×800㎛인 화학적으로 에칭된 웰의 10×10(a)(또는 16×16(b)) 정렬을 갖는 12×12(a)(또는 18×18(b))㎜ Si 칩; (7) 각각 깊이가 48 내지 300㎛의 범위이고 피치가 0.5㎜인, 측면에서 450×450㎛인 화학적으로 에칭된 웰의 28×28 정렬을 갖는 15×15㎜ Si 칩; (8) 평면 폴리카보네이트 또는 다른 플라스틱; (9) 금 및 다른 금속; (10) 막; (11) 금 또는 다른 전도성 물질로 스퍼터링된 플라스틱 표면을 포함한, MALDI TOF 분석기에서 표적으로서 작용하는 몇몇 표면상에 연속 시스템으로 분배한다. 분배 용적은 분배되는 적가물의 수를 조정함으로써 10-10내지 10-6L으로 조절한다.
샘플 제조 및 분배:
1. 연속식
상이한 서열 또는 농도의 올리고뉴클레오타이드(0.1 내지 50ng/㎕)를 96웰의 미세역가 플레이트의 웰에 적하시킨다; 첫번째 웰은 매트릭스 용액을 위해 준비한다. 함몰된 칩(MALDI 표적 구획의 표적 6a)을 스테이지에 위치시키고 수동으로 배열시킨다. 제1 웰의 좌표, 배열 크기(즉, x 및 y에서의 스팟의 수), 요소 사이의 간격, 및 정렬 요소당 0.2nL 적가물의 수를 (윈도우 기반의) 로봇식 조절 소프트웨어에 입력시킨다. 연속적 진동 형식을 유지하면서 팁의 완전성 및 세정성을 확인하기 위해 스트로브 광 조명 카메라 시각에서 자동으로 이동되는 모세관은 약 10㎕의 세정 H2O로 충전시키고 제거한다. 모세관을 매트릭스 용액으로 충전시키고 다시 스트로보스코프에서 이를 확인한 다음, 이를 사용하여 평면 또는 함몰된 표면상에 정렬을 스팟팅한다. 상이한 MS 양식에서 재현률을 조사하기 위해, 통상 0.2 내지 20nL의 적가물을 10×10 정렬로 분배한다. 모세관은 정압을 적용시켜 비운 다음, 임의로 H2O로 세정하고, 공급 올리고 플레이트로 0.05 내지 2.0μM의 합성 올리고 약 5㎕가 배출되도록 유도시킨다. 모세관은 0.2 내지 20nL의 수용액이 가해진 각각의 매트릭스 스팟상에 연속하여 래스터(raster)시킨다.
2. 병렬식
병렬 프로그램은 옵셋 인쇄에 의해 생성되는 배열을 조절하도록 기록되어 있는데, 10개의 웨이퍼상에 64개의 요소 정렬을 생성하기 위해, 예를 들어 표적(예: Si, 플라스틱, 금속)으로 이동하는 장치를 384웰의 DNA 공급 플레이트의 16웰로 침지시키고, 표면 접촉에 의해 샘플을 스팟팅시킨다. 장치를 동일한 16웰로 침지시키고 제2 표적상에 스팟팅시킨 다음, 이 순환 주기를 모두 10개의 웨이퍼상에서 반복한다. 이어서, 장치를 세정액에 침지시킨 다음, 공급 플레이트의 상이한 16개 웰로 침지시키고, 16개 스팟의 초기 세트로부터 옵셋된 표적 2.25㎜상에 스팟팅한 다음, 다시 이를 모두 10개의 웨이퍼상에서 반복하고, 전체 순환 주기를 반복하여 각각의 핀으로부터 2×2 정렬을 생성하여 8×8 정렬의 스팟을 형성한다(2×2요소/핀×16핀=총 64개의 스팟 요소).
MS 분석에 대한 정렬을 생성하기 위해, 상이한 서열 또는 농도의 올리고뉴클레오타이드를 3개 이하의 상이한 384웰 미세역가 플레이트상의 웰로 적하시키고, 16웰의 한 세트에는 매트릭스 용액을 준비한다. 2개의 플레이트의 웰은 세정액으로 충전시킨다. 5개의 미세역가 플레이트는 슬라이드 아웃 장치 플레이트상에 적하시킨다. 10개의 웨이퍼는 장치 플레이트에서 뱅킹 핀에 인접하게 위치시키고 진공을 작동시킨다. 매트릭스 및 올리고뉴클레오타이드를 미리 혼합하지 않는 경우, 핀장치를 사용하여 10개의 웨이퍼의 모든 목적하는 배열 요소에서 먼저 매트릭스 용액을 스팟팅한다. 예를 들어, 16×16 정렬을 생성한 다음, 1.125㎜의 옵셋을 갖는 10개의 웨이퍼 각각에 장치는 16회의 스팟팅을 실시해야만 한다. 이어서, 올리고뉴클레오타이드 용액을 동일한 패턴으로 스팟팅시켜 매트릭스를 재용해시킨다. 유사하게, 정렬은 먼저 웨이퍼상에 올리고뉴클레오타이드 용액을 위치시킨 후, 매트릭스 용액을 위치시키거나, 또는 매트릭스와 올리고뉴클레오타이드 용액을 미리 혼합함으로써 생성할 수 있다.
질량 분광분석:
각각의 분배를 수행한 후, 적하된 칩은 경사진 스크류 탑재된 폴리카보네이트화 지지체 세트를 갖는 MALDI-TOF 공급 플레이트상에 고정화시킨다. 플레이트는 이동시보 질량 분광분석의 공급 영역에서 1㎛의 해상도 및 1" 이동 xy 스테이지(뉴포트)로 고정될 프로브의 말단으로 운반한다. 18 내지 26kV의 익스트랙션(extraction)으로 일반적으로 작동되는 기기는 선형 또는 커프 영역 리플렉트론 형식, 및 연속 또는 지연된 익스트랙션 형식으로 작동시킬 수 있다.
압전기 피펫을 사용한 연속식 분배:
포화 3HPA 용액의 전달로 인해 모세관-공기 계면 증발시 팁이 용액으로 막힐 수 있지만, 미리 혼합한 DNA와 매트릭스는 매트릭스를 충분히 희석시켜 모세관이 비워질 때까지 유지될 수 있는 안정한 분무물을 생성하면서 이를 용액중에서 유지시키는데, 1:1 희석된 (H2O중의) 매트릭스 용액을 사용하는 경우, 10분을 훨씬 초과하는 시간(10<<) 동안 이를 연속적으로 분무시키는 것이 가능한다. 압전기 요소를 차단시켜 모세관을 5분을 초과하는 시간 동안 불활성화시킨 상태로 유지시키면, 압전 요소를 재활성화시키는 것이 모세관을 막지 않는다.
핀니간 비젼 2000 MALDI-TOF 시스템에 의해 제공되는 바와 같이 스테인레스 강 샘플 표적을 사용하는 초기 실험은, 샘플 표적에 이를 분배하기 전에 미리 혼합한 매트릭스와 DNA의 용액이 사용되는 리플렉트론 형식으로 수행한다. 단일 미세역가 웰에서, 포화 매트릭스 용액 50㎕, 12-머(ATCG)3(서열 3)의 51㎕ 용액중 25㎕ 및 28-머(ATCG)7(서열 4)의 51㎕ 용액중 25㎕를 혼합한다. 적가물 0.6㎕의 10×10 정렬 세트를 직접 핀니간 비젼 2000 샘플 표적 디스크에 분배하고, 각각 2개의 올리고뉴클레오타이드 750아토몰을 함유하는 단일 정렬 요소로부터 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 수득한다. 본 방법을 사용하여 53-머(350amol을 적하시킴, 나타내지 않음)까지의 DNA 분자에 대해 해석가능한 질량 스펙트럼을 수득한다.
실리콘 칩의 웰로 미세분산시킨 DNA 분자로부터 질량 스펙트럼을 또한 수득한다. 도 10은 100개의 화학적으로 에칭된 웰을 갖는 12×12㎜ 실리콘 칩을 나타내는데, 마스크 치수 및 에칭 시간은, 퍼스툼(fustum, 즉 역위 평면 상부 피라미드형) 기하 웰이 800×800㎛(상부 표면)이고 깊이가 100㎛가 되도록 설정한다. 임의로, 웰은 조악하거나 함몰될 수 있다. 상기한 바와 같이, 칩의 모서리는 모세관에 대해 x 및 y 좌표 시스템을 한정하는 스테이지상에서 돌출된 표면에 반하여 배열시킨다(대안으로는 광학 정렬, 인공지능 패턴 인지 루틴 및 장부맞춤 핀(dowel-pin) 기본의 수동 정렬이 포함된다). 분석물이 없는 3-HPA 매트릭스 용액 20방울(약 5nL)을 각각의 웰로 분배하는데, 50%의 CH3CN 용액이 사용되는 경우, 각각의 적가물에 대한 증발 시간은 거의 5 내지 10초이다. 용매가 증발될 때, 120 배율의 입체현미경하에 나타나는 바와 같이 각각의 미세분산된 매트릭스 적가물은 일반적으로 비결정이고 "밀키(milky)" 평면 디스크로서 나타나며, 이러한 외형은 도 3b의 스펙트럼이 수득되는 적가물의 것과 일치한다. 팁을 비우고 세정하며 1.4μM의 23-머 DNA 수용액(Mr(계산치)=6967Da)으로 재충전시키고, DNA 수용액 5nL가 매트릭스 적가물 상부상에 직접 분배되도록 각각 100개의 매트릭스 스팟에 대해 모세관을 위치시킨다. CCD 카메라를 통한 시각화를 사용하면, 분석 수용액이 매트릭스와 혼합되어 이를 재용해시키는 것으로 나타난다(주위 온도 및 습도에서 완전한 증발은 대략 10초가 소요된다). 비결정성 매트릭스 표면은 결정 모양이 대략 1㎛ 미만인 실질적인 미세결정성 표면으로 전환된다.
매트릭스 재용해 방법으로 수득되는 개선된 결정화도와 일치하면서, 질량 스펙트럼 결과는 미리 혼합한 매트릭스와 분석 용액의 것보다 재현률이 높은 것으로 나타나고, 23-머의 100개의 5fmol 스팟 각각은, 시그날:노이즈의 비가 5를 초과하는 99/100의 모 이온 시그날을 갖는 해석되는 질량 스펙트럼(도 11)을 생성하고, 이러한 재현률은 또한 시험된 평면 실리콘 및 금속성 표면을 사용하는 경우에도 수득된다(나타내지 않음). 도 11의 스펙트럼은 26kV에서 작동하는 선형 TOF 기기로 수득한다. 단일 또는 이중 하전된 분자 이온을 사용하여 상부 왼쪽 스펙트럼(웰 "k1")을 내부 보정하고, 이러한 보정을 다른 99개의 모든 스펙트럼에 대해 외부 보정으로서 적용하면(도 12), 평균 분자량으로부터 9Da 미만의 표준 편차가 수득되는데, 이는 약 0.1%의 상대 표준 편차에 상응한다.
로봇식 핀장치의 병렬식 분배:
정렬은 상기한 바와 같이 옵셋 인쇄로 생성한다. X 및 Y 스테이지의 속도는 35인치/초이고, Z 스테이지의 속도는 5.5인치/초이다. X 및 Y 스테이지를 최고 속도로 이동시켜 순환 주기 시간을 감소시키는 것이 가능하지만, Z 스테이지의 속도는 표면 손상을 방지하기 위해 표면과 웨이퍼를 접촉시키기 전에 감소시켜야만 한다. 상기한 축 속도에서, 10개의 모든 웨이퍼상에서 16개의 스팟 요소(동일한 용액의 한가지 장치의 압인)에 대한 대략적인 순환 주기 시간은 20초이고, 따라서 256요소의 정렬을 생성하는데는 대략 5.3분이 소요된다. 상이한 올리고뉴클레오타이드 용액을 정렬상에 위치시키는 경우, 다른 용액에 침지시키기 전에 핀 팁을 세정하기 위한 추가 세척 단계가 도입되어야 하기 때문에 순환 주기 시간은 25초로증가되어 10개의 웨이퍼를 생성하는데 6.7분이 소요된다.
상기한 바와 같은 방사능 표지된 용액 및 포스포로이미저를 사용하여 장치에 의한 샘플 전달을 조사하면, 각각의 핀은 대략 1nL의 액체를 전달하는 것으로 측정되었다. 스팟 대 스팟의 재현률은 높다. 다양한 서열 및 농도의 256 올리고뉴클레오타이드 요소의 정렬은 핀 장치를 사용하여 평면 실리콘 웨이퍼상에서 생성하고, 웨이퍼는 MALDI-TOF MS로 분석한다.
실시예 3
핵산 정렬을 생성하기 위한 고밀도 핵산 고정화의 용도
MALDI-TOF 질량 분광분석적 분석할 수 있는 DNA 올리고머의 정렬은, 실시예 1에서 기술한 고밀도 부착 공정을 사용하여 표면에 다수의 구획(예: 침몰 또는 돌출)을 갖는 실리콘 웨이퍼상에 생성시킨다. 정렬을 생성하기 위해, 유리 티올 함유 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 웨이퍼의 선택된 위치에만 고정화시킨다(도 13을 참조한다). 정렬 각각의 위치는 3개의 상이한 올리고머중 하나를 포함한다. 상이한 고정화된 올리고머가 개별적으로 검출되고 구별될 수 있음을 입증하기 위해, 3개의 올리고머중 하나에 대해 상보적인, 길이가 상이한 3개의 개별적인 올리고머를 웨이퍼상의 정렬과 하이브리드화하고, MALDI-TOF 질량 분광분석법으로 분석한다.
올리고데옥시뉴클레오타이드:
상보적인 올리고데옥시뉴클레오타이드 쌍의 3개의 세트는, 상보적인 올리고뉴클레오타이드 쌍중 한 구성원이 3'- 또는 5'-디설파이드 연결을 포함하도록 합성한다(오페론 테크놀로지즈 또는 올리고스 등에서 구입한다). 예를 들어, 올리고머 1(d(CTGATGCGTCGGATCATCTTTTTT-SS; 서열 5)은 3'-디설파이드 연결을 포함하지만, 올리고머 2(d(SS-CCTCTTGGGAACTGTGTAGTATT); 서열 6의 5'-디설파이드 유도체) 및 올리고머 3(d(SS-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG); 서열 1의 5'-디설파이드 유도체)은 각각 5'-디설파이드 연결을 포함한다.
올리고머 1 내지 3에 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 MALDI-TOF MS 분석 동안에 서로 용이하게 분해될 수 있는 상이한 길이를 가지도록 디자인한다. 예를 들어, 23-머 올리고뉴클레오타이드(서열 7)은 올리고머 1의 일부에 대해 상보적이도록 합성하고, 12-머 올리고뉴클레오타이드(서열 8)은 올리고머 2의 일부에 대해 상보적이도록 합성하며, 21-머(서열 2; 실시예 1에서 "MJM6"으로 지정)는 올리고머 3의 일부에 대해 상보적이도록 합성한다. 또한, 4번째 29-머 올리고뉴클레오타이드(서열 9)는 3개의 올리고머중 어떤 것에 대해서도 상보성이 결여되도록 합성한다. 이러한 4번째 올리고뉴클레오타이드는 음성 대조구로서 사용한다.
실리콘 표면 화학반응 및 DNA 고정화:
(a) 4×4(16위치) 정렬
16×16 웰 정렬 형태인 256개의 개별적인 함몰부 또는 웰을 갖는 2×2㎠ 규소 웨이퍼는 제조회사로부터 구입한다[액셀레이터 테크놀로지 코포레이션(Accelerator Technology Corp., College Station, Texas)]. 웰은 깊이가 120㎛이며 피치가 1.125이며 800×800μ㎡이다. 실리콘 웨이퍼는 3-아미노프로필트리에톡시실란과 반응시켜 표면상에 1급 아민의 균일 층을 생성시킨 다음, 헤테로이작용성 가교결합제 SIAB에 노출시켜 표면상에 요오도아세트아미도 작용 그룹을 생성시킨다(예를 들어, 도 7을 참조한다).
실리콘 정렬의 다양한 위치와 커플링되는 올리고머를 제조하기 위해, 각각의 올리고머의 디설파이드 결합은 실시예 1에서 설명한 바와 같이 10mM의 TCEP를 사용하여 완전하게 환원시키고, DNA는 pH 8.0의 100mM 인산염 완충액중에 10μM의 최종 농도로 재현탁시킨다. 디설파이드 결합 환원을 수행한 즉시, 올리고머의 유리 티올 그룹은, 도 7에서 기술한 바와 같이 실질적인 프로브 커플링 조건을 사용하여 웨이퍼상의 16개 위치에서 요오도아세트아미도 작용 그룹과 커플링시킨다. 웨이퍼의 16개의 개별적인 위치에서 개별적인 커플링을 수행하기 위해, 웨이퍼의 전체 표면을 올리고뉴클레오타이드 용액으로 플러싱하는 대신에, 미리 측정한 변형된 올리고머 약 30nl의 분취량을 웨이퍼상의 256웰의 각각 16개의 위치(즉, 함몰부)에 병렬로 가하여, 본원에서 기술한 바와 같은 핀 장치를 사용하여 고정화시킨 DNA의 4×4 정렬을 생성시킨다[예를 들어, 본원에서 제공하는 실시예 4 및 상세한 설명을 참조한다].
따라서, 도 13에 나타낸 바와 같이, 변형된 올리고머 1 내지 3중의 하나를 실리콘 웨이퍼상의 256웰의 16개의 분리된 웰 각각에 공유 고정시켜 고정화된 DNA의 4×4 정렬을 생성시킨다. 예를 들어, 올리고머 1은 4×4 정렬의 왼쪽 코너의 상부의 웰 위치에 결합시키고, 올리고머 2는 인접한 위치에 결합시키는 등이다. 완전한 정렬의 도식은 도 13에 나타내었다.
하이브리드화 반응을 수행하는데 있어서, 3개의 상보적인 올리고뉴클레오타이드 및 음성 대조구 올리고뉴클레오타이드는 1M NaCl이 공급된 TE 완충액(10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA) 1㎖중의 올리고뉴클레오타이드 각각에 대하여 10μM의 최종 농도로 혼합하고, 용액은 65℃에서 10분 동안 가열한다. 이를 수행한 즉시, 실리콘 웨이퍼의 전체 표면을 가열된 올리고뉴클레오타이드 용액 800㎕로 플러싱한다. 상보적인 올리고뉴클레오타이드는, 주위 온도에서 1시간 동안 실리콘 정렬을 항온처리한 다음, 4℃에서 10분 이상 동안 항온처리함으로써 고정화된 올리고머에 어닐링시킨다. 선택적으로, 올리고뉴클레오타이드 용액을 웨이퍼에 가한 다음, 하이브리드화를 위해 이를 가열하고 냉각시킨다. 각각의 위치에 공유적으로 고정화된 특이적 올리고머에 대해 어닐링되는 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 도 14에 나타내었다.
하이브리드화 정렬은 이온 교환을 위해 50mM의 암모늄시트레이트 완충액으로 세척하여 DNA 골격상의 나트륨 및 칼륨 이온을 제거한다[참조 문헌: Pieles, U. et al., (1993) Nucl. Acids Res. 21: 3191-3196]. 3-하이드록시피콜린산(50% 아세토니트릴중의 0.7M 3-하이드록시피콜린산-10% 암모늄시트레이트, 참조 문헌: Wu et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 7:142-146 (1993))의 매트릭스 용액의 6nl의 분취량은 본원에서 기술한 바와 같이 압전기 피펫을 사용하여 정렬 각각의 위치에 가한다.
용액은 주위 온도에서 방치하여 건조시킨 다음, 압전기 피펫을 사용하여 물 6nl의 분취량을 각각의 위치에 가하여, 주위 온도에서 건조시 매트릭스-DNA 복합체가 각각의 위치의 하부 표면상에 일정한 결정성 표면을 형성하는 건조된 매트릭스-DNA 복합체를 재현탁시킨다.
MALDI-TOF MS 분석:
MALDI-TOF MS 분석은 실시예 1에서 실질적으로 기술한 바와 같이 도 14에 나타낸 하이브리드화 정렬의 16개 위치 각각에 대해 연속하여 수행한다. DNA 하이브리드화 정렬의 16개 위치 각각에 특이적으로 하이브리드화되는 올리고뉴클레오타이드의 수득된 질량 스펙트럼은 도 15에 나타내었다. 질량 스펙트럼은 특이적인 상보적 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 관찰된 실험적인 질량:전하 비를 대표하는, 각각의 위치에서 특이적인 시그날을 나타낸다.
예를 들어, 올리고머 1만이 결합되어 있는 위치에서, 질량 스펙트럼은 23-머의 것과 거의 동일한, 7072.4의 관찰된 실험적인 질량:전하 비를 갖는 우세한 시그날을 나타내는데, 23-머의 이론적인 질량:전하 비는 7072.6Da이다. 유사하게, 관찰된 실험적인 질량:전하 비가 3618.33Da인 정렬에 대한 12-머 올리고뉴클레오타이드의 특이적인 하이브리드화는 올리고머 2가 결합되어 있는 위치에서만 검출되지만, MJM6의 특이적인 하이브리드화(관찰된 실험적인 질량:전하 비는 6415.4이다)는 올리고머 3이 결합된 정렬의 위치에서만 검출된다(이론치: 6407.2Da).
정렬의 어떤 위치도 음성 대조구인 29-머 올리고뉴클레오타이드(이론적인 질량:전하 비는 8974.8이다)에 상응하는 시그날을 나타내지 않는데, 이는 특이적인 표적 DNA 분자가 실리콘 정렬 표면상의 특이적 위치에 공유 고정되어 있는 올리고머와 하이브리드화될 수 있고, 다수의 하이브리드화 검정물은 MALDI-TOF MS 분석법을 사용하여 개별적으로 모니터할 수 있음을 나타낸다.
(b) 8×8(64개 위치) 정렬
16×16 웰 정렬을 형성하는 256개의 개별적인 함몰부 또는 웰을 갖는 2×2㎠ 규소 웨이퍼는 제조회사로부터 구입한다[액셀러레이터 테크놀로지 코포레이션(Accelerator Technology Corp., College Station, Texas)]. 웰은 깊이가 120㎛이며 피치가 1.125이고 800×800μ㎡이다. 실리콘 웨이퍼는 3-아미노프로필트리에톡시실란과 반응시켜 표면상에 1급 아민의 일정 층을 생성시킨 다음, 헤테로이작용성 가교결합제 SIAB에 노출시켜 표면상에 요오도아세트아미도 작용 그룹을 생성시킨다(예를 들어, 도 7을 참조한다).
16개 위치의 DNA 정렬을 제조하기 위해 상기한 공정을 수행한 후, 올리고머 1 내지 3을 256웰의 규소 웨이퍼상의 8×8 정렬을 형성하는 64개 위치에 고정화시키고, 상보적인 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화시키고 MALDI-TOF MS 분석법에 의해 분석한다. 도 16은 MALDI-TOF 분석법에 의해 연속해서 분석한 64개 위치의 DNA 정렬의 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다. 16개 위치의 정렬에 대해서 나타낸 바와 같이, 고정화된 티올 함유 올리고머 각각에 대해 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 특이적인 하이브리드화가 DNA 정렬 각각의 위치에서 관찰된다.
실시예 4
닉이 형성된 일본쇄 DNA 주형의 RNA 전사
본 실시예는 RNA 전사체가 생성되는 효율에 대한 암호화 쇄의 닉 배치의 효과를 평가하고 서열화를 위한 RNA 전사체 생성의 최적 조건을 제공한다.
1. 주형 및 프라이머 서열의 디자인
모든 프라이머는 통상적인 포스포로아미디트 화학반응을 사용하여 시판중인 DNA 합성기상에서 합성한다[참조 문헌: Sinha et al., (1984) Nucleic Acid Res. 12: 4539]. 시험관내 RNA 전사는 합성 55개 뉴클레오타이드 이본쇄 DNA 주형상에서 수행한다. 주형은 다음의 3가지 프라이머를 사용하여 어셈블리한다: 55개 뉴클레오타이드 비암호화 쇄(서열 10) 및 암호화 쇄를 형성하는 2개의 추가 프라이머(서열 11 및 12). 도 17에 나타낸 바와 같이, 암호화 쇄에서의 닉의 특이적인 위치는 암호화 쇄 프라이머 각각의 길이에 의해 결정된다. 이러한 전사용 작제물을 사용하는 것은, 상기 위치에서의 닉이 실질적으로 전사를 약화시키지 않는다는 것을 입증한다.
2. 프라이머 하이브리드화 및 RNA 전사
닉이 형성된 일본쇄 주형은, 반응 혼합물을 70℃에서 10분 동안 가열한 다음 실온에서 4시간 이상 냉각시킴으로써, 10mM MgCl2중 총 10μM의 DNA 농도로 3개의 일본쇄 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화에 의해 생성된다. 닉의 위치는 2개의 암호화 쇄(5'-3') DNA 올리고뉴클레오타이드의 상응하는 길이에 의해 결정된다.
SP6 RNA 폴리머라제 전사:
닉이 형성된 DNA 주형의 시험관내 전사는 40mM 트리스-HCl(pH 7.0), 6mM MgCl2, 2mM 스페르미딘, 10mM NaCl, 10mM 디티오트레이톨, 1단위/㎕ RNasin(프로메가), 5mM rNTP, 5μCi[α-32P]rCTP 및 1단위/㎕ SP6 RNA 폴리머라제(애머샴)의 반응물 20㎕중에서 37℃에서 30분 동안 수행한다. 미숙한 RNA 전사체 및 완전한 길이의 RNA 전사체는 겔 전기영동으로 분리하고, 폴리아크릴아미드 겔을 건조시키고 포스포르이미저(모르큘라 다이나믹스, 인코포레이티드)를 사용하여 공지된 표준물과 방사능을 비교 측정함으로써 개별적인 RNA 단편의 방사능을 측정하여 정량화한다. 닉이 형성된 DNA 주형의 완전한 길이의 RNA 전사 효율은 닉이 없는 DNA 주형으로부터 전사되는 완전한 길이의 RNA의 몰에 대한 퍼센트로서 계산한다. 닉이 형성된 DNA 주형의 닉 우회 효율은, 완전한 길이의 DNA 전사체의 몰 및 닉에서 정지된 RNA 전사체의 몰 퍼센트로서 계산한다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 전사 출발점에 대해서 +7, +8, +9 또는 +19번째 뉴클레오타이드 다음에 닉이 암호화 쇄로 도입되는 경우, 완전한 길이의 RNA 전사는 88 내지 94%의 효율로 진행된다.
6-머 RNA(%) 닉으로 정지된 RNA(%) 완전한 길이의 RNA(%) 닉 우회 효율(%)
참조 320±93 - (100) 100±0
1N+7U 193.2±46.3 12.45.4 95.8±6.5 88.5±5.1
1N+8U 187.4±39.9 5.3±4.2 87.1±4.3 94.3±0.5
1N+9U 232.7±45.6 10.1±1.1 65.7±4.4 87.6±1.8
1N+19U 279.6±33.8 6.6±0.3 64.8±4.5 90.9±0.4
실시예 5
T7 RNA 폴리머라제를 사용한 DNA 서열화
1. 주형 및 프라이머 서열의 디자인
모든 프라이머는 통상적인 포스포로아미디트 화학반응을 사용하여 시판중인 DNA 합성기상에서 합성한다[참조 문헌: Sinha et al. (1984) Nucleic Acid Res. 12: 4539]. 시험관내 RNA 전사는 합성 276개 뉴클레오타이드 이본쇄 DNA 주형상에서 수행한다(T7 프로모터를 포함하는 서열 13).
2. DNA 서열화
40mM 트리스-HCl(pH 7.9), 6mM MgCl2, 2mM 중화된 스페르미딘, 5mM 디티오트레이톨, 300nM rCTP, 300nM rATP, 300nM rUTP, 300nM rITP, 600nM rGMP, 10μCi(α-32P) rCTP 또는 UTP, 10 내지 300, 일반적으로는 10 내지 50μM의 3'-데옥시뉴클레오타이드, 0.5 내지 1.0pmol의 선형 또는 초나선 DNA 주형, 4단위의 RN아신(프로메가) 및 10단위/㎕ T7 RNA 폴리머라제(USB)의 반응물 10㎕중에서 37℃에서 30분 동안 표적 DNA 주형의 DNA 서열화를 수행한다. RNA 전사체의 쇄 종결 단편은 8% 또는 13% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 겔 전기영동에 의해 분리시킨다.
RNA 종결된 단편의 DNA 서열화 래더(ladder)는 180 내지 200개 염기까지로 생성된다. 본 실시예는 T7 RNA 폴리머라제가 염기 특이적 쇄 터미네이터로서 변형된 3'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 특이적으로 혼입시켜 핵산 서열화를 위한 한벌의 RNA 전사체를 생성할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 변형은 당해 기술 분야의 숙련가에게는 명백하기 때문에, 본 발명은 청구의 범위의 범주로만 제한되지는 않는다.
<110> SEQUENOM, INC. KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Mass spectrometric methods for sequencing nucleic acids <130> 5-2000-021201-6, 3-1998-098866-1 <150> US 08/990,851 <151> 1997-12-15 <160> 13 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 1 gaattcgagc tcggtacccg g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 2 ccgggtaccg agctcgaatt c 21 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 3 atcgatcgat cg 12 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 4 atcgatcgat cgatcgatcg atcgatcg 28 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 5 ctgatgcgtc ggatcatctt tttt 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 6 cctcttggga actgtgtagt att 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 7 gatgatccga cgcatcagaa tgt 23 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 8 aatactacac ag 12 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 9 gatctagctg ggccgagcta ggccgttga 29 <210> 10 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 10 atagacgctg ctggacggca cccttctcca agacttctat agtgtcacct aaatc 55 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 11 gatttaggtg acactataga agtct 25 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 12 tggagaaggg tgccgtccag cagcgtctat 30 <210> 13 <211> 276 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA, single <400> 13 gctctaatac gactcactat agggagacaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg 60 atccccgggt accgagctcg aattcctggc agtttatggc gggcgtctgc caccctccgg 120 gccgttgctt cgcaacgttc aaatccgcgt ccggcggatt tgtcctactc aggagagcgt 180 tcacccgaca aacaacagat aaaaaaaaag cccagtcttt cgactgggcc tttcgtttta 240 tttgatgcct gggaattcgt attctattct atagtg 276

Claims (44)

  1. a) 표적 핵산의 3'-말단에 있는 일본쇄 영역에 상보적인 암호화 쇄의 3'-말단에 5개 이상의 뉴클레오타이드, 및 하이브리드화된 표적 핵산 분자가 전사되도록 배향된 프로모터 함유 이본쇄 부분을 포함하는 핵산 프로모터 함유 프로브를 고체 지지체상에 고정화시키고;
    b) 표적 핵산을 고정화된 핵산 프로브의 일본쇄 부분과 하이브리드화시키고;
    c) 프로모터를 인지하는 RNA 폴리머라제를 사용하여 표적 핵산을 전사시켜 염기 특이적으로 종결된 다수의 RNA 전사체를 생성하고;
    d) 질량 분광분석법에 의해 염기 특이적으로 종결된 RNA 전사체 각각의 분자량을 측정하고;
    e) 염기 특이적으로 종결된 RNA 전사체를 분자량에 따라 정렬하여 핵산의 서열을 결정함을 포함하는, 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 고정화된 핵산 프로모터 함유 프로브가 이의 상보체를 포함하는 단편을 하이브리화시켜 수득됨으로써 수득된 이본쇄 영역이 프로모터를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, b) 단계 및 c) 단계 사이에, 핵산 프로브와 표적 핵산의 인접한 쇄의 3' 하이드록실 그룹과 5' 포스페이트 그룹간의 포스포디에스테르 결합이 형성되도록 리가제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 아키박테리아, 유박테리아, 박테리오파지, DNA 바이러스, RNA 바이러스, 식물, 식물 바이러스 및 진핵 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 폴리머라제가 DNA 의존성 RNA 폴리머라제인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 폴리머라제가 RNA 의존성 RNA 폴리머라제인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 폴리머라제가 아키박테리아, 유박테리아, 박테리오파지, DNA 바이러스, RNA 바이러스, 식물 및 진핵 RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 폴리머라제가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제 및 Qβ리플리카제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산을 고정화시키기 전에, 지지체 표면을 아미노실란과 반응시켜 지지체의 표면을 유도체화시킴으로써 지지체의 표면에 1급 아민을 생성시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 아미노실란이 3-아미노프로필트리에톡시실란인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 지지체 표면상의 1급 아민을 티올 반응성 가교결합제와 반응시켜 티올 반응성 고체 지지체를 형성함을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 티올 반응성 가교결합제가 N-석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB)인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 유리 5'- 또는 3'-티올 그룹을 갖는 핵산 프로브와 티올 반응성 고체 지지체를 반응시켜 티올 그룹과 티올 반응성 고체 지지체 사이에 공유 결합을 형성시킴으로써 핵산 프로브를 고체 지지체에 고정화시키는 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 프로브가 고체 지지체 표면에 20fmol/mm2내지 250fmol/mm2의 밀도로 공유 결합되는 방법.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 정렬 형태로 고체 지지체의 표면상에 고정화되는 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 실리콘인 방법.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 표면이 고정화된 핵산 분자를 함유하는 다수의 웰을 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 웰이 조악한 내부 표면을 갖는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 고체 지지체가 조악한 표면을 갖는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 웰의 표면이 에칭되는 방법.
  21. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 질량 분광분석법이 매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화(MALDI) 분석법, 이동시보(Time-of-Flight)(TOF) 분석법, 전기분무(ES) 분석법 및 퓨리어 변환 이온 사이클로트론 공명(ICR) 분석법으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  22. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 3'-데옥시리보뉴클레오타이드의 존재하에 전사가 수행되는 방법.
  23. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 물질을 지지체의 표면에 첨가하고 질량 분광분석법을 사용하여 합성된 일본쇄 리보핵산의 분자량을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열화될 핵산을 고체 지지체에 하이브리드화하여 프로모터부터 전사 개시점까지의 +6 이상의 위치에 상응하는 암호화 쇄에 닉을 형성시키는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 닉이 +7, +8, +9 또는 +19에 위치하는 방법.
  26. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 변형된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 유사체의 존재하에 전사가 수행되어 수득된 RNA 분자가 변형되지 않은 리보뉴클레오타이드 트리포스페이트로부터 제조된 RNA 분자와 비교하여 감소된 2차 구조를 갖는 방법.
  27. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, c) 단계에서, 변형된 리보뉴클레오타이드의 존재하에 전사가 수행되어 RNA 폴리머라제 턴오버율이 증가된 방법.
  28. 제27항에 있어서, 변형된 리보뉴클레오타이드가 4-티오 UTP, 5-브로모 UTP 및 5-요오도 CTP로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  29. a) 표적 핵산의 3'-말단에 있는 일본쇄 영역에 상보적인 암호화 쇄의 3'-말단에 5개 이상의 뉴클레오타이드, 및 하이브리드화된 표적 핵산 분자가 전사되도록 배향된 프로모터 함유 이본쇄 부분을 포함하는 핵산 프로모터 함유 프로브를 고체 지지체상에 고정화시키고;
    b) 표적 핵산 분자를 고정화된 핵산 프로브와 하이브리드화시키고;
    c) 프로모터를 인지하는 RNA 폴리머라제를 사용하여 표적 핵산을 전사시켜 서열 종결된 RNA 전사체를 생성하고;
    d) 질량 분광분석법에 의해 RNA 전사체의 분자량을 측정하여 관찰된 RNA의 양에 의해 표적 핵산 분자중에 터미네이터 또는 어태뉴에이터 서열의 존재를 확인함을 포함하여, 표적 핵산 분자 중의 전사 터미네이터 또는 어태뉴에이터 서열을 동정하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 암호화 서열 전에 종결시켜 어테뉴에이터를 동정하는 방법.
  31. 제29항에 있어서, c) 단계에서, 변형된 리보뉴클레오타이드의 존재하에 전사가 수행되어 RNA 폴리머라제 턴오버율이 증가된 방법.
  32. 제31항에 있어서, 변형된 리보뉴클레오타이드가 4-티오 UTP, 5-브로모 UTP 및 5-요오도 CTP로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
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