JP6134646B2 - 親水性チオールプローブ - Google Patents
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Description
例えば、N末端アミノ基やリジン残基のアミノ基がプローブの付加部位として利用されている。そのようなプローブとして例えばTMPP試薬(Anal. Biochem. 2008, 380(2), 291-296(非特許文献1))やSPITC試薬(RCM. 2004, 18(1), 96-102(非特許文献2))等を用い、ペプチドのMS/MSイオン系列の選択性を持たせる方法論がある。
さらに、タンパク質の一斉定量方法もiTRAQ(R)(Isobaric tag for relative and absolute quantitation)として改良され(Mol Cell Proteomics. 2004, 3, 1154-1169(非特許文献5))、質量分析によってタンパク質又はペプチドの発現変動解析が行われている。
本発明は、以下の発明を含む。
前記架橋基が、炭素数1〜3の炭化水素基又は炭素数2〜6のアルキレンオキシド含有基である、(1)に記載のタンパク質のチオールプローブ。
(3)
前記アルキレンオキシド含有基におけるアルキレンオキシドが、エチレンオキシド又はプロピレンオキシドである、(2)に記載のタンパク質のチオールプローブ。
前記置換アミノ基が、−NHR3(R3は、炭化水素基又は窒素含有基を表す)で表される基である、(1)〜(3)のいずれかに記載のタンパク質のチオールプローブ。
前記R3が、置換されていてもよいアミジノ基又は置換されていてもよいトリアジノ基である、(4)に記載のタンパク質のチオールプローブ。
(6)
前記置換されていてもよいトリアジノ基における置換基が、アミノ基及び炭素数1又は2のアルコキシ基からなる群から選ばれる、(5)に記載のタンパク質のチオールプローブ。
(7)前記置換されていてもよいアミジノ基における置換基が、炭素数1又は2のアルキル基である、(5)に記載のタンパク質のチオールプローブ。
(1)〜(15)のいずれかに記載のチオールプローブをタンパク質と反応させることにより、修飾タンパク質を得る工程と、
前記修飾タンパク質を質量分析に供する工程とを含む、タンパク質の質量分析法。
上記(16)においては、チオールプローブと反応すべきタンパク質は、還元処理によって生じたチオール基を有するものでありうる。
具体的には、チオール基への反応性を有する構造は、チオール基以外への官能基(例えばアミノ基)への副反応を最小限にし、且つ反応速度選択性の高い、ヨードアセチル基である。
分子全体の疎水性度を抑制するための構造は、酸素含有基である。
プロトン化し易い構造は窒素含有基である。
より具体的には、本発明のチオールプローブは、下記式(I)、すなわちヨードアセチル基(ICH 2 CO−)、酸素含有基(−OR1−)、及び窒素含有基(−R2)を有する構造式で表される。
2価の有機基は、炭素数1又は2の炭化水素基でありうる。前記範囲を上回ると、分子全体の疎水性度が高くなり、イオン化促進効果が十分に得られにくくなる傾向にある。
あるいは、2価の有機基は、炭素数2〜6のアルキレンオキシド含有基でありうる。好ましくは、ポリアルキレンオキシド含有基である。より具体的には、アルキレンオキシド含有基におけるアルキレンオキシドは、エチレンオキシド又はプロピレンオキシドである。
例えば、OR1で表される基が、ポリアルキレングリコール基であることが好ましい。上記のポリアルキレングリコール基は、炭素数2〜6のアルキレングリコールの重合によって生じる基でありうる。本発明においては、ポリエチレングリコール基(エチレングリコールの重合によって生じる基)及びポリプロピレングリコール基(1,2−プロパンジオール又は1,3−プロパンジオールの重合によって生じる基)からなる群から選ばれうる。なお、上記のポリアルキレングリコール基におけるグリコールの重合度は、2〜6でありうる。
置換アンモニウム基は、三級アンモニウム基及び四級アンモニウム基でありうる。置換アンモニウム基における置換基は、炭素数1又は2のアルキル基等でありうる。置換アンモニウム基のカウンターアニオンは、1価のハロゲンアニオンであればよい。例えばCl−、Br−、I−などでありうる。
−NHR3で表される基において、R3は、炭素数1又は2の炭化水素基又は窒素含有基でありうる。
好ましくは、R3は、置換されていてもよいアミジノ基又は置換されていてもよいトリアジノ基でありうる。
置換されていてもよいアミジノ基の場合、すなわち、−NHR3で表される基は、置換されていてもよいグアニジノ基である。置換されていてもよいアミジノ基における置換基は、炭素数1又は2のアルキル基等でありうる。
置換されていてもよいトリアジノ基における置換基は、アミノ基、炭素数1又は2のアルコキシ基からなる群から選ばれうる。
また、イオン源としてマトリックス支援レーザー脱離イオン化法を採用する場合、マトリックスとしては、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、2,5−ジヒドロキシ安息香酸等、従来から用いられているタンパク質用マトリックスを使用することができる。
さらに、MS2乗以上の多段階MSが可能なタンデム型質量分析装置が好ましく用いられる。
具体的には、(1)状態の異なるタンパク質試料、例えば解析すべきタンパク質試料Iとその対照タンパク質試料IIとの2種類の状態のタンパク質試料を用意し、(2)前記タンパク質試料Iを、非標識プローブ及び安定同位体標識プローブのいずれか一方を用いて修飾し、別途、前記タンパク質試料IIを、非標識プローブ及び安定同位体標識プローブのいずれか他方を用いて修飾し、(3) 修飾されたタンパク質試料I及び修飾されたタンパク質試料IIを混合し、(4)得られた修飾タンパク質混合物を消化工程に供することなく質量分析に供することができる。
1.以下のサンプル(タンパク質又はペプチド)、試薬及び機器を用意した。
タンパク質の還元アルキル化のモデルとして汎用されるタンパク質1種;
Insulin(Sigma-Aldrich)
alpha鎖とbeta鎖とが、システインのSS結合を介して結合している。
alpha鎖:GIVEQC CASVCSLYQL ENYCN(配列番号1))
beta鎖:FVNQHL CGSHLVEALY LVCGERGFFY TPKA(配列番号2))
システインを一つだけ含むペプチドのモデル3種;
NC4 CLAC-P (Anaspec)
LGPDGLPMPG CWQK(配列番号3)
PSA2 (Anaspec)
KLQCVDLHV(配列番号4)
S26C Amyloid-beta (17-40) (Anaspec)
LVFFAEDVGC NKGAIIGLMV GGVV(配列番号5)
内部標準ペプチド1種;
P14R (Sigma-Aldrich)
PPPPPPPPPP PPPPR(配列番号6)
その他汎用試薬;
重炭酸アンモニウム(Fluka)
ジチオトレイトール(和光純薬)
ヨードアセトアミド(和光純薬)
α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)(島津GLC)
トリフルオロ酢酸(和光純薬)
アセトニトリル(和光純薬)
ZipTip C18(Millipore)
使用機器;
AXIMA(R) Performance(島津製作所)
ペプチドを0.05% TFAと50%acetonitrileとを含む水溶液に溶解し、200 pmol分注 (100 pmol/μL, 2μL)した。
100 mM NH4HCO3と10mM Dithiothreitolとを含む水溶液を10μL加え、pHを確認した (約pH 8.3であった)。
56℃で30分インキュベートした。
50 mM プローブ溶液を15 μl加え、室温, 30分暗所で撹拌した。なお、プローブ溶液の溶媒はそれぞれ以下の通りである。
CC-02 HI、CC-02 Q、CC-03 Q、CC-10 HI及びIAAの場合は水
TOC-06、TOC-07及びTOC-08の場合はメタノール
10% TFA水溶液を5μL加え、反応停止させた。
反応溶液2 μLを以下の量の0.1% TFA水溶液で希釈後、ZipTip C18で脱塩精製した。
CC-02 HI、CC-02 Q、CC-03 Q、CC-10 HI及びIAAの場合は 20 μLのTFA水溶液
TOC-06、TOC-07及びTOC-08の場合は200 μLのTFA水溶液
MSに供すべきサンプルは、プローブそれぞれについて12個作成した。
内部標準として、0.3 pmolのP14Rを添加した。
マトリックスとして、0.1% TFAと50% acetonitrileとを含む水溶液に5 mg/ml CHCAを溶解させた溶液を1ウェルにつき1μL添加した。
質量分析として、ラスタースキャンで自動測定を行った(300 profile/run)。
測定モードとして、linear positiveを用いた。
プローブの付加により質量数がシフトしたピークを目的ピークとし、目的ピークの強度を、内部標準P14Rのピーク強度に対して補正した。
上位及び下位からそれぞれ1番目の値及び2番目の値を異常値として排除した(35% trim-mean)。MALDI MS分析において、レーザーを照射する場所により、非常にイオンが発生しやすいホットスポットの存在と、逆にイオンがほとんど発生しない場所とがあることが経験的に知られていることから、MALDI MS分析は、常に異常値が出ることを前提に、その解析方法を考慮する必要があるためである。
Insulinのalpha鎖、Insulinのbeta鎖、NC4 CLAC-P、PSA2、及びS26C Amyloid-betaについての解析結果を、それぞれ図1〜5に示す。それぞれの図においては、使用したプローブごとにサンプルの相対ピーク強度のばらつきで表したグラフと、コントロール(IAA)に対するサンプルのピーク強度の比(Enhanced ratio)及びイオン化促進の程度を統計的に評価したp値(p-value)を表した表とを示す。なお、それぞれの表においては、10のべき乗をEを用いて表示しており、Eに引き続く負の整数は10のべき乗の指数を表す。
Claims (15)
- 前記R 1 が炭素数2〜6のアルキレンオキシド含有基を表す場合において、前記アルキレンオキシド含有基におけるアルキレンオキシドが、エチレンオキシド又はプロピレンオキシドである、請求項1に載のタンパク質の質量分析用チオールプローブ。
- 前記R 2 が置換アミノ基を表す場合において、前記置換アミノ基が、−NHR3(R3は、炭化水素基又は窒素含有基を表す)で表される基である、請求項1又は2に記載のタンパク質の質量分析用チオールプローブ。
- 前記R3が、置換されていてもよいアミジノ基又は置換されていてもよいトリアジノ基である、請求項3に記載のタンパク質の質量分析用チオールプローブ。
- 前記置換されていてもよいトリアジノ基における置換基が、アミノ基及び炭素数1又は2のアルコキシ基からなる群から選ばれる、請求項4に記載のタンパク質の質量分析用チオールプローブ。
- 前記置換されていてもよいアミジノ基における置換基が、炭素数1又は2のアルキル基である、請求項4に記載のタンパク質の質量分析用チオールプローブ。
- 前記R 2 が置換アンモニウム基を表す場合において、前記置換アンモニウム基が、炭素数1又は2のアルキル基で置換された第三級アンモニウム基又は第四級アンモニウム基である、請求項1又は2に記載のタンパク質の質量分析用チオールプローブ。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の質量分析用チオールプローブをタンパク質と反応させることにより、修飾タンパク質を得る工程と、
前記修飾タンパク質を質量分析に供する工程とを含む、タンパク質の質量分析法。
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