JP4141834B2

JP4141834B2 - マトリックス支援レーザー脱離イオン化マススペクトロメトリーを使用したハイスループットなタンパク質の同定及び定量のための同位体コードイオン化増強試薬（ｉｃｉｅｒ）

Info

Publication number: JP4141834B2
Application number: JP2002548456A
Authority: JP
Inventors: チュ，ヨンチャン; ワン，ジャック・エイチ; ヒューウィック，ロドニー・エム
Original assignee: ジェネティックスインスティテュートエルエルシー
Priority date: 2000-10-23
Filing date: 2001-10-22
Publication date: 2008-08-27
Anticipated expiration: 2021-10-22
Also published as: WO2002046770A2; ATE405839T1; WO2002046770A3; US20030054570A1; DE60135504D1; AU2002241732B2; EP1415161A2; CA2426728A1; JP2004534205A; EP1415161B1; US6905879B2; AU4173202A

Description

【０００１】
発明の背景
本発明は、ハイスループットタンパク質分析の分野に関する。より具体的には、本発明は、ペプチドマスフィンガープリンティング又はフラグメントイオンに基づくデータベース検索と組み合わされたマトリックス支援レーザー脱離イオン化マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を使用したタンパク質の同定及び定量において使用するための新規試薬に関する。
【０００２】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、単離されたタンパク質の迅速な同定のための確立された道具となっており、特に、ヒトのガンに関与しているタンパク質を同定するため、多タンパク質複合体の成分を解明するため、そして完全に配列決定されたゲノムを有する生物におけるタンパク質の大規模同定のため、使用されている。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析の前に、タンパク質／ペプチドは、まず、１次元もしくは２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１Ｄもしくは２Ｄ−ＰＡＧＥ）、又は多次元液体クロマトグラフィにより分離される。次いで、タンパク質／ペプチドが、ペプチドマスマッピング又はフラグメントイオンに基づくデータベース検索により同定される。ＭＡＬＤＩ−ＭＳを含む分析法は、極めて信頼性が高く、自動化が容易であり、そして最も重要なこととして、データの獲得及び分析の両方に関して極めて速い。
【０００３】
しかしながら、ペプチドマスマッピングは、ペプチドが２〜３個しか見出されない場合には特に、信頼性の高い明瞭なタンパク質同定を常に行えるわけではない。さらに、ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、しばしば、エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー（ＥＳＩ−ＭＳ）よりも分析されたタンパク質の配列包括度（sequence coverage）が低くなる。この低い配列包括度は、主に、試料調製における疎水性ペプチドの不充分な回収、及びＭＡＬＤＩによるアルギニン残基を含まないペプチドの非効率的なイオン化に起因する。さらに、ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、本来、定量の道具としては不充分である。従って、ＭＡＬＤＩ−ＭＳデータを使用して直接的にタンパク質の相対存在量を測定することは極めて困難である。
【０００４】
タンパク質／ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析の性能を、信頼性のある同定及び正確な定量の両方に関して改良するため、付加的な試薬及び方法が、当分野においては求められている。
【０００５】
発明の概要
一つの態様において、本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用した、正確なタンパク質の相対的定量のための方法を提供する。この方法は、生物学的混合物に由来するタンパク質のジスルフィド結合を還元する工程；（場合により、還元の前又は後に）比較すべき試料を、重い同位体又は軽い同位体のいずれかでディファレンシャルに標識されうるリンカーを介してチオール反応基に付加されたグアニジノ基を含有している化合物と反応させる工程；混合物からタンパク質を分離する工程；タンパク質を消化する工程；並びにそれらを定量的マススペクトル分析に供する工程を含む。本発明の化合物はＭＡＬＤＩ−ＭＳによるシステイン含有ペプチドのイオン化効率の増強にも適している。この方法は、以下の付加的な工程と共に、前記の工程を使用して実施される。第一の試料を、同位体置換を含む試薬で標識し、第二の試料（例えば、対照）を同位体置換を欠いたこれらと同等の試薬で標識する。その後、分離工程の前に、試料又はそれらの一部を混合する。混合後、修飾されたタンパク質を１Ｄ−又は２Ｄ−ＰＡＧＥで分離することができ、ゲルバンド又はスポットを切り出し、ゲル中酵素消化に供し、その後ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に供する。別法として、修飾されたタンパク質の混合物を酵素消化に供し、次いで得られたペプチドを様々なクロマトグラフィ工程により分離した後、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に供してもよい。タンパク質は、ペプチドマスマッピング又はフラグメントイオンに基づくデータ分析により同定することができ、タンパク質の相対存在量は、２個の異なる試料に由来する同一ペプチドの相対的なピーク強度又はピーク面積を分析することにより入手することができる。
【０００６】
もう一つの態様において、本発明は、エレクトロスプレーＭＳ分析によるタンパク質の正確な相対的定量及び同定のための方法も提供する。この方法は、前記の方法と同様にして実施される。
【０００７】
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明の化合物を含有している新規な試薬及び試薬キットを提供する。
【０００８】
本発明のその他の態様及び利点を、以下の好ましい実施態様の詳細な説明においてさらに記載する。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明者らは、ゲル電気泳動、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、及びペプチドマスマッピングを含む従来のアプローチを使用したタンパク質の同定及び相対的定量の両方において、不明瞭な結果を引き起こす多数の問題を同定した。より具体的には、本発明者らは、従来の２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ペプチドマスマッピングのアプローチにおいては、ゲル像分析によるタンパク質の定量が、しばしば不正確となり、またタンパク質同定が、しばしば不明瞭となることを見出した。本発明者らは、ＭＡＬＤＩによるある種のペプチドの不充分なイオン化が、不明瞭なタンパク質同定の主因の一つであると考える。本発明は、従来のＭＡＬＤＩ−ＭＳ法及びペプチドマスマッピング法の欠点を克服する試薬及び方法を提供する。
【００１０】
有利なことに、本発明の試薬は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳに使用される、従来より記載されている試薬より、多くのペプチドピークをＭＡＬＤＩ−ＭＳにおいて提供する、システインアルキル化試薬として使用されうる。この本発明の試薬を利用した場合に観察されるペプチドピークの増加は、システイン含有ペプチドにおける親水性が増し、イオン化効率が高まることに起因する。さらに、本発明の方法は、軽い試薬と重い試薬との混合物を利用するため、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより観察される全ペプチドピーク内の正確なシステイン残基数を決定することが可能である。その結果、タンパク質配列包括度が高くなる（より多くのペプチドが観察される）とともに、観察される全ペプチド内の正確なシステイン残基数がわかるため、ペプチドマスフィンガープリンティングを使用したデータベース検索の特異性が大幅に増す。実際、この付加的な情報によって、ペプチドマスフィンガープリンティングにより、信頼性のあるタンパク質同定を常に行えるようになり、従って、ペプチドマスフィンガープリンティングと組み合わされたＭＡＬＤＩ−ＭＳは、真にハイスループットな、しかも明瞭な、タンパク質同定の道具となり得る。タンパク質配列包括度が高まることにより、より完全なタンパク質の化学修飾マップを得ることができる。さらに、ディファレンシャル標識戦略は、ダイナミックレンジを増加させ、個々のタンパク質を正確に定量することにより、プロテオミクスにおいて現在頻用されている２Ｄ−ＰＡＧＥ−ＭＳ又は２Ｄ−ＬＣ−ＭＳのアプローチを改良する。この改良により、２Ｄ−ＰＡＧＥ／２Ｄ−ＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳの使用を通して、任意のプロテオームのはるかに完全な像が提供され、従って疾患状態においてディファレンシャルに発現される薬物標的タンパク質を発見する可能性を増加させる。
【００１１】
従って、本発明の試薬は、タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析のための従来の試薬よりも有利である。これらの試薬は、その他の多様な目的にも使用されうる。これらの試薬及び使用を、以下に、より詳細に記載する。
【００１２】
グアニジノ官能基を含む化合物
ジスルフィド結合は、通常、球状タンパク質の内部に埋め込まれているという事実のため、システイン含有ペプチドは、しばしば比較的疎水性である。有利なことに、本発明の新規なシステイン修飾試薬は、システイン含有ペプチドの親水性を増加させ、従ってこれらの疎水性ペプチド／タンパク質の損失を最小限に抑えるのみならず、より重要なこととして、グアニジノ官能基の付加によりこれらのペプチドのイオン化効率をも増加させる。そのような使用に限定はされないが、これらの化合物は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析における使用にとって特に好適である。
【００１３】
一つの実施態様において、本発明の化合物（ＩＣＩＥＲ）は、安定同位体でディファレンシャルに標識されうるリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）を介してイオン化増強基（Ａ２）に付加された反応基（Ａ１）を含むＡ１−Ｌｉｎｋｅｒ−Ａ２なる式を有する。好適には、イオン化増強基は、強塩基性官能である。一つの実施態様において、イオン化増強基（Ａ２）は、グアニジノ基であり、式：−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ₂を有する。
【００１４】
リンカーは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いるタンパク質の定量及び同定において使用される安定同位体により、ディファレンシャルに標識され得る構造であればよい。一つの実施態様において、リンカーは、炭素原子、及び場合によってはＯ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ、ＮＲ′、ＣＯ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、Ｓ−Ｓ、ＳＯ₂、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ′、ＣＳ−ＮＲ′、又はＳｉ−Ｏより選択される１又は２個から構成される主鎖に１〜１００個、約３〜約５０個、又は約５〜約１５個の原子を含有している。場合により、Ｃ原子のうちの１個以上が、小さいアルキル基（Ｃ₁〜Ｃ₆）、アルケニル基、アルコキシ基、アリール基、又はジアリール基で置換されていてもよい。例えば、リンカーは、場合により前記のように置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基でありうる。もう一つの例において、リンカーは、それ自体、場合により置換されていてもよい１個以上のＣ原子と結合したＯ基、Ｓ基、ＮＨ基、ＮＲ基、ＮＲ′基、ＣＯ基、Ｃ（Ｏ）Ｏ基、Ｃ（Ｏ）Ｓ基、Ｓ−Ｓ基、ＳＯ₂基、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ′基、ＣＳ−ＮＲ′基、又はＳｉ−Ｏ基を１個以上含有していてもよい。一つの実施態様において、リンカーは、約４〜約１２個の原子の安定同位体による置換を含有しているアルキル基である。しかしながら、リンカーは、望ましい場合には、６個超の同位体置換を含有していてもよい。例えば、ＭＳが有用である分子量範囲の上限（例えば、約２０００〜３５００Da）のペプチドの場合、必要とされるディファレンシャルな分析を達成するためには、リンカーが８個、１０個、１２個、又はそれ以上の置換を含有していることが望ましいが、ＭＳの分子量範囲の下限（例えば、約５００〜２０００Da）のペプチドでは、わずか４〜６個の置換で充分かもしれない。リンカー内の水素原子、窒素原子、酸素原子、炭素原子、又は硫黄原子のうちの１個以上が、選択された置換数分、同位体的に安定な同位体：²Ｈ、¹³Ｃ、¹⁵Ｎ、¹⁷Ｏ、¹⁸Ｏ、又は³⁴Ｓで置換され得る。
【００１５】
反応基Ａ１は、チオール、より具体的にはシステイン残基と、好ましく特異的に反応する。望ましくは、チオール反応基は、ヨウ化物、マレイミド（例えば、下記構造参照）、
【００１６】
【化４】

【００１７】
又はＸ−ＣＨ₂ＣＯ−のようなα−ハロアセチル基からなる群より選択される。
最も好適には、Ｘは、ヨードアセチル、ブロモアセチル、又はクロロアセチル官能性を形成するヨウ素、臭素、及び塩素のようなハロゲンより選択される。
【００１８】
もう一つの別実施態様において、チオール反応基は、
【００１９】
【化５】

【００２０】
等のような、その他のα−、β−共役二重結合構造より選択されてもよい。さらにその他の反応基は、システイン含有ペプチドとの結合において使用するその他のチオール特異的反応基を含有するよう、容易に合成することができる。
【００２１】
いくつかの好ましい実施態様において、本発明の化合物（ＩＣＩＥＲ）は、リンカーによりグアニジノ基に付加されたチオール反応基を含み、その化合物の式は、以下の通りである。
【００２２】
【化６】

【００２３】
化合物Ｃ′（重いＩＣＩＥＲの一例）は、化合物Ｃ（軽いＩＣＩＥＲの一例）の、特に好ましい同位体的に重い置換型であるが、この式のその他の同位体的に重い型も、本発明に従い容易に作製され得る。同様に、化合物Ａ、Ｂ、及びＤの多様な置換が、本明細書に提供された教示に基づき、当業者によって容易に作出され得る。
【００２４】
試薬の合成
本発明の化合物は、下記実施例に記載された方法及び当業者に既知の技術を利用して、当業者によって容易に合成されうる。いくつかの例示的な方法が、下記実施例１に例示されている。
【００２５】
例えば、適当な出発物質を、約１容積部に対し約１容積部という比率のテトラヒドロン（ＴＨＦ）と水との混合物の中で、室温で、約１０〜約４８時間、最も好ましくは約１６時間、Ｌ−アルギニンと混合することができる。次いで、反応混合物をアセトンへと注入し、固体を収集する。次いで、固体を水に溶解させ、適当なカラムへと導入し、水で溶出させ、本発明の化合物を得る。しかしながら、本発明はそのように制限はされない。例えば、その他の適当な溶媒が、ＴＨＦ又はアセトンの代わりに使用され得る。別法として、ＴＨＦ対水の比率が、必要又は所望に応じて調整され得る。もう一つの例として、Ｌ−アルギニンの塩（例えば、Ｌ−アルギニンＤ７−塩酸塩又はＬ−アルギニンアミド二塩酸塩）を水に溶解させ、pHを塩基性域（例えば、約８〜約１３、より好ましくは約８〜約１０）に調整した後、ヨードアセチル無水物と反応させることができる。その後、例えばpHを酸性域（約２〜４）に低下させ、樹脂を濾過し、水性溶液を抽出した後、さらに濾過することにより、固体を収集することができる。得られた固体を凍結乾燥させ、所望の化合物を得ることができる。
【００２６】
しかしながら、本明細書に提供された記載より、当業者であれば、本発明の化合物の合成のため、適切な技術及び試薬を容易に選択することができるであろう。
【００２７】
合成後、ｉｎｓｉｔｕで作成された試薬は、等電点電気泳動の第一分離工程を干渉する過剰の塩を含有しているため、２Ｄ−ＰＡＧＥと併せて使用される場合には特に、最良の結果を達成するため、化合物は精製されることが好ましい。好適には、精製は濾過により実施される。別法として、その他の適当な方法が、当業者により容易に選択され得る。
【００２８】
これらの化合物は、タンパク質／ペプチドの標識、及び／又はシステイン含有ペプチドのイオン化の増加が望まれる様々な方法において利用されうる。しかしながら、化合物は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用したハイスループットなタンパク質の同定及び定量のための方法において特に有用である。
【００２９】
本発明の化合物の使用法
本発明の化合物は、混合物中の１種以上のタンパク質の定量及び同定のための方法において特に有用である。好適には、本発明の方法により分析されるペプチドは、約５００〜約３５００ダルトン（Da）である。タンパク質混合物は、細胞もしくは組織の培養物に由来する試料、又は生物学的液体、細胞、もしくは組織でありうる。培養物由来の試料には、細胞ホモジネート及び細胞画分が含まれる。生物学的液体には、尿、血液（例えば全血、血漿、及び血清を含む）、脳脊髄液、涙、便、唾液、及び洗浄液が含まれる。混合物は、タンパク質、脂質、炭水化物、及び核酸を含んでいてもよい。本発明の方法は、ＭＳ法及び（ＭＳ）ⁿ法を利用する。現在のところ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化ＭＳ（ＭＡＬＤＩ／ＭＳ）法及びエレクトロスプレーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ／ＭＳ）法が好ましい。しかしながら、その他の様々なＭＳ技術及び（ＭＳ）ⁿ技術も選択されうる。
【００３０】
一つの実施態様において、本発明は、本発明の化合物を使用したプロテオーム（即ち、タンパク質及び／又はペプチドを含有している複雑な混合物）の定量分析のための方法を提供する。典型的には、試料は、前記定義のような起源より得られる。単離されたタンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ及びペプチドマスマッピングに基づく技術を使用して同定する場合には、試料は、同一起源に由来するサンプルとして得られる、又は別の起源より得られる対照タンパク質混合物と比較してもよい。別法として、単離されたタンパク質は、ポストソース分解（ＰＳＤ）又は衝突誘起解離（ＣＩＤ）の技術を使用し、続いてフラグメントイオンに基づくデータベース検索（M.Mann and M.Wilm,Anal.Chem.,66:4390(1994)）又はｄｅｎｏｖｏ配列決定を使用して同定されてもよく、試料は、ＭＳデータを使用して対照タンパク質混合物と比較されうる。試料タンパク質混合物及び対照タンパク質混合物は、一方の混合物（例えば、試料）のみを、同位体的に安定な同位体を含有している化合物と反応させる点を除き同一の反応条件を適用して、別々にプロセシングされる。別法として、タンパク質の相対的定量が必要ない場合には、対照試料は必要なく、本発明の化合物の、同位体的に重い等価物も必要ない。場合により、標識反応工程は、本明細書に記載された他の工程の前又は後に実施してもよい。
【００３１】
典型的には、タンパク質試料は、１Ｄ−ＰＡＧＥもしくは２Ｄ−ＰＡＧＥ又は溶液内酵素消化に適した緩衝液に溶解させられる。そのような緩衝液は、多様な供給元（例えば、Genomic Solutions, Ann Arbor, MI; BioRad, Hercules, CA）より商業的に購入してもよく、又は既知の方法に従い調製してもよい。以下の工程の全体を通して、混合物のpHは、中性又は塩基性の条件下で維持される。最も好適には、pHは７〜１０に維持される。グアニジノ基を含有している本発明の化合物（例えば、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ′、及びＤ）を利用する場合には、好ましくは、本発明の方法は、塩基性pHにおいて実施される。最も好適には、pHは約８〜約９の範囲であり、最も好ましくは約８．５である。別法として、マレイミドアフィニティタグを含有している本発明の化合物が利用される場合には、本発明の方法は、好ましくは、中性pHにおいて実施される。この場合、本法は、好ましくは、約６．５〜約８．５、より好ましくは７〜８、最も好ましくは７〜７．５のpHにおいて実施される。
【００３２】
試料及び対照の調製の後、（１以上の）試料又は対照混合物の中のタンパク質のジスルフィド結合が遊離ＳＨ基へと還元される。適当な還元剤には、トリ−ｎ−ブチルホスフィン、メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及びトリカルボキシエチルホスフィンが含まれ、それらは過剰に使用される。しかしながら、その他の適当な還元剤を代用してもよい。一つの実施態様において、ジスルフィド結合を、５０mMトリス緩衝液、６ＭグアニジンＨＣｌ、５mMトリブチルホスフィンを使用して、pH８．５、３７℃で１時間、変性させる。しかしながら、塩基性域のpHに緩衝されたその他の還元剤を選択し、室温で、様々な時間インキュベートしてもよい。
【００３３】
タンパク質定量が実施されない場合には、対照試料を標識する必要がなく、その後の重い又は軽いＩＣＩＥＲ同等物による平行反応工程、及び混合工程が排除されうる。タンパク質定量が実施される場合には、選択された本発明の化合物であり、同位体的に重い又は軽い化合物を、比較すべき試料と反応させる。この標識反応工程は、本明細書に記載された他の工程の前又は後に実施してもよい。典型的には、対照試料が、同位体的に重い化合物で標識され、（１以上の）実験試料が同位体的に軽い型の化合物で標識される。しかしながら、標識は逆であってもよい。還元、及び選択された標識試薬（重い又は軽いＩＣＩＥＲ）との反応後、一定量の試料の一部（同位体的に異なる化合物、例えば対応する軽い化合物及び重い化合物により任意に標識されたもの）が、合わせられ、その後の全工程がプールされた試料に対して実施される。好ましくは、等量の試料が、合わせられる。
【００３４】
好適には、１次元（１Ｄ）又は２次元（２Ｄ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のために調製されたゲルは、多様な商業的供給元から入手可能であり、製造業者の説明書に従い使用される（Genomics Solutions; Ann Arbor, MI; NOVEX, San Diego, CA）。しかしながら、本発明はそのように制限はされない。当業者であれば、容易に、ＩＣＩＥＲ標識タンパク質を分離するために、その他の技術を適用することができよう。
【００３５】
ＩＣＩＥＲで処理された試料の混合の後、タンパク質は、１Ｄ−ＰＡＧＥ又は２Ｄ−ＰＡＧＥにより分離される。次いで、目的のタンパク質のバンド又はスポットが切り出され、酵素消化に供される。好適には、タンパク質は、前述の技術（例えば、Rosenfeld et al, Anal. Biochem., 203: 173-179(1992)及びSechi et al, Anal. Chem., 70: 5150-5158(1998)）、又は下記実施例に記載されるようなそれらの変法を使用して、ゲル中消化に供されうる。
【００３６】
この酵素消化法における使用に適したプロテアーゼは、塩基性条件及び手順と適合するプロテアーゼの中から容易に選択されうる。一つの実施態様において、プロテアーゼはトリプシンである。もう一つの態様において、塩基性pHにおいて類似の活性レベルを有するプロテアーゼの混合物が使用される。そのようなプロテアーゼには、特にアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチドが含まれる。また、分析すべきタンパク質が小さい（例えば、約５００〜１０００Da）場合には、タンパク質の消化が省略され得る。
【００３７】
好適には、ペプチドは、従来の技術を使用してゲルから抽出される。例えば、脱染後、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液をゲルバンドに添加し、インキュベートした後、液相を収集することにより、ペプチドは抽出されうる。この工程は繰り返されてもよく、抽出を完了するため、さらなるアセトニトリルが添加される。抽出物溶液は、プールされ、乾燥させられ、次いでアセトニトリル及びＴＦＡの溶液で再生させられる。ペプチド抽出に適したその他の方法は、当業者に周知であり、容易に利用されうる。
【００３８】
次いで、単離された誘導体化されたペプチドは、ＭＳ技術を使用して分析される。標識されたペプチドの起源であるタンパク質の相対量及び配列同一性の両方が、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ技術（即ち、ＭＳ及びＭＳⁿ（ＰＳＤ、ＣＩＤ））、並びにその後のデータ分析（即ち、ペプチドマスマッピング又はフラグメントイオンに基づくデータ分析）により決定されうる。好ましくは、タンパク質の相対的定量は、ＭＳデータから得られ、タンパク質の同定は、ＭＳデータ（ペプチドマスマッピング）又はＭＳⁿデータ（フラグメントイオンに基づくデータベース検索）のいずれかの分析から導出される。
【００３９】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳを実施するための機器、及びそれらの使用のための技術は、国際公開ＷＯ９３／２４８３５、米国特許第５，２８８，６４４号、R. Beavis and B. Chait, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6873-6877(1990); B.Chait and K.Standing, Int. J Mass Spectrom, Ion Phys., 40: 185(1981)、及びMamyrin et al, Sov. Phys. JETP, 37: 45(1973)に記載されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。簡潔には、例えばＱスイッチルモニクス（Lumonics）ＨＹ４００ネオジム／イットリウムアルミニウムザクロ石レーザー（「Ｎｄ−ＹＡＧ」）（３５５nm、１０nsec出力パルス）の、周波数三重（tripled）出力を、レンズ（１２インチ焦点距離）により、溶融シリカウィンドウを通し、質量分析計内部の試料へと集束させる。レーザーにより形成された生成イオンは、３０kVという静電ポテンシャルにより加速される。次いで、イオンは、３０μPaという真空に維持された２mの管を降下し、イオンの管末端への到達が、例えばLecroy TR8828D一時記録機を使用して検出され記録される。最大２００の個々のレーザーショットの一時記録が総合され、得られたヒストグラムがマススペクトルとしてプロットされる。ピークの重心の決定及びデータ換算は、ＶＡＸワークステーション又はその他のコンピュータシステムを使用して実施されうる。
【００４０】
しかしながら、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）／ＭＳ等を含むその他のＭＳ技術も、本発明の化合物（ＩＣＩＥＲ）により修飾されたタンパク質及びペプチドを分析するために容易に利用され得る。
【００４１】
試薬キット
本発明は、さらに、質量スペクトル分析によるタンパク質の分析のための試薬キットを提供する。典型的には、そのようなキットは、１種以上の本発明の化合物を含有する。最も好適には、キットは、ディファレンシャルに標識された実質的に同一の化合物（同位体的に軽い化合物及び重い化合物）のセットを含有する。キットは、１種以上のタンパク質分解酵素、反応緩衝液、又は洗浄溶液をさらに含有していてもよい。
【００４２】
本発明の方法及びキットは、タンパク質の存在、欠如、不足、又は過剰が、正常又は疾患の状況と関連している、多様な臨床的及び診断的なアッセイに使用されうる。本発明の方法及びキットは、細胞及び組織におけるタンパク質発現の定性的及び定量的な分析のために使用されうる。方法及びキットは、細胞又は生物学的液体における発現レベルが、薬物、毒素、環境変化、又は条件もしくは細胞状態の変化、例えば、疾患状態、悪性度、部位特異的突然変異、遺伝子治療、又は遺伝子ノックアウトにより影響を受けるタンパク質をスクリーニングするためにも使用されうる。
【００４３】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるのであって、本発明の範囲を制限するものではない。特定の試薬及び条件が以下の実施例に概説されているが、それらを変更することが可能であり、それらも本発明の本旨及び範囲に包含されるものであることを、当業者であれば認識するであろう。
【００４４】
実施例１：本発明の試薬
この実施例は、本発明の例示化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ′、及びＤの合成方法を例示する。これらの化合物は、以下の実施例において示されるように、ＭＡＩＤＩ−ＭＳ及びペプチドマスマッピングにおける試薬として有用である。
【００４５】
１．２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イル）−アセチルアミノ）−５−グアニジノ−ペンタン酸又はマレイミドアセチルアルギニン（Ａ）：
（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イル）−酢酸−２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（４．８g、１９mmol）及びＬ−アルギニン（２．９、１７mmol）を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）と水との混合物（ＴＨＦ：Ｈ₂０（１：１））３０mLの中で、室温で１６時間撹拌した。反応混合物を、アセトン（１．５L）へと注入し、固体を収集した。固体をＨ₂Ｏ（３mL）に溶解し、次いでベーカーボンド（Bakerbond）（オクタデシル（Ｃ１８）４０μm prep LC Packing）カラムに導入し、水で溶出し、生成物１．１gを得た。
【００４６】
【表１】

【００４７】
２．２−（３−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イル）−プロピオニルアミノ）−５−グアニジノ−ペンタン酸又はマレイミドプロピオニルアルギニン（Ｂ）：
３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イル）−プロピオン酸−２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（７．６g、２８．５mmol）及びＬ−アルギニン（４．３g、２５mmol）を、ＴＨＦ：Ｈ₂Ｏ（１：１）の混合物５０mLの中で室温で１６時間撹拌した。反応混合物を、アセトン（１．５L）へと注入し、固体を収集した。固体をＨ₂Ｏ（５mL）に溶解し、次いでベーカーボンド（オクタデシル（Ｃ１８）４０μm prep LC Packing）カラムに導入し、水で溶出し、生成物１．５gを得た。
【００４８】
【表２】

【００４９】
３．Ｎ−α−（ヨードアセチル）−Ｌ−アルギニン（Ｃ）：
Ｌ−アルギニン（８．０g、４５．６mmol）を脱イオン水（７５mL）に溶解し、ダウエックス（Dowex）１ｘ２−１００（ＯＨ^-）でpHを８〜９．５に維持しながら、激しく撹拌し無水ヨード酢酸（２１．０g、５９．３mmol）と１５分間反応させた。pHを４にまで低下させ（５〜１０分）、pHが２になるまで５５％ヨウ化水素酸水溶液を添加した。樹脂をろ過し、ヨウ化水素酸水溶液をジエチルエーテル（３×２５０ml）で抽出した。水層を、ダウエックス１ｘ２−１００（ＯＨ^-）でpH８〜９にまで中和し、樹脂をろ過し、水で洗浄し、得られた溶液を凍結乾燥させ、Ｎ−α−（ヨードアセチル）−Ｌ−アルギニン（１１．９g、７６％全収率）を綿毛状の白色粉末として得た。
【００５０】
【表３】

【００５１】
４．Ｎ−α−（ヨードアセチル）−Ｌ−アルギニン−Ｄ₇（Ｃ′）：
Ｌ−アルギニン−Ｄ₇塩酸塩（５．２g、２８．７３mmol）を、脱イオン水（５０mL）に溶解させ、ダウエックス１ｘ２−１００（ＯＨ^-）でpHを８に調整した。次いで、それを前記と同様にして無水ヨード酢酸（１５．５g、４３．７８mmol）と反応させ、Ｎ−α−（ヨードアセチル）−Ｌ−アルギニン−Ｄ₇（５．５g、全収率５５％）を綿毛状の白色粉末として得た。
【００５２】
【表４】

【００５３】
５．Ｎ−α−（ヨードアセチル）−Ｌ−アルギニンアミド塩酸塩（Ｄ）：
Ｌ−アルギニンアミド二塩酸塩（１０．５g、４２．６mmol）を脱イオン水（７５mL）に溶解し、ダウエックス１ｘ２−１００（ＯＨ^-）でpHを１３に調整した。次いで、ダウエックス１ｘ２−１００（ＯＨ^-）でpHを８〜９．５に維持しながら、激しく撹拌し、無水ヨード酢酸（１８．０g、５０．８５mmol）と１５分間反応させた。pHをおよそ４にまで低下させ（５〜１０分）、pHが２になるまで５５％ヨウ化水素酸水溶液を添加した。樹脂をろ過し、水性溶液をジエチルエーテル（３×２５０ml）により抽出した。水層をパッド、ダウエックスリターディオン（Dowex Retardion）１１Ａ８（５０g）でろ過し、水で洗浄した。得られた溶液を凍結乾燥させ、Ｎ−α−（ヨードアセチル）−Ｌ−アルギニンアミド塩酸塩（１１．１g、６９％）を綿毛状の白色粉末として得た。
【００５４】
【表５】

【００５５】
実施例２−イオン化増強を証明する比較例−本発明の試薬（軽いＩＣＩＥＲ）又は従来の試薬（ＩＡＡ）のいずれかによる処理後の６種の個々のモデルタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析
Ａ．還元：
６種のモデルタンパク質、ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、α−ラクトアルブミン、トリプシノーゲン、リゾチーム、及びリボヌクレアーゼ各９０μgを、それぞれ、５％ＳＤＳ、２０％グリセロール、及び７５０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．４５）を含有する反応緩衝液３０μLに溶解し、３μg/μLの溶液を得た。各溶液に、（タンパク質１分子当たりのシステイン含量に対して）２００倍過剰のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加した。９０℃で３０分間還元を進行させた後、１０分間溶液を冷却した。
【００５６】
Ｂ．システイン修飾：
試薬Ｃ（軽いＩＣＩＥＲ）を、実施例１に記載のように合成した。６種のタンパク質を、各々、別々に試薬Ｃ及びヨードアセトアミドの両方を使用してアルキル化した。アルキル化試薬（試薬Ｃ又はヨードアセトアミド）の量は、工程Ａにおいて使用されたＤＴＴの量に対し５倍過剰相当とした。室温で１時間、アルキル化を進行させた。次いで、試薬Ｃにより標識された各タンパク質０．１μgを、ヨードアセトアミドによりアルキル化された同一タンパク質０．１μgと混合した。次いで、得られた６種のタンパク質溶液を、各々、１：１比（容積対容積）で２×トリシン添加緩衝液と混合した。
【００５７】
Ｃ．ゲル電気泳動及び染色：
パートＢに記載の、最終的に得られたタンパク質溶液（各溶液は、６種のタンパク質のうちの１種を０．２μg含有している）を、各々、１０％１０穴トリシンミニゲル（Novex,San Diego,CA）にロードした。ゲルを、製造業者の説明書に従って泳動させ、クーマシーブルーＧ−２５０で染色した。
【００５８】
Ｄ．ゲル中消化：
タンパク質の自動ゲル中消化を、Rosenfeld et al, Anal. Biochem., 203: 173-179(1992)及びSechi et al,Anal. Chem., 70: 5150-5158(1998）の方法を改変して、９６穴プロゲスト（ProGest）（Genomic Solutions, Ann Arbor, MI）を使用して実施した。簡単に説明すると、ゲルバンドを１×１mm片へと切り出し、次いで以下の溶液：（１）２００mM ＮＨ₄ＨＣＯ₃、（２）５０％メタノール／１０％酢酸；（３）４０％エタノール／水、各５０μLで連続的に洗浄することにより脱染し、各工程につき１０分間インキュベートした。３つの洗浄工程を５回繰り返し、次いで１０mM ＮＨ₄ＨＣＯ₃を１００μL添加し、１０分間インキュベートした。次いで、アセトニトリル２×１００μLの添加により、ゲル片を脱水した。過剰のアセトニトリルを除去した後、トリプシン６２５ngを含有している１０mM ＮＨ₄ＨＣＯ₃の溶液２５μLでゲルを再水和し、３７℃で１０時間インキュベートした。５０％アセトニトリル／０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液３０μLを添加することによりペプチドを抽出し、１０分間インキュベートした後、液相を収集した。この工程をもう１回繰り返し、次いで抽出を完了するためアセトニトリル３０μLを添加した。抽出された溶液を共にプールし、スピードバック（SpeedVac）（Savant,Holbrook,NY）を用いて完全に乾燥させた。最後に、乾燥したペプチド試料を、アセトニトリル／水／ＴＦＡ（５０：５０：１）溶液２０μLで再生させた。
【００５９】
Ｅ．ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー
窒素レーザー（３３７nm）を装備したマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）遅延引き出し（delayed extraction）（ＤＥ）リフレクトロン飛行時間型（ＴＯＦ）装置（Voyager DE-STR,PE Biosystems,Frammingham,MA）をリフレクトロンモードで利用して、再生させたペプチド溶液の２０分の１を分析することにより、全てのペプチドの分子量を決定した。試料溶液０．８μLを、０．５％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル／水の中に飽和したα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含有するマトリックス溶液０．８μLと混合することにより、ペプチドを結晶化させた。スペクトルを、既知のペプチドの混合物を使用して外的に較正した。
【００６０】
各スペクトルよりピークテーブルを作成し、データを使用して、下記のイオン化増強及びピーク比の表を創作した。
【００６１】
以下の表は、試薬Ｃ（ＩＣＩＥＲ）又はヨードアセトアミド（ＩＡＡ）による処理後の６種のタンパク質試料のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析の結果、及びそれらの比較を要約したものである。表Ｉ〜XVIIIを参照のこと。
【００６２】
【表６】

【００６３】
これらのデータより、従来のシステインアルキル化試薬であるヨードアセトアミドと比較して、ＩＣＩＥＲが、Ｃ末端にリジン残基を含むシステイン含有トリプシンペプチドのイオン化効率を大きく増加させたことが結論付けられた。例えば、試薬Ｃ及びＩＡＡの両方により修飾されたリゾチームに由来するトリプシンペプチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトル（表XII参照）において、試薬Ｃにより修飾されたペプチド（ＧＹＳＬＧＮＷＶＣＡＡＫ、配列番号：２１のａａ２〜１３、分子量１４２８．７２Da）の強度は、ＩＡＡにより修飾された同ペプチド（分子量１３２５．６３Da）の場合の７．４倍である。さらに、ＩＡＡを使用した場合には存在しなかった、Ｃ末端にリジン残基を含む多くのシステイン含有ペプチドの質量ピークが、ＩＣＩＥＲを使用した場合には良好に観察されるようになった。一方で、ＩＣＩＥＲ修飾は、Ｃ末端にアルギニン残基を含むペプチドのイオン化には有意な効果を及ぼさなかった。結果として、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより検出されるシステイン含有ペプチドの全体数も増加し、従って、ＩＣＩＥＲを使用した場合、分析タンパク質について得られる配列包括度は、ヨードアセトアミドを使用した場合よりもはるかに高くなる。
【００６４】
実施例３−モデルタンパク質としてＣＴＬＡ４−ＩｇＧを使用したＩＣＩＥＲ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳによるタンパク質定量
１：１、１：１．５、１：２、１：５、及び１：１０の比率の異なる量のＣＴＬＡ４−ＩｇＧを、実施例２に記載されたようにＤＴＴにより還元した。実施例２に記載されたのと同一の条件を使用して、比較すべき試料を軽いＩＣＩＥＲ又は重いＩＣＩＥＲのいずれかでアルキル化し、次いで共に混合した後、ゲル電気泳動、タンパク質染色、ゲル中消化、及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に供した。
【００６５】
表XIXは、軽いＩＣＩＥＲ及び重いＩＣＩＥＲを使用した異なる比率のＣＴＬＡ４−ＩｇＧの標識を要約したものである。ペプチド質量は、全て、デフォルトの較正ファイルを使用して外的に較正した。２つの異なるプールからのタンパク質の相対的定量は、軽いＩＣＩＥＲ及び重いＩＣＩＥＲにより標識された７つのペプチド対全ての質量強度比を平均化することにより決定した。
【００６６】
【表７】

【００６７】
表XIX中、^*は、観察された比率の値を示す。下線は、不充分な品質、又はオーバーラップしているピークを示す。これらの値は、統計計算には含めなかった。
【００６８】
これらのデータより、特に、極めて弱い強度を与えるか、又は他の質量ピークとオーバーラップしている質量ピークを排除した場合、観察された比率が、軽いＩＣＩＥＲで標識されたペプチドの、重いＩＣＩＥＲで標識されたペプチドに対する比率の予想値を密接に反映することが例示された。ＩＣＩＥＲアプローチを使用した定量の誤差率（％）は、全ての比率に関して１２％未満であり、濃度測定法とは対照的に極めて正確である。さらに、ＩＣＩＥＲアプローチは、定量が既知の配列同一性を有するペプチドに基づいているため、単一の試料、ゲルバンド、又はスポットの中の複数のタンパク質を定量することも可能である。
【００６９】
これらのデータより、軽いＩＣＩＥＲと重いＩＣＩＥＲとの混合物の使用により、追加の試料操作なしに、検出された各ＭＳピークに含まれるシステイン残基の正確な数が、同位体的に標識された対の存在又は欠如に基づき決定されうることも結論付けられた（表XX参照）。この付加的な情報は、より検索条件の多いペプチドマスマッピングのため、ペプチド質量と共に容易に利用され、信頼性のあるタンパク質同定が行える。これは、一つの分析において複数のタンパク質を扱う場合、又は質量ピークの数が限定されている場合、特に有用である。
【００７０】
【表８】

【００７１】
この明細書中に引用された全ての出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。特に好ましい実施態様に関して本発明を説明してきたが、本発明の本旨を逸脱することなく、改変を施すことが可能であることが理解されよう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されるものとする。
【配列表】

Claims

マススペクトロメトリー（ＭＳ）を使用したタンパク質及びペプチドの同定及び相対的定量を増強するための方法であって、
（ａ）タンパク質及びペプチドを含有している生物学的混合物に由来する第一の試料のジスルフィド結合を還元する工程；
（ｂ）ディファレンシャルに標識され得るリンカーを介してグアニジノ基に付加されたチオール特異的反応基を含む試薬で、第一の試料の中のタンパク質及びペプチドを標識する工程；
（ｃ）試料からタンパク質及びペプチドを分離する工程；
（ｄ）タンパク質を消化し、第一の試料に由来する消化ペプチド及びペプチドを含有する混合物を提供する工程；並びに
（ｅ）（ｄ）のペプチドを定量的ＭＳ分析及びタンパク質同定に供する工程を含む方法。
工程（ｅ）が（ｄ）のペプチドをマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）−ＭＳに供することを含む、請求項１記載の方法。
試薬が、α−ハロアセチル（−Ｘ−ＣＨ₂ＣＯ−、Ｘ＝Ｉ、Ｂｒ、もしくはＣｌ）、又は下記式：

からなる群より選択される構造を有するマレイミド基からなる群より選択されるチオール特異的反応基を含む、請求項１記載の方法。
リンカーが、３〜８個の炭素原子を有するアルキル鎖を含み、前記炭素原子が１個以上のアミド基、カルボキシ基、又はアミノ基で置換されているか又は置換されていない、請求項１記載の方法。
タンパク質及びペプチドがさらにペプチドマスマッピングに供される、請求項１記載の方法であって、
第二の試料の中のタンパク質及びペプチドを重い安定同位体を有する該試薬で標識する工程；
分離工程の前に、第一の試料と第二の試料とを混合する工程をさらに含み、標識工程（ｂ）における試薬が軽い安定同位体を含有している方法。
工程（ｂ）の試薬内のリンカーが、４〜１２個の原子の安定同位体による置換を含有している、請求項１記載の方法。
リンカーが、７個の安定同位体を含有している、請求項６記載の方法。
水素原子が、重水素で置換されている、請求項６記載の方法。
試薬が、下記式：

からなる群より選択される、請求項５記載の方法。
分離工程が、１次元もしくは２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１Ｄもしくは２Ｄ−ＰＡＧＥ）、又は液体クロマトグラフィを使用して実施される、請求項５記載の方法。
消化工程が、ゲル中又は溶液中で実施される、請求項１記載の方法。
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ及びその後のデータ分析のためにペプチドを調製する方法であって、
（ａ）生物学的試料に由来するタンパク質のジスルフィド結合を還元する工程；
（ｂ）軽い安定同位体でディファレンシャルに標識されたリンカーを介してグアニジノ基に付加されたチオール特異的反応基を含む試薬で、一つの試料中のタンパク質を標識する工程；
（ｃ）重い安定同位体を有する試薬で、第二の試料の中のタンパク質を標識する工程；
（ｄ）第一及び第二の標識された試料を混合する工程；
（ｅ）混合物からタンパク質を分離する工程；
（ｆ）タンパク質を消化し、それによりＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析及びタンパク質同定のためのペプチドを準備する工程を含む方法。
消化工程が、トリプシンを使用して実施される、請求項１１記載の方法。
タンパク質混合物の定量的分析において有用な化合物であって、安定同位体でディファレンシャルに標識され得るリンカーを介してグアニジノ基に付加されたチオール特異的反応基を含む化合物。
リンカーが、４〜１２個の安定同位体を含有している、請求項１４記載の化合物。
リンカーが、少なくとも６個の水素原子の重水素による置換を含有している、請求項１４記載の化合物。
下記式：

からなる群より選択される、請求項１４記載の化合物。
請求項１４又は請求項１７の化合物を含む、マススペクトロメトリック分析によるタンパク質の分析のための試薬キット。
ディファレンシャルに標識された、実質的に同一のアルキル化試薬のセットを含む、請求項１８記載の試薬キット。
該化合物により修飾されたタンパク質の消化のために使用する、１種以上のタンパク質分解酵素をさらに含む、請求項１８記載の試薬キット。