CN113267554A - 一种用于评估蛋白质组还原烷基化效率的质控方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于评估蛋白质组还原烷基化效率的质控方法，包括以下步骤：(1)还原烷基化之前的任一步骤，在样品中加入含有至少两个半胱氨酸的多肽或蛋白标品，然后进行后续的操作至上机检测；(2)原始数据经软件分析后得到可鉴定肽段，分别找出该标品含有半胱氨酸的肽段以及不含半胱氨酸的肽段，标品还原烷基化率＝(含半胱氨酸的肽段峰面积/不含半胱氨酸的肽段峰面积)*100％；(3)根据不同样品中标品还原烷基化率的差异，评估样品的还原烷基化效率。本发明方法可有效的对还原烷基化效率进行计算并标准化此步骤的质控方式，用于评估同批次不同样本间以及不同批次间还原烷基化的效率，进而辅助评判蛋白质组学的鉴定结果及数据分析。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种用于评估蛋白质组还原烷基化效率的质控方法。
背景技术
蛋白质组学研究的意义重大，包括对疾病进行早筛分类、对预后进行预判、筛选药物靶点等。然而蛋白质组提取作为蛋白质组学研究中的关键一步，其提取的质量直接影响整个研究过程。
蛋白质组提取步骤包括样本裂解、提取蛋白、还原烷基化、酶解、除盐等，每个步骤对最终获得的肽段质量都至关重要，尤其还原烷基化如果不够充分，直接影响酶解效率，影响最终肽段的鉴定及定量。目前对于还原烷基化效率的判断依赖于对整体还原烷基化效率进行计算，计算方式为鉴定到的含有半胱氨酸的肽段种类数除以总肽段种类数，最终的结果不能反应含有半胱氨酸的肽段被还原烷基化的比例，因此不能区分整体烷基化效率的差异是样本本身属性还是实验操作所致。目前还没有成熟的系统和标准对还原烷基化实验操作进行质控。
发明内容
发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于评估蛋白质组还原烷基化效率的质控方法，可有效的对还原烷基化的效率进行评估。
技术方案：一种用于评估在质谱分析过程中蛋白质组还原烷基化效率的质控方法，包括以下步骤：
(1)还原烷基化之前的任一步骤，在样品中加入含有至少两个半胱氨酸的多肽或蛋白标品，然后进行后续的操作至上机检测；
(2)质谱原始数据经软件分析后得到可鉴定肽段，分别找出该标品含有半胱氨酸的肽段以及不含半胱氨酸的肽段，标品还原烷基化率＝(含半胱氨酸的肽段峰面积/不含半胱氨酸的肽段峰面积)*100％；
(3)根据样品中标品还原烷基化率，评估样品的还原烷基化效率。
优选：
步骤(1)中，所述多肽或蛋白标品为合成的标准品，酶切后的肽段与样本内源性肽段没有重复。
步骤(1)中，所述多肽或蛋白标品可被特定蛋白酶酶切为至少两个肽段，其中一个至少含有两个半胱氨酸，一个不含有半胱氨酸。
步骤(1)中，所述后续的操作包括酶解、除盐和/或分离等。
步骤(2)中，所述软件为蛋白质组分析软件，例如选自Spectronaut软件。
步骤(3)中，所述评估样品的还原烷基化效率，可以评估同批次不同样本间或者不同批次间还原烷基化的效率。
有益效果：相对于现有技术，本发明提供一种用于评估蛋白质组还原烷基化效率的质控方法，可有效的对还原烷基化效率进行计算，通过在还原烷基化前加入含有至少两个半胱氨酸(Cysteine)的多肽或蛋白标品用于评估同批次不同样本间以及不同批次间还原烷基化的效率，进而辅助评判蛋白质组学的鉴定结果及数据分析。
具体实施方式
以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
实施例
1.三个不同的细胞样本，如样本1、样本2、样本3，各分为一样的两份，作为组1和组2；
2.两组分别加入适量裂解液提取蛋白，组1使用商品化液相级纯度的水配置裂解液，组2使用Millipore设备制备的双蒸水配置裂解液；
3.向每个样本中加入等量的多肽标品，如MCGAYCDLKSPFQYNTVG，然后加入适量浓度TCEP和CAA分别进行还原烷基化及其他操作，等量上机检测；
4.原始数据经Spectronaut软件分析后，得到最终鉴定到的肽段/蛋白及对应的相对表达量，对三个样本各自整体的还原烷基化率进行计算，结果见表1：
表1整体还原烷基化效率
5.根据可鉴定肽段及蛋白的相对表达量，从中找到加入的含半胱氨酸(C)肽段标品1，如MCGAYCDLK的表达量，不含C肽段标品2，如SPFQYNTVG的表达量，可计算样本间的还原烷基化率为：含C肽段表达量/不含C肽段表达量，结果见下表2：
表2标品还原烷基化效率
*相对含量：为相对于组1的样本1中相应的标品肽段含量倍数
6.随机抽取样本中含有半胱氨酸的肽段定量数据，如表3；
7.以组1的样本1为基准，计算出每个肽段相对于组1样本1的相对含量，设第一组样品1的肽段还原烷基化率都为92.91％，则其他每个样品中的肽段还原烷基化率可估算：肽段相对含量/标品2相对含量*92.91％，如表3；
表3样品中含C肽段检测强度及还原烷基化率
*相对含量：为相对于组1的样本1中相应的肽段含量倍数
#还原烷基化率：以第一组样品1为基准，其的肽段还原烷基化率都设为92.91％，以估算其他样品各肽段还原烷基化率
结果分析：
1.根据表1结果可以看出，2组6个样本还原烷基化率大多在10-12％，只有1组的样本1为18.8％，无法判断各样本是否还原烷基化成功；
2.从表2结果来看，组1的样品1、2中，标品的还原烷基化率都在90％以上，说明还原烷基化成功，但这两个样本整体还原烷基化率差异较大分别为18.8％和11.8％，说明为样本间性质差异；
3.从表2结果来看，样品3的标品还原烷基化率只有46％，说明还原烷基化不充分造成整体还原烷基化率低，可能为实验操作失误造成；
4.从表2结果来看，在组2中的标品还原烷基化率差别相近，且都在30-40％附近，说明还原烷基化率低，而组2与组1的区别在于实验用水不同，后续实验证明，组1用的商业液相纯度水的pH为7，而Milipore设备制备的双蒸水的pH为6.2，造成相同配方配置的缓冲液pH分别为8.0和7.2，由于TCEP+CAA体系在pH为8.0时效率最高，接近中性时效率降低，造成了还原烷基化效率的降低；
5.从表3结果来看，抽检的含有C的肽段来自不同蛋白，信号强度也不同，但这些肽段相对于组1样品1中相应肽段的相对强度比例都与标品的相对强度比例近似，且相应估算出的还原烷基化效率也与标品的还原烷基化效率近似，因此，标品可以反映样品中不同蛋白来源的含C肽段的还原烷基化效率。
Claims (6)
1.一种用于评估蛋白质组还原烷基化效率的质控方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)还原烷基化之前的任一步骤，在样品中加入含有至少两个半胱氨酸的多肽或蛋白标品，然后进行后续的操作至上机检测；
(2)质谱原始数据经软件分析后得到可鉴定肽段，分别找出该标品含有半胱氨酸的肽段以及不含半胱氨酸的肽段，标品还原烷基化率＝(含半胱氨酸的肽段峰面积/不含半胱氨酸的肽段峰面积)*100％；
(3)根据样品中标品还原烷基化率，评估样品的还原烷基化效率。
2.根据权利要求1所述的用于评估蛋白质组还原烷基化效率的质控方法，其特征在于，步骤(1)中，所述多肽或蛋白标品为合成的标准品，酶切后的肽段与样本内源性肽段没有重复。
3.根据权利要求1所述的用于评估蛋白质组还原烷基化效率的质控方法，其特征在于，步骤(1)中，所述多肽或蛋白标品可被特定蛋白酶酶切为至少两个肽段，其中一个至少含有两个半胱氨酸，一个不含有半胱氨酸。
4.根据权利要求1所述的用于评估蛋白质组还原烷基化效率的质控方法，其特征在于，步骤(1)中，所述后续的操作包括酶解、除盐和/或分离。
5.根据权利要求1所述的用于评估蛋白质组还原烷基化效率的质控方法，其特征在于，步骤(2)中，所述软件为蛋白质组分析软件，例如选自Spectronaut软件。
6.根据权利要求1所述的用于评估蛋白质组还原烷基化效率的质控方法，其特征在于，步骤(3)中，所述评估样品的还原烷基化效率，可以评估同批次不同样本间或者不同批次间还原烷基化的效率。
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