CN109061013B - 一种利用lc-ms/ms检测食品中甲壳动物原肌球蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用LC‑MS/MS检测食品中甲壳类原肌球蛋白的方法，从36种甲壳动物中获得原肌球蛋白氨基酸序列，进行序列对比得到其高度保守区域，模拟酶解过程得到一系列肽段，选择不含半胱氨酸和蛋氨酸的肽段，进行高分辨质谱检测，选择响应高、重复性好的肽段作为原肌球蛋白的定量肽段，制备高纯度标准品，以定量肽段标准品的浓度值为横坐标，以其定量子离子峰面积作为纵坐标绘制标准曲线，待测样品经酶解净化后待LCMS/MS检测，进而计算得到样品中原肌球蛋白浓度。本发明从具有代表性且性质稳定的特征肽段中选择酶解较稳定且酶解效率高的作为定量肽段，消除蛋白结构变化、蛋白修饰及基质效应等对检测的影响，具有准确、精密和灵敏等优点。

Description

一种利用LC-MS/MS检测食品中甲壳动物原肌球蛋白的方法

技术领域

本发明属于食品过敏原的检测方法，具体涉及一种液相色谱串联质谱检测甲壳动物主要过敏原原肌球蛋白的方法。

背景技术

全球范围内，甲壳动物的致敏率为0.2％，研究表明，甲壳动物的主要过敏原是原肌球蛋白(tropomyosin，TM)，由两个相同的亚基组成一种肌原纤维蛋白，分子量为35-38kDa。原肌球蛋白是一种稳定性较强的蛋白质，对热、研磨及常规加工方法不敏感。

目前国内外对甲壳动物中原肌球蛋白的检测方法有不少报道，主要有酶联免疫法(ELISA)、聚合酶链式反应法(PCR)及液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)。其中传统的过敏原检测方法ELISA和PCR最为常用，但是ELISA方法容易受食品中基质的干扰而出现假阴性假阳性的结果；PCR方法通过检测编码过敏原蛋白基因是否存在从而说明过敏原存在的可能，这种方法可以实现对过敏原蛋白基因的定量，但是对过敏原蛋白的定量存在较高的不确定性。

LC-MS/MS的过敏原检测方法通过检测酶解得到的特征肽段来对目标过敏原蛋白进行定性定量分析。色谱的分离有效地降低基质干扰，选择多个特征肽段防止出现假阳性和假阴性结果。LC-MS/MS的甲壳动物原肌球蛋白的定量方法的建立最重要的是特征肽段的选择和定量肽段的选择。目前为止，国内外利用 LC-MS/MS方法检测食品中甲壳动物原肌球蛋白的研究主要集中在对原肌球蛋白的定性方面，定量方面的研究很少。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提出一种利用LC-MS/MS(液相色谱串联质谱)检测甲壳动物原肌球蛋白的方法，包括如下步骤：

步骤(1)从UniProt蛋白库搜索到甲壳动物原肌球蛋白氨基酸序列；该原肌球蛋白氨基酸序列长度为284，涵盖了19种虾、3种虾蛄、2种虾鳌、3种龙虾和10种蟹在内的37种甲壳动物；

步骤(2)将该氨基酸序列导入DNAMAN软件，进行氨基酸序列对比，得到其高度保守区域80-215，同源性高达98.52％；

步骤(3)将原肌球蛋白高度保守区域导入Skyline软件，模拟酶解过程，模拟酶解结束后得到一系列肽段；

步骤(4)选择不含有半胱氨酸(C)和蛋氨酸(M)、且长度在8-18个氨基酸之间的肽段，得到此类肽段⁹²IQLLEEDLER¹⁰¹、¹¹³LAEASQAADESER¹²⁵、¹⁵³FLAEEADR¹⁶⁰、¹⁹⁰IVELEEELR¹⁹⁸、²⁰⁶SLEVSEEK²¹³共五个；

步骤(5)将上述五个肽段进行高分辨质谱检测，选择响应高、重复性好的IQLLEEDLER、LAEASQAADESER和IVELEEELR三个肽段作为甲壳类动物原肌球蛋白的特征肽段；

步骤(6)将特征肽段进行化学合成，制备纯度高于95％的标准品；

步骤(7)特征肽段的定量子离子峰面积作为纵坐标分别绘制标准曲线，得到三个方程；其中，液相色谱条件：色谱柱：EC-C18分析柱(100mm×3mm， 2.7μm)；流动相A:0.1％甲酸水；流动相B：0.1％甲酸乙腈；使用以下梯度：0min， 10％B；4min，25％B；10min，30％B；10.1min，100％B；12min，100％B；14 min，10％B；17min，10％B；流速：0.3mL·min^-1；柱温：35℃；进样体积：10 μL；质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；气体：氮气；干燥气温度：300℃，干燥气体流量12.0L/min；雾化器气体压力：40psi，电喷雾毛细管电压：3500V；

步骤(8)在上述三十七中甲壳类动物中选择其中一种，将该动物的肌肉组织与蛋白提取液按照1：10比例混合匀浆，水平震荡30min，离心后取上清；100℃加热5min，离心取上清液，得到蛋白提取液，通过BCA方法测得其蛋白质浓度；

取蛋白提取液100μL稀释10倍进行酶解，按照酶与蛋白的质量比1：30，1： 15，1：10，2：15，1：6，1：5和1：3添加酶进行酶用量的优化，酶解时间均为16h，加入1％甲酸终止酶解，用固相萃取柱对酶解液进行净化，待LC-MS/MS 检测，通过酶解结果可知，IVELEEELR在不同酶浓度条件下酶解性质稳定用作定量肽段，IQLLEEDLER、LAEASQAADESER酶解性质不稳定用作为定性肽段；因此最终选择酶与蛋白的质量比为1：15作为最优的酶添加量；在酶与蛋白的质量比为1：15的基础上对1h、3h、5h、7h、9h、11h、13h和16h八个酶解时间进行优化，酶解时间达到13h后三个特征肽段的酶解水平趋于稳定，因此选择酶解时间为13h；

(9)以步骤(8)所选甲壳类动物的肌肉制备肌原纤维蛋白丙酮粉末，并重新溶解在50mmol/L Tris-HCl缓冲液中；经过50％硫酸铵饱条件下的盐析提取和 2次pH4.5等电点沉淀后，从肌原纤维蛋白溶液中获得原肌球蛋白沉淀；将沉淀溶于水溶液中，用透析袋进行透析除盐，透析液为水，间隔6h换一次透析液，重复3次；将透析过的原肌球蛋白溶液冷冻干燥后，配置成1mg/mL水溶液，进行酶解，酶解方法与步骤(8)一致；

步骤(10)以定量肽段IVELEEELR的标准曲线作为样品检测的定量标准曲线；

步骤(11)提取待测样品总蛋白，样品总蛋白经过酶解后净化，得到净化酶解液，酶解采用步骤(8)得到的酶解优化条件，将得到的净化酶解液进行 LC-MS/MS检测，得到食物样品中定量肽段子离子峰面积，再根据标准曲线求得样品中定量肽段浓度，进而得到样品原肌球蛋白浓度。

所述步骤(8)中的蛋白提取液为含有1mol/LKCl的50mmol/L Tri-HCL缓冲液，PH＝7.4。

所述定量肽段IVELEEELR的标准曲线为：y＝1.1586x+425.3614。其中，y 为定量肽段定量离子峰面积，x为定量肽段浓度，标准品浓度的范围为1-1000μg/L。

本发明相对于现有技术所具有的优点为：

1.本发明目的在于建立一种对食品中甲壳动物原肌球蛋白进行精确定量检测的高效液相色谱串联质谱方法，选择不易被修饰且对甲壳动物原肌球蛋白具有代表性的肽段作为特征肽段，选择酶解较稳定且酶解效率高的特征肽段作为定量肽段，消除蛋白结构变化、蛋白修饰及基质效应等对检测的影响，该方法具有准确、精密和灵敏等优点。

2.本发明根据原肌球蛋白具有热稳定的性质设计前处理方法，通过加热去除食物中的杂蛋白，以获得纯度较高的原肌球蛋白，减小其他蛋白对胰蛋白酶酶解及离子化过程的影响，提高检测的准确性，前处理方法简单、耗时短。

3.本发明通过对37种甲壳类动物原肌球蛋白的氨基酸序列进行对比，找到同源性较高的区域(80-215)，在此区域内选择鱼小清蛋白最佳的特征肽段，肽段具有代表性强、易被酶解、响应高、稳定性强等优点。本发明克服了ELISA方法容易受食品中基质的干扰而出现假阴性假阳性的结果的问题，较ELISA方法具有更高的检测精度，所选取的定量肽段特异性较强，IVELEEELR在特征肽段中最适合作为定量肽段，经进一步实验证实，其他两种特征肽段IQLLEEDLER、 LAEASQAADESER均与软体动物原肌球蛋白存在相对较高的交叉，不利于精确检测。

4.本发明优化了原肌球蛋白的酶解条件，主要在酶与蛋白的质量比及酶解时间等方面进行优化，使胰蛋白酶对原肌球蛋白的酶解效率达到最大化。

5.本发明对线性曲线、精密度、灵敏度及准确度等进行验证，证明该发明线性关系好、线性范围广、灵敏、精密及准确。

附图说明

为了更清楚地说明本发明现有技术中的技术方案，下面将对现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些说。

图1为37种甲壳动物原肌球蛋白的高度保守区域；

图2为原肌球蛋白高度保守区域模拟酶解所得到的肽段；

图3为HPLC-MS/MS所检测到的甲壳类动物(南美白对虾)中原肌球蛋白的IQLLEEDLER、LAEASQAADESER和IVELEEELR特征肽段的离子色谱图及质谱图；

图4为酶与蛋白质质量比例优化图；其中，IQL、LAE、IVE分别代表肽段IQLLEEDLER、LAEASQAADESER和IVELEEELR；

图5为酶解时间的优化图；其中，IQL、LAE、IVE分别代表肽段IQLLEEDLER、LAEASQAADESER和IVELEEELR；

图6为提纯原肌球蛋白SDS-PAGE图；其中左侧泳道(M)为标准肽段的分子质量，右侧泳道(1)为提纯原肌球蛋白泳道。

图7为IVELEEELR的标准曲线。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

一种利用LC-MS/MS(液相色谱串联质谱)检测甲壳动物原肌球蛋白的方法，包括如下步骤：

步骤(1)从UniProt蛋白库搜索到甲壳动物原肌球蛋白氨基酸序列；该原肌球蛋白氨基酸序列长度为284，涵盖了19种虾、3种虾蛄、2种虾鳌、3种龙虾和10种蟹在内的37种甲壳动物(见表1)；

表1

步骤(2)将该氨基酸序列导入DNAMAN软件，进行氨基酸序列对比，得到其高度保守区域80-215，同源性高达98.52％(见图1)；

步骤(3)将原肌球蛋白高度保守区域导入Skyline软件，模拟酶解过程，模拟酶解结束后得到一系列肽段；

步骤(4)选择不含有半胱氨酸(C)和蛋氨酸(M)、且长度在8-18个氨基酸之间的肽段，得到此类肽段⁹²IQLLEEDLER¹⁰¹、¹¹³LAEASQAADESER¹²⁵、¹⁵³FLAEEADR¹⁶⁰、¹⁹⁰IVELEEELR¹⁹⁸、²⁰⁶SLEVSEEK²¹³共五个(见图2)；

步骤(5)将上述五个肽段进行高分辨质谱检测，选择响应高、重复性好的IQLLEEDLER、LAEASQAADESER和IVELEEELR三个肽段作为甲壳类动物原肌球蛋白的特征肽段；

步骤(6)将特征肽段进行化学合成，制备纯度高于95％的标准品；

步骤(7)特征肽段的定量子离子峰面积作为纵坐标分别绘制标准曲线，得到三个方程；其中，液相色谱条件：色谱柱：EC-C18分析柱(100mm×3mm， 2.7μm)；流动相A:0.1％甲酸水；流动相B：0.1％甲酸乙腈；使用以下梯度：0min， 10％B；4min，25％B；10min，30％B；10.1min，100％B；12min，100％B；14 min，10％B；17min，10％B；流速：0.3mL·min^-1；柱温：35℃；进样体积：10 μL；质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；气体：氮气；干燥气温度：300℃，干燥气体流量12.0L/min；雾化器气体压力：40psi，电喷雾毛细管电压：3500V；

步骤(8)在上述三十七中甲壳类动物中选择南美白对虾作为本次检测对象，将南美白对虾的肌肉组织与蛋白提取液(1mol/L KCl的50mmol/L Tri-HCL缓冲液，PH＝7.4)按照1：10比例混合匀浆，水平震荡30min，离心后取上清；100℃加热5min，离心取上清液，得到蛋白提取液，通过BCA方法测得其蛋白质浓度；

取蛋白提取液100μL稀释10倍进行酶解，按照酶与蛋白的质量比1：30，1： 15，1：10，2：15，1：6，1：5和1：3添加酶进行酶用量的优化(见图3)，酶解时间均为16h，加入1％甲酸终止酶解，用固相萃取柱(30mg/1mL)对酶解液进行净化，待LC-MS/MS检测，通过酶解结果可知IVELEEELR在不同酶浓度条件下酶解性质稳定，用作定量肽段，IQLLEEDLER、LAEASQAADESER酶解性质不稳定用作为定性肽段；因此最终选择酶与蛋白的质量比为1：15作为最优的酶添加量；在酶与蛋白的质量比为1：15的基础上对1h、3h、5h、7h、9h、 11h、13h和16h八个酶解时间进行优化(见图4)，酶解时间达到13h后三个特征肽段的酶解水平趋于稳定，因此选择酶解时间为13h；南美白对虾最优酶解条件下的色谱图及色谱图见图5；

(9)以南美白对虾的肌肉制备肌原纤维蛋白丙酮粉末，并重新溶解在50 mmol/LTris-HCl缓冲液中；经过50％硫酸铵饱条件下的盐析提取和2次pH4.5 等电点沉淀后，从肌原纤维蛋白溶液中获得原肌球蛋白沉淀；

将沉淀溶于水溶液中，用透析袋进行透析除盐，透析液为水，间隔6h换一次透析液，重复3次；

将透析过的原肌球蛋白溶液冷冻干燥后，配置成1.00mg/mL水溶液，进行 SDS-PAGE和酶解，酶解方法与步骤(8)一致；

电泳结果如图6所示，通过灰度分析原肌球蛋白的纯度达到97％以上；根据酶解原肌球蛋白所得定量肽段浓度计算原肌球蛋白浓度为1.08mg/L，其中 RSD＝4％，重复三次；对应的差异性为8％，定量肽段能够满足原肌球蛋白的定量要求；

步骤(10)以定量肽段IVELEEELR的标准曲线作为样品检测的定量标准曲线；所述定量肽段IVELEEELR的标准曲线为：y＝1.1586x+425.3614；其中，y 为定量肽段定量离子峰面积，x为定量肽段浓度，标准品浓度的范围为1-1000μg/L (见图7)；

步骤(11)提取待测样品总蛋白，样品总蛋白经过酶解后净化，得到净化酶解液，酶解采用步骤(8)得到的酶解优化条件，将得到的净化酶解液进行 LC-MS/MS检测，得到食物样品中定量肽段子离子峰面积，再根据标准曲线求得样品中定量肽段浓度，进而得到样品原肌球蛋白浓度。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明的应用。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

一、仪器和试剂

特征肽段委托上海sangon biotech公司合成(纯度＞95％)

二、具体实施例1

1样品前处理

1.1提取

将鸡肉火腿肠(原料中不含甲壳类动物)样品在均质器中打碎，然后将称取 1g样品于50mL离心管中，向样品中加入10mL蛋白质提取溶液(1mol/LKCl， 50mmol/L Tri-HCL，PH＝7.4)，于水平振动摇床上摇动30min，12000r/min(20700 g)离心30min；将5mL上清液转移到15mL离心管中，然后在100℃水浴中加热5min。将提取物冷却至室温后，12000r/min(20700g)离心30min，上清液即为待酶解的蛋白提取液；

1.2酶解

BCA方法测蛋白提取液蛋白质浓度；取蛋白提取液100μL稀释10倍，按酶与蛋白的质量比为1：15的比例加入胰蛋白酶，37℃酶解13h，加入1％甲酸终止酶解；

1.3净化

固相萃取柱预先用1mL甲醇和1mL 1％甲酸活化并平衡；接下来，用1mL 的5％甲醇/1％甲酸洗涤样品，用1mL的90％甲醇/10％甲酸洗脱；将洗脱液收集在1.5mL离心管中用氮气(40℃)吹干，复溶解于500μL1％甲酸水溶液中。

2标准曲线的建立

配制IQLLEEDLER、LAEASQAADESER和IVELEEELR三个特征肽段浓度为1、5、10、20、50、100、200、400和1000μg/L的混合标准溶液,进行 HPLC-MS/MS检测，各个特征肽段保留时间质谱参数如表2所示，以峰面积(y) 对浓度(x)进行线性回归，定量肽段IVELEEELR回归方程为y＝1.1586x+425.3614，相关系数R²＝0.9994，在1-1000μg/L浓度范围内线性关系良好。

表2

3方法验证

回收率测定和精密度测定：对空白鸡肉香肠样品进行12.5、25.0和50.0μg/g 三个水平的原肌球蛋白添加回收，每个浓度6个平行样品，计算回收率和精密度 (见表3)，其中合成IVELEEELR的分子质量为1129.3g/mol，原肌球蛋白分子质量按照36000g/mol计算。检出限和定量限设定为3：1和10：1的信噪比，LAE、 IVE和IQL的检出线分别为2.0、1.0和1.5μg/g(原肌球蛋白/鸡肉香肠，m/m)， IVELEEELR的定量限为3ug/g。

表3

由表3结果可知在鸡肉火腿肠中12.5、25.0和50.0μg/g三个水平的添加回收，回收率在91％-93％之间，RSD<8，满足检测要求。

以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利技术特征并不限于此，任何相关领域技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (2)

1.一种利用LC-MS/MS检测甲壳动物原肌球蛋白的方法，包括如下步骤：

步骤（1）从UniProt蛋白库搜索到甲壳动物原肌球蛋白氨基酸序列；该原肌球蛋白氨基酸序列长度为284，涵盖了19种虾、3种虾蛄、2种虾鳌、3种龙虾和10种蟹在内的37种甲壳动物；

步骤（2）将该氨基酸序列导入DNAMAN 软件，进行氨基酸序列对比，得到其高度保守区域80-215，同源性高达98.52％；

步骤（3）将原肌球蛋白高度保守区域导入Skyline 软件，模拟酶解过程，模拟酶解结束后得到一系列肽段；

步骤（4）选择不含有半胱氨酸C和蛋氨酸M、且长度在8-18个氨基酸之间的肽段，得到此类肽段⁹²IQLLEEDLER¹⁰¹、¹¹³LAEASQAADESER¹²⁵、¹⁵³FLAEEADR¹⁶⁰、¹⁹⁰IVELEEELR¹⁹⁸、²⁰⁶SLEVSEEK²¹³共五个；

步骤（5）将上述五个肽段进行高分辨质谱检测，选择响应高、重复性好的IQLLEEDLER、LAEASQAADESER和IVELEEELR三个肽段作为甲壳类动物原肌球蛋白的特征肽段；

步骤（6）将特征肽段进行化学合成，制备纯度高于95%的标准品；

步骤（7）特征肽段的定量子离子峰面积作为纵坐标分别绘制标准曲线，得到三个方程；其中，液相色谱条件：色谱柱：EC-C18分析柱；流动相A:0.1%甲酸水；流动相B：0.1%甲酸乙腈；使用以下梯度：0 min，10%B；4 min，25%B；10 min，30%B；10.1 min，100%B；12 min，100%B；14 min，10%B；17 min，10%B；流速：0.3 mL·min^-1；柱温：35 °C；进样体积：10 mL；质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；气体：氮气；干燥气温度：300 °C，干燥气体流量12.0 L/ min；雾化器气体压力：40 psi，电喷雾毛细管电压：3500 V；

步骤（8）在上述三十七种甲壳类动物中选择其中一种，将该动物的肌肉组织与含有1mol/LKCl的50 mmol/L Tri-HCL且PH = 7.4的蛋白提取缓冲液按照1：10比例混合匀浆，水平震荡30 min，离心后取上清；100 ℃加热5 min，离心取上清液，得到蛋白提取液，通过BCA方法测得其蛋白质浓度；

取蛋白提取液100 μL用纯水稀释10倍，按照胰蛋白酶与蛋白的质量比1：30，1：15，1：10，2：15，1：6，1：5和1：3添加胰蛋白酶进行酶用量的优化，酶解时间均为16 h，加入1%甲酸终止酶解，用固相萃取柱对酶解液进行净化，待LC-MS/MS检测，通过酶解结果可知，IVELEEELR在不同酶浓度条件下酶解性质稳定用作定量肽段， IQLLEEDLER、LAEASQAADESER酶解性质不稳定用作为定性肽段；因此最终选择酶与蛋白的质量比为1：15作为最优的酶添加量；在酶与蛋白的质量比为1：15的基础上对1 h、3h、5 h、7 h、9 h、11 h、13 h和16 h八个酶解时间进行优化，酶解时间达到13 h后三个特征肽段的酶解水平趋于稳定，因此选择酶解时间为13 h；

（9）以步骤（8）所选甲壳类动物的肌肉制备肌原纤维蛋白丙酮粉末，并重新溶解在50mmol/L Tris-HCl缓冲液中；经过50％硫酸铵饱条件下的盐析提取和2次pH4.5等电点沉淀后，从肌原纤维蛋白溶液中获得原肌球蛋白沉淀；将沉淀溶于水溶液中，用透析袋进行透析除盐，透析液为水，间隔6h换一次透析液，重复3次；将透析过的原肌球蛋白溶液冷冻干燥后，配置成1mg/mL水溶液，进行酶解，酶解方法与步骤（8）一致；

步骤（10）以定量肽段IVELEEELR的标准曲线作为样品检测的定量标准曲线；

步骤（11）提取待测样品总蛋白，样品总蛋白经过酶解后净化，得到净化酶解液，酶解采用步骤（8）得到的酶解优化条件，将得到的净化酶解液进行LC-MS/MS检测，得到食物样品中定量肽段子离子峰面积，再根据标准曲线求得样品中定量肽段浓度，进而得到样品原肌球蛋白浓度。

2.如权利要求1所述的一种利用LC-MS/MS检测甲壳动物原肌球蛋白的方法，其特征是所述定量肽段IVELEEELR的标准曲线为： y=1.1586x+425.3614；其中，y为定量肽段定量离子峰面积，x为定量肽段浓度，标准品浓度的范围为1-1000 μg/L。

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