CN105388296A - 一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法，突破针对单一过敏原逐个发展检测方法的免疫分析模式，而针对虾蟹类水产品过敏原，研究制备了具有广谱识别能力的族特异性表位肽抗体，开发了一种新型的水产品过敏原检测方法，实现了水产品中过敏原的高通量快速检测。

Description

一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种原肌球蛋白的检测方法，特别涉及一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高，虾蟹类水产品的消费量日益增加，2013年全国水产品总产量5907.68万吨，人均占有量43.63千克，已经成为我国人民重要的食物来源。但虾蟹类水产品是联合国粮农组织公布的八大类食物过敏原之一，我国的调研数据也表明虾蟹类水产品是引发消费者发生过敏性疾病的主要原因。此外，处于保护消费者安全及贸易保护的目的，发达国家针对食物过敏原，制定了严格的检测标准和指标，由此形成有效的贸易壁垒。近年来我国的食品出口因为过敏原问题被扣留、退回、索赔和终止合同的事件等经常发生，部分产品甚至长期受阻。因此，水产品过敏原的问题已经成为制约我国水产品行业发展的重要瓶颈因素。
为了有效的消除或缓解水产品过敏原对人们身体健康及相关行业所造成的危害，首先要发展先进的检测技术，并在此基础上建立合理、完善的检测体系。从目前国内外的发展情况看，这一检测体系包括快速筛选检测技术和确证检测方法，首先利用前者对大量样本进行现场、快速的筛检，从中发现的疑似样本则利用后者进行最终的验证。
包括虾蟹类水产品过敏原，目前食品过敏原的确证性检测主要利用液相色谱-质谱联用等大型仪器进行，已经形成了较为成熟的检测方法。由于过敏原种类繁多，不同的水产品中过敏原或多或少的有一些差异。因此尽管免疫分析等检测手段已经取得了较快的发展并显示出巨大的潜力，但较高的研究和使用成本使它们还无法作为理想的快速筛选工具而普及使用。对于包括水产品过敏原在内的食品过敏原，目前均难以实现大量样品高效的快速筛选和现场检测，这也是当前世界食品安全研究领域的关键问题和难点问题之一。而面对当前虾蟹类水产品产量大、种类繁多、特别是以虾蟹类水产品为原料的调理食品呈现快速增长的现实情况，水产品过敏原快速筛选技术的研究和开发显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法，突破针对单一过敏原逐个发展检测方法的免疫分析模式，而针对虾蟹类水产品过敏原，研究制备了具有广谱识别能力的族特异性表位肽抗体，开发了一种新型的水产品过敏原检测方法，实现了水产品中过敏原的高通量快速检测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
1.一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)海产品中原肌球蛋白同源表位的筛选
在NCBI蛋白数据库收集多种海产品原肌球蛋白的氨基酸序列，将获得的原肌球蛋白的氨基酸序列利用EBI中的Clustalw软件进行多序列比对，结果用Bioedit软件分析其中保守和非保守区域位置，筛选确定不同原肌球蛋白的共同表位，称为同源表位；
2)表位肽的线性合成及鉴定
将步骤1)筛选得到的同源表位采用F-moc法进行固相合成，采用高效液相色谱进行纯化后，得到纯度为99％的表位肽，并采用质谱进行鉴定；
3)表位肽多克隆抗体的制备
以表位肽为抗原，结合血蓝蛋白合成完全抗原后，免疫BALB/c小鼠，制备表位肽的多克隆抗体，并通过proteinGSepharose亲和柱进行纯化，得表位肽多克隆抗体；
4)海产品原肌球蛋白竞争性ELISA检测方法的建立
以虾原肌球蛋白(虾过敏原蛋白)为标准品，稀释后以虾原肌球蛋白100ng/孔的包被量进行96孔板包被，将梯度浓度的虾原肌球蛋白液分别与等体积的表位肽多克隆抗体液共同加入96孔板包被孔中孵育，以辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测，以3,3`,5,5`-四甲基联苯胺作为显色剂，用H2SO4终止后，测定450nm的吸光值，并绘制标准曲线(横坐标为抗原浓度，纵坐标为吸光值)；
5)待检样品中原肌球蛋白的检测
将待检样品中的原肌球蛋白进行抽提，以虾原肌球蛋白100ng/孔的包被量进行96孔板包被，将抽提得到的待检样品中的原肌球蛋白液与等体积的表位肽多克隆抗体液共同加入96孔板包被孔中孵育，以辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测，以3,3`,5,5`-四甲基联苯胺作为显色剂，用H2SO4终止后，测定450nm的吸光值，将待检样品的OD值换算成B/B0，其中B为待检样品在450nm的OD值，B0为空白对照的OD值，根据步骤4)绘制的标准曲线计算出待检样品中原肌球蛋白的含量，当测定的OD值位于标准曲线线性区域内，即为待测样品中有原肌球蛋白检出，反之视为未检出。
作为优选，所述海产品包括虾类和蟹类。
作为优选，辣根过氧化物酶标记的二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。
作为优选，步骤4)中梯度浓度的虾原肌球蛋白溶液的浓度梯度为：0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL，10μg/mL，100μg/mL，1000μg/mL。
作为优选，表位肽多克隆抗体溶液为表位肽多克隆抗体用pH7.4的含有0.5％BSA的PBST按照1g:2000mL的稀释比稀释而成。
本发明的有益效果是：以表位肽抗体为基础建立的检测方法，不但解决了当前由于虾蟹类水产品种类繁多带来的检测结果不准确的问题，而且能够消除加工或贮藏等因素对检测结果的影响。
附图说明
图1是间接竞争ELISA法检测虾原肌球蛋白的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法，包括以下步骤：
1)海产品中原肌球蛋白同源表位的筛选
取4种已经有完整氨基酸序列的虾过敏原、4种虾类的原肌球蛋白以及6种蟹类原肌球蛋白，在NCBI蛋白数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)中查找对应的序列，相应的氨基酸序列编号见表1。将获得的14种蛋白氨基酸序列利用EBI中的Clustalw软件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行多序列比对，结果用Bioedit软件分析其中保守和非保守区域位置，筛选确定不同原肌球蛋白的共同表位(共同表位的标准就是表位肽的序列相同)，称为同源表位。
表114种甲壳类原肌球蛋白的检索号
2)表位肽的线性合成及鉴定
将步骤1)筛选得到的同源表位采用Fmoc固相方法合成表位多肽，委托上海吉尔生化有限公司完成。所制备多表位多肽的分析和纯化采用高效液相色谱(HPLC)方法进行，并利用电喷雾离子化质谱(ESI-MS)对其进行质谱分析鉴定其分子量，验证合成准确性。
3)表位肽多克隆抗体的制备
以表位肽为抗原，结合血蓝蛋白合成完全抗原后，免疫BALB/c小鼠，制备表位肽的多克隆抗体，并通过proteinGSepharose亲和柱进行纯化，得表位肽多克隆抗体，具体操作为：
(1)选择健康雌性6-8周龄的Babl/c纯种小鼠(体重50～70g)6只，断尾采血，作为阴性对照；
(2)免疫用抗原的制备方法，将表位肽与血蓝蛋白进行偶联，形成完全抗原，并用于制备抗体；
(3)小鼠免疫程序
第3次免疫后7天，断尾采血，测定抗血清的效价，若效价未达到要求，继续免疫。效价达到要求后，虾过敏原蛋白溶液腹腔注射，冲击免疫1次，5d后摘眼球采血，收集于2mL灭菌塑料离心管中。室温静置4h，5000rpm离心15min，取上清，proteinGSepharose亲和柱纯化后，加入硫柳汞，使其终浓度为0.01％，分装，-80℃冰箱中保存。
4)海产品原肌球蛋白竞争性ELISA检测方法的建立
虾原肌球蛋白的制备方法如下：
将虾肉与4倍体积(g:mL)pH7.4，20mmol/LTris-HCl缓冲液中进行绞碎，经离心得到的上清用30％-50％饱和度的硫酸铵盐析；盐析后的沉淀再次溶于20mmol/LTris-HCl缓冲液中透析，透析后的样品用0.01mol/L的盐酸溶液调节pH至4.5-4.7，进行等电点沉淀，将沉淀重新溶于20mmol/LTris-HCl缓冲液中透析，透析后的样品上样于预先用pH7.4,20mmol/LTris-HCl平衡的DEAE52离子交换层析，收集未吸附部分进行浓缩后，上样于SephadexG-100凝胶柱层析，纯化后即得到虾过敏原原肌球蛋白。
精确称取虾原肌球蛋白(虾过敏原蛋白)10mg，用0.01mol/L，pH7.4的PBS定容至10ml，即可得到1000mg/L的虾原肌球蛋白储备液。将虾原肌球蛋白储备液稀释得系列浓度为0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL，10μg/mL，100μg/mL，1000μg/mL的标准虾原肌球蛋白标准溶液。
间接竞争ELISA法测定各系列虾原肌球蛋白标准溶液的浓度，建立标准曲线。具体方法如下：
(1)将虾原肌球蛋白用包被缓冲液(包被缓冲液是0.01mol/L，pH9.6的CBS缓冲液)稀释成10μg/ml，100μL/孔，4℃冰箱中过夜。
(2)次日取出，回至室温，pH7.4的PBST洗涤液洗涤3次后，加入pH7.4的含有0.5％BSA的PBST封闭液满孔，37℃孵育1.5h。
(3)再次洗涤后，拍干，4℃储存备用。
(4)取5条板条，先加入50μL系列浓度虾原肌球蛋白标准溶液(pH7.4)，每个浓度3个重复，随后各孔加入1:2000(g：mL)稀释的表位肽多克隆抗体(一抗)(0.01mol/L，pH7.4的含有0.5％BSA的PBST稀释)50μL，剩下孔全部加入100μLpH为7.4的PBST，作为空白对照，37℃孵育1h。
(5)洗涤后，加入用PBST(pH7.4，0.01mol/L)1:8000(g：mL)稀释的HRP-IgG(二抗，市售，北京华美)，100μL/孔，37℃孵育1h。
(6)随后加入显色液(3,3`,5,5`-四甲基联苯胺，市售)，100μL/孔，室温20min后，加入2mol/L的H2SO4溶液50μL/孔终止反应，测OD450nm，并绘制标准曲线。
标准曲线见图1。最大、最小OD值分别为1.05和0.16，LOD(90％抑制率对应的浓度)为1.85ng/mL，检测范围(20％～80％抑制率对应的浓度)为4.79～1400ng/mL。18个空白孔的平均OD值为0.092，标准差为0.003，则平均OD±2SD的值为0.086～0.098，与10％抑制率对应浓度0.096差不多。平均OD-2SD和10％抑制率对应浓度为ELISA计算LOD常用的两种方法。
5)待检样品中原肌球蛋白的检测
具体步骤如下：
将待检样品中的原肌球蛋白进行抽提：将待检样品与4倍体积(g:mL)pH7.4，20mmol/LTris-HCl缓冲液中进行绞碎，离心取上清(待检样品的原肌球蛋白液)进行检测。
(1)将虾原肌球蛋白用包被缓冲液(包被缓冲液是0.01mol/L，pH9.6的CBS缓冲液)稀释成10μg/ml，100μL/孔，4℃冰箱中过夜。
(2)次日取出，回至室温，PBST(0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次后，加入含有5％脱脂奶粉的PBST(0.01mol/L，pH7.4)封闭液满孔，37℃孵育1h。由于是检测实际样品，干扰较多，用PBST洗涤及封闭后抗干扰强，检测更精确。
(3)再次洗涤后，拍干，4℃储存备用。
(4)将待检样品的原肌球蛋白液与1:2000(g：mL)稀释的表位肽多克隆抗体(一抗，0.01mol/L，pH7.4的含有0.5％BSA的PBST稀释)进行1:1体积混合，并在室温下孵育60min，然后将100μL混合液加入孔内，每个浓度3个重复，剩下孔全部加入100μLpH为7.4的PBST，作为空白对照，37℃孵育1h。
(5)洗涤后，加入用PBST(pH7.4，0.01mol/L)1:8000(g：mL)稀释的HRP-IgG(二抗，市售，北京华美)，100μL/孔，37℃孵育1h。
(6)随后加入显色液(3,3`,5,5`-四甲基联苯胺，市售)，100μL/孔，室温20min后，加入2mol/L的H2SO4溶液50μL/孔终止反应，测OD450nm。
将待检样品的OD值换算成B/B0，其中B为待检样品各浓度在450nm的OD值，B0为空白对照的OD值，根据绘制的标准曲线即可计算出待检样品中原肌球蛋白的含量，当测定的OD值位于标准曲线线性区域内，即为待测样品中有原肌球蛋白检出，反之视为未检出。
间接竞争ELISA法的评估
1、以孔间变异系数及板间变异系数表示该方法的精确度。
(1)孔间误差：将一块酶标板分成3×8四个部分，每个浓度3个平行孔，测定。以标准曲线的孔间平均变异系数(CV)来表示，CV％＝SD均值/平均孔间结合率×100％。
(2)板间误差：从同一批包被、封闭的酶标板中，每板抽取3条酶标板条，用同一批配制的溶液测定。以3块板测定的结合率值进行平均，求出各浓度的板间变异系数，再平均求其总板间变异系数(CV)。
由表2可以看出，不同浓度的虾过敏原蛋白的孔间变异系数为3.4％-9.1％，板间变异系数为12.9-19.6％，各浓度组孔间和板间的变异系数小于20％。各浓度组板间变异程度大于孔间变异程度。说明总体上，本试验方法的平行性要好于重复性。不同的酶标板之间存在吸附能力和光滑程度等的差异，从而影响到试验结果的准确性。
表2Ci-ELISA方法的精密度
2、稳定性的测定
将包被好的酶标板放在37℃条件下进行稳定性的试验，结果显示其能够在4℃条件下存在8个月而活性变化不大。
实际样品检测
以本发明的检测方法对猪肉丸、牛肉丸、鲭鱼罐头、虾仁、虾丸、鱼松、海螺、鱿鱼仔、菲律宾蛤仔等十个样品中原肌球蛋白的含量进行了分析，结果见下表3：
表3
食物品种 原肌球蛋白含量(mg/kg)
猪肉丸 未检出
牛肉丸 未检出
鲭鱼罐头 未检出
虾仁 91.3±8.6
虾丸 16.4±4.6
鱼松 未检出
海螺 31.4±5.2
鱿鱼仔 11.5±3.2
菲律宾蛤仔 22.3±4.7
锯缘青蟹 36.8±7.8
由上表可知，本发明的检测方法能对实际样品进行有效检测。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (5)

1.一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)海产品中原肌球蛋白同源表位的筛选
在NCBI蛋白数据库收集多种海产品原肌球蛋白的氨基酸序列，将获得的原肌球蛋白的氨基酸序列利用EBI中的Clustalw软件进行多序列比对，结果用Bioedit软件分析其中保守和非保守区域位置，筛选确定不同原肌球蛋白的共同表位，称为同源表位；
2)表位肽的线性合成及鉴定
将步骤1)筛选得到的同源表位采用F-moc法进行固相合成，采用高效液相色谱进行纯化后，得到纯度为99％的表位肽，并采用质谱进行鉴定；
3)表位肽多克隆抗体的制备
以表位肽为抗原，结合血蓝蛋白合成完全抗原后，免疫BALB/c小鼠，制备表位肽的多克隆抗体，并通过proteinGSepharose亲和柱进行纯化，得表位肽多克隆抗体；
4)海产品原肌球蛋白竞争性ELISA检测方法的建立
以虾原肌球蛋白为标准品，稀释后以虾原肌球蛋白100ng/孔的包被量进行96孔板包被，将梯度浓度的虾原肌球蛋白液分别与等体积的表位肽多克隆抗体液共同加入96孔板包被孔中孵育，以辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测，以3,3`,5,5`-四甲基联苯胺作为显色剂，用H2SO4终止后，测定450nm的吸光值，并绘制标准曲线；
5)待检样品中原肌球蛋白的检测
将待检样品中的原肌球蛋白进行抽提，以虾原肌球蛋白100ng/孔的包被量进行96孔板包被，将抽提得到的待检样品中的原肌球蛋白液与等体积的表位肽多克隆抗体液共同加入96孔板包被孔中孵育，以辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测，以3,3`,5,5`-四甲基联苯胺作为显色剂，用H2SO4终止后，测定450nm的吸光值，将待检样品的OD值换算成B/B0，其中B为待检样品在450nm的OD值，B0为空白对照的OD值，根据步骤4)绘制的标准曲线计算出待检样品中原肌球蛋白的含量，当测定的OD值位于标准曲线线性区域内，即为待测样品中有原肌球蛋白检出，反之视为未检出。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述海产品包括虾类和蟹类。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：辣根过氧化物酶标记的二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中梯度浓度的虾原肌球蛋白溶液的浓度梯度为：0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL，10μg/mL，100μg/mL，1000μg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：表位肽多克隆抗体溶液为表位肽多克隆抗体用pH7.4的含有0.5％BSA的PBST按照1g:2000mL的稀释比稀释而成。
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