TWI781481B

TWI781481B - 蝦類過敏原鑑定方法

Info

Publication number: TWI781481B
Application number: TW109141366A
Authority: TW
Inventors: 余旭勝; 徐睿良; 何祈緯; 陳信宏
Original assignee: 國立屏東科技大學
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2022-10-21
Also published as: TW202221320A

Abstract

一種蝦類過敏原鑑定方法，用以解決習知蝦類過敏原鑑定方法有偽陽性反應的發生的問題，其包含：層析分離一胜肽溶液以得一分離液；使該分離液中的特徵胜肽形成一樣品離子，續對該樣品離子進行MS-1掃描以得存在一第一波峰的一母離子光譜，該第一波峰與該特徵胜肽所形成的一胜肽母離子的第一特徵質荷比匹配；及使該樣品離子形成一碎片離子，續對該碎片離子進行MS-2掃描以得存在一第二波峰的一子離子光譜，該第二波峰與該胜肽母離子所形成的一胜肽子離子的第二特徵質荷比匹配；其中，該特徵胜肽具有如SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列。

Description

蝦類過敏原鑑定方法

本發明係關於一種過敏原鑑定方法，尤其是一種蝦類過敏原鑑定方法。

食品過敏(food allergy)為對食物的異常免疫反應(abnormal immune response)，其症狀可能包含搔癢(itchiness)、舌頭腫脹(swelling)、嘔吐(vomiting)、腹瀉(diarrhea)、蕁麻疹(urticaria)、呼吸困難(dyspnea)或低血壓(low blood pressure)等。然而，食物過敏尚不存在積極療法(curative care)，僅能夠藉由減少與過敏原接觸的機會，來預防食物過敏的發生，而在台灣，蝦、蟹等帶殼海鮮為最主要的食物過敏原(allergen)，該些過敏原能夠與人類免疫系統中的免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)結合，觸發組織胺(histamine)等炎性化學物質(inflammatory chemical)的釋放，導致平滑肌擴張、毛細血管破裂與其他過敏症狀，甚至可能造成休克或死亡。

習知蝦類過敏原鑑定方法係採用酵素免疫測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，其係使用可以辨識過敏原的抗體，惟由於習知蝦類過敏原鑑定方法的檢測專一性不佳，故仍有偽陽性反應(false positive)的發生，有鑑於此，仍有必要開發新的蝦類過敏原鑑定方法。

為解決上述問題，本發明的目的是提供一種蝦類過敏原鑑定方法，其具有良好的檢測專一性者。

本發明的蝦類過敏原鑑定方法，可以包含：以一萃取劑萃取一待測樣品，獲得一蛋白質溶液，該萃取劑包含濃度為20mM的Tris-HCl緩衝液，且該萃取劑的pH值為9.0；將該蛋白質溶液混合一蛋白質變性劑，獲得一胜肽溶液，該胜肽溶液包含一特徵胜肽具有如SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列，該特徵胜肽經離子化之後，形成一胜肽母離子，該胜肽母離子經碰撞解離之後，形成一胜肽子離子，該胜肽母離子具有一第一特徵質荷比介於708~709之間，且該胜肽子離子具有一第二特徵質荷比介於157~158之間；層析分離該胜肽溶液，以獲得一分離液，該分離液包含該特徵胜肽；離子化該分離液中的特徵胜肽，以形成一樣品離子；對該樣品離子進行一MS-1掃描，以獲得一母離子光譜，該母離子光譜中存在至少一第一波峰，該至少一第一波峰與該第一特徵質荷比匹配；在確認該母離子光譜中存在該至少一波峰之後，使該樣品離子受碰撞而形成一碎片離子；及對該碎片離子進行一MS-2掃描，以獲得一子離子光譜，該子離子光譜中存在至少一第二波峰，該至少一第二波峰與該第二特徵質荷比匹配。

據此，本發明的蝦類過敏原鑑定方法，藉由該特徵胜肽的選用，至少可以辨識該胜肽溶液是否蝦類的過敏原(原肌球蛋白)，且藉由依據進行該MS-1掃描及該MS-2掃描，可以有效提升該蝦類過敏原鑑定方法的專一性及靈敏度，減少偽陽性、偽陰性反應的發生，進而能夠提供對蝦類過敏之患者飲食生活的參考，以提升國人的生活品質。為本發明之功效。

再且，藉由該第一特徵質荷比介於708~709之間，且該第二特徵質荷比介於157~158之間，可以提升該蝦類過敏原鑑定方法的專一性及靈敏度。

以及，藉由該胜肽溶液係為該蛋白質溶液混合該蛋白質變性劑所獲得，使該蛋白質變性劑可以對該蛋白質溶液中的蛋白質進行還原、烷基化、水解，使蛋白質形成短鏈的胜肽片段，提升該蝦類過敏原鑑定方法的定量準確度。

此外，藉由該蛋白質溶液係以該萃取劑萃取該待測樣品所獲得，該萃取劑可以包含濃度為20mM的Tris-HCl緩衝液，且該萃取劑的pH值可以為9.0，可以提升自該待測樣品中獲得的總蛋白之萃取量。

並且，藉由該萃取劑另包含重量體積百分比為3%的氯化鈉，可以提升蛋白質的鹽溶性，進而提升自該待測樣品中獲得的總蛋白之萃取量。

本發明的蝦類過敏原鑑定方法，另可以包含：在層析分離該胜肽溶液以獲得該分離液之前，以一固相萃取管柱純化該胜肽溶液。如此，可以去除該胜肽溶液中的鹽，減少後續分析的基質效應。

本發明的蝦類過敏原鑑定方法，其中，可以使用電噴灑離子化技術，使該分離液中的特徵胜肽形成該樣品離子。如此，使該樣品離子可以攜帶多個電荷，以利進行胜肽之分析。

本發明的蝦類過敏原鑑定方法，其中，可以使用三段四極柱質量分析器，進行該MS-1掃描及該MS-2掃描。如此，可以提供較高之偵測靈敏度，同時增加定量的可信度。

〔本發明〕

S1:樣品提供步驟

S2:鑑定步驟

〔第1圖〕本發明之一實施例的蝦類過敏原鑑定方法的流程圖。

〔第2圖〕試驗(B)中，4種常見蝦類的原肌球蛋白的胺基酸序列的多重序列比對結果。

〔第3圖〕試驗(C)中，MS-1掃描的分析結果。

〔第4圖〕試驗(C)中，以MRM模式進行MS-2掃描的分析結果。

〔第5圖〕試驗(C)中，以MRM模式進行MS-2掃描的分析結果。

〔第6圖〕試驗(D)中，以不同濃度的特徵胜肽繪出的檢量線。

〔第7圖〕試驗(F)中，鮮蝦雲吞的分析結果。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明所述「蝦類」係可以指食用蝦類，包含但不限於，白蝦(Litopenaeus vannamei)、泰國蝦(Macrobrachium rosenbergii)、斑節蝦(Marsupenaeus japonicus)、火燒蝦(Metapenaeopsis barbata)、沙蝦(Metapenaeus ensis)、草蝦(Penaeus monodon)、中國草蝦(Fenneropenaeus chinensis)、印度對蝦(Fenneropenaeus indicus)、劍蝦(Parapenaeopsis hardwickii)、蘆蝦(Trachysalambria curvirostris)、紅尾蝦(Penaeus penicillatus)及淡水大蝦(Macrobrachium rosenbergii)。

本發明之一實施例的蝦類過敏原鑑定方法，可以包含：一樣品提供步驟S1及一鑑定步驟S2。

詳而言之，該樣品提供步驟S1中，工者可以提供一胜肽溶液，該胜肽溶液包含一特徵胜肽(signature peptide)，當欲進行測試的一待測樣品為包含蝦類的生鮮食品、經烹煮後的食品(如經過蒸煮炒炸之各式食品)或加工食品(如料理粉、調理包)時，該待測樣品可以先以一萃取劑進行萃取，進而獲得一蛋白質溶液。

舉例而言，該萃取劑可以包含濃度為20~100mM的Tris-HCl 緩衝液，且該萃取劑的pH值可以為7.0~9.0，即，配製濃度為20~100mM的Tris緩衝液(Tris buffer)，再以鹽酸(hydrochloric acid，HCl)將pH值調整至介於7.0~9.0之間；較佳地，該萃取劑另可以包含重量體積百分比為1~3%的氯化鈉(sodium chloride，NaCl)，即，每公升的萃取劑包含10~30公克的氯化鈉。工者可以混合該萃取劑及該待測樣品之後，以均質機均質1分鐘(例如，均質30秒後，於冰上暫存10秒，再均質30秒)，再以10,000×g的轉速離心20分鐘，收取上清液即可以獲得該蛋白質溶液。

接著，該蛋白質溶液可以再混合一蛋白質變性劑，該蛋白質變性劑可以對該蛋白質溶液中的蛋白質進行還原(reduction)、烷基化(alkylation)、水解(hydrolysis)等作用，使蛋白質形成短鏈的胜肽片段，提升該蝦類過敏原鑑定方法的定量準確度。

舉例而言，工者可以於該蛋白質溶液中加入尿素(urea)，加入50μL的0.01%的RapiGest SF solution(溶於25mM的碳酸氫銨水溶液中)，再加入100μL的二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol，DTT，溶於25mM的碳酸氫銨水溶液中)，使混合液中的二硫蘇糖醇的終濃度(final concentration)為5mM，接著於60℃之溫度下進行反應，以還原蛋白質的雙硫鍵(disulfide bond)。爾後，加入100μL的碘乙醯胺(iodoacetamide，IAM，溶於25mM的碳酸氫銨水溶液中)，使混合液中的碘乙醯胺的終濃度為15mM，接著於室溫下避光進行反應，以進行烷基化反應。接著，加入800μL的碳酸氫銨水溶液(25mM)，再加入胰蛋白酶(trypsin，溶於25mM的碳酸氫銨水溶液中)，使胰蛋白酶專一性地水解蛋白質中由離胺酸(Lys，K)與精氨酸(Arg，R)的羧基(carboxyl group)所構成的胜肽鍵(peptide bond)，最終於13,000rpm之轉速離心10分鐘，收取上清液作為該胜肽溶液。

此外，在該萃取劑包含氯化鈉的狀況下，在獲得該胜肽溶液之後，較佳可以利用一固相萃取管柱純化該胜肽溶液，如此可以減少後續的基質效應(matrix effect)。於本實施例中，係使用HyperSep Retain PEP Polymeric Material Solid-Phase Extraction Column作為該固相萃取管柱(購自Thermo)，該固相萃取管柱內所填充有作為靜相(stationary phase)的載體顆粒，其粒徑(particle size)為55μm，表面積(surface area)為550~750m²/g，且孔徑(pore size)為55~90Å。

工者能夠先以甲醇(methanol，1mL)浸潤該載體顆粒，續以一平衡液(含5%乙腈(acetonitrile，ACN)、0.1%甲酸(formic acid)及94.9%的水，體積為1mL)平衡該載體顆粒，接著注入該胜肽溶液。再以一洗滌液(含5%乙腈、0.1%甲酸及94.9%的水，體積為1mL)洗滌該載體顆粒，以去除該胜肽溶液中的高極性鹽類，接著再依序以如第1表所示之一第一沖提液、一第二沖提液、一第三沖提液及一第四沖提液進行沖提，並且取該第一沖提液、該第二沖提液、該第三沖提液及該第四沖提液所沖提出的析出液(eluate)進行後續的鑑定步驟S2。

值得注意的是，該特徵胜肽在經離子化之後，可以形成一胜肽母離子(parent ion)，該胜肽母離子具有一第一特徵質荷比(first signature m/z ratio)；而該胜肽母離子在經碰撞解離(collision-induced dissociation，CID)之後，可以形成一胜肽子離子(daughter ion)，且該胜肽子離子具有一第二特徵質荷比(second signature m/z ratio)。於本實施例中，該特徵胜肽具有如SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列，該第一特徵質荷比介於708~709之間，且該第二特徵質荷比介於157~158之間。

該鑑定步驟S2中，係能夠以液相層析串連質譜儀(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)進行鑑定。

詳而言之，工者能夠以液相層析法對該胜肽溶液進行層析分離，以獲得包含有該特徵胜肽的一分離液，該液相層析法係使用C18管柱(150×2.1mm，粒徑為5μm，購自Thermo Scientific)作為固定相(stationary phase)，及使用如第2表所示的混合溶液作為移動相(mobile phase)進行梯度沖提(gradient elution)，沖提流速為0.35mL/min。

接著，工者可以利用電噴灑離子化(electrospray ionization， ESI)或基質輔助雷射脫附(matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI)等技術，離子化該分離液中的特徵胜肽，使該特徵胜肽形成一樣品離子。於本實施例中，係選用電噴灑離子化技術，其適用液態樣品，且對巨分子(macromolecule)具有優秀的分析能力，其中，霧化氣為高純度氮氣(N₂)，鞘氣流速(sheath gas flow rate)為40 arb，蒸發溫度(vaporizer temperature)為300℃，輔助流速(auxiliary gas flow rate)為5arb，離子噴霧電壓(spray voltage)為3.5kV，毛細管溫度(capillary temperature)為320℃，毛細管電壓(capillary voltage)為45V，管透鏡偏移電壓(tube lens offset)為124V。

該樣品離子係可以經由三段四極柱(triple quadruple，QQQ)質量分析器(mass analyzer)或離子阱(ion trap)質量分析器進行後續的分析。詳而言之，本實施例中，係選用三段四極柱質量分析器，於第一段四極柱(Q1)進行一MS-1掃描(MS-1 scan)，該MS-1掃描為全圖譜掃描(full scan)，質荷比選擇範圍(mass range)為400~1600 m/z，帶電模式(polarity)為正電(positive)，數據顯示(data type)為柱狀類型質譜圖(centroid)，即可以獲得一母離子光譜(parent ion spectrum)，該母離子光譜中存在至少一第一波峰，該至少一第一波峰與該第一特徵質荷比匹配；接著，在第二段四極柱(Q2)中，使該樣品離子進行碰撞誘導解離(collision-induced dissociation，CID)進而形成一碎片離子(fragment ion)，例如能夠以氬氣作為碰撞氣體，以1.0 arb的碰撞壓(collision pressure)進行碰撞；而後，則是在第三段四極柱(Q3)中，對該碎片離子進行一MS-2掃描(MS-2 scan)，該MS-2掃描的掃描類型(scan type)為多重反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)，質荷比選擇範圍(mass range)為100~1000 m/z，帶電模式(polarity)為正電(positive)，數據顯示(data type)為柱狀類型質譜圖(centroid)，即可以獲得一子離子光譜(daughter ion spectrum)，該子離子光譜中存在至少一第二波峰，該至少一第二波峰與該第二特徵質荷比匹配。

為證明本實施例的蝦類過敏原鑑定方法確實可以有效鑑定蝦類的過敏原，遂進行以下試驗：

(A)萃取條件的最適化

本試驗係取白蝦，去殼、去頭、去尾、去除蝦腸之後，均質形成蝦泥，接著以如第3表所示之萃取劑進行萃取，續利用BCA蛋白質定量法檢測總蛋白量，及利用ELISA法測定其中的原肌球蛋白量。

請參照第3表所示，在第A02~A06組之中，隨著所使用之萃取劑的pH值升高，所萃取獲得的總蛋白量亦有所提升，而在第A02、A07~A10組之中，Tris的濃度升高，所萃取獲得的總蛋白量則有下降，故以第A02組的萃取劑(含20mM Tris-HCl，且pH值為9.0)的萃取效果為佳。另，比較第A02、A11~A13組可以得知，添加氯化鈉可以提高蛋白質鹽溶性，且以含3%氯化鈉的第A13組萃取劑所能夠萃取獲得的原肌球蛋白含量最佳，且與其他各組均具有顯著差異(P<0.05)。

(B)特徵胜肽的選用

本試驗係取白蝦(Litopenaeus vannamei，其原肌球蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示)、泰國蝦(Macrobrachium rosenbergii，其原肌球蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示)、沙蝦(Metapenaeus ensis，其原肌球蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示)、草蝦(Penaeus monodon，其原肌球蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示)等4種常見蝦類的原肌球蛋白(tropomyosin)的胺基酸序列進行多重序列比對(multiple sequence alignment，MSA)，其比對結果如第2圖所示。

自其中找出具有保守序列(conserved sequence)的胜肽片段，包含為ALSNAEGEVAALNR(SEQ ID NO：5)、IQLLEEDLER(SEQ ID NO：6)、IVELEEELR(SEQ ID NO：7)及SITDELDQTFSELSGY(SEQ ID NO：8)。

接著將前述胜肽片段分別以本實施例的蝦類過敏原鑑定方法進行後續分析測試，其結果如第4表所示。

請參照第4表所示，上述不同胜肽片段進行測試的結果，第B1組之具有如SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列的胜肽片段，不僅背景干擾較少，且訊號強、專一性高，定量準確性亦良好，故後續試驗均選用該胜肽片段作為該特徵胜肽。

(C)胜肽母離子、胜肽子離子的選用

本試驗係以第B1組的胜肽片段作為該特徵胜肽，以等量的溶劑(含5%乙腈及0.1%甲酸)溶解該特徵胜肽的標準品，續於第一段四極柱進行該MS-1掃描，其結果如第3圖所示，該母離子光譜中存在有該標準品所形成的樣品離子產生的第一波峰([M+2H]²⁺)，其質荷比為708.3，與該第一特徵質荷比匹配。

接著於第二段四極柱進行碰撞誘導解離，續於第三段四極柱中以MRM模式進行該MS-2掃描，其結果如第4圖所示，該子離子光譜中存在有母離子[M+2H]²⁺=m/z 708.3所形成的碎片離子產生的第二波峰([M+H]⁺)，其質荷比為157.0，與該第二特徵質荷比匹配。

最終以MRM模式進行該MS-2掃描，其結果如第5圖所示，於滯留時間(retention time)為11.39分鐘時，可以沖提出該標準品。

(D)分析確效(validation)

本試驗係以濃度介於0.25~10ng/μL的特徵胜肽作為一標準品，及以濃度介於1.5~2.5ng/μL的氘化特徵胜肽作為一內標準品，混合該標準品及該內標準品後進行測試，其檢量線(calibration curve)如第6圖所示，其迴歸公式(regression equation)如下列式一，且其相關係數平方值(R² value)為0.09974，顯示該特徵胜肽的濃度與該第二波峰的面積具有高度正相關性。

y=1.4095x-0.0318 (式一)

又，以下列式二、式三的公式換算該蝦類過敏原鑑定方法的偵測極限(limit of detection，LOD)及定量極限(limit of quantitation，LOQ)，其中，σ為y-截距的標準差，S為校正曲線的斜率，以不同天所得的4條檢量線取其平均值，計算獲得的偵測極限及定量極限分別為0.072197ng/μL及0.218779ng/μL，均小於線性範圍的最小濃度，顯示上述迴歸公式可以用於定性及定量的判別。

LOD=^3.3σ/_S (式二)

LOQ=^10σ/_S (式三)

接著，以低濃度(0.5ng/μL)、中濃度(1.0ng/μL)及高濃度(7.5ng/μL)的特徵胜肽進行日內精密度測試(intra-day precision)及日間精密度測試(inter-day precision)，其結果如第5表所示，變異係數(coefficient of variation，CV)均為15%以下。

(E)物種交叉測試

本試驗係以雞肉(Gallus gallus domesticus)、鯛魚(Oreochromis mossambicus)及小卷(Loligo deulis)作為測試對象，其結果顯示，在前述肉品中均無法測得該特徵胜肽；再且，小卷屬於軟體動物門(Mollusca)頭足綱(Cephalopoda)管魷目(Teuthida)鎖管科(Loliginidae)的生物，與蝦類同屬於帶殼海鮮(shell fish)，其原肌球蛋白的同源性高，但以本實施例的蝦類過敏原鑑定方法仍不會發生交叉反應。

此外，相較於無論是針對雞肉、豬肉或魚肉均可以測得其中的原肌球蛋白的習知蝦類過敏原鑑定方法，本實施例的蝦類過敏原鑑定方法確實有較佳的專一性。

(F)加工食品的測試結果

本試驗係以鮮蝦雲吞作為該待測樣品，經萃取獲得該胜肽溶液之後進行後續分析，其結果如第7圖所示，於滯留時間為11.39分鐘時可以偵測到該特徵胜肽的胜肽子離子，經換算可以得知鮮蝦雲吞中所含有的特徵胜肽的濃度為6.6029μg/g。

綜上所述，本發明的蝦類過敏原鑑定方法，藉由該特徵胜肽的選用，至少可以辨識該胜肽溶液是否蝦類的過敏原(原肌球蛋白)，且藉由依據進行該MS-1掃描及該MS-2掃描，可以有效提升該蝦類過敏原鑑定方法的專一性及靈敏度，減少偽陽性、偽陰性反應的發生，進而能夠提供對蝦類過敏之患者飲食生活的參考，以提升國人的生活品質。為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

                         序列表
          <![CDATA[<110>  國立屏東科技大學]]>
          <![CDATA[<120>  蝦類過敏原鑑定方法]]>
          <![CDATA[<160>  8     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  284]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Litopenaeus vannamei（白蝦）]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Asp Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Ala Met Lys Leu Glu Lys Asp 
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              210                 215                 220                 
          Ile Lys Thr Leu Thr Asn Lys Leu Lys Ala Ala Glu Ala Arg Ala Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Ala Glu Arg Ser Val Gln Lys Leu Gln Lys Glu Val Asp Arg Leu 
                          245                 250                 255     
          Glu Asp Glu Leu Val Asn Glu Lys Glu Lys Tyr Lys Ser Ile Thr Asp 
                      260                 265                 270         
          Glu Leu Asp Gln Thr Phe Ser Glu Leu Ser Gly Tyr 
                  275                 280                 
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  284]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Macrobrachium rosenbergii（泰國蝦）]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Asp Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Ala Met Lys Leu Glu Lys Asp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Met Asp Arg Ala Asp Thr Leu Glu Gln Gln Asn Lys Glu Ala 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Arg Ala Glu Lys Ser Glu Glu Glu Val His Asn Leu Gln Lys 
                  35                  40                  45              
          Arg Met Gln Gln Leu Glu Asn Asp Leu Asp Ser Val Gln Glu Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Ala Asn Gln His Leu Glu Glu Lys Asp Lys Ala Leu Ser Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Glu Gly Glu Val Ala Ala Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Leu Glu 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Leu Glu Arg Ser Glu Glu Arg Leu Asn Thr Ala Thr Thr Lys 
                      100                 105                 110         
          Leu Ala Glu Ala Ser Gln Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Met Arg Lys 
                  115                 120                 125             
          Val Leu Glu Asn Arg Ser Leu Ser Asp Glu Glu Arg Met Asp Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Glu Asn Gln Leu Lys Glu Ala Arg Phe Leu Ala Glu Glu Ala Asp Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Tyr Asp Glu Val Ala Arg Lys Leu Ala Met Val Glu Ala Asp Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Thr Gly Glu Ser Lys Ile Val Glu 
                      180                 185                 190         
          Leu Glu Glu Glu Leu Arg Val Val Gly Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu 
                  195                 200                 205             
          Val Ser Glu Glu Lys Ala Asn Gln Arg Glu Glu Ala Tyr Lys Glu Gln 
              210                 215                 220                 
          Ile Lys Thr Leu Thr Asn Lys Leu Lys Ala Ala Glu Ala Arg Ala Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Ala Glu Arg Ser Val Gln Lys Leu Gln Lys Glu Val Asp Arg Leu 
                          245                 250                 255     
          Glu Asp Glu Leu Val Asn Glu Lys Glu Lys Tyr Lys Ser Ile Thr Asp 
                      260                 265                 270         
          Glu Leu Asp Gln Thr Phe Ser Glu Leu Ser Gly Tyr 
                  275                 280                 
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  274]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Metapenaeus ensis（沙蝦）]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Met Lys Leu Glu Lys Asp Asn Ala Met Asp Arg Ala Asp Thr Leu Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Gln Asn Lys Glu Ala Asn Asn Arg Ala Glu Lys Ser Glu Glu Glu 
                      20                  25                  30          
          Val His Asn Leu Gln Lys Arg Met Gln Gln Leu Glu Asn Asp Leu Asp 
                  35                  40                  45              
          Gln Val Gln Glu Ser Leu Leu Lys Ala Asn Asn Gln Leu Val Glu Lys 
              50                  55                  60                  
          Asp Lys Ala Leu Ser Asn Ala Glu Gly Glu Val Ala Ala Leu Asn Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Ile Gln Leu Leu Glu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Glu Glu Arg Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Thr Ala Thr Thr Lys Leu Ala Glu Ala Ser Gln Ala Ala Asp Glu 
                      100                 105                 110         
          Ser Glu Arg Met Arg Lys Val Leu Glu Asn Arg Ser Leu Ser Asp Glu 
                  115                 120                 125             
          Glu Arg Met Asp Ala Leu Glu Asn Gln Leu Lys Glu Ala Arg Phe Leu 
              130                 135                 140                 
          Ala Glu Glu Ala Asp Arg Lys Tyr Asp Glu Val Ala Arg Lys Leu Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Met Val Glu Ala Asp Leu Glu Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Thr Gly 
                          165                 170                 175     
          Glu Ser Lys Ile Val Glu Leu Glu Glu Glu Leu Arg Val Val Gly Asn 
                      180                 185                 190         
          Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val Ser Glu Glu Lys Ala Asn Gln Arg Glu 
                  195                 200                 205             
          Glu Ala Tyr Lys Glu Gln Ile Lys Thr Leu Thr Asn Lys Leu Lys Ala 
              210                 215                 220                 
          Ala Glu Ala Arg Ala Glu Phe Ala Glu Arg Ser Val Gln Lys Leu Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Glu Val Asp Arg Leu Glu Asp Glu Leu Val Asn Glu Lys Glu Lys 
                          245                 250                 255     
          Tyr Lys Ser Ile Thr Asp Glu Leu Asp Gln Thr Phe Ser Glu Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Gly Tyr 
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  284]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Penaeus monodon（草蝦）]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Met Asp Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Ala Met Lys Leu Glu Lys Asp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Met Asp Arg Ala Asp Thr Leu Glu Gln Gln Asn Lys Glu Ala 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Arg Ala Glu Lys Ser Glu Glu Glu Val His Asn Leu Gln Lys 
                  35                  40                  45              
          Arg Met Gln Gln Leu Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Gln Glu Ser Leu 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Ala Asn Ile Gln Leu Val Glu Lys Asp Lys Ala Leu Ser Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Glu Gly Glu Val Ala Ala Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Leu Glu 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Leu Glu Arg Ser Glu Glu Arg Leu Asn Thr Ala Thr Thr Lys 
                      100                 105                 110         
          Leu Ala Glu Ala Ser Gln Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Met Arg Lys 
                  115                 120                 125             
          Val Leu Glu Asn Arg Ser Leu Ser Asp Glu Glu Arg Met Asp Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Glu Asn Gln Leu Lys Glu Ala Arg Phe Leu Ala Glu Glu Ala Asp Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Tyr Asp Glu Val Ala Arg Lys Leu Ala Met Val Glu Ala Asp Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Thr Gly Glu Ser Lys Ile Val Glu 
                      180                 185                 190         
          Leu Glu Glu Glu Leu Arg Val Val Gly Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu 
                  195                 200                 205             
          Val Ser Glu Glu Lys Ala Asn Gln Arg Glu Glu Ala Tyr Lys Glu Gln 
              210                 215                 220                 
          Ile Lys Thr Leu Thr Asn Lys Leu Lys Ala Ala Glu Ala Arg Ala Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Ala Glu Arg Ser Val Gln Lys Leu Gln Lys Glu Val Asp Arg Leu 
                          245                 250                 255     
          Glu Asp Glu Leu Val Asn Glu Lys Glu Lys Tyr Lys Ser Ile Thr Asp 
                      260                 265                 270         
          Glu Leu Asp Gln Thr Phe Ser Glu Leu Ser Gly Tyr 
                  275                 280                 
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  特徵胜肽候選一]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Ala Leu Ser Asn Ala Glu Gly Glu Val Ala Ala Leu Asn Arg 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  特徵胜肽候選二]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Ile Gln Leu Leu Glu Glu Asp Leu Glu Arg 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  特徵胜肽候選三]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Ile Val Glu Leu Glu Glu Glu Leu Arg 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  特徵胜肽候選四]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Ser Ile Thr Asp Glu Leu Asp Gln Thr Phe Ser Glu Leu Ser Gly Tyr 
          1               5                   10                  15

S1:樣品提供步驟

S2:鑑定步驟

Claims

一種蝦類過敏原鑑定方法，包含：以一萃取劑萃取一待測樣品，獲得一蛋白質溶液，該萃取劑包含濃度為20mM的Tris-HCl緩衝液及重量體積百分比為3%的氯化鈉，且該萃取劑的pH值為9.0；將該蛋白質溶液混合一蛋白質變性劑，獲得一胜肽溶液，該胜肽溶液包含一特徵胜肽具有如SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列，該特徵胜肽經離子化之後，形成一胜肽母離子，該胜肽母離子經碰撞解離之後，形成一胜肽子離子，該胜肽母離子具有一第一特徵質荷比介於708~709之間，且該胜肽子離子具有一第二特徵質荷比介於157~158之間；層析分離該胜肽溶液，以獲得一分離液，該分離液包含該特徵胜肽；離子化該分離液中的特徵胜肽，以形成一樣品離子；對該樣品離子進行一MS-1掃描，以獲得一母離子光譜，該母離子光譜中存在至少一第一波峰，該至少一第一波峰與該第一特徵質荷比匹配；在確認該母離子光譜中存在該至少一波峰之後，使該樣品離子經碰撞解離而形成一碎片離子；及對該碎片離子進行一MS-2掃描，以獲得一子離子光譜，該子離子光譜中存在至少一第二波峰，該至少一第二波峰與該第二特徵質荷比匹配。
如請求項1之蝦類過敏原鑑定方法，另包含：在層析分離該胜肽溶液以獲得該分離液之前，以一固相萃取管柱純化該胜肽溶液。
如請求項1之蝦類過敏原鑑定方法，其中，使用電噴灑離子化技術，使該分離液中的特徵胜肽形成該樣品離子。
如請求項1之蝦類過敏原鑑定方法，其中，使用三段四極柱質量分析器，進行該MS-1掃描及該MS-2掃描。