CN109142561A - 同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法，利用iTRAQ试剂和iodoTMT试剂的质量报告基团分子量不同和结合多肽位置不同的特征，应用iodoTMT试剂标记蛋白质半胱氨酸，同时应用iTRAQ试剂标记多肽氨基末端，实现同时检测半胱氨酸氧化还原水平和蛋白质表达丰度的变化，从而可准确判断蛋白质氧化还原水平的变化。本发明在另一方面还公开了上述方法在同时定量分析细胞、组织及体液等样品中蛋白质丰度与半胱氨酸氧化还原水平中的应用。

Description

同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法及其在细胞、组织及体液等样品中的应用。
背景技术
蛋白质半胱氨酸氧化修饰(Cysteine oxidative modification，Cys-氧化修饰)是一类由活性氧分子(ROS)介导的作用于Cys的蛋白质翻译后修饰。蛋白质中的Cys残基含有富含电子的硫原子，是ROS介导氧化还原的敏感靶点之一。Cys-氧化修饰包括由ROS引发的二硫键(S-S)形成、S-谷胱甘肽化(-SSG)、S-磺胺化(-SN)、S-亚磺酰化(-SOH)、次磺酰化(-SO2H)，以及S-磺酰化(-SO3H)。其中，Cys氧化形成的S-S、-SSG和-SOH可以被相应的还原剂还原成游离巯基(-SH)。这三种形式的Cys可逆修饰可以通过调节蛋白质构象与功能，从而影响细胞生理过程和细胞稳态。近年来，蛋白质Cys可逆氧化还原修饰作为一个新兴的研究热点，越来越受到科研工作者的关注。因此，发展能对生物体内蛋白质Cys-氧化修饰进行定量检测的方法，可极大推动相关的生理生化研究。
近年来，逐渐发展起来的一系列氧化还原蛋白质组学技术为系统研究细胞、组织及体液等样品的蛋白质氧化还原修饰提供了重要手段。其中，差异烷基化技术是研究蛋白质Cys-可逆氧化修饰的常用方法。该技术先利用N-乙基马来酰亚胺(NEM)或碘乙酰胺(IAM)等烷基化试剂封闭游离巯基，再利用还原剂如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)对已被可逆氧化修饰的Cys进行还原，进而应用不同试剂标记还原后新形成的自由巯基，并通过生物质谱鉴定氨基酸序列或Cys位点，从而实现对蛋白质的氧化还原水平进行定量分析。早前，广泛应用的标记试剂主要包括可与巯基特异结合的荧光试剂，如单溴二胺(mBBr)或吲哚乙酰氨基荧光素(IAF)；与生物素结合的巯基特异性试剂，如biotin-HDPD或biotin-IAM/NEM/maleimide。这些试剂标记后的蛋白质往往通过双向电泳(2DE)被分离。2DE凝胶上呈现的蛋白质斑点大小可反映Cys被氧化的蛋白质丰度。但是，基于2DE技术的氧化还原蛋白质组学技术操作步骤繁琐，重复性不稳定，对于特殊蛋白质(如极端等电点、极端分子量和低丰度蛋白质)分离效果不好。尽管基于2DE技术可以检测蛋白质总体Cys氧化还原水平的变化，但无法对蛋白质中被修饰的Cys进行定量分析。后来，人们又发展了多种可与Cys直接发生作用的同位素标签，包括同位素亲和标签(ICAT)、可逆巯基特异性串联质量标签(CysTMT)和不可逆巯基特异性串联质量标签(iodoTMT)。这些同位素标签可直接实现对蛋白质可逆修饰Cys的定量。然而，尽管这些标签可以直接对蛋白质Cys的氧化还原水平进行定量，但是无法同时定量蛋白质丰度，从而导致无法准确判断蛋白质氧化还原水平的变化。因此，发展同时检测蛋白质丰度与Cys氧化还原水平的定量技术十分必要。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种规模化同时定量分析细胞、组织及体液等样品中蛋白质丰度与Cys氧化还原水平的蛋白质组学方法。其具体技术方案如下：
本发明在第一方面提供了一种同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法，包括以下步骤：
步骤1、采用烷基化试剂封闭蛋白质上游离的巯基，烷基化试剂优选为N-乙基马来酰亚胺(NEM)；
步骤2、采用还原剂对已被可逆氧化修饰的半胱氨酸进行还原，还原剂优选为三(2-羧乙基)膦(TCEP)；
步骤3、对还原后的蛋白质进行脱盐处理；
步骤4、采用iodoTMT标签标记经脱盐处理后的蛋白质；
步骤5、电泳分离步骤4中得到的蛋白质，并进行消化处理；电泳优选采用SDS-PAGE电泳，消化处理优选采用胰蛋白酶和胶内酶切的方法；
步骤6、采用脱盐柱对步骤5中消化得到的多肽样品进行脱盐处理；
步骤7、采用iTRAQ标签标记多肽样品，优选采用AB SCIEX公司生产的iTRAQ试剂；
步骤8、采用脱盐柱对iTRAQ标签标记后的多肽样品进行脱盐处理；
步骤9：采用超高效液相色谱分离步骤8中脱盐处理后的多肽样品，优选地采用Waters公司的Acquity UPLC超高效液相色谱对肽段样品进行分级；
步骤10、采用高分辨质谱仪鉴定各分级多肽样品；优选地采用WatersnanoAcquity UPLC和Thermal Orbitrap Fusion高分辨质谱仪对多肽样品进行鉴定，流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的100％乙腈溶液，以200nL/min的流速洗脱180min；
步骤11、搜索相应的蛋白质数据库，并对搜库结果进行分析。
优选地，上述步骤3中，采用Zeba脱盐离心柱进行脱盐处理。
优选地，上述步骤4中，采用iodoTMT标签标记蛋白质后，用二硫苏糖醇终止反应。
在一个较优实施例中，步骤6中的脱盐柱为C18脱盐柱，其制备方法为：用直径为1.5mm的平口针头戳取两片3M Empore C18 SPE膜片，再用直径为0.7mm的平口针头套于1.5mm的平口针头内部，将双层C18膜片填于低吸附的200μl移液器吸头中。
进一步地，上述C18脱盐柱的制备方法还包括：在1.5ml离心管管盖中央剪出直径为0.6cm的圆形区域，然后将移液器吸头插入圆形区域并悬于1.5ml离心管中。
优选地，上述C18脱盐柱的使用方法包括以下步骤：
步骤1、活化C18脱盐柱：向C18脱盐柱中加入200μl甲醇，2000g离心1min；
步骤2、平衡C18脱盐柱：加入200μl含0.2％三氟乙酸和70％乙腈的水溶液，2000g离心1min，并重复一次；再加入200μl 0.2％三氟乙酸溶液，2000g离心1min，并重复一次；
步骤3、多肽样品结合C18脱盐柱：应用200μl 0.2％三氟乙酸复溶多肽样品，将复溶后的多肽样品加至C18脱盐柱，1000g离心3min；将已过柱的溶液再次加至C18脱盐柱上，进行第二次过柱，1000g离心3min；
步骤4、脱盐：加入200μl 0.2％三氟乙酸溶液冲洗C18脱盐柱两遍；
步骤5、洗脱样品：加入100μl含0.1％甲酸和90％乙腈的溶液，静置1min，1000g离心2min，重复三遍后，真空冷冻干燥。
在一个较优实施例中，步骤9中的流动相A为含2％乙腈和2mM氨水的溶液，流动相B为含98％乙腈和20mM氨水的溶液，流速为0.25ml/min，洗脱梯度为：初始，0％流动相B；0.1min，1％流动相B；40min，40％流动相B；44min，90％流动相B；48min，90％流动相B；48.1min，2％流动相B；53min，2％流动相B。
在一个较优实施例中，步骤10中的HCD碰撞能量设置为40％。
优选地，上述步骤11中，应用Proteome DiscovererTM 2.2搜索相应蛋白质数据库；蛋白质修饰的相关参数设置如下：鉴定和定量蛋白质丰度时，将氨基端和赖氨酸的iTRAQ-8plex修饰设置为固定修饰，将甲硫氨酸的氧化修饰、半胱氨酸的NEM和iodoTMT修饰设置为可变修饰；鉴定和定量氧化还原修饰蛋白质时，将氨基端和赖氨酸的iTRAQ-8plex修饰、甲硫氨酸的氧化修饰、半胱氨酸的NEM和iodoTMT修饰设置为可变修饰。其它参数参考软件说明书设置。
优选地，对搜库结果进行分析时，可信的氧化还原修饰多肽定量结果应符合如下标准：含iodoTMT修饰、鉴定结果为unambiguous、可信度为High、唯一定量、蛋白质群组(protein group)为1、鉴定结果排序为1，以及delta Cn A Sequest HT为0。另外，针对不同的研究对象，选择不同的分析策略进行可信蛋白质的筛选。(a)、若研究对象为已有基因组信息的物种，可信的蛋白质丰度定量结果应符合如下标准：蛋白质特异性肽段的数量(#Protein Unique Peptides：master protein含有的特异性肽段的数目)≥2，共用肽段的数量≤1，蛋白质FDR可信度为High；(b)、若研究对象为无基因组信息的物种，搜索的数据库为包含该物种的数据库(如绿色植物库和禾本科数据库等)，则可信的蛋白质丰度定量结果应符合如下标准：蛋白质类群特异性肽段的数量(#Unique Peptides：protein group中含有的特异性肽段数目)≥2，共用肽段的数量≤1，蛋白质FDR可信度为High。
本发明在第二方面还提供了上述方法在同时定量分析细胞、组织及体液样品中蛋白质丰度与半胱氨酸氧化还原水平中的应用。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明利用iTRAQ试剂和iodoTMT试剂的质量报告基团分子量不同和结合多肽位置不同的特征，应用iodoTMT试剂标记蛋白质Cys，同时应用iTRAQ试剂标记多肽氨基末端，实现同时检测Cys氧化还原水平和蛋白质表达丰度的变化，从而可准确判断蛋白质氧化还原水平的变化。
(2)本发明在iodoTMT试剂标记氧化还原修饰蛋白质的步骤之前，先应用Zeba离心脱盐柱对蛋白质样品进行脱盐，可提高iodoTMT试剂标记氧化还原修饰蛋白质的效率；另外，在iTRAQ试剂标记多肽的步骤之前，先应用自制C18脱盐柱对蛋白质酶解后的多肽样品进行脱盐处理，可提高iTRAQ试剂标记多肽的效率。
(3)本发明应用不添加盐离子的流动相和合适的洗脱梯度分离复杂肽段样品，使复杂样品简单化，有利于后续质谱鉴定更快速、更准确和更全面。
(4)本发明针对单条肽段携带双报告基团(iodoTMT和iTRAQ的报告基团)的情况，应用了比单独试剂标记时更高的HCD碰撞能量进行质谱分析，有利于报告基团的检测和定量。
(5)本发明通过调整搜库软件的参数设置，可同时报告Cys氧化还原修饰肽段和蛋白质表达丰度的定量信息，为后续准确判断蛋白质氧化还原水平的变化提供有效信息。
(6)本发明针对不同的研究对象，应用不同的策略对结果进行分析，有利于后续数据的进一步挖掘研究。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1示出了本发明较优实施例中同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法的实验流程图；
图2示出了本发明较优实施例中菠菜叶片蛋白质酶解后多肽样品液相分级色谱图；
图3示出了本发明较优实施例中HCD碰撞能量设置为32％时肽段二级图谱示例；
图4示出了本发明较优实施例中HCD碰撞能量设置为40％时肽段二级图谱示例。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1、菠菜叶片高温应答氧化还原蛋白质组学分析
附图1示出了同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法的实验流程图。包括以下步骤：
1、应用已加入NEM的提取液提取37℃处理0h、2h和4h的菠菜(Spinacia oleraceaL.)叶片蛋白质，之后应用丙酮沉淀蛋白质，再应用HES缓冲液(50mM HEPES、1mM EDTA、0.1％SDS，pH8.0)复溶蛋白质。
2、往蛋白质溶液中加入5mM TCEP还原蛋白质，50℃孵育70min。
3、参考Zeba脱盐离心柱对蛋白质样品进行脱盐说明书对蛋白质样品进行脱盐。
4、应用iodoTMT标签126、127和128分别标记37℃处理0h、2h和4h的叶片蛋白质样品。反应结束后，加入20mM DTT终止反应。
5、应用SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品15min。
6、采取胶内酶切方法消化蛋白质，按照胰蛋白酶：蛋白质＝1：20的比例，37℃酶切16h后，真空冷冻干燥。
7、利用3M Empore C18SPE膜自制C18脱盐柱，具体使用方法如下：
(a)活化C18柱：往脱盐柱中加入200μl甲醇，2000g离心1min；
(b)平衡C18柱：加入200μl含0.2％三氟乙酸(TFA)和70％乙腈(ACN)的水溶液，2000g离心1min，并重复一次；再加入200μl 0.2％TFA溶液，2000g离心1min，并重复一次；
(c)多肽样品结合C18柱：应用200μl 0.2％TFA复溶多肽样品，将复溶后的多肽样品加至C18柱，1000g离心3min；将已过柱的溶液再次加在C18柱上，进行第二次过柱，1000g离心3min；
(d)脱盐：加入200μl 0.2％TFA溶液冲洗C18柱两遍；
(e)洗脱样品：加入100μl含0.1％甲酸(FA)和90％ACN的溶液，静置1min，1000g离心2min，重复三遍后，真空冷冻干燥。
8、应用iTRAQ标签113、115和116分别标记37℃处理0h、2h和4h的叶片蛋白质样品。反应结束后，加入H2O终止反应。
9、混合各不同标记的样品，再次应用自制C18脱盐柱对多肽样品进行脱盐处理。
10、应用Waters公司的Acquity UPLC超高效液相色谱对多肽样品进行分级，流动相A为含2％ACN和2mM氨水的溶液，流动相B为含98％ACN和20mM氨水的溶液，流速为0.25ml/min，洗脱梯度为：Initial，0％流动相B；0.1min，1％流动相B；40min，40％流动相B；44min，90％流动相B；48min，90％流动相B；48.1min，2％流动相B；53min，2％流动相B。图2为菠菜叶片蛋白质酶解后多肽样品液相分级色谱图。
11、应用Waters nanoAcquity UPLC和Thermal Orbitrap Fusion高分辨质谱仪对多肽样品进行鉴定。流动相A为含0.1％FA的水溶液，流动相B为含0.1％FA的100％ACN溶液，以200nL/min的流速洗脱180min。质谱仪设置的主要参数如下：分辨率为30000；扫描质量范围为300～1800；数据采集模式为最高速度模式运行3秒；HCD碰撞能量设置为40％。
12、应用Proteome DiscovererTM 2.2搜索菠菜蛋白质数据库。蛋白质修饰的相关参数设置如下：(a)鉴定和定量蛋白质丰度时，将氨基端和赖氨酸的iTRAQ-8plex修饰设置为固定修饰，将甲硫氨酸的氧化修饰、半胱氨酸的NEM和iodoTMT修饰设置为可变修饰。(b)鉴定和定量氧化还原修饰蛋白质时，将氨基端和赖氨酸的iTRAQ-8plex修饰、甲硫氨酸的氧化修饰、半胱氨酸的NEM和iodoTMT修饰设置为可变修饰。其它参数参考软件说明书设置。
13、可信的氧化还原修饰多肽定量结果符合如下标准：含iodoTMT修饰、鉴定结果为unambiguous、可信度为High、唯一定量、蛋白质群组(protein group)为1、鉴定结果排序为1，以及delta Cn A Sequest HT为0。可信的蛋白质丰度定量结果符合如下标准：蛋白质特异性肽段的数量(#Protein Unique Peptides：master protein含有的特异性肽段的数目)≥2，共用肽段的数量≤1，蛋白质FDR可信度为High。
14、三次生物学重复实验的搜库结果如表1所示，鉴定的肽段总数为29510±187，其中有定量信息的肽段数量为1026±25，其中满足上述条件的可信氧化还原修饰多肽定量结果数量为865±27。另外，鉴定的蛋白质总数为6620±58，其中有定量信息的蛋白质数量为5356±11，其中满足上述条件的可信蛋白质定量结果数量为2833±18。结果显示，iodoTMT试剂标记肽段的效率为3.48％，iTRAQ试剂标记肽段的效率为80.9％，由此可看出本方法有效保证了iodoTMT试剂和iTRAQ试剂标记多肽的效率。
表1、菠菜叶片高温应答氧化还原蛋白质组学质谱数据搜索菠菜蛋白质数据库的结果
15、如表2所示，按照变化倍数(Fold change，FC)大于1.2且p小于0.05的筛选标准，与对照样品相比，231条多肽中Cys所携带的iodoTMT标签数量在至少一种高温处理条件下发生显著变化。将iodoTMT标记结果与相应的iTRAQ结果进行比对，在携带iodoTMT标签数量的FC值大于1.2(p<0.05)的153条多肽中，8条多肽所携带的iodoTMT标签数量FC值小于相应的iTRAQ标签数量的FC值，据此，可认为这8条多肽的氧化还原水平没有发生显著变化；而其余147条多肽所携带的iodoTMT标签数量FC值大于相应的iTRAQ标签数量的FC值，因此，可认为这147条多肽的氧化水平显著上升。类似地，在iodoTMT标签数量的FC值小于0.8(p<0.05)的78条多肽中，一条多肽的iodoTMT标签数量FC值大于相应的iTRAQ标签，可认为该多肽的氧化还原水平并未发生显著变化；而剩余的77条多肽的iodoTMT标签数量FC值小于相应的iTRAQ标签数量的FC值，据此，可认为这77条多肽的氧化水平显著下降，即还原水平显著上升。最终，该方法共鉴定到代表183种独特蛋白质的224条多肽的氧化还原水平在至少一种高温处理条件下发生显著变化。
表2、菠菜叶片高温应答氧化还原多肽关联iTRAQ数据的分析
实施例2、星星草叶绿体氧化胁迫应答氧化还原蛋白质组学分析
1、与实施例1的分析流程相同，不同之处在于所分析的样品为星星草(Puccinellia tenuiflora)应答0mM、5mM和10mM H2O2胁迫的叶绿体蛋白质样品。应用iodoTMT标签126和129、127和130，以及128和131分别标记0mM、5mM和10mM H2O2胁迫的叶绿体蛋白质样品；同时应用iTRAQ标签113和116、114和117，以及115和119分别标记0mM、5mM和10mM H2O2胁迫的叶绿体蛋白质样品。
2、应用Waters nanoAcquity UPLC和Thermal Orbitrap Fusion高分辨质谱仪对多肽样品进行鉴定时，除HCD碰撞能量设置参数与实施例1不一致，其余参数与实施例1相同。图3为HCD碰撞能量设置为32％时肽段“QINVTCEVQQLLGNNR”的二级图谱示例，图4为HCD碰撞能量设置为40％时肽段“QINVTCEVQQLLGNNR”的二级图谱示例。如图3所示，HCD碰撞能量设置为32％时，在二级图谱上可见母离子峰很强，但报告基团的相对信号强度非常弱；相反，如图4-A所示，能量设置为40％时，在二级图谱上可见报告基团的相对信号强度很强，而几乎无母离子峰。该结果说明本发明优选的HCD碰撞能量设置为40％，有利于肽段碎片的生成和报告基团的检测与定量。将报告基团峰图区域放大，如图4-B所示，在二级谱图中可同时检测到iodoTMT试剂的报告基团(标签126、127、128、129，130和131)和iTRAQ试剂的报告基团(标签113,114、115、116，117和119)，实现了同时检测Cys氧化还原水平和蛋白质的表达丰度。
3、星星草是一种禾本科的耐盐植物，目前尚无基因组信息，因此应用搜库软件搜索的蛋白质数据库为禾本科数据库。三次生物学重复实验的搜库结果如表3所示，鉴定的肽段总数为22656±18，其中有定量信息的肽段数量为335±6，其中满足实施例1中所述条件的可信氧化还原修饰多肽定量结果数量为154±4。另外，鉴定的蛋白质总数为7178±101，其中有定量信息的蛋白质数量为5807±70。但是，若是同样采取实施例1所用的可信蛋白质丰度定量结果的筛选标准，则满足条件的可信蛋白质定量结果数量仅为90±5。因此，针对星星草这种尚无基因组信息的物种，选择蛋白质类群特异性肽段的数量(#UniquePeptides：protein group中含有的特异性肽段数目)≥2替代实施例1中的蛋白质独特肽段的数量≥2这一筛选标准，满足条件的可信蛋白质定量结果数量为1911±18。
表3、星星草叶片氧化胁迫应答质谱数据搜索禾本科蛋白质数据库的结果
4、如表4所示，按照FC＞1.2且p<0.05的筛选标准，与对照样品相比，44条肽段中Cys所携带的iodoTMT标签数量在至少一种H2O2处理条件下发生显著变化。将iodoTMT标记结果与相应的iTRAQ结果进行比对，在携带iodoTMT标签数量的FC值大于1.2(p<0.05)的19条多肽中，2条多肽所携带的iodoTMT标签数量FC值小于相应的iTRAQ标签数量的FC值，据此，可认为这2条多肽的氧化还原水平没有发生显著变化；而其余17条多肽所携带的iodoTMT标签数量FC值大于相应的iTRAQ标签数量的FC值，因此，可认为这17条多肽的氧化水平显著上升。类似地，在iodoTMT标签数量的FC值小于0.8(p<0.05)的25条多肽中，2条多肽的iodoTMT标签数量FC值大于相应的iTRAQ标签，可认为这2条多肽的氧化还原水平并未发生显著变化；而剩余23条多肽的iodoTMT标签数量FC值小于相应的iTRAQ标签数量的FC值，据此，可认为这23条多肽的氧化水平显著下降，即还原水平显著上升。最终，该方法共鉴定到代表39种独特蛋白质的40条多肽的氧化还原水平在至少一种H2O2处理条件下发生显著变化。
表4.星星草叶片氧化胁迫应答氧化还原多肽关联iTRAQ数据的分析
从实施例1和实施例2的结果可以看出，本发明可同时检测Cys氧化还原水平和蛋白质表达丰度的变化，从而可准确判断蛋白质氧化还原水平的变化；且可针对不同的研究对象，应用不同的策略对结果进行分析，为后续数据的进一步挖掘提供有效信息。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、采用烷基化试剂封闭蛋白质上游离的巯基；
步骤2、采用还原剂对已被可逆氧化修饰的半胱氨酸进行还原；
步骤3、对还原后的蛋白质进行脱盐处理；
步骤4、采用iodoTMT标签标记经脱盐处理后的所述蛋白质；
步骤5、电泳分离步骤4中得到的所述蛋白质，并进行消化处理；
步骤6、采用脱盐柱对步骤5中消化得到的多肽样品进行脱盐处理；
步骤7、采用iTRAQ标签标记所述多肽样品；
步骤8、采用所述脱盐柱对所述iTRAQ标签标记后的多肽样品进行脱盐处理；
步骤9：采用超高效液相色谱分离步骤8中脱盐处理后的所述多肽样品；
步骤10、采用高分辨质谱仪鉴定各分级多肽样品；
步骤11、搜索相应的蛋白质数据库，并对搜库结果进行分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中，采用Zeba脱盐离心柱进行脱盐处理。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中，采用iodoTMT标签标记所述蛋白质后，用二硫苏糖醇终止反应。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6中，所述脱盐柱为C18脱盐柱，其制备方法为：用直径为1.5mm的平口针头戳取两片3M Empore C18SPE膜片，再用直径为0.7mm的平口针头套于1.5mm的平口针头内部，将双层C18膜片填于低吸附的200μl移液器吸头中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述C18脱盐柱的制备方法还包括：在1.5ml离心管管盖中央剪出直径为0.6cm的圆形区域，然后将所述移液器吸头插入所述圆形区域并悬于1.5ml离心管中。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述C18脱盐柱的使用方法包括以下步骤：
步骤1、活化C18脱盐柱：向所述C18脱盐柱中加入200μl甲醇，2000g离心1min；
步骤2、平衡C18脱盐柱：加入200μl含0.2％三氟乙酸和70％乙腈的水溶液，2000g离心1min，并重复一次；再加入200μl 0.2％三氟乙酸溶液，2000g离心1min，并重复一次；
步骤3、多肽样品结合C18脱盐柱：应用200μl 0.2％三氟乙酸复溶多肽样品，将复溶后的多肽样品加至所述C18脱盐柱，1000g离心3min；将已过柱的溶液再次加至所述C18脱盐柱上，进行第二次过柱，1000g离心3min；
步骤4、脱盐：加入200μl 0.2％三氟乙酸溶液冲洗所述C18脱盐柱两遍；
步骤5、洗脱样品：加入100μl含0.1％甲酸和90％乙腈的溶液，静置1min，1000g离心2min，重复三遍后，真空冷冻干燥。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤9中，流动相A为含2％乙腈和2mM氨水的溶液，流动相B为含98％乙腈和20mM氨水的溶液，流速为0.25ml/min，洗脱梯度为：初始，0％流动相B；0.1min，1％流动相B；40min，40％流动相B；44min，90％流动相B；48min，90％流动相B；48.1min，2％流动相B；53min，2％流动相B。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤10中，HCD碰撞能量设置为40％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤11中，应用ProteomeDiscovererTM 2.2搜索相应蛋白质数据库；蛋白质修饰的相关参数设置如下：鉴定和定量蛋白质丰度时，将氨基端和赖氨酸的iTRAQ-8plex修饰设置为固定修饰，将甲硫氨酸的氧化修饰、半胱氨酸的NEM和iodoTMT修饰设置为可变修饰；鉴定和定量氧化还原修饰蛋白质时，将氨基端和赖氨酸的iTRAQ-8plex修饰、甲硫氨酸的氧化修饰、半胱氨酸的NEM和iodoTMT修饰设置为可变修饰。
10.根据权利要求1-9中任何一项所述的方法在同时定量分析细胞、组织及体液样品中蛋白质丰度与半胱氨酸氧化还原水平中的应用。
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