CN101581727A

CN101581727A - 一种高效检测体内蛋白相互作用的方法

Info

Publication number: CN101581727A
Application number: CN 200810037359
Authority: CN
Inventors: 贺宇飞; 陈先
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2008-05-13
Filing date: 2008-05-13
Publication date: 2009-11-18
Anticipated expiration: 2028-05-13
Also published as: CN101581727B

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种高效检测体内蛋白相互作用的方法。本发明利用高效瞬时转染表达系统，改进生物素－链霉亲合素一步亲和纯化技术，应用只15个氨基酸的标签，整合同位素标记技术，建立了蛋白质相互作用检测方法。本方法采用用量为10⁷数量级的起始细胞，应用于原代细胞的蛋白质相互作用检测，特异性和效率明显高于现有技术，能鉴定出更多的相互作用蛋白尤其是弱的和瞬时相互作用，同时检测耗时和费用也大为减少。本发明有助于理解细胞的信号传导过程，对开发相关的对疾病有针对性治疗的药物及治疗方法具有重要参考价值。

Description

一种高效检测体内蛋白相互作用的方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及蛋白质相互作用，具体涉及一种高效检测体内蛋白相互作用的方法

背景技术

现有技术揭示了细胞的大部分生物学功能是通过多个蛋白质的相互作用来介导的，虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是与其他蛋白质形成复合物的形式来发挥作用的。细胞接受外源或是内源的信号(生理的、病理的、以及药物等)，通过相应的信号传递途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性和发挥相应的生物学功能。在上述整个过程中，蛋白质之间的相互作用都参与其间，并且随着时间和空间的变化而变化(1)。由于细胞中蛋白质的数量庞大，因此，在后基因组时代，要更好地理解细胞的生物学活性、理解某些药物的作用机制，高通量的蛋白质相互作用的检测就至关重要。蛋白质相互作用的研究将有助于理解细胞的信号传导过程，对寻找和开发相关的对疾病进行有针对性治疗的药物和治疗方法都十分重要。

本领域公认，较为理想的用于检测蛋白质相互作用的方法，应该具有特异性并能够尽量的反映蛋白质在生理状态下的相互作用，而且要高效，能适应高通量检测的需求。但是目前的有关检测方法均难以满足上述需求，它们的主要缺陷表现为：起始细胞用量巨大，特异性不高，耗时费力。

亲和纯化技术主要基于特异性抗体或与靶蛋白融合的标签肽段来富集靶蛋白及相应的相互作用蛋白，而在此基础上发展的串联亲和纯化(tandem affinitypurification，TAP)技术则串行两步的亲和纯化。该方法的优点是：1)不需要过多的背景知识就可以得到大量含靶蛋白的复合体，大量与靶蛋白相互作用的未知蛋白质可鉴定出；2)蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水平，是一种检测体内蛋白相互作用的方法；3)TAP采用两步亲和纯化，提高了纯化产物的特异性(2)。但TAP技术尚存在如下缺点：1)在哺乳动物细胞中天然表达的蛋白量很少，需要超大规模的培养细胞(一般达到10⁹数量级)才能获得用于质谱鉴定的蛋白量；2)多步洗涤的过程中弱的和瞬时的相互作用复合物会丢失；3)标签肽段过大，可能妨碍靶蛋白与其它蛋白的相互作用。为了在亲和纯化过程中获得更多的靶蛋白，Burckstummer等更改了传统的标签肽段，分别用蛋白G和链霉亲合素结合肽(38个氨基酸)取代原来是双标签(3)。该方法可使最初的细胞使用量减少至5×10⁷，但该方法仍然没有避免TAP技术的一些固有缺陷，如标签肽段过大，仍需多步洗涤纯化等等。

为了简化纯化步骤，de Boer等建立了基于生物素-链霉亲合素系统的一步亲和纯化方法(4)。此方法首先与靶蛋白融合了一个人工的可生物素化的小肽段标签(23个氨基酸)，该标签可被在细胞中同时转染表达的生物素化酶BirA生物素化，被生物素化的靶蛋白最终由链霉亲合素微珠结合富集。由于生物素-链霉亲合素之间的相互作用力是目前已知的最强的存在于自然界中的非共价作用力，比抗体和通常使用的其它亲和标签肽段高几个数量级，所以利用该系统可一步特异性的纯化靶蛋白及其相互作用蛋白。

然而，建立在亲和纯化基础上的技术仍然会得到一些非特异性结合的蛋白，因此如何将与靶蛋白特异性相互作用的蛋白区分开来同样变得十分重要。稳定同位素特征标记生物质谱可以很好的解决这个问题。这一技术将不同质量的稳定同位素如碳13或氮15或氘作为在DNA和蛋白质分子中特征质量标记引入生物质谱领域(5)。在蛋白质定量研究中，将稳定同位素碳13或氮15标记的某种氨基酸作为标记载体加入细胞培养液中，由此所产生的细胞中的蛋白质群体会在相应氨基酸序列的位置包含这些比自然氨基酸更重的标记载体，从而在质谱上很容易被区分开来，该技术被称为氨基酸代谢标记(amino acid-coded mass tagging，AACT)技术(6，7)，或者SILAC(stable isotopelabeling by amino acids in cell culture)技术(8)。

在蛋白质相互作用研究中，Chen等将AACT技术与一步亲和纯化技术结合起来，又发展了双标记蛋白质组学研究技术，即同时将靶蛋白用亲和纯化肽段标签(如FLAG、Myc等)和稳定同位素标记(9-11)，将标记与未标记的细胞等比例混合后提取总蛋白，靶蛋白及其复合物经肽段标签的抗体亲和纯化后，质谱鉴定，通过同位素标记与否的肽质量差异来确定特异性相互作用蛋白。利用该方法，Chen等进行了一系列的蛋白质相互作用研究，包括巨噬细胞中TLR信号通路关键接头分子MyD88的相互作用蛋白(9，10)，以及DNA修复过程中组蛋白H2AX的相互作用蛋白(11)，发现了一些新的重要相互作用蛋白分子。但是，由于该方法使用基于抗体相互作用的亲和纯化肽段标签，因此仍需要大量的起始细胞(约10⁹或更多)用来富集靶蛋白，从而制约了使用该方法进行大规模高通量的蛋白质相互作用检测，尤其是信号通路中低丰度蛋白质的相互作用检测与研究。与本发明相关的现有技术有下述文献(分别被引用于上文中)。

现有技术：

1.Berggard T，Linse S，James P.Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.Proteomics.2007，7：833-42.

2.关薇，王建，贺福初.大规模蛋白质相互作用研究方法进展.生命科学.2006，18：507-12.

3.Burckstummer T，Bennett KL，Preradovic A，Schutze G，Hantschel O，Superti-Furga G，BauchA.An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammaliancells.Nat Methods.2006，3：1013-9.

4.de Boer E，Rodriguez P，Bonte E，Krijgsveld J，Katsantoni E，Heck A，Grosveld F，StrouboulisJ.Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors inmammalian cells and transgenic mice.Proc Natl Acad Sci USA.2003，100：7480-5.

5.Chen X，Smith LM，Bradbury EM.Site-specific mass tagging with stable isotopes in proteinsfor accurate and efficient protein identification.Anal Chem.2000，72：1134-43.

6.Zhu H，Pan S，Gu S，Bradbury EM，Chen X.Amino acid residue specific stable isotopelabeling for quantitative proteomics.Rapid Commun Mass Spectrom.2002，16：2115-23.

7.Chen X，Sun L，Yu Y，Xue Y，Yang P.Amino acid-coded tagging approaches in quantitativeproteomics.Expert Rev Proteomics.2007，4：25-37.

8.Ong SE，Blagoev B，Kratchmarova I，Kristensen DB，Steen H，Pandey A，Mann M.Stableisotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC，as a simple and accurate approach toexpression proteomics.Mol Cell Proteomics.2002，1：376-86.

9.Wang T，Gu S，Ronni T，Du YC，Chen X.In vivo dual-tagging proteomic approach in studyingsignaling pathways in immune response.J Proteome Res.2005，4：941-9.

10.Wang T，Chuang TH，Ronni T，Cai H，Sun HQ，Yin HL，Chen X.Flightless I HomologNegatively Modulates the TLR Pathway.J Immunol.2006，176：1355-1362.

11.Du YC，Gu S，Zhou J，Wang T，Cai H，Maclnnes MA，Bradbury EM，Chen X.The DynamicAlterations of H2AX Complex during DNA Repair Detected by a Proteomic Approach Revealthe Critical Roles of Ca2+/Calmodulin in the Ionizing Radiation-induced Cell Cycle Arrest.

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的缺陷，提供一种高效检测体内蛋白相互作用的方法。

本发明利用高效瞬时转染表达系统，改进生物素-链霉亲合素一步亲和纯化技术，应用只15个氨基酸的标签，整合同位素标记技术，建立了本发明蛋白质相互作用检测方法。

本发明方法采用用量为10⁷数量级的起始细胞，应用于原代细胞的蛋白质相互作用检测，特异性和效率明显高于现有技术方法，能鉴定出更多的相互作用蛋白尤其是弱的和瞬时相互作用，同时检测耗时和费用也大为减少。

本方法包括下述步骤：

1、构建质粒表达载体

建立含有表达可生物素化的人工小肽段标签(由已知公开文献获得--Beckett，D.，Kovaleva，E.& Schatz，P.J.(1999)Protein Sci.8，921-929，15个氨基酸，基因序列为：TCCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAA TCGAATGGCACGAA)的通用质粒载体(基于Invitrogen公司的pcDNA3.1 Directional TOPO载体)，该载体有两个亚型，分别用于将肽段标签连于靶蛋白的N端和C端，分别命名为pAP-N和pAP-C；

构建含生物素化酶BirA基因的真核质粒表达载体(命名为pBirA，所述基因具有序列1的序列，由PubMed检索获得)；

2、人工小肽段标签的可生物素化

通过在细胞中共瞬时转染表达生物素化酶BirA基因实现与靶蛋白融合的肽段标签的生物素化；

3、建立一步亲和纯化方法

被生物素化的靶蛋白通过链霉亲合素磁珠富集纯化，

所采用的仪器和试剂为德国美天旎公司的免疫磁珠分离系统，具体操作方法参照该公司提供的说明书；

4、整合AACT技术与一步亲和纯化方法

将细胞稳定同位素标记(AACT技术)，按文献报道：)与可生物素化肽段标签一步亲和纯化技术整合；

5、蛋白质酶解、质谱鉴定、数据库搜索和蛋白鉴定

相关操作方法参照文献报道(J Proteome Res.2005，4：941-9；Mol Cell Proteomics.2006，5：1033-1044.)。

本发明以研究293T细胞中的重要接头蛋白14-3-3ε的相互作用蛋白作为实例，获得最佳实验方案并建立了相应的技术体系，能满足高通量、高效蛋白质相互作用检测及研究的需求。

具体实施方式

本发明以293T细胞中的重要接头蛋白14-3-3ε的相互作用蛋白作为实例，详细阐述本发明方法及步骤。

实施例1

1.构建质粒载体

以含有表达可生物素化的人工小肽段标签的质粒pAP-N为基础，构建同时含14-3-3ε的质粒pAP-N-1433。14-3-3ε的基因序列插入pAP-N的Xbal和EcoRV酶切位点。细胞转染用质粒的中量提取采用Invitrogen公司中抽试剂盒(货号：K210004)。

2.细胞培养

HEK293T细胞(市购)为人的胚胎肾细胞，贴壁生长。稳定细胞系于37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养，其培养基为正常的或d3-Leu标记的高糖DMEM。293T细胞用AACT技术标记并培养在含10％透析胎牛血清、带标记氨基酸的DMEM培养液中(称为293T-d3)，同时未标记的293T细胞则用含10％胎牛血清的普通DMEM培养液培养(称为293T-d0)。有关的AACT标记技术可参阅现有技术(J Proteome Res.2005，4：941-9；Mol Cell Proteomics.2006，5：1033-1044.)。

3.以Lipofectamine 2000脂质体(Invitrogen公司)转染293T细胞

转染293T细胞的流程参照Invitrogen公司脂质体说明书进行(https://catalog.invitrogen.com/index.cfm？fuseaction＝viewCatalog.viewProductDetails&productDescription＝541)。本实施例在6孔细胞培养板中置等量的293T-d3和293T-d0细胞各3孔，转染前细胞生长密度为80％左右，于细胞培养板中的3孔293T-d3细胞均转染pAP-N-1433质粒，而3孔293T-d0细胞则均共转染pBirA和pAP-N-1433质粒。

4.提取细胞蛋白

转染40小时后，上述两种细胞总共各用400微升裂解液(碧云天公司，Western及IP细胞裂解液，P0013)，裂解细胞后获得总蛋白，具体操作按裂解液说明书。

5.一步亲和纯化14-3-3ε靶蛋白及复合物

仪器和试剂使用德国美天旎公司的免疫磁珠分离系统，上述两种400微升细胞裂解液分别和100微升链霉亲合素磁珠结合反应，具体的操作按公司说明书提供的方法：(http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_562_489_Display_technology.aspx和http://www.miltenyibiotec.com/download/datasheets/95/DS130-074-101.pdf)。最后分别用100微升1×SDS蛋白上样缓冲液分别洗出磁珠结合蛋白，混合两者。

6.蛋白分离

得到的蛋白混合物在沸水中煮5分钟，进行常规的12％的SDS-PAGE胶电泳，至溴芬蓝到达底部。

7.蛋白质酶解(胶内酶解)

1)水洗：用前先用去离子水洗一下SDS-PAGE，浸泡几十分钟；

2)切胶：切成1平方毫米大小的胶粒，放入EP管中；

3)脱色：脱色液为50％ACN+50mM NH4HCO3，50-100μl/次，振荡洗涤2-3次，洗至颜色基本去掉；

4)脱水：先用50％ACN脱水，60-100μl/次，5min；然后用100％ACN再次脱水，脱水后胶粒会缩小；

5)干燥：将脱水后的胶粒用氮气吹干或37℃烘至完全脱水，一般10分钟以上；

6)加酶：原液(或储备液)为100ng/μl，需稀释8倍至12.5ng/μl Trypsin，10-20μl/次(酶20μl+140μl 25/20mM NH4HCO3)，加完酶解液，放入4℃冰箱10-15min，以便酶被完全吸收，之后吸出多余酶液，再加入10-20μl 25/20mMNH4HCO3，有时也可以用水，37℃酶解，振荡过夜；

7)提肽：0.1％TFA+50％ACN，50μl，上清不吸出，超声10min(超声容器内加冰)，离心后，收集上清于EP管中。再加50μl0.1％TFA+50％ACN，超声10min，加冰，合并两次的上清。

8)冻干：每个试管用膜封好，扎几个孔，放入-80℃，同时把冷冻干燥的架子也冷冻好，3-4小时后，放入低温冷冻干燥机中冻干。将冻干好的样品放入-80℃备用。

上述有关操作还可参阅现有技术(J Proteome Res.2005，4：941-9；Mol CellProteomics.2006，5：1033-1044.)。

8.质谱鉴定

酶解的肽段进行LC-MS/MS分离分析，具体操作是在配置有Finnigan动态纳喷雾源的LTQ-Orbitrap杂交质谱(Thermo Finnigan，Bremen，Germany)。肽段混合物先用液相的流动相溶解，然后上样到一ZORBAX 300SB-C18柱子(来自Agilent，4.6×250，5μm)，流速为1.6μl/min，120min的梯度洗脱。流动相A为含5％乙腈、0.1％甲酸的水相；流动相B为含95％乙腈、0.1％甲酸的有机相。样品用流动相A溶解，肽段先用10％的流动相B洗脱2.5min，然后采用一个线性梯度，于92.5min时流动相B达到60％，在95.5min时，升至95％的流动相B，保持在95％的流动相中10min，然后在5min内迅速将流动相降为10％的流动相B，使之平衡。LTQ-Orbitrap杂交质谱按照依靠数据处理的模式进行操作，采用前三个最强峰策略。简单的说，在一个扫描周期中，先在orbitrap中进行质荷比400-2000(m/z400-2000)的全质量范围扫描，质量分辨率设为60000，然后在线性离子阱选取最强的3个母离子进行串级扫描，单电荷离子在串级扫描时被剔除。

有关的操作还可参阅现有技术(J Proteome Res.2005，4：941-9；Mol CellProteomics.2006，5：1033-1044.)。

9.数据库搜索和蛋白鉴定

使用TurboSequest V.27(rev.12)搜索引擎，将所得的所有的MS/MS质谱进行了人类数据库搜索，搜索参数设置如下：胰酶特异性酶切，最大允许2个漏切位点；母离子的质量误差为10ppm，碎片离子的误差为1Da；可变修饰为磷酸化的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸(+79.9663)以及d3标记的亮氨酸(+3.018)。所鉴定到的肽段用XCorr、肽的概率、delta Cn、肽质量准确度及不同的肽段数进行过滤，XCorr设定为1.9、2.7、3.5，分别对应于相应的2+、3+和4+母离子；delta Cn＞0.1；肽的概率＜0.001；肽的质量准确度＞0.01Da；两条以上的肽段匹配一个蛋白。

结果显示，本发明以6孔板中总共6个孔的细胞数量为起始，转染时细胞总共5×10⁶，起始细胞量少，从细胞培养到得到相互作用复合物只需用3天时间，一次在293T细胞中共鉴定到297个14-3-3ε的特异性相互作用蛋白。比较现有技术需用稳转的方法，从细胞培养到得相互作用复合物需用2个月左右的时间，本发明方法可用于哺乳动物细胞中蛋白质相互作用检测及研究，具有高效、高特异性、省时省力省经费的优势。

表1是293T细胞中检测到的297个14-3-3ε的特异性相互作用蛋白。表2是本发明与现有技术方法的比较。

表1

表2

	本发明	以往方法(以TAP为例)
	本发明	以往方法(以TAP为例)	起始细胞量	转染时细胞总共5×10⁶	1×10⁹
得到蛋白复合物时间	3天	2月	起始细胞量	转染时细胞总共5×10⁶	1×10⁹
得到蛋白复合物时间	3天	2月	特异性	很高	低
检测到的相互作用蛋白	几百个	一般几十个	特异性	很高	低

一种高效检测体内蛋白相互作用的方法

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学

<120>一种高效检测体内蛋白相互作用的方法

<130>11

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>966

<212>DNA

<213>动物

<400>1

atgaaggata acaccgtgcc actgaaattg attgccctgt tagcgaacgg tgaatttcac 60

tctggcgagc agttgggtga aacgctggga atgagccggg cggctattaa taaacacatt 120

cagacactgc gtgactgggg cgttgatgtc tttaccgttc cgggtaaagg atacagcctg 180

cctgagccta tccagttact taatgctaaa cagatattgg gtcagctgga tggcggtagt 240

gtagccgtgc tgccagtgat tgactccacg aatcagtacc ttcttgatcg tatcggagag 300

cttaaatcgg gcgatgcttg cattgcagaa taccagcagg ctggccgtgg tcgccggggt 360

cggaaatggt tttcgccttt tggcgcaaac ttatatttgt cgatgttctg gcgtctggaa 420

caaggcccgg cggcggcgat tggtttaagt ctggttatcg gtatcgtgat ggcggaagta 480

ttacgcaagc tgggtgcaga taaagttcgt gttaaatggc ctaatgacct ctatctgcag 540

gatcgcaagc tggcaggcat tctggtggag ctgactggca aaactggcga tgcggcgcaa 600

atagtcattg gagccgggat caacatggca atgcgccgtg ttgaagagag tgtcgttaat 660

caggggtgga tcacgctgca ggaagcgggg atcaatctcg atcgtaatac gttggcggcc 720

atgctaatac gtgaattacg tgctgcgttg gaactcttcg aacaagaagg attggcacct 780

tatctgtcgc gctgggaaaa gctggataat tttattaatc gcccagtgaa acttatcatt 840

ggtgataaag aaatatttgg catttcacgc ggaatagaca aacagggggc tttattactt 900

gagcaggatg gaataataaa accctggatg ggcggtgaaa tatccctgcg tagtgcagaa 960

aaataa 966

Claims

1、一种高效检测体内蛋白相互作用的方法，其特征是采用用量为10⁷数量级的起始细胞，检测原代细胞的蛋白质相互作用，包括下述步骤：

1)构建质粒表达载体

建立含有表达可生物素化的15个氨基酸的人工小肽段标签的通用质粒载体，

构建含生物素化酶BirA基因的真核质粒表达载体；

2)人工小肽段标签的可生物素化

3)建立一步亲和纯化方法

被生物素化的靶蛋白通过链霉亲合素磁珠富集纯化；

4)整合氨基酸代谢标记技术与一步亲和纯化方法

将细胞稳定同位素标记与可生物素化肽段标签一步亲和纯化技术整合；

5)蛋白质酶解、质谱鉴定、数据库搜索和蛋白鉴定。

2、按权利要求1所述的高效检测体内蛋白相互作用的方法，其特征是所述的步骤1)的15个氨基酸其序列为：

TCCGGCCTGAACGACATC TTCG AGGCTCAGAAAA TCGAATGGCACGAA。

3、按权利要求1所述的高效检测体内蛋白相互作用的方法，其特征是所述的步骤1)的通用质粒载体基于pcDNA3.1 Directional TOPO载体，所述载体有两个亚型，分别用于将肽段标签连于靶蛋白的N端和C端，分别命名为pAP-N和pAP-C。

4、按权利要求1所述的高效检测体内蛋白相互作用的方法，其特征是所述的步骤1)的BirA基因具有序列1的序列。