CN1673378A - 哺乳细胞串联亲和纯化载体及其纯化蛋白复合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白分离纯化领域。本发明提供了一种用于哺乳细胞的串联亲和纯化载体，其制备方法及其纯化蛋白复合物的方法。串联亲合纯化(TAP)用于分离蛋白复合物，研究生理条件下蛋白－蛋白相互作用。本发明的串联亲合纯化载体适于研究高等哺乳细胞中蛋白质相互作用，用两个Flag标签序列取代了最初TAP载体上蛋白A标签序列，使得标签分子量大大减小，有利于外源目的基因与TAP载体有效融合表达，减小标签对融合蛋白的功能或稳定性的影响；同时双重Flag标签序列有利于与抗Flag的单克隆抗体发生高亲和力结合。因此，本发明的TAP载体用于分离纯化高等哺乳细胞中的蛋白复合物，将更为高效和简便。
Description
技术领域
本发明属于蛋白分离纯化领域，具体的说，本发明提供了一种哺乳(动物)细胞(mammalian cell)串联亲和纯化载体，其制备方法及其纯化蛋白复合物的方法。应用该串联亲和纯化载体系统可高效分离蛋白质复合物，研究蛋白质间的物理相互作用。
背景技术
随着许多生物全基因组测序的完成，生命科学已进入基因组、蛋白质组等主要研究内容的后基因组时代，新学科蛋白质组学也应运而生。蛋白质-蛋白质间的相互作用分析是蛋白质组学、分析化学、生物化学等多学科交叉的新近热点研究内容。现在大规模基因组测序产生的海量数据急需系统蛋白质组学来阐明基因编码的、执行细胞功能的蛋白质作用网络。各种生命活动是不同功能蛋白质在时空上有序表达和协同作用的结果。细胞中决大多数的酶和调控过程是通过蛋白质复合物或多蛋白质网络协同作用实现的，细胞信息传递和免疫反应等都是蛋白质相互识别和相互作用的结果。分析建立分子间相互作用形成的调节网络是后基因组时代分子生物学的主要任务之一，蛋白质间的相互作用也蛋白质组学研究的重要内容之一。
近年发展起酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)等许多技术来研究蛋白-蛋白间的相互作用。尤其以Fields等1989年建立的酵母双杂交系统普遍用来检测蛋白质间的相互作用，但其操作步骤繁多，及存在较高的假阳性和假阴性结果是酵母双杂交分析中常面临的问题。而且，酵母双杂交系统都用酿酒酵母作为宿主细胞，由于酵母中缺乏适当的修饰酶，因此生物体中那些依靠翻译后修饰的相互作用在酵母中就不能检测到。
由Rigaut等1999年首先在酵母中建立的串联亲合纯化(Tandem affinitypurification，TAP)方法来分离蛋白质复合物，结合基质辅助激光解吸离子飞行时间/质谱(MALDI-TOF/MS)、电喷雾(ESI)等生物质谱技术来研究蛋白质复合物及蛋白质间的相互作用。TAP技术：即构建含有葡萄球菌蛋白A、钙调素结合肽(calmodulin binding peptide，CBP)和TEV酶切位点(Tobacco Etch Virus，TEV)的TAP标签(TAP tag)载体，将感兴趣的靶蛋白基因与TAP tag载体重组，导入酵母细胞中进行融合表达，表达的融合蛋白通过IgG和钙调素(Calmodulin)亲合柱、在生理状态下两次特异亲和洗脱而得到较纯的蛋白质复合物。蛋白质复合物再通过串联质谱(Tandem MS，MS/MS)进行蛋白质的鉴定。TAP方法能在生理条件下简单快速分离含量低的蛋白质复合物；TAP结合MS技术，可以绘制蛋白质-蛋白质之间特异性的物理性相互作用图而减少假阳性结果。TAP-MS技术较之免疫沉淀-质谱(IP-MS)方法，TAP-MS功能更强大，因IP-MS方法在MS谱图分析中存在较强的背景而影响蛋白质的鉴定。因此，TAP结合质谱技术现逐渐成为蛋白质组学研究中大规模快速分离鉴定蛋白质复合物的有效手段之一。
串联亲合纯化(TAP)最早是用于酵母细胞中分离蛋白复合物，研究生理条件下蛋白-蛋白相互作用。TAP技术通过嵌入一段蛋白标签(TAP tag)，在目的蛋白的一端(N端或C端)或中部结合蛋白标签，这样就在不破坏目的蛋白调控序列的基础上，使得被标记的目的蛋白的表达量能够与其在细胞中自然表达水平相当，避免了由于过量表达导致非自然条件下的蛋白质相互作用。经过特异性的两步亲和纯化，在生理条件下与目标蛋白发生真实相互作用的蛋白质便可一起被洗脱下来，得到的蛋白复合体就可用质谱鉴定。TAP研究蛋白相互作用的方法集成了经典的亲和纯化和免疫共沉淀这两种方法的优点，既通过亲和纯化可以得到高纯度低拷贝数的蛋白质复合体，也利用了免疫共沉淀中运用特异性的标记蛋白与亲和柱之间的相互作用，可快速地得到生理条件下与目标蛋白存在真实相互作用的蛋白质。TAP技术是研究蛋白质相互作用的方法学上的巨大突破。
运用TAP技术研究蛋白质相互作用的内容包括：鉴定新的蛋白复合物和鉴定已知蛋白复合体中的新组分。TAP技术研究蛋白复合物的好处在于，对那些功能未知的蛋白质或某蛋白新功能的诠释都可通过与复合物中功能已知的蛋白质的相互作用来推定预测。TAP技术较其他研究蛋白相互作用的方法的优势在于：它可以鉴定出空间上非直接物理相互作用的蛋白分子，而这种情况在蛋白质复合体中又很常见的。因此，运用TAP技术，不仅可以鉴定出传统研究蛋白质相互作用的技术能够检测的组分，而且还能够找出传统方法不能鉴定出的新组分。Yoon等运用TAP技术发现了酵母APC复合体中有13个组分，而传统的遗传和生化方法只鉴定出了11种组分。运用TAP技术发现新的蛋白质复合体也是TAP应用的重要方面。Bouveret运用TAP方法发现了一种新的Sm类蛋白复合体，该复合体参与mRNA的降解过程。
与传统研究蛋白相互作用的技术相比，TAP技术研究的是生理条件下细胞中几种或多种蛋白与蛋白之间的相互作用，假阳性和假阴性结果少；鉴定出的蛋白质相互作用能真实反映细胞中蛋白质分子之间的联系，实验结果更加接近真实情况。而且，由于TAP技术与质谱技术的联用，以及质谱技术的自动化，使得大规模分析蛋白质相互作用成为可能，适合于蛋白质组水平的大规模研究。TAP-MS技术已成功用于酵母和大肠杆菌的蛋白质复合物相互作用网络分析。很多蛋白质功能是通过蛋白质复合体或蛋白质复合体间的相互作用共同实现的。TAP技术能够提供大量蛋白质复合体的信息，随着大量蛋白复合体的数据增加，大规模、全细胞地分析蛋白质之间的相互作用可以揭示细胞内蛋白质复合体之间的相互作用网络图。蛋白质之间的相互作用网络为准确深入了解蛋白功能、揭示细胞生命活动中正常或病变行为的物质基础，为针对关键的蛋白分子设计诊断或治疗药靶提供重要信息。
虽然TAP技术已成功运用于酵母细胞蛋白质相互作用的大规模研究中，但在高等真核细胞中的发展较慢、应用受到限制。这是因为高等真核细胞的基因组比酵母这样的低等真核细胞更复杂，细胞抽提物中蛋白混合物的高度复杂性，加之蛋白的翻译后修饰等原因，难于鉴定哺乳细胞中的蛋白复合物及其特征。经典的生化纯化方法常常是根据某一目的蛋白的生物物理性质来进行的，由于每一种蛋白的理化特征不一样，因此各种蛋白的分离纯化方法需要研究人员经验的积累。由于最初Rigaut所构建的含有TAP标签(TAP tag)的pBS1761、pBS1479等质粒载体适合从酵母中分离蛋白复合物，而对于高等真核细胞和哺乳动物细胞，难于直接使用这些TAP标签载体有效纯化目的蛋白复合物。因此，现在研究者们纷纷发展一些适于在高等哺乳细胞中分离蛋白复合体的TAP载体及蛋白分离系统。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种哺乳动物细胞串联亲和纯化载体。
本发明的另一个目的是提供一种哺乳动物细胞串联亲和纯化载体的制备方法。
本发明的再一个目的是提供一种串联亲和纯化载体的应用，即应用上述的串联亲和纯化载体纯化蛋白复合物的方法。
本发明的一个目的是提供一种哺乳动物细胞串联亲和纯化载体。
本发明的串联亲和纯化载体的多克隆位点上游含有Flag标签和钙调素结合肽序列，并且在Flag标签和钙调素结合肽序列之间有烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV，Invitrogen #12575-015)酶切位点。
该载体多克隆位点上游的Flag标签由2个相同的8肽组成。
本发明的串联亲和纯化载体上还有若干筛选标记，如编码氨苄青霉素和嘌呤霉素乙酰转移酶的筛选标记，以方便在大肠杆菌和细胞中筛选转入TAP载体的阳性克隆。
本发明的串联亲和纯化载体的多克隆位点还含有若干个限制性内切酶位点，以便插入目的基因。例如含有BamH I、BstX I、EcoRV及Xho I等酶切位点。
在本发明的一个实施例中，构建了一个命名为p2FCBP的串联亲和纯化载体，其具体构成如图1所示。p2FCBP载体上有BamH I、BstX I、EcoRV及Xho I等多克隆位点供外源基因方便插入，且在多克隆位点上游插入2个相同的8肽组成的Flag标签(DFlag，即DYKDDDDK)和1个钙调素结合肽(CBP)序列，在Flag标签和CBP序列之间有1个TEV蛋白酶酶切位点。载体上还各有一个编码氨苄青霉素(Amp)和嘌呤霉素乙酰转移酶(puromycin N-acetyl transferase)的筛选标记，以方便在大肠杆菌和细胞中筛选含有p2FCBP标签的阳性克隆。
本发明的另一个目的是提供一种上述串联亲和纯化载体的制备方法。
该制备方法主要包括：(1)载体MSCVpac的酶切制备(2)TAP标签序列的制备。具体而言，本发明的串联亲和纯化载体可按如下方法制备：该串联亲和纯化载体是在逆转录病毒载体MSCVpac的基础上改建发展而成。即将由2×Flag与TEV酶酶切序列及CBP序列组成的TAP标签序列加上HindIII和BamH I限制性内切酶的接头序列，与用限制性内切酶HindIII和BamH I双酶切的载体MSCVpac连接而成。
本发明的再一个目的是提供一种应用上述的串联亲和纯化载体纯化蛋白复合物的方法。
本发明的TAP载体用于分离纯化高等哺乳细胞中的蛋白复合物，将更为高效和简便，纯化过程包括如下步骤：
(1)将克隆的目的基因与权利要求1所述的串联亲和纯化载体进行重组，获得重组质粒并稳定表达融合蛋白，制备细胞抽提物；
(2)用FLAG单抗纯化细胞抽提物；
(3)用烟草蚀纹病毒蛋白酶处理(2)的产物；
(4)用钙调素多肽纯化(3)的产物。
具体蛋白的分离纯化可按下述方法操作。将与p2FCBP载体重组的质粒导入靶细胞中进行稳定表达融合蛋白，制备细胞抽提物。将细胞抽提液加入30-50μl用pH3.5 glycine-HCl平衡过的Anti-FLAG M2 beads(Anti-FLAG M2 AgaroseAffinity Gel，Sigma #A2220)中，混匀，4℃摇动2-3h，1500×g离心5min，去上清，用TBS(50mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl)洗2-3次。TEV酶酶解缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0，0.5mM EDTA，150mM NaCl，0.1％NP-40，0.1 mM DTT)洗一次，加入含2-4μl 10U/μl TEV酶(Invitrogen #12575-015)室温摇动2~3h，4℃、1500×g离心5min，保留上清。上清转移到已用CBB缓冲液(10mM Tris-HClpH8.0，150mM NaCl，1mM MgOAc，1mM Imidazole，2mM CaCl2，10mMβ-ME)平衡过的钙调素(CM)beads(Calmodulin Affinity Resin，Stratagene #214303)中，4℃摇动过夜，1500×g离心5min，去上清，用CBB缓冲液洗2-3次，加入40~60μl 2×蛋白上样缓冲液(100mM Tris-HCl pH6.8，2％SDS，20％(V/V)glycerol，0.002％brophenol blue，1.43Mβ-ME)、煮沸3-5min，1500×g离心5min，保留上清。将上清进行12％SDS-PAGE电泳分离后，将蛋白条带切割酶解，提取肽段，进行质谱鉴定。
本发明的p2FCBP载体中用仅有16个氨基酸残基的两个Flag(2×Flag)标签序列取代了最初TAP载体上有137个氨基酸残基组成的Protein A标签序列，使得标签分子量大大减小，有利于外源目的基因与TAP载体有效融合表达，减小标签对融合蛋白的功能或稳定性的影响。而且，2×Flag能与抗Flag的单克隆抗体发生高亲和力结合。因此，在第一次分离纯化蛋白过程中，由于带有TAP标签的靶蛋白含有Flag序列而与Anti-Flag M2特异性结合，那些与靶蛋白有相互作用与其结合形成的蛋白复合物就吸附在Anti-Flag M2 beads上，而其余杂蛋白就被洗脱除去。同理，经过第二次纯化后，未与靶蛋白结合或者不含有钙调素结合肽的蛋白就被洗脱。这样，经过两次纯化，最终得到非常纯的含有目的蛋白的复合物。因此，本发明的TAP载体用于分离纯化高等哺乳细胞中的蛋白复合物，与现有的各种TAP载体相比，更为高效和简便。
附图说明
图1为p2FCBP载体构建示意图。其中，1为两个Flag标签序列，2为钙调素结合肽(CBP)序列，3为TEV酶酶切位点，4为多克隆位点，5为内部核糖体进入位点(IRES)，6为嘌呤霉素乙酰转移酶(puromycin N-acetyl transferase)位点，7为信号序列，8为5’端长末端重复序列(5’LTR)，9为3’端长末端重复序列(3’LTR)，10为编码氨苄青霉素序列(Amp)，11为NdeI酶切位点，12为XmnI酶切位点。
具体实施方式
实施例1 串联亲和纯化载体p2FCBP的构建
该串联亲和纯化载体是在逆转录病毒载体MSCVpac的基础上改建发展而成。即将由2×Flag与TEV酶酶切序列及CBP序列组成的TAP标签序列加上HindIII和BamH I限制性内切酶的接头序列，与用限制性内切酶HindIII和BamH I双酶切的载体MSCVpac连接而成。
制得串联亲和纯化载体如图1所示，命名为p2FCBP。p2FCBP载体上有BamHI、BstX I、EcoRV及Xho I等多克隆位点供外源基因方便插入，且在多克隆位点上游插入2个相同的8肽组成的Flag标签(DFlag)和1个钙调素结合肽(CBP)序列，在Flag标签和CBP序列之间有1个TEV酶酶切位点。载体上还各有一个编码氨苄青霉素(Amp)和嘌呤霉素乙酰转移酶(puromycin N-acetyl transferase)的筛选标记，以方便在大肠杆菌和细胞中筛选含有p2FCBP标签的阳性克隆。
实施例2 将p2FCBP载体应用于鉴定靶蛋白14-3-3ε在QGY7703细胞中的相互作用蛋白
(1)细胞培养和收集
QGY7703培养在含10％胎牛血清(FCS)的培养液1640中，37℃、5％CO2，每2-3天传代。细胞生长到80-100％时，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA的消化液处理几分钟使细胞脱壁，加入预冷PBS悬浮，离心洗去培养液，再用PBS重复一次。
(2)RT-PCR
将收集的106QGY7703细胞抽提总RNA，用50μl无RNA酶的ddH2O溶解。PCR扩增14-3-3ε的正义引物(5’-TATGGATCCGATGATCGAGAGGATCTGGTGTAC-3’)；反义引物为(5’-ATTCTCGAGTCACTGATTTTCGTCTTCCACGTC-3’)。RT-PCR条件是：2μl总RNA作为模板，20μmol/L引物各1μl，10mmol/L dNTP 5μl，25mmol/L MgCl210μl，10×PCR buffer 5μl，40U/μl RNase抑制剂1μl，5U/μlAMV RTase XL 1μl，5U/μl AMV Taq聚合酶1μl，总体积50μl。50℃反转录30min，94℃、2min灭活反转录酶后，94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，共进行30次循环，扩增出一条约750bp的目的带。纯化回收的PCR产物直接测序结果表明，所扩增条带序列完全正确。
(3)重组质粒的构建
将目的PCR产物回收，用BamH I和Xho I双酶切后，与经BamH I和Xho I双酶切的TAP tag载体连接，转化感受态E.coli DH5α，筛选获得重组质粒，重组质粒经BamH I和Xho I双酶切后，能切下约750bp的目的带。将此质粒命名为p2FCBP-14-3-3ε，测序结果也表明重组完全正确。
(4) 稳定转染细胞的筛选
将重组质粒p2FCBP-14-3-3ε用GeneJammer(Stratagene #073003)转染试剂转染QGY7703。将在6孔板中对数生长期的QGY7703细胞原培养液弃去，换成900μl含10％FCS的培养液1640。按每孔用量计：6μl GeneJammer转染试剂加入到无血清的培养液1640中，室温孵育10min，加入2μg质粒(总体积为100μl)室温孵育10min，加入到培养孔里，37℃、5％CO2培养5-7h后，每孔加入1ml含10％FCS的培养液1640，继续培养2天。将每孔细胞传到10cm培养皿中，1-2天后，加入0.5μg/ml puromycin培养，每3天换液一次并添加0.5μg/ml嘌呤霉素(puromycin)，1-2周后获得稳定转染细胞。
(5)融合蛋白Western blot
收集2×107稳定转染细胞，加入2ml含20μl蛋白酶抑制剂的裂解液ProteaseInhibitor Cocktail(Sigma #P8340)，冰浴上超声破碎3min，4℃、12000×g离心25min，保留上清。为了验证转染细胞是否有效表达含TAP tag的融合蛋白，将细胞抽提液进行12％SDS-PAGE后，电转移到PVDF膜上，用FLAG Western检测试剂盒(Stratagene #200470)针对TAP tag上的FLAG标签进行Western blot检测，阳性结果表明表达的融合蛋白含有FLAG标签。
(6)蛋白复合物的TAP法分离
将5ml细胞抽提液加入40μl平衡过的Anti-FLAG M2 beads中，混匀，4℃摇动3h，1500×g离心5min，去上清，用1ml TBS洗2-3次。500μl TEV酶酶解缓冲液洗一次，加入含4μl 10U/μl TEV酶，室温摇动3h，4℃、1500×g离心5min，保留上清。上清转移到已平衡过的钙调素(CM)beads中，4℃摇动过夜，1500×g离心5min，去上清，用1ml CBB缓冲液洗2-3次，加入60μl 2×蛋白上样缓冲液、煮沸3min，1500×g离心5min，保留上清。将提取蛋白进行12％SDS-PAGE电泳及进行靶蛋白14-3-3ε的Western blot验证。蛋白混合物经过这两次特异亲和分离后，获得了较纯的蛋白复合物。用抗14-3-3ε的抗体(Santa Cruz SC-1020)对蛋白复合物PVDF转膜后免疫印迹证实，纯化的蛋白复合物中具有靶蛋白14-3-3ε。
(7) 蛋白的质谱鉴定
将SDS-PAGE电泳条带切割，用测序级trypsin进行酶解，提取肽段，进行MALDI-TOF/MS-MS质谱鉴定，用Mascot对SwissProt数据库进行搜索。通过MS-MS鉴定了14-3-3ε复合物中的组分有14-3-3β和角蛋白CK 1。
实施例3 将p2FCBP载体应用于鉴定靶蛋白14-3-3ε在MHCC97H细胞中的相互作用蛋白
步骤同实施例2，只是将插入14-3-3εcDNA的p2FCBP重组载体转入MHCC97H细胞进行融合蛋白表达。最终的蛋白质谱鉴定显示，14-3-3ε复合物中的组分有14-3-3β和角蛋白CK 1。
Claims (6)
1.一种哺乳细胞串联亲和纯化载体，其特征在于，在该载体多克隆位点上游含有Flag标签和钙调素结合肽序列，并且在Flag标签和钙调素结合肽序列之间有烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点。
2.一种如权利要求1所述的串联亲和纯化载体，其特征在于，在该载体多克隆位点上游的Flag标签由两个相同的八肽组成。
3.一种如权利要求1所述的串联亲和纯化载体，其特征在于，在该载体上有编码氨苄青霉素的筛选标记。
4.一种如权利要求1所述的串联亲和纯化载体，其特征在于，在该载体上有编码嘌呤霉素乙酰转移酶的筛选标记。
5.一种哺乳动物串联亲和纯化载体的制备方法，其特征在于，先用限制性内切酶HindIII和BamH I分别双酶切逆转录病毒载体和由Flag标签、钙调素结合肽序列及Flag标签与钙调素结合肽序列之间的烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点组成的TAP标签序列，然后将酶切过的逆转录病毒载体与TAP标签序列连接。
6.一种应用权利要求1所述的串联亲和纯化载体纯化蛋白复合物的方法，其特征在于，将权利要求1所述的载体用于蛋白分离纯化，纯化过程包括如下步骤：
(1)将克隆的目的基因与权利要求1所述的串联亲和纯化载体进行重组，获得重组质粒并稳定表达融合蛋白，制备细胞抽提物；
(2)用Flag单抗纯化细胞抽提物；
(3)用烟草蚀纹病毒蛋白酶处理(2)的产物；
(4)用钙调素多肽纯化(3)的产物。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101581727B (zh) * | 2008-05-13 | 2013-05-29 | 复旦大学 | 一种高效检测体内蛋白相互作用的方法 |
| CN104928312A (zh) * | 2014-03-21 | 2015-09-23 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | Gdf15受体下游信号因子的鉴定方法 |
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2005
- 2005-03-24 CN CN 200510024614 patent/CN1673378A/zh active Pending
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