CN104928312A - Gdf15受体下游信号因子的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及GDF15受体下游信号因子的鉴定方法。本发明人首次应用HSP90共转化的方式重组表达获得带有TAP标签的生长分化因子15胞外区,应用His标签进行蛋白纯化,FLAG标签和钙调素结合蛋白标签捕捉生长分化因子15以及与其相互作用的蛋白的复合体。该复合体可运用于对GDF15受体的下游信号因子进行鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程和分子生物学领域。更具体而言,本发明涉及GDF15受体下游信号因子的鉴定及应用。
背景技术
生长分化因子15(GDF15)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的一员,具有典型的TGF-β超家族蛋白结构特点。GDF15在胚胎的生长发育,细胞对压力信号的反应,炎症和组织损伤后修复的过程中均起着重要作用。TGF-β是一个多功能细胞因子,可以影响多种细胞的生长、分化及凋亡。在免疫系统中,TGF-β能够诱导Foxp3在CD4+CD25-T细胞中的表达,使细胞分化为iTreg。GDF15基因的GenBank登录号为:NM_004864.2,蛋白的GenBank登录号为:NP_004855.2。
GDF15在静态细胞中的表达量往往比较低,但是许多细胞压力信号都可以使GDF15的表达量突然提高,例如在炎症、病毒感染、急性组织损伤等情况下或在肿瘤恶化过程中。许多信号通路都与GDF15的表达、分泌及其在细胞基质中的储存的调节有关,并调节GDF15的功能。GDF15的表达受P53、Sp1、Sp3、Nkx-2、NF-κB、AP-1等多个转录因子的调控,P53对GDF15的调控作用与其在抑制肿瘤转移和促进凋亡方面密切相关。GDF15的启动子区具有两个P53的结合位点,其启动子激活具有显著的P53浓度依赖性和P53转录结合位点依赖性。在人卵巢癌和前列腺癌细胞中,GDF15作为P53的下游因子被诱导表达,可以降低癌细胞的转移。此外,许多其它转录因子也能诱导GDF15在一定类型的细胞中表达,例如在乳腺癌细胞中,Akt的激活能够上调GDF15的表达。在黑色素细胞中,紫外线照射能够明显上调GDF-15的mRNA水平,而在黑色素瘤细胞系中,通过激活MAPK和MITF也能够明显上调GDF-15的mRNA水平。
GDF15通过自分泌和旁分泌的作用发挥抗炎症反应、抑制生长、促进肿瘤细胞凋亡等功能。作为TGF-β超家族的一员,GDF15可通过依赖或非依赖Smad的方式传导信号,也可通过激活其它的信号元件来发挥功能,如PI3K/Akt、FAK-RhoA、Ras/MAPKs等。虽然GDF15的受体还没有被鉴定出来,但是作为TGF-β超家族的一员,在某些细胞中GDF15能够通过激活TGF-β的I型和II型受体及细胞内的Smad蛋白复合物来介导细胞的反应。Yi Sun等证明GDF15蛋白或转染的GDF15能够抑制前列腺癌细胞系的生长,该过程的信号通路与TGF-β的相似,GDF15能够对存在完整TGF-β信号通路的癌细胞系的生长起到抑制作用,但是不能对TGF-βI型和II型受体突变细胞或Smad4失活细胞起到抑制作用。GDF15在培养的新生儿心肌细胞中的表达能够通过激活Smad2/3的信号通路起到诱导抗心肌肥厚反应,通过过表达Smad6/7可以消除GDF15的此种作用。在肝癌细胞中,GDF15通过Akt及其下游信号通路的磷酸化来介导其功能。SK Batra等证明在前列腺癌细胞中,GDF15能够通过激活FAK-RhoA信号通路,介导肌动蛋白的调整,从而影响癌细胞的迁移。在乳腺癌细胞中,目前已知GDF15能够激活ErbB家族受体酪氨酸激酶,并能够通过反式激活ErbB2而激活Erk1/2和Akt,从而激活乳腺癌细胞的侵袭潜能。
综上所述,GDF15在多种癌症的发生发展过程发挥着重要的作用,在癌症发生发展的不同阶段均发挥着重要的作用,但由于其精确受体目前尚未鉴定,所以在分子机制上研究GDF15如何发挥其多样性功能至关重要,这将为基础分子免疫研究转化为临床研究,以及多种癌症如乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多种癌症的治疗提供新的药物靶点。此外,Treg细胞在癌症的发生发展及逃逸过程中均发挥着重要的功能,而TGF-β对调节性T细胞的分化及功能发挥有着重要的作用。
因此,了解作为TGF-β家族的GDF15蛋白对调节性T细胞作用将有利于进一步研究GDF15在不同的癌症发展过程通过调节免疫系统发挥的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供GDF15受体下游信号因子的鉴定及应用。
在本发明的第一方面,提供一种制备生长分化因子15(GDF15)胞外区的方法,所述方法包括:
(1)提供一表达构建物,其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件:His标签序列,FLAG标签序列,TEV蛋白酶体识别序列,钙调素结合蛋白(CBP)的基因序列,生长分化因子15胞外区序列;
(2)将步骤(1)的表达构建物与HSP90蛋白的表达构建物共转大肠杆菌(如Rosetta)细胞,表达获得带有TAP标签的生长分化因子15胞外区(较佳地,包括二聚体形式的结构)。
在一个优选例中,步骤(2)之后,还包括分离纯化所述带有TAP标签的生长分化因子15胞外区的步骤。
在本发明的另一方面,提供一种表达构建物,其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件:His标签序列,FLAG标签序列,TEV蛋白酶体识别序列、钙调素结合蛋白(CBP)的基因序列,生长分化因子15胞外区序列。
在一个优选例中,所述的表达构建物是表达载体。
在本发明的另一方面,提供所述的表达构建物的用途,用于表达带有TAP标签的生长分化因子15胞外区,捕获与生长分化因子15相互作用的蛋白。
在本发明的另一方面,提供一种捕获与生长分化因子15相互作用的蛋白的方法,所述方法包括:
(a)利用所述的表达构建物表达获得带有TAP标签的生长分化因子15胞外区;
(b)利用His标签,镍柱纯化获得纯化中间物1;
(c)利用Flag抗体,对步骤(b)的产物进一步纯化(如用Protein A/G beads纯化),获得纯化中间物2;
(d)利用TEV酶酶切纯化中间物2,获得纯化中间产物3;
(e)利用钙调素从中间产物3中捕捉获得终产物,该终产物包括与生长分化因子15相互作用的蛋白。
在一个优选例中,步骤(c)中,以附着有抗Flag抗体的Protein A/G的固相载体(较佳地为珠(beads))与Flag结合,进行纯化。
在一个优选例中,步骤(e)中,以附着有钙调素的固相载体(较佳地为珠(beads))与钙调素结合蛋白结合,进行捕捉。
在一个优选例中,步骤(e)后,还包括:
步骤(f):将捕捉出的复合物质谱鉴定,分析出与生长分化因子15相互作用的蛋白;和/或
步骤(g):通过抑制剂实验和/或基因沉默(knock down)实验确定与生长分化因子15相互作用的蛋白对于生长分化因子15信号通路的影响。
在本发明的另一方面,提供一种蛋白复合物,所述的复合物包括:生长分化因子15胞外区以及与之结合的下游蛋白,所述的下游蛋白包括:GNAI1,GNB1,DNM1,CAMKII,MERTK。
在本发明的另一方面,提供生长分化因子15(GDF15)胞外区的用途,用于体外诱导naive T细胞分化表达Foxp3为iTreg细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A-1C、体外纯化出带有亲和纯化标签的有活性的TAP-tag-exGDF15蛋白。
图1A、融合表达His标签、FLAG标签、TEV蛋白酶体识别序列、钙调素结合蛋白、人源GDF15蛋白胞外段的构建物结构示意图。
图1B、纯化得到TAP-tag-exGDF15的电泳鉴定。pET-GDF15(1)为共转化PGEX-Hsp90质粒后诱导表达,pET-GDF15(2)为单转化质粒表达结果。
图1C、将纯化的TAP-tag-exGDF15蛋白分别处理293T人胚肾细胞系,检测GDF15蛋白活性。
图2A-2B、体外纯化有活性的TAP-tag-exGDF15蛋白及其点突变失活的对照组蛋白。
图2A、重组表达及镍柱纯化得到TAP-tag-exGDF15及TAP-tag-exGDF15C273S。相同条件下得到野生型基因序列正确及突变型拥有一个氨基酸突变的TAP-tag-exGDF15蛋白。
图2B、利用纯化的野生型及突变型TAP-tag-exGDF15分别处理293T人胚肾细胞系,检测蛋白活性。
图3TAP-tag-exGDF15串联亲和纯化技术路线示意图。
图4、TAP-tag-exGDF15串联亲和纯化后,纯化出一系列蛋白。1.6×109293T人胚肾细胞系,分为两组,一组为野生型蛋白刺激(实验组8*108细胞),一组为突变型蛋白刺激(对照组8×108细胞),刺激前细胞做饥饿12h,刺激细胞5分钟后,收集细胞,1000rpm离心,弃上清,预冷PBS洗一遍,收集细胞沉淀,裂解细胞,12000rpm离心,收集细胞裂解液,串联亲合纯化细胞裂解上清(如图3所示技术路线),收集最终蛋白产物,聚丙烯凝胶电泳,进行银染,将实验组与对照组银染结果相比,取实验组中特异条带进行质谱检测。
图5A-5C、利用小分子抑制剂鉴定纯化出的GNB1,DNM1,CAMKII等蛋白存在于GDF15的信号通路上
图5A、可能存在于GDF15信号通路上的蛋白及其小分子抑制剂示意图。
图5B-C、细胞预处理(饥饿12h)后,先用适宜浓度的小分子刺激后,再做蛋白刺激,蛋白刺激条件同上所述。1.非刺激;2.单Anismycin刺激30min;3.单PMA刺激15min;4.单用野生型exGDF15刺激5min;5.KN-62(CaMK II抑制剂)刺激1h;6.KN-93(CaMK II抑制剂)刺激30min;7.GTP14564[Class IIIreceptor tyrosine kinase(RTK)抑制剂刺激2h;8.PF562271(FAK;RTKs抑制剂)刺激30min;9.PD98059(MEK特异性抑制剂)刺激1h;10.CP-724714(ErbB2抑制剂)刺激2h;11.Dynasore(Inhibits GTPase activity of Dynamin1/2)刺激30min;12.单用10ul DMSO作为对照(大多数抑制剂溶于DMSO);13.单用点突变体蛋白刺激5min;14.CCR2拮抗剂刺激30min;15.Gallein(阻滞Gβγ-依赖的细胞活性)刺激30min;16.TMB-8盐酸盐(胞内Ca2+拮抗剂)刺激1h;17.BIBX1382Dihydrochloride(高选择性EGFR-激酶抑制剂)刺激1h;18.Mitoxantrone(DNA合成抑制剂)。
图6、shRNA基因沉默实验证明GNAI1,GNBI,CAMKII,MERTK,DNM1存在于GDF15蛋白的下游信号通路上。
图6A、据质谱结果及小分子抑制剂实验结果,选取作为进一步研究GDF15信号通路复合物的目标蛋白GNAI1,GNBI,CAMKII,MERTK,DNM1,设计shRNA,plko.1-sh GNAI1,plko.1-sh GNB1,plko.1-sh CAMKII,plko.1-shMERTK,plko.1-sh DNM1,各shRNA转染至HEK293T细胞48h后收细胞用定量PCR检测各基因的表达。
图6B,6C、plko.1-sh GNAI1,plko.1-sh GNB1,plko.1-sh CAMKII,plko.1-shMERTK,plko.1-sh DNM1质粒转染HEK293T细胞36h后,细胞饥饿12h后,exGDF15蛋白刺激5min后,收集细胞裂解后,取上清跑胶免疫印迹检测p-Erk,Erk,p-Akt,Akt等的表达水平。结果显示GNAI1,GNB1,CAMKII,MERTK,DNM1基因沉默后exGDF15蛋白刺激不能激活Erk信号通路,对其他的例如p-38,p-Akt等没有特异影响。
图7、TAP-tag-exGDF15蛋白能够诱导iTreg的体外分化,CAMKII存在于TAP-tag-exGDF15诱导iTreg细胞分化的信号通路上。
图7A、取5×104个细胞加入圆底的96孔板中,加入100U/ml的IL-2,以CD3/CD28T细胞扩增珠和细胞1:1的比例诱导iTreg细胞的分化增殖,不同的孔分别加入野生型exGDF15蛋白及突变体exGDF15蛋白,5天后,收细胞,FACs检测Foxp3的表达。结果显示野生型exGDF15能够诱导iTreg的体外分化。
图7B、取5×104个细胞加入圆底的96孔板中,加入100U/ml的IL-2,以CD3/CD28T细胞扩增珠和细胞1:1的比例诱导iTreg细胞的分化增殖,不同的孔分别加入野生型exGDF15蛋白及突变体exGDF15蛋白,4天后,加入CAMKII的抑制剂KN93(终浓度40nM),5天后,收细胞,FACs检测Foxp3的表达。结果显示CAMKII存在于exGDF15诱导iTreg细胞分化的信号通路上。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究,首次应用HSP90共转化的方式重组表达获得带有TAP标签的生长分化因子15胞外区,应用His标签进行蛋白纯化,应用FLAG标签、钙调素琼脂糖珠捕捉生长分化因子15胞外区以及与其相互作用的蛋白的复合体。在此基础上完成了本发明。
在本发明的第一个方面中,提供了原核纯化有活性的exGDF15蛋白的方法,制备了可融合表达His标签、FLAG标签、TEV蛋白酶体识别序列、钙调素结合蛋白(CBP)标签的构建物。
由于GDF15蛋白活性形式是其胞外区形成的二聚体,而原核表达系统中缺乏氧化还原系统,故很难表达出有活性的蛋白。鉴于此,本发明人进行了深入的研究,克隆了GDF15基因的胞外区片段,通过共转化表达HSP90蛋白,得到有活性的exGDF15蛋白。Hsp90帮助exGDF15蛋白实现了正确折叠,得到有活性的蛋白。
在本发明的优选实施例中,为验证293T细胞中Erk的激活确实是由exGDF15蛋白刺激形成的,选择一个C273S突变型蛋白作为对照组刺激,排除其它可能因素,证实确实得到了有活性的带有TAP标签的exGDF15蛋白(TAPtag-exGDF15)。该方法也可用于其它蛋白的表达纯化。
在本发明的第二个方面中,提供了利用体外纯化蛋白捕捉其受体及信号通路复合体成员的方法技术。根据已有的TAP纯化技术,本发明人构建了配体激活的TAP-tag-exGDF15串联亲合纯化系统,用于捕捉GDF15受体及其通路的复合体成员。TAP有His标签、FLAG标签、TEV蛋白酶体识别序列、钙调素结合蛋白(CBP)组成。首先通过基于His标签的Ni柱纯化,获得活性蛋白。其次,通过两步纯化的方法,捕捉已知蛋白的受体及其信号通路复合物。所述的两步纯化包括:首先通过Flag标签与Flag抗体,Flag抗体与proteinA/G磁珠的结合,纯化出复合体;之后用TEV酶酶切过后,再利用CBP蛋白与Calmodulin珠的结合,捕捉出最终蛋白复合体,通过质谱鉴定,分析出蛋白复合体所包含的蛋白种类。
串联亲和纯化技术(Tandem Affinity Purification,TAP)可以快速研究生理条件下蛋白质相互作用、揭示蛋白质复合体相互作用。使用特别设计的纯化标签在非常接近于生理条件的情况下,捕捉出特定的蛋白质及其相互作用分子,并借助于质谱技术鉴别蛋白质的相互作用。
在本发明的第三方面中,提供了纯化出GDF15受体及复合体成员,通过以上两方面技术的运用,质谱分析出一系列蛋白。其中涉及GDF15信号通路的复合物包括:Guanine Nucleotide Binding Protein Alpha Inhibiting ActivityPolypeptide1(GNAI1),Guanine Nucleotide Binding Protein(G Protein)BetaPolypeptide1(GNB1),Dynamin1(DNM1),Calcium/Calmodulin-DependentProtein Kinase II Delta(CAMK2D),C-Mer Proto-Oncogene TyrosineKinase(MERTK)等等。虽然目前仍没有一条确切的信号通路,但是根据小分子抑制试验和基因沉默(knock down)实验,本发明人归结为两条可能的信号通路1、G protein-Dynamin-CAMKII信号通路,2、MERTK作为GDF15受体引发的一系列信号通路。此两条信号通路,可为进一步的GDF15诱导的信号通路的研究指明方向。
在本发明的第四个方面中,提供了GDF15蛋白对iTreg细胞的体外诱导分化的作用,exGDF15蛋白能够诱导细胞分化为表达Foxp3的iTreg细胞。exGDF15能够诱导iTreg的分化,CAMKII的小分子抑制剂KN93能够抑制该过程,进一步证明CAMKII存在于GDF15下游的信号通路上。
本发明的有益效果主要在于:
(1)提供了一种蛋白纯化新思路,有助于某些原核表达困难的蛋白质实现原核纯化,即通过共表达HSP90实现活性蛋白的纯化。
(2)提供了一种纯化蛋白受体及信号转导复合物的方法。
(2)本发明首次证明GNAI1,GNB1,CAMKII,MERTK,DNM1存在于GDF15的下游信号通路上。为GDF15的受体及其信号转导过程的分子机制研究指明了方向,也可为研究GDF15在不同的癌症发生发展过程中如何发挥其功能提供方向。
(3)本发明首次证明GDF15能够诱导iTreg细胞的体外分化,且该过程能够被CAMKII的小分子抑制剂KN93抑制。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
1、质粒和载体
克隆构建N端6*His-2*FLAG-TEV-CBP标签的exGDF15质粒。以pcDNA4/TO N-TAP(将N-TAP插入pcDNA4/TO质粒(购自Life Technologies)的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点中)质粒作为TEV-CBP标签的基因的模板,分别以引物TEV-CBP上游引物和TEV-CBP下游引物扩增得到TEV-CBP,插入pIPFLAG2(参考PCT/CN2011/077032)的BamHⅠ位点以及EcoRⅠ位点中,以该pIPFLAG2-TEV-CBP为模板,NheⅠ和XhoⅠ酶酶切得到FLAG2-TEV-CBP标签基因片段,插入到pET28a原核表达载体(Addgene)的NheⅠ位点及XhoⅠ位点中。
GDF15基因从人Hela细胞cDNA文库中扩增获得,设计如表1的引物。exGDF15是GDF15的胞外片段(即GDF15氨基酸序列的第197aa-308aa),从全长GDF15基因扩增获得,插入到带有6*His-2*FLAG-TEV-CBP标签的pET28质粒的EcoRⅠ/XhoⅠ位点。引物序列如表1。
表1
2、抗体
Erk和p-Erk抗体购自Cell Signaling Technology。Flag抗体(M2)购自Sigma公司。His抗体购自艾比玛特公司。HRP偶联的抗鼠二抗购自Promega公司。β-Tubulin购自天津三箭生物技术有限公司,HRP偶联的抗兔二抗购自Jackson公司。
3、细胞及其处理
人HEK293T(购自中国科学院细胞库(目录号:GNHu17))在含有10%FBS、100单位/毫升青链霉素的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’smedium)中,于37℃,5%CO2条件下培养。
4、免疫印迹
用RIPA缓冲液(20mM Tris/HCL pH7.5,150mM NaCl,1%NP-40,0.5%Na-DOC,1mM EDTA以及蛋白酶抑制剂1mM PMSF,1×Cocktail,磷酸酶抑制剂1mM Na3VO4,1mM NaF)裂解细胞。细胞裂解液中加入SDS上样缓冲液制成蛋白样品。蛋白质样品通过SDS-PAGE蛋白电泳后,转膜至硝酸素纤维膜,再用5%脱脂奶粉TBST中封闭一小时,加入一抗孵育一小时(磷酸化抗体4℃冰箱孵育过夜),再加入HRP偶联的二抗孵育一小时,用ECL底物曝光显色。
5、基因定点突变
利用表2记载的引物,通过突变PCR得到GDF15突变体C273S。
表2
6、蛋白质的表达及纯化
将携带2*FLAG-TEV-CBP标签的exGDF15和exGDF15C273S基因(GDF15发生C273S突变后分离获得的胞外区)分别插入pET28a原核表达载体的EcoRⅠ/XhoⅠ中后分别获得pET28a-2*FLAG-TEV-CBP-exGDF15及pET28a-2*FLAG-TEV-CBP-exGDF15C273S,随后与pGEX-Hsp90(将HSP90基因插入pGEX-4T2质粒(购自Snapgene)的BamH1和Xho1酶切位点中)转化Rosseta感受态细胞,37℃培养至OD600=0.6,加入IPTG使其终浓度为0.5mM、18℃诱导表达8h,收细胞,裂解,镍柱纯化(Qiagen公司,按操作说明书进行),获得纯化蛋白。最后用Brandford法测定所有蛋白浓度(上海碧云天生物技术有限公司)。
7、蛋白活性检测
将HEK293T细胞做饥饿12小时处理,用纯化的exGDF15蛋白及其突变体蛋白刺激细胞,1ug蛋白/106细胞在37℃条件下刺激5min,用4℃的PBS洗一遍,加入细胞裂解液裂解细胞,离心取上清,SDS胶鉴定p-Erk水平。
8、TAP纯化技术
将HEK293T细胞做饥饿12小时处理,用纯化的exGDF15蛋白及其突变体蛋白刺激细胞1ug蛋白/106细胞在37℃条件下刺激5min,用4℃的PBS洗一遍,加入裂解液(30mM Tris-HCl[pH7.4],120mM NaCl,2mM EDTA,2mMKCl,1%Triton X-100,1*COMPLETE protease-inhibitor cocktai protease抑制剂s(Roche),1mM PMSF,1mM NaF,1mM Na3VO4)。裂解细胞,离心,将上清与protein A/G beads(sc2003,santa cruz)和M2antibody(anti-Flag)4℃孵育12h。下一步用TEV酶切缓冲液(10ml Tris-HCl,pH8.0,150mM NaCl,0.1%NP40,0.5mM EDTA and1mM DTT),重悬离心得到的protein A/G agarose,并使用TEV蛋白酶(大肠杆菌中表达通过镍柱纯化得到)4℃酶切过夜,收集上清。至此得到第一步亲和纯化复合物,之后进行第二步亲和纯化。将上步得到的上清与CaM结合缓冲液(10mM Tri-HCl,150mM NaCl,0.1%NP40,1mM MgAcetate,1mM Imidazol,2mM CaCL2和1mM2-Mercaptoethanol)和钙调蛋白珠(214303,Stratagene)混匀4℃孵育一小时。最后,通过钙调蛋白洗脱液(10mM Tri-HCl,150mM NaCl,0.1%NP40,1mM Mg Acetate,1mM Imidazol,2mM EGTA和1mM2-Mercaptoethanol)洗脱exGDF15复合物。将此复合物通过TCA沉淀后,SDS蛋白胶跑胶鉴定,银染后送测质谱。
实施例1、体外纯化出带有亲和纯化标签的有活性的TAP-tag-exGDF15蛋白
通过基因克隆构建带有6*His-2*FLAG-TEV-CBP标签的exGDF15质粒(如图1A结构图所示),获得pET28a-2*FLAG-TEV-CBP-exGDF15质粒(含6*His)。
将该质粒单转化或与pGEX-Hsp90共转化大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞,37℃培养至OD600=0.6,加入IPTG使其终浓度为0.5mM、18℃诱导表达8h,收细胞,裂解,镍柱纯化(Qiagen公司按操作说明书进行),获得纯化蛋白TAP-tag-exGDF15。结果显示纯化后的TAP-tag-exGDF15蛋白以单体及二聚体形式存在(图1B)。
将纯化的蛋白做活性检测,将纯化的TAP-tag-exGDF15蛋白分别处理293T人胚肾细胞系,刺激前细胞做饥饿12h,1ug蛋白/106细胞,分别在刺激0,5min,10min,30min,1h后收集细胞,裂解细胞,取上清跑胶,免疫印迹检测内源性总ERK及磷酸化ERK水平,检测其活性。结果显示,只有共表达HSP90时,才能纯化出有活性的TAP-tag-exGDF15蛋白(图1C)。
以上结果表明,可通过与pGEX-Hsp90质粒共转化表达,原核纯化出有活性的TAP-tag-exGDF15蛋白。
实施例2、体外纯化C273S点突变失活的TAP-tag-exGDF15蛋白
构建C273S突变体TAP-tag-exGDF15质粒(pET28a-2*FLAG-TEV-CBP-exGDF15C273S),将该质粒与pGEX-Hsp90共转化Rosseta感受态细胞,37℃培养至OD600=0.6,加入IPTG使其终浓度为0.5mM、18℃诱导表达8h,收细胞,裂解,镍柱纯化(Qiagen公司,按操作说明书进行),获得纯化蛋白,可作为正确蛋白活性的对照组(图2A)。
将纯化的实验组蛋白(序列正确蛋白)与对照组蛋白(点突变蛋白)分别处理293T人胚肾细胞系,刺激前细胞做饥饿12h,1ug蛋白/106细胞,分别在刺激0,5min,10min,15min,30min后收集细胞,裂解细胞,取上清跑胶,免疫印迹检测内源性总ERK及磷酸化ERK水平,检测其活性(图2B)。
结果显示,只有基因序列正确的纯化的蛋白才具有活性。该结果也表明,突变体蛋白可作为较好的对照组蛋白。
实施例3、TAP-tag-exGDF15蛋白串联亲和纯化后得到的信号通路复合物
利用纯化的实验组蛋白(序列正确蛋白)与对照组蛋白(点突变蛋白)在293T细胞中同样条件下做串联亲和纯化(图3)。
将HEK293T细胞做饥饿12小时处理,用纯化的TAP-tag-exGDF15蛋白及其突变体蛋白刺激细胞1ug蛋白/106细胞,在37℃条件下刺激5min,用4℃的PBS洗一遍,加入裂解液(30mM Tris-HCl[pH7.4],120mM NaCl,2mMEDTA,2mM KCl,1%Triton X-100,1*COMPLETE protease-inhibitor cocktaiprotease抑制剂s(Roche),1mM PMSF,1mM NaF,1mM Na3VO4)。裂解细胞。离心,将上清与protein A/G beads(sc2003,santa cruz)和M2antibody(anti-Flag)4℃孵育12h。下一步用TEV酶切缓冲液(10ml Tris-HCl,pH8.0,150mM NaCl,0.1%NP40,0.5mM EDTA和1mM DTT),重悬离心得到的protein A/Gagarose,并使用TEV蛋白酶(大肠杆菌中表达通过镍柱纯化得到)4℃酶切过夜,收集上清。至此得到第一步亲和纯化复合物,之后进行第二步亲和纯化。将上步得到的上清与CaM结合缓冲液(10mM Tri-HCl,150mM NaCl,0.1%NP40,1mM Mg Acetate,1mM Imidazol,2mM CaCl2和1mM2-Mercaptoethanol)和钙调蛋白珠(214303,Stratagene)混匀4℃孵育1小时。最后,通过钙调蛋白洗脱液(10mM Tri-HCl,150mM NaCl,0.1%NP40,1mM Mg Acetate,1mMImidazol,2mM EGTA和1mM2-Mercaptoethanol)洗脱GDF15复合物。将此复合物通过TCA沉淀后,SDS蛋白胶跑胶鉴定出对照组蛋白特异条带,切割下后送质谱鉴定(图4)。
根据质谱鉴定出的一系列蛋白(表3),选取排列靠前的几种蛋白,用于下一步的鉴定。
表3
实施例4、筛选涉及GDF15信号通路的具体复合物
本实施例的目标是筛选到涉及GDF15信号通路的具体复合物,通过小分子抑制剂及基因沉默实验,确定存在于GDF15信号通路上的蛋白,明确GDF15信号通路。且证明GDF15能够诱导iTreg细胞的体外分化,CAMK II存在GDF15诱导iTreg细胞分化的信号通路上。
1、小分子抑制剂实验
小分子化合物(购自“发育与生殖研究”小分子化合物中心)包括:
KN-62(CaMK II抑制剂,刺激1h),
KN-93(CaMK II抑制剂,刺激30min),
GTP14564[Class III受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂,刺激2h],
PF562271(FAK;RTKs抑制剂,刺激30min),
PD98059(MEK特异性抑制剂,刺激1h),
CP-724714(ErbB2抑制剂,刺激2h),
Dynasore(Inhibits GTPase activity of Dynamin1/2,刺激30min),
CCR2Antagonist(刺激30min),
Gallein(阻滞Gβγ-依赖的细胞活性,刺激30min),
TMB-8hydrochloride(胞内Ca2+拮抗剂;抑制钙调蛋白-敏感的Ca2+-ATPase活性;蛋白激酶C抑制剂,刺激1h),
BIBX1382dihydrochloride(高选择性EGFR-激酶抑制剂,刺激1h),
Mitoxantrone(DNA合成抑制剂;当添加该抑制剂,多数细胞死亡),
293T细胞饥饿12小时后,分别加小分子抑制剂(终浓度50nM)刺激相应时间,之后用纯化的蛋白刺激五分钟之后收样,SDS-PAGE胶鉴定。
2、抗体
EGFR、p-EGFR、p-p38、Erk和p-Erk抗体购自Cell Signaling Technology。P38、p-Akt购自Santa Cruz。HRP联的抗鼠二抗购自Promega公司。β-Tubulin购自天津三箭生物技术有限公司,HRP偶联的抗兔二抗购自Jackson公司。CD4、CD25及CD45RA抗体购自Biolegend公司。
3、细胞及其处理
人HEK293T(购自中国科学院细胞库(目录号:GNHu17))在含有10%FBS、100单位/毫升青链霉素的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)中,于37℃,5%CO2条件下培养。
细胞转染:利用PEI(Polyscience)转染(按操作说明书进行),转染48小时后收样分析。
shCK引物序列设计如表4。
表4
shGNAI1,shGNB1,shDNM1,shCAMK2D,shMERTK引物序列设计如表5。
表5
将合成好的shRNA引物1和2序列退火构成双链后连入shRNA慢病毒表达载体pLKO.1(购自Addgene公司),分别获得plko.1-sh GNAI1,plko.1-shGNB1,plko.1-sh CAMK2,plko.1-sh MERTK,plko.1-sh DNM1质粒。质粒用PEI转染HEK293T细胞36h后,细胞饥饿12h在用exGDF15蛋白刺激。
4.免疫印迹
用RIPA缓冲液(20mM Tris/HCL pH7.5,150mM NaCl,1%NP-40,0.5%Na-DOC,1mM EDTA以及蛋白酶抑制剂1mM PMSF,1×Cocktail,磷酸酶抑制剂1mM Na3VO4,1mM NaF)裂解细胞。细胞裂解液中加入SDS上样缓冲液制成蛋白样品。蛋白质样品通过SDS-PAGE蛋白电泳后,转膜至硝酸素纤维膜,再用5%脱脂奶粉TBST中封闭一小时,加入一抗孵育1小时(磷酸化抗体4℃冰箱孵育过夜),再加入HRP偶联的二抗孵育1小时,用ECL底物曝光显色。
6.原代细胞分选及调节性T细胞诱导检测实验
分别从人外周血单核细胞(购自上海市血液中心)中,将PBMC同时染上CD4、CD25及CD45RA抗体,然后在FACSAriaII细胞分选仪上分选出CD4+CD25lowCD45RAhigh 细胞群。分选出的细胞在体外使用含有1%GlutaMax(GIBCO)、1%NaPyr(GIBCO)、1%GlutaMAXTM(GIBCO)、1%Pen Strep(invitrogen)的X-VIVO(Lonza)培养基中培养。诱导过程中需要CD3/CD28T细胞扩增珠的存在(Dynabeads;Invitrogen;目录号:111-41D),扩增珠与细胞的比例为1:1。扩增细胞的iTreg表型通过检测FOXP3的表达水平加以鉴定。如前所述,取5×104个细胞加入圆底的96孔板中,加入100U/ml的IL-2,以CD3/CD28T细胞扩增珠和细胞1:1的比例诱导iTreg细胞的分化增殖,不同的孔分别加入IL2、IL2和TGF-β、IL2和野生型exGDF15蛋白、IL2和突变体exGDF15蛋白,5天后,收细胞,FACs检测Foxp3的表达。
原代细胞的小分子抑制试验:取5×104个细胞加入圆底的96孔板中,加入100U/ml的IL-2,以CD3/CD28T细胞扩增珠和细胞1:1的比例诱导iTreg细胞的分化增殖,不同的孔分别加入IL2和野生型exGDF15蛋白、IL2和突变体exGDF15蛋白,四天后,加入CAMKII抑制剂KN93(终浓度40nM),5天后,收细胞,FACs检测Foxp3的表达。
实施例5、通过小分子抑制剂实验确定存在于GDF15信号通路上的复合物包括GNB1,DNM1,MERTK
根据质谱分子结果及其他报告,选取KN-62,KN-93,GTP14564,PF562271,PD98059,CP-724714,Dynasore,CCR2Antagonist,Gallein,TMB-8hydrochloride,BIBX1382dihydrochloride,Mitoxantrone小分子抑制剂,这些小分子抑制剂的作用机制示意图如图5A。
HEK293T细胞,饥饿12小时后,首先用不同的小分子抑制剂刺激,(同材料与方法描述),之后用纯化的带标签的exGDF15蛋白37℃条件下刺激5min(1ug/106细胞),不刺激和用对照组的突变体蛋白刺激作为负对照,PMA(Santa cruz SC3576)刺激细胞十五分钟和Anismycin(enzo)刺激细胞30分钟作为正对照,收集细胞后,免疫印记检测细胞内p-Erk、Erk、p-EGFR、EGFR、p-p38、p-38、p-Akt和Akt的蛋白水平(图5B和图5C)。
结果显示,exGDF15蛋白刺激后主要特异性激活Erk信号通路,这些小分子化合物除去Mitoxantrone会直接导致细胞死亡不能检测到Erk信号通路的变化外,其它小分子化合物均能在不同程度上抑制GDF15诱导的Erk的激活。
在抑制CaMK II、RTKs、CCR2、MEK时,可完全抑制exGDF15蛋白引发的Erk的磷酸化;在抑制Gβγ、ErbB2、CaMK II、RTK、CCR2的作用下,可抑制GDF15诱导的p-EGFR(Y1068)的磷酸化。
综上所述,除去已被发现的信号通路,GDF15涉及的信号通路还包括Gprotein-Dynamin-CAMKII和MERTK两条信号通路。
实施例6、通过基因敲除实验确定存在于GDF15信号通路上的复合物包括GNAI1,GNB1,DNM1,CAMK2,MERTK
plko.1-sh GNAI1,plko.1-sh GNB1,plko.1-sh CAMK2,plko.1-sh MERTK,plko.1-sh DNM1质粒PEI转染HEK293T细胞24h后,将细胞分至六孔板中,12h后,细胞饥饿12h,取一部分细胞抽取RNA,RTPCR检测基因沉默效率(如图6A所示),其余细胞exGDF15蛋白刺激5min,收集细胞裂解后,取上清跑胶免疫印迹检测p-Erk,Erk,p-Akt,Akt等的表达水平(如图6B,6C所示)。
结果显示,GNAI1,GNB1,CAMK2,MERTK,DNM1基因沉默后exGDF15蛋白刺激不能激活Erk及其上游的MEK信号,说明GNAI1,GNB1,CAMK2,MERTK,DNM1存在于GDF15的下游信号通路。
实施例7、GDF15能够诱导iTreg的体外分化,且该过程依赖CAMKII
分别从人外周血单核细胞(购自上海市血液中心)中,将PBMC同时染上CD4、CD25及CD45RA抗体,然后在FACSAriaII细胞分选仪上分选出CD4+CD25lowCD45RAhigh的细胞群。取5×104个细胞加入圆底的96孔板中,每孔加入100U/ml的IL-2,以CD3/CD28T细胞扩增珠和细胞1:1的比例诱导iTreg细胞的分化增殖,不同的孔分别加入IL2、IL2和TGF-β、IL2和野生型exGDF15蛋白、IL2和突变体exGDF15蛋白,5天后,收细胞,FACs检测Foxp3的表达(图7A)。
原代细胞的小分子抑制试验:取5×104个细胞加入圆底的96孔板中,加入100U/ml的IL-2,以CD3/CD28T细胞扩增珠和细胞1:1的比例诱导iTreg细胞的分化增殖,同时做IL2、IL2和野生型GDF15蛋白、IL2和突变体GDF15蛋白,5天后收样,令不同的孔分别加入IL2和野生型exGDF15蛋白、IL2和突变体exGDF15蛋白,四天后,加入CAMK2的抑制剂KN93(终浓度40nM),5天后,收细胞,FACs检测Foxp3的表达(图7B)。
结果显示,GDF15蛋白能够诱导iTreg细胞的体外分化,CAMKII的小分子抑制剂KN93能够一定程度上抑制该过程。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种制备生长分化因子15胞外区的方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)提供一表达构建物,其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件:His标签序列,FLAG标签序列,TEV蛋白酶体识别序列,钙调素结合蛋白的基因序列,生长分化因子15胞外区序列;
(2)将步骤(1)的表达构建物与HSP90蛋白的表达构建物共转大肠杆菌细胞,表达获得带有TAP标签的生长分化因子15胞外区。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)之后,还包括分离纯化所述带有TAP标签的生长分化因子15胞外区的步骤。
3.一种表达构建物,其特征在于,其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件:His标签序列,FLAG标签序列,TEV蛋白酶体识别序列、钙调素结合蛋白的基因序列,生长分化因子15胞外区序列。
4.权利要求3所述的表达构建物的用途,其特征在于,用于表达带有TAP标签的生长分化因子15胞外区,捕获与生长分化因子15相互作用的蛋白。
5.一种捕获与生长分化因子15相互作用的蛋白的方法,其特征在于,所述方法包括:
(a)利用权利要求3的表达构建物表达获得带有TAP标签的生长分化因子15胞外区;
(b)利用His标签,镍柱纯化获得纯化中间物1;
(c)利用Flag抗体,对步骤(b)的产物进一步纯化,获得纯化中间物2;
(d)利用TEV酶酶切纯化中间物2,获得纯化中间产物3;
(e)利用钙调素从中间产物3中捕捉获得终产物,该终产物包括与生长分化因子15相互作用的蛋白。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(c)中,以附着有抗Flag抗体的Protein A/G的固相载体与Flag结合,进行纯化。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(e)中,以附着有钙调素的固相载体与钙调素结合蛋白结合,进行捕捉。
8.如权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(e)后,还包括:
步骤(f):将捕捉出的复合物质谱鉴定,分析出与生长分化因子15相互作用的蛋白;和/或
步骤(g):通过抑制剂实验和/或基因沉默实验确定与生长分化因子15相互作用的蛋白对于生长分化因子15信号通路的影响。
9.一种蛋白复合物,其特征在于,所述的复合物包括:生长分化因子15胞外区以及与之结合的下游蛋白,所述的下游蛋白包括:GNAI1,GNB1,DNM1,CAMKII,MERTK。
10.生长分化因子15胞外区的用途,其特征在于,用于体外诱导naive T细胞分化为表达Foxp3的iTreg细胞。
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