JP3516146B2 - 核酸の高密度固定化 - Google Patents
核酸の高密度固定化Info
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Description
て、核酸ハイブリダイゼーションは特定のオリゴヌクレ
オチド配列を検出、分離及び分析するための強力なツー
ルとなりつつある。通常、前記ハイブリダイゼーション
アッセイは、例えば逆ドットブロット法(Saiki,R.K.,W
alsh,P.S.,Levenson,C.H.及びErlich,H.A.,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,86,6231(1989))の場合のように固体支
持体上に固定化したオリゴデオキシヌクレオチドプロー
ブを使用する。より最近、固体表面に結合させた固定化
DNAプローブのアレーがハイブリダイゼーションによる
配列決定(SBH)のために開発された(Drmanac,R.,Laba
t,I.,Brukner,I.及びCrkvenjakov,R.,Genomics,4,114
−128(1989);Strezoska,Z.,Pauneska,T.,Radosavljev
ic,D.,Labat,I.,Drmanac,R.及びCrkvenjakov,R.,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,88,10089−10093(1991))。SBHは
固定支持体上の固定化オリゴヌクレオチドの規則アレー
を使用する。未知DNAのサンプルをアレーに適用し、ハ
イブリダイゼーションパターンを観察し分析して、配列
情報の多くの短ビットを同時に作成する。一本鎖3'−オ
ーバーハングを含む二重らせんプローブを用いるポジシ
ョナルSBH(PBSH)と称されるSBHの改良型が開発された
(Broude,N.E.,Sano,T.,Smith,C.L.及びCantor,C.R.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,91,3072−3076(1994))。PBSH
捕捉法を従来のサンガー配列決定法と組み合わせて、例
えばゲル電気泳動により検出可能な配列決定用ラダーを
作成することが可能である(Fu,D.,Broude,N.E.,Kste
r,H.,Smith,C.L.及びCantor.C.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,92,10162−10166(1995))。
な性能のために満たさなければならない基準が多数あ
る。例えば、固定化DNAは安定でなければならず、ハイ
ブリダイゼーション、線状または分析中に脱離してはな
らない。固定化オリゴデオキシヌクレオチドの密度は確
実な分析のために高くなければならない。DNAの表面へ
の非特異的結合は最小でなければならない。加えて、固
定化方法は、固定化プローブのハイブリダイズ能力及び
酵素固相合成のためのサブストレートである能力を妨げ
てはならない。多くの用途に対して、DNAの1点のみ、
理想的には末端が固定化されるのが最良である。
に対するDNAの共有固定化方法が開発されている。例え
ば、適切に修飾したDNAを、アミノ酸(Running,J.A.及
びUrdea,M.S.,Biotechniques,8,276−277(1990);New
ton,C.R.ら,Nucl.Acids.Res.,21,1155−1162(1993);N
ikiforov,T.T.及びRogers,Y.H.,Anal.Biochem.,227,201
−209(1995))、カルボキシル基(Zhang,Y.ら,Nucl.a
cids.Res.,19,3929−3933(1991))、エポキシ基(Lam
ture,J.B.ら,Nucl.Acids.Res.,22,2121−2125(1994);
Eggers,M.D.ら,BioTechniques,17,516−524(199
4))、またはアミノ基(Rasmussen,S.R.ら,Anal.Bioch
em.,198,138−142(1991))官能化された平担な表面に
共有結合させた。これらの方法の多くはそれぞれの用途
でかなり成功を収めたが、結合したオリゴヌクレオチド
の密度(DNAは表面1mm2あたり最高約20fmol)(Lamtur
e,J.B.ら,Nucl.Acids.Res.,22,2121−2125(1994);Egg
ers,M.D.ら,BioTechniques,17,516−542(1994))はDN
Aの理論充填限界よりはるかに低い。
法が必要とされている。特に、固定化核酸の使用、取り
扱い及び更なる反応を可能にする表面固定化核酸の高密
度化を達成する方法が必要とされている。
定化方法の改良の必要性に関連して、生物学的サンプル
の試験及び分析を自動化し迅速に処理する精巧なラボラ
トリーツールの開発が要求されている。より最近では、
複雑な生化学構造の分析を迅速に処理するためにより精
巧な分析ツールを開発することが試みられている。この
ことは、24染色体上に少なくとも約10万個の遺伝子を含
むヒトゲノムDNAの場合に特に当てはまる。各遺伝子
は、生きた細胞内で特定の生化学的機能を果たす特定タ
ンパク質をコードする。DNA配列の変化は突然変異とし
て知られており、生化学的活性が変化するかまたは場合
により該活性を無くしたタンパク質が生じ得る。また、
これにより遺伝病が引き起こされ得る。3000以上の遺伝
病が現在公知である。特定DNA配列があるとヒトは多数
の遺伝病、例えば糖尿病、アテローム性動脈硬化症、肥
満症、幾つかの自己免疫疾患及びガンに罹りやすいとい
う証拠は多数ある。従って、DNA分析は、困難であるが
多くの生命を脅かす病気の治療に根本的な情報が得られ
る重要な研究である。
NAがコーディング配列及び非コーディング配列(例え
ば、エクソン及びイントロン)の両方を含んでいるため
に特に厄介である。そのような分析において、化学構造
を分析するための従来の方法、例えば分析用サンプルを
作成するためにソース材料を手動でピペッティングする
方法は有用でない。必要な分析の規模を広げるために、
科学者らはDNA診断用の並行処理プロトコルを開発し
た。
るピンツールデバシスをその近位端部に有するロボット
アームを用いることにより手動によるピペッティング及
びスポッティングの必要性を解消したロボットデバイス
を開発した。マトリックスの各ピンは、各ピンが微量滴
定プレートのウェル内に浸漬され得るように相互に離れ
ている。ロボットアームにより複数のピンは微量滴定プ
レートの複数のウェルに浸漬され、それにより各ピン要
素はサンプル材料で濡れる。次いで、ロボットアームに
よりピンツールデバイスを標的表面の上の位置に移動
し、ピンツールをピンが標的に接触する表面まで下げて
表面上にスポットのマトリックスを形成する。従って、
ピンツールを用いると、サンプル材料を並行に分配する
ことによりサンプルを迅速に作成することができる。
成するべくうまく働くが、幾つかの欠点を有する。スポ
ッティング操作中、ピンツールはサブストレート表面に
実際接触する。小サイズのスポットを標的上にプリント
するために各ピンが細い先端を必要とすると仮定する
と、ピンツールが標的表面に連続的に接触するとピンツ
ールの細かい繊細な先端が磨耗し変形するであろう。こ
うすると、精度及び生産性を減らす誤差が生ずる。
ストレート表面に化学的に結合する方法である。1つの
特定方法では、DNAをサブストレート表面上でその場で
合成して空間的に離れた多種多様の化学生成物の組を生
成する。前記方法は本質的に、固相化学、光不安定性保
護基及び光活性化リソグラフィーを組み合わせたフォト
リソグラフィである。このシステムはサンプル材料のア
レーを首尾よく作成するが、化学的に強く、時間がかか
り且つ高価である。
配されるサンプル材料の容量を十分にコントロールでき
ないという別の問題がある。従って、上記した方法では
うまく調整され且つ正確に再現されるサンプル容量を有
するアンプルアレーを作成することができないのでエラ
ーが生ずる恐れがある。この問題を回避する1つの試み
はしばしば十分量の試薬材料を分配する作成方法であ
る。この方法によれば十分なサンプル容量を確保できる
が、サンプル材料が無駄となり、このため高価であり利
用が制限されることが多い。
ンプルを分析するための精巧な診断方法の要望に直面す
る。このために、科学者らはDNAのような材料を同定す
るために幾つかの方法を使用する。例えば、同定すべき
核酸に相補的なプローブを用いるハイブリダイゼーショ
ンにより核酸配列を同定することができる。通常、核酸
断片を、放射性、蛍光または化学発光であり得る感受性
リポータ機能物質で標識する。これらの方法は成功する
が、幾つかの欠点を有する。放射性標識は危険であり、
生じた信号は経時的に減衰する。非放射性(例えば、蛍
光)標識の感度は低く、高強度レーザーを同定過程で使
用したときに信号が減衰する。加えて、標識化は労力及
び時間がかかり、エラーが生じがちである。結果とし
て、生化学的サンプル材料のアレーを作成し分析する方
法は複雑であり、エラーを生じがちである。従って、生
化学的サンプル材料のアレーを作成し、分析する方法は
複雑であり、エラーを生じやすい。
するための改良システム及び方法を提供する。本発明の
更なる目的は、サンプルアレーを迅速に作成し得るシス
テムを提供することである。本発明の更なる目的は、高
密度の核酸分子が結合される支持体を提供することであ
る。
化する方法は、修飾表面もしくは修飾核酸の遊離チオー
ル基を適切な条件で他方の成分(表面もしくは核酸)の
チオール反応性官能基と反応させることに基づく。この
反応は直接であってもまたは二官能性架橋剤を用いて行
ってもよい。好ましい実施態様では、修飾核酸がチオー
ル基を含み、架橋剤がヨードアセチル基を含む。
をも提供する。ビーズは必ずしも球形でなくてもよく、
固体支持体の表面積を大きくする及び/または核酸また
は他方の分子の結合のための別の表面を提供するために
固体支持体に結合させた粒子を指す。ビーズは好ましく
は約1μm〜100μmの大きさを有する。固体支持体に
結合し、更に少なくとも1つの分子、特に核酸に結合し
たビーズを少なくとも1個含む組成物も提供する。ビー
ズは当業界で公知の適当なマトリックス材料から形成さ
れ、この材料には膨潤可能なものも膨潤不能なものも含
まれる。固体支持体は、化学合成及び分析において固体
マトリックスとして使用される当業界で公知の任意の支
持体である。例えば、核酸を本明細書に記載のように硫
黄原子を介してビーズに結合させる。特定実施態様で
は、ビーズを表面上のウェルまたはピット内の固体支持
体に結合するか、またはビーズを支持体上にアレーの形
態で配列してもよい。
としての役割をする材料から選択される材料から調製さ
れる。前記材料の非限定例には、シリカゲル、ガラス、
磁性材料、ポリスチレン/1%ジビニルベンゼン樹脂、例
えばFmoc−アミノ酸−4−(ヒドロキシメチル)フェノ
キシメチルコポリ(スチレン−1%ジビニルベンゼン
(DVB))樹脂、クロロトリチル(2−クロロトリチル
クロリドコポリスチレン−DVB樹脂)樹脂、メリフィー
ルド(クロロメチル化コポリスチレン−DVB樹脂)樹脂
のようなWang樹脂、金属、プラスチック、セルロース、
例えばセファデックス(Pharmacia)の商品名で市販さ
れているように架橋デキストラン、セファロース(Phar
macia)の商品名で市販されている水素結合した多糖類
型アガロースゲルのようなアガロースゲル、並びに当業
界で公知の他の樹脂及び固相支持体が含まれる。好まし
い実施態様では、ビーズは直径約0.1〜500μm、より好
ましくは約1〜100μmの大きさを有する。
ズ、毛細管、プレート、膜、ウェハ、コム、ピン、ピッ
ト付きウェハ、ピットまたはナノリッタウェルを有する
アレー、並びに当業界で公知の他の形状寸法または形態
が含まれる。
トも提供される。1つの実施態様では、キットは適切な
量のi)チオール反応性架橋剤及びii)前記チオール反
応性架橋剤と反応し得る官能基を有する表面を修飾する
ための表面修飾剤を含む。前記キットは任意に核酸の固
定化に使用するための不溶性支持体、例えば固体表面、
磁性マイクロビーズまたはシリコンウェハを含む。前記
キットは任意に適当な緩衝液または使用指示書をも含
む。
を使用すると、従来の方法に比して少なくとも12.5倍高
い固定化が達成される。従って、上記方法は質量分析用
核酸ランチングパッドを作成するために特に有用であ
る。
(化学的及び酵素的)核酸合成、ハイブリダイゼーショ
ン及び/またはエクステンション等の各種固相核酸化学
分野、並びに核酸検出及び多形性分析に基づく診断方法
(例えば、米国特許第5,605,798号)で使用され得る。
従って、本発明は更に、核酸分子のチオール含有誘導体
をチオール反応性基含有不溶性支持体と反応させるかま
たはチオール含有不溶性支持体を核酸分子のチオール反
応性基含有誘導体と反応させ、次いで更に固定化核酸分
子を反応させることにより核酸分子を表面上に固定化す
る核酸分子を反応させる方法を提供する。
定化核酸を更に、該固定化核酸またはその一部に相補的
な核酸とハイブリダイズすることにより反応させる。前
記ハイブリダイゼーション反応は、サンプル中の特定核
酸の存在を検出するために使用され得る。これは、病気
の診断に使用され得る、サンプル(特に生物学的サンプ
ル)中の病原体の検出の際に特に有用である。
法をも提供し、この方法では本発明の方法を用いて表面
に固定化した標的核酸に相補的なチオール含有核酸及び
サンプルを、サンプル中の標的核酸が固定化核酸にハイ
ブリダイズするような条件下で表面と接触させる。ハイ
ブリダイズした標的核酸は、各種方法を用いて検出され
得るが、好ましい方法は質量分析法である。本発明では
更に、標的核酸のヌクレオチド配列の改変(例えば、欠
失、挿入及び変換)を検出する方法をも提供する。上記
した方法では、ハイブリダイズした標的核酸の質量分析
法で測定した分子量を標的核酸配列の分子量予測値と比
較する。分子量測定値の分子量予測値からの偏差が標的
核酸のヌクレオチド配列中の改変を示す。
は、標的核酸をチオール反応性基を含む表面に固定化す
る。この方法では、固定化前に、オリゴヌクレオチドプ
ライマーが3'−または5'−ジスルフィド結合を含む反応
で標的核酸を増幅させ、生じた産物を還元して、チオー
ル含有核酸を生成する。チオール含有核酸をチオール反
応性基を含む表面に固定化し、固定化核酸またはその一
部に相補的な一本鎖核酸と接触させる。一本鎖核酸のハ
イブリダイゼーションは各種方法により検出され得る。
例えば、一本鎖核酸を容易に検出し得る放射性もしくは
化学発光標識で標識化することができる。好ましい実施
態様では、一本鎖核酸は質量分析法により検出される。
酸を更に、該固定化核酸またはその一部にハイブリダイ
ズした核酸をエクステンション(延長)させることによ
り反応させる。エクステンション反応は、例えば本発明
の方法を用いて不溶性支持体に固定化したDNA分子を配
列決定する方法において使用され得る。従って、本発明
はサブストレート上のDNA分子の配列を決定する方法を
も提供し、この方法ではDNA分子のチオール含有誘導体
をチオール反応性基を含む不溶性支持体の表面上に固定
化し、固定化DNA分子の一部に相補的な一本鎖核酸とハ
イブリダイズさせ、その後1つ以上のジデオキシヌクレ
オチドの存在下でDNA合成を実施する。
る核酸プライマーのエクステンションは、標的核酸のヌ
クレオチド配列の改変(例えば、欠失、挿入または変
換)を検出する際にも使用され得る。従って、本発明は
標的核酸配列中の改変を検出する方法を提供し、この方
法では本発明の固体支持体に固定化したチオール含有標
的核酸に一本鎖核酸をハイブリダイズし、ハイブリダイ
ズした一本鎖核酸を分子の3'末端にヌクレオチドを付加
することにより延長する。エクステンション産物は例え
ば質量分析により特徴付けられ、その特徴が固定化標的
核酸に相補的な配列の予想される特徴と異なるかどうか
を調べる。例えば質量分析で測定したエクステンション
産物の分子量を標的核酸に相補的な核酸の分子量予測値
と比較する。分子量予測値との偏差が標的核酸の配列の
改変を示す。
実施態様では、チオール反応性表面に固定化する前に、
標的分子をオリゴヌクレオチドプライマーが3'−または
5'−ジスルフィド結合を含む反応で増殖させることがで
きる。生じた産物を還元してチオール含有標的核酸を生
成する。次いで、チオール含有標的核酸をチオール反応
性基を含む表面に固定化し、一本鎖相補的核酸をハイブ
リダイズし、延長させる。
る実施態様では、標的核酸に相補的な一本鎖核酸を、チ
オール基−チオール反応性官能基結合及び開裂可能なリ
ンカー部分を含む結合を介して表面に固定化する。標的
核酸を含むサンプルを、標的を固定化一本鎖核酸とハイ
ブリダイズする条件下で表面と接触させる。固定化した
一本鎖核酸を、分子の3'末端にヌクレオチドを付加する
ことにより延長する。延長後、二本鎖分子を変性し、一
本鎖の固定化エクステンション産物をリンカーの位置で
表面から開裂する。エクステンション産物は、例えば質
量分析により特徴付けられ、その特徴を固定化標的核酸
に相補的な配列の予想される特徴との違いを調べる。
た核酸に基づく固相核酸化学の用途はすべて、チオール
含有核酸とチオール反応性表面またはチオール反応性核
酸とチオール含有支持体を用いて実施され得る。
に配列してチオール反応性基を含む不溶性支持体と接触
させることによりサブストレート表面上に核酸のアレー
を形成する方法をも提供する。本発明のサブストレート
表面上に核酸のアレーを形成する別の方法では、支持体
表面上に規則的に配列してチオール官能基を含む不溶性
支持体をチオール反応性基を含む核酸と接触させる。
び方法、特に診断分析用サンプルのアレーを作成するた
めにサブストレート表面上に低容量の流体材料を分配す
るシステム及び方法を提供する。本発明のサンプル材料
のアレーを作成するシステム及び方法は、通常試薬材料
を使用し保存するために余り高価でなく、高度に再現可
能なサンプルアレーを迅速に作成することができる。
ためのシステム及び方法として、本発明ではサブストレ
ート表面上にサンプル材料のマルチエレメントアレーを
作成するために使用することができる連続及び並行分配
ツールを提供する。サブストレート表面は平坦であって
も、または受容材料のウェルを含むように幾何学的に変
更されていてもよい。
並行に作成し得るものである。このために、前記ツール
は、各ピンがナノリッター容量の流体を保持するのに適
した狭い内部チャンバを含み得るベシクルエレメントま
たはピンのアセンブリと理解することができる。各ピン
は、それ自体内部チャンバを有するハウジングの内側に
適合し得る。ハウジング内部は、ピンの内部チャンバを
介する流体の流れを調節するために内部ハウジングチャ
ンバ内の圧力をコントロールする圧力源に接続すること
ができる。こうすると、ベシクルからの特定量の流体の
分配をコントロールすることができる。
する毛細管ピンを含み得るジェットアセンブリと、ピン
に取り付けられ、ピンから流体を放出させるためにピン
の内部チャンバを介して流体を動かすことができるトラ
ンスデューサ要素とを含み得る。このようにして、前記
ツールは、ピンから流体をスプレーすることによりサブ
ストレート表面に流体スポットを分配することができ
る。或いは、前記トランスデューサにより流体液滴を毛
細管から伸長させ、液滴がサブストレート表面に接触す
ることにより流体をサブストレートに流すことができ
る。
にサブストレート表面の上の異なる位置にピンを移動さ
せながら一連のステップでサンプル材料を分配すること
によりサンプル材料のアレーを形成することができる。
別の実施態様では、作成したサンプルアレーを、質量分
析のためのサンプルアレーを配置するプレートアセンブ
リに移す。このために、分析するサンプル材料の組成を
示すと理解され得る1組のスペクトル信号を発生する質
量分析計を用いる。
的方法で特定量の流体(ナノ容量及びナノ容量以下の流
体)を分配するための分配装置は、複数の側面と複数の
孔が形成されてなる底部部分とを有し、前記側面と底部
部分により内部が規定されるハウジング、前記孔内に取
り付けられた、ハウジングの内部に流体連通して配置さ
れたナノ容量の流体を保持するためのナノ容量サイズの
流体保持チャンバを有する1つ以上の流体通過ベシクル
(fluid transmitting vesicles)、及び流体をベシク
ルの流体保持チャンバに充填したときにナノ容量サイズ
の流体通過ベシクルからナノ容量の流体を選択的に分配
するためにハウジングの内部に連通している分配要素を
含み得る。本明細書に記載するように、前記分配要素に
より、装置をサブストレート上に位置合わせして配置し
たときにサブストレート表面上にナノ容量の流体を分配
することができる。
放端部と前記孔内に取り付けられたときに前記ハウジン
グの底部部分を越えて延びている遠位チップ部分とを有
する。このようにして、前記近位開放端部は孔内に取り
付けられたときにハウジング内部と流体連通して前記流
体保持チャンバを配置している。前記した複数の流体通
過ベシクルは任意に、ハウジングの孔内に取外し自在且
つ取替え自在に取り付けられているか、またはハウジン
グ内に孔を固定的に取り付けるためのグルーシールを含
み得る。
用により流体を満たすのに寸法的に適合した狭い径を含
み、毛管作用により流体で実質的に完全に満たされる大
きさを有し得る。
ルが流体送達ニードルのアレーからなり、このニードル
は金属、ガラス、シリカ、ポリマー材料または他の任意
の適当な材料で形成され得る。
び複数の流体通過ベシクルを機械的にバイアスして前記
ハウジングの底部部分とシール接触させる機械的バイア
ス要素を含み得る。1つの特定実施態様では、各流体通
過ベシクルはフランジを含む近位端部部分を有し、更に
ハウジング内部と外部環境との間にシールを形成するた
めに前記フランジと前記ハウジング底部部分の内面との
間に配置されるシーラー要素を含む。前記バイアス要素
は機械的であり、それぞれの一端が前記した各流体通過
ベシクルの近位端部に、他端が前記ハウジング頂部部分
の内面に連結している複数のスプリング要素を含み得
る。前記スプリングはシールを形成するために前記ベシ
クルの近位端部に機械的バイアス力を加えることができ
る。
及び該ハウジング頂部部分をハウジング底部部分に固定
するための固定手段を含む。前記固定手段は、ハウジン
グの頂部部分及び底部部分の1つに形成された複数のフ
ァスナ受容孔とハウジングの頂部部分及び底部部分を一
緒に固定するために前記孔内に取り付けるための複数の
ファスナとを含み得る。
でハウジング内部を処置する(dispose)のために前記
ハウジング内部に流動的に連結した圧力源を含み得る。
更に、前記流体通過ベシクルが毛管作用により満たされ
る実施態様では、前記分配手段が異なる圧力条件下でハ
ウジングの内部を処置するために圧力源を変更できる圧
力コントローラを含み得る。こうして、各ベシクルの流
体保持チャンバを所定流体量に相当する所定高さまで満
たすために毛管作用を補償する(offset)に十分な特定
圧力条件下でハウジング内部は処置される。加えて、前
記コントローラは更に、特定ナノリッター容量の流体を
各ベシクルのチャンバから選択的に排出させるための流
体選択手段を含むことができる。1つの特定実施態様で
は、ハウジング内部に対して加えられる圧力に対して可
変可能なコントロールを与えるためにデータ処理システ
ムで動くコンピュータプログラムの制御下で操作する圧
力コントローラを含む。
ングの内部に対して開放した近位端部を有し得、ベシク
ルの流体保持チャンバは該近位開放端部でメニスカスを
形成することなく毛管作用により流体で実質的に完全に
満たされる大きさを有している。前記装置は任意に、複
数のベシクルを含み、その第1部分のベシクルは第1の
大きさの流体保持チャンバを含み、第2部分は第2の大
きさの流体保持チャンバを含み、これにより複数の流体
容量が分配され得る。
でハウジング内部を処置するためにハウジングに連結し
ておりハウジング内部と連通している圧力源を有する流
体選択要素及び前記圧力源に連結した、前記した各流体
通過ベシクルの流体チャンバから分配される流体の量を
変化させるべく該流体通過ベシクルの流体チャンバに正
圧を加えるために前記ハウジング内部の圧力を変化させ
る調節要素を含み得る。前記した選択要素及び調節要素
は、内部チャンバに接続した圧力コントローラの操作を
命令するデータ処理システムで働くコンピュータプログ
ラムであり得る。
サブストレートの1つ以上のウェルに対して化学的また
は生物学的手法で流体を分配するためのものである。前
記装置は、複数の側面と複数の孔が形成されてなる底部
部分とを有し、前記側面と前記底部部分により内部が規
定されているハウジング、前記孔内に取り付けられてい
る、前記ハウジングの内部に連通して配置された流体保
持チャンバを有する複数の流体通過ベシクル、及び前記
ハウジング内部と連通している、1組の複数の流体通過
ベシクルから分配されるべく前記ベシクルの流体保持チ
ャンバに供給される流体の量を自由に選択するための流
体容量選択・分配手段を含み得る。従って、前記分配装
置はサブストレート上に位置合わせして配置されたとき
に前記分配手段がマルチウェルサブストレートのウェル
に特定量の流体を分配する。
トレートの1つ以上のウェルに対して化学的または生物
学的手法で流体を分配するための流体分配装置を提供
し、前記装置は、複数の側面と頂部部分と複数の孔が形
成されてなる底部部分とを有し、前記側面、前記頂部部
分及び前記底部部分により内部が規定されているハウジ
ング、前記孔内に取り付られた、前記ハウジング内部に
流体連通して配置されたナノ容量の流体を保持する大き
さの流体保持チャンバを有する複数の流体通過ベシク
ル、及び前記した複数の通過ベシクルを機械的にバイア
スして前記ハウジングの底部部分とシール接触させるた
めの機械的バイアス要素を含む。
ーを作成する一般的な方法は、流体を収容する内部チャ
ンバを有するベシクルを用意するステップ、前記ベシク
ルをサブストレート表面上の第1位置に隣接して配置す
るステップ、サブストレート表面の第1位置でナノリッ
ター容量の流体を分配するためにベシクルをコントロー
ルするステップ、及び前記サブストレート表面に隣接す
る1組の位置に前記ベシクルを移動させて、サンプル材
料のアレーを形成するために前記組の各位置に流体を分
配するステップを含む。
で使用されるサブストレートは、サンプル材料を受容す
るための平坦表面及びベシクルのチャンバから放出され
得る流体を受容するための位置を規定するために表面上
に形成されたウェルを含む表面を包含し得る。前記サブ
ストレートは、シリコン、金属、プラスチック、膜、ポ
リマー材料、金属をグラフトしたポリマーであり得、ま
た化学的に官能化させた、ビーズで官能化させたもしく
は樹枝状捕捉材料で官能化させたサブストレート、また
は上記の組み合わせ、または分配される流体を受容する
のに適当な類似材料であり得る。
ーを作成する一般的方法において、前記装置は分析対象
材料及び該分析対象材料を助ける支持体材料、例えばマ
トリックス材料を分配し得ることは理解され得る。この
ために、本発明の方法は、サブストレート表面上にマト
リックス材料を沈着させる(deposit)ステップを含
む。更に、前記方法は、マトリックス材料の溶媒を蒸発
させるために所定時間待機するステップを含む。本発明
の方法は、マトリックス材料の溶媒を蒸発させたら、蒸
発させたマトリックス材料に、ある容量の分析対象流体
を放出して前記マトリックス材料で溶解し、前記サブス
トレート表面上に結晶性構造物を形成させるステップを
含む。このマトリックス材料を分析対象材料で再溶解さ
せるステップは、特定の分析方法、例えば質量分析法に
おいて材料の組成を分析するのに役立つことが理解され
る。
材料からなる混合物及び他の材料組成物を分配するステ
ップを含み得る。こうして、前記マトリックス及び分析
対象材料は1つの材料としてサブストレート表面に送達
される。更なるステップにおいて、作成されたサンプル
材料のアレーは前記サンプル材料の組成を示す情報を測
定する診断ツールにかけられ得る。
析計は飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析
計、またはサンプルアレーの組成を分析することができ
る他の適当な型の質量分析計であり得る。
するベシクルを用意するステップは、流体を前記チャン
バを通って移動させるために圧電要素を有するベシクル
を用意するステップを含む。この方法は、前記ベシクル
を前記サブストレート表面を横断してラスタさせること
によりベシクルを移動させ、サンプル材料のアレーを作
成するステップを含み得る。
用することができ、この場合前記処理中に使用されるベ
シクルはサブストレート表面上の第1の複数位置に流体
を分配するためにマトリックスに配置された複数のベシ
クルを有するベシクルアセンブリを含む。このようにし
て、前記方法によれば1回の操作でサブストレート表面
上にサンプル材料のマトリックスが形成される。オフセ
ット印刷が、ベシクルマトリックスを用いて複数回印刷
ステップを使用することによりサンプル材料の大きなマ
トリックスを形成するために使用され得る。本発明の範
囲を逸脱しないで本発明により他の印刷技術を使用する
こともできる。
クルを接触させて該サブストレート表面にサンプル材料
をスポットすることにより、流体をサブストレート表面
に分配し得る。或いは、前記方法は、流体の液滴をベシ
クルの遠位チップ上またはチップで形成させる別の非接
触印刷方法を用いる。流体液滴は、サンプル材料をサブ
ストレート表面に送達するために該表面と接触させる。
この方法によれば、ベシクルをサブストレート表面に接
触させることなく既知容量の流体の送達がコントロール
される。
するのに適した寸法を有する内部チャンバを備えたベシ
クルを用意する。
記材料を含む流体を運ぶのに適したベシクルを用意する
ステップ、前記ベシクルをサブストレート表面の第1位
置に隣接して配置するステップ、サブストレート表面の
第1位置で特定且つ調整された容量の流体を与えるべく
ナノリッター容量の流体を送達するために前記ベシクル
をコントロールするステップ、前記ベシクルを前記サブ
ストレート表面上の第1位置に隣接する第2位置に移動
させて、前記サブストレート表面上の位置のアレーに沿
って特定且つ調整された容量の材料を分配するステッ
プ、及び前記アレーの各位置の材料について質量分析を
実施するステップを含む。この方法は、マトリックス材
料及び分析対象材料を混合してサブストレート表面に送
達させる流体材料を調製するステップを含み得る。或い
は、この実施態様は、ベシクル内のチャンバをマトリッ
クス材料で満たすステップ及びマトリックス材料をアレ
ーの位置に分配するステップを含み得る。続いて、分析
対象物が分配され得る。質量分析を実施するステップ
が、マトリックスによるレーザー脱離イオン化質量分析
法、飛行時間型質量分析法、またはフーリエ変換質量分
析法を実施するステップを含み得る。
を形成するための装置が提供される。前記装置は、流体
を運ぶのに適当な遠位端部を有するベシクル、前記ベシ
クルに取り付けられた遠位部分を有する可動性アーム、
前記ベシクルをサブストレート表面上の第1位置に隣接
して配置すべく前記アームを移動させるための及びサブ
ストレート表面の第1位置でナノリッター容量の流体を
与えるべく前記ベシクルをコントロールするためのコン
トローラ、及び前記材料の化学的組成を示す組成信号を
発生させるために前記材料を分析するための診断ツール
を含む。この装置では、ベシクルは材料の中実軸(soli
d shaft)を含むことができ、ベシクルは流体を運ぶの
に適した内部チャンバを有し、ベシクルはチャンバから
流体を放出するためのトランスデューサ要素内の流体を
運ぶためのチャンバを含み得る。
有するサブストレートを提供し、このサブストレートは
マトリックス材料を含む流体を移すのに適したベシクル
を用意し、前記ベシクルをサブストレート表面の第1位
置に隣接して配置し、サブストレート表面の第1位置
に、ある量の流体を送達させるために前記ベシクルをコ
ントロールし、前記サブストレート表面に隣接する組の
位置に前記ベシクルを移動し、前記組の各位置で流体を
送達してマトリックス材料のアレーを形成することを含
むプロセスにより形成される。このサブストレート自体
は、平坦なシリコンチップであっても他の適当な材料で
あってもよく、またはピットが形成されていても、ウェ
ルを含んでいても、粗な内表面を有するウェルを有して
いてもよい。
核酸のアレーを形成する方法は、不溶性支持体の表面の
所定位置を、チオール含有核酸溶液を収容した内部チャ
ンバを有するベシクルを用いて前記位置に分配される前
記溶液と接触させ、これにより所定位置がチオール含有
基を含む方法が提供される。或いは、サブストレートの
全表面をチオール含有基で誘導化し、チオール含有核酸
を表面上の所定位置にアレーが形成されるように分配す
る。本発明は、本発明方法により形成される核酸のアレ
ーを担持する表面を有するサブストレートをも提供す
る。
面、詳細説明及び請求の範囲の記載から明らかとなるで
あろう。
を示す。
を実施するために図1に示すシステムと一緒に使用する
のに適したピンアセンブリを示す。
図である。
す。
アセンブリを示す。
ゴデオキシヌクレオチドの共有結合を示す概略図であ
る。特に、二酸化ケイ素を3−アミノプロピルトリエト
キシシランと反応させて表面上に第1級アミノ基の均一
層を形成した。次いで、ヘテロ二官能性架橋剤を第1級
アミンと反応させてヨードアセタミド基を導入した。3'
−または5'−ジスルフィド(5'として示す)を含有する
オリゴデオキシヌクレオチドをトリス−(2−カルボキ
シエチル)ホスフィン(TCEP)で処理してジスルフィド
を遊離チオールに還元し、次いでヨードアセタミド表面
にカップリングさせた。
チドプローブの結合をジスルフィド還元に使用したTCEP
濃度の関数としてプロットしたグラフである。
“TCUC"と呼称されるオリゴデオキシヌクレオチド配列
(5'−GAATTCGAGCTCGGTACCCGG−3';配列番号1)及びハ
イブリダイズさせた“MJM6"と呼称されるオリゴデオキ
シヌクレオチド配列(5'−CCGGGTACCGAGCTCGAATTC−3';
配列番号2)を有するシリコンウェハのマトリックスを
用いたレーザー脱離/イオン化−飛行時間(MALDI−TO
F)質量スペクトルである。
せた特定のチオール含有DNA標的のシリコンウェア表面
への固定化の概略図である。DNA標的配列の一部に相補
的なオリゴヌクレオチド(配列番号7)を固定化DNA標
的にハイブリダイズし、MALDI−TOF MS分析を実施し
た。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに相当する
主たるシグナルが質量/電荷数の測定値3618.33で認め
られた。なお、質量/電荷数の理論値は3622.4である。
を施したウェルを有するサブストレートの1具体例を示
す。
示すサブストレートの表面上のサンプル材料の材料組成
を示すスペクトルの1例を示す。
について測定した分子量を示す。
表面上の16箇所に共有結合させた、“オリゴマー1"(5'
−CTGGATGCGTCGGATCATCTTTTTT−(S)−3';配列番号
8)、“オリゴマー2"(5'−(S)−CCTCTTGGGAACTGTG
TAGTATT−3';配列番号3)及び“オリゴマー3"(配列番
号1;実施例1の遊離チオール誘導体“TCUC"オリゴヌク
レオチド)と呼称されるチオール含有オリゴヌクレオチ
ド分子を有するシリコンウェハの表面上の4×4(16箇
所)DNAアレーの概略図である。
的オリゴヌクレオチド(5'−GATGATCCGACGCATCAGAATGT
−3';配列番号9)、オリゴマー2に結合させたオリゴ
マー2相補的オリゴヌクレオチド(5'−AATACTACACAG−
3';配列番号7)及びオリゴマー3に結合させたオリゴ
マー3相補的オリゴヌクレオチド(5'−CCGGGTACCGAGCT
CGAATTC−3';配列番号2)を有する図14のDNAハイブリ
ダイゼーションアレーの16箇所の各々に対する特定オリ
ゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの概略図であ
る。
4(16箇所)DNAアレーの代表的MALDI−TOF質量スペク
トルである。このスペクトルは、特定のハイブリダイズ
されたオリゴヌクレオチドに対応する各箇所における質
量/電荷数実験値の1個の主シグナルを示している。2
+は、MALDI−TOF MS分析で参照標準として使用した2
重電荷分子の位置を示す。*は、洗浄作業後のチップ表
面に残存している汚染オリゴヌクレオチドの残留量を示
す。*シグナルの相対位置が汚染オリゴヌクレオチドの
だいたいの大きさを示す。
TOF質量スペクトルである。このスペクトルは、予測さ
れる特定のハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドに
対応する質量/電荷数実験値を有する1個の主シグナル
を示している。*は、洗浄作業後ウェハ表面に残存して
いる汚染オリゴヌクレオチドの残留量を示す。*シグナ
ルの相対位置が汚染オリゴヌクレオチドのだいたいの大
きさを示す。
れたチオール含有DNA鋳型にアニーリングしたDNAプライ
マーのヌクレオチドエクステンションの例示である。相
補的12量体オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号1
2)を、SIAB架橋剤を介してシリコン支持体に固定化し
た27量体チオール含有オリゴヌクレオチド(配列番号1
1)にハイブリダイズした。固定化したDNA二重らせんを
含むシリコン表面をdATP、dCTP、dGTP及びddTTPの存在
下エクステンション条件でDNAポリメラーゼとインキュ
ベートし、MALDI−TOF MS分析にかけた。シリコンウェ
ハの質量スペクトルは、主シグナルが2つ存在すること
を示す。1つは未延長12量体オリゴヌクレオチドに等し
い質量/電荷数を有し、他の1つはウェハ上でddTTPを
挿入した配列中の第1位置に対して3ヌクレオチドだけ
延長させた15量体DNA分子に相当するシグナルである。
ョン反応で形成されたDNA二重らせんとの距離の影響を
調べるべく企画された実験の略図である。配列がそれぞ
れ異なる2つのチオール含有オリゴヌクレオチド(配列
番号8及び11)をSIAB誘導体化シリコン表面に固定化
し、SIAB誘導化表面と固定化されたチオール含有DNAに
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドにより形成され
たDNA二重らせんとの間に0、3、6、9及び12塩基ス
ペーサーを有するDNA二重らせんを形成する特定のオリ
ゴヌクレオチドとインキュベートした。ハイブリダイズ
したオリゴヌクレオチドの遊離3'末端を、シークエナー
ゼDNAポリメラーゼまたはサーモシークエナーゼDNAポリ
メラーゼのいずれかを用い、3つのデオキシヌクレオチ
ドトリホスフェート及び対応するジデオキシヌクレオチ
ドトリホスフェートの存在下エクステンション条件で延
長させ、生じた反応産物をMALDI−TOF MS分析にかけ
た。
の特定エクステンション産物の代表的MALDI−TOF質量ス
ペクトルである。左カラムのスペクトルは、シークエナ
ーゼを使用したエクステンション反応のMALDI−TOF MS
分析から得られたものである。右カラムのスペクトル
は、サーモシークエナーゼを使用したエクステンション
反応の分析から得られたものである。サーモシークエナ
ーゼDNA分析ポリメラーゼにより、DNA二重らせんと誘導
化シリコンウェハとの距離が0〜12ヌクレオチドである
ハイブリダイズDNAプライマーの3'末端を延長させるこ
とができた。シークエナーゼDNAポリメラーゼにより、D
NA二重らせんとシリコンウェハとの距離が3〜9ヌクレ
オチドであるハイブリダイズDNAを延長させることがで
きた。
用語はすべて本発明が属する分野の当業者が通常理解し
ている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の特許
及び文献はすべて本明細書に援用されるものとする。
A)やリボ核酸(RNA)のようなオリゴヌクレオチドまた
はポリヌクレオチド、並びにヌクレオチドアナログから
調製される一本鎖もしくは二本鎖のRNAまたはDNAのアナ
ログを指す。核酸分子は合成されたものでも、当業界で
公知の方法(特に、特定の生物学的サンプルに対して適
当な方法を選択する)を用いて特定の生物学的サンプル
から単離されたものであってもよい。
−もしくはトリホスフェートを含む。また、ヌクレオチ
ドはホスホロチオエートヌクレオチド及びデアザプリン
ヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドも含む。鎖伸長
ヌクレオチドの完全組は、4つの異なるDNA鋳型含有塩
基の各々にハイブリダイズできる4つの異なるヌクレオ
チドを指す。
リヌクレオチドを生成する方法を指す。前記方法とし
て、非限定的に化学反応または酵素反応を含む方法が例
示される。
規則的配列を指す。アレーは任意の数のメンバーまたは
位置を含み得、アレーの形も多種多様であり得る。好ま
しい実施態様において、アレーは2次元であり、n×m
(n及びmは整数であり、同数でも異なっていてもよ
い)メンバーを含む。特に好ましい実施態様で、n及び
mはそれぞれ4またはその倍数である。
本明細書では不溶性支持体に好ましくは共有結合を介し
て核酸を固定化させ得る試薬を指す。よって、本発明で
使用するのに適切な架橋剤は不溶性支持体の表面上に存
在する官能基及び核酸分子中に存在する官能基と反応し
得る各種物質を含む。前記反応性を有する試薬にはホモ
−及びヘテロ−二官能性試薬が含まれ、その多くは当業
界で公知である。ヘテロ二官能性試薬が好ましい。
オール部分と迅速に反応して共有結合(例えば、ジスル
フィド結合またはチオエーテル結合)を生じ得る官能基
を指す。通常、チオール基は良好な求核物質であり、好
ましいチオール反応性官能基は反応性親電子物質であ
る。多種多様のチオール反応性官能基が当業界で公知で
あり、例えばハロアセチル(好ましくはヨードアセチ
ル)、ジアゾケトン、エポキシケトン、α,β−不飽和
カルボニル(例えば、α,β−エノン)及び他の反応性
ミカエルアクセプター(マレイミドを含む)、酸ハロゲ
ン化物、ベンジルハライド等が含まれる。特定実施態様
では、ジスルフィドの遊離チオール基が遊離チオール基
と(すなわち、ジスルフィド交換のようなジスルフィド
結合形成により)反応し得る。本明細書中、チオール反
応性架橋剤は少なくとも1つのチオール反応性官能基を
含むかもしくは含むように修飾され得る架橋剤(または
表面)を指す。当業界で慣用されている適当な保護基
(例えば、T.W.Greene及びP.G.M.Wuts、“Protective
Groups in Organic Synthesis"、第2版、John Wil
ey & Sons(1991))でブロックすることにより、チ
オール基の反応が一時的に阻止され得る。
下で開裂されるリンカーであり、例えば光開裂性リンカ
ー、化学的に開裂性リンカー及び酵素的に開裂性リンカ
ー(すなわち、制限エンドヌクレアーゼサイトまたはリ
ボヌクレオチド/RNase消化)である。リンカーを支持体
と固定化DNAとの間に介在させる。
及び「ペプチド」は翻訳された核酸(例えば、遺伝子産
物)を指すときには互換可能に使用される。
成物を指す。好ましい実施態様において、サンプルは生
物学的サンプル、すなわちヒト、動物、植物、細菌、真
菌、原生生物、ウィルスのような生きたソースから得ら
れる任意の材料である。生物学的サンプルの形態は任意
であり、固体材料(例えば、組織、細胞ペレット及び生
検によって得られた材料)及び生物学的流体(例えば、
尿、血液、唾液、羊水及びうがい液(口腔細胞を含
む))が含まれる。好ましくは、固体材料を流体と混合
する。
方法に従ってサンプルが沈着される不溶性支持体を意味
する。適当な支持体としては、ビーズ(例えば、シリカ
ゲル、一定の細孔を有するガラス、磁性物質、セファデ
ックス/セファロース、セルロース)、毛細管、ガラス
繊維フィルタのような平坦な支持体、ガラス表面、金属
表面(スチール、金、銀、アルミニウム、銅及びシリコ
ン)、(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ
アミド、ポリビニリデンジフロリド製の)マルチウェル
プレートまたは膜を含めたプラスチック材料、ピン(例
えば、組合せ合成または分析に適したピンのアレー)、
または任意にプレートを有する平坦な表面(例えば、シ
リコンウェハのようなウェハ)のピット中のビーズが例
示される。
特定方法において、好ましいサブストレートは、好まし
くは共有結合した核酸がサブストレート上に少なくとも
20fmol/mm2、より好ましくは少なくとも約75fmol/mm2、
もっと好ましくは少なくとも約85fmol/mm2、更に好まし
くは少なくとも約100fmol/mm2、最も好ましくは少なく
とも約150fmol/mm2の密度で存在するように核酸の高密
度結合を支持し得るものである。本発明のサブストレー
トに核酸を固定化する特定方法で使用する最も好ましい
サブストレートの1つはシリコンであり、余り好ましく
ないサブストレートにはポリアクリルアミドのようなポ
リマー材料が含まれる。本発明のアレーを作成する方法
で使用されるサブストレートには広範囲の不溶性支持体
材料が含まれ、非限定的にシリカゲル、一定の孔を有す
るガラス、セルロース、ガラス繊維フィルタ、ガラス表
面、金属表面(スチール、金、銀、アルミニウム、シリ
コン及び銅)、(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリアミド、ポリビニリデンジフロリド製の)プラ
スチック材料及びシリコンが例示される。
に核酸分子が高密度で固定化される。通常、核酸分子は
直接または架橋剤を用いて不溶性支持体上に固定化され
る。
適当に官能化された表面と直接反応させて固定化された
核酸を生じさせる。例えば、ヨードアセチル修飾表面
(または他のチオール反応性表面官能基)をチオール修
飾核酸と反応させて、固定化核酸を得ることができる。
上に固定化されるように架橋剤が選択される。理論に束
縛されるつもりはないが、本発明で高密度の核酸が固定
化される理由の少なくとも一因は、核酸を固定化するた
めに従来使用されていた他の反応と比較して、架橋剤と
核酸(例えば、チオール修飾核酸)との間の反応が比較
的迅速に起こるからである。更に、高密度の少なくとも
一因は官能化された不溶性支持体と反応性基(例えば、
アミノ基または他の反応性官能基)との距離が近いこと
である。従って、表面を修飾するための試薬は通常、官
能化された支持体と官能基との距離が近くなるように選
択される。架橋剤(及び支持体表面または核酸分子を官
能化させるために使用される他の試薬)は、固定化され
る核酸分子が支持体表面から所望の距離離れ、固定化さ
れる核酸が相互に所望の距離離れるように選択される。
従って、適切な架橋剤を選択することにより核酸分子の
立体障害を低下もしくは解消することができる。特定の
実施態様では、架橋剤は、複数の核酸を1個の架橋部分
に結合させるためのデンドリマー合成に使用される多反
応性官能基を与えるように選択され得る。好ましくは、
架橋剤は核酸分子と反応性が高く迅速な、完全な及び/
または選択的な反応を与えるように選択される。好まし
い実施態様では、試薬(例えば、チオール基及びチオー
ル反応性官能基)の反応容量は小さい。
酸、すなわち少なくとも1個の反応性チオール部分を含
むように誘導化された核酸である。後記実施例1におい
て更に詳細に記載するように、少なくとも1個の反応性
チオールを含む核酸は、好ましくは3'−または5'−ジス
ルフィドを含む核酸を還元剤で処理して製造される。前
記還元剤としては、後続反応で競合しない(すなわち、
ヨードアセトイミド官能基と反応しない)ものが好まし
い。ジスルフィド誘導化核酸は各種方法に従って合成さ
れ得る。例えば、核酸は、ジスルフィド含有修飾剤と反
応させることにより3'−または5'−末端で修飾され得
る。或いは、チオール化プライマーを酵素的にまたは非
酵素的に核酸に結合させることができる。5'−ホスホル
アミダイト官能基は、チオールもしくはジスルフィド含
有シトシンまたはジオキシシトシンに対する結合点をも
提供する。ジスルフィド修飾核酸の還元のために適当な
還元剤の例にはトリス(2−カルボキシエチル)ホスフ
ィン(TCEP)、ジチオトレイトールが含まれる。TCEPは
好ましくは1〜100mM(最も好ましくは約10mM)の濃
度、pH3〜6(最も好ましくは約4.5)、温度20〜45℃
(最も好ましくは約37℃)で約1〜約10時間(最も好ま
しくは約5時間)反応させる。ジチオトレイトールは好
ましくは25〜100mM(反応物質を単離するかどうかによ
り)の濃度、pH6〜10(最も好ましくは約8)、温度25
〜45℃(最も好ましくは約37℃)で約1〜約10時間(最
も好ましくは約5時間)反応させる。TCEには低pHで反
応性であるという利点がある。こうした低pHによりチオ
ールが効果的にプロトン化され、よってチオールの求核
反応が抑制され、より高いpHで使用される他のジスルフ
ィド還元剤に比較して生じる副反応が少なくなる。
性架橋剤はN−スクシンイミジル(4−ヨードアセチ
ル)アミノベンゾエート(SIAB)である。非限定的に例
示するジマレイミド、ジチオ−ビスニトロ安息香酸(DT
NB)、N−スクシンイミジル−S−アセチルチオアセテ
ート(SATA)、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリ
ジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、スクシンイ
ミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−
1−カルボキシレート(SMCC)及び6−ヒドラジノニコ
チンイミド(HYNIC)などの他の架橋剤も新規方法に使
用され得る。架橋剤の更なる例については、例えばWon
g,“Chemistry of Protein Coujugation and Cros
s−Linking",CRC Press(1991)及びHermanson,“Bioc
onjugate Techniques",Academic Press(1995)を参
照されたい。
る光開裂性架橋剤を用いて固定化される。光不安定な架
橋剤としては、非限定的に3−アミノ−(2−ニトロフ
ェニル)プロピオン酸(Brownら,Molecular Diversit
y,pp.4−12(1995)及びRothschildら,Nucleic Acids
Res.,24:361−66(1996))が例示される。
定化方法の別の実施態様では、前記した標的核酸に相補
的な一本鎖核酸が、チオール基−チオール官能基結合及
び開裂可能な、好ましくは選択的に開裂可能なリンカー
部分を含む結合を介して表面に固定化される。
能基(L')と捕捉分子上の適当な官能基(L)との間の
可逆的もしくは非可逆的結合を介して固体支持体に直接
結合させることができる。可逆的結合は、質量分析の条
件下(すなわち、電荷移動複合体または不安定結合のよ
うな光開裂可能な結合が比較的安定な有機ラジカル間で
形成される)で開裂され得るような結合であり得る。
ば、Goldmacherら,Bioconj.Chem.,3:104−107(1992)
を参照されたい)、よって光にさらすと標的物質を放出
するリンカーである。光にさらすと開裂される光開裂性
リンカーは公知であり[例えば、Hazumら,Pept.Proc.Eu
r.Pept.Symp.,16版,Brunfeldt,K.編,pp.105−10(198
1)にはシステインに対する光開裂性保護基としてニト
ロベンジル基を使用することが記載されている。Yenら,
Makromol.Chem.,190:69−82(1989)には、ヒドロキシ
プロピルメタクリルアミドコポリマー、グリシンコポリ
マー、フルオレセインコポリマー及びメチルローダミン
コポリマーを含めた水溶性の光開裂可能なコポリマーが
記載されている。Goldmacherら,Bioconj.Chem.,3:104
−107(1992)には、近UV光(350nm)に露出すると光分
解を受ける架橋剤及び試薬が記載されている。更に、Se
nterら,Photochem.Photobiol.,42:231−237(1985)に
は、光分解可能な結合を形成するニトロベンジルオキシ
カルボニルクロリド架橋剤が記載されている。]、これ
により光に露出すると標的物質が遊離する。好ましい実
施態様では、核酸を、質量分析中に開裂される光開裂性
リンカーを用いて固定化する。
ることができる。この場合、固体支持体の表面は、負に
帯電した核酸骨格に反発し、よって質量分析に必要な脱
離を促進する負電荷を有する。脱離はレーザーパルスに
より生成される熱により及び/またはL'に依存して、L'
発色団と共鳴するレーザーエネルギーの特異的吸収によ
り生じ得る。
ールまたはジチオエリトールにより化学的に開裂可能
な)ジスルフィド結合型、ビオチン/ストレプトアビジ
ン系、穏和な酸性条件下及び質量分析条件下で開裂され
得るトリチルエーテル基のヘテロ二官能性誘導体(例え
ば、Kosterら,“A Versatile Acid−Labile Linke
r for Modification of Synthetic Biomolecule
s",Tetrahedron Letters,31:7095(1980)参照)、ほ
ぼ中性条件下でヒドラジニウム/アセテート緩衝液によ
り開裂可能なレブリニル基、トリプシンのようなエンド
ペプチダーゼ酵素により開裂可能なアルギニン−アルギ
ニンまたはリシン−リシン結合、またはピロホスファタ
ーゼにより開裂可能なピロホスフェート結合、または例
えばリボヌクレアーゼまたはアルカリにより開裂され得
るオリゴデオキシヌクレオチド間のリボヌクレオチド結
合であり得る。
時的なL−L'結合を形成することができる。多くの場合
電荷移動結合はUV/ビス分光分析により測定され得るの
で(例えば、R.Foster著、Organic Charge Transfer
Complexes,Academic Press(1969)参照)、レーザ
ーエネルギーを電荷移動波長の対応エネルギーに変える
ことができ、よって固体支持体の特異的脱離を開始させ
ることができる。当業者が認識しているように、上記目
的にいくつかの組み合わせが使用され得、ドナー官能基
は固体支持体上に存在させてもまた検出すべき核酸分子
に結合させてもよい。また、その逆でもよい。
安定なラジカルを均一に形成することにより生じさせる
ことができる。レーザーパルスの影響下で、(上記し
た)脱離及びイオン化がラジカル位置で起こる。当業者
が認識しているように、他の有機ラジカルが選択され
得、前記ラジカル間の結合を均一に開裂するために必要
な解離エネルギーに関連して、対応するレーザー波長を
選択し得る(例えば、C.Wentrup,John Wiler & Son
sのReactive Molecules,1984参照)。
を行う場合、固体支持体に5−末端を介して固定化した
一本鎖DNA分子を3'−進行的エキソヌクレアーゼを用い
て片側だけ分解し、分解したヌクレオチドの分子量をそ
の後測定する。逆サンガー配列決定により、固定化した
DNAのヌクレオチド配列が明らかになる。選択的に開裂
可能なリンカーを添加することにより、測定すべき遊離
ヌクレオチドの質量並びに洗浄によりヌクレオチドを除
去することにより残りのフラグメントの質量が、固体支
持体からDNAを開裂して、MALDI−TOFにより検出され得
る。選択的に開裂可能なリンカー、例えば本発明で提供
される光開裂可能なリンカーまたは化学的に開裂可能な
リンカーを使用することにより、MALDI−TOFのイオン化
及び揮発段階で生ずるように前記開裂が選択される。同
じ反応原理が、二重らせんのままで分解される二本鎖DN
Aの5'固定化鎖に対して適用される。同様に、前記反応
原理が5'進行性エキソヌクレアーゼを用いる場合にも適
用され。DNAは3'−末端を介して固体支持体に固定化さ
れる。
方法が考えられる。1)標的核酸を増幅または入手する
(プライマーを増幅または分離するために標的配列また
は周囲のDNA配列は公知でなければならない)。2)プ
ライマー核酸を固体支持体に固定化し、標的核酸をハイ
ブリダイズする(これはサンプル中の標的配列の存在を
検出するかまたは該配列を決定するためである)。また
は、3)(増幅または分離された)二本鎖DNAを1つの
所定鎖への結合を介して固定化し、二重らせんをはずす
ためにDNAを変性した後、標的サイトから上流が同一の
高濃度の相補性プライマーを有するDNAを添加し、鎖置
換を起こし、プライマーを固定化鎖にハイブリダイズす
る。
的核酸をハイブリダイズする実施態様では、開裂性リン
カーを加えることにより遊離3'−OHが核酸合成(エクス
テンション)に利用されるようにプライマーDNAは5'末
端で固定化され、ハイブリダイズされた標的DNAの配列
が決定され得る。なぜならば、ハイブリダイズされた鋳
型は変性により除去され得、延長されたDNA産物はMALDI
−TOF MS用固体支持体から開裂されるからである。
3)についても同様に、固定化されたDNA鎖は鋳型にハ
イブリダイズし、支持体から開裂したときに伸長され得
る。よって、サンガー配列決定、下記するプライマーオ
リゴ塩基エクステンション(PROBE)、エクステンショ
ン反応は、標的配列の非可変領域に相補的な公知の上流
DNA配列を有する固定化プライマーを用いて実施され得
る。ヒトから核酸を入手し、可変領域(遺伝素質または
病気を引き起こす欠失、挿入、ミスセンス突然変異、ま
たはウィルス性/細菌性もしくは真菌性DNAの存在)のD
NA配列が検出されるばかりでなく、突然変異の実際の配
列及び位置も調べることができる。
ニーリングしなければならない。このためには、公知の
配列に基づいてより大きなDNAを増幅し、固定化された
フラグメント(すなわち、延長されたフラグメントは上
記したようにハイブリダイズされているが支持体に固定
化されていない)を配列決定する必要がある。これらの
場合リンカーを挿入することは望ましくない。なぜなら
ば、MALDI−TOFスペクトルはハイブリダイズされたDNA
のものであるからである。固定化された鋳型を開裂しな
くてよい。
化するためのリンカーを使用して、核酸を固体支持体に
結合することができる。本発明において好ましいリンカ
ーは選択的に開裂し得るリンカーであり、特に例示され
ているものである。他のリンカーには、ビスマレイミド
エトキシプロパンのような酸開裂性リンカーまたは酸不
安定トリチルリンカーである。
セスできるようにしなければならない場合には、酸開裂
性リンカー、光開裂性リンカー及び感熱性リンカーも使
用することができる。酸開裂性リンカーには、非限定的
にビスマレイミドエトキシプロパン、アジピン酸ジヒド
ラジドリンカー(例えば、Fattomら,Infection & Im
mun.,60:584−589(1992)参照)、及び細胞内トランス
フェリンサイクリング経路に進入し得るに十分量のトラ
ンスフェリンを含む酸不安定トランスフェリン結合体
(例えば、Welhonerら,J.Biol.Chem.,266:4309−4314
(1991)参照)が含まれる。
ーをオリゴヌクレオチドの固相合成で使用するためにそ
のホスホルアミダイト誘導体として提供する。前記リン
カーは、UV照射されると結合体が数分以内に完全に光開
裂され得るo−ニトロベンジル部分とホスフェート結合
を含んでいる。使用されるUV波長は照射がオリゴヌクレ
オチドにダメージを与えないように選択され、好ましく
は約350〜380nm、より好ましくは365nmである。本発明
で提供される光開裂性リンカーは、慣用されているホス
ホルアミダイトモノマー(例えば、Sinhaら,Tetrahedro
n Lett.,24:5846−5846(1983);Sinhaら,Nucleic Ac
ids Res.,12:4539−4557(1984);Beaucageら,Tetrahe
dron,49:6123−6194(1993);及びMatteucciら,J.Am.C
hem.Spc.,103:3185−3191(1981)参照)に比較して匹
敵し得るカップリング効率を有する。
シ)アルキルまたはω−ヒドロキシアルキルであり、R
21は水素、アルキル、アリール、アルコキシカルボニ
ル、アリールオキシカルボニル及びカルボキシから選択
され、R22は水素または(ジアルキルアミノ)(ω−シ
アノアルコキシ)P−であり、tは0〜3であり、R50
はアルキル、アルコキシ、アリールまたはアリールオキ
シである) を有する。
I: (式中、R20はω−(4,4'−ジメトキシトリチルオキ
シ)アルキル、ω−ヒドロキシアルキルまたはアルキル
であり、R21は水素、アルキル、アリール、アルコキシ
カルボニル、アリールオキシカルボニル及びカルボキシ
から選択され、R22は水素または(ジアルキルアミノ)
(ω−シアノアルコキシ)P−であり、X20は水素、ア
ルキルまたはOR20である) を有する。
トキシトリチルオキシ)プロピル、3−ヒドロキシプロ
ピルまたはメチルであり、R21は水素、メチル及びカル
ボキシから選択され、R22は水素または(ジイソプロピ
ルアミノ)(2−シアノエトキシ)P−であり、X20は
水素、メチルまたはOR20である。より好ましい実施態様
では、R20は3−(4,4'−ジメトキシトリチルオキシ)
プロピルであり、R21はメチルであり、R22は(ジイソプ
ロピルアミノ)(2−シアノエトキシ)P−であり、X
20は水素である。別のより好ましい実施態様では、R20
はメチルであり、R21はメチルであり、R22は(ジイソプ
ロピルアミノ)(2−シアノエトキシ)P−であり、X
20は3−(4,4'−ジメトキシトリチルオキシ)プロポキ
シである。
シアノアルコキシ)P−であり、R24はω−ヒドロキシ
アルコキシ、ω−(4,4'−ジメトキシトリチルオキシ)
アルコキシ、ω−ヒドロキシアルキル及びω−(4,4'−
ジメトキシトリチルオキシ)アルキルから選択され、未
置換でもアルキルもしくはアルコキシ鎖が1つ以上のア
ルキル基で置換されていてもよく、r及びsはそれぞれ
0〜4であり、R50はアルキル、アルコキシ、アリール
またはアルコキシである) を有する。ある実施態様では、R24はアルキル鎖がメチ
ル基で置換された、ω−ヒドロキシアルキルまたはω−
(4,4'−ジメトキシトリチルオキシ)アルキルである。
ソプロピルアミノ)(2−シアノエトキシ)P−であ
り、R24は3−ヒドロキシプロポキシ、3−(4,4'−ジ
メトキシトリチルオキシ)プロポキシ、4−ヒドロキシ
ブチル、3−ヒドロキシ−1−プロピル、1−ヒドロキ
シ−2−プロピル、3−ヒドロキシ−2−メチル−1−
プロピル、2−ヒドロキシエチル、ヒドロキシメチル、
4−(4,4'−ジメトキシトリチルオキシ)ブチル、3−
(4,4'−ジメトキシトリチルオキシ)−1−プロピル、
2−(4,4'−ジメトキシトリチルオキシ)エチル、1−
(4,4'−ジメトキシトリチルオキシ)−2−プロピル、
3−(4,4'−ジメトキシトリチルオキシ)−2−メチル
−1−プロピル及び4,4'−ジメトキシトリチルオキシメ
チルから選択される。
アミノ)(2−シアノエトキシ)P−であり、r及びs
は0であり、R24は3−(4,4'−ジメトキシトリチルオ
キシ)プロポキシ、4−(4,4'−ジメトキシトリチルオ
キシ)ブチル、3−(4,4'−ジメトキシトリチルオキ
シ)プロピル、2−(4,4'−ジメトキシトリチルオキ
シ)エチル、1−(4,4'−ジメトキシトリチルオキシ)
−2−プロピル、3−(4,4'−ジメトキシトリチルオキ
シ)−2−メチル−1−プロピル及び4,4'−ジメトキシ
トリチルオキシメチルから選択される。最も好ましく
は、R24は3−(4,4'−ジメトキシトリチルオキシ)プ
ロポキシである。
より、適切な出発物質を選択することにより方法を若干
改変することにより、または当業界で公知の他の方法に
より製造され得る。
で製造され得る。5−ヒドロキシ−2−ニトロベンズア
ルデヒドをω−ヒドロキシアルキルハライド、例えば3
−ヒドロキシプロピルブロミドを用いてアルキル化し、
生じたアルコールを例えばシリルエーテルとして保護す
ると、5−(ω−シリルオキシアルコキシ)−2−ニト
ロベンズアルデヒドが生ずる。このアルデヒドに有機金
属を添加すると、ベンジルアルコールが得られる。使用
し得る有機金属には、(R21がアルキルのリンカーに対
しては)トリメチルアルミニウムのようなトリアルキル
アルミニウム、(R21が水素のリンカーに対しては)ホ
ウ水素化ナトリウムのようなホウ水素化物、また(R21
がカルボキシまたはアルコキシカルボニルのリンカーに
対しては)シアン化カリウムのような金属シアン化物が
含まれる。金属シアン化物の場合、反応生成物であるシ
アノヒドリンを次いで、水またはアルコールのいずれか
の存在下酸性もしくは塩基性条件下で加水分解すること
により所望の化合物が得られる。
例えばテトラブチルアンモニウムフロリドを用いて脱シ
リル化することにより4,4'−ジメトキシトリチル基と交
換すると、対応するアルコールが生じ、これを4,4'−ジ
メトキシトリチルクロリドと反応させる。例えば2−シ
アノエチルジイソプロピルクロロホスホルアミダイトと
反応させると、R22が(ジアルキルアミノ)(ω−シア
ノアルコキシ)P−であるリンカーが得られる。
ームに示す。以下のスキームにはオリゴヌクレオチド合
成におけるリンカーの使用も示す。このスキームは例示
にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。ここ
に示した合成変換の実験の詳細は実施例に記載されてい
る。
−ジヒドロキシアセトフェノンの4−ヒドロキシを、例
えば炭酸カリウムとシリルクロリドと反応させることに
より選択的に保護する。前記アセトフェノンに代えてベ
ンゾエートエステル、プロピオフェノン、ブチロフェノ
ン等を使用することができる。次いで、生じた4−シリ
ルオキシ−3−ヒドロキシアセトフェノンの3−ヒドト
ロキシを(R20がアルキルのリンカーの場合には)アル
キルハライドを用いてアルキル化し、例えばテトラブチ
ルアンモニウムフロリドを用いて脱シリル化することに
より、3−アルコキシ−4−ヒドロキシアセトフェノン
が生ずる。次いで、この化合物の4−ヒドロキシをω−
ヒドロキシアルキルハライド、例えば3−ヒドロキシプ
ロピルブロミドと反応させることによりアルキル化する
と、4−(ω−ヒドロキシアルコキシ)−3−アルコキ
シアセトフェノンが生ずる。次いで、この側鎖アルコー
ルをエステル、例えばアセテートとして保護する。次い
で、この化合物の5位を例えば濃硝酸を用いてニトロ化
すると、対応する2−ニトロアセトフェノンが生ずる。
この側鎖エステルの例えば炭酸カリウムを用いるけん化
及びケトンの例えばホウ水素化ナトリウムを用いる還元
を任意の順序で実施すると、2−ニトロ−4−(ω−ヒ
ドロキシアルコキシ)−5−アルコキシベンジルアルコ
ールが生ずる。
リドと反応させることにより、対応する4,4'−ジメトキ
シトリチルエーテルとして選択的に保護する。更に、例
えば2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホルア
ミダイトと反応させると、R22が(ジアルキルアミノ)
(ω−シアノアルコキシ)P−であるリンカーが得られ
る。
ームに示す。このスキームは例示にすぎず、本発明の範
囲を限定するものではない。ここに示した変換の実験の
詳細は実施例に記載されている。
適当な出発物質を選択することにより方法を若干改変す
ることにより、または当業者に公知の他の方法により製
造することができる。
アルキル−またはアルコキシアリール化合物、特にω−
ヒドロキシアルキル−またはアルコキシベンゼンから製
造される。前記した化合物は市販されているかまたは、
多くはω−ヒドロキシアルキルハライド(例えば、3−
ヒドロキシプロピルブロミド)と(ω−ヒドロキシアル
キルベンゼンの場合には)フェニルリチウムまたは(ω
−ヒドロキシアルコキシベンゼンの場合には)フェノー
ルとから製造される。ω−ヒドロキシ基の(例えば、酢
酸エステルとして)アシル化後、芳香族環を2−ニトロ
ベンゾイルクロリドを用いてフリーデル−クラフッアシ
ル化すると、4−(ω−アセトキシアルキルまたはアル
コキシ)−2−ニトロベンゾフェノンが得られる。ケト
ンの例えばホウ水素化ナトリウムによる還元及び側鎖エ
ステルのケン化を任意の順序で実施すると、2−ニトロ
フェニル−4−(ヒドロキシ−アルキルまたはアルコキ
シ)フェニルメタノールが得られる。末端ヒドロキシ基
を4,4'−ジメトキシトリチルクロリドと反応させると、
末端ヒドロキシ基は対応する4,4'−ジメトキシトリチル
エーテルとして保護される。次いで、ベンジルヒドロキ
シ基を例えば2−シアノエチルジイソプロピルクロロホ
スホルアミダイトと反応させると、R23が(ジアルキル
アミノ)(ω−シアノアルキル)P−である式IIのリン
カーが得られる。他の式IIIを有する光開裂性リンカー
は、上記合成におけるω−ヒドロキシ−アルキルもしく
はアルコキシ−ベンゼンの代わりに2−フェニル−1−
プロパノールまたは2−フェニルメチル−1−プロパノ
ールを使用することにより製造され得る。上記した化合
物は市販されており、多くは例えばフェニルマグネシウ
ムブロミドまたはベンジルマグネシウムブロミドと必要
なオキシラン(すなわち、プロピレンオキシド)を触媒
作用の銅イオンの存在下で反応させることによっても製
造され得る。
化核酸と固体支持体との間に開裂可能な結合を導入する
ことができる。現在、酸不安定リンカーが質量分析用、
特にMALDI−TOF MS用の化学的に開裂可能なリンカーと
して好ましい。なぜならば、酸不安定結合が3−HPAマ
トリックス溶液を添加すると核酸のコンディショニング
中に開裂するからである。酸不安定結合を別のリンカー
基、例えば酸不安定トリチル基として導入することがで
き、またはジイソプロピルシリルを用いて1つもしくは
それ以上のシリルインターヌクレオシド架橋を導入し、
ジイソプロピル結合オリゴヌクレオチドアナログを形成
することにより合成核酸リンカー中に組み入れることも
できる。DNA骨格中のホスホジエステル結合をジイソプ
ロピルシリル架橋で置換し、穏和な酸性条件下で、例え
ば1.5%トリフルオロ酢酸(TFA)または3−HPA/1%TFA
MALDI−TOFマトリックス溶液の条件下でDNA分子中に
1つもしくはそれ以上の鎖内切断が導入される。ジイソ
プロピルシリル結合オリゴヌクレオチド前駆体及びアナ
ログを製造する方法は当業者に公知である(例えば、Sa
haら,J.Org.Chem.,58:7827−7831(1993)を参照された
い)。前記オリゴヌクレオチドアナログは、ジイソプロ
ピルシリル誘導化デオキシリボヌクレオシドを用いる固
相オリゴヌクレオチド合成により容易に製造され得る。
を修飾した核酸を使用することができる。3'−または5'
−末端以外の位置でヌクレオチドの糖部分を修飾するこ
とは慣用の方法を用いて可能である。また、核酸塩基の
修飾は、例えばF.Eckstein編、Oligonucleotides and
Analogues:A Practical Approach",,IRL Press(1
991)に記載されているように、例えばdTのC−5をリ
ンカーアームで修飾することにより実施し得る。前記し
たリンカーアームはチオール部分を含むように修飾され
得る。或いは、骨格修飾核酸(例えば、ホスホルアミダ
イトDNA)を用いて、チオール基を修飾ホスフェート骨
格により付与される窒素中心に結合させることができ
る。
修飾させても、核酸または核酸配列のその相補体にハイ
ブリダイズする能力は実質的に損われない。従って、好
ましい修飾は、ワトソン・クリック塩基対に関与する核
酸の官能性を実質的に変化するのを避けるべきである。
核酸は非末端チオール基が存在するように修飾され得、
核酸は支持体に固定化したときに自己相補的塩基対を形
成して二重らせん領域を有するヘアピン構造を形成でき
る。
として、非限定的にビーズ(シリカゲル、一定の孔を有
するガラス(controlled pore glass)、磁気ビーズ、
セファデックス/セファロースビーズ、セロルースビー
ズ等)、毛細管、平坦な支持体、例えばガラス繊維フィ
ルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、ア
ルミニウム、シリコン及び銅)、(例えば、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフ
ルオリド製の)マルチウェルまたは膜を含めたプラスチ
ック材料、ウェハ、コム、ピン(例えば、組合せ合成ま
たは分析に適したピンのアレー)、または任意にフィル
タープレートを有する平坦な表面、例えばシリコンウェ
ハのようなウェハのピット中のビーズが例示される。
IR、蛍光、化学発光を用いて、またはNMR分光分析、質
量分析、または当業界で公知の他の方法を用いて、また
はこれらを組み合わせて分析され得る。好ましい質量分
析計フォーマットにはイオン化(I)、例えばマトリッ
クスによるレーザー脱離(MALDI)、連続もしくはパル
スエレクトロスプレー(ESI)及び関連方法(例えば、
イオンスプレーまたはサーモスプレー)、または塊状ク
ラスター衝撃(MCI)が挙げられる。これらのイオン源
は、線形もしくは非線形リフレクトロン飛行時間(TO
F)、4倍もしくはその倍数、1個もしくはそれ以上の
磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴
(FTICR)、イオントラップ、及びハイブリッド検出基
を与えるこれらの組み合わせ(例えば、イオントラップ
/飛行時間)を含めた検出フォーマットと一致させるこ
とができる。イオン化のために、複数のマトリックス/
波長の組み合わせ(MALDI)または溶媒の組み合わせ(E
SI)を使用することができる。
レーを作成する方法及びシステムを提供する。例えば、
診断ツールによる分析用サンプル材料のアレーを作成す
る1つのシステムが図1に示されている。図1に示すシ
ステム10は、データ処理装置12、モーションコントロー
ラ14、ロボットアームアセンブリ16、モニター要素18
a、中央処理装置18b、ソース材料の微量滴定プレート2
0、ステージハウジング22、ロボットアーム24、ステー
ジ26、圧力コントローラ28、管路30、マウンティングア
センブリ32、ピンアセンブリ38及びサブストレート要素
34を含む。図1に示す概略図においては、ロボットアー
ムアセンブリ16が可動マウント要素40及び水平スライド
溝42を含み得ることが示されている。ロボットアームは
場合によりピン36の周りを旋回することができ、これに
よりアーム24の移動範囲が広がり、アーム24はピンアセ
ンブリ38をソースプレート上に配置することができる。
ロボットアセンブリ16の動作及び操作を制御するための
情報を与えるプログラム指示を実行するのに適したIBM
PC互換性コンピュータシステムのような慣用のデジタ
ルデータ処理システムでよい。当業者には自明のよう
に、データ処理装置12は、ロボットハウジング16に統合
されているロボットアセンブリを操作する指示信号のプ
ログラムを処理するのに適していれば任意のものであり
得る。場合により、データ処理装置12は、ロボットハウ
ジング16に統合されているマイクロコントロール式アセ
ンブリであり得る。別の代替実施態様例では、システム
10はプログラム制御されなくてもよく、ロボットアセン
ブリ16を操作するための指示を保存するファームウェア
メモリを有するシングルボードコンピュータであっても
よい。
理装置12とロボットアセンブリ16とを電子的に接続して
いる。図示のコントローラ14は、ロボットアーム24を特
定位置に配置するためにロボットアセンブリ16のモータ
要素を駆動させるモーションコントローラである。ま
た、コントローラ14は、図示のピンアセンブリ38の各ピ
ン要素から放出される流体容量を調整すべく圧力コント
ローラ28に対して命令するためにロボットアセンブリ16
に指示を与えることができる。図示のモーションコント
ローラ14のデザイン及び構造は電気工学の分野で周知の
原理に従い、本発明の範囲を逸脱しないでロボットアセ
ンブリ16を駆動させるのに適した任意のコントローラ要
素を使用することができる。
に電子的に接続している。図示のロボットアセンブリ16
は、ロボットアームをXY面の周りに移動させるためのXY
テーブルを含み、更にロボットアームをXY面に対して直
交方向に移動させるためのZ軸アクチュエータをも含む
ガントリーシステムである。図1に示すロボットアセン
ブリ16は、XYステージに取り付けられるアーム24を含
み、このアームはXYアクセスにより規定される面内を移
動する。図示の具体例では、XYテーブルは、XY面に対し
て直交方向のZ軸に沿ってテーブル全体を移動させるた
めにZ軸アクチュエータに取り付けられている。こうし
て、ロボットアセンブリは、サブストレート34及びソー
スプレート20の上の任意の位置にピンアセンブリ38を配
置することができる3自由度を有する。なお、図1にお
いてサブストレート34及びソースプレート20はロボット
アセンブリ16に取り付けられたステージ26上に置かれて
いる。
の原理に従い、図示のサブストレート34のようなサブス
トレート及びソースプレートに隣接した位置にピンアセ
ンブリを移動させるのに適したロボットアセンブリの1
例にすぎない。従って、当業者には自明のように、本発
明の範囲を逸脱しないで本明細書の記載に従って別のロ
ボットシステムを使用することができる。
センブリ38に接続したマウント32に管路30を介して連結
している圧力コントローラ28を含む。この具体例では、
マウント32は、管路30をピンアセンブリ38に流体的に接
続させるために内部チャネルを含んでいる。従って、圧
力コントローラ28は、管路30及びマウント32を介してピ
ンアセンブリ38に流動的に連結している。こうして、コ
ントローラ14は、ピンアセンブリ38に対して加えられる
流体圧力を選択的にコントロールするために圧力コント
ローラ28に対して信号を送ることができる。
ムを用いて実施するのに適したピンアセンブリ50の1具
体例を示す。図示した具体例では、ピンアセンブリ50は
上部ブロック52と下部ブロック54から形成されるハウジ
ングを含み、前記した上部ブロック52と下部ブロック54
とはスクリュー56a及び56bにより連結され、こうして内
部チャンバ58が規定される。図2には更に、内部チャン
バ58を流体的にシールするためにハウジングがシール要
素を含み得ることが示されており、図2において該シー
ル部材は上部ブロック52と下部ブロック54との間に位置
し且つ内部チャンバ58の周囲を完全に包囲するOリング
ガスケット60として示されている。図2には更に、ピン
アセンブリ50が複数のベシクル62a−62dを含み、各ベシ
クルはその中を通り抜けてのびる軸方向の孔を含んでお
り、こうして図示の保持チャンバ64a−64dが形成されて
いることが示されている。図示のベシクルの各々は、ハ
ウジングの下部ブロック54内に設けられているそれぞれ
の孔68a−68dを介して延びている。
各々はシール要素70a−70dにのるように置かれた上部フ
ランジ部分を有しており、こうしてベシクルと下部ブロ
ック54との間に流密性シールが形成され、孔68a−68dを
通って流体が流れるのが防止される。流密性を保つため
に、図示のピンアセンブリ50は更に1組のバイアス要素
74a−74dを含み、図2において該バイアス要素はスプリ
ングとして示されており、このスプリングは図示の具体
例においてベシクル62a−62dのフランジ要素をそれぞれ
のシール要素70a−70dに対して押しつけるために圧縮状
態にある。図2に示すように、バイアス要素74a−74dは
ベシクルと上部ブロック52との間に延びている。スプリ
ング74a−74dの各々はマウンティングパッド76a−76dに
固定的に取り付けられており、このパッドでスプリング
要素は上部ブロック52に接続され得る。上部ブロックは
更に孔部78をも含み、図2において該孔部78は中央に配
置されており、孔部78内に回転自在に載置され得るスエ
ージロック(swagelok)80を受容するためのねじ付き径
を含む孔として示されている。
管路によりバルブ82に取り付けられており、このバルブ
82を介してスエージロック80は圧力源に連結され得る管
路84に接続され得るか、またはスエージロック80は内部
チャンバのガス抜きのために設けられる管路86に連結さ
れ得る。中央径88は、スエージロック80を通り抜けて延
びており且つチューブ要素に連結しており、チューブ要
素は更にバルブ82に接続しており、これにより内部チャ
ンバ58は圧力源またはガス抜き出口に流動的にまた選択
的に連結される。
要素90上に配置されており、このサブストレート要素90
はサブストレート90の上表面をエッチングして形成され
る複数のウェル92を含む。図2に示すように、ベシクル
62a−62dのピッチは、各ベシクルと隣接のベシクルとが
サブストレート90の上表面をエッチングして形成される
ウェル92間のピッチ距離の倍数である距離だけ離れてい
るようなピッチである。以下の記載から明らかなよう
に、このスペースにより流体を並行して分配するのが容
易となり、1回の操作で流体を複数のウェルに分配する
ことができるようになる。各ベシクルは、ステンレスス
チール、シリカ、ポリマー材料または流体サンプルを保
持するのに適した他の材料から構成され得る。1つの例
では、ニッケルプレートに金メッキした硬化ベリリウム
銅からなる16個のベシクルがアセンブリに使用されてい
る。このベシクルの長さは43.2mmであり、ベシクルの軸
の外径0.46mmに目盛がつけられており、軸の先端は凹状
である。ポインティング精度が約501μmであるように
ピンを選択した。しかしながら、適当な形状、例えばこ
れに限定されないが平坦な形、星形、凹形、山形中実
形、山形半中空形、片側もしくは両側傾斜形(angled o
n one or both sides)またはその他の幾何学的形状の
ピンがデバイスに使用され得ることは自明である。
ク54を側面から透視した図である。図3は1つのピンア
センブリをほぼ同寸で示す。図示するように、下部ブロ
ック54は底部プレート98と周囲ショルダー100を有す
る。底部プレート98の厚さは約3mmであり、ショルダー1
00の厚さは約5mmである。
るのに適した1つの下部ブロック54の一般的な構造及び
大きさを上から透視した図である。図4に示すように、
それぞれがベシクルを収容するのに適した16個の孔を設
けるために下部ブロック54は孔68の4×4マトリックス
を含んでいる。図2を参照して上記したように、孔68間
のスペースは通常、サブストレート表面上のウェル間及
びソースプレートのウェル間の距離の倍数である。従っ
て、図4に示す下部ブロック54を有するピンアセンブリ
は流体を最高16個のウェルに同時に分配することができ
る。図4には、ブロック54の各辺の長さが通常22mmであ
り、孔68の間のピッチが約4.5mmであるような1つの下
部ブロック54の一般的な大きさが示されている。前記し
たピッチは、図2にサブストレート90で示すように流体
を約500μm離れた位置に分配するサブストレートと一
緒に使用するのに適している。図4には、下部ブロック
54が、図2に示すシール要素60のようなOリングシール
要素を収容するためのOリング溝94を任意に含み得るこ
とをも示している。このO溝部材94によりシール要素60
により形成される流体シールが強化・改良され得ること
が理解される。
きるので、ピンブロックはステンレススチールから製造
され得るが、G10ラミネート、PMMAまたは他の適当な材
料のような各種プローブ材料も使用することができる。
ピンブロックは任意の数の孔を含み得、16個のピンを適
所に保持する16個の容器と示されている。各ピンのポイ
ンティング精度を高めるために、アライメントプレース
を、ピンの先端の約6mmが微量滴定プレートのウェルに
浸漬し得るようにブロックの下に任意に配置することが
できる。図示のツール中のプローブの配置は、384ウェ
ルの微量滴定プレートを適当に配置するように設計され
ており、この場合プローブの中心間スペースは4.5mmと
なる。4×4プローブのアレーを選択した。なぜなら
ば、このアレーは本出願人が使用したMALDI TOF MSの
xyステージの移動距離である1インチ平方未満に適合す
るからである。デバイスの頂部にステンレススチール製
カバーを設けることによりピンアセンブリは完成し、こ
れはロボットのZアームに取り付けられる。
アセンブリ50と類似の配置を有するピンツールアセンブ
リ38を使用している。圧力コントローラ28は、チャンバ
58内の圧力を選択的にコントロールする。この具体例で
は、コントロールプログラムは、ロボットアセンブリ16
がサブストレート34上に要素アレーをプリントするよう
にロボットアセンブリ16を制御するようにデータ処理装
置で作動する。
ンブリ16に命令して、ピンアセンブリ38を動かしてソー
スプレート20上に配置させ得る。次いで、ロボットアセ
ンブリ16は、384ウェルのDNAソースプレートであり得る
ソースプレート20にピンアセンブリを浸漬する。図4に
示すように、ピンアセンブリは、ピンアセンブリ50が16
個のピンを384ウェル−DNAソースプレートの16個の異な
るウェルに浸漬するように16個のピンを含み得る。次い
で、データ処理装置12はモーションコントローラ14に命
令して、ロボットアセンブリ16を操作してピンアセンブ
リを動かし、サブストレート34の表面上に配置され得
る。サブストレート34は材料のサンプルを受容するのに
適した任意のサブストレートであり得、シリコン、プラ
スチック、金属または他の適当な材料から形成され得
る。場合により、サブストレートは平坦な表面を有する
が、ピット付き表面、ウェルを有するエッチングされた
表面または他の適当な印刷面をも含み得る。次いで、デ
ータ処理装置12で作動するプログラムはロボットアセン
ブリを命令し、モーションコントローラ14を介して圧力
コントローラ28に指示して内部チャンバ58内に正圧を生
成する。この場合、内部チャンバの正圧により、ベシク
ル62の保持チャンバからの流体に圧力が加えられ、流体
はベシクルからサブストレート90の各ウェル92に放出さ
れる。
ローラ14に命令して、圧力コントローラ28をコントロー
ルして保持チャンバのソースプレート20由来のソース材
料による充填を制御する。圧力コントローラ28は、ピン
アセンブリの内部チャンバ内に負圧を生じさせ得る。こ
うすると、流体はベシクル62a−62dの保持チャンバに抜
き取られる。圧力コントローラ28は、流体が保持チャン
バから流出して内部チャンバ58にこぼれ出るのを避ける
ために開ループまたは閉ループ制御により圧力を調節す
ることができる。圧力をコントロールするためのループ
制御システムは当業界で公知であり、任意の適当なコン
トローラを使用することができる。特にソースプレート
20から抜き取られたソース材料がウェル毎に異なる場合
には、前記のように溢出物により相互汚染が生じ得る。
々は十分に小さく、チャンバを毛管作用により充填でき
る。この実施例では、ピンアセンブリは、下部ブロック
54の孔を通り抜けて延びる細い径ニードル、例えばステ
ンレススチールニードルのアレーから構成される。ソー
ス溶液に浸漬したニードルは毛管作用により充填され
る。1つの実施例では、大気圧下で充填される毛細管の
長さは、ほぼ下記式により決められる。
は重力、Rはニードルの半径を示す。各ベシクルにより
保持される流体の容量は、内径の直径を選択することに
より調整され得る。室温において水は半径100μmの毛
細管に長さ15cmまで充填されることに留意されたい。よ
って、短い径ナノリッターニードルは十分容量まで満た
すであろうが、毛管力が十分に小さく、ニードルオリフ
ィスの上部にメニスカスが形成されると考えられるので
溢出することはない。これにより、溢出物による相互汚
染が防止される。1つの具体例では、ピンアセンブリの
ベシクルは、容量の異なる流体を保持し分配するために
サイズの異なる内部チャンバを備えることができる。
れる液体容量を減らすために、わずかに正の圧力を圧力
コントローラ28により内部チャンバ58内に加えることが
できる。正圧により形成される下向きの力を用いて、上
向きの毛管力を相殺することができる。このようにし
て、毛管作用によりベシクルの保持チャンバに抜き取ら
れる流体の容量が調整され得る。
ジロック80を通り抜けて延びる中央径88を介して加えら
れるわずかに正の圧力により分配されることが示されて
いる。内部チャンバ58に加えられる正圧を調整すること
により、流体はスプレーとしてまたはニードル先端での
液滴形成により放出され得る。液滴対スプレーの分配比
率を左右する1因は圧力コントローラ28により加えられ
る圧力である。1つの具体例では、10〜1000トル大気圧
の圧力が加えられる。
容量を制御し調整するコンピュータプログラムを動かす
ことができる。前記プログラムはコントローラ28に命令
して、特定量の流体をスプレーを生成するかまたはベシ
クルの末端で液滴を形成することにより放出させ、前記
プログラムはサブストレート表面に流体を分配させるた
めにサブストレート表面を接触させることができる。
施し得ることが示されている。ただし、ここでのサブス
トレート表面上の位置は初期の位置とはずれている。図
示した方法では、ピンツールは、2つのウェル92間の距
離に等しい距離だけずれている。本発明の範囲を逸脱し
ないで他のオフセット印刷技術を使用することができる
ことは自明である。
れることは十分理解される。例えば、分配操作の間のす
すぎが簡単であり、1回もしくはそれ以上のピンの充填
及びすすぎ溶液による排出操作のみを必要とするだけで
ある。また、保持チャンバすべてが十分容量まで充填さ
れるので、分配される容量の精度がニードルの内径によ
つてのみ異なるだけである。なお、ニードルの内径はピ
ン作成中に注意深くコントロールされ得る。更に、デバ
イスが費用効果的である。デバイスの中で最も高価なの
はニードルであるが、ニードルは表面と接触させる必要
がないので、ニードルはほとんど物理的歪みもしくは応
力を受けず、取り替え回数を減らし寿命を長くするから
である。
る方法として、ブロックから伸長している固体ピン要素
を有するピンツールアセンブリを使用する方法が例示さ
れ、この方法ではロボットアームがピンアセンブリの固
体ピン要素をサンプル材料のソースに浸漬し、ピンの遠
位端部をサンプル材料で湿らす。次いで、ロボットアセ
ンブリはピンアセンブリをサブストレート上のある位置
に移動させた後、ピンアセンブリをサブストレート表面
に当たるまで下げて、湿らせたピンのそれぞれをサブス
トレート表面の材料をスポットさせるための表面に当た
るように接触させる。
に対して材料を分配するための別の代替システムを示
す。特に、図6Aは、毛細管要素112、トランスデューサ
要素114及びオリフィス(図示せず)118、流体導管122
及びロボットアームアセンブリに連結するマウント12
4、例えば図1に示すロボットアーム24を含むジェット
印刷デバイス110を示す。図6Aに更に示すように、ジェ
ットアセンブリ110はオリフィス118からサンプル材料の
液滴120を放出してサンプル材料を表面128上に沈着させ
るのに適している。
管、プラスチック毛細管、または流体サンプルを運ぶこ
とができ、流体サンプルをトランスデューサ要素、例え
ばトランスデューサ要素114の作用により放出させるこ
とができる他の適当なハウジングであり得る。図6Aに示
すトランスデューサ要素114は、毛細管112のパラメータ
ーの周りに形成し且つロボットアセンブリ16内のパルス
発生装置から受けた電気パルスを変換して流体を毛細管
112のオリフィス118から放出させ得る圧電トランスデュ
ーサ要素である。圧電トランスデューサ要素を有するジ
ェットアセンブリの1つは、ドイツのMicroFab Techno
logy,Inc.で製造されている。しかしながら、調整され
た特定量の流体を分配するのに適したジェットアセンブ
リを本発明で使用することができ、例えば圧電トランス
デューサ、電気トランスデューサ、電気制御トランスデ
ューサ、磁気制限トランスデューサ、電気機械トランス
デューサまたは他の適当なトランスデューサ要素を使用
することができる。図示した具体例では、毛細管112は
流体材料を受容するための流体導管122を有している。
任意の具体例では、オリフィス118が流体材料ソースに
沈められたときオリフィス118を介して流体を抜き取る
真空圧の作用により、流体を毛細管に抜き取ることがで
きる。本発明の範囲を逸脱しないで他のジェットアセン
ブリ110を本発明で使用することができる。
ンブリ1のロボットアームで実施されるpに適当な別の
代替アセンプリを示す。図6Bは、相互に接続した4つの
ジェットアセンブリ130a−130dを示す。図2に示すピン
アセンブリと同様に、図6Bに示すジェットアセンブリを
流体材料を並行して分配するために使用することができ
る。電気工学の当業者には自明のように、特定のジェッ
トアセンブリから流体を選択的に分配するためにジェッ
トアセンブリ130a−130dの各々は他とは独立して操作さ
れ得る。また、ジェットアセンブリ130a−130dのそれぞ
れから分配される流体の容量を選択するために各ジェッ
トアセンブリ130a−130dは独立して制御され得る。本発
明の範囲を逸脱しないで図6Bに示すアセンブリに改変及
び変更を加えることができる。
のために、サンプルアレーを上記したいずれかの方法に
従ってサブストレート表面上に形成することができる。
次いで、サンプルアレーを質量分析法により分析して、
アレー中のサンプルの組成を示すスペクトルデータを集
める。上記した方法により調整された特定量の分析対象
材料を迅速に分配できる方法が提供されることが理解さ
れる。特に、この方法によりナノリッター以下〜低ナノ
リッターの容量の流体を分配することができる。こうし
た低容量の分配方法により、質量分析に十分適したサン
プルアレーが作成される。例えば、低容量であればスポ
ット諸特性、例えば蒸発速度及び室温や光のような大気
条件に対する低依存性が再現可能となる。
濃度が異なるオリゴヌクレオチド(0.1〜50ng/lll)を9
6ウェル−微量滴定ソースプレート20のウェルに充填す
ることにより作成され得る。第1ウェルはマトリックス
容器を保持するために残しておくことができる。サブス
トレート34、例えばピット付シリコンチップサブストレ
ートをロボットアセンブリ16のステージ26上に置くこと
ができ、1組の基準軸の周りにウェルのマトリックスを
配向させるために手動で整列させることができる。デー
タ処理装置12で実行するコントロールプログラムは、ソ
ースプレート20の第1ウェルの座標を受け取ることがで
きる。ロボットアーム12により、16個のピンの各々がウ
ェルの1つに沈むようにピンアセンブリ38をソースプレ
ート20に浸すことができる。各ベシクルは毛管作用によ
り満たすことができ、こうして保持チャンバの全体が流
体を収容する。場合により、データ処理装置12で実行す
るプログラムは圧力コントローラを命令して、保持チャ
ンバに抜き取られる流体の容量を制限または低減させる
べく毛管作用の力を部分的に補償する(offset)正のバ
イアス力でピンアセンブリ38の内部チャンバ58を満た
す。
同じ16個のウェルに浸し、第2の標的サブストレートに
スポットすることができる。このサイクルを所望の数の
標的サブストレートに対して繰り返すことができる。そ
の後、ロボットアーム12はピンアセンブリ38を洗浄溶液
に浸し、次いでピンアセンブリをソースプレート20の別
の16個のウェルに浸し、最初の組の16個のスポットから
ある距離ずれたサブストレート標的上にスポットするこ
とができる。この操作も所望の数の標的サブストレート
に対して繰り返すことができる。全サイクルを繰り返し
て、各ベシクルから2×2アレーを作成し、8×8アレ
ーのスポットを作成することができる[(2×2要素/
ベシクル)×16ベシクル=64個のスポットされたエレメ
ント]。しかしながら、本発明の範囲を逸脱しないでア
レーを作成するのに適した方法を本発明で実施すること
ができることは当業者に自明である。
枚の別々の384ウェル−微量滴定ソースプレートのウェ
ルに充填することができる。16ウエルの1組をマトリッ
クス溶液用に残しておくことができる。2枚のプレート
のウェルに洗浄溶液を充填する。5枚の微量滴定プレー
トをロボットアセンブリ16のステージ上に載せることが
できる。複数の標的サブストレートを、ステージ26上に
載置した任意の組のバンキングもしくは位置決めピンに
隣接して配置することができ、1組の基準軸に沿って標
的サブストレートを整列させるためのものである。マト
リックス及びオリゴヌクレオチドが予め混合されていな
いときには、所望する標的サブストレートすべてに対し
てまずマトリックス溶液をスポットするためにピンアセ
ンブリを使用することができる。後続段階において、オ
リゴヌクレオチド溶液をマトリックス材料と同じパター
ンでスポットし、マトリックスを再溶解することができ
る。或いは、ウェハ上にまずオリゴヌクレオチド溶液、
次いでマトリック溶液を供給するか、またはマトリック
ス溶液とオリゴヌクレオチド溶液を予め混合することに
よりサンプルアレーを作成することができる。
後、アレーを各種手段(例えば、UV/VIS、IR、蛍光、化
学発光、NMR分析法または質量分析法のような分光分析
法)を用いて分析することができる。例えば、分配プロ
セス後、サンプルを供給したサブストレートをMALDI−T
OFソースプレート上に配置し、そこにベベルスクリュー
付きポリカーボネート支持体を用いて保持する。1つの
例では、プレートをプローブの端部に移して飛行時間型
質量分析計のソース領域の1μm分解能、1"行程xyステ
ージ(Newport)上に保持する。本発明の範囲を逸脱せ
ずに適合な質量分析計を本発明で使用することができる
ことは当業者には自明である。
フォーマットにはイオン化(I)方法が含まれ、この非
限定例としてマトリックスによるレーザー脱離(MALD
I)、連続もしくはパルスエレクトロスプレー(ESI)及
び関連方法(例えば、イオンスプレーまたはサーモスプ
レー)、または塊状クラスター衝撃(MCI)が含まれ
る。これらのイオン源は、線形もしくは非線形リフレク
トロン飛行時間(TOF)、4倍もしくはその倍数、1個
もしくはそれ以上の磁気セクター、フーリエ変換イオン
サイクロトロン共鳴(FTICR)、イオントラップ及びこ
れらの組み合わせ(例えば、イオントラップ/飛行時
間)を含めた検出フォーマットと調和させることができ
る。イオン化のために、複数のマトリックス/波長の組
み合わせ(MALDI)または溶媒の組み合わせ(ESI)を使
用することができる。例えば、ESI(Valaskovic,G.A.
ら、Science,273:1199−1202(1996))またはMALDI(L
i,L.ら、J.Am.Chem.Soc.,118:1662−1663(1996))質
量分析法を用いて10-18モル以下のレベルのタンパク質
を検出できた。
部分接触の低圧液滴形成モードを使用できることが理解
される。後者のモードでは、液滴とウェルの壁またはサ
ブストレート34の親水性の平坦な表面との間のみが接触
している。いずれにおいてもニードル先端と表面との接
触は必要でない。
官能基で官能化することにより[例えば、支持体を3−
アミノプロピルトリエトキシシラン(ウィスコンシン州
ミルウォーキーに所在のAldrich Chemical Co.,)の
ような試薬を用いて誘導化することにより]、核酸分子
を該支持体上に共有結合させることができる。他の官能
化されたオキシシランまたはオルトシリケートを使用す
ることもでき、これらは例えばペシルバニア州Tullytow
nに所在のGelest,Inc.から市販されている。例えば、3
−メルカプトプロピルトリエトキシシランを使用してシ
リコン表面をチオール基で官能化することができる。次
いで、アミノ官能化シリカをヘテロ二官能性試薬、例え
ばN−スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノ
ベンゾエート(SIANB)(イリノイ州ロックフォードに
所在のPierce)と反応させることができる。使用可能な
他のホモ−もしくはヘテロ−二官能性試薬は例えばPier
ceから市販されている。最後に、(例えば、5'−末端
が)チオール基で官能化された核酸は、核酸分子のチオ
ール官能基と支持体のヨードアセチル官能基との反応に
より誘導化されたシリカ支持体に共有結合する。
剤/核酸結合体を形成し、次いでこれを官能化支持体と
反応させて、固定化された核酸を得ることができる。代
替方法として、架橋剤を核酸及び官能化固体支持体とを
1つの容器で合わせて、架橋剤と核酸及び固体支持体を
実質的に同時に反応させることもできる。この実施態様
では、通常ヘテロ二官能性架橋剤、即ち核酸及び官能化
固体支持体のいずれかと選択的に反応し得る2つの異な
る反応性官能基を有する架橋剤を使用する必要がある。
空間的アドレス可能なアレーを作成するために有用であ
る。例えば、本発明方法は、アレーに配列されたピン上
に固定化された異なる核酸のアレーを作成することがで
きる。別の実施態様では、固体支持体上の光開裂可能な
保護基を(例えば、写真平版により)選択的に開裂させ
て、核酸の固定化のための活性化された表面部分を得る
ことができる。例えば、チオール基を与えるべく3−メ
ルカプトプロピルトリエトキシシランで処理して修飾さ
せたシリコン表面を光開裂性保護基(光開裂性保護基の
例については、例えばPCT国際公開WO92/10092、またはM
cCrayら、Ann.Rev.Biophys.Biophys.Chem.,18:239−270
(1989)を参照されたい)でブロックすることができ、
表面の特定領域を例えば写真平版マスクを用いて照射す
ることにより選択的に脱ブロックすることができる。次
いで、チオール反応性基を含むように修飾された核酸は
支持体に直接結合させることができ、またはチオール反
応性架橋剤をチオール修飾支持体と反応させた後(また
は実質的に同時に)核酸と反応させて、固定化核酸を得
ることできる。本発明方法に従って支持体上に固定化さ
れた核酸塩基または配列を更に公知の方法により修飾す
ることができる。例えば、組合わせ技術を含めた慣用技
術に従って固相核酸合成を実施することにより核酸配列
を延長させることができる。
酸を少なくとも1個の硫黄原子を介して不溶性支持体の
表面に共有結合させる。すなわち、核酸を少なくとも1
個の硫黄原子を含むリンカー部分を介して表面に共有結
合させる。前記のように共有結合させた核酸は、本明細
書に記載の方法により容易に製造することができる。不
溶性支持体は、ハイブリダイゼーションや配列決定を含
めた各種用途で使用され得る。用途については実施例に
例示する。
少なくとも約20fmol/mm2、より好ましくは少なくとも約
75fmol/mm2、更に好ましくは少なくとも約fmol/mm2、も
っと好ましくは少なくとも約100fmol/mm2、最も好まし
くは少なくとも約150fmol/mm2の密度で不溶性支持体の
表面上に存在させる。
酸の組合わせライブラリーを提供する。
供する。1つの実施態様では、前記キットは適当量の
i)チオール反応性架橋剤及びii)表面を前記チオール
反応性架橋剤と反応し得る(好ましくはチオール以外
の)官能基で修飾するための表面修飾剤を含む。前記キ
ットは任意に、核酸を固定化する際に使用される不溶性
支持体、例えば磁性マイクロビーズのような固体表面を
含むことができる。前記キットは、核酸をチオール官能
基で修飾するための試薬をも含み得る。
オール部分で修飾するための試薬及び支持体のチオール
部分と反応し得るチオール反応性架橋剤を含む。特定実
施態様では、前記キットは核酸を固定化する際に使用さ
れる不溶性支持体、例えば磁性マイクロビーズのような
固体表面をも含むことができる。
するための容器及び/または使用指示書を含むことがで
きる。
支持体、例えば立体アドレスもしくは前アドレス可能な
アレーフォーマットの全表面を各種固相核酸化学用途
[この非限定例として、(化学的及び酵素的)核酸合
成、ハイブリダイゼーション及び/またはエクステンシ
ョンが挙げられる]または核酸検出及び多形性分析に基
づく診断方法[例えば、米国特許第5,605,798号明細
書]において使用することができる。従って、本発明は
更に核酸分子の反応方法をも提供し、この方法では、核
酸分子のチオール含有誘導体をチオール反応性基を含む
不溶性支持体と反応させることにより、またはチオール
含有不溶性支持体を核酸分子のチオール反応性基含有誘
導体と反応させ、その後更に固定化された核酸分子と反
応させることにより、核酸分子を表面上に固定化する。
化核酸またはその一部に相補的な核酸とハイブリダイズ
することにより反応させる。別の実施態様では、固定化
された核酸を更に、該固定化核酸またはその一部にハイ
ブリダイズされる核酸をエクステンションさせることに
より反応させる。このようなエクステンション反応は例
えば、本発明方法により不溶性支持体に固定化されたDN
A分子を配列決定する方法において使用することができ
る。従って、本発明はサブストレート上のDNA分子の配
列を決定する方法をも提供し、この方法では、DNA分子
のチオール含有誘導体をチオール反応性基を含有する不
溶性支持体の表面上に固定し、固定化DNAの一部に相補
的な一本鎖核酸とハイブリダイズし、その後1つもしく
はそれ以上のジデオキシヌクレオチドの存在下でDNA合
成を実施する。
ら実施例は単に例示にすぎず、本発明を限定するものと
解釈すべきでない。本明細書で引用した全ての文献(参
照文献、特許明細書、公開明細書及び係属中の特許出願
明細書を含む)の開示内容は本明細書中に援用されるも
のとする。
ウォーキーに所在のAldrich Chemicalから入手した。
ナーで殺菌し、トルエン中に25容量%の3−アミノプロ
ピルトリエトキシシランを含む無水溶液に3時間浸漬し
た。次いで、シラン溶液を除去し、ウェハをトルエンで
3回、ジメチルスルホキシド(DMSO)で3回洗浄した。
次いで、ウェハを無水DMSO中にN−スクシンイミジル
(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)
(イリノイ州ロックフォードに所在のPierce Chemica
l)の10mM無水溶液中でインキュベートした。反応後、S
IAB溶液を除去し、ウェハをDMSOで3回洗浄した。
ターすることは不可能であったので、反応を溶液中で実
施し、最適反応時間を調べた。2つの出発材料を分離で
きる95:5クロロホルム:メタノール(ニュージャージー
州フィリップスバーグに所在のBaker)を用いる薄層ク
ロマトグラフィー(TLC)(254nm蛍光インジケータを備
えたガラス裏打ちシリカプレート)(ニュージャージー
州フィリップスバーグに所在のBaker)を使用した。SIA
B出発材料は長波長紫外光(302nm)で可視化できた。3
−アミノプロピルトリエトキシシランは紫外光の下では
不活性であった。従って、プレートに第1級アミンと反
応するニンヒドリン溶液をスプレーすると、加熱により
紫色スポットが現れた。微量規模反応を、3−アミノプ
ロピルトリエトキシシランに比して僅かにモル過剰のSI
ABを使用してクロロホルム/DMSO中で実施し、上記TLC条
件でモニターした。
レオチド(カリフォメニア州アラメダに所在のOperon
Technologiesまたはオレゴン州ウィルソンビルに所在の
Oligo Etc.)由来のジスルフィドの還元を、逆相FPLC
(ニュージャージー州ピスカタウェーに所在のPharmaci
a)を用いてモニターした。シフトをジスルフィド開裂
時のオリゴデオキシヌクレオチドの保持時間で見ること
ができる。最適条件を調べるために各種還元方法を試験
した。1つの方法では、ジスルフィド含有オリゴデオキ
シヌクレオチド(31.5nmol,0.5mM)をpH8.0及び37℃で
ジチオトレイトール(DTT)(イリノイ州ロックフォー
ドに所在のPierce Chemical)(6.2mmol,100mM)とイ
ンキュベートした。開裂反応が実質的に完了したら、遊
離チオール含有オリゴデオキシヌクレオチドをChromasp
in−10カラム(カリフォルニア州パロアルトに所在のCl
ontech)を用いて単離した。なぜならば、DTTは後続の
反応で競合する恐れがあるからである。代替方法とし
て、トリス−(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TC
EP)(イリノイ州ロックフォードに所在のPierce Chem
ical)を使用してジスルフィドを開裂させた。ジスルフ
ィド含有オリゴデオキシヌクレオチド(7.2nmol,0.36m
M)をpH4.5の緩衝液中37℃でTCEPとインキュベートし
た。TCEPはヨードアセトアミド官能基と競合反応しない
ので、反応後生成物を単離する必要はなかった。開裂反
応のために各種濃度のTCEPを使用して結合反応のために
最適な条件を調べた。
に誘導化させた各ウェハに対して、100mMリン酸塩緩衝
液(pH8)中に遊離チオール含有オリゴデオキシヌクレ
オチドを含む10mM水溶液を添加した。反応を室温、100
%相対湿度で最低5時間実施した。反応後、オリゴデオ
キシヌクレオチド溶液を除去し、ウェハを50%ホルムア
ミド(オハイオ州クリーブランドに所在のUSB)を含む
5×SSC緩衝液(75MMクエン酸ナトリウム、750mM塩化ナ
トリウム、pH7)で2回洗浄した。
る相補的配列の量を測定するために、放射線標識したプ
ローブを使用した。5'−ジスルフィド含有オリゴデオキ
シヌクレオチドを固定化する場合、3'末端をターミナル
トランスフェラーゼ酵素及び放射線標識したジデオキシ
ヌクレオシドトリホスフェートを用いて放射線標識し
た。標準反応では、15pmol(0.6μM)の5'−ジスルフ
ィド含有オリゴデオキシヌクレオチドを、0.2mMの2−
メルカプトエタノールの存在下で50μCi(16.5pmol,0.6
6μM)の[α−32P]ジデオキシアデノシン−5'−トリ
ホスフェート(ddATP)(イリノイ州アーリントンハイ
ツに所在のAmersham)とインキュベートした。40単位の
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
酵素(オハイオ州クリーブランドに所在のUSB)を添加
し、反応を37℃で1時間実施した。その後、バイアルを
75℃の水浴に10分間浸漬することにより反応を停止し、
生成物をChromaspin−10カラム(カリフォルニア州パロ
アルトに所在のClontech)を用いて単離した。同様に、
5'−ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチドを35
Sで放射線標識した。
固定化する場合、5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼ
及び放射線標識したヌクレオシドトリホスフェートを用
いて放射線標識した。例えば、15pmol(0.6μM)の3'
−ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチドを、50
mMトリス−HCl(pH7.6)、10mM MgCl2及び10mM 2−
メルカプトエタノールの存在下で50μCi(16.5pmol,0.6
6μM)の[λ32P]アデノシン−5'トリホスフェート
(ATP)(イリノイ州アーリントンハイツに所在のAmers
ham)とインキュベートした。40単位のT4ポリヌクレオ
チドキナーゼを添加後、反応を37℃で1時間実施した。
バイアルを75℃の水浴に10分間浸漬することにより反応
を停止した。次いで、生成物をChromaspin−10カラム
(カリフォルニア州パロアルトに所在のClontech)を用
いて単離した。
に、特定のジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチ
ドを痕跡量の上記したように放射線標識した同じ物質に
添加した。ジスルフィドを開裂し、プローブをヨードア
セトアミド官能化したウェハに固定化し、ウェハを洗浄
後ホスホロイメージャー(phosphorimager)スクリーン
(カリフォルニア州サニーベールに所在のMolecular D
ynamics)にかけた。使用したそれぞれ異なるオリゴデ
オキシヌクレオチドに対して、オリゴデオキシヌクレオ
チドのモル量が既知の参照スポットをポリスチレン上に
作成した。3つの基準スポットを同様にホスホロイメー
ジャースクリーンにかけた。スクリーンを走査して、各
チップに結合したオリゴデオキシヌクレオチドの量(mo
le)を基準の特定活性に対してカウントを比較すること
により測定した。
NaCl及びTE緩衝液中に相補的配列(10μM)を含む溶液
を添加した。ウェハ及び溶液を75℃に加熱し、3時間か
けて室温まで放冷した。その後、溶液を除去し、ウェハ
をTE緩衝液で2回洗浄した。
るために、プローブをまず32Pよりむしろ35Sで標識する
こと以外は上記と同様にして固定化した。固定化したプ
ローブの密度をホスホロイメージャーを用いて測定し
た。次いで、同じウェハをTE緩衝液、1M NaCl及び32P
で放射線標識したその相補的鎖(10μM)中でインキュ
ベートした。上記したようにハイブリダイゼーションを
実施した。洗浄して非特異的結合を除去後、ウェハ及び
基準を、スクリーンをウェハの間に銅ホイルを有するホ
スホロイメージャーにかけた。32P信号は自由に通過し
得るが、35Sからの信号をブロックするために銅ホイル
を使用する。次いで、ハイブリダイズしたオリゴヌクレ
オチドのモル量を測定し、よってハイブリダイゼーショ
ンのために利用可能な共有的に固定化したプローブの割
合を示す。
キシヌクレオチド(名称TCUC;配列GAATTCGAGCTCGGTACCC
GG;分子量6455Da;配列番号1)を含有するウェハを合成
し、相補的配列(名称MJM6;配列CCGGGTACCGAGCTCGAATT
C;分子量6415Da;配列番号2)をハイブリダイズした。
ウェハをカチオン交換用50mMクエン酸アンモニウム緩衝
液中で洗浄してDNA骨格上のナトリウムイオン及びカリ
ウムイオンを除去した(Pieles,Uら,Nucl.Acids Res.,
21:3191−3196(1993))。3−ヒドロキシピコリン酸
のマトリックス溶液(3−HPA,50%アセトニトリル中0.
7M 10%クエン酸アンモニウム;Wu,K.J.ら,Rapid Comm
un.Mass Spectrom.,7:142−143(1993))をウェハ上
にスポットし、室温で乾燥させた。ウェハを、導電性テ
ープを用いてFinnigan MAT(ドイツのBremen)Vision2
000レフレクトロンTOF質量分析計のサンプルプローブに
直接取り付けた。レフレクトロンは5keVイオン源及び20
keVポストアクセレレーションを有する。窒素レーザー
を使用した。スペクトルはすべて正のイオンモードで得
た。
ハを3−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させ
て表面上に第1級アミノ基の均一層を形成した。図7に
示すように、次いで表面をヘテロ二官能性架橋剤に接触
して表面上にヨードアセトアミド基を形成した。TLCを
用いて、溶液中の上記反応の最適反応時間を決定するこ
とができた。SIAB架橋剤を長波紫外光(302nm)の下で
可視化すると、Rf値が0.58のスポットが見られた。3−
アミノプロピルトリエトキシシランは紫外光の下で不活
性であった。従って、ニンヒドリンを使用すると、基線
に第1級アミンが存在することを示す紫色スポットが現
れた。3−アミノプロピルトリエトキシシランに比して
僅かに過剰モルのSIABを使用して微量規模反応を実施し
た。約1分後のTLC分析で、長波長紫外光の下で目に見
えるRf値が0.28の新しいスポットが認められた。ニンヒ
ドリンをスプレーしても紫色スポットは生じず、よって
3−アミノプロピルトリエトキシシラン出発物質は全て
反応で消費された。UV光は、過剰のSIABは反応後残存し
ていることを示した。これらの結果から、約1分後に反
応は完了することが分かった。いずれの場合にも、不安
定なヨードアセトアミド官能基の加水分解を最小限とす
べくヨードアセトアミド官能化したウェハは直ちに使用
した。ヨードアセトアミド官能基は感光性であるので、
ウェハの取り扱いはすべて暗室で行った。
逆相FPLCでの保持時間のシフトを観察することによりモ
ニターした。DTT(100mM)またはTCEP(10mM)の存在下
で5時間後、ジスルフィドが遊離チオールに完全に還元
されたことが判明した。DTT反応をより長く実施した場
合、遊離チオールの対が反応してオリゴヌクレオチド二
量体が形成された。前記した二量化反応は、開裂反応が
完了後DTTを除去したときにも見られた。TCEPを開裂試
薬として使用したときには二量化反応は見られなかっ
た。なぜならば、この反応はpH4.5で実施されるので遊
離チオールは完全にプロトン化され、二量化が阻止され
るからである。
チドをヨードアセトアミド官能化ウェハとインキュベー
トした。チオールを完全に脱プロトン化させるために、
カップリング反応をpH8.0で実施した。このシリコンウ
ェハの化学により達成されるプローブ表面密度を放射線
標識プローブ及びホスホロイメージャーを用いて分析し
た。また、プローブ表面密度をジスルフィド開裂反応で
使用したTCEP濃度の関数としてモニターした(図8)。
ジスルフィドを開裂するために10mM TCEP及び上記した
他の反応条件を用いると、表面1mm2当たり250fmolの表
面密度を再現可能に得ることができた。オリゴヌクレオ
チドプローブがチオール修飾を欠いている以外は上記と
同じ実験を実施した。表面1mm2当たり5fmol未満の表面
密度では、図7に示すように非特異的結合は最小であ
り、プローブカップリングが起こりそうであることを示
す。
結合し、結合体密度を測定した後、32P標識オリゴヌク
レオチドのハイブリダイゼーションを実施した。ハイブ
リダイゼーション効率及び密度をホスホロイメージャー
及び銅ホイルを用いて測定した。銅フォイルは35S信号
の98.4%をブロックし、32P信号を十分に検出できるこ
とが実験的に判明した。相補的配列は再現可能にハイブ
リダイズして、表面1mm2当たり105fmolが生じた。これ
は、ハイブリダイゼーションに利用可能な結合プローブ
の約40%に相当する。このスキームで同様に非相補的配
列を使用した場合には、非特異的結合は表面1mm2当たり
5fmol未満であった。
の間の立体障害はハイブリダイゼーション効率を40%以
上阻害すると仮定される。このことを考慮して、スペー
サー分子をオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域の
末端と支持体との間に挿入した。選択したスペーサーは
長さが3〜25のポリdT配列であった。上記サンプルを放
射線標識及びホスホロイメージャーを用いて試験する
と、ハイブリダイゼーションが最高40%達成され得るこ
とが判明した。
ダイズし、サンプルを上記したような標準MALDI条件で
分析した。分析により、アニールした鎖(MJM6)のみが
質量/電荷数実験値が6415.4の質量スペクトルで観察さ
れた。質量/電荷数の理論値は6415である(図9)。64
55の質量/電荷数で信号はなかったが、ウェハ結合鎖
(TCUC)は脱離せず、よってヨードアセトアミド結合は
レーザーに耐えるに十分な安定性を有しており無傷のま
まであることが判明した。6262.0の質量/電荷数で別の
信号が観察された。この信号はグアノシンの脱プリン化
により生じた。なぜならば、DNAがMALDIプロセス中にプ
リン塩基の損失を受けやすいことは公知であるからであ
る(Nordoff,E.ら,Rapid Commun.Mass Spectrom.,6:
771−776(1992))。均一な分布は良好なスポットを得
るのに必要であったが、ウェハ上のサンプル結晶は均一
に分布されていなかった。この不均一性のために、質量
解像が変化するが、通常マススペクトルにおける脱離オ
リゴヌクレオチドの場合200〜300の範囲である。1連の
実験で、非相補的配列をウェハにハイブリダイズした。
上記したように洗浄後のMALDI−TOF MS分析により、信
号が検出されなかったことから非特異的アニーリングは
最小であることが分かった。
ラグメントを分析するために、SIAB結合シリコンウェハ
を使用した。
ムDNA鋳型(Genebank寄託番号Z52259;配列番号4)に相
補的である5'−ジスルフィド結合含有23量体オリゴデオ
キシヌクレオチド(Operon Technologiesから購入;配
列番号3)をプライマーとして、ゲノムDNAの5'末端部
分に相補的な市販の49量体プライマー(Operon Techno
logiesから購入;配列番号5)と一緒に使用し、DNA二
重らせん(配列番号6)の1本鎖にのみ結合させた5'−
ジスルフィド結合を含む135bpDNA産物を増幅させた。
タログ番号N808−0249)を用いて実施した。簡単に説明
すると、200ngの112bpヒトゲノムDNA鋳型を、製造業者
から提供された緩衝液中で10μMの23量体プライマー、
8μMの市販の49量体プライマー、10mMのdNTP類、1単
位のAmplitaq Gold DNAポリメラーゼとインキュベー
トし、PCRをサーモサイクラーで実施した。
記載したように10mMのTCEPを用いて還元して、遊離5'−
チオール基を生じさせた。遊離チオール基を含むDNA鎖
を、図7に本質的に概説するようにしてSIABリンカーを
介してシリコンウェハの表面に結合させた。
相補的12量体オリゴヌクレオチド(配列番号7)とイン
キュベートし、特異的にハイブリダイズしたDNA断片をM
ALDI−TOF MS分析により検出した。質量スペクトル
は、質量/電荷数の実験値が3618.33の信号を示した。1
2量体オリゴマー配列の質量/電荷数の理論値は3622.4D
aである。
的分子を増幅させることができる。この分子を本明細書
に記載の方法を用いてSIAB誘導化シリコンウェハに固定
し、特定の相補的オリゴヌクレオチドを前記標的分子に
ハイブリダイズし、MALDI−TOF MS分析法を用いて検出
することができる。
リポタンパク質E遺伝子の検出のための固定化鋳型のハ
イブリダイゼーション、プライマーエクステンション及
び質量分析を記載する。本実施例では、特定配列を含む
固定化DNA分子を、非標識アレレ特定プライマーのプラ
イマーエクステンション及びエンステンション産物の質
量分析法による分析を用いて検出、区別できることを立
証する。
質E遺伝子のアレレ3のコーディング配列に相補的な50
塩基合成DNA鋳型: またはコドン158にG→Aトランジッションを有する突
然変異アポリポタンパク質E遺伝子に相補的な50塩基合
成DNA鋳型: をカップリングして、図7に本質的に概説し、実施例1
及び2に記載したSIAB誘導化シリコンウェハを分離し
た。
のキット(例えば、U.S.Biochemical Corp.のシークエ
ナーゼまたはサーモシークエナーゼ)を用いて延長させ
た。製造業者の指示に従って緩衝液中、3つのデオキシ
リボヌクレオシドトリホスフェート(dNTPs;dATP,dGTP,
dTTP)及びジデオキシリボヌクレオシドシトシントリホ
スフェート(ddCTP)の存在下でシークエナーゼDNAポリ
メラーゼまたはサーモシークエナーゼDNAポリメラーゼ
を添加すると、野生型アポリポタンパク質E遺伝子をコ
ードする固定化鋳型に結合した21量体プライマーが1塩
基延長し、突然変異型アポリポタンパク質E遺伝子をコ
ードする固定化鋳型に結合した21量体プライマーが3塩
基延長した。
析した。野生型アポリポタンパク質E配列では、質量/
電荷数が6771.17Da(質量/電荷数の理論値6753.5Da)
の1塩基延長したプライマー(22量体)を質量/電荷数
が6499.64Daの元の21量体プライマーを区別する質量ス
ペクトルが生じた。突然変異型アポリポタンパク質E配
列では、質量/電荷数が7386.9Da(質量/電荷数の理論
値7386.9Da)の3塩基延長したプライマー(24量体)を
質量/電荷数が6499.64Daの元の21量体プライマーを区
別する質量スペクトルが生じた。
ために、ロボット駆動式連続及び並行pL−nL分配ツール
を用いて平坦なまたは幾何学的に変更を加えた(例え
ば、ウェルを有する)表面を有する<1平方インチチッ
プ上に10〜103エレメントDNAアレーを作成した。前者で
は、圧電ピペット(内径70μmの毛細管)で〜0.2nlの
マトリックス液滴をチップ上に一回もしくは複数回分配
した後分析した。この方法を用いて、0.2fmol程度の36
量体DNAからスペクトルを得た。急速に(<5秒)蒸発
するが、分析対象物を含む3−ヒドロキシピコリン酸マ
トリックスの微結晶が通常生成され、よって大容量作成
で通常得られるよりも高い再現性が得られた。100個の8
00μmウェル中の5fmolの23量体のスポットの全てで信
号/ノイズ比が>5の99/100親イオン信号を有する容易
に解釈される質量スペクトルが得られた。第2の方法で
は、384ウェル微量滴定プレートからのプローブを、表
面接触によりチップに〜20nlを移すスプリング付きピン
のアレーを用いてチップウェルまたは平坦な表面に一度
に分配する。並行方法で沈着させたアレーエレメントの
MS分析は、感度及び解像度の点で連続方法に匹敵する。
ら購入したシステムを改良したものであり、分配すべき
溶液を保持するガラス毛細管に結合しその周りの圧電要
素にパルス信号を送る圧電要素ドライバ;毛細管に(負
圧により)充填または毛細管を(正圧により)空にする
ための圧力トランスデューサ;充填、取り出し、分配及
び洗浄のために毛細管を移動させるためのロボットxyz
ステージ及びロボットドライバ;「保留(suspende
d)」液滴特性を目視可能にするためのストロボスコー
プ及び圧電要素の周波数でパルスを出すドライバ;ソー
ス及び指定プレートまたはサンプル標的のための別個の
ステージ(すなわち、Siチップ);指定プレートへの充
填を目視するためのロボットアームに取り付けたカメ
ラ;及び圧力ユニット、xyzロボットアーム及び圧電ド
ライバを制御するデータステーションを含み得る。
れ且つX,Y,Zロボットステージ上に載置された16個のプ
ローブからなる。ロボットステージは、ロボットアーム
の下にサンプルトレーを配置することができるガントリ
ーシステムであった。前記ガントリーユニットそれ自体
は、リニアオプティカルエンコーダにより与えられる位
置フィードバックを有するブラシレスリニアサーボモー
ターにより案内される、それぞれ250mm及び450mm移動す
るX及びYアームからなる。Z軸(鉛直に50mm移動)に
より駆動される鉛スクリューがガントリーユニットのxy
軸側に取り付けられており、モーター載置ロータリーオ
プティカルエンコーダによる位置フィードバックを有す
るインラインロータリーサーボモーターにより制御され
る。システムの作動域には、5枚の微量滴定プレート
(最も一般的には、最高1152の異なるオリゴヌクレオチ
ド溶液に対して2枚の洗浄溶液プレート及び3枚のサン
プルプレート)及び最高10枚のウェハを保持するスライ
ドアウトツールプレートが設けられている。ウェハは2
つの裏打ちピンに対してプレート内に正確に配置され、
真空により確実に固定されている。システム全体は安全
のためにプレキシガラスハウジング内に収容されてお
り、熱及び振動を抑制するためにスチール支持レーム上
に載置されている。動作のコントロールは3軸サーボコ
ントローラであり、コンピュータに統合される市販のモ
ーションコントローラを使用することにより達成され
る。特定の用途のためのプログラムコードが所要により
書かれている。
いて標的として機能する幾つかの表面に対して分配し
た。前記表面は、(1)Thermo Bioanalysis Vision
2000で通常作用するために供給されている平坦なステ
ンレススチールサンプル標的、(2)マイクロ機械加工
されたナノピットを有する同じデザインのステンレスス
チール標的、(3)平坦なシリコン(Si)ウェハ、
(4)研磨された多平坦なSiウェハ、(5)粗い(3〜
6pLm特徴)ピットを有するSiウエハー、(6)化学的に
エッチングした、大きさ800×800μmで深さ99〜400
(または(b)120)μmの複数のウェルの10×10(ま
たは(b)16×16)アレーを有する12×12(または
(b)18×18)mmSiチップ、(7)化学的にエッチング
した、大きさ450×450μmで深さ48〜300μmの複数の
ウェルの28×28アレーを有する15×15mmSiチップ、
(8)平らなポリカーボネートまたは他のプラスチッ
ク、(9)金及び他の金属、(10)膜、(11)金または
他の導電性材料をスパッタリングしたプラスチック表面
を含む。分配容量は、分配する液滴の数を調節すること
により10-10〜10-6Lにコントロールされる。
g/μl)を96ウェル−微量滴定プレートのウェルに充填
した。第1のウエルをマトリックス溶液用に残した。ピ
ットを設けたチップ(MALDI標的セクションの標的6a)
をステージ上に置き、手動で整列させた。(Windows
の)ロボット制御ソフトウェアに、第1ウェルの座標、
アレーサイズ(すなわち、x×yにおけるスポット数)
及びエレメント間の距離、並びに1つのアレーエレメン
ト当たりの0.2nl液滴の数をインプットした。毛細管に
〜10μLのリンスH2Oを充填し、連続パルスモードでチ
ップの一体性及び清潔度をチェックすべくストロボ発光
カメラで目視するために自動的に移動し、空にした。次
いで、毛細管にマトリックス溶液を充填し、再びストロ
ボスコープでチェック後、平坦なもしくはピット付き表
面上のアレーをスポットするために使用した。再現可能
に別のMSモードで研究するために、通常0.2〜20nlの液
滴の10×10アレーを分配した。正圧を加えて毛細管を空
にし、必要によりH2Oですすぎ、0.05〜2.0μMの合成オ
リゴ〜5μLを抜き取るソースオリゴプレートに誘導し
た。次いで、毛細管を、0.2〜20nl水溶液を添加したマ
トリックススポットのそれぞれに亘って連続してラスタ
した。
をコントロールするために書かれた。10枚のウェハ上に
64×64エレメントのアレーを作成するためには、例えば
ツールを384ウェル−DNAソースプレートの16ウェルに浸
し、標的(例えば、Si、プラスチック、金属)に移動
し、サンプルを表面接触によりスポットした。次いで、
ツールを同じ16ウェルに浸し、第2標的上にスポットし
た。このサイクルを10枚のウェハすべてに対して繰り返
した。次いで、ツールを洗浄溶液に浸し、ソースプレー
トの別の16枚のウェハに浸し、最初の組の16スポットか
ら2.25mmはずれた標的上にスポットした。これを、再び
10枚のウェハすべてに対して繰り返した。全サイクルを
繰り返して、各ピンから2×2アレーを作成し、スポッ
トの8×8アレーを作成した[(2×2エレメント/ピ
ン)×16ピン=スポットされたエレメントの全数64]。
が異なるオリゴヌクレオチドを最高3つの異なる394ウ
ェル−微量滴定プレートのウェルに充填した。16ウェル
の1組をマトリックス溶液のために残しておいた。2つ
のプレートのウェルに洗浄溶液を満たした。5枚の微量
滴定プレートをスライディングアウトツールプレート上
に置いた。10枚のウェハをツールプレート上にバンクピ
ンに接して置き、真空とした。マトリックス及びオリゴ
ヌクレオチドが予め混合されていない場合には、ピンツ
ールを用いて、まず10枚のウェハの所望のアレーエレメ
ントのすべてにマトリックス溶液をスポットした、本実
施例では、16×16アレーを作成し、こうして1.125mmの
オフセットで10枚のウェハの各々を16回スポットしなけ
ればならない。次いで、オリゴヌクレオチド溶液を同じ
パターンでスポットしてマトリックスを溶解した。同様
にして、ウェハ上にまずオリゴヌクレオチド溶液、次い
でマトリックス溶液を導入するか、またはマトリックス
溶液とオリゴヌクレオチド溶液を予め混合することによ
り作成することができる。
を、1組のベベルスクリューを取り付けたポリカーボネ
ート支持体を有するMALDI−TOFソースプレート上に据え
付けた。前記プレートをプローブの末端上に移し、飛行
時間型質量分析計のソース領域において1μm分解度、
1"移動xyステージ(Newport)上に保持した。通常18〜2
6kV抽出で操作される装置は、線形またはわん曲フィー
ルド反射モード及び連続もしくは遅延抽出モードで操作
され得た。
蒸発するのでチップの閉塞が起こり得るが、マトリック
スが溶液中に残り、毛細管が空になるまで維持される安
定なスプレーが得られるようにDNA及びマトリックスの
予混合によりマトリックスを十分に希釈する。1:1希釈
(H2O中)マトリックス溶液で>>10分間の連続スプレ
ーが可能であった。毛細管が>5分間放置されるように
圧電要素を止め、圧電要素を再び動かしても、毛細管が
閉塞することはなかった。
−TOFシステムにより与えられるステンレススチールサ
ンプル標的を用いる初期実験では、サンプル標的に分配
する前にマトリックス及びDNAの予混合溶液を用いた。
1つの微量滴定ウェルに、50μlの飽和マトリックス溶
液、25μlの12量体(ATGG)3の51μl溶液及び25μl
の28量体(ATGG)7の51μl溶液を混合した。0.6μl
液滴の10×10アレーの1組を直接Finnigan Vision 20
00サンプル標的ディスクに分配した。2つのオリゴヌク
レオチドの各々を750×10-18モル含む1つのアレーエレ
メントからMALDI−TOF質量スペクトルを得た。この方法
を用いて、53量体(350×10-18モル充填、図示せず)の
DNAについて解析可能な質量スペクトルが得られた。
らも質量スペクトルを得た。図11は、100個の化学的エ
ッチングを施したウェルを有する12×12mmシリコンチッ
プを示す。マスクの大きさ及びエッチング時間は、800
×800μm(頂部表面)及び深さ100μmのフスタム(す
なわち、頂部平坦の逆ピラミッド)形状のウェルが得ら
れるように設定した。場合により、ウェルは粗な表面ま
たピットを有していてもよい。上記したように、毛細管
に関してx及びy座標系を規定するために、チップの端
をステージ上の高くなった表面に対して整列させた。
(代替方法では任意に光学アラインメント、人工知能パ
ターン認識ルーチン及びジベル−ピンを用いる手動アラ
インメントを含み得る。)各ウェルに、分析対象物を含
まない3−HPAマトリックス溶液を20滴(〜5nl)を分配
した。使用した50%CH3CN溶液の場合、各液滴の蒸発時
間は5〜10秒のオーダーであった。溶媒を蒸発後、微量
分配された各マトリックス液滴を120倍双眼写真鏡で観
察すると、非晶質で不透明なフラットディスクとして見
られた。こうした外観は図3bのスペクトルに示す液滴の
外観と一致する。チップを空にし、すすぎ、1.4μmの2
3量体DNA(Mr計算値=6967Da)水溶液を再充填後、毛細
管を100個のマトリックススポット上に誘導し、そこで5
nlのDNA水溶液を直接マトリックス液滴の上に分配し
た。CCDカメラを用いて可視化すると、分析対象水溶液
はマトリックスと混合し、再溶解させたことが認められ
た(大気温度及び湿度で完全蒸発には〜10秒かかっ
た)。非晶質マトリックス表面は、結晶特徴が<1μm
のオーダーの真の微結晶質表面に変換した。
て、予混合したマトリックス+分析対象物溶液の場合よ
りも再現性の高い質量スペクトルが得られた。100個
の、23量体5fmolのスポットの各々で、信号/ノイズ比
が>5の99/100親イオン信号を有する解釈質量スペクト
ルが生じた(図12)。前記した再現性は試験した平坦な
シリコン及び金属表面でも得られた(図示せず)。図12
のスペクトルは、26kVで操作した線形TOF装置で得た。
1重及び二重に帯電させた分子イオンを用いて左上スペ
クトル(ウェルk1)を内部較正し、この較正ファイルを
外部較正として他の99のスペクトルすべてに適用する
と、平均分子量からの標準偏差は<9Daであった。これ
は、〜0.1%の相対標準偏差に相当する。
た。X及びYステージの速度は35インチ/秒であり、Z
ステージの速度は5.5インチ/秒である。サイクル時間
を短縮するためにXおよびYステージを最高速度で移動
させることも可能であるが、ダメージを避けるために表
面がウェハと接触する前にZステージの速度を低下させ
なければならない。そのような軸速度では、10枚すべて
のウェハに対して16エレメント(同一溶液の1つのツー
ルキャビティ)をスポットするための適切なサイクル時
間は20秒であり、256エレメントのアレーを作成するに
は〜5.3分を要する。前記アレーに各種オリゴヌクレオ
チドを充填する場合、別の溶液に浸漬する前にピンチッ
プを清潔にするために追加の洗浄ステップを設けなけれ
ばならず、10枚のウェハを作成するためにサイクル時間
が25秒まで、または6.7分まで延びる。
識溶液及びホスホロイメージャーを用いて試験した。各
ピンは約1nlの液体を送達することが分かった。スポッ
ト−スポットの再現性は高い。配列または濃度が異なる
256のオリゴヌクレオチドエレメントのアレーを、ピン
ツールを用いて平坦なシリコンウェハ上に作成し、前記
ウェハをMALDI−TOF MS法により分析した。
OF質量分析にかけやすいDNAオリゴマーのアレーを、実
施例1に記載の高密度結合方法を用いてその表面上に複
数位置、例えば複数の窪みまたはパッチを有するシリコ
ンウェハ上に作成した。前記アレーに対して、ウェハの
特定位置でのみ遊離チオール含有オリゴヌクレオチドプ
ライマーを固定化した(例えば、図14参照)。アレーの
各位置は3つのオリゴヌクレオチドの1つを含んでい
た。異なる固定化オリゴヌクレオチドが別々に検出され
区別され得ることを立証するために、3種のオリゴマー
の1つの相補的であり、長さの異なる3種の別個のオリ
ゴヌクレオチドをウェハのアレーに対してハイブリダイ
ズし、MALDI−TOF質量分析法により分析した。
は5'−ジスルフィド結合を含んでいる(Operon Techno
logiesまたはOligos,Etc.から購入)相補的オリゴデオ
キシヌクレオチド対3組を合成した。例えば、オリゴマ
ー1 は3'−ジスルフィド結合を含むのに対して、オリゴマー
2 の5'−ジスルフィド誘導体]及びオリゴマー3 の5'−ジスルフィド誘導体]はそれぞれ5'−ジスルフィ
ド結合を含む。
MALDI−TOF MS分析中に互いに容易に分割され得る異な
る長さを有するように設計された。例えば、23量体オリ
ゴヌクレオチド(配列番号9)はオリゴマー1の一部に
相補的に合成し、12量体オリゴヌクレオチド(配列番号
7)はオリゴマー2の一部に相補的に合成し、21量体
(配列番号2;実施例1において“MJM6"と称した配列)
はオリゴマー3の一部に相補的に合成した。更に、4番
目の29量体オリゴヌクレオチド(配列番号10)は、3つ
のオリゴヌクレオチドのいずれとも相補性を欠くように
合成した。この第4のオリゴヌクレオチドはネガティブ
コントロールとして使用した。
ェルを有する2×2cm2シリコンウェハを業者(テキサス
州カレッジステーションに所在のAccelerator Technol
ogy Corp.)から購入した。ウェルは800×800μm2、12
0μm深さ、1.125ピッチであった。シリコンウェハを3
−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させて、表
面上に第1級アミンの均一層を形成し、その後ヘテロ二
官能性架橋剤SIABに接触させて、表面上にヨードアセト
アミド官能基を生じさせた(例えば、図7参照)。
のオリゴマーを製造するために、各オリゴマーのジスル
フィド結合を実施例1に記載したように10mM TCEPを用
いて完全に還元し、DNAを100mMリン酸塩緩衝液(pH8.
0)中に10μMの最終濃度で再懸濁させた。ジスルフィ
ド還元後直ちに、オリゴマーの遊離チオール基を図7に
本質的に記載したプローブカップリング条件を用いてウ
ェハ上の16箇所でヨードアセトアミド官能基にカップリ
ングさせた。ウェハの16箇所でそれぞれカップリングを
行うために、ウェハの全表面をオリゴヌクレオチド溶液
でフラッシュせず、その代わりにウェハ上の256ウェル
の16箇所(すなわち、窪み)の各々に本明細書に記載の
ピンツール(例えば、詳細説明の欄及び実施例4参照)
を用いて〜30nlアリコートの所定通りに修飾させたオリ
ゴマーを並行して添加して、固定化DNAの4×4アレー
を作成した。
の1つをシリコンウェハ上の256ウェルの16個の別々の
ウェルの各々に対して共有的に固定化し、これにより固
定化DNAの4×4アレーを作成した。例えば、オリゴマ
ー1を4×4アレーの左上部のウェルの位置で結合さ
せ、オリゴマー2は隣接の位置に結合させ、以下同様に
した。完成したアレーを図14に図示する。
相補的オリゴヌクレオチド及びネガティブコントロール
のオリゴヌクレオチドを、1M NaClを補充したTE緩衝液
(10mMのTris−HCl(pH8.0),1mMのEDTA)中で各オリゴ
ヌクレオチドにつき10μMの最終濃度で混合し、溶液を
65℃で10分間加熱した、直ちに、シリコンウェハの全表
面を加熱したオリゴヌクレオチド溶液800μlでフラッ
シュした。相補的オリゴヌクレオチドを、シリコンアレ
ーを室温で1時間インキュベートした後4℃で少なくと
も10分間インキュベートすることにより固定化オリゴマ
ーにアニーリングした。或いは、オリゴヌクレオチド溶
液をウェハに添加した後、ハイブリダイゼーションのた
めに加熱し、放冷することもできる。各位置で共有的に
固定化された特定のオリゴマーにアニーリングした相補
的オリゴヌクレオチドを図15に示す。
50mMクエン酸アンモニウム緩衝液で洗浄してDNA骨格上
のナトリウムイオン及びカリウムイオンを除去した(Pi
eles,U.ら,Nucl.Acids Res.,21:3191−3196(199
3))。本明細書に記載したように、各位置に6nlアリコ
ートの3−ヒドロキシピコリン酸のマトリックス溶液
(50%アセトニトリル中0.7M 3−ヒドロキシピリコン
酸−10%クエン酸アンモニウム;Wuら,Rapid Commun.Ma
ss Spectrom.,7:124−146(1933)参照)を圧電ピペ
ットを用いて添加した。
電ピペットを用いて各位置に添加して、室温で乾燥する
とマトリックス−DNA結合体が各位置の底面上に均一結
晶面を形成するように乾燥したマトリックス−DNA結合
体を再懸濁させた。
に記載したハイブリダイゼーションアレーの16箇所の各
々に対して連続して実施した。DNAハイブリダイゼーシ
ョンアレーの16箇所の各々に対して特異的にハイブリダ
イズしたオリゴヌクレオチドの質量スペクトルを図16に
示す。質量スペクトルは、特定の相補的ヌクレオチド配
列に対応する質量/電荷数の測定値を示す各位置の特定
信号を示した。
スペクトルは23量体の質量/電荷数にほぼ等しい質量/
電荷数実験値7072.4を有する主信号を示した。23量体の
質量/電荷数の理論値は7072.6Daである。同様に、質量
/電荷数測定値が3618.33Da(理論値3622.4Da)のアレ
ーに対する12量体オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリ
ダイゼーションはオリゴマー2を結合させた位置でのみ
検出され、質量/電荷数測定値が6415.4DaのMJM6の特異
的ハイブリダイゼーションはオリゴマー3(理論値640
7.2Da)を結合させたアレーの特定位置でのみ検出され
た。
(質量/電荷数の理論値8974.8Da)に対応する信号はア
レーのいずれの位置でも見られなかった。このことは、
特定の標的DNA分子はシリコンアレーの表面の特定位置
に共有結合したオリゴマーにハイブリダイズされ得、複
数のハイブリダイゼーションアッセイはMALDI−TOF MS
分析法により個別にモニターされ得ることを示す。
ウェルを有する2×2cm2シリコンウェハを業者(テキサ
ス州カレッジステーションに所在のAccelerator Techn
ology Corp.)から購入した。ウェルは800×800μm2、
120μm深さ、1.125ピッチであった。シリコンウェハを
3−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させて、
表面上に第1級アミンの均一層を形成し、その後ヘテロ
二官能性架橋剤SIABに接触させて表面上にヨードアセト
アミド官能基を生じさせた(例えば、図7参照)。
て、オリゴマー1〜3を256ウェルシリコンウェハ上に
8×8アレーを形成する64箇所に固定化し、相補的オリ
ゴヌクレオチドにハイブリダイズし、MALDI−TOF MS分
析法により分析した。図17は、MALDI−TOF分析法により
連続分析した64箇所DNAアレーの質量スペクトルを示
す。16箇所アレーについて示すように、固定化されたチ
オール含有オリゴマーの各々に対する相補的オリゴヌク
レオチドの特異的ハイブリダイゼーションがDNAアレー
のそれぞれの位置で観察された。
イブリダイズDNAプライマーのエクステンション SIAB誘導化シリコンウェハを、米国特許第5,605,798
号明細書に実質的に記載されている手順を用いる固定化
DNA鋳型のプライマーエクステンション反応のために使
用することができる。
量体オリゴヌクレオチド(配列番号11)を上記した、例
えば実施例1に記載したSIAB誘導化シリコンウェハにカ
ップリングさせた。12量体オリゴヌクレオチドプライマ
ー(配列番号12)を固定化オリゴヌクレオチドにハイブ
リダイズし、市販のキット(例えば、U.S.Biochemical
Corp.のシークエナーゼまたはサーモシークエナー
ゼ)を用いて延長させた。製造業者の指示に従って緩衝
液中、3つのデオキシリボヌクレオシドトリホスフェー
ト(dNTPs;dATP,dGTP,dTTP)及びジデオキシリボヌクレ
オシドチミジントリホスフェート(ddTTP)の存在下で
シークエナーゼDNAポリメラーゼまたはサーモシークエ
ナーゼDNAポリメラーゼを添加すると、シリコンウェハ
に結合したまま12量体プライマーが3塩基延長した。次
いで、このウェハを上記したようにMALDI−TOF質量分析
法により分析した。図18に示すように、15量体(配列番
号13)と元の未延長12量体とを明確に区別する質量スペ
クトルが得られた。このことは特異的エクステンション
がシリコンウェハの表面で実施され、MALDI−TOF MS分
析法により検出され得ることを示す。
ブリダイズDNAプライマーのポリメラーゼエクステンシ
ョンに対するリンカー長さの影響 SIAB誘導化シリコン表面と標的DNAのハイブリダイゼ
ーションにより形成された二重らせんDNAとの距離の固
定化されたオリゴマー鋳型に対する影響及び酵素の選択
を調べた(例えば、図19参照)。
スペーサー配列を3'末端に挿入した以外は同一のDNA配
列の2つの遊離チオール含有オリゴヌクレオチド(配列
番号8及び11)の3'末端に結合させた。上記した2つの
オリゴヌクレオチドを合成し、その各々をSIAB架橋剤を
介してシリコンウェハの表面に別々に固定化した(例え
ば、図7参照)。各ウェハを、75℃で変性し、シリコン
ウェハをゆっくり冷却することにより両オリゴヌクレオ
チドに共通のヌクレオチド配列部分と相補的な12量体オ
リゴヌクレオチド(配列番号12,14及び15)とインキュ
ベートした。次いで、ウェハを上記したようにMALDI−T
OF質量分析法により分析した。
スペーサーが存在するオリゴマープライマー(配列番号
12)を用いると結合した12量体オリゴヌクレオチドが特
異的に3塩基延長するのが認められた。図19に示すよう
に、SIAB部分とDNA二重らせんとのDNAスペーサー長さが
0、3、6及び12の場合にも同様の結果が認められた。
ウェハのMALDI−TOF質量分析の結果を図20に示す。更
に、図19は、エクステンション反応を各種ポリメラーゼ
を用いて実施し得ることをも示す。従って、SIABリンカ
ーはDNA鋳型に直接カップリングすることも、またハイ
ブリダイズDNAのプライマーエクステンションせずとも
リンカー配列をも含み得る。
ンによる二本鎖核酸分子の検出 本実施例では、24量体プライマーを固定化し、二重ら
せんDNA分子の1本鎖を特異的ハイブリダイゼーション
することにより液相中で特定標的分子を増幅でき且つ二
本鎖分子を検出できることを示す。
化シリコンウェハにカップリングさせた。
配列を有する12量体オリゴヌクレオチド と予混合した。このオリゴヌクレオチドミックスを75℃
に加熱し、ゆっくりと室温に冷却して、二重らせん分子
の形成を促した。
量体鎖の特異的ハイブリダイゼーションを、実施例6に
記載のハイブリダイゼーション条件を用いて1μMの二
重らせん分子を混合して実施した。
ハイブリダイゼーションが、質量/電荷数が3682.78Da
の12量体の質量スペクトルで検出された。
リチルプロポキシ)フェニル)−1−O−((2−シア
ノエトキシ)−ジイソプロピルアミノホスフィノ)エタ
ン A.2−ニトロ−5−(3−ヒドロキシプロポキシ)ベン
ズアルデヒド 3−ブロモ−1−プロパノール(3.34g,24mmol)を無
水アセトニトリル中で5−ヒドロキシ−2−ニトロベン
ズアルデヒド(3.34g,20mmol)、K2CO3(3.5g)及びKI
(100mg)と一晩(15時間)還流した。反応混合物を室
温に冷却し、ジクロロメタン150mlを添加した。混合物
を濾過し、固体残渣をジクロロメタンと洗浄した。合わ
せた有機溶液を蒸発乾固し、ジクロロメタン100ml中に
再溶解した。生じた溶液を飽和NaCl溶液で洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥した。溶媒を真空下で除去後、所望の
生成物4.31g(96%)が得られた。
nm1 H NMR(DMSO−d6)δ 10.28(s,1H)、8.17(d,1
H)、7.35(d,1H)、7.22(s,1H)、4.22(t,2H)、3.5
4(t,2H)、1.90(m,2H)13 C NMR(DMSO−d6)δ 189.9、153.0、141.6、134.
3、127.3、118.4、114.0、66.2、56.9、31.7 B.2−ニトロ−5−(3−O−t−ブチルジメチルシリ
ルプロポキシ)ベンズアルデヒド 2−ニトロ−5−(3−ヒドロキシプロポキシ)ベン
ズアルデヒド(1g,4.44mmol)を無水アセトニトリル50m
lに溶解した。この溶液に、トリエチルアミン1ml、イミ
ダゾール200mg及びtBDMSC10.8g(5.3mmol)を添加し
た。混合物を室温で4時間撹拌した。反応を止めるため
にメタノール1mlを添加した。溶媒を真空下で除去し、
固体残渣をジクロロメタン100mlに再溶解した。生じた
溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液、次いで水で洗浄し
た。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下で
除去した。粗混合物をクイックシリカゲルカラムにか
け、ジクロロメタンで溶出すると、2−ニトロ−5−
(3−O−t−ブチルジメチルシリルプロポキシ)ベン
ズアルデヒド1.44g(96%)が得られた。
H)、7.32(d,1H)、7.20(s,1H)、4.20(t,2H)、3.7
5(t,2H)、1.90(m,2H)、0.85(s,9H)、0.02(s,6
H)13 C NMR(DMSO−d6)δ 189.6、162.7、141.5、134.
0、127.1、118.2、113.8、65.4、58.5、31.2、25.5、−
3.1、−5.7 C.1−(2−ニトロ−5−(3−O−t−ブチルジメチ
ルシリルプロポキシ)フェニル)エタノール 高真空乾燥した2−ニトロ−5−(3−O−t−ブチ
ルジメチルシリルプロポキシ)ベンズアルデヒド(1.02
g,3mmol)を無水ジクロロメタン50mlに溶解した。トル
エン(3ml)中2Mトリメチルアルミニウムを10分間を要
して滴下し、反応混合物を室温で保持した。更に10分間
撹拌し、混合物を氷冷水10mlに注いだ。乳濁液を水相か
ら分離し、硫酸ナトリウム100gで乾燥して残存する水を
除去した。溶媒を真空下で除去し、混合物をシリカゲル
カラムにかけ、ジクロロメタン中メタノールで勾配溶離
した。所望の生成物0.94g(86%)が単離された。
H)、7.00(d,1H)、5.49(b,OH)、5.31(q,1H)、4.1
9(m,2H)、3.77(t,2H)、1.95(m,2H)、1.37(d,3
H)、0.86(s,6H)、0.04(s,6H)13 C NMR(DMSO−d6)δ 162.6、146.2、139.6、126.
9、112.9、112.5、64.8、63.9、58.7、31.5、25.6、24.
9、−3.4、−5.8 D.1−(2−ニトロ−5−(3−ヒドロキシプロポキ
シ)フェニル)エタノール 1−(2−ニトロ−5−(3−O−t−ブチルジメチ
ルシリルプロポキシ)フェニル)エタノール(0.89g,2.
5mmol)をTHF30mlに溶解し、nBu4NF0.5mmolを撹拌しな
がら添加した。混合物を室温で5時間撹拌し、溶媒を真
空下で除去した。残渣をシリカゲルカラムにかけ、ジク
ロロメタン中メタノールで勾配溶離した。1−(2−ニ
トロ−5−(3−ヒドロキシプロポキシ)フェニル)エ
タノール0.6g(99%)が得られた。
H)、7.00(d,1H)、5.50(d,OH)、5.28(d,OH)、4.5
9(t,1H)、4.17(t,2H)、3.57(m,2H)、1.89(m,2
H)、1.36(d,2H)13 C NMR(DMSO−d6)δ 162.8、146.3、139.7、127.
1、113.1、112.6、65.5、64.0、57.0、31.8、25.0 E.1−(2−ニトロ−5−(3−O−4,4'−ジメトキシ
トリチルプロポキシ)フェニル)エタノール 1−(2−ニトロ−5−(3−ヒドロキシプロポキ
シ)フェニル)エタノール(0.482g,2mmol)を無水ピリ
ジンと2回共蒸発させ、無水ピリジン20mlに溶解した。
溶液を氷水浴で冷却し、DMTC1750mg(2.2mmol)を添加
した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、反応を止めるた
めにメタノール0.5mlを添加した。溶媒を真空下で除去
し、残渣をトルエンと2回共蒸発させて痕跡量のピリジ
ンを除去した。最終残渣をシリカゲルカラムにかけ、ト
リエチルアミンを数滴含むジクロロメタン中メタノール
で勾配溶離した。所望の生成物である1−(2−ニトロ
−5−(3−O−4,4'−ジメトキシトリチルプロポキ
シ)フェニル)エタノール0.96g(89%)が得られた。
233,208nm、最小290,258,220nm1 H NMR(DMSO−d6)δ 8.00(d,1H)、6.82−7.42(A
rH)、5.52(d,OH)、5.32(m,1H)、4.23(t,2H)、3.
71(s,6H)、3.17(t,2H)、2.00(m,2H)、1.37(d,3
H)13 C NMR(DMSO−d6)δ 162.5、157.9、157.7、146.
1、144.9、140.1、139.7、135.7、129.5、128.8、127.
6、127.5、127.3、126.9、126.4、113.0、112.8、112.
6、85.2、65.3、63.9、59.0、54.8、28.9、24.9 F.1−(2−ニトロ−5−(3−O−4,4'−ジメトキシ
トリチルプロポキシ)フェニル)−1−O−((2−シ
アノエトキシ)−ジイソプロピルアミノホスフィノ)エ
タン 1−(2−ニトロ−5−(3−O−4,4'−ジメトキシ
トリチルプロポキシ)フェニル)エタノール(400mg,0.
74mmol)を高真空下で乾燥し、無水ジクロロメタン20ml
に溶解した。この溶液に、N,N−ジイソプロピルエチル
アミン0.5ml及び2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピ
ルクロロホスホルアミダイト0.3ml(1.34mmol)を添加
した。反応混合物を室温で30分間撹拌し、反応を止める
ためにメタノール0.5mlを添加した。混合物を飽和重炭
酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し
た。溶媒を真空下で除去し、クイックシリカゲルカラム
にかけ、トリエチルアミンを数滴含むジクロロメタン中
1%メタノールで溶離した。所望のホスホルアミダイト
510mg(93%)が得られた。
キシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)−1−O
−((2−シアノエトキシ)−ジイソプロピルアミノホ
スフィノ)エタン A.4−(3−ヒドロキシプロポキシ)−3−メトキシア
セトフェノン 3−ブロモ−1−プロパノール(53ml,33mmol)を無
水アセトニトリル100ml中で4−ヒドロキシ−3−メト
キシアセトフェノン(5g,30mmol)、K2CO3(5g)及びKI
(300mg)と一晩(15時間)還流した。室温に冷却後ジ
クロロメタン(150ml)を反応混合物に添加した。混合
物を濾過し、固体残渣をジクロロメタンで洗浄した。合
わせた有機溶液を蒸発乾固し、ジクロロメタン100mlに
再溶解した。生じた溶液を飽和NaCl溶液で洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥した。溶媒を真空下で除去後所望生成
物6.5g(96.4%)が得られた。
44,214nm1 H NMR(DMSO−d6)δ 7.64(d,1H)、7.46(s,1
H)、7.04(d,1H)、4.58(b,OH)、4.12(t,2H)、3.8
0(s,3H)、3.56(t,2H)、2.54(s,3H)、1.88(m,2
H)13 C NMR(DMSO−d6)δ 196.3、152.5、148.6、129.
7、123.1、111.5、110.3、65.4、57.2、55.5、31.9、2
6.3 B.4−(3−アセトキシプロポキシ)−3−メトキシア
セトフェノン 4−(3−ヒドロキシプロポキシ)−3−メトキシア
セトフェノン(3.5g,15.6mmol)を乾燥し、無水アセト
ニトリル80mlに溶解した。この混合物にトリエチルアミ
ン6ml及び無水酢酸6mlを添加した。4時間後、メタノー
ル6mlを添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣をジク
ロロメタン100mlに溶解し、溶液を希重炭酸ナトリウム
溶液、次いで水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで
乾燥し、溶媒を除去した。固体残渣をシリカゲルカラム
にかけ、ジクロロメタンで溶離すると、4−(3−アセ
トキシプロポキシ)−3−メトキシアセトフェノン4.1g
(98.6%)が得られた。
43,214nm1 H NMR(DMSO−d6)δ 7.62(d,1H)、7.45(s,1
H)、7.08(d,1H)、4.42(m,4H)、3.82(s,3H)、2.5
4(s,3H)、2.04(m,2H)、2.00(s,3H)13 C NMR(DMSO−d6)δ 196.3、170.4,152.2、148.
6、130.0、123.0、111.8、110.4、65.2、60.8、55.5、2
7.9、26.3、20.7 C.4−(3−アセトキシプロポキシ)−3−メトキシ−
6−ニトロアセトフェノン 4−(3−アセトキシプロポキシ)−3−メトキシア
セトフェノン(3.99g,15mmol)を水浴にて70%−HNO315
mlに少しずつ添加し、反応温度を室温に維持した。反応
混合物を室温で30分間撹拌し、砕いた氷30gを添加し
た。この混合物をジクロロメタン100mlで抽出し、有機
相を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。溶液を硫酸
ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下で除去した。粗混合
物をシリカゲルカラムにかけ、ジクロロメタン中メタノ
ールで勾配溶離すると、所望生成物の4−(3−アセト
キシプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロアセトフ
ェノン3.8g(81.5%)及びipso置換生成物である5−
(3−アセトキシプロポキシ)−4−メトキシ−1,2−
ジニトロベンゼン0.38g(8%)が得られた。
4−メトキシ−1,2−ジニトロベンゼン: Rf=0.47(ジクロロメタン/メタノール=99/1) UV(メタノール):最大334,330,270,240,212nm、最小3
10,282,263,223nm1 H NMR(CDCl3)δ 7.36(s,1H)、7.34(s,1H)、4.
28(t,2H)、4.18(t,2H)、4.02(s,3H)、2.20(m,2
H)、2.08(s,3H)13 C NMR(CDCl3)δ 170.9、152.2、151.1、117.6、1
11.2、107.9、107.1、66.7、60.6、56.9、28.2、20.9 所望生成物4−(3−アセトキシプロポキシ)−3−メ
トキシ−6−ニトロアセトフェノン: Rf=0.29(ジクロロメタン/メタノール=99/1) UV(メタノール):最大344,300,246,213nm、最小320,2
70,227nm1 H NMR(CDCl3)δ 7.62(s,1H)、6.74(s,1H)、4.
28(t,2H)、4.20(t,2H)、3.96(s,3H)、2.48(s,3
H)、2.20(m,2H)、2.08(s,3H)13 C NMR(CDCl3)δ 200.0、171.0、154.3、148.8、1
38.3、133.0、108.8、108.0、66.1、60.8、56.6、30.
4、28.2、20.9 D.1−(4−(3−ヒドロキシプロポキシ)−3−メト
キシ−6−ニトロフェニル)エタノール 4−(3−アセトキシプロポキシ)−3−メトキシ−
6−ニトロアセトフェノン(3.73g,12mmol)にエタノー
ル150ml及びK2CO36.5gを添加した。混合物を室温で4時
間撹拌した。ジクロロメタン中5%メタノールを用いる
TLCは反応の完了を示した。この同じ反応混合物にNaBH4
3.5gを添加し、混合物を室温で2時間撹拌した。アセト
ン10mlを添加して残りのNaBH4と反応させた。溶媒を真
空下で除去し、残渣をシリカゲル50gに吸収させた。こ
のシリカゲル混合物をシリカゲルカラムの上部にかけ、
ジクロロメタン中5%メタノールで溶離して、所望生成
物の1−(4−(3−ヒドロキシプロポキシ)−3−メ
トキシ−6−ニトロフェニル)エタノール3.15g(97
%)が得られた。
シ)−3−メトキシ−6−ニトロアセトフェノン: Rf=0.60(ジクロロメタン/メタノール=95/5) 最終生成物の1−(4−(3−ヒドロキシプロポキシ)
−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)エタノール: Rf=0.50(ジクロロメタン/メタノール=95/5) UV(メタノール):最大344,300,243,219nm、最小317,2
64,233nm1 H NMR(DMSO−d6)δ 7.54(s,1H)、7.36(s,1
H)、5.47(d,OH)、5.27(m,1H)、4.55(t,OH)、4.0
5(t,2H)、3.90(s,3H)、3.55(q,2H)、1.88(m,2
H)、1.37(d,3H)13 C NMR(DMSO−d6)δ 153.4、146.4、138.8、137.
9、109.0、108.1、68.5、65.9、57.2、56.0、31.9、29.
6 E.1−(4−(3−O−4,4'−ジメトキシトリチルプロ
ポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)エタノ
ール 1−(4−(3−ヒドロキシプロポキシ)−3−メト
キシ−6−ニトロフェニル)エタノール(0.325g,1.2mm
ol)を無水ピリジンと2回共蒸発し、無水ピリジン15ml
に溶解した。溶液を氷水浴で冷却し、DMTCI450mg(1.33
mmol)を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、反
応を止めるためにメタノール0.5mlを添加した。溶媒を
真空下で除去し、残渣をトルエンと2回共蒸発させて痕
跡量のピリジンを除去した。最終残渣をシリカゲルカラ
ムにかけ、トリエチルアミンを数滴含むジクロロメタン
中メタノールで勾配溶離して、所望生成物の1−(4−
(3−O−(4,4'−ジメトキシトリチルプロポキシ)−
3−メトキシ−6−ニトロフェニル)エタノール605mg
(88%)が得られた。
最小322,292,263,222nm1 H NMR(DMSO−d6)δ 7.54(s,1H)、6.8−7.4(Ar
H)、5.48(d,OH)、5.27(m,1H)、4.16(t,2H)、3.8
5(s,3H)、3.72(s,6H)、3.15(t,2H)、1.98(t,2
H)、1.37(d,3H)13 C NMR(DMSO−d6)δ 157.8、153.3、146.1、144.
9、138.7、137.8、135.7、129.4、128.7、127.5、127.
4、126.3、112.9、112.6、108.9、108.2、85.1、65.7、
63.7、59.2、55.8、54.8、29.0、25.0 F.1−(4−(3−O−4,4'−ジメトキシトリチルプロ
ポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)−1−
O−((2−シアノエトキシ)−ジイソプロピルアミノ
ホスフィノ)エタン 1−(4−(3−O−4,4'−ジメトキシトリチルプロ
ポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)エタノ
ール(200mg,3.5mmol)を高真空下で乾燥し、無水ジク
ロロエタン15mlに溶解した。この溶液にN,N−ジイソプ
ロピルエチルアミン0.5ml及び2−シアノエチル−N,N−
ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト0.2ml(0.89m
mol)を添加した。反応混合物を室温で30分間撹拌し、
反応を止めるためにメタノール0.5mlを添加した。混合
物を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウ
ムで乾燥した。溶媒を真空下で除去し、クイックシリカ
ゲルカラムにかけ、トリエチルアミンを数滴含むジクロ
ロメタン中1%メタノールで溶離して、所望ホスホルア
ミダイトの1−(4−(3−O−4,4'−ジメトキシトリ
チルプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニ
ル)−1−O−((2−シアノエトキシ)−ジイソプロ
ピルアミノホスフィノ)エタン247mg(91.3%)が得ら
れた。
標準条件下で固相核酸合成(Sinhaら,Tetrahedron Let
t.,24,5843−5846(1983);Sinhaら,Nucleic Acids R
es.,12,4539−4557(1984);Beaucageら,Tetrahedron,4
9,6123−6194(1993);及びMatteucciら,J.Am.Chem.So
c.,103,3185−3191(1981)参照)により製造した。ま
た、光開裂性単位及び5'末端アミノ基を導入するために
より長いカップリング時間を使用した。カップリング効
率を遊離DMTカチオンの吸光度を測定することにより調
べ、その結果はホスホルアミダイトの1−(2−ニトロ
−5−(3−O−4,4'−ジメトキシトリチルプロポキ
シ)フェニル)−1−O−((2−シアノエトキシ)−
ジイソプロピルアミノホスフィノ)エタンまたは1−
(4−(3−O−4,4'−ジメトキシトリチルプロポキ
シ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)−1−O−
((2−シアノエトキシ)−ジイソプロピルアミノホス
フィノ)エタンのカップリング効率は従来のヌクレオシ
ドホスホルアミダイトに匹敵することを示した。濃アン
モニウムを用いて55℃で一晩処理して塩基保護を脱保護
し、固体支持体から結合体を遊離した。他の結合体の塩
基保護は、AMA試薬を用いて迅速に脱保護した。結合体
上MMTの精製は、0.1M酢酸トリエチルアンモニウム(pH
7.0)を用い、アセトニトリル(20分で5%→25%)の
勾配を用いてHPLC(トリチル−オン)で実施した。集め
たMMTまたはDMT保護結合体の容量を減らし、80%酢酸水
溶液を用いて脱トリチル化し(40分、0℃)、脱塩し、
−20℃で保存した。
リゴヌクレオチド2nmolを、10cmの距離から長波長UVラ
ンプ(Blak Ray XX−15UVランプ、カリフォルニア州
サンガブリエルに所在のUltravioletの製品)で照射し
た(励起ピーク365nm,距離31cmでのランプ照射の強さ=
1.1mW/cm2)。生じた混合物を、0.1M酢酸トリエチルア
ンモニウム(pH7.0)及びアセトニトリル勾配を用いてH
PLC(トリチル−オフ)で分析した。分析は、結合体はU
V照射で数分以内にリンカーから開裂されることを示し
た。
る多数の均等物を通常の実験により想到し得、または確
認することができる。前記均等物も本発明の範囲内であ
ると見做され、下記する請求の範囲により包含される。
Claims (53)
- 【請求項1】サブストレート表面に対して化学的または
生物学的手法でナノリッター容量の流体を分配するため
の分配装置であって、 複数の側面と複数の孔が形成されてなる底部部分とを有
し、前記側面と前記底部部分により内部が規定されてい
るハウジング、 前記孔内に取り付けられており、ナノリッター容量の流
体を保持・分配するために同じ大きさの流体保持チャン
バを有している1つ以上の流体通過ベシクルであって、
前記流体保持チャンバが前記ハウジング内部と流体連通
して配置されている前記流体通過ベシクル、及び 前記ベシクルの流体保持チャンバが十分に充填されたと
きにナノリッター容量の大きさの流体通過ベシクルから
ナノリッター容量の流体を選択的に分配するために前記
ハウジング内部と連通している分配手段 を含み、前記装置がサブストレート表面上に位置合わせ
して配置されたときに前記分配手段がサブストレート表
面に対してナノリッター容量の流体を分配することを特
徴とする前記分配装置。 - 【請求項2】前記した各流体通過ベシクルは近位開放端
部と前記孔内に取り付けられたときに前記ハウジングの
底部部分を越えて延びている遠位チップ部分とを有し、
前記近位開放端部は孔内に取り付けられたときにハウジ
ング内部と流体連通して前記流体保持チャンバを配置し
ていることを特徴とする請求の範囲第1項に記載の装
置。 - 【請求項3】前記した1つ以上の流体通過ベシクルが前
記ハウジングの孔内に取外し自在且つ取替え自在に取り
付けられていることを特徴とする請求の範囲第1項に記
載の装置。 - 【請求項4】前記した1つ以上の流体通過ベシクルが前
記ハウジング内に孔を固定的に取り付けるためのグルー
シールを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載
の装置。 - 【請求項5】前記流体保持チャンバが、毛管作用により
流体を満たすために十分に狭い径を含むことを特徴とす
る請求の範囲第1項に記載の装置。 - 【請求項6】前記した1つ以上の流体通過ベシクルの各
流体保持チャンバが、該流体保持チャンバが毛管作用に
より流体で実質的に満たされる大きさを有していること
を特徴とする請求の範囲第1項に記載の装置。 - 【請求項7】前記した複数の流体通過ベシクルが流体送
達ニードルのアレーからなることを特徴とする請求の範
囲第1項に記載の装置。 - 【請求項8】前記流体送達ニードルが金属から製造され
ていることを特徴とする請求の範囲第7項に記載の装
置。 - 【請求項9】前記流体送達ニードルがガラスから製造さ
れていることを特徴とする請求の範囲第7項に記載の装
置。 - 【請求項10】前記流体送達ニードルがシリカから製造
されていることを特徴とする請求の範囲第7項に記載の
装置。 - 【請求項11】前記流体伝達ニードルがポリマー材料か
ら製造されていることを特徴とする請求の範囲第7項に
記載の装置。 - 【請求項12】前記流体通過ベシクルの数がマルチウェ
ルサブストレートのウェルの数に等しいかもしくはそれ
より少ないことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の
装置。 - 【請求項13】複数の流体通過ベシクルを含み、更に該
複数の流体通過ベシクルを機械的にバイアスさせて前記
ハウジング底部部分とシール接触させる機械的バイアス
手段をも含み、前記ハウジングが更に頂部部分を含むこ
とを特徴とする請求の範囲第1項に記載の装置。 - 【請求項14】前記した各流体通過ベシクルがフランジ
を含む近位端部部分を有し、更にハウジング内部と外部
環境との間にシールを形成するために前記フランジと前
記ハウジング底部の内表面との間に配置されるシーラー
要素を含むことを特徴とする請求の範囲第13項に記載の
装置。 - 【請求項15】前記機械的バイアス手段が複数のスプリ
ング要素を含み、前記した各スプリング要素の一端は前
記した各流体通過ベシクルの近位端部に、他端は前記ハ
ウジング頂部部分に連結しており、前記スプリング要素
はシールを形成するために前記ベシクルの近位端部に機
械的バイアス力を加えることを特徴とする請求の範囲第
14項に記載の装置。 - 【請求項16】前記ハウジングが更に頂部部分を含み、
更に前記ハウジング頂部部分をハウジング底部部分に固
定するための固定手段を含むことを特徴とする請求の範
囲第1項に記載の装置。 - 【請求項17】前記固定手段が、前記ハウジングの頂部
部分及び底部部分の1つに形成された複数のファスナ受
容孔と前記ハウジングの頂部部分及び底部部分を一緒に
固定するために前記孔内に取り付けるための複数のファ
スナとを含むことを特徴とする請求の範囲第16項に記載
の装置。 - 【請求項18】前記分配手段が、特定圧力条件下で前記
ハウジング内部を処置するために前記ハウジング内部に
流動的に連結した圧力源を含むことを特徴とする請求の
範囲第1項に記載の装置。 - 【請求項19】前記流体通過ベシクルが毛管作用により
満たされ、前記分配手段が更に異なる圧力条件下でハウ
ジング内部を処置するために圧力源を変更する手段を含
み、この圧力源変更手段が各ベシクルの流体保持チャン
バを所定流体量に相当する所定の高さにまで満たすため
に毛管作用を補償する(offset)に十分な特定圧力条件
下でハウジング内部を処置することを特徴とする請求の
範囲第18項に記載の装置。 - 【請求項20】前記圧力源変更手段が更に特定ナノリッ
ター容量の流体を前記した各ベシクルのチャンバから選
択的に排出させるための流体選択手段を含むことを特徴
とする請求の範囲第19項に記載の装置。 - 【請求項21】前記流体通過ベシクルが前記ハウジング
の内部に対して開放した近位端部を有し、前記ベシクル
の流体保持チャンバが該近位開放端部でメニスカスを形
成することなく前記流体保持チャンバが毛管作用により
流体で実質的に満たされる大きさを有していることを特
徴とする請求の範囲第1項に記載の装置。 - 【請求項22】前記分配手段が各ベシクルの流体保持チ
ャンバから分配される流体の量を選択的に変化させるた
めの流体選択手段を含むことを特徴とする請求の範囲第
1項に記載の装置。 - 【請求項23】複数のベシクルを含み、その第1部分は
第1の大きさの流体保持チャンバを含み、第2部分は第
2の大きさの流体保持チャンバを含み、これにより複数
の流体容量が分配され得ることを特徴とする請求の範囲
第1項に記載の装置。 - 【請求項24】前記流体選択手段が、特定圧力条件下で
前記ハウジング内部を処置するために前記ハウジングに
連結し前記ハウジング内部と連通している圧力源、及び 前記圧力源に連結した、前記した各流体通過ベシクルか
ら分配される流体の量を変化させるべく該流体通過ベシ
クルの流体チャンバに正圧を加えるために前記ハウジン
グ内部の圧力を変化させる調節手段を含むことを特徴と
する請求の範囲第22項に記載の装置。 - 【請求項25】マルチウェルサブストレートの1つ以上
のウェルに対して化学的または生物学的手法でナノリッ
ター容量の流体を分配するための流体分配装置であっ
て、 複数の側面と複数の孔が形成されてなる底部部分とを有
し、前記側面と前記底部部分により内部が規定されてい
るハウジング、 前記孔内に取り付けられている、前記ハウジングの内部
に連通して配置された流体保持チャンバを有するナノリ
ッター容量の流体を保持するための複数の流体通過ベシ
クル、及び 前記ハウジング内部と連通している、1組の複数の流体
通過ベシクルから分配されるべく前記ベシクルの流体保
持チャンバに充填される流体の量を自由に選択するため
の流体容量選択・分配手段 を含み、前記装置がサブストレート上に位置合わせして
配置されたときに前記分配手段がマルチウェルサブスト
レートのウェルにナノリッター容量である特定量の流体
を分配することを特徴とする前記流体分配装置。 - 【請求項26】前記流体容量選択・分配手段が前記1組
のベシクルから分配される流体の量を選択するように適
合されることを特徴とする請求の範囲第25項に記載の流
体分配装置。 - 【請求項27】前記流体容量選択・分配手段が特定圧力
条件下で前記ハウジング内部を処置するために前記ハウ
ジング内部と流動的に連結した圧力源を含むことを特徴
とする請求の範囲第25項に記載の流体分配装置。 - 【請求項28】更に、前記流体通過ベシクルから分配さ
れる流体の量を選択するためにハウジング内部の圧力を
変更する手段を含むことを特徴とする請求の範囲第27項
に記載の流体分配装置。 - 【請求項29】前記流体通過ベシクルが毛管作用により
流体で満たされ、更に異なる圧力条件下でハウジング内
部を処置するために圧力源を変更する手段を含み、この
圧力源変更手段が、各ベシクルの流体保持チャンバを所
定流体量に相当する所定の高さにまで満たすために毛管
作用を補償するに十分な圧力条件下でハウジング内部を
処置することを特徴とする請求の範囲第27項に記載の流
体分配装置。 - 【請求項30】前記流体選択手段が、 特定圧力条件下で前記ハウジング内部を処置するために
前記ハウジングに連結し前記ハウジング内部に連通して
いる圧力源、及び 前記圧力源に連結した、前記した各流体通過ベシクルの
流体保持チャンバから分配される流体の量を変化させる
べく該流体通過ベシクルの流体保持チャンバに正圧を加
えるために前記ハウジング内部の圧力を変化させる調節
手段を含むことを特徴とする請求の範囲第25項に記載の
流体分配装置。 - 【請求項31】マルチウェルサブストレートの1つ以上
のウェルに対して化学的または生物学的手法で流体を分
配するための流体分配装置であって、 複数の側面と頂部部分と複数の孔が形成されてなる底部
部分とを有し、前記側面、前記頂部部分及び前記底部部
分により内部が規定されているハウジング、 前記孔内に取り付けられた、前記ハウジング内部に流体
連通して配置されたナノリッター容量の流体を保持する
ための大きさの流体保持チャンバを有する複数の流体通
過ベシクル、及び 前記した複数の流体通過ベシクルを機械的にバイアスさ
せて前記ハウジング底部部分とシール接触させるための
機械的バイアス手段を含み、前記孔がナノリッター容量
の流体を分配することを特徴とする前記流体分配装置。 - 【請求項32】前記した各流体通過ベシクルがフランジ
を含む近位端部部分を有し、更に内部と外部環境との間
に圧力及び流体シールを形成するために前記フランジと
前記ハウジング底部部分の内面との間に配置されるシー
ラー要素を含むことを特徴とする請求の範囲第31項に記
載の流体分配装置。 - 【請求項33】前記機械的バイアス手段が複数のスプリ
ング要素を含み、前記した各スプリング要素の一端は前
記した各流体通過ベシクルの近位端部に、他端は前記ハ
ウジング頂部部分に連結しており、前記スプリング要素
は流体及び圧力シールを形成するために前記ベシクルの
近位端部に機械的バイアス力を加えることを特徴とする
請求の範囲第31項に記載の流体分配装置。 - 【請求項34】更に、前記ハウジング頂部部分をハウジ
ング底部部分に固定するための固定手段を含むことを特
徴とする請求の範囲第31項に記載の流体分配装置。 - 【請求項35】前記固定手段が、前記ハウジングの頂部
部分及び底部部分の1つに形成された複数のファスナ受
容孔と前記ハウジングの頂部部分及び底部部分を一緒に
固定するために前記孔内に取り付けるための複数のファ
スナとを含むことを特徴とする請求の範囲第34項に記載
の流体分配装置。 - 【請求項36】更に、前記ハウジング内部に連通した、
流体を前記流体通過ベシクルの流体保持チャンバに充填
したときに前記ベシクルから流体を選択的に分配するた
めの分配手段を含み、前記装置がサブストレート上に位
置合わせして配置されたときに前記分配手段が前記マル
チウェルサブストレートのウェルに流体を分配すること
を特徴とする請求の範囲第31項に記載の流体分配装置。 - 【請求項37】前記分配手段が前記ハウジングの内部に
流動的に連通している、特定の圧力条件下で前記ハウジ
ング内部を処置するための圧力源を含むことを特徴とす
る請求の範囲第36項に記載の流体分配装置。 - 【請求項38】前記した複数の流体通過ベシクルが前記
ハウジングの孔内に取外し自在且つ取替え自在に取り付
けられていることを特徴とする請求の範囲第31項に記載
の流体分配装置。 - 【請求項39】前記した複数の流体通過ベシクルが流体
送達ニードルのアレーからなることを特徴とする請求の
範囲第31項に記載の流体分配装置。 - 【請求項40】前記流体通過ベシクルが毛管作用により
流体で満たされ、前記分配手段が更に異なる圧力条件下
でハウジング内部を処置するために圧力源を変更する手
段を含み、この圧力源変更手段が、各ベシクルの流体保
持チャンバを所定流体量に相当する所定の高さにまで満
たすために毛管作用を補償するに十分な特定圧力条件下
でハウジング内部を処置することを特徴とする請求の範
囲第36項に記載の流体分配装置。 - 【請求項41】前記分配手段が各ベシクルの流体保持チ
ャンバから分配される流体の量を選択的に変化させるた
めの流体選択手段を含むことを特徴とする請求の範囲第
36項に記載の流体分配装置。 - 【請求項42】更に、 特定圧力条件下で前記ハウジング内部を処置するために
前記ハウジングに連結し前記ハウジング内部に連通して
いる圧力源、及び 前記圧力源に連結した、前記した各流体通過ベシクルの
流体保持チャンバから分配される流体の量を変化させる
べく該流体通過ベシクルの流体保持チャンバに正圧を加
えるために前記ハウジング内部の圧力を変化させる調節
手段を含むことを特徴とする請求の範囲第31項に記載の
流体分配装置。 - 【請求項43】複数の流体通過ベシクルを含むことを特
徴とする請求の範囲第1項に記載の装置。 - 【請求項44】請求の範囲第1項に記載の装置を含むシ
ステムであって、更に前記ハウジングに接続したロボッ
トアームを含み、前記ロボットアームはベシクルをナノ
リッター容量の流体で充填すべくベシクルを流体ソース
に挿入させるためにハウジングを保持し移動させるため
のものであり、前記ベシクルから該ベシクルに近接する
サブストレート表面上に流体を分配させるべくベシクル
を含むハウジングをサブストレートに近接して配置する
ためのものであることを特徴とする前記システム。 - 【請求項45】更に、データを処理し、ロボットアーム
の動作及び操作を制御するための情報を与えるべくプロ
グラム指示を実行するために中央処理手段を含むことを
特徴とする請求の範囲第44項に記載のシステム。 - 【請求項46】前記サブストレートがサブストレート上
に沈着させたサンプルに対して質量分析を実施するため
のものであることを特徴とする請求の範囲第44項に記載
のシステム。 - 【請求項47】サブストレート表面に対して化学的また
は生物学的手法でナノリッター容量の流体を分配するシ
ステムであって、 1つ以上の孔及び前記孔内に取り付けられた1つ以上の
流体通過ピンを含むピンアセンブリであって、前記ピン
が材料の中実軸を含み、ナノリッター容量の流体を捕捉
するための一端を有する前記ピンアセンブリ、及び 前記ピンアセンブリと接触してロボットアームを含み、
前記ロボットアームは流体を前記ピンの端部で捕捉すべ
くピンの端部を流体ソースに挿入するために、またはピ
ン端部上の流体をサブストレート表面と接触させること
により該サブストレート表面上に流体を分配させるべく
サブストレート表面に近接してピンアセンブリを配置す
るためにピンアセンブリを保持・移動させるためのもの
であることを特徴とする前記システム。 - 【請求項48】更に、データーを処理し、ロボットアー
ムの動作及び操作を制御するための情報を与えるべくプ
ログラム指示を実行するために中央処理手段を含むこと
を特徴とする請求の範囲第47項に記載のシステム。 - 【請求項49】前記したナノリッター容量の流体を捕捉
するためのピンの端部が平坦、星形、凹形、山形中実、
山形半中空及び片側若しくは両側傾斜からなる群から選
択される形状を有することを特徴とする請求の範囲第47
項に記載のシステム。 - 【請求項50】前記ピンアセンブリが複数のピンをアレ
ー状に含むことを特徴とする請求の範囲第47項に記載の
システム。 - 【請求項51】サブストレート表面に対して化学的また
は生物学的手法でナノリッター容量の流体を分配するシ
ステムであって、 毛細管のオリフィスを介して分配されるある容量の流体
を収容するための毛細管要素と前記毛細管に接触して、
該毛細管からナノリッター容量の流体を放出させる毛細
管の物理的変形を生じさせるためのトランスデューサ要
素とを含むアセンブリ、 前記アセンブリを保持するため、およびナノリッター容
量の流体を毛細管から該毛細管に整列するサブストレー
ト表面に分配すべくサブストレート表面に近接するアセ
ンブリを整列させるためのロボットアーム、及び 前記ロボットアームを前記アセンブリに固定するための
取り付け手段を含むことを特徴とする前記システム。 - 【請求項52】更に、データーを処理し、ロボットアー
ムの動作及び操作を制御するための情報を与えるべくプ
ログラム指示を実行するための中央処理手段を含むこと
を特徴とする請求の範囲第51項に記載のシステム。 - 【請求項53】前記トランスデューサ要素が圧電、電
気、電気制限、磁気制限及び電気機械トランスデューサ
からなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲
第51項に記載のシステム。
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