JP2004125799A - 核酸の高密度固定化 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 核酸の質量分析による検出のために特に有用である、不溶性表面上に高密度の核酸を固定化する方法及びキットを開示する。固定化核酸を含むアレー、並びに(化学的及び酵素的)核酸合成、ハイブリタイゼーション及び/または配列決定を含めた各種固相核酸化学用途での固定化核酸の使用が提供される。更に、サブストレート表面上にサンプル材料のマルチエレメントアレーを作成するために特定容量の流体を送達することができる連続及び並行分配ツールが提供される。サブストレート表面上にサンプル材料のマルチエレメントアレーを作成するために使用することができるツールを分配する方法も提供される。
【選択図】図1
Description
分子生物学及び生化学野分野並びに病気の診断において、核酸ハイブリダイゼーションは特定のオリゴヌクレオチド配列を検出、分離及び分析するための強力なツールとなりつつある。通常、前記ハイブリダイゼーションアッセイは、例えば逆ドットブロット法(Saiki,R.K.,Walsh,P.S.,Levenson,C.H.及びErlich,H.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,6231(1989))の場合のように固体支持体上に固定化したオリゴデオキシヌクレオチドプローブを使用する。より最近、固体表面に結合させた固定化DNAプローブのアレーがハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)のために開発された(Drmanac,R.,Labat,I.,Brukner,I.及びCrkvenjakov,R.,Genomics,4,114−128(1989);Strezoska,Z.,Pauneska,T.,Radosavljevic,D.,Labat,I.,Drmanac,R.及びCrkvenjakov,R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,10089−10093(1991))。SBHは固体支持体上の固定化オリゴヌクレオチドの規則アレーを使用する。未知DNAのサンプルをアレーに適用し、ハイブリダイゼーションパターンを観察し分析して、配列情報の多くの短ビットを同時に作成する。一本鎖3’−オーバーハングを含む二重らせんプローブを用いるポジショナルSBH(PBSH)と称されるSBHの改良型が開発された(Broude,N.E.,Sano,T.,Smith,C.L.及びCantor,C.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,3072−3076(1994))。PBSH捕捉法を従来のサンガー配列決定法と組み合わせて、例えばゲル電気泳動により検出可能な配列決定用ラダーを作成することが可能である(Fu,D.,Broude,N.E.,Koester,H.,Smith,C.L.及びCantor.C.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,10162−10166(1995))。
本発明により提供される高密度の核酸を表面上に固定化する方法は、修飾表面もしくは修飾核酸の遊離チオール基を適切な条件で他方の成分(表面もしくは核酸)のチオール反応性官能基と反応させることに基づく。この反応は直接であってもまたは二官能性架橋剤を用いて行ってもよい。好ましい実施態様では、修飾核酸がチオール基を含み、架橋剤がヨードアセチル基を含む。
定義
特記しない限り、本明細書に記載の技術用語及び科学用語はすべて本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の特許及び文献はすべて本明細書に援用されるものとする。
本発明の方法により、不溶性(例えば、固体)支持体に核酸分子が高密度で固定化される。通常、核酸分子は直接または架橋剤を用いて不溶性支持体上に固定化される。
本発明で使用される好ましい核酸はチオール修飾核酸、すなわち少なくとも1個の反応性チオール部分を含むように誘導化された核酸である。後記実施例1において更に詳細に記載するように、少なくとも1個の反応性チオールを含む核酸は、好ましくは3’−または5’−ジスルフィドを含む核酸を還元剤で処理して製造される。前記還元剤としては、後続反応で競合しない(すなわち、ヨードアセトイミド官能基と反応しない)ものが好ましい。ジスルフィド誘導化核酸は各種方法に従って合成され得る。例えば、核酸は、ジスルフィド含有修飾剤と反応させることにより3’−または5’−末端で修飾され得る。或いは、チオール化プライマーを酵素的にまたは非酵素的に核酸に結合させることができる。5’−ホスホルアミダイト官能基は、チオールもしくはジスルフィド含有シトシンまたはジオキシシトシンに対する結合点をも提供する。ジスルフィド修飾核酸の還元のために適当な還元剤の例にはトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、ジチオトレイトールが含まれる。TCEPは好ましくは1〜100mM(最も好ましくは約10mM)の濃度、pH3〜6(最も好ましくは約4.5)、温度20〜45℃(最も好ましくは約37℃)で約1〜約10時間(最も好ましくは約5時間)反応させる。ジチオトレイトールは好ましくは25〜100mM(反応物質を単離するかどうかにより)の濃度、pH6〜10(最も好ましくは約8)、温度25〜45℃(最も好ましくは約37℃)で約1〜約10時間(最も好ましくは約5時間)反応させる。TCEには低pHで反応性であるという利点がある。こうした低pHによりチオールが効果的にプロトン化され、よってチオールの求核反応が抑制され、より高いpHで使用される他のジスルフィド還元剤に比較して生じる副反応が少なくなる。
標的検出サイトを、標的核酸分子(T)上の適当な官能基(L’)と捕捉分子上の適当な官能基(L)との間の可逆的もしくは非可逆的結合を介して固体支持体に直接結合させることができる。可逆的結合は、質量分析の条件下(すなわち、電荷移動複合体または不安定結合のような光開裂可能な結合が比較的安定な有機ラジカル間で形成される)で開裂され得るような結合であり得る。
光開裂性リンカーを提供する。特に、光開裂性リンカーをオリゴヌクレオチドの固相合成で使用するためにそのホスホルアミダイト誘導体として提洪する。前記リンカーは、UV照射されると結合体が数分以内に完全に光開裂され得るo−ニトロベンジル部分とホスフェート結合を含んでいる。使用されるUV波長は照射がオリゴヌクレオチドにダメージを与えないように選択され、好ましくは約350〜380nm、より好ましくは365nmである。本発明で提供される光開裂性リンカーは、慣用されているホスホルアミダイトモノマー(例えば、Sinhaら,Tetrahedron Lett.,24:5846−5846(1983);Sinhaら,Nucleic Acids Res.,12:4539−4557(1984);Beaucageら,Tetrahedron,49:6123−6194(1993);及びMatteucciら,J.Am.Chem.Spc.,103:3185−3191(1981)参照)に比較して匹敵し得るカップリング効率を有する。
を有する。
を有する。
を有する。ある実施態様では、R24はアルキル鎖がメチル基で置換された、ω−ヒドロキシアルキルまたはω−(4,4’−ジメトキシトリチルオキシ)アルキルである。
A.式IまたはIIの光開裂性リンカーの製造
式IまたはIIの光開裂性リンカーは、下記する方法により、適切な出発物質を選択することにより方法を若干改変することにより、または当業界で公知の他の方法により製造され得る。
式IIIの光開裂性リンカーは、下記する方法により、適当な出発物質を選択することにより方法を若干改変することにより、または当業者に公知の他の方法により製造することができる。
各種の化学的に開裂可能なリンカーを使用して、固定化核酸と固体支持体との間に開裂可能な結合を導入することができる。
現在、酸不安定リンカーが質量分析用、特にMALDI−TOF MS用の化学的に開裂可能なリンカーとして好ましい。なぜならば、酸不安定結合が3−HPAマトリックス溶液を添加すると核酸のコンディショニング中に開裂するからである。酸不安定結合を別のリンカー基、例えば酸不安定トリチル基として導入することができ、またはジイソプロピルシリルを用いて1つもしくはそれ以上のシリルインターヌクレオシド架橋を導入し、ジイソプロピル結合オリゴヌクレオチドアナログを形成することにより合成核酸リンカー中に組み入れることもできる。DNA骨格中のホスホジエステル結合をジイソプロピルシリル架橋で置換し、穏和な酸性条件下で、例えば1.5%トリフルオロ酢酸(TFA)または3−HPA/1%TFA MALDI−TOFマトリックス溶液の条件下でDNA分子中に1つもしくはそれ以上の鎖内切断が導入される。ジイソプロピルシリル結合オリゴヌクレオチド前駆体及びアナログを製造する方法は当業者に公知である(例えば、Sahaら,J.Org.Chem.,58:7827−7831(1993)を参照されたい)。前記オリゴヌクレオチドアナログは、ジイソプロピルシリル誘導化デオキシリボヌクレオシドを用いる固相オリゴヌクレオチド合成により容易に製造され得る。
特定の実施態様では、3’−または5’−末端以外の位置を修飾した核酸を使用することができる。3’−または5’−末端以外の位置でヌクレオチドの糖部分を修飾することは慣用の方法を用いて可能である。また、核酸塩基の修飾は、例えばF.Eckstein編、Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach”,,IRL Press(1991)に記載されているように、例えばdTのC−5をリンカーアームで修飾することにより実施し得る。前記したリンカーアームはチオール部分を含むように修飾され得る。或いは、骨格修飾核酸(例えば、ホスホルアミダイトDNA)を用いて、チオール基を修飾ホスフェート骨格により付与される窒素中心に結合させることができる。
本発明で使用される不溶性支持体及びサブストレートとして、非限定的にヒーズ(シリカゲル、一定の孔を有するガラス(controlled pore glass)、磁気ビーズ、セファデックス/セファロースビーズ、セロルースビーズ等)、毛細管、平坦な支持体、例えばガラス繊維フィルター、ガラス表面、金属表面(スチール、金、銀、アルミニウム、シリコン及び銅)、(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリド製の)マルチウェルまたは膜を含めたプラスチック材料、ウェハ、コム、ピン(例えば、組合せ合成または分析に適したピンのアレー)、または任意にフィルタープレートを有する平坦な表面、例えばシリコンウェハのようなウェハのピット中のビーズが例示される。
核酸は固定されると、任意の手段、例えば、UV/VIS、IR、蛍光、化学発光を用いて、またはNMR分光分析、質量分析、または当業界で公知の他の方法を用いて、またはこれらを組み合わせて分析され得る。好ましい質量分析計フォーマットにはイオン化(I)、例えばマトリックスによるレーザー脱離(MALDI)、連続もしくしはパルスエレクトロスプレー(ESI)及び関連方法(例えは、イオンスプレーまたはサーモスプレー)、または塊状クラスター衝撃(MCI)が挙げられる。これらのイオン源は、線形もしくは非線形リフレクトロン飛行時間(TOF)、4倍もしくはその倍数、1個もしくはそれ以上の磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FTICR)、イオントラップ、及びハイブリッド検出基を与えるこれらの組み合わせ(例えば、イオントラップ/飛行時間)を含めた検出フォーマットと一致させることができる。イオン化のために、複数のマトリックス/波長の組み合わせ(MALDI)または溶媒の組み合わせ(ESI)を使用することができる。
本発明は、診断ツールによる分析用サンプル材料のアレーを作成する方法及びシステムを提供する。例えば、診断ツールによる分析用サンプル材料のアレーを作成する1つのシステムが図1に示されている。図1に示すシステム10は、データ処理装置12、モーションコントローラ14、ロボットアームアセンブリ16、モニター要素18a、中央処理装置18b、ソース材料の微量滴定プレート20、ステージハウジング22、ロボットアーム24、ステージ26、圧力コントローラ28、管路30、マウンティングアセンブリ32、ピンアセンブリ38及びサブストレート要素34を含む。図1に示す概略図においては、ロボットアームアセンブリ16が可動マウント要素40及び水平スライド溝42を含み得ることが示されている。ロボットアームは場合によりピン36の周りを旋回することができ、これによりアーム24の移動範囲が広がり、アーム24はピンアセンブリ38をソースプレート上に配置することができる。
H=(2γ)/(PGR)
上記式中、Hは高さ、γは表面張力、Pは溶液密度、Gは重力、Rはニードルの半径を示す。各ベシクルにより保持される流体の容量は、内径の直径を選択することにより調整され得る。室温において水は半径100μmの毛細管に長さ15cmまで充填されることに留意されたい。よって、短い径ナノリッターニードルは十分容量まで満たすであろうが、毛管力が十分に小さく、ニードルオリフィスの上部にメニスカスが形成されると考えられるので溢出することはない。これにより、溢出物による相互汚染が防止される。1つの具体例では、ピンアセンブリのベシクルは、容量の異なる流体を保持し分配するためにサイズの異なる内部チャンバを備えることができる。
1つの好ましい実施態様では、シリカ支持体をアミノ官能基で官能化することにより[例えば、支持体を3−アミノプロピルトリエトキシシラン(ウィスコンシン州ミルウォーキーに所在のAldrich Chemical Co.,)のような試薬を用いて誘導化することにより]、核酸分子を該支持体上に共有結合させることができる。他の官能化されたオキシシランまたはオルトシリケートを使用することもでき、これらは例えばペシルバニア州Tullytownに所在のGelest,Inc.から市販されている。例えば、3−メルカプトプロピルトリエトキシシランを使用してシリコン表面をチオール基で官能化することができる。次いで、アミノ官能化シリカをヘテロ二官能性試薬、例えばN−スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIANB)(イリノイ州ロックフォードに所在のPierce)と反応させることができる。使用可能な他のホモ−もしくはヘテロー二官能性試薬は例えばPierceから市販されている。最後に、(例えは、5’−末端が)チオール基で官能化された核酸は、核酸分子のチオール官能基と支持体のヨードアセチル官能基との反応により誘導化されたシリカ支持体に共有結合する。
DNAのシリコンウェハへの高密度結合
材料及び方法
特記しない限り、試薬はすべてウィスコンシン州ミルウォーキーに所在のAldrich Chemicalから入手した。
シリコンウェハをエタノールで洗浄し、ブンゼンバーナーで殺菌し、トルエン中に25容量%の3−アミノプロピルトリエトキシシランを含む無水溶液に3時間浸漬した。次いで、シラン溶液を除去し、ウェハをトルエンで3回、ジメチルスルホキシド(DMSO)で3回洗浄した。次いで、ウェハを無水DMSO中にN−スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)(イリノイ州ロックフォードに所在のPierce Chemical)の10mM無水溶液中でインキュベートした。反応後、SIAB溶液を除去し、ウェハをDMSOで3回洗浄した。
3’−または5’−ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド(カリフォメニア州アラメダに所在のOperon Technologiesまたはオレゴン州ウィルソンビルに所在のOligo Etc.)由来のジスルフィドの還元を、逆相FPLC(ニュージャージー州ピスカタウェーに所在のPharmacia)を用いてモニターした。シフトをジスルフィド開裂時のオリゴデオキシヌクレオチドの保持時間で見ることができる。最適条件を調べるために各種還元方法を試験した。1つの方法では、ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド(31.5nmol,0.5mM)をpH8.0及び37℃でジチオトレイトール(DTT)(イリノイ州ロックフォードに所在のPierce Chemical)(6.2mmol,100mM)とインキュベートした。開裂反応が実質的に完了したら、遊離チオール含有オリゴデオキシヌクレオチドをChromaspin−10カラム(カリフォルニア州パロアルトに所在のClontech)を用いて単離した。なぜならば、DTTは後続の反応で競合する恐れがあるからである。代替方法として、トリス−(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(イリノイ州ロックフォードに所在のPierce Chemical)を使用してジスルフィドを開裂させた。ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチド(7.2nmol,0.36mM)をpH4.5の緩衝液中37℃でTCEPとインキュベートした。TCEPはヨードアセトアミド官能基と競合反応しないので、反応後生成物を単離する必要はなかった。開裂反応のために各種濃度のTCEPを使用して結合反応のために最適な条件を調べた。
上記したようにヨードアセトアミド官能基を含むように誘導化させた各ウェハに対して、100mMリン酸塩緩衝液(pH8)中に遊離チオール含有オリゴデオキシヌクレオチドを含む10mM水溶液を添加した。反応を室温、100%相対湿度で最低5時間実施した。反応後、オリゴデオキシヌクレオチド溶液を除去し、ウェハを50%ホルムアミド(オハイオ州クリーブランドに所在のUSB)を含む5×SSC緩衝液(75MMクエン酸ナトリウム、750mM塩化ナトリウム、pH7)で2回洗浄した。
表面に共有結合したDNAの量及びハイブリダイズされる相補的配列の量を測定するために、放射線標識したプローブを使用した。5’−ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチドを固定化する場合、3’末端をターミナルトランスフェラーゼ酵素及び放射線標識したジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いて放射線標識した。標準反応では、15pmol(0.6μM)の5’−ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチドを、0.2mMの2−メルカプトエタノールの存在下で50μCi(16.5pmol,0.66μM)の[α−32P]ジデオキシアデノシン−5’−トリホスフェート(ddATP)(イリノイ州アーリントンハイツに所在のAmersham)とインキュベートした。40単位のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーセ酵素(オハイオ州クリーブランドに所在のUSB)を添加し、反応を37℃で1時間実施した。その後、バイアルを75℃の水浴に10分間浸漬することにより反応を停止し、生成物をChromaspin−10カラム(カリフォルニア州パロアルトに所在のClontech)を用いて単離した。同様に、5’−ジスルフィド含有オリゴデオキシヌクレオチドを35Sで放射線標識した。
固定化プローブで官能化させたウェハに対して、1M NaCl及びTE緩衝液中に相補的配列(10μM)を含む溶液を添加した。ウェハ及び溶液を75℃に加熱し、3時間かけて室温まで放冷した。その後、溶液を除去し、ウェハをTE緩衝液で2回洗浄した。
上記したように、非放射線標識した固定化オリゴデオキシヌクレオチド(名称TCUC;配列GAATTCGAGCTCGGTACCCGG;分子量6455Da;配列番号1)を含有するウェハを合成し、相補的配列(名称MJM6;配列CCGGGTACCGAGCTCGAATTC;分子量6415Da;配列番号2)をハイブリタイズした。ウェハをカチオン交換用50mMクエン酸アンモニウム緩衝液中で洗浄してDNA骨格上のナトリウムイオン及びカリウムイオンを除去した(Pieles,Uら,Nucl.Acids Res.,21:3191−3196(1993))。3−ヒドロキシピコリン酸のマトリックス溶液(3−HPA,50%アセトニトリル中0.7M 10%クエン酸アンモニウム;Wu,K.J.ら,Rapid Commun.Mass Spectrom.,7:142−143(1993))をウェハ上にスポットし、室温で乾燥させた。ウェハを、導電性テープを用いてFinnigan MAT(ドイツのBremen)Vision2000レフレクトロンTOF質量分析計のサンプルプローブに直接取り付けた。レフレクトロンは5keVイオン源及び20keVポストアクセレレーションを有する。窒素レーザーを使用した。スペクトルはすべて正のイオンモードで得た。
表面化学
標準の二酸化ケイ素修飾化学を用いて、シリコンウェハを3−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させて表面上に第1級アミノ基の均一層を形成した。図7に示すように、次いで表面をヘテロ二官能性架橋剤に接触して表面上にヨードアセトアミド基を形成した。TLCを用いて、溶液中の上記反応の最適反応時間を決定することができた。SIAB架橋剤を長波紫外光(302nm)の下で可視化すると、Rf値が0.58のスポットが見られた。3−アミノプロピルトリエトキシシランは紫外光の下で不活性であった。従って、ニンヒドリンを使用すると、基線に第1級アミンが存在することを示す紫色スポットが現れた。3−アミノプロピルトリエトキシシランに比して僅かに過剰モルのSIABを使用して微量規模反応を実施した。約1分後のTLC分析で、長波長紫外光の下で目に見えるRf値が0.28の新しいスポットが認められた。ニンヒドリンをスプレーしても紫色スポットは生じず、よって3−アミノプロピルトリエトキシシラン出発物質は全て反応で消費された。UV光は、過剰のSIABは反応後残存していることを示した。これらの結果から、約1分後に反応は完了することが分かった。いずれの場合にも、不安定なヨードアセトアミド官能基の加水分解を最小限とすべくヨードアセトアミド官能化したウェハは直ちに使用した。ヨードアセトアミド官能基は感光性であるので、ウェハの取り扱いはすべて暗室で行った。
上記したように35S−標識プローブをウェハの表面に結合し、結合体密度を測定した後、32P標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション効率及び密度をホスホロイメージャー及び銅ホイルを用いて測定した。銅フォイルは35S信号の98.4%をブロックし、32P信号を十分に検出できることが実験的に判明した。相補的配列は再現可能にハイブリダイズして、表面1mm2当たり105fmolが生じた。これは、ハイブリダイゼーションに利用可能な結合プローブの約40%に相当する。このスキームで同様に非相補的配列を使用した場合には、非特異的結合は表面1mm2当たり5fmol未満であった。
ウェハをプローブで官能化し、相補的配列をハイイブリダイズし、サンプルを上記したような標準MALDI条件で分析した。分析により、アニールした鎖(MJM6)のみが質量/電荷数実験値が6415.4の質量スペクトルで観察された。質量/電荷数の理論値は6415である(図9)。6455の質量/電荷数で信号はなかったが、ウェハ結合鎖(TCUC)は脱離せず、よってヨードアセトアミド結合はレーザーに耐えるに十分な安定性を有しており無傷のままであることが判明した。6262.0の質量/電荷数で別の信号が観察された。この信号はグアノシンの脱プリン化により生じた。なぜならば、DNAがMALDIプロセス中にプリン塩基の損失を受けやすいことは公知であるからである(Nordoff,E.ら,Rapid Commun.Mass Spectrom.,6:771−776(1992))。均一な分布は良好なスポットを得るのに必要であったが、ウェハ上のサンプル結晶は均一に分布されていなかった。この不均一性のために、質量解像が変化するが、通常マススペクトルにおける脱離オリゴヌクレオチドの場合200〜300の範囲である。1連の実験で、非相補的配列をウェハにハイブリダイズした。上記したように洗浄後のMALDI−TOF MS分析により、信号が検出されなかったことから非特異的アニーリングは最小であることが分かった。
増幅DNA標的のシリコンウェハに対する固定化
特定の増幅DNA標的配列の特定遊離チオール含有DNAフラグメントを分析するために、SIAB結合シリコンウェハを使用した。
ApoE遺伝子におけるスペクトロチップ突然変異体検出
本実施例では、診断目的での野生型及び突然変異アポリポタンパク質E遺伝子の検出のための固定化鋳型のハイブリダイゼーション、プライマーエクステンション及び質量分析を記載する。本実施例では、特定配列を含む固定化DNA分子を、非標識アレレ特定プライマーのプライマーエクステンション及びエンステンション産物の質量分析法による分析を用いて検出、区別できることを立証する。
またはコドン158にG→Aトランジッションを有する突然変異アポリポタンパク質E遺伝子に相補的な50塩基合成DNA鋳型:5'-GCCTGGTACACTGCCAGGCACTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAG-3'(配列番号18)
をカップリングして、図7に本質的に概説し、実施例1及び2に記載したSIAB誘導化シリコンウェハを分離した。
連続及び並行分配ツールを用いるDNAアレーの作成
マトリックスによるレーザー脱離イオン化質量分析のために、ロボット駆動式連続及び並行pL−nL分配ツールを用いて平坦なまたは幾何学的に変更を加えた(例えば、ウェルを有する)表面を有する<1平方インチチップ上に10〜103エレメントDNAアレーを作成した。前者では、圧電ピペット(内径70μmの毛細管)で〜0.2nlのマトリックス液滴をチップ上に一回もしくは複数回分配した後分析した。この方法を用いて、0.2fmol程度の36量体DNAからスペクトルを得た。急速に(<5秒)蒸発するが、分析対象物を含む3−ヒドロキシピコリン酸マトリックスの微結晶が通常生成され、よって大容量作成で通常得られるよりも高い再現性が得られた。100個の800μmウェル中の5fmolの23量体のスポットの全てで信号/ノイズ比が>5の99/100親イオン信号を有する容易に解釈される質量スペクトルが得られた。第2の方法では、384ウェル微量滴定プレートからのプローブを、表面接触によりチップに〜20nlを移すスプリング付きピンのアレーを用いてチップウェルまたは平坦な表面に一度に分配する。並行方法で沈着させたアレーエレメントのMS分析は、感度及び解像度の点で連続方法に匹敵する。
実験システムは北ドイツに所在のMicrodrop GmbHから購入したシステムを改良したものであり、分配すべき溶液を保持するガラス毛細管に結合しその周りの圧電要素にパルス信号を送る圧電要素ドライバ;毛細管に(負圧により)充填または毛細管を(正圧により)空にするための圧力トランスデューサ;充填、取り出し、分配及び洗浄のために毛細管を移動させるためのロボットxyzステージ及びロボットドライバ;「保留(suspended)」液滴特性を目視可能にするためのストロボスコープ及び圧電要素の周波数でパルスを出すドライバ;ソース及び指定プレートまたはサンプル標的のための別個のステージ(すなわち、Siチップ);指定プレートへの充填を目視するためのロボットアームに取り付けたカメラ;及び圧力ユニット、xyzロボットアーム及び圧電ドライバを制御するデータステーションを含み得る。
ロボットピンツールは、プローブブロック内に収容され且つX,Y,Zロボットステージ上に載置された16個のプローブからなる。ロボットステージは、ロボットアームの下にサンプルトレーを配置することができるガントリーシステムであった。前記ガントリーユニットそれ自体は、リニアオプティカルエンコーダにより与えられる位置フィードバックを有するブラシレスリニアサーボモーターにより案内される、それぞれ250mm及び450mm移動するX及びYアームからなる。Z軸(鉛直に50mm移動)により駆動される鉛スクリューがガントリーユニットのxy軸側に取り付けられており、モーター載置ロータリーオプティカルエンコーダによる位置フィードバックを有するインラインロータリーサーボモーターにより制御される。システムの作動域には、5枚の微量滴定プレート(最も一般的には、最高1152の異なるオリゴヌクレオチド溶液に対して2枚の洗浄溶液プレート及び3枚のサンプルプレート)及び最高10枚のウェハを保持するスライドアウトツールプレートが設けられている。ウェハは2つの裏打ちピンに対してプレート内に正確に配置され、真空により確実に固定されている。システム全体は安全のためにプレキシガラスハウジング内に収容されており、熱及び振動を抑制するためにスチール支持レーム上に載置されている。動作のコントロールは3軸サーボコントローラであり、コンピュータに統合される市販のモーションコントローラを使用することにより達成される。特定の用途のためのプログラムコードが所要により書かれている。
1.連続
オリゴヌクレオチド(配列及び濃度の異なる0.1〜50ng/μl)を96ウェル−微量滴定プレートのウェルに充填した。第1のウエルをマトリックス溶液用に残した。ピットを設けたチップ(MALDI標的セクションの標的6a)をステージ上に置き、手動で整列させた。(Windows(登録商標)の)ロボット制御ソフトウェアに、第1ウェルの座標、アレーサイズ(すなわち、x×yにおけるスポット数)及びエレメント間の距離、並びに1つのアレーエレメント当たりの0.2nl液滴の数をインプットした。毛細管に〜10μLのリンスH2Oを充填し、連続パルスモードでチップの一体性及び清潔度をチェックすべくストロボ発光カメラで目視するために自動的に移動し、空にした。次いで、毛細管にマトリックス溶液を充填し、再びストロボスコープでチェック後、平坦なもしくはピット付き表面上のアレーをスポットするために使用した。再現可能に別のMSモードで研究するために、通常0.2〜20nlの液滴の10×10アレーを分配した。正圧を加えて毛細管を空にし、必要によりH2Oですすぎ、0.05〜2.0μMの合成オリゴ〜5μLを抜き取るソースオリゴプレートに誘導した。次いで、毛細管を、0.2〜20nl水溶液を添加したマトリックススポットのそれぞれに亘って連続してラスタした。
並行プログラムは、オフセット印刷によるアレー作成をコントロールするために書かれた。10枚のウェハ上に64×64エレメントのアレーを作成するためには、例えばツールを384ウェル−DNAソースプレートの16ウェルに浸し、標的(例えば、Si、プラスチック、金属)に移動し、サンプルを表面接触によりスポットした。次いで、ツールを同じ16ウェルに浸し、第2標的上にスポットした。このサイクルを10枚のウェハすべてに対して繰り返した。次いで、ツールを洗浄溶液に浸し、ソースプレートの別の16枚のウェハに浸し、最初の組の16スポットから2.25mmはずれた標的上にスポットした。これを、再び10枚のウェハすべてに対して繰り返した。全サイクルを繰り返して、各ピンから2×2アレーを作成し、スポットの8×8アレーを作成した[(2×2エレメント/ピン)×16ピン=スポットされたエレメントの全数64]。
いずれかの分配スキームに続いて、充填したチップを、1組のベベルスクリューを取り付けたポリカーボネート支持体を有するMALDI−TOFソースプレート上に据え付けた。前記プレートをプローブの末端上に移し、飛行時間型質量分析計のソース領域において1μm分解度、1”移動xyステージ(Newport)上に保持した。通常18〜26kV抽出で操作される装置は、線形またはわん曲フィールド反射モード及び連続もしくは遅延抽出モードで操作され得た。
圧電ピペットを用いる連続分配
飽和3FPA溶液を送達すると毛細管−空気界面で溶媒が蒸発するのでチップの閉塞が起こり得るが、マトリックスが溶液中に残り、毛細管が空になるまで維持される安定なスプレーが得られるようにDNA及びマトリックスの予混合によりマトリックスを十分に希釈する。1:1希釈(H2O中)マトリックス溶液で>>10分間の連続スプレーが可能であった。毛細管が>5分間放置されるように圧電要素を止め、圧電要素を再び動かしても、毛細管が閉塞することはなかった。
アッセイは上記したオフセット印刷を用いて作成した。X及びYステージの速度は35インチ/秒であり、Zステージの速度は5.5インチ/秒である。サイクル時間を短縮するためにXおよびYステージを最高速度で移動させることも可能であるが、ダメージを避けるために表面がウェハと接触する前にZステージの速度を低下させなければならない。そのような軸速度では、10枚すべてのウェハに対して16エレメント(同一溶液の1つのツールキャビティ)をスポットするための適切なサイクル時間は20秒であり、256エレメントのアレーを作成するには〜5.3分を要する。前記アレーに各種オリゴヌクレオチドを充填する場合、別の溶液に浸漬する前にピンチップを清潔にするために追加の洗浄ステップを設けなければならず、10枚のウェハを作成するためにサイクル時間が25秒まで、または6.7分まで延びる。
核酸アレーを作成するための高密度核酸固定化の使用
実施例1に記載の高密度結合方法を用いて、MALDI−TOF質量分析にかけやすいDNAオリゴマーのアレーを、実施例1に記載の高密度結合方法を用いてその表面上に複数位置、例えば複数の窪みまたはパッチを有するシリコンウェハ上に作成した。前記アレーに対して、ウェハの特定位置でのみ遊離チオール含有オリゴヌクレオチドプライマーを固定化した(例えば、図14参照)。アレーの各位置は3つのオリゴヌクレオチドの1つを含んでいた。異なる固定化オリゴヌクレオチドが別々に検出され区別され得ることを立証するために、3種のオリゴマーの1つの相補的であり、長さの異なる3種の別個のオリゴヌクレオチドをウェハのアレーに対してハイブリダイズし、MALDI−TOF質量分析法により分析した。
相補的オリゴヌクレオチド対の1メンバーが3’−または5’−ジスルフィド結合を含んでいる(Operon TechnologiesまたはOligos,Etc.から購入)相補的オリゴデオキシヌクレオチド対3組を合成した。例えば、オリゴマー1[d(CTGATGCGTCGGATCATCTTTTTT-SS);配列番号8]は3’−ジスルフィド結合を含むのに対して、オリゴマー2[d(SS-CCTCTTGGGAACTGTGTAGTATT);配列番号3の5’−ジスルフィド誘導体]及びオリゴマー3[d(SS-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG);配列番号1の5’−ジスルフィド誘導体]はそれぞれ5’−ジスルフィド結合を含む。
(a)4×4(16箇所)アレー
16×16ウェルアレーの形態の256個の窪みもしくはウェルを有する2×2cm2シリコンウェハを業者(テキサス州カレッジステーションに所在のAccelerator Technology Corp.)から購入した。ウェルは800×800μm2、120μm深さ、1.125ピッチであった。シリコンウェハを3−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させて、表面上に第1級アミンの均一層を形成し、その後ヘテロ二官能性架橋剤SIABに接触させて、表面上にヨードアセトアミド官能基を生じさせた(例えば、図7参照)。
MALDI−TOF MS分析を、図15に示し実施例1に実質的に記載したハイブリタイゼーションアレーの16箇所の各々に対して連続して実施した。DNAハイブリダイゼーションアレーの16箇所の各々に対して特異的にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの質量スペクトルを図16に示す。質量スペクトルは、特定の相補的ヌクレオチド配列に対応する質量/電荷数の測定値を示す各位置の特定信号を示した。
ウェルの16×16アレーを形成する256個の窪みまたはウェルを有する2×2cm2シリコンウェハを業者(テキサス州カレッジステーションに所在のAccelerator Technology Corp.)から購入した。ウェルは800×800μm2、120μm深さ、1.125ピッチであった。シリコンウェハを3−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させて、表面上に第1級アミンの均一層を形成し、その後ヘテロ二官能性架橋剤SIABに接触させて表面上にヨードアセトアミド官能基を生じさせた(例えば、図7参照)。
シリコンウェハ上に固定化されたDNA鋳型に結合したハイブリダイズDNAプライマーのエクステンション
SIAB誘導化シリコンウェハを、米国特許第5,605,798号明細書に実質的に記載されている手順を用いる固定化DNA鋳型のプライマーエクステンション反応のために使用することができる。
シリコンウェハ上に固定化したDNA鋳型に結合したハイブリダイズDNAプライマーのポリメラーゼエクステンションに対するリンカー長さの影響
SIAB誘導化シリコン表面と標的DNAのハイブリダイゼーションにより形成された二重らせんDNAとの距離の固定化されたオリゴマー鋳型に対する影響及び酵素の選択を調べた(例えは、図19参照)。
鎖置換及び固定化相補的核酸へのハイブリダイゼーションによる二本鎖核酸分子の検出
本実施例では、24量体プライマーを固定化し、二重らせんDNA分子の1本鎖を特異的ハイブリダイゼーションすることにより液相中で特定標的分子を増幅でき且つ二本鎖分子を検出できることを示す。
5'-CTGATGCGTCGGATCATC-3'(配列番号16)
3'-GCAGCCTAGTAG-5'(配列番号12)
1−(2−ニトロ−5−(3−O−4,4’−ジメトキシトリチルプロポキシ)フェニル)−1−O−((2−シアノエトキシ)−ジイソプロピルアミノホスフィノ)エタン
A.2−ニトロ−5−(3−ヒドロキシプロポキシ)ベンズアルデヒド
3−ブロモ−1−プロパノール(3.34g,24mmol)を無水アセトニトリル中で5−ヒドロキシ−2−ニトロベンズアルデヒド(3.34g,20mmol)、K2CO3(3.5g)及びKI(100mg)と一晩(15時間)還流した。反応混合物を室温に冷却し、ジクロロメタン150mlを添加した。混合物を濾過し、固体残渣をジクロロメタンと洗浄した。合わせた有機溶液を蒸発乾固し、ジクロロメタン100ml中に再溶解した。生じた溶液を飽和NaCl溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を真空下で除去後、所望の生成物4.31g(96%)が得られた。
Rf=0.33(ジクロロメタン/メタノール=95/5)
UV(メタノール):最大313,240(肩),215nm、最小266nm1H NMR(DMSO−d6)δ 10.28(s,1H)、8.17(d,1H)、7.35(d,1H)、7.22(s,1H)、4.22(t,2H)、3.54(t,2H)、1.90(m,2H)
13C NMR(DMSO−d6)δ 189.9、153.0、141.6、134.3、127.3、118.4、114.0、66.2、56.9、31.7
2−ニトロ−5−(3−ヒドロキシプロポキシ)ベンズアルデヒド(1g,4.44mmol)を無水アセトニトリル50mlに溶解した。この溶液に、トリエチルアミン1ml、イミダゾール200mg及びtBDMSCl0.8g(5.3mmol)を添加した。混合物を室温で4時間撹拌した。反応を止めるためにメタノール1mlを添加した。溶媒を真空下で除去し、固体残渣をジクロロメタン100mlに再溶解した。生じた溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液、次いで水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下で除去した。粗混合物をクイックシリカゲルカラムにかけ、ジクロロメタンで溶出すると、2−ニトロ−5−(3−O−t−ブチルジメチルシリルプロポキシ)ベンズアルデヒド1.44g(96%)が得られた。
Rf=0.67(ヘキサン/酢酸エチル=5/1)
UV(メタノール):最大317,243,215nm、最小235,267nm
1H NMR(DMSO−d6)δ 10.28(s,1H)、8.14(d,1H)、7.32(d,1H)、7.20(s,1H)、4.20(t,2H)、3.75(t,2H)、1.90(m,2H)、0.85(s,9H)、0.02(s,6H)
13C NMR(DMSO−d6)δ 189.6、162.7、141.5、134.0、127.1、118.2、113.8、65.4、58.5、31.
2、25.5、−3.1、−5.7
高真空乾燥した2−ニトロ−5−(3−O−t−ブチルジメチルシリルプロポキシ)ベンズアルデヒド(1.02g,3mmol)を無水ジクロロメタン50mlに溶解した。トルエン(3ml)中2Mトリメチルアルミニウムを10分間を要して滴下し、反応混合物を室温で保持した。更に10分間撹拌し、混合物を氷冷水10mlに注いだ。乳濁液を水相から分離し、硫酸ナトリウム100gで乾燥して残存する水を除去した。溶媒を真空下で除去し、混合物をシリカゲルカラムにかけ、ジクロロメタン中メタノールで勾配溶離した。所望の生成物0.94g(86%)が単離された。
Rf=0.375(ヘキサン/酢酸エチル=5/1)
UV(メタノール):最大306,233,206nm、最小255,220nm
1H NMR(DMSO−d6)δ 8.00(d,1H)、7.36(s,1H)、7.00(d,1H)、5.49(b,OH)、5.31(q,1H)、4.19(m,2H)、3.77(t,2H)、1.95(m,2H)、1.37(d,3H)、0.86(s,6H)、0.04(s,6H)
13C NMR(DMSO−d6)δ 162.6、146.2、139.6、126.9、112.9、112.5、64.8、63.9、58.7、31.5、25.6、24.9、−3.4、−5.8
1−(2−ニトロ−5−(3−O−t−ブチルジメチルシリルプロポキシ)フェニル)エタノール(0.89g,2.5mmol)をTHF30mlに溶解し、nBu4NF0.5mmolを撹拌しながら添加した。混合物を室温で5時間撹拌し、溶媒を真空下で除去した。残渣をシリカゲルカラムにかけ、ジクロロメタン中メタノールで勾配溶離した。1−(2−ニトロ−5−(3−ヒドロキシプロポキシ)フェニル)エタノール0.6g(99%)が得られた。
Rf=0.17(ジクロロメタン/メタノール=95/5)
UV(メタノール):最大304,232,210nm、最小255,219nm
1H NMR(DMSO−d6)δ 8.00(d,1H)、7.33(s,1H)、7.00(d,1H)、5.50(d,OH)、5.28(t,OH)、4.59(t,1H)、4.17(t,2H)、3.57(m,2H)、1.89(m,2H)、1.36(d,2H)
13C NMR(DMSO−d6)δ 162.8、146.3、139.7、127.1、113.1、112.6、65.5、64.0、57.0、31.8、25.0
1−(2−ニトロ−5−(3−ヒドロキシプロポキシ)フェニル)エタノール(0.482g,2mmol)を無水ピリジンと2回共蒸発させ、無水ピリジン20mlに溶解した。溶液を氷水浴で冷却し、DMTC1750mg(2.2mmol)を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、反応を止めるためにメタノール0.5mlを添加した。溶媒を真空下で除去し、残渣をトルエンと2回共蒸発させて痕跡量のピリジンを除去した。最終残渣をシリカゲルカラムにかけ、トリエチルアミンを数滴含むジクロロメタン中メタノールで勾配溶離した。所望の生成物である1−(2−ニトロ−5−(3−O−4,4’−ジメトキシトリチルプロポキシ)フェニル)エタノール0.96g(89%)が得られた。
Rf=0.50(ジクロロメタン/メタノール=99/1)
UV(メタノール):最大350(肩),305,283,276(肩),233,208nm、最小290,258,220nm
1H NMR(DMSO−d6)δ 8.00(d,1H)、6.82−7.42(ArH)、5.52(d,OH)、5.32(m,1H)、4.23(t,2H)、3.71(s,6H)、3.17(t,2H)、2.00(m,2H)、1.37(d,3H)
13C NMR(DMSO−d6)δ 162.5、157.9、157.7、146.1、144.9、140.1、139.7、135.7、129.5、128.8、127.6、127.5、127.3、126.9、126.4、113.0、112.8、112.6、85.2、65.3、63.9、59.0、54.8、28.9、24.9
1−(2−ニトロ−5−(3−O−4,4’−ジメトキシトリチルプロポキシ)フェニル)エタノール(400mg,0.74mmol)を高真空下で乾燥し、無水ジクロロメタン20mlに溶解した。この溶液に、N,N−ジイソプロピルエチルアミン0.5ml及び2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト0.3ml(1.34mmol)を添加した。反応混合物を室温で30分間撹拌し、反応を止めるためにメタノール0.5mlを添加した。混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を真空下で除去し、クイックシリカゲルカラムにかけ、トリエチルアミンを数滴含むジクロロメタン中1%メタノールで溶離した。所望のホスホルアミダイト510mg(93%)が得られた。
Rf=0.87(ジクロロメタン/メタノール=99/1)
1−(4−(3−O−4,4’−ジメトキシトリチルプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)−1−O−((2−シアノエトキシ)−ジイソプロピルアミノホスフィノ)エタン
A.4−(3−ヒドロキシプロポキシ)−3−メトキシアセトフェノン
3−ブロモ−1−プロパノール(53ml,33mmol)を無水アセトニトリル100ml中で4−ヒドロキシ−3−メトキシアセトフェノン(5g,30mmol)、K2CO3(5g)及びKI(300mg)と一晩(15時間)還流した。室温に冷却後ジクロロメタン(150ml)を反応混合物に添加した。混合物を濾過し、固体残渣をジクロロメタンで洗浄した。合わせた有機溶液を蒸発乾固し、ジクロロメタン100mlに再溶解した。生じた溶液を飽和NaCl溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を真空下で除去後所望生成物6.5g(96.4%)が得られた。
Rf=0.41(ジクロロメタン/メタノール=95/5)
UV(メタノール):最大304,273,227,210nm、最小291,244,214nm
1H NMR(DMSO−d6)δ 7.64(d,1H)、7.46(s,1H)、7.04(d,1H)、4.58(b,OH)、4.12(t,2H)、3.80(s,3H)、3.56(t,2H)、2.54(s,3H)、1.88(m,2H)
13C NMR(DMSO−d6)δ 196.3、152.5、148.6、129.7、123.1、111.5、110.3、65.4、57.2、55.
5、31.9、26.3
4−(3−ヒドロキシプロポキシ)−3−メトキシアセトフェノン(3.5g,15.6mmol)を乾燥し、無水アセトニトリル80mlに溶解した。この混合物にトリエチルアミン6ml及び無水酢酸6mlを添加した。4時間後、メタノール6mlを添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣をジクロロメタン100mlに溶解し、溶液を希重炭酸ナトリウム溶液、次いで水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去した。固体残渣をシリカゲルカラムにかけ、ジクロロメタンで溶離すると、4−(3−アセトキシプロポキシ)−3−メトキシアセトフェノン4.1g(98.6%)か得られた。
Rf=0.22(ジクロロメタン/メタノール=99/1)
UV(メタノール):最大303,273,227,210nm、最小290,243,214nm
1H NMR(DMSO−d6)δ 7.62(d,1H)、7.45(s,1H)、7.08(d,1H)、4.42(m,4H)、3.82(s,3H)、2.54(s,3H)、2.04(m,2H)、2.00(s,3H)
13C NMR(DMSO−d6)δ 196.3、170.4,152.2、148.6、130.0、123.0、111.8、110.4、65.2、60.8、55.5、27.9、26.3、20.7
4−(3−アセトキシプロポキシ)−3−メトキシアセトフェノン(3.99g,15mmol)を水浴にて70%−HNO315mlに少しずつ添加し、反応温度を室温に維持した。反応混合物を室温で30分間撹拌し、砕いた氷30gを添加した。この混合物をジクロロメタン100mlで抽出し、有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下で除去した。粗混合物をシリカゲルカラムにかけ、ジクロロメタン中メタノールで勾配溶離すると、所望生成物の4−(3−アセトキシプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロアセトフェノン3.8g(81.5%)及びipso置換生成物てある5−(3−アセトキシプロポキシ)−4−メトキシ−1,2−ジニトロベンゼン0.38g(8%)が得られた。
ipso置換副生成物5−(3−アセトキシプロポキシ)−4−メトキシ−1,2−ジニトロベンゼン:
Rf=0.47(ジクロロメタン/メタノール=99/1)
UV(メタノール):最大334,330,270,240,212nm、最小310,282,263,223nm
1H NMR(CDCl3)δ 7.36(s,1H)、7.34(s,1H)、4.28(t,2H)、4.18(t,2H)、4.02(s,3H)、2.20(m,2H)、2.08(s,3H)
13C NMR(CDCl3)δ 170.9、152.2、151.1、117.6、111.2、107.9、107.1、66.7、60.6、56.9、28.2、20.9
所望生成物4−(3−アセトキシプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロアセトフェノン:
Rf=0.29(ジクロロメタン/メタノール=99/1)
UV(メタノール):最大344,300,246,213nm、最小320,270,227nm
1H NMR(CDCl3)δ 7.62(s,1H)、6.74(s,1H)、4.28(t,2H)、4.20(t,2H)、3.96(s,3H)、2.48(s,3H)、2.20(m,2H)、2.08(s,3H)
13C NMR(CDCl3)δ 200.0、171.0、154.3、148.8、138.3、133.0、108.8、108.0、66.1、60.8、56.6、30.4、28.2、20.9
4−(3−アセトキシプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロアセトフェノン(3.73g,12mmol)にエタノール150ml及びK2CO36.5gを添加した。混合物を室温で4時間撹拌した。ジクロロメタン中5%メタノールを用いるTLCは反応の完了を示した。この同じ反応混合物にNaBH43.5gを添加し、混合物を室温で2時間撹拌した。アセトン10mlを添加して残りのNaBH4と反応させた。溶媒を真空下で除去し、残渣をシリカゲル50gに吸収させた。このシリカゲル混合物をシリカゲルカラムの上部にかけ、ジクロロメタン中5%メタノールで溶離して、所望生成物の1−(4−(3−ヒドロキシプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)エタノール3.15g(97%)が得られた。脱保護後の中間生成物の4−(3−ヒドロキシプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロアセトフェノン:
Rf=0.60(ジクロロメタン/メタノール=95/5)
最終生成物の1−(4−(3−ヒドロキシプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)エタノール:
Rf=0.50(ジクロロメタン/メタノール=95/5)UV(メタノール):最大344,300,243,219nm、最小317,264,233nm
1H NMR(DMSO−d6)δ 7.54(s,1H)、7.36(s,1H)、5.47(d,OH)、5.27(m,1H)、4.55(t,OH)、4.05(t,2H)、3.90(s,3H)、3.55(q,2H)、1.88(m,2H)、1.37(d,3H)
13C NMR(DMSO−d6)δ 153.4、146.4、138.8、137.9、109.0、108.1、68.5、65.9、57.2、56.0、31.9、29.6
1−(4−(3−ヒドロキシプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)エタノール(0.325g,1.2mmol)を無水ピリジンと2回共蒸発し、無水ピリジン15mlに溶解した。溶液を氷水浴で冷却し、DMTCI450mg(1.33mmol)を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、反応を止めるためにメタノール0.5mlを添加した。溶媒を真空下で除去し、残渣をトルエンと2回共蒸発させて痕跡量のピリジンを除去した。最終残渣をシリカゲルカラムにかけ、トリエチルアミンを数滴含むジクロロメタン中メタノールで勾配溶離して、所望生成物の1−(4−(3−O−4,4’−ジメトキシトリチルプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)エタノール605mg(88%)が得られた。
Rf=0.50(ジクロロメタン/メタノール=95/5)
UV(メタノール):最大354,302,282,274,233,209nm、最小322,292,263,222nm
1H NMR(DMSO−d6)δ 7.54(s,1H)、6.8−7.4(ArH)、5.48(d,OH)、5.27(m,1H)、4.16(t,2H)、3.85(s,3H)、3.72(s,6H)、3.15(t,2H)、1.98(t,2H)、1.37(d,3H)
13C NMR(DMSO−d6)δ 157.8、153.3、146.1、144.9、138.7、137.8、135.7、129.4、128.7、127.5、127.4、126.3、112.9、112.6、108.9、108.2、85.1、65.7、63.7、59.2、55.8、54.8、29.0、25.0
1−(4−(3−O−4,4’−ジメトキシトリチルプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)エタノール(200mg,3.5mmol)を高真空下で乾燥し、無水ジクロロエタン15mlに溶解した。この溶液にN,N−ジイソプロピルエチルアミン0.5ml及び2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト0.2ml(0.89mmol)を添加した。反応混合物を室温で30分間撹拌し、反応を止めるためにメタノール0.5mlを添加した。混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を真空下で除去し、クイックシリカゲルカラムにかけ、トリエチルアミンを数滴含むジクロロメタン中1%メタノールで溶離して、所望ホスホルアミダイトの1−(4−(3−O−4,4’−ジメトキシトリチルプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)−1−O−((2−シアノエトキシ)−ジイソプロピルアミノホスフィノ)エタン247mg(91.3%)が得られた。
Rf=0.87(ジクロロメタン/メタノール=99/1)
オリゴヌクレオチド合成
光開裂性リンカーを含むオリゴヌクレオチド結合体を標準条件下で固相核酸合成(Sinhaら,TetrahedronLett.,24,5843−5846(1983);Sinhaら,Nucleic Acids Res.,12,4539−4557(1984);Beaucageら,Tetrahedron,49,6123−6194(1993);及びMatteucciら,J.Am.Chem.Soc.,103,3185−3191(1981)参照)により製造した。また、光開裂性単位及び5’末端アミノ基を導入するためにより長いカップリング時間を使用した。カップリング効率を遊離DMTカチオンの吸光度を測定することにより調べ、その結果はホスホルアミダイトの1−(2−ニトロ−5−(3−O−4,4’−ジメトキシトリチルプロポキシ)フェニル)−1−O−((2−シアノエトキシ)−ジイソプロピルアミノホスフィノ)エタンまたは1−(4−(3−O−4,4’−ジメトキシトリチルプロポキシ)−3−メトキシ−6−ニトロフェニル)−1−O−((2−シアノエトキシ)−ジイソプロピルアミノホスフィノ)エタンのカップリング効率は従来のヌクレオシドホスホルアミダイトに匹敵することを示した。濃アンモニウムを用いて55℃で一晩処理して塩基保護を脱保護し、固体支持体から結合体を遊離した。他の結合体の塩基保護は、AMA試薬を用いて迅速に脱保護した。結合体上MMTの精製は、0.1M酢酸トリエチルアンモニウム(pH7.0)を用い、アセトニトリル(20分で5%→25%)の勾配を用いてHPLC(トリチル−オン)で実施した。集めたMMTまたはDMT保護結合体の容量を減らし、80%酢酸水溶液を用いて脱トリチル化し(40分、0℃)、脱塩し、−20℃で保存した。
光分解研究
通常、200μlの蒸留水中の光開裂性リンカー含有オリゴヌクレオチド2nmolを、10cmの距離から長波長UVランプ(Blak Ray XX−15UVランプ、カリフォルニア州サンガブリエルに所在のUltravioletの製品)で照射した(励起ピーク365nm,距離31cmでのランプ照射の強さ=1.1mW/cm2)。生じた混合物を、0.1M酢酸トリエチルアンモニウム(pH7.0)及びアセトニトリル勾配を用いてHPLC(トリチル−オフ)で分析した。分析は、結合休はUV照射で数分以内にリンカーから開裂されることを示した。
当業者ならば、本明細書に記載した特定の方法に対する多数の均等物を通常の実験により想到し得、または確認することができる。前記均等物も本発明の範囲内であると見做され、下記する請求の範囲により包含される。
Claims (90)
- サブストレート表面上にサンプル材料のアレーを形成する方法であつて、
前記サンプル材料を含む溶媒からなる流体を収容する内部チヤンバを有するベシクルを用意するステップ、
前記表面と前記ベシクルを接触させることなく、前記サブストレート表面上の第1位置に近接させてベシクルを配置するステップ、
前記サブストレート表面の第1位置でナノリッター容量の流体を分配すべく前記流体を前記チャンバから放出させるためにベシクルの内部に機械的圧力を与えるステップ、及び
前記サブストレート表面に近接する1組の位置の各々に前記ベシクルを移動させて、前記サブストレート上にサンプル材料のアレーを形成する前記1組の位置の各位置にナノリッター容量の流体を分配するステップを含むことを特徴とする前記方法。 - 前記サブストレートが前記チャンバから放出された流体を受容すべく位置を規定するためにサブストレート上に形成されたウェルを有することを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 前記サンプル材料が質量分析用マトリックス材料を含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 更に、前記マトリックス材料を含む溶媒をサブストレート表面上で蒸発させて該表面上にマトリックス材料を沈着させるために所定時間待機するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第3項に記載の方法。
- 更に、ナノリッター容量の分析対象材料を含む流体を、蒸発させたマトリックス材料上に放出して前記マトリックス材料で溶解し、前記サブストレート表面上に結晶性構造物を形成させることを含むことを特徴とする請求の範囲第4項に記載の方法。
- 前記サンプル材料が分析対象材料及び質量分析用マトリックス材料を含む溶媒からなることを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 更に、沈着させたサンプル材料のアレーを、前記サンプル材料の組成を示す情報を測定する診断ツールを用いて分析するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 診断ツールが質量分析計であることを特徴とする請求の範囲第7項に記載の方法。
- 前記ベシクルが更に、ナノリッター容量の流体をチャンバから放出させるための圧力を与える圧電要素を含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 前記ベシクルを移動させるステップが、前記ベシクルを、前記サブストレート表面を横断してラスタさせるステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- ベシクルアセンブリの前記ベシクル部分が、サブストレート表面上の第1の複数位置に流体を分配するために、マトリックスに配置された複数のベシクルを有することを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 前記ベシクルを移動させるステッブが、ベシクルを含むベシクルアセンブリを第1の複数位置に隣接する位置に移動させるための距離を示すオフセット信号を測定するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第11項に記載の方法。
- 前記ベシクルを移動させるステップが、前記ベシクルアセンブリを前記サブストレート表面上に移動させ、前記ベシクルアセンブリから流体を分配し、放出された流体を有する位置がマトリックスを形成するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第12項に記載の方法。
- 更に、洗浄流体を前記ベシクルのチャンバに抜き取って前記チャンバを濯ぐステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 更に、前記チャンバを毛管作用で満たすために前記ベシクルを流体材料ソースと接触させるステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- シリコンからなるサブストレート材料を用意するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 金属材料からなるサブストレート材料を用意するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- プラスチック材料からなるサブストレート材料を用意するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 膜からなるサブストレートを用意するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- ポリマー材料からなるサブストレートを用意するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 金属をグラフトしたポリマーからなるサブストレートを用意するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 化学的に官能化させたサブストレート材料であるサブストレートを用意するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- ビーズで官能化させたサブストレートを用意するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 樹枝状材料で官能化させたサブストレートを用意するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- 材料を分析する方法であって、
溶媒中に前記材料を含む流体を含むベシクルを用意するステップ、
前記ベシクルと表面を接触させることなく、前記サブストレート表面の第1位置に近接して前記ベシクルを配置するステップ、
前記サブストレート表面の第1位置で特定且つ調整されたナノリッター容量の流体を送達するステップ、
前記ベシクルを前記サブストレート表面上の第1位置の次の第2位置に移動させ、前記サブストレート表面上の位置のアレーに沿って特定且つ調整された容量の材料を分配して材料のアレーを形成するステップ、及び
前記アレーの各位置の材料について質量分析を実施するステップを含むことを特徴とする前記方法。 - 前記ベシクルを用意するステップが、マトリックス材料及び分析対象材料を混合して前記材料を含む流体を調製するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第25項に記載の方法。
- 流体を保持するのに適当な内部チャンバを有するベシクルを用意するステップを含み、前記材料が質量分析用マトリックス材料を含むことを特徴とする請求の範囲第25項に記載の方法。
- 前記質量分析を実施するステップがマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析を実施するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第25項に記載の方法。
- 前記質量分析を実施するステップが飛行時間型質量分析を実施するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第25項に記載の方法。
- 前記質量分析を実施するステップがフーリエ変換質量分析を実施するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第25項に記載の方法。
- サブストレート表面上にサンプル材料のアレーを形成するためのシステムであつて、
ナノリッターの流体を運ぶのに適当な遠位端部を有するベシクル、
前記ベシクルを移動させるために取り付けられた遠位部分を有する可動性アーム、
前記ベシクルを前記サブストレート表面上の第1位置に近接して配置すべく前記アームを移動させるための及び前記サブストレート表面の第1位置でナノリッター容量の流体を与えるべく前記ベシクルをコントロールするためのコントローラ、及び
前記材料の化学的組成を示す組成信号を発生させることにより前記サブストレート表面上に沈着させた材料を分析するための診断ツールを含む前記システム。 - 前記ベシクルは材料の中実軸を含むことを特徴とする請求の範囲第31項に記載のシステム。
- 前記ベシクルは流体材料を運ぶのに適した内部チャンバを含むことを特徴とする請求の範囲第31項に記載のシステム。
- 前記ベシクルがチャンバと前記チャンバから流体を放出するためのトランスデューサ要素とを含むことを特徴とする請求の範囲第31項に記載のシステム。
- 前記診断ツールが質量分析計を含むことを特徴とする請求の範囲第31項に記載のシステム。
- 質量分析用マトリックス材料または前記マトリックス材料とサブストレート上の離れた位置に沈着した分析対象物質との混合物から選択されるサンプル材料のアレーを含む表面を有するサブストレートであって、各位置のマトリックス材料が結晶構造物を形成し、表面上にナノリッター容量の材料の沈着により生じた量を含むことを特徴とする前記サブストレート。
- 前記表面上に配置したウェルを有し、前記サンプル材料が前記ウェル内に沈着されていることを特徴とする請求の範囲第36項に記載のサブストレート。
- 前記表面にピットが形成されていることを特徴とする請求の範囲第37項に記載のサブストレート。
- 前記ウェルが粗な内表面を有していることを特徴とする請求の範囲第37項に記載のサブストレート。
- ナノリッター容量の材料をサブストレート表面上にアレーとして分配する方法であって、
(a)液体を分配するための、各々が材料を含む流体を収容する内部チャンバを有するベシクルの複数個をアレーの形態で配置して含むアセンブリを用意するステップ、
(b)前記ベシクルを表面と接触させることなく、前記サブストレート表面に近接する第1組の位置でベシクルを整列するステップ、
(c)ナノリッター容量の流体を、各ベシクルから、前記ベシクルで整列させたサブストレート表面上に放出させるために、機械的圧力を用いて各チャンバをコントロールして、流体のアレーをサブストレート表面上に沈着させることを特徴とする前記方法。 - 更に、
(d)サブストレート表面に隣接する第2組の位置でベシクルを整列させるために前記ステップ(a)のアセンブリを移動させるステップ、
(e)ステップ(c)を繰り返すステップ、及び
(f)任意にステップ(d)及び(e)を繰り返して、サブストレート表面上の更なる組の位置で流体を分配するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。 - 前記サブストレートが、ベシクルから放出される流体を受容するための位置を規定するためにサブストレート表面上に形成されたウェルを有することを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。
- 前記流体が溶媒及びマトリックス材料を含むことを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。
- 更に、サブストレート表面上に放出した流体からマトリックス材料を含む溶媒を蒸発させて該表面上に沈着させたマトリックス材料を残すために所定期間待機するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第43項に記載の方法。
- 更に、マトリックス材料が沈着されるのと同じ位置でステップ(a)〜(c)を繰り返すことを含み、前記アセンブリ中のベシクルのチャンバが、マトリックス材料のアレー上に放出するとマトリックス内に溶解する分析対象材料を含む溶媒を収容していることを特徴とする請求の範囲第44項に記載の方法。
- マトリックス材料が沈着されるのと同じ位置でステップ(a)〜(f)を繰り返し、前記アセンブリ中のベシクルのチャンバが、マトリックス材料のアレー上に放出するとマトリックス内に溶解する分析対象材料を含む溶媒を収容していることを特徴とする請求の範囲第44項に記載の方法。
- 前記流体が溶媒中に分析対象物を含むことを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。
- 更に、サブストレート表面上に放出された流体から分析対象物を含む溶媒を蒸発させて前記表面上に沈着した分析対象材料を残すために所定期間待機するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第47項に記載の方法。
- 更に、分析対象物が沈着される同じ位置でステップ(a)〜(c)を繰り返すことを含み、前記アセンブリ中のベシクルのチャンバが、分析対象物のアレー上に放出すると分析対象物に溶解するマトリックス材料を含む溶媒を収容していることを特徴とする請求の範囲第48項に記載の方法。
- 流体が溶媒中に分析対象物を含み、
更にサブストレート表面上に放出された流体から分析対象物を含む溶媒を蒸発させて前記表面上に沈着した分析対象材料を残すために所定期間待機するステップを含み、
分析対象物が沈着される同じ位置でステップ(a)〜(f)を繰り返し、前記アセンブリ中のベシクルのチャンバが、分析対象物のアレー上に放出すると分析対象物に溶解するマトリックス材料を含む溶媒を収容していることを特徴とする請求の範囲第41項に記載の方法。 - 前記流体が分析対象材料及びマトリックス材料の混合物を含むことを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。
- 更に、サブストレート上に沈着させた材料のアレーを有するサブストレートを、沈着させた材料の組成を示す情報を測定する診断ツールにかけるステップを含むことを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。
- 診断ツールが質量分析計であることを特徴とする請求の範囲第52項に記載の方法。
- 前記アセンブリを移動させるステップが、前記アセンブリを前記サブストレート表面を横断してラスターさせるステップを含むことを特徴とする請求の範囲第41項に記載の方法。
- 前記アセンブリを移動させるステップが、第1組の複数位置に近接する位置にベシクルを整列させるべくアセンブリを移動させるための距離を示すオフセット信号を測定するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第41項に記載の方法。
- 更に、チャンバを濯ぐべく洗浄流体をチャンバに抜き取るステップを含むことを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。
- 各ベシクルが、チャンバを毛管作用により流体で少なくとも部分的に満たすために十分に狭い径を含むチャンバを有するピンからなり、
チャンバを毛管作用によりある容量の流体で少なくとも部分的に満たすべく前記アセンブリのベシクルが流体ソースと接触していることを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。 - ベシクルのチャンバが圧力源に接続しており、
チャンバを毛管作用により満たす流体容量を部分的に補償すべく圧力源からの正圧をチャンバに加えることを特徴とする請求の範囲第57項に記載の方法。 - ベシクルのチャンバが、チャンバに負圧を加える圧力源に接続しており、
チャンバを負圧によりある容量の流体で少なくとも部分的に満たすために流体ソースと接触させることにより流体をベシクルに導入することを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。 - 前記サブストレートがシリカ、ガラス、セルロース、シリコン、金属、プラスチック、ポリマー及び金属をグラフトしたポリマーからなる群から選択される材料からなることを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。
- 前記サブストレートが平坦表面、ピット付き平坦表面、中実または多孔性ビーズ、膜またはピンからなることを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。
- 前記サブストレート表面を化学的に官能化、ビーズで官能化またはデンドライト捕捉材料で官能化されていることを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。
- 前記流体がオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。
- 前記ベシクルのチャンバが圧力源に接続しており、前記圧力源により正圧を前記ベシクルのチャンバに加えることにより流体を放出させるためにベシクルをコントロールすることを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。
- 前記ベシクルのチャンバ内の圧力が該ベシクルから流体スプレーを放出するのに十分であることを特徴とする請求の範囲第64項に記載の方法。
- 前記ベシクルのチャンバ内の圧力が該ベシクルから流体液滴を放出すべく選択されることを特徴とする請求の範囲第64項に記載の方法。
- 前記アセンブリの各ベシクルが、流体をサブストレート表面に導くための毛細管要素と流体を分配すべくベシクルに圧力を加えるためのトランスデューサ要素とを有するアセンブリを含むことを特徴とする請求の範囲第40項に記載の方法。
- 前記トランスデューサ要素が前記毛細管の周りに配置されており、電気パルスを変換して毛細管を機械的に変形させ、毛細管から流体を放出させ得ることを特徴とする請求の範囲第67項に記載の方法。
- 前記トランスデューサ要素が圧電、電気、電気制限、磁気制限及び電気機械トランスデューサからなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第67項に記載の方法。
- ナノリッター容量の材料をサブストレート表面上にアレーとして分配する方法であって、
(a)液体を分配するために、ナノリッター容量の流体を保持するために端部を有する材料の中実軸を含む細長いベシクルを複数個アレーとして配置して有するビンアセンブリを用意するステップ、
(b)ナノリッター容量の、液体材料を含む流体を流体ソースから前記ピンアセンブリのベシクルの端部に充填するステップ、
(c)前記ベシクルを表面に接触させることなく、前記サブストレート表面に近接する第1組の位置にベシクルを整列させるためにピンアセンブリを配置するステップ、
(d)充填した流体を前記ベシクルと整列させたサブストレート表面に接触させて、サブストレート表面上に材料のアレーを形成するステップを含むことを特徴とする前記方法。 - 更に、
(e)ステップ(b)を繰り返すステップ、
(f)サブストレート表面に近接し且つ第1組の位置に隣接する第2組の位置でベシクルを整列させるためにピンアセンブリを移動させるステップ、
(g)ステップ(d)を繰り返すステップ、
(h)任意に、ステップ(e)〜(g)を繰り返してサブストレート上の別の位置で材料を分配するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第70項に記載の方法。 - 前記サブストレートが、ベシクルから放出される流体を受容するための位置を規定するためにサブストレート表面上に形成されたウェルを有することを特徴とする請求の範囲第70項に記載の方法。
- 前記溶媒が質量分析用マトリックス材料を含むことを特徴とする請求の範囲第70項に記載の方法。
- 更に、マトリックス材料を含む溶媒を蒸発させて該マトリックス材料を前記表面上に沈着させるために所定期間待機するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第73項に記載の方法。
- ステップ(a)〜(d)を分析対象材料を含む溶媒を収容するベシクルを用いて繰り返し、
前記ベシクルの端部の分析対象材料の流体をサブストレート表面上の蒸発させたマトリックス材料と接触させて前記マトリックス材料を分析対象材料で溶解し、マトリックス材料と分析対象材料の混合物を沈着させることを特徴とする請求の範囲第74項に記載の方法。 - 溶媒の材料が分析対象材料を含むことを特徴とする請求の範囲第70項に記載の方法。
- 更に、分析対象材料を含む溶媒を蒸発させて該分析対象材料を前記表面上に沈着させるために所定期間待機するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第76項に記載の方法。
- ステップ(a)〜(d)をマトリックス材料を含む溶媒を収容したベシクルを用いて繰り返し、
前記ベシクルの端部のマトリックス材料の流体をサブストレート表面上の蒸発させた分析対象材料と接触させて前記マトリックス材料を分析対象材料で溶解し、マトリックス材料と分析対象材料の混合物を沈着させることを特徴とする請求の範囲第77項に記載の方法。 - 溶媒の材料が分析対象材料とマトリックス材料の混合物を含むことを特徴とする請求の範囲第70項に記載の方法。
- 更に、サブストレート上に沈着させた材料のアレーを有するサブストレートを前記材料の組成を示す情報を測定する診断ツールにかけるステップを含むことを特徴とする請求の範囲第70項に記載の方法。
- 前記診断ツールが質量分析計を含むことを特徴とする請求の範囲第80項に記載の方法。
- 前記ピンアセンブリを移動させるステップが、前記ピンアセンブリを前記サブストレート表面を横断してラスターさせるステップを含むことを特徴とする請求の範囲第71項に記載の方法。
- 前記ピンアセンブリを移動させるステップが、第1の複数位置に近接する位置でベシクルを整列させるべくピンアセンブリを移動させるための距離を示すオフセット信号を測定するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第71項に記載の方法。
- 前記サブストレートがシリカ、ガラス、セルロース、シリコン、金層、プラスチック、ポリマー及び金属をグラフトしたポリマーからなる群から選択される材料からなることを特徴とする請求の範囲第70項に記載の方法。
- 前記サブストレートが平坦表面、ピット付き平坦表面、中実または多孔性ビーズ、膜またはピンからなることを特徴とする請求の範囲第70項に記載の方法。
- 前記サブストレート表面を化学的に官能化、ビーズで官能化またはデンドライト捕捉材料で官能化されていることを特徴とする請求の範囲第70項に記載の方法。
- 前記ベシクルがベシクル要素の部分アセンブリであり、各ベシクルがナノリッター容量の流体を保持する内部チャンバを含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
- ベシクルが、内部ハウジング内の圧力をコントロールする圧力源に接続した内部チャンバを有するハウジングの内側にあり、
前記圧力源が、各ベシクルの内部チャンバを介する流体の流れを調節してベシクルから特定ナノリッター容量の流体を分配するためにハウジングのチャンバに圧力を加えることを特徴とする請求の範囲第87項に記載の方法。 - 前記ベシクルは内部チャンバを有し、複数のベシクルとチャンバを変形することにより流体を放出させるべく内部チャンバを介して流体を動かすために各ベシクルに取り付けられたトランスデューサ要素とを含むアセンブリの一部を形成し、
前記トランスデューサ要素は十分な圧力でチャンバを変形して、ピンから流体をスプレーさせるかまたはチャンバから流体液滴を仲長させて、該液滴をサブストレート表面に接触させることにより流体をサブストレートに対して流し得ることを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。 - 自動化されることを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
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