JP2005017155A - 金属基板上のアレイの作製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】容易にかつ安価にかつ、安定性良く金属基板上にアレイを作製できる方法を確立する
【解決手段】固定化する物質を含む溶液をピンに保持させ、ピンを基板に接触させることにより、金属基板チップ上に溶液をスポッティングすることでアレイを作製する方法であって、周囲の湿度を７０％以上に保つことにより、スポットの乾燥を防ぎ、生体分子の活性を保つことにより、表面プラズモン法で測定した際にも安定したコントラストの像が得られる。
【選択図】 なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、金属基板上にアレイを作製する方法に関し、スポット部分を乾燥させることなく長時間維持することにより安定したスポット部分を得ることができ、安定した評価結果の得られるアレイの作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体分子の機能解析、もしくは細胞内に発現している生体分子を調べる手段として相互作用解析が注目を浴びている。中でも表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、エリプソメトリー法をはじめとした光学的検出方法はラベルフリーかつリアルタイムに測定できる相互作用解析法として広く使われるようになっている。このような光学的検出方法は金属基板上に分子を固定化し、相互作用するかどうか調べたい測定対象物質（アナライト）を表面に曝露させる。アナライトが表面に結合したかどうかについて反射光を分析することで知ることができる。蛍光やラジオアイソトープを用いた方法ではアナライトをそれぞれのラベル物質で標識しておく必要があるのに対し、上記の光学的検出法ではアナライトをラベルする必要がないのが大きな利点である。
【０００３】
しかし、従来の光学的相互作用検出法は、多数点での検出は困難であり、最大４点までしか検出できず、研究の効率は不十分であった。Ｊｏｒｄａｎらはレーザー光を広げてから偏光平行光にし、金薄層を蒸着したチップの広い面積に照射し、その反射光を撮影することで、ＤＮＡハイブリダイゼーションによるＳＰＲ変化を観察するのに成功した（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
また、Ｂｒｏｃｋｍａｎらは７回のステップによって７５０μｍ四方のＤＮＡスポットを作製し、複数のスポットでＤＮＡ−蛋白相互作用を観察するのに成功した（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
いずれも固定化したサンプルはＤＮＡであり、スポット後に乾燥しても問題は少ない。しかし、蛋白などのサンプルを固定化する場合、乾燥によりサンプルが変性する可能性があった。
【０００６】
また、乾燥していく場合、液滴が周囲より徐々に小さくなっていくため、スポットの大きさが一定しない、濃縮されていくためにスポットの部分部分で固定化条件が異なる、十分な結合前に乾燥する、などスポットの固定化密度のムラがひどくなり、相互作用観察の結果が安定して得られない問題があった。
本発明は金属基板に固定化するサンプルを乾燥させることなく、相互作用解析のためのアレイを得る手段を提供する。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｊｏｒｄａｎら Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６９， １４４９−１４５６， １９９７
【非特許文献２】
Ｂｒｏｃｋｍａｎら ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２１， ８０４４−８０５１， １９９９
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、スポットした液滴を乾燥させないことで、スポットに含まれるサンプルを変性させず、スポットのムラを抑制し、安定した観察のできる分子を固定化したアレイを得ることにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．基板周囲の湿度を７０％以上に保ち、スポッティング操作を行う金属基板上のアレイの作製方法
２．上記湿度が７８％以上である１記載のアレイの作製方法
３．上記金属基板が表面プラズモン共鳴測定用である１〜２いずれか記載のアレイの作製方法
４．上記金属基板が表面プラズモン共鳴イメージング用である１〜３いずれか記載のアレイの作製方法
５．上記金属基板が金である１〜４いずれか記載のアレイの作製方法
６．上記金属基板が金薄層をコーティングしたガラスである１〜５いずれか記載のアレイの作製方法
７．スポッティングの中心間間隔が１．５ｍｍ以下である１〜６いずれか記載のアレイの作製方法
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、主に金属基板チップ上にピンの接触によってのアレイを作製する方法を開示している。
【００１１】
本発明において、スポッティング操作により微小液滴が金属基板上に形成される。スポッティング操作は特に限定されるものではなく、ピンを用いた接触法やインクジェット法などが挙げられる。微小液滴の乾燥を防ぐため、基板周囲の湿度は７０％ＲＨ以上が好ましく、７８％ＲＨ以上がより好ましい。それ以下の湿度であると、乾燥によって液滴が徐々に小さくなりスポットの大きさが一定しない、液滴中のサンプル濃度が濃縮されていき、スポットの部分部分で、固定化条件が異なるために固定ムラが生じる、反応により固定化する際には十分な反応前に乾燥するために固定ムラが生じる、等が起こりやすい。大きさの大きなムラや固定ムラがある場合、相互作用によって得られるシグナルにばらつきが生じ易いため、好ましくない。よって、微小液滴は周囲の湿度調整により、乾燥を防ぐほうが好ましい。
【００１２】
湿度調整は、基板近傍のみだけでもよく、スポッティングを行う装置全体であってもよい。ただし、本発明における湿度とは基板近傍にて測定されたものを言う。
【００１３】
湿度を７０％ＲＨ以上に維持する手段としては、スポッター内部を閉鎖空間とし、加湿機構を設けることが好ましい。加湿機構としては、水のたまり場を設ける方法、ヒーター等で水を加熱して水蒸気を発生させる方法、超音波で霧を噴霧する方法等、任意のものが挙げられる。また、加湿機構と湿度センサーを連動させ、一定の湿度にコントロールされるようにすることも好ましい。
さらに、スポッター内部の空気を循環させることで、スポッター内の湿度の場所による偏り、時間的変動を少なくすることができ好ましい。
【００１４】
周囲温度は特に限定されるものではないが、常識的には４℃から３０℃でスポッティングは行われる。室温２５℃前後で使用するのが安価であり簡便であるが、４〜１０℃に冷やす方法も湿度を高める手段として有効である。
【００１５】
スポット後、基板は微小液滴が乾燥されない状態で好ましくは５分以上、好ましくは１０分以上、さらに好ましくは１５分以上の時間、湿度７０％ＲＨ以上、さらには７８％ＲＨ以上の環境下に放置され、固定化が完全に行われることが好ましい。スポット後の放置はスポッターのチップ置き場でそのまま放置しても良いし、スポッター内部の別の場所で湿度７０％ＲＨ以上の場所に移動させて放置しても良い。さらには基板をスポッターから取り出して別の湿度７０％ＲＨの容器内に放置しても良い。湿度７０％ＲＨ以上の容器としては、密封できる容器でスポッターと同様の加湿機構を持つものが好ましい。簡便なものとしては、底部に水を入れたデシケータ等が挙げられる。
【００１６】
また、本発明は基板上のサンプルが結合する部分に、サンプルと化学反応可能な官能基を有し、この化学反応可能な官能基とサンプルとが化学反応により結合することにより固定化されるものに特に好ましく適応できる。
サンプルと化学反応可能な官能基としては、カルボン酸基、アミノ基、酸無水物、マレイミド基、スクシンイミド基、エポキシ基、イソシアネート基、アジド基などが挙げられる、中でもマレイミド基、スクシンイミド基が好ましい官能基として挙げられる。
【００１７】
また、また、化学反応以外でも、基板上の官能基とによるキレート結合、イオン結合、疎水結合となる様式にも好ましく適応することができる。
【００１８】
スポッティング後すぐには乾燥されることなく十分な時間を与えられることにより、基板上のこれら官能基とスポットされるサンプルの官能基とが十分に結合し、強固なスポットとなるために安定した各種の観測が可能となる。
【００１９】
このようにして完全に固定化された基板は、必要により、過剰分のサンプル液を洗い流す、さらに別の反応液と反応させる、乾燥させる等の後処理を行い、測定用のアレイとする。
【００２０】
作製したアレイを用いて相互作用を観察する手段としてはＳＰＲ法、エリプソメトリー法、和周波発生（ＳＦＧ）法などが挙げられるが、中でもＳＰＲ法は広く用いられており、相互作用の測定方法として信頼性が高いために好ましい。また、ＳＰＲイメージング法は広い範囲の相互作用を観察することができるため、さらに好ましい。
【００２１】
金属基板の金属は金であることが好ましい。金は金−硫黄結合により、表面修飾が容易であるためである。例えば、末端に前述の官能基、特にアミノ基やカルボキシル基などの官能基をもつアルカンチオールを溶液中で接触させることでアルカンチオールの自己組織化表面が形成され、表面に官能基を導入することができる。
【００２２】
金基板は金薄層をコーティングしたガラス基板であることが好ましい。金薄膜をコーティングする手段は特に限定されるものではないが、蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが挙げられる。金の厚さは特に限定されるものではないが、通常は３０〜１００ｎｍの範囲で使用される。金の剥離を防ぐために、金をコーティングする前に、基板にあらかじめクロムもしくはチタンの層を１〜１０ｎｍだけ形成しておくのが一般的である。
【００２３】
ガラスはさまざまな屈折率を有する透明基板が用意できるため好ましい。プラスチックも基板に使うことは可能であるが、残存応力が残らないようにして成形するのは困難である。ガラス板は平面であることが好ましい。回折格子などの加工を行うことで、プリズムを用いずに測定ができることができるものの、加工は高価である。
【００２４】
こうして得られるアレイにおける隣り合うスポットの中心間の距離は１．５ｍｍ以下である。１．５ｍｍより大きいスポットの場合、スポッティング操作中に液滴が乾燥することはほとんど考えられない。本発明は微小液滴の乾燥を防ぐのに非常に有効である。
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２５】
［実施例］
末端にチオール基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧチオール：日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。ＰＥＧチオールの分子量は５，０００であり、親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの末端はメトキシ基であり、反応性をほとんど有さない。
【００２６】
１８ｍｍ四方、１ｍｍ厚のＬａｋ１０ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを結合させた。
【００２７】
スライドをミリＱ水とエタノールで洗浄し、空気噴霧により乾燥させたのち、このスライドの上に図１に示すフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、照射された部分のＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクのパターンは５００μｍ×５００μｍの四角形が９６個並んだものである。
【００２８】
ミリＱ水とエタノールで洗浄したのち、７−カルボキシル−１−ヘプタンチオール（７−ＣＨＴ：同仁化学研究所）の１ｍＭ溶液中にスライドを１時間浸漬し、紫外線照射部にカルボキシル基を導入した。
【００２９】
３００μＬの０．２Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（水溶性カルボジイミド）／０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ＰＢＳ（−）溶液をスライドの上に滴下して一時間反応させ、ＣＯＯＨ基をスクシンイミドエステルとして活性化した。
【００３０】
スライドを水洗後、空気噴霧により乾燥させ、自動スポッターに装着した。１３種類の抗ヤギＩｇＧモノクローナル抗体を１００μｇ／ｍｌの濃度に調整し（ＰＢＳ（−））、１０μｌを９６穴プレートのＡ１〜１２、Ｂ１のウェルに用意した。自動スポッターの内部湿度を８１％、温度２５℃に保ち、ｎ＝４でスポッティングを行った。湿度はアズワン社ＮＴ−１８００デジタル温湿度計をチップ置場横に置いて測定した。
【００３１】
スポッティングのパターンを図２に示す。このように、９６穴プレートに入れたサンプルの入れ方を反映した形でスポッティングを行った。Ｂ２〜１２のウェルにはモノクローナル抗体サンプルは入っていないため、ブランクのスポットとなる。
【００３２】
スポッティングに用いたピンの先端の図を図３に示す。ピンの直径は４８７μｍであり、２００μｍの幅の溝が入っている。従って、面積は０．０９ｍｍ^２である。また、ピンが取り付けられたヘッド部分の内部構造の概略図を図４に示す。ピンはガイドを通して内部のピン固定治具に取り付けられており、ピン固定治具は上下方向に移動可能となっている。ピン固定治具の上には緩衝材として軟質ウレタンフォームが設けられ、ピンが基板に押し付けられた時には、ピンがピン固定治具と共に上方に移動し、緩衝材が圧縮され、衝撃を緩和すると共にピンに適度な応力を与える。
【００３３】
スポッティングは自動的に行われる。図５に使用した自動スポッターの内部の配置の概略を示す。ピンは９６穴プレートに浸漬され、ウェル内のサンプルを保持し、スライド上へと移動し、スポッティングを行う。実施例の場合はｎ＝４であるため、９６穴プレートとスライドの間を３回往復する。４回目のスポッティングが終わった段階でピンは洗浄浴へと移動し、ミリＱ水で２回洗浄される。洗浄後にドライヤー内にて上下運動が３０ｍｍの振り幅で３回行われ、ピンが乾燥される。次のウェルにてサンプルと採取し、同様の動作は付属したコンピュータで制御されて自動的に行われる。
湿度の調整は超音波加湿器を用い、超音波により発生した霧をスポッター内に吹き込む方式とし、内部湿度はチップ置き場周辺での湿度を測定し、このデータを元に超音波加湿器のＯＮ／ＯＦＦを切り替えて調整した。基板周辺の湿度は８１％±２％内に維持されていた。装置の概略は図１１および図１２に示す。
【００３４】
スポッティング終了後、スポッターからスライドを取り出し、直ちに加湿チャンバー内にスライドを移し、２時間保持してスライド上の官能基と抗体のアミノ基を反応させ、抗体を表面に固定化した。なお、加湿チャンバーは、図１３に示した様に、容器の底部に水を張り、中段にスライドを置ける構造となったものであり、密閉が可能であるため、長時間乾燥させることなく反応の進行を続けることが出来る。内部の湿度はほば１００％である。
反応終了後のチップをミリＱ水で数回洗浄した上で、空気噴霧により水を取り除き、分子量２，０００のアミノ基末端ポリエチレングリコール水溶液を２ｍｇ／ｍｌの濃度でｐＨ８．５に調製し、３００μｌをスライド上に注ぎ、残存するスクシンイミド基にポリエチレングリコールを反応させ、ブロッキング反応を行った。表面固定化の反応スキームを図６に示す。
【００３５】
抗体を固定化したスライドを３回水洗した後、空気噴霧により乾燥させ、ＳＰＲイメージング装置（東洋紡績製）にセットした。緩衝液としてＰＢＳ（−）を２５０μｌ／ｍｌの流速で３０分通液し、１００μｌ／ｍｌの流速で３０分通液して安定化させた。その際のＳＰＲイメージング像を図７に示す。白くなっているスポット部分には抗体が固定化されており、その他の部分には固定化されていない。ピンが接触してサンプル液がスポットされた部分には全く傷は見当たらなかった。
【００３６】
次に抗原であるヤギＩｇＧを１μｇ／ｍｌから８μｇ／ｍｌまで濃度（Ｃ）を段階的に倍増させて流し、各々の濃度における平衡時のシグナル（Ｒｅｑ）を得た。この際のＳＰＲシグナルの変化を図８に示す。
【００３７】
Ｒｅｑ／ＣとＣをプロットした（スキャッチャードプロット）結果を図９に示す。いずれもほぼ直線関係が得られている。図９の直線の傾きから結合平衡定数を算出し、表１に示す。
ただし、シグナルが低いために相関係数が０．８未満となったデータは省いている。このように金属基板上に基板を傷つけることなく、分子のアレイを作製し有用なデータを取ることが可能となった。
【００３８】
［比較例］
スポッターのカバーを外し、加湿装置を作動させることなく、２５℃３０％ＲＨ環境下で実施例１と同様にスポットを行った。目視による観察ではスポット部の微小液滴はスポッティング後１分以内に乾燥した。さらに加湿チャンバーで保存することなく直ちにミリＱ水で洗浄して後は実施例と同様に行った。得られたスライドをＳＰＲにより観察した時のイメージング像を図１０に示す。スポット部は不鮮明であり、安定したデータが見込めなかったため、測定は中止した。
【００３９】
【表１】

【００４０】
【発明の効果】
本発明により、金属基板上にサンプル溶液の微小液滴が形成されて、アレイが得られた。液滴は乾燥することはなく、スポットの固定ムラとサンプルの変性を抑制した。今後、本発明により作製されたアレイは生体分子の相互作用解析に広く使用されていくと期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例に使用したフォトマスクパターン。黒色部分にクロムがコーティングされ光を遮断する。
【図２】実施例１で使用したスポッティングのパターン。上図がスライド上を表し、下図が９６穴プレートを示す。９６穴プレートのＡ１〜Ｂ１２のウェル内のサンプルを、上図のパターンでスポットした。実施例１ではＢ２〜１２はブランクとした。
【図３】実施例で使用したピンの先端の概略図
【図４】実施例で使用したピンの取り付けヘッド内部の概略図
【図５】実施例の自動スポッターの内部構造概略図
【図６】実施例でのスライド上の反応スキーム
【図７】実施例での抗体を固定化したスライドのＳＰＲイメージング像
【図８】実施例での抗原の濃度を段階的に増加させた場合のＳＰＲシグナル変化
【図９】図７のデータから作成したスキャッチャードプロット
【図１０】比較例での抗体を固定化したスライドのＳＰＲイメージング像
【図１１】実施例の自動スポッターの概略図（斜視図、レール、ヘッドは省略）
【図１２】実施例の自動スポッターの概略図（断面図）
【図１３】実施例で用いた加湿チャンバーの概略図

Claims (6)

1. 基板周囲の湿度を７０％ＲＨ以上に保ち、スポッティング操作を行う金属基板上のアレイの作製方法
2. 上記金属基板が表面プラズモン共鳴測定用である請求項１記載のアレイの作製方法
3. 上記金属基板が表面プラズモン共鳴イメージング用である請求項２記載のアレイの作製方法
4. 上記金属基板が金である請求項１〜３いずれか記載のアレイの作製方法
5. 上記金属基板が金薄層をコーティングしたガラスである請求項１〜４いずれか記載のアレイの作製方法
6. スポッティングの中心間間隔が１．５ｍｍ以下である請求項１〜５いずれか記載のアレイの作製方法

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