JP2006266708A - ペプチドの固定化方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 表面プラズモン共鳴測定装置にペプチドを強固に固定化し、厳密な解析を可能とする方法を提供すること。
【解決手段】 表面プラズモン共鳴測定装置におけるペプチドの固定化方法であって、（１）表面プラズモン共鳴測定装置の金属膜表面に予め結合された第一のペプチドに該第一のペプチドと相互作用する第二のペプチドを結合させる工程、及び（２）ペプチドと化学結合を形成する官能基を少なくとも２個以上有する架橋剤を作用させることによって該第一のペプチドと該第二のペプチドとを架橋させる工程を含むペプチドの固定化方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴測定装置におけるペプチドの固定化方法、及び該方法を用いたペプチドと被験物質との相互作用の分析方法に関する。

現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。

上記の中でも表面プラズモン共鳴測定は、多くの生理活性物質の相互作用測定に利用されている。ここで、プラズモンを発生する金属膜表面に生理活性物質を配向させて結合させることが結合された生理活性物質の活性を維持するうえで重要であることが知られている。このため、固定化される生理活性物質の特定部位を認識する抗体などのペプチドを固定化し、該ペプチドに生理活性物質を認識させて固定化した後、該生理活性物質と他の生理活性物質の相互作用を検出する方法が提案されている。しかしながら、固定化された特定の生理活性物質認識用ペプチドと該生理活性物質の結合は弱く、後段の相互作用解析中に解離してしまい、厳密な解析が困難となる問題があった。

任意のタンパク質を担体に対して強固に固定化するための手段としては、例えば、特許文献１には、タグ部を有する固定化対象のタンパク質に対して共有結合可能な反応基を有する固定化担体における当該反応基を活性化する第１工程と、上記第１工程の後、上記固定化担体に対して、上記固定化対象のタンパク質を含む溶液を作用させる第２工程とを含み、上記第２工程では、上記タグ部と上記固定化担体のタグ部結合部位との間の相互作用及び上記反応基とタンパク質との間の共有結合を介して、上記タンパク質を上記固定化担体に固定化することを特徴とするタンパク質の固定化方法が記載されている。しかしながら、この方法でも厳密な解析を行うことは困難であった。

特開２００４−１７０１９５号公報

本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、表面プラズモン共鳴測定装置にペプチドを強固に固定化し、厳密な解析を可能とする方法を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、表面プラズモン共鳴測定装置の金属膜表面に予め結合された第一のペプチドに該第一のペプチドと相互作用する第二のペプチドを結合させた後に架橋剤を作用させることによって該第一のペプチドと該第二のペプチドとを架橋させることによって、表面プラズモン共鳴測定装置にペプチドを強固に固定化でき厳密な解析が可能となることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、表面プラズモン共鳴測定装置におけるペプチドの固定化方法であって、（１）表面プラズモン共鳴測定装置の金属膜表面に予め結合された第一のペプチドに該第一のペプチドと相互作用する第二のペプチドを結合させる工程、及び（２）ペプチドと化学結合を形成する官能基を少なくとも２個以上有する架橋剤を作用させることによって該第一のペプチドと該第二のペプチドとを架橋させる工程を含むペプチドの固定化方法が提供される。

好ましくは、表面プラズモン共鳴測定装置は、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置である。

好ましくは、架橋剤は、ペプチドのアミノ基又はスルフィド基と化学結合を形成する官能基を少なくとも２個以上有する架橋剤である。

本発明の別の側面によれば、表面プラズモン共鳴測定装置を用いて表面プラズモン共鳴の変化を測定することによってペプチドと被験物質との相互作用を分析する方法であって、
（１）表面プラズモン共鳴測定装置の金属膜表面に予め結合された第一のペプチドに該第一のペプチドと相互作用する第二のペプチドを結合させる工程、及びペプチドと化学結合を形成する官能基を少なくとも２個以上有する架橋剤を作用させることによって該第一のペプチドと該第二のペプチドとを架橋させる工程、及び（２）被験物質を該金属膜表面に接触させることにより該第二のペプチドと相互作用させる工程を含む、ペプチドと被験物質との相互作用の分析方法が提供される。

好ましくは、表面プラズモン共鳴測定装置は、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置である。

好ましくは、前記流路系内の液体を、被験物質を含まない液体から被験物質を含む液体へと交換することにより表面プラズモン共鳴の変化を測定し、それによりペプチドと被験物質との相互作用を分析する。

本発明のペプチドの固定化方法によれば、表面プラズモン共鳴測定装置にペプチドを強固に固定化することが可能である。本発明のペプチドの固定化方法を用いることによって、ペプチドと被験物質との相互作用について厳密な分析を行うことが可能である。

以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明による表面プラズモン共鳴測定装置におけるペプチドの固定化方法は、（１）表面プラズモン共鳴測定装置の金属膜表面に予め結合された第一のペプチドに該第一のペプチドと相互作用する第二のペプチドを結合させる工程、及び（２）ペプチドと化学結合を形成する官能基を少なくとも２個以上有する架橋剤を作用させることによって該第一のペプチドと該第二のペプチドとを架橋させる工程を含むことを特徴とする。

本発明におけるペプチドとはアミノ酸が複数結合したものを意味し、タンパク質を含む。具体的な例としては抗体、抗体の認識部位、生理活性物質認識性タンパクやその結合部位があげられる。

ペプチドの具体例についてさらに説明する。
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。

酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。

非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。

本発明では、表面プラズモン共鳴測定装置の金属膜表面に予め結合された第一のペプチドに該第一のペプチドと相互作用する第二のペプチドを結合させる。上記の第一のペプチドと第二のペプチドは、互いに相互作用する組み合わせとして選択される限り、任意のペプチドの組み合わせを使用することができ、例えば、特に第二のペプチドの方は、上記したようなペプチドの具体例の中から選択することもできる。

上記のようにしてペプチドを固定化した測定チップは、当該ペプチドと相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。被験物質としては例えば、上記したペプチドと相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。

本発明で用いる架橋剤としてはペプチドのアミノ基、スルフィド基などと化学結合を形成する基を複数有するものである。アミノ基と化学結合を形成する基の具体例としては、アルデヒド、活性エステル、活性メチレン、ビニルスルホン、ハロゲン化トリアジン、ヒドロキシトリアジン、エポキシなどがあげられるがこれらに限定されるわけではない。スルフィド基と化学結合を形成する基の具体例としては、マレインイミド活性エステルなどがあげられるがこれらに限定されるわけではない。以下に架橋剤の具体的化合物例を示すが、本発明はこれらに限定されるわけではない。具体的な化合物としては、グルタルアルデヒド、塩化シアヌル、ジグリシジルエタン、および下記化合物CR-1〜6があげられる。これらの化合物は単独もしくは混合物として用いることができる。

本発明の測定方法では、表面共鳴プラズモン測定装置の流路系内の液体を交換することで表面プラズモン共鳴の変化を測定する。本発明の好ましい態様によれば、流路系内の液体を交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。液の流れを停止させる時間は特に限定されないが、例えば、１秒以上３０分以下であり、好ましくは１０秒以上２０分以下であり、さらに好ましくは１分以上２０分以下程度である。

上記の通り、本発明においては、流路系内の液体を、測定すべき被験物質を含有しない対照液体から、測定すべき被験物質を含有する試料液体へと交換し、その後、試料液体の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。
液体の交換にかける時間としては、0.01秒以上100秒以下が好ましく、0.1秒以上10秒以下がより好ましい。

表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。以下、本発明で用いる表面プラズモン共鳴測定装置について説明する。

表面プラズモン共鳴測定装置とは、表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析するための装置である。本発明で用いられる表面プラズモン共鳴測定装置は、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備える。

本発明では、具体的には、特開２００１−３３０５６０号公報記載の図１〜図３２で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置、特開２００２−２９６１７７号公報記載の図１〜図１５で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置を用いることができる。特開２００１−３３０５６０号公報および特開２００２−２９６１７７号公報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。

例えば、特開２００１−３３０５６０号公報記載の表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる複数の測定ユニットと、これら複数の測定ユニットを支持した支持体と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段と、前記複数の測定ユニットの各誘電体ブロックに関して順次前記全反射条件および種々の入射角が得られるように、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、各測定ユニットを順次前記光学系および光検出手段に対して所定位置に配置する駆動手段とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン共鳴測定装置が挙げられる。

なお、上記の測定装置においては、例えば前記光学系および光検出手段が静止状態に保たれるものとされ、前記駆動手段が、前記支持体を移動させるものとされる。

その場合、前記支持体は、回動軸を中心とする円周上に前記複数の測定ユニットを支持するターンテーブルであり、また前記駆動手段は、このターンテーブルを間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、この支持体を前記複数の測定ユニットの並び方向に間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。

一方、上記とは反対に、前記支持体が静止状態に保たれるものであり、前記駆動手段が、前記光学系および光検出手段を移動させるものであっても構わない。

その場合、前記支持体は、円周上に前記複数の測定ユニットを支持するものであり、前記駆動手段は、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。

他方、前記駆動手段が、その回動軸を支承するころがり軸受けを有するものである場合、この駆動手段は、該回動軸を一方向に回動させて前記複数の測定ユニットに対する一連の測定が終了したならば、この回動量と同量だけ該回動軸を他方向に戻してから、次回の一連の測定のためにこの回動軸を前記一方向に回動させるように構成されることが望ましい。

また上記の測定装置においては、前記複数の測定ユニットが連結部材により１列に連結されてユニット連結体を構成し、前記支持体が、このユニット連結体を支持するように構成されていることが望ましい。

また上記の測定装置においては、前記支持体に支持されている複数の測定ユニットの各試料保持機構に、自動的に所定の試料を供給する手段が設けられることが望ましい。

さらに上記の測定装置においては、前記測定ユニットの誘電体ブロックが前記支持体に固定され、測定ユニットの薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが上記誘電体ブロックに対して交換可能に形成されていることが望ましい。

そして、このような測定チップを適用する場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、前記誘電体ブロックと組み合う状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。

あるいは、測定ユニットの誘電体ブロック、薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが前記支持体に対して交換可能に形成されてもよい。

測定チップをそのような構成とする場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、支持体に支持される状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。

他方、前記光学系は、光ビームを誘電体ブロックに対して収束光あるいは発散光の状態で入射させるように構成され、そして前記光検出手段は、全反射した光ビームに存在する、全反射減衰による暗線の位置を検出するように構成されることが望ましい。

また上記光学系は、光ビームを前記界面にデフォーカス状態で入射させるものとして構成されることが望ましい。そのようにする場合、光ビームの上記界面における、前記支持体の移動方向のビーム径は、この支持体の機械的位置決め精度の１０倍以上とされることが望ましい。

さらに上記の測定装置において、測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光源は前記支持体より上の位置から下方に向けて前記光ビームを射出するように配設され、前記光学系は、前記下方に向けて射出された前記光ビームを上方に反射して、前記界面に向けて進行させる反射部材を備えていることが望ましい。

また、上記の測定装置において、前記測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光学系は、前記光ビームを前記界面の下側から該界面に入射させるように構成され、前記光検出手段は前記支持体よりも上の位置で光検出面を下方に向けて配設されるとともに、前記界面で全反射した光ビームを上方に反射して、前記光検出手段に向けて進行させる反射部材が設けられることが望ましい。

他方、上記の測定装置においては、前記支持体に支持される前および／または支持された後の前記測定ユニットを、予め定められた設定温度に維持する温度調節手段が設けられることが望ましい。

また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された測定ユニットの試料保持機構に貯えられた試料を、前記全反射減衰の状態を検出する前に撹拌する手段が設けられることが望ましい。

また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された複数の測定ユニットの少なくとも１つに、前記試料の光学特性と関連した光学特性を有する基準液を供給する基準液供給手段が設けられるとともに、前記光検出手段によって得られた、試料に関する前記全反射減衰の状態を示すデータを、前記基準液に関する前記全反射減衰の状態を示すデータに基づいて補正する補正手段が設けられることが望ましい。

そのようにする場合、試料が被検体を溶媒に溶解させてなるものであるならば、前記基準液供給手段は、基準液として前記溶媒を供給するものであることが望ましい。

さらに、上記の測定装置は、測定ユニットの各々に付与された、個体識別情報を示すマークと、測定に使用される測定ユニットから前記マークを読み取る読取手段と、測定ユニットに供給される試料に関する試料情報を入力する入力手段と、測定結果を表示する表示手段と、この表示手段、前記入力手段および前記読取手段に接続されて、各測定ユニット毎の前記個体識別情報と前記試料情報とを対応付けて記憶するとともに、ある測定ユニットに保持された試料について求められた測定結果を、その測定ユニットに関して記憶されている前記個体識別情報および前記試料情報と対応付けて前記表示手段に表示させる制御手段とを備えることが望ましい。

上記した測定装置を用いてペプチド（生理活性物質）と相互作用する物質を検出または測定する場合、前記測定ユニットの１つにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出した後、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、別の測定ユニットにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出し、その後前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、前記１つの測定ユニットにおける試料に関して、再度全反射減衰の状態を検出することにより測定を行うことができる。

本発明で用いる測定チップは、本明細書中に記載した構成を有する表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、金属膜で構成されている。

金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記金属膜への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。

金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。

金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。

金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。

金属膜は、最表面にペプチド（生理活性物質）を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「最表面」とは、「金属膜から最も遠い側」という意味である。

好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ¹Ｒ²（式中、Ｒ¹及びＲ²は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ³ＮＲ¹Ｒ²（式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。

最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、例えば、それらの官能基の前駆体を含有する高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。

上記のようにして得られた測定チップにおいて、上記の官能基を介してペプチド（生理活性物質）を共有結合させることによって、金属膜にペプチド（生理活性物質）を固定化することができる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）生理活性物質のセンサー表面への固定
市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ビアコア社製、BIACORE3000）のカートリッジブロック上に市販のCM5チップ（ビアコア社製）を設置し、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液３００μＬを流速１０μＬ／ｍｉｎで測定セルに10分間流したのち、バッファー(10mM HEPES(N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸), 150mM NaCl, 10mM CaCl2)で洗浄した。次いで、流路3,4のみにanti-6His抗体（モノクローナル：フナコシ社）（溶液(1mg/mlになるようバッファーに溶解したもの)に入れ替え10分間流し、anti-6His抗体を固定したのち、全ての流路に1M エタノールアミン溶液を10分間流した。さらに、バッファーで10分間洗浄する。こうして、anti-6His抗体をセンサー表面に固定化した。

（２）GFP吸着解析
HEPESバッファーのみを流した部分を0として測定を行った。10μg/mlのGFP（Green Fluorescent Protein：フナコシ社）のHEPESバッファー溶液を（１）で作成したセンサー表面に全ての流路に対して流速20μl/minで流しSPR信号を測定し、流路3,4の平均と流路1,2の平均の差を結合信号とした。次いで、GFPを含まないHEPESバッファーを流しGFPを解離させた。10秒後と130秒後のGFP結合量を測定した。結果を表１に示す。このチップを比較サンプル１とした。

別途、上記と同様の操作を行ったあと、GFPの解離を行う際にHEPESバッファーに化合物CR-4およびCR-5をそれぞれ0.05%(w/w)含む溶液を用いて、上記と同様に10秒後と130秒後のGFP結合量を測定した。結果を表１に示す。このときのチップを本発明のサンプルとした。

（３）抗GFP抗体吸着解析
10nMの抗GFP抗体（ポリクローナル（ヤギ）：フナコシ社）の溶液を（２）により作成した比較サンプル１および本発明のサンプルのセンサー表面に全ての流路に対して流速20μl/minで流しSPR信号を測定し、流し始めてから120秒後の流路3,4の平均と流路1,2の平均の差を結合信号とした。結果を表１に示す。本発明のサンプルでは抗GFP抗体の吸着信号が明確に検出されるが、比較サンプル１では吸着信号が非常に小さくなることが判った。また、比較サンプル２として、GFPを固定した後、すぐに10nMの抗GFP抗体をセンサー表面に全ての流路に対して流速20μl/minで流したサンプルでも、程度の良化はあるものの実質的に解析に用いることができない吸着信号しか得られなかった（表１）。

Claims (6)

1. 表面プラズモン共鳴測定装置におけるペプチドの固定化方法であって、（１）表面プラズモン共鳴測定装置の金属膜表面に予め結合された第一のペプチドに該第一のペプチドと相互作用する第二のペプチドを結合させる工程、及び（２）ペプチドと化学結合を形成する官能基を少なくとも２個以上有する架橋剤を作用させることによって該第一のペプチドと該第二のペプチドとを架橋させる工程を含むペプチドの固定化方法。
2. 表面プラズモン共鳴測定装置が、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置である、請求項１に記載のペプチドの固定化方法。
3. 架橋剤が、ペプチドのアミノ基又はスルフィド基と化学結合を形成する官能基を少なくとも２個以上有する架橋剤である、請求項１又は２に記載のペプチドの固定化方法。
4. 表面プラズモン共鳴測定装置を用いて表面プラズモン共鳴の変化を測定することによってペプチドと被験物質との相互作用を分析する方法であって、
   （１）表面プラズモン共鳴測定装置の金属膜表面に予め結合された第一のペプチドに該第一のペプチドと相互作用する第二のペプチドを結合させる工程、及びペプチドと化学結合を形成する官能基を少なくとも２個以上有する架橋剤を作用させることによって該第一のペプチドと該第二のペプチドとを架橋させる工程、及び（２）被験物質を該金属膜表面に接触させることにより該第二のペプチドと相互作用させる工程を含む、ペプチドと被験物質との相互作用の分析方法。
5. 表面プラズモン共鳴測定装置が、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置である、請求項４に記載のペプチドと被験物質との相互作用の分析方法。
6. 前記流路系内の液体を、被験物質を含まない液体から被験物質を含む液体へと交換することにより表面プラズモン共鳴の変化を測定し、それによりペプチドと被験物質との相互作用を分析する、請求項５に記載のペプチドと被験物質との相互作用の分析方法。