JP4332478B2 - 表面プラズモン共鳴分析における反応速度係数の測定方法 - Google Patents
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Description
dR/dt=Ka×C×[Rmax−R(t)]−Kd×R(t) (i)
R(t)=(Ka×C×Rmax)/(Ka×C+Kd) ×(1−exp(-Ka×C+Kd) ×t))(ii)(上記式(i)を解いたもの)
Ka:吸着速度係数、Kd:離脱速度係数、C:アナライト濃度(既知)、Rmax:理論的最大結合量、t:時間
好ましくは、表面プラズモン共鳴の信号変化を測定は、液体を交換後、液の流れを停止させた状態で行われる。
本発明の測定方法は、表面プラズモン共鳴測定装置を用いて表面プラズモン共鳴の信号変化を測定することにより取得した信号曲線にフィッティングを施し、それにより、金属表面に固定化された被解析分子と該被解析分子と相互作用する分子との反応における吸着速度係数(Ka)及び離脱速度係数(Kd)を求める測定方法に関するものであり、特に、液交換時およびその後所定の時間のデータを除いた信号にてフィッティングを行うとともに、フィッティング曲線を、液交換時又はその直前のベースラインの値を通るようなアルゴリズムとすることを特徴とする。
dθ/dt=ka×cs×(1−θ)−kd×θ (1)
式中、θは吸着率(=吸着量/飽和吸着量)、kaは吸着速度係数、kdは離脱速度係数、csは金属表面近傍の被解析分子の濃度を表す。
ここで、金属表面を定常的に新鮮な液に置換しつづけられる理想的な条件ではcsは一定となり、簡素な微分方程式を解くことで測定結果からka、kdを求めることが可能である。
∂c/∂t=D×∂2c/∂x2 (2)
(式中、xは金属表面からの距離、Dは被解析分子の拡散係数、cは被解析分子の濃度を表し、x=0のときc=csとなる。)
θ=R/Rmax (3)
(式中、θは吸着率(=吸着量/飽和吸着量)を示し、Rは表面プラズモン信号を示し、Rmaxは被解析分子が飽和吸着したときの信号を表す。)
被解析分子を含まない参照溶液から被解析分子を含む試料溶液への切り替えが、被解析分子の吸着速度より充分速く、かつ沖合い濃度C0が均一な流れが定常的に生じている場合(以下、理想条件と呼ぶ)は、式(1)で計算することが可能となる。具体的には表面プラズモンの信号変化は式(4)で表される。
dR/dt=Ka×C0×(Rmax−R)Kd×R (4)
(C[0,t+Δt]−C[0,t]) << C[0,t] (9)
Δx << D/(DM×Sm×ka) (10)
Δx=Ax×D/(DM×Sm×ka) (11)
C[n×Δx,0]=C0 (12)
R[t]=(ka×C0×(Rmax−R[t−Δt])−kd×R[t−Δt])×Δt+R[t−Δt] (13)
R[t]=(ka×C[0,(t−Δt)]×(Rmax−R[t−Δt])−kd×R[t−Δt])×Δt+R[t−Δt] (14)
C[n×Δx,t]=D×(C[(n+1)×Δx,(t−Δt)]+C[(n−1)×Δx,(t−Δt)]−2×C[Δx,(t−Δt)])+C[Δx,(t−Δt)] (16)
C[n×Δx,ti]=C0 (17)
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、DNA(cDNAを含む)、RNAのいずれも使用できる。DNAの種類は特に限定されず、天然由来のDNA、遺伝子組換え技術により調製した組換えDNA、又は化学合成DNAの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインAあるいはプロテインG、リウマチ因子(RF)等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
金属膜として50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをModel-208UV−オゾンクリーニングシステム(TECHNOVISION INC.)で30分間処理した後、エタノール/水(80/20)中11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。
続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を1回繰り返した。
上記のデキストラン測定チップ内の溶液を除去した後、200mM EDC(N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド ハイドロクロライド)と50mM NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)の混合溶液70μlを添加し、10分間放置した。混合溶液を除去した後、100μlの水で3回、100μlのAcetate5.0バッファー(BIAcore社製)で3回洗浄した。Acetate5.0バッファーを100μl入れた状態でこのチップを本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、チップ内をProteinA溶液(ProteinA(ナカライテスク社製)を50μg/mlになるようAcetate5.0(BIAcore社製)に溶解したもの)に入れ替え30分間放置し、ProteinAを固定した。チップ内を1M エタノールアミン溶液に置き換え、10分間放置した。チップ内を100μlのAcetate5.0バッファーで10回洗浄した。ProteinAの固定による共鳴シグナル変化量は、500RUであった。
上記のデキストラン測定チップ内の溶液を除去した後、200mM EDCと50mM NHSの混合溶液70μlを添加し、10分間放置した。混合溶液を除去した後、100μlの水で3回、100μlのAcetate5.0バッファーで3回洗浄した。チップ内を1M エタノールアミン溶液に置き換え、10分間放置した。チップ内を100μlのAcetate5.0バッファーで10回洗浄した。
本発明のProteinA固定チップに対し、誘電体ブロックをシリコンゴムでふたをすることで、内容積15μlのセルを作成した。また、ふたのシリコンゴムに2箇所、1mmφの穴をあけ、内径0.5mm、外径1mmのテフロンチューブを通し、流路を作成した。同様に参照チップにもふた、流路を作成し、2つのチップを直列につなぎ、流路系を作成した。この流路系の2つのチップをそれぞれ、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置した。
流路系内をHBS-EPバッファー(BIAcore社製)で満たした。液交換前を基準とした信号変化を0.5秒間隔で測定した。流路系内を20μl/secの速度でmouse IgG溶液(mouse IgG(コスモバイオより購入)を10μg/mlになるようHBS-EPバッファーに溶解したもの)に置き換えた。
原理的にデッドタイムが「0秒」の時の測定は不可能(極度に困難)なため、それを可能な限り短くした(具体的には0.5秒)時の結合速度定数と比較し、補正法の効果を調べた(図6を参照)。その結果、「デッドタイム」が5秒あった場合でも、従来法の誤差 33% を1%へと劇的に抑制することができた(図6)。この誤差は、実質的に無視できる値である。これにより、測定精度を向上できるとともに、装置を簡略化でき、精度/信頼性/コストの全ての面にて大幅な改善をもたらすことができた。
11 誘電体ブロック
12 金属膜
13 試料保持枠
14 センシング物質
30 光ビーム
31 レーザ光源
32 集光レンズ
40 光検出器
S40 出力信号
400 ガイドロッド
401 スライドブロック
402 精密ねじ
403 パルスモータ
404 モータコントローラ
410 ユニット連結体
411 連結部材
Claims (6)
- 表面プラズモン共鳴測定装置を用いて表面プラズモン共鳴の信号変化を測定することにより取得した信号曲線にフィッティングを施し、それにより、金属表面に固定化された被解析分子と該被解析分子と相互作用する分子との反応における吸着速度係数(Ka)及び離脱速度係数(Kd)を求める測定方法において、液交換時およびその後所定の時間のデータを除いた信号にてフィッティングを行うとともに、フィッティング曲線が、液交換時又はその直前のベースラインの値を通るようなアルゴリズムであることを特徴とする、測定方法。
- 表面プラズモン共鳴の信号変化の測定が、非定常な流れの系にて行われる、請求項1に記載の方法。
- 表面プラズモン共鳴の信号変化を測定が、液体を交換後、液の流れを停止させた状態で行われる、請求項1に記載の方法。
- 金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、金属膜面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用いる、請求項1に記載の方法。
- 誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用いる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記流路系内の液体を、測定すべき被験物質を含有しない対照液体から、測定すべき被験物質を含有する試料液体へと交換し、その後、試料液体の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定する、請求項1から3の何れかに記載の方法。
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