ES2215241T3 - Procedimiento de espectrometria de masa. - Google Patents

Procedimiento de espectrometria de masa.

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ES2215241T3
ES2215241T3 ES97946893T ES97946893T ES2215241T3 ES 2215241 T3 ES2215241 T3 ES 2215241T3 ES 97946893 T ES97946893 T ES 97946893T ES 97946893 T ES97946893 T ES 97946893T ES 2215241 T3 ES2215241 T3 ES 2215241T3
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fluid
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vesicle
series
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ES97946893T
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English (en)
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Maryanne J. O'donnell
Charles R. Cantor
Daniel P. Little
Hubert Koster
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Sequenom Inc
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Abstract

SE PRESENTAN PROCEDIMIENTOS Y KITS PARA LA INMOVILIZACION DE UNA GRAN DENSIDAD DE ACIDOS NUCLEICOS SOBRE UNA SUPERFICIE INSOLUBLE, PARTICULARMENTE UTILES PARA UNA DETECCION ESPECTROMETRICA EN MASA DE ACIDOS NUCLEICOS. SE PRESENTAN AGRUPACIONES QUE CONTIENEN LOS ACIDOS NUCLEICOS INMOVILIZADOS Y EL USO DE LOS ACIDOS NUCLEICOS INMOVILIZADOS EN UNA VARIEDAD DE APLICACIONES QUIMICAS DE ACIDOS NUCLEICOS EN FASE SOLIDA, INCLUIDA LA SINTESIS (QUIMICA Y ENZIMATICA), HIBRIDACION Y/O EXTENSION DE ACIDOS NUCLEICOS, Y SECUENCIACION. TAMBIEN SE PRESENTAN HERRAMIENTAS DE DISTRIBUCION EN SERIE Y EN PARALELO CAPACES DE DISTRIBUIR VOLUMENES PREDETERMINADOS DE UN FLUIDO PARA GENERAR AGRUPACIONES DE MULTIPLES ELEMENTOS DE UN MATERIAL DE MUESTRA SOBRE LA SUPERFICIE DE UN SUBSTRATO. ENTRE LAS HERRAMIENTAS PRESENTADAS CABE INCLUIR UN CONJUNTO DE ELEMENTOS VESICULARES, O PASADORES, PUDIENDO INCLUIR CADA UNO DE LOS PASADORES UNA CAMARA INTERIOR ESTRECHA ADECUADA PARA RETENER VOLUMENES NANOLITRICOS DE FLUIDO. TAMBIEN SE PRESENTAN PROCEDIMIENTOS PARA LA DISTRIBUCION DE HERRAMIENTAS QUE SE PUEDEN UTILIZAR PARA GENERAR AGRUPACIONES DE MULTIPLES ELEMENTOS DE MATERIAL DE MUESTRA SOBRE LA SUPERFICIE DE UN SUBSTRATO. LA HERRAMIENTA PUEDE DISTRIBUIR UNA PORCION DE FLUIDO A LA SUPERFICIE DEL SUBSTRATO PULVERIZANDO EL FLUIDO DEL PASADOR, PONIENDO EN CONTACTO LA SUPERFICIE DEL SUBSTRATO O FORMANDO UNA GOTA QUE TOQUE LA SUPERFICIE DEL SUBSTRATO. LA HERRAMIENTA PUEDE FORMAR UNA AGRUPACION DE MATERIAL DE MUESTRA DISTRIBUYENDO EL MATERIAL DE MUESTRA EN UNA SERIE DE PASOS, AL TIEMPO QUE MUEVE EL PASADOR A DIFERENTES LUGARES ENCIMA DE LA SUPERFICIE DEL SUBSTRATO PARA FORMAR LA AGRUPACION DE MUESTRAS. LAS AGRUPACIONES DE MUESTRAS PREPARADA SE PUEDE PASAR A UN CONJUNTO DE PLACAS QUE DISPONE LAS AGRUPACIONES DE MUESTRAS PARA ANALISIS MEDIANTE UNA ESPECTROMETRIA EN MASA.

Description

Procedimiento de espectrometría de masa.
Antecedentes de la invención
En los campos de la biología molecular y la bioquímica, así como en el diagnóstico de enfermedades, la hibridación de ácido nucleicos se ha convertido en una herramienta poderosa para la detección, aislamiento y análisis de secuencias oligonucleotídicas específicas. Típicamente, tales ensayos de hibridación utilizan una sonda oligodesoxinucleotídica que se ha inmovilizado en un soporte sólido; tal como por ejemplo en el procedimiento dot blot inverso (Saiki, R. K., Walsh, P.S., Levenson, C.H., y Erlich, H.A. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6230). Más recientemente, se han creado series de sondas de ADN inmovilizadas unidas a una superficie sólida para secuenciación por hibridación(SBH) (Drmanac, R., Labat, I., Brukner, I., y Crkvenjakov, R. (1989) Genomics, 4, 114-128), (Strezoska, Z., Pauneska, T., Radosavljevic, D., Labat, I., Drmanac, R., y Crkvenjakov, r. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10089-10093). La SBH usa una serie ordenada de oligodesoxinucleótidos inmovilizados en un soporte sólido. A la serie se le aplica una muestra de ADN desconocido, y el modelo de hibridación se observa y se analiza para producir muchos bits cortos de formación de secuencia simultáneamente. Se ha creado una versión mejorada de SBH, denominada SBH posicional (PSBH), que usa sondas bicatenarias que contienen salientes 3' monocaternarios (Broude, N.E., Sano, T., Smith, C.L., y Cantor, C.R. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3072-3076). Ahora es posible combinar una estrategia de captura de PSBH con la secuenciación de Sanger convencional para producir escaleras de secuenciación detectables, por ejemplo, por electroforesis en gel (Fu, d., Broude, N.E., Köster, H., Smith, C.L. y Cantor, C.R. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10162-10166).
Para las series utilizadas en estos esquemas, hay varios criterios que deben cumplirse para conseguir un rendimiento satisfactorio. Por ejemplo, el ADN inmovilizado debe ser estable y no debe desorberse durante la hibridación, lavado o análisis. La densidad del oligodesoxinucleótido inmovilizado debe ser suficiente para los análisis posteriores. Debe haber una unión mínima no específica del ADN a la superficie. Además, el proceso de inmovilización no debe interferir con la capacidad de las sondas inmovilizadas para hibridar y ser sustratos para la síntesis enzimática en fase sólida. Para la mayoría de las aplicaciones, lo mejor es inmovilizar sólo un punto del ADN, idealmente un extremo.
En los últimos años, se han creado varios métodos para la inmovilización covalente de ADN a soportes sólidos, Con la intención de satisfacer todos los criterios indicados anteriormente. Por ejemplo, se ha unido ADN modificado de manera apropiada a superficies planas funcionalizadas con aminoácidos (Running, J.A., y Urdea, M.S. (1990) Biotechniques, 8, 276-277), (Newton, C.R., et al., (1993) Nucl.Acids. Res., 21, 1155-1162), (Nikiforov, T.T., y Rogers, Y.H. 81995) Anal. Biochem., 227, 201-209), grupos carboxilo (Zhang, Y., et al., (1991) Nucl. Acids. Res., 19 3929-3933), grupos epoxi (Lamture, J.B. et al., (1994) Nucl. Acids. Res., 22, 2121-2125), (Eggers, M.D., et al., (1994) Bio Techniques, 17, 516-524) o grupos amino (Rasmussen, S.R., et al., (1991) Anal. Biochem .,198, 138-142). Aunque muchos de estos métodos fueron bastante satisfactorios para sus aplicaciones respectivas, la densidad de oligonucleótido unido (máxima de aproximadamente 20 fmol de ADN por milímetro cuadrado de superficie) (Lamture, J.B., et al., (1994) Nucl. Acids, Res. 22, 2121-2125), (Eggers, M.D., et al., (1994) bio Techniques, 17, 516-524), estaba muy lejos del límite de empaquetamiento teórico del ADN.
Por lo tanto, se necesita un método para conseguir mayores densidades de ácidos nucleicos inmovilizados en una superficie. En particular, se necesita un método para conseguir mayores densidades de ácidos nucleicos inmovilizados en una superficie que permita el uso, la manipulación y la reacción adicional de los ácidos nucleicos inmovilizados así como el análisis de las reacciones.
En relación con la necesidad de métodos de inmovilización de ácidos nucleicos mejorados para uso, por ejemplo, en sistemas analíticos y de diagnóstico, está la necesidad de desarrollar herramientas de laboratorio sofisticadas que automaticen y aceleren el ensayo y análisis de muestras biológicas. En la vanguardia de los esfuerzos recientes para desarrollar mejores herramientas analíticas está el logro de acelerar el análisis de estructuras bioquímicas complejas. Esto es así particularmente en el caso del ADN genómico humano, que comprende al menos aproximadamente cien mil genes localizados en veinticuatro cromosomas. Cada gen codifica para una proteína específica, que cumple una función bioquímica específica dentro de una célula viva. Los cambios en una secuencia de ADN se conocen como mutaciones y puede producir proteínas con actividades bioquímicas alteradas o en algunos casos incluso perdidas; esto a su vez puede producir una enfermedad genética. Actualmente se conoce hoy más de 3.000 enfermedades genéticas. Además, la evidencia creciente indica que ciertas secuencias de ADN pueden predisponer a un individuo a cualquiera de varias enfermedades genéticas, tales como diabetes, ateroesclerosis, obesidad, ciertas enfermedades autoinmunes y cáncer. Por consiguiente, el análisis de ADN es un objetivo difícil pero que merece la pena, que promete producir información fundamental para el tratamiento de muchas enfermedades amenazadoras para la
vida.
Desafortunadamente, el análisis del ADN se hace particularmente problemático debido al tamaño y al hecho de que el ADN genómico incluye tanto secuencias codificantes como no codificantes (por ejemplo, exones e intrones). Como tales, tienen un valor mínimo técnicas tradicionales para analizar estructuras químicas, tales como el pipeteo manual del material fuente para crear muestras para análisis. Para abordar la escala del análisis necesario, los científicos han desarrollado protocolos de procesamiento paralelos para el diagnóstico de ADN.
Por ejemplo, los científicos han creado dispositivos robóticos que eliminan la necesidad del pipeteo manual y de la aplicación de manchas proporcionando un brazo robótico que lleva en su extremo proximal un dispositivo de herramienta de boquilla que consta de una matriz de elementos boquillas individuales de la matriz están separados entre si para permitir que cada elemento boquilla se sumerja dentro de un pocillo de una placa de microtitulación. El brazo robótico sumerge las boquillas en los pocillos de la placa de microtitulación mojando de esta manera cada uno de los elementos boquillas con material de muestra. El brazo robótico después mueve el dispositivo de herramienta de boquillas a una posición por encima de una superficie diana y bajo la herramienta de boquillas hasta la superficie poniendo en contacto las boquillas con la diana para formar una matriz de manchas sobre la misma. Por consiguiente, la herramienta de boquillas acelera la producción de muestras suministrando el material de muestra en paralelo.
Aunque esta técnica de herramienta de boquillas funciona bien para acelerar la producción de series de muestras, tiene varios inconvenientes. En primer lugar durante la operación de aplicación de manchas, la herramienta de boquillas realmente entra en contacto con la superficie del sustrato. Como cada herramienta de boquillas requiere un punto fino para que un pequeño tamaño de manchas se aplique sobre la diana, el contacto continuo de la herramienta de boquillas con la superficie diana desgastará y deformará los puntos finos y delicados de la herramienta de boquillas. Esto conduce a errores que reducen la exactitud y productividad.
Una técnica alternativa desarrollada por los científicos emplea la asociación química del material de muestra a la superficie del sustrato. En un proceso particular, se sintetiza ADN in situ en una superficie de sustrato para producir una serie de productos químicos espacialmente distintos y diversos. Tales técnicas son esenciales fotolitográficamente ya que combinan la química de fase sólida, grupos protectores fotoinestables y litografía fotoactivada. Aunque estos sistemas funcionan bien para generar series de material de muestra, son químicamente intensas, requieren mucho tiempo y son caras.
Además, es inquietante que ninguna de las técnicas anteriores proporcione un control suficiente sobre el volumen de material de muestra que se distribuye sobre la superficie del sustrato. Por consiguiente, pueden surgir errores por el fallo de estas técnicas para proporcionar series de muestra con volúmenes de muestra bien controlados y reproducidos de forma precisa. En un intento de solucionar este problema, el proceso de preparación a menudo distribuye grandes cantidades de materiales reactivos. Aunque esto puede asegurar volúmenes de muestra suficientes, despilfarra materiales de muestra, que a menudo son caros y de una disponibilidad limitada.
Incluso después de preparar las muestras, los científicos deben confrontar la necesidad de métodos de diagnóstico sofisticados para analizar las muestras preparadas. Para este fin, los científicos emplean varias técnicas para identificar materiales tales como ADN. Por ejemplo, pueden identificarse secuencias de ácido nucleico por hibridación con una sonda que sea complementaria a la secuencia a identificar. Típicamente, el fragmento de ácido nucleico se marca con una función indicadora sensible que puede ser radioactiva, fluorescente o quimioluminiscente. Aunque estas técnicas pueden funcionar bien, tienen ciertos inconvenientes. Los marcadores radioactivos pueden ser peligrosos y las señales que producen se desintegran a lo largo del tiempo. Los marcadores no isotópicos (por ejemplo fluorescentes) sufren de una falta de sensibilidad y una pérdida de intensidad de la señal cuando se emplean láseres de alta intensidad durante el proceso de identificación. Además, el marcaje es un procedimiento laborioso que requiere mucho tiempo y propenso a errores. Por consiguiente, el proceso de preparación y análisis de series de un material de muestra bioquímica es complejo y propenso a errores.
Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar sistemas y métodos mejorados para preparar series de material de muestra. Es otro objeto proporcionar sistemas que permitan la producción rápida de series de muestra. Es otro objeto de la presente invención proporcionar soportes a los que se unan altas densidades de moléculas de ácido nucleico. Véanse también las patentes de Estados Unidos Nº 5.547.835, 5.622.824 y 5.605.798.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere al campo del análisis por espectrometría de masas.
De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para formar una serie de un material sobre una superficie de un sustrato y analizar el material en la serie, que comprende:
proporcionar una vesícula o una pluralidad de vesículas que comprenden un fluido que incluye el material;
sin poner en contacto la superficie con la vesícula, disponer la vesícula o la pluralidad de vesículas adyacentes a una primera posición o una primera pluralidad de posiciones en la superficie de un sustrato;
suministrar un volumen de nanolitros definido y controlado del fluido en la primera posición o en la primera pluralidad de posiciones de la superficie del sustrato formando de esta manera una serie de material sobre la superficie del sustrato;
realizar un análisis de espectrometría de masas del material en cada posición de la serie,
donde, si sólo se proporciona una vesícula, después de la etapa de suministrar un volumen de nanolitros definido y controlado del fluido y antes de realizar el análisis de espectrometría de masas, el método comprende además:
desplazar la vesícula hasta una pluralidad de posiciones adyacentes a la superficie del sustrato y suministrar un volumen de nanolitros definido y controlado del fluido en la pluralidad de posiciones, formando de esta manera una serie del material.
De acuerdo con un segundo aspecto, la presente invención también proporciona un sustrato que comprende una superficie que comprende material depositado en una pluralidad de posiciones, donde:
el material comprende una matriz para un análisis espectrométrico de masas, y
el material depositado está en una cantidad que resulta de la deposición de un volumen de nanolitros definido y controlado que contiene el material en la superficie.
En este documento se proporcionan métodos para formar una serie de ácidos nucleicos en una superficie de un sustrato poniendo en contacto ácidos nucleicos que contienen tiol con un soporte insoluble que contiene grupos reactivos con tiol colocados en una disposición ordenada en la superficie del soporte. En un método alternativo para formar una serie de ácidos nucleicos en una superficie de un sustrato como se proporciona en este documento, un soporte insoluble que contiene funcionalidades tiol colocadas en una disposición ordenada en la superficie del soporte se pone en contacto con ácidos nucleicos que contienen un grupo reactivo con tiol.
Los métodos generales para preparar una serie de material de muestra en una superficie de un sustrato como se describen en este documento incluyen las etapas de proporcionar una vesícula que tiene una cámara interior que contiene un fluido, disponer la vesícula adyacente a una primera posición en la superficie del sustrato, controlar el recipiente para suministrar un volumen de nanolitros y un fluido en la primera posición de la superficie del sustrato, y desplazar la vesícula a una serie de posiciones adyacentes al sustrato de la superficie con lo que se suministra fluido en cada posición de la serie de posiciones para formar una serie de material de muestra.
Los sustratos empleados durante los procesos generales para preparar una serie de material de muestra descritos en este documento pueden incluir superficies planas para recibir el material de muestras y que tienen la superficies que incluyen pocillos formados en la superficies que incluyen pocillos formados en la superficie para definir posiciones para recibir el fluido que puede expulsarse desde las cámaras de las vesículas. Tales sustratos pueden ser silicio, metal, plástico, una membrana, material polimérico, un polímero con injertos de metales, así como un sustrato que esté químicamente funcionalizado, funcionalizado con perlas, funcionalizado con árboles dendríticos de material capturado, o cualquier combinación de los anteriores o cualquier material adecuado similar para recibir el fluido suministrado.
Se entenderá que en los métodos generales para preparar una serie de material de muestra sobre una superficie de sustrato descritos en este documento, el aparato puede suministrar tanto un material de analito como un material de soporte, tal como un material de matriz, que ayude al análisis del analito. Para este fin, los métodos proporcionados en este documento pueden incluir las etapas de depositar un material de matriz sobre la sustancia del sustrato. Además, los métodos pueden incluir también una etapa de espera durante un período de tiempo predeterminado para permitir que se evapore el disolvente del material de matriz. Una vez evaporado el disolvente del material de matriz, los métodos de esta invención pueden incluir la etapa de expulsar un volumen de fluido de analito en el interior del material de matriz evaporado para disolverse con la matriz y formar una estructura cristalina sobre la superficie del sustrato. Se entenderá que esta etapa de resolución del material de matriz con el material de analito ayuda al análisis de la composición del material durante ciertos procesos analíticos tales como espectrometría de masas.
En una realización práctica alternativa, los métodos de la presente invención pueden incluir la etapa de distribuir una mezcla que consta del material de analito y el material de matriz, así como otras composiciones de material. De esta forma, la matriz y el analito se suministran en la superficie del sustrato como un volumen de material. En otra etapa, las series preparadas de material de muestra pueden proporcionarse en una herramienta de diagnóstico para determinar información que es representativa de la composición del material de muestra.
Tal herramienta de diagnóstico puede incluir un espectrómetro de masas. Los espectrómetros de masas pueden ser espectrómetros de masas de tiempo de vuelo, espectrómetros de masas de transformada de Fourier o cualquier otro tipo de espectrómetro de masas que permita el análisis de la composición de la serie de muestras.
En una realización práctica de los métodos, la etapa de proporcionar una vesícula que tenga una cámara interior incluye la etapa de proporcionar una vesícula que tenga un elemento piezoeléctrico para hacer que el fluido se mueva a través de la cámara. Este método también puede incluir la etapa de desplazar la vesícula arrastrando la vesícula a través de la superficie del sustrato, para formar la serie de material de muestra.
En una realización práctica alternativa de los métodos, pueden emplearse protocolos de procesamiento paralelos en los que la vesícula que se emplea durante el procesamiento incluye un montaje de vesículas que tiene una pluralidad de vesículas dispuestas en una matriz para distribuir fluido en una primera pluralidad de posiciones en la superficie del sustrato. De esta forma, en una sola operación, el método proporciona la formación de una matriz de un material de muestra sobre la superficie del sustrato. También puede emplearse impresión offset para formar una gran matriz de material de muestra empleando múltiples etapas de impresión con la matriz de vesículas. La presente invención puede emplear otras técnicas de impresión sin apartarse de su alcance.
En otra realización, puede distribuirse fluido en la superficie del sustrato poniendo en contacto la vesícula contra la superficie del sustrato para manchar la superficie del sustrato con material de muestra. Como alternativa, los métodos proporcionan otra estrategia de impresión sin contacto donde los procesos de la invención hacen que se forme una gota de fluido en la punta distal de la vesícula. Es la gota de fluido la que entra en contacto con la superficie del sustrato para suministrar el material de muestra a la misma. Esto facilita la liberación controlada del volumen conocido de fluidos sin ocasionar el contacto de la vesícula con la superficie del sustrato.
En otras realizaciones, se describen vesículas que tienen una cámara interior que está adaptada dimensionalmente para permitir el relleno de la cámara por acción capilar.
En este documento también se proporcionan sustratos que tienen una superficie para llevar una serie de un material de matriz y formados de acuerdo con un proceso que comprende las etapas de proporcionar una vesícula adecuada para transferir un fluido que contiene un material de matriz, disponer la vesícula adyacente a una primera posición en la superficie del sustrato, controlar la vesícula para suministrar el fluido en la primera posición de la superficie del sustrato y desplazar la vesícula a una serie de posiciones adyacentes a la superficie del sustrato y suministrar fluido en cada una de estas posiciones para formar una serie de material de matriz. El propio sustrato puede ser un chip de silicio plano así como cualquier otro material adecuado, y puede pipetearse, incluir pocillos y tener pocillos que tengan superficies interiores rugosas.
En realizaciones particulares, los métodos para formar una serie de ácidos nucleicos en una superficie de un sustrato como se proporcionan en este documento, incluyen poner en contacto posiciones predeterminadas de la superficie de un soporte insoluble con soluciones de ácidos nucleicos que contienen tiol distribuidas en las posiciones con una vesícula que tiene una cámara interior que contiene las soluciones respectivas, incorporando de esta manera las posiciones predeterminadas grupos reactivos con tiol. Como alternativa, la superficie entera del sustrato se modifica con los grupos reactivos con tiol y el ácido nucleico que contiene tiol se distribuye en posiciones predeterminadas sobre la superficie de una manera que se forma la serie. En esta invención también se proporcionan sustratos que tienen una superficie que lleva una serie de ácidos nucleicos formados por los métodos descritos en el documento.
También se describen procesos para inmovilizar una alta densidad de ácidos nucleicos en una superficie, que están basados en la reacción rápida de un grupo tiol libre de una superficie modificada o un ácido nucleico modificado, en condiciones apropiadas, con una funcionalidad reactiva con tiol del otro componente (superficie o ácido nucleico). Esta reacción puede ser directa o por medio de un reactivo de reticulación bifuncional. Preferiblemente, el ácido nucleico modificado incluye un grupo tiol y el reactivo de reticulación contiene un grupo yodoacetilo.
También se describen soportes sólidos a los que se unen "perlas" que están unidas a moléculas de ácido nucleico. Las perlas no necesariamente son esféricas, si no que se refieren a partículas que están conjugadas con el soporte sólido para aumentar de esta manera la superficie específica del soporte sólido y/o proporcionar una superficie alternativa para la conjugación de ácidos nucleicos u otras moléculas. Las perlas preferiblemente tienen un tamaño de aproximadamente 1 \mum a 100 \mum. También se describen composiciones que contienen al menos una perla conjugada con un soporte sólido y conjugado adicionalmente con al menos una molécula, particularmente un ácido nucleico. La perla se forma a partir de cualquier material de matriz adecuado conocido por los especialistas en la técnica, incluyendo los que son hinchables y no hinchables. El soporte sólido es cualquier soporte conocido por los especialistas en la técnica para uso como matriz de soporte en síntesis y análisis químicos. En tales casos, el ácido nucleico se une a la "perla" a través de un átomo de azufre como se describe en este documento. En ciertas realizaciones, las perlas pueden conjugarse en el soporte sólido en pocillos o picaduras en la superficie o las perlas pueden disponerse en forma de una serie en el soporte.
Preferiblemente, la perla está hecha de un material seleccionado entre materiales que sirven como soportes sólidos para síntesis y para ensayos incluyendo, pero no limitados a: gel de sílice, vidrio, imán, resinas de poliestireno/divinilbenceno al 1% tales como resinas Wang, que son resinas de Fmoc-aminoácido-4-(hidroximetil)fenoximetilcopoli(estireno-divinilbenceno al 1% (DVD)), resina de clorotritil (2-clorotritilcloruro copoliestireno-DVB), metal de resina de Merrifield (copoliestireno clorometilado-DVB), plástico, celulosa, dextrano reticulado, tales como los vendidos con el nombre comercial Sephadex® (Pharmacia) y gel de agarosa, tales como geles vendidos con el nombre comercial Shepharose® (Pharmacia), que es un gel de agarosa de tipo polisacárido con enlaces de hidrógeno, y otras resinas y soportes de fase sólida conocidos por los especialistas en la técnica. Preferiblemente, la perla tiene un tamaño en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 500 \mum, más preferiblemente de aproximadamente 1 a 100 \mum de diámetro.
El soporte sólido es de cualquier forma deseada, incluyendo, pero sin limitación: una perla, capilar, placa, membrana, oblea, peine, boquilla, una oblea con picaduras, una serie de picaduras o pocillos de nanolitros y otras geometrías y formas conocidas por los especialistas en la técnica.
En otro aspecto, se describen kits para ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte insoluble. En una realización, el kit puede comprender una cantidad apropiada de: i) un reactivo de reticulación reactivo con tiol; ii) un reactivo modificador de la superficie para modificar una superficie con una funcionalidad que puede reaccionar con el reactivo de reticulación reactivo con tiol. El kit opcionalmente puede incluir un soporte insoluble, por ejemplo, una superficie sólida, microperlas magnéticas u obleas de silicio, para uso en la inmovilización de ácidos nucleicos. El kit también puede incluir opcionalmente tampones apropiados así como instrucciones para uso.
El uso de estos procesos para inmovilizar moléculas de ácido nucleico en un soporte sólido produce una inmovilización al menos 12,5 veces mayor que las técnicas indicadas previamente. Por lo tanto, los procesos son particularmente útiles para formar plataformas de lanzamiento de ácido nucleico para espectrometría de masas.
Los ácidos nucleicos inmovilizados en una superficie usando los métodos descritos en este documento pueden usarse en una diversidad de aplicaciones de química de ácido nucleico en fase sólida, incluyendo pero sin limitación síntesis (química y enzimática), hibridación y/o extensión de ácidos nucleicos, y en métodos de diagnóstico basados en análisis de detección y polimorfismos de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.605.798). Por consiguiente, en el presente documento también se describen métodos para hacer reaccionar moléculas de ácido nucleico en los que las moléculas de ácido nucleico se inmovilizan en una superficie por reacción de un derivado que contiene tiol de la molécula de ácido nucleico con un soporte insoluble que contiene un grupo reactivo con tiol o por reacción de un soporte insoluble que contiene tiol con un derivado que contiene grupos reactivos con tiol de la molécula de ácido nucleico y posteriormente la reacción adicional de las moléculas de ácido nucleico inmovilizadas.
En un aspecto particular, el ácido nucleico inmovilizado se hace reaccionar adicionalmente por hibridación con un ácido nucleico que es complementario al ácido nucleico inmovilizado o a una parte del mismo. Tales reacciones de hibridación pueden usarse para detectar la presencia de un ácido nucleico específico en una muestra. Esto es particularmente útil en la detección de patógenos en una muestra, tal como una muestra biológica que puede emplearse en el diagnóstico de enfermedades.
En el presente documento también se describen métodos para detectar un ácido nucleico diana en una muestra, donde un ácido nucleico que contiene tiol complementario al ácido nucleico diana se inmoviliza en una superficie usando los procesos descritos en este documento y la muestra se pone en contacto con la superficie en condiciones con lo que el ácido nucleico diana en la muestra hibrida con el ácido nucleico inmovilizado. El ácido nucleico diana hibridado puede detectarse usando una diversidad de métodos, siendo el método preferido la espectrometría de masas. En el presente documento también se describen métodos para detectar alteraciones (por ejemplo deleciones, inserciones y conversiones) en la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico diana. En estos métodos, el peso molecular del ácido nucleico diana hibridado, determinado por espectrometría de masas, se compara con el peso molecular esperado para la secuencia de ácido nucleico diana. Las desviaciones del peso molecular medido del peso molecular esperado son indicativas de una alteración en la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico diana.
En otros métodos de detección de un ácido nucleico diana en una muestra, el ácido nucleico diana se inmoviliza en una superficie que contiene los grupos reactivos con tiol. En estos métodos, antes de la inmovilización, el ácido nucleico diana se amplifica en una reacción en la que un cebador oligonucleotídico contiene un enlace disulfuro 3' ó 5' y el producto resultante se reduce para generar un ácido nucleico que contiene tiol. El ácido nucleico que contiene tiol se inmoviliza en una superficie que contiene grupos reactivos con tiol y se pone en contacto con un ácido nucleico monocatenario que es complementario al ácido nucleico inmovilizado o a una parte del mismo. La hibridación del ácido nucleico monocatenario puede detectarse por una diversidad de métodos. Por ejemplo, el ácido nucleico monocatenario puede marcarse con un resto fácilmente detectable, por ejemplo, marcadores radioactivos o quimioluminiscentes. Preferiblemente, el ácido nucleico monocatenario se detecta por espectrometría de masas.
En otro aspecto, el ácido nucleico inmovilizado se hace reaccionar adicionalmente por extensión de un ácido nucleico que se hibrida con el ácido nucleico inmovilizado o una parte del mismo. Pueden usarse reacciones de extensión tales como estas, por ejemplo, en métodos para secuenciar moléculas de ADN que están inmovilizadas en un soporte insoluble usando los procesos descritos en este documento. De esta manera, en el presente documento también se describen métodos para determinar la secuencia de una molécula de ADN en un sustrato en el que un derivado que contiene tiol de la molécula de ADN se inmoviliza sobre la superficie de un soporte insoluble que contiene grupos reactivos con tiol e hibridan con un ácido nucleico monocaterio complementario a una parte de la molécula de ADN inmovilizada antes de realizar la síntesis de ADN en presencia de uno o más de didesoxinucleótidos.
También puede usarse la extensión de un cebador de ácido nucleico que hibrida con un ácido nucleico inmovilizado en una superficie como se describe en este documento en la detección de alteraciones de secuencias de nucleótidos (por ejemplo, deleciones, inserciones, conversiones) de un ácido nucleico diana. En el presente documento se describen métodos para detectar alteraciones en una secuencia de ácido nucleico diana en la que un ácido nucleico monocatenario se hibrida con un ácido nucleico diana que contiene tiol inmovilizado en un soporte sólido de acuerdo con los procesos proporcionados en el presente documento y el ácido nucleico monocatenario hibridado se extiende por la adición de nucleótidos al extremo 3' de la molécula. El producto de extensión se caracteriza, por ejemplo, por espectrometría de masas para determinar si sus características difieren de las esperadas de una secuencia complementaria al ácido nucleico diana inmovilizado. De esta manera, por ejemplo, el peso molecular del producto de extensión determinado por espectrometría de masas se compara con el peso molecular esperado de un ácido nucleico complementario al ácido nucleico diana. Las desviaciones del peso molecular esperado son indicativas de una alteración en la secuencia del ácido nucleico diana.
En aspectos particulares, el ácido nucleico diana puede amplificarse antes de la inmovilización en una superficie reactiva con tiol en una reacción en la que un cebador oligonucleotídico contiene un enlace disulfuro 3' ó 5'. El producto resultante se produce para generar un ácido nucleico diana que contiene tiol. El ácido nucleico diana que contiene tiol después se inmoviliza en una superficie que contiene grupos reactivos con tiol y el ácido nucleico complementario monocatenario se hibrida con el mismo y se extiende.
En otro aspecto, un ácido nucleico monocatenario complementario al ácido nucleico diana se inmoviliza en una superficie a través de un enlace que incluye un enlace grupo tiol-funcionalidad reactiva con tiol y un resto enlazador escindible. La muestra que contiene el ácido nucleico diana se pone en contacto con la superficie en condiciones en las que la diana hibrida con el ácido nucleico monocatenario inmovilizado. El ácido nucleico monocatenario inmovilizado se extiende por la adición de nucleótidos al extremo 3' de la molécula. Después de la extensión, la molécula bicatenaria se desnaturaliza y el producto de extensión inmovilizado monocatenario se escinde de la superficie en la posición del enlazador. El producto de extensión se caracteriza, por ejemplo, por espectrometría de masas para determinar si sus características difieren de las esperadas de una secuencia complementaria al ácido nucleico diana inmovilizado.
Se entenderá que todas las aplicaciones de la química de ácidos nucleicos en fase sólida basadas en ácidos nucleicos inmovilizados en un sustrato sólido de acuerdo con los procesos proporcionados en este documento pueden realizarse con ácidos nucleicos que contienen tiol y una superficie reactiva con tiol así como con ácidos nucleicos que reaccionan con tiol y un soporte que contiene tiol.
En el presente documento también se describen sistemas y métodos para preparar una muestra para análisis, y más específicamente sistemas y métodos para distribuir pequeños volúmenes de material fluido sobre una superficie de sustrato para generar una serie de muestras para un análisis de diagnóstico. Los sistemas y métodos descritos en el presente documento para preparar series de material de muestra generalmente son menos caros de emplear y conservan los materiales reactivos al mismo tiempo que permiten la rápida producción de series de muestra muy
reproducibles.
En el presente documento se describen, con respecto a sistemas y métodos para distribuir pequeños volúmenes de material fluido sobre una superficie de sustrato, herramientas de distribución en serie y paralelo que pueden emplearse para generar series de múltiples elementos de materiales de muestra en una superficie de sustrato. Las superficies de sustrato pueden ser planas o estar alteradas geométricamente para incluir pocillos de recepción del material.
En una realización, la herramienta es una que permite el desarrollo paralelo de una serie de muestras. Para este fin, la herramienta puede entenderse como una serie de elementos de vesículas, o boquillas, donde cada uno de las boquillas puede incluir una cámara interior estrecha adecuada para albergar volúmenes de nanolitros de fluido. Cada uno de las boquillas puede ajustarse dentro de un alojamiento que por si mismo tiene una cámara interior. El alojamiento interior puede estar conectado a una fuente de presión que controlará la presión dentro de la cámara de alojamiento interior para regular el flujo de fluido a través de la cámara interior de las boquillas. Esto permite la distribución controlada de volúmenes definidos de fluido desde las vesículas.
En una realización alternativa, la herramienta incluye una serie de chorro que puede incluir una boquilla capilar que tiene una cámara interior y un elemento transductor montado en la boquilla y capaz de dirigir fluido a través de la cámara interior de la boquilla para expulsar fluido desde la boquilla. De esta manera, la herramienta puede distribuir una mancha de fluido en una superficie de sustrato pulverizando el fluido desde la boquilla. Como alternativa, el transductor puede hacer que se extienda una gota de fluido desde el capilar de forma que el fluido pueda pasarse al sustrato por contacto de la gota con la superficie del sustrato.
Además, la herramienta puede formar una serie de material de muestra distribuyendo material de muestra en una serie de etapas, mientras que se desplaza la boquilla en posiciones diferentes por encima de la superficie del sustrato para formar la serie de muestra. En otra realización, las series de muestra preparadas se pasan a una serie de placas que dispone las series de muestra para el análisis por espectrometría de masas. Para este fin, se proporciona un espectrómetro de masas que genera una serie de señales espectrales que pueden entenderse como indicativas de la composición del material de muestra que se está analizando.
En un aspecto, el aparato de distribución para distribuir volúmenes definidos de fluido, incluyendo nanovolúmenes y subnanovolúmenes de fluido, en procedimientos químicos o biológicos sobre la superficie de un sustrato puede incluir un alojamiento que tiene una pluralidad de lados y una parte de fondo que tiene una pluralidad de aberturas formadas, definiendo las paredes y la parte de fondo del alojamiento un volumen interior; una o más vesículas de transmisión de fluidos, o boquillas, montadas dentro de las aberturas, que tienen una cámara que alberga el fluido con un tamaño de nanovolúmen para albergar nanovolúmenes de fluido, estando dispuesta la cámara para albergar el fluido en comunicación fluida con el volumen interior del alojamiento, y un elemento de distribución que está en comunicación con el volumen interior del alojamiento para distribuir selectivamente nanovolúmenes de fluido desde las vesículas de transmisión de fluidos con tamaño de nanovolúmen cuando el fluido se carga en las cámaras que albergan fluido de las vesículas. Como se describe en este documento, esto permite que el elemento de distribución distribuya nanovolúmenes del fluido en la superficie del sustrato cuando el aparato se dispone sobre y alineado con el sustrato.
En una realización, la vesícula de transmisión de fluidos tiene un extremo proximal abierto y una parte de punta distal que se extiende más allá de la parte de fondo del alojamiento cuando se monta dentro de las aberturas. De esta manera, el extremo proximal abierto puede distribuir la cámara de alojamiento de fluido en comunicación fluida con el volumen interior cuando se monta con las aberturas. Opcionalmente, la pluralidad de vesículas de transmisión de fluido se montan de forma retirable y reemplazable dentro de las aberturas del alojamiento, o como alternativa pueden incluir un sellado con pegamento para montar de forma fija las vesículas dentro del alojamiento.
En una realización, la cámara que alberga el fluido incluye un orificio estrecho adaptado dimensionalmente para rellenarse con el fluido por medio de una acción capilar, y puede estar dimensionada para rellenarse de una forma sustancialmente completa con el fluido por medio de la acción capilar.
En una realización, la pluralidad de vesículas de transmisión de fluido comprende una serie de agujas de suministro de fluido, que pueden estar formadas de metal, vidrio, sílice, material polimérico o cualquier otro material adecua-
do.
En una realización, el alojamiento puede incluir una parte superior, y elementos de desviación mecánicos para desviar de forma mecánica la pluralidad de vesículas de transmisión de fluido a un contacto cerrado herméticamente con la parte de fondo del alojamiento. En una realización particular, cada vesícula de transmisión de fluido tiene una parte de extremo proximal que incluye un reborde, y que también incluye un elemento de sellado dispuesto entre el reborde y la superficie interna de la parte de fondo del alojamiento para formar un cierre hermético entre el volumen interior y el medio externo. Los elementos de desviación pueden ser mecánicos y pueden incluir una pluralidad de elementos de muelle de los que cada uno está acoplado por un extremo al extremo proximal de cada una de la pluralidad de vesículas de transmisión de fluido, y por otro extremo a la superficie interna de la parte superior del alojamiento. Los muelles pueden aplicar una fuerza de desviación mecánica al extremo proximal de la vesícula para formar el cierre hermético.
En otra realización, el alojamiento también incluye una parte superior, y un elemento de fijación para fijar la parte superior del alojamiento a la parte inferior del alojamiento. El elemento de fijación puede comprender una pluralidad de aberturas que reciben grapas dentro de una de las partes superior en inferior del alojamiento, y una pluralidad de grapas para montar dentro de las aberturas para fijar conjuntamente las partes superior e inferior del alojamiento.
En una realización, el elemento de distribución puede comprender una fuente de presión acoplada de forma fluida al volumen interior del alojamiento para disponer el volumen interior en un estado de presión seleccionado. Además, en una realización en la que las vesículas de transmisión de fluidos se rellenan a través de la acción capilar, el elemento de distribución puede incluir un controlador de presión que puede variar la fuente de presión para disponer el volumen interior del alojamiento en condiciones de presión variables. Esto permite al controlador variar los elementos para disponer el volumen interior a unas condiciones de presión seleccionadas suficientes para compensar la acción capilar para introducir el fluido en la cámara de alojamiento de cada vesícula hasta una altura predeterminada correspondiente a una cantidad de fluido predeterminada. Además, el controlador también puede incluir un elemento de selección de fluidos para descargar selectivamente una cantidad de fluido de nanovolúmen seleccionada desde la cámara de cada vesícula. En una realización particular, se incluye un controlador de presión que funciona bajo el controlador de un programa de ordenador que funciona en un sistema de procesamiento de datos para proporcionar un control variable sobre la presión aplicada a la cámara interior del alojamiento.
En una realización, la vesícula de transmisión de fluido puede tener un extremo proximal que se abre en el volumen interior del alojamiento, y la cámara que alberga el fluido de las vesículas está dimensionada para rellenarse de una forma sustancialmente completa con el fluido por medio de acción capilar sin formar un menisco en el extremo abierto proximal. Opcionalmente, el aparato puede tener diversas vesículas, donde una primera parte de las diversas vesículas incluye cámaras de alojamiento de fluidos de un primer tamaño y una segunda parte que incluye cámaras de alojamiento de fluido de un segundo tamaño, con lo que pueden distribuirse diversos volúmenes de fluidos.
En otra realización, el aparato de distribución puede incluir un elemento de selección de fluido que tiene una fuente de presión acoplada al alojamiento y en comunicación con el volumen interior para disponer el volumen interior a una condición de presión seleccionada, y un elemento de ajuste que se acopla a la fuente de presión para variar la presión dentro del volumen interior del alojamiento para aplicar una presión positiva en la cámara de fluido de cada una de las vesículas de transmisión de fluido para variar la cantidad de fluido distribuida desde las mismas. El elemento de selección y el elemento de ajuste pueden ser programas de ordenador que funcionan en un sistema de procesamiento de datos que dirige la operación de un controlador de presión conectado a la cámara interior.
En otra realización alternativa, el aparato es para distribuir un fluido en procedimientos químicos o biológicos en uno o más pocillos de un sustrato de múltiples pocillos. El aparato puede incluir un alojamiento que tiene una pluralidad de lados y una parte inferior que tiene formada una pluralidad de aberturas, definiendo las paredes y la parte inferior un volumen interior, una pluralidad de vesículas de transmisión de fluido, montadas dentro de las aberturas, que tienen una cámara de alojamiento de fluido dispuesta en comunicación con el volumen interior del alojamiento, y un medio de selección y distribución de fluido en comunicación con el volumen interior del alojamiento para seleccionar de forma variable una cantidad del fluido cargado dentro de las cámaras de alojamiento de fluido de las vesículas a distribuir desde una sola serie de la pluralidad de vesículas de transmisión de fluido. Por consiguiente, el medio de distribución distribuye una cantidad seleccionada del fluido en los pocillos del sustrato de múltiples pocillos cuando el aparato se dispone sobre y alineado con el sustrato.
En el presente documento se describe un aparato de distribución de fluidos para distribuir fluidos en procedimientos químicos o biológicos en uno o más pocillos de un sustrato de múltiples pocillos que comprende un alojamiento que tiene una pluralidad de lados y partes superior e inferior, teniendo la parte inferior formadas en la misma una pluralidad de aberturas, definiendo las paredes y las partes superior e inferior del alojamiento un volumen interior, una pluralidad de vesículas de transmisión de fluido, montadas dentro de las aberturas, que tienen una cámara de alojamiento de fluidos dimensionada para albergar nanovolúmenes del fluido, estando dispuesta la cámara de alojamiento de fluidos en comunicación fluida con el volumen del alojamiento, y un elemento de desviación mecánico para desviar mecánicamente la pluralidad de vesícula de transmisión de fluido a un contacto hermético con la parte inferior del alojamiento.
En otro aspecto se describen métodos para analizar un material que comprende las etapas de proporcionar una vesícula adecuada para llevar un fluido que tiene el material, disponer la vesícula adyacente a una primera posición de la superficie del sustrato, controlar la vesícula para suministrar un volumen de nanolitros del fluido para proporcionar un volumen definido y controlado de fluido en la primera posición de la superficie del sustrato, desplazar la vesícula a una segunda posición adyacente a una segunda posición en la superficie del sustrato para distribuir un volumen definido y controlado del material a lo largo de una serie de posiciones en la superficie del sustrato, y realizar un análisis de espectrometría de masas del material en cada posición de la serie. Estos métodos pueden incluir la etapa de mezclar un material de matriz y un material de analito para formar el fluido que se suministra a la superficie del sustrato. Como alternativa, esta realización puede incluir las etapas de rellenar una cámara contenida dentro de la vesícula con un material de matriz y distribuir el material de matriz en la serie de posiciones. Posteriormente, puede distribuirse un analito. La etapa de realizar espectrometría de masas puede incluir la etapa de realizar una espectrometría de masas de ionización de desorción de láser ayudada por matriz, así como espectrometría de masas de tiempo de vuelo, o una espectrometría de transformada de Fourier.
En otro aspecto, se describen aparatos para formar una serie de un material de muestra sobre una superficie de un sustrato. Tal aparato comprenderá una vesícula que tiene un extremo distal adecuado para llevar un fluido en la misma, un brazo móvil que tiene una parte distal montada en la vesícula, un controlador para mover el brazo para disponer la vesícula adyacente a una primera posición en la superficie del sustrato y para controlar la vesícula para proporcionar un volumen de nanolitros del fluido en la primera posición de la superficie del sustrato, y una herramienta de diagnóstico para analizar el material y generar una señal de composición que sea representativa de la composición química del material. En este aparato, la vesícula puede comprender un eje sólido de material así como una vesícula que tiene una cámara interior adecuada para llevar fluido así como una cámara para llevar fluido en un elemento de transducción para expulsar el fluido desde esa cámara.
Las características anteriores y otras características y ventajas de la presente invención se harán más claras a partir de las siguientes figuras, descripción detallada y reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra un sistema para preparar series de un material de muestra para análisis.
La figura 2 ilustra una serie de boquillas adecuado para uso con el sistema representado en la fig. 1 para realizar un proceso en paralelo de distribución de material en una superficie de un sustrato.
La figura 3 representa una parte inferior del conjunto mostrado en la fig. 2.
La figura 4 representa una vista alternativa de la parte inferior del conjunto de boquillas representado en la fig. 2.
Las figuras 5A-5D representan un método para preparar una serie en material de muestra.
Las figuras 6A-6B representan una serie alternativo para distribuir material en la superficie de un sustrato.
La figura 7 es un esquema que muestra la unión covalente de oligodesoxinucleótidos a una superficie de dióxido de silicio como se describe en los métodos del presente documento. En particular, se hizo reaccionar dióxido de silicio con 3-aminopropiltrietoxisilan para producir una capa uniforme de grupos amino primarios en la superficie. Después se hizo reaccionar un agente de reticulación heterobifuncional con la amina primaria para incorporar un grupo yodoacetamida. Un oligodesoxinucleótido que contenía un disulfuro 3' ó 5' (mostrado como 5') se trató con tris-(2-carboxietil) fosfina (TCEP) para reducir el disulfuro a un tiol libre, que después se acopló a la superficie de yodoacetamido.
La figura 8 es un gráfico que representa la conjugación de sondas oligodesoxinucleotídicas a una superficie de silicio en función de la concentración de TCEP usada en la reducción de disulfuro.
La figura 9 es un espectro de masas láser ayudado por matriz de desorción/ionización-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) de una oblea de silicio con la secuencia oligodesoxinucleotídica denominada "TCUC" (5'-GAATTCGAGCTCG
GTACCCGG-3'; SEC ID Nº 1) unida covalentemente esencialmente como se describe en la figura 7 y la secuencia oligodesoxinucleotídica denominada "MJM6" (5'-CCGGGTACCGAGCTCGAATTC-3'; SEC ID Nº 2) hibridada con la misma.
La figura 10 es un esquema de la inmovilización de dianas de ADN que contienen tiol específicas generadas por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la superficie de una oblea de silicio. Un oligonucleótido [SEC ID Nº: 7] complementario a una parte de la secuencia diana de ADN se hibridó con la diana de ADN inmovilizada y se realizó un análisis MS MALDI-TOF que revelaba una señal predominante en una relación de masa a carga observada de 3618,33 correspondiente al oligonucleótido hibridado, que tiene una relación teórica entre la masa y la carga de 3622,4.
La figura 11 representa una realización de un sustrato que tiene pocillos grabados que son adecuados para recibir un material para análisis.
La figura 12 representa un ejemplo de espectros obtenidos a partir de un instrumento espectrómetro de masas de tiempo de vuelo lineal y representativo de la composición del material de muestra en la superficie del sustrato representado en la fig. 11.
La figura 13 representa pesos moleculares determinados para el material de muestra que tiene los espectros identificados en la fig. 12.
La figura 14 es un esquema de una serie de ADN de 4 x 4 (16 posiciones) en la superficie de una oblea de silicio con las moléculas de oligonucleótido que contienen tiol denominadas "oligómero 1", [5'-CTGGATGCGTCGGATCATCT
TTTTT-(S)-3'; SEC ID Nº: 8], oligómero 2 [5'-(S)-CCTCTTGGGAACTGTGTAGTATT-3'; SEC ID Nº: 3] y "oligómero 3" (SEC ID Nº: 1; un derivado de tiol libre "TCUC" oligonucleótido del Ejemplo 1) unido covalentemente a 16 posiciones en la superficie de la oblea de silicio esencialmente como se describe en el ejemplo 2.
La figura 15 es un esquema de la hibridación de oligonucleótidos específicos a cada una de las 16 posiciones de la serie de hibridación de ADN de la figura 14 con el oligonucleótido complementario al oligómero 1 unido al oligómero 1, el oligonucleótido complementario al oligómero 2 (5'-ATGATCCGACGCATCAGAATGT-3'; SEC ID Nº: 9) unido al oligómero 2 y el oligonucleótido complementario al oligómero 3 (5'-CCGGGTACCGAGCTCGAATTC-3'; SEC ID Nº: 2) unido al oligómero 3.
La figura 16 es un espectro de masas MALDI-TOF representativo de una serie de ADN de 4 x 4 (16 posiciones) en una oblea de silicio mostrada esquemáticamente en la figura 15. El espectro revela una sola señal predominante de una relación entre masa y carga experimental en cada posición correspondiente a los oligonucleótidos hibridados específicos. El 2+ indica la posición de una molécula cargada doblemente usada como patrón de referencia durante el análisis de MS MALDI-TOF. El * indica cantidades residuales de oligonucleótido contaminante que permanecen en la superficie del chip después de los procedimientos de lavado. La posición relativa de la señal * revela el tamaño aproximado del oligonucleótido contaminante.
La figura 17 es un espectro de masas MALDI-TOF representativo de una serie de ADN de 8 x 8 (posición 64). El espectro revela una sola señal predominante y una relación entre masa y carga experimental que corresponde a los oligonucleótidos hibridados específicos previstos. El * indica cantidades residuales de oligonucleótido contaminante que permanecen en la superficie de la oblea después de procedimientos de lavado. La posición relativa de la señal * revela el tamaño aproximado del oligonucleótido contaminante.
La figura 18 es una ilustración de la extensión de nucleótidos de un cebador de ADN hibridado con un molde de ADN que contiene tiol inmovilizado en la superficie de una oblea de silicio derivatizada con SIAB. Un cebador oligonucleotídico de 12 nucleótidos complementario [SEC ID Nº: 12] se hibridó con un oligonucleótido que contenía tiol de 27 nucleótidos [SEC ID Nº: 11] inmovilizado en un soporte de silicio a través del agente de reticulación SIAB. La superficie de silicio que contenía el dúplex de ADN inmovilizado se incubó con ADN polimerasa en presencia de dATP, dCTP, dGTP y ddTTP en condiciones de extensión y se sometió a un análisis MS MALDI-TOF. El espectro de masas de la oblea de silicio reveló la presencia de dos señales predominantes; una de una relación entre masa y carga igual al oligonucleótido de 12 nucleótidos no extendido así como una señal correspondiente a una molécula de ADN de 15 nucleótidos que se ha extendido en la oblea por 3 nucleótidos en la primera posición en la secuencia en la que se incorporó un ddTTP.
La figura 19 representa un diseño experimental para ensayar el efecto de la distancia entre la superficie modificada con SIAB y el dúplex de ADN formado en reacciones de extensión de cebadores. Dos oligonucleótidos que contenían tiol de diferentes secuencias [SEC ID Nº: 8 y 11] se inmovilizaron en una superficie de silicio modificada con SIAB y se incubaron con oligonucleótidos específicos que formaban un dúplex de ADN con 0, 3, 6, 9 y 12 espaciadores de bases entre la superficie modificada con SIAB y el dúplex de ADN formado por el oligonucleótido hibridado en el ADN que contenía tiol inmovilizado. El extremo 3' libre del oligonucleótido hibridado se extendió usando ADN polimerasa Secuenasa o ADN polimerasa Termosecuenasa en presencia de los tres desoxinucleótidos trifosfato y los correspondientes didesoxinucleótidos trifosfato en condiciones de extensión y los productos de reacción resultantes se sometieron a análisis MS MALDI-TOF.
La figura 20 es un espectro de masas MALDI-TOF representativo de los productos de extensión específicos del experimento de extensión de cebadores ilustrado en la figura 19. Los espectros en la columna a mano izquierda son resultantes del análisis MS MALDI-TOF de las reacciones de extensión en las que se usó Secuenasa. Los espectros en la columna derecha son los resultantes del análisis de las reacciones de extensión en la que se usó Termosecuenasa. La ADN polimerasa Termosecuenasa pudo extender el extremo 3' del cebador de ADN hibridado donde la distancia entre el dúplex de ADN y la superficie de la oblea de silicio modificada variaba entre 1 y 12 nucleótidos. La ADN polimerasa Secuenasa también pudo extender el ADN hibridado donde la distancia entre el dúplex de ADN y la oblea de silicio estaba comprendida entre 3 y 9 nucleótidos.
Descripción detallada y realizaciones preferidas
La presente invención se refiere al campo del análisis por espectrometría de masas.
Definiciones
A menos que se indique otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que los que se entienden comúnmente por un especialista en la técnica a la que pertenece esta invención.
Como se usa en este documento, la expresión "ácido nucleico" se refiere a oligonucleótidos o polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN), así como análogos de ARN o ADN, por ejemplo, obtenidos a partir de análogos de nucleótidos, pudiendo estar cualquiera de ellos en forma monocatenaria o bicatenaria. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser sintéticas o pueden aislarse a partir de una muestra biológica particular usando cualquier número de procedimientos que son bien conocidos en la técnica, siendo el procedimiento particular elegido apropiado para la muestra biológica particular.
Como se usa en este documento, nucleótidos incluye los nucleósidos mono, di y trifosfatos. Los nucleótidos también incluyen los nucleótidos modificados tales como nucleótidos de fosforotioato y nucleótidos de azapurina. Una serie completa de nucleótidos de alargamiento de cadena se refiere a 4 nucleótidos diferentes que pueden hibridar con cada una de las cuatro bases diferentes que constituyen el molde de ADN.
Como se usa en este documento, síntesis de ácido nucleico se refiere a cualquier proceso por medio del cual se generan oligonucleótidos o polinucleótidos incluyendo, aunque no se limitan a, procesos que implican reacciones químicas o enzimáticas.
Como se usa en este documento, el término "serie" se refiere a una disposición ordenada de miembros o posiciones. La serie puede contener cualquier número de miembros o posiciones y puede estar en una diversidad de formas. En realizaciones preferidas, la serie es bidimensional y contiene n x m miembros, siendo n y m números enteros que pueden ser iguales o diferentes. En realizaciones particularmente preferidas, n y m son cada uno 4 o un múltiplo de 4.
La expresión "agente de reticulación" es reconocida en la técnica, y, como se usa en este documento se refiere a reactivos que pueden inmovilizar un ácido nucleico en un soporte insoluble, preferiblemente por medio de enlaces covalentes. De esta manera, los "agentes de reticulación" apropiados para uso en la presente invención incluyen una diversidad de agentes que son capaces de reaccionar con un grupo funcional presente en una superficie del soporte insoluble y con un grupo funcional presente en la molécula de ácido nucleico. Los reactivos capaces de presentar tal reactividad incluyen reactivos homo- y heterobifuncionales, de los que muchos son conocidos en la técnica. Se prefieren los reactivos heterobifuncionales.
Como se usa en este documento, la expresión "funcionalidad reactiva con tiol" se refiere a una funcionalidad que es capaz de reaccionar rápidamente con un resto tiol nucleófilo para producir un enlace covalente (por ejemplo, un enlace disulfuro o tioéter). En general, los grupos tiol son buenos nucleófilos y las funcionalidades reactivas con tiol preferidas son reactivos electrófilos. En la técnica se conocen diversas funcionalidades reactivas con tiol, e incluyen, por ejemplo, haloacetilos (preferiblemente yodoacetilo), diazocetonas, epoxicetonas, carbonilos \alpha, \beta insaturados (por ejemplo \alpha, \beta-enonas) y otros aceptores de Michael reactivos (incluyendo maleimida), haluros de ácido, haluros de bencilo y similares. En ciertas realizaciones, un grupo tiol libre de un disulfuro puede reaccionar con un grupo tiol libre (es decir, por medio de la formación de enlaces disulfuro, incluyendo intercambio de disulfuro). Un agente de reticulación "reactivo con tiol", como se usa en este documento, se refiere a un reactivo de reticulación (o superficie) que incluye, o puede modificarse para incluir, al menos una funcionalidad reactiva con tiol. Se entenderá que la reacción de un grupo tiol puede prevenirse temporalmente por bloqueo con un grupo protector apropiado, como es convencional en la técnica (véase, por ejemplo T.W. Greene y P.G.M. Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", 2ª ed. John Wiley & Sons, (1991)).
Como se usa en este documento, un enlazador escindible selectivamente es un enlazador que se escinde en condiciones seleccionadas, tal como un enlazador fotoescindible, un enlazador escindible químicamente y un enlazador escindible enzimáticamente (es decir, un sitio de endonucleasas de restricción o una digestión con ribonucleótido/RNasa). El enlazador se interpone entre el soporte y el ADN inmovilizado.
Como se usan en este documento, los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se usan indistintamente cuando hacen referencia a un ácido nucleico traducido (por ejemplo, un producto génico).
Como se usa en este documento, "muestra" hará referencia a una composición que contiene un material a detectar. En una realización preferida, la muestra es una "muestra biológica" (es decir, cualquier material obtenido a partir de una fuente viva (por ejemplo, humano, animal, planta, bacteria, hongos, protistas o virus). La muestra biológica puede estar en cualquier forma, incluyendo materiales sólidos (por ejemplo, tejidos, sedimentos celulares y biopsias) y en fluidos biológicos (por ejemplo, orina, sangre, saliva, fluido amniótico y enjuagues bucales (que contienen células bucales)). Preferiblemente, los materiales sólidos se mezclan con un fluido.
Como se usa en este documento, "sustrato" hará referencia a un soporte insoluble sobre el cual se deposita una muestra de acuerdo con los materiales como se describe en este documento. Los ejemplos de sustratos apropiados incluyen perlas (por ejemplo, gel de sílice, vidrio de porosidad controlada, imán, Sephadex®/Sepharose®, celulosa), capilares, soportes planos tales como filtros de fibra de vidrio, superficies de vidrio, superficies metálicas (acero, oro, plata, aluminio, cobre y silicio), materiales plásticos incluyendo placas o membranas de múltiples pocillos (por ejemplo, de polietileno, polipropileno, poliamida, difluoruro de polivinilideno), boquillas (por ejemplo series de boquillas adecuadas para síntesis o análisis combinatorios o perlas en picaduras de superficies planas tales como obleas (por ejemplo, obleas de silicio) con o sin placas.
En los métodos particulares para inmovilizar ácidos nucleicos en un sustrato proporcionados en esta invención, son sustratos preferidos los que pueden soportar la unión de ácidos nucleicos a altas densidades, preferiblemente de tal forma que los ácidos nucleicos unidos covalentemente estén presentes en el sustrato a una densidad de al menos aproximadamente 20 fmol/mm^{2}, más preferiblemente al menos aproximadamente 75 fmol/mm^{2}, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 85 fmol/mm^{2}, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 100 fmol/mm^{2} y más preferiblemente al menos aproximadamente 150 fmol/mm^{2}. Entre los sustratos más preferidos para uso en los métodos particulares de inmovilización de ácidos nucleicos en sustratos proporcionados en esta invención se encuentra el silicio, aunque otros sustratos menos preferidos incluyen materiales poliméricos tales como poliacrilamida. Los sustratos para usar en métodos para producir las series proporcionadas en este documento incluyen cualquiera de una amplia diversidad de materiales de soporte insolubles que incluyen, aunque no se limitan a, gel de sílice, vidrio de poros controlados, celulosa, filtros de fibra de vidrio, superficies de vidrio, superficies metálicas (acero, oro, plata, aluminio, silicio y cobre), materiales plásticos (por ejemplo, de polietileno, polipropileno, poliamida, difluoruro de polivinilideno) y silicio.
Inmovilización de ácidos nucleicos de alta densidad a soportes sólidos
Los métodos descritos en la presente invención proporcionan la inmovilización de alta densidad de moléculas de ácido nucleico en un soporte insoluble (por ejemplo sólido). En general, las moléculas de ácido nucleico se inmovilizan en el soporte insoluble directamente o por medio de agentes de reticulación.
En realizaciones de los métodos en las que no se emplea un agente de reticulación, un ácido nucleico modificado se hace reaccionar directamente con una superficie funcionalizada de forma apropiada para producir un ácido nucleico inmovilizado. De esta manera, por ejemplo, una superficie modificada con yodoacetilo (u otra funcionalidad superficial reactiva con tiol) puede reaccionar con un ácido nucleico modificado con tiol para proporcionar ácidos nucleicos inmovilizados.
De acuerdo con los métodos proporcionados en este documento, el agente de reticulación se selecciona para proporcionar una alta densidad de ácidos nucleicos inmovilizados en el soporte insoluble. Sin el deseo de limitarse por ninguna teoría, se cree que la alta densidad de ácidos nucleicos inmovilizados descritos en esta invención se debe, al menos en parte, a una reacción relativamente rápida que se produce entre el agente de reticulación y el ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico modificado con tiol) en comparación con otras reacciones usadas previamente para inmovilizar ácidos nucleicos. Además, la alta densidad puede deberse al menos en parte a una separación de los grupos reactivos (por ejemplo, grupos amino de otra funcionalidad reactiva) en el soporte insoluble funcionalizado. De esta manera, los reactivos para modificar la superficie generalmente se seleccionarán de forma que proporcionen funcionalidades poco separadas en el soporte funcionalizado. El agente de reticulación (y otros reactivos usados para funcionalizar la superficie de soporte o la molécula de ácido nucleico) pueden seleccionarse para proporcionar cualquier separación deseada de las moléculas de ácido nucleico inmovilizadas de la superficie de soporte, y para proporcionar cualquier separación deseada de los ácidos nucleicos inmovilizados entre si. De esta manera, el impedimento estérico de las moléculas de ácido nucleico puede reducirse o eliminarse por medio de la elección de un agente de reticulación apropiado. En ciertas realizaciones, el reactivo de reticulación puede seleccionarse para proporcionar múltiples funcionalidades reactivas como se usa en la síntesis de dendrímeros para la unión de múltiples ácidos nucleicos a un solo resto de reticulación. Preferiblemente, el agente de reticulación se selecciona para que sea muy reactivo con la molécula de ácido nucleico, para proporcionar una reacción rápida, completa y/o selectiva. En realizaciones preferidas, el volumen de reacción de los reactivos (por ejemplo, el grupo tiol y la funcionalidad reactiva con tiol) es pequeño.
Ácidos nucleicos y enlazadores
Los ácidos nucleicos preferidos para uso en la presente invención son "ácidos nucleicos modificados con tiol" es decir, ácidos nucleicos modificados para contener al menos un resto tiol activo. Como se describe con más detalle en el ejemplo 1, presentado más adelante, los ácidos nucleicos que contienen al menos un tiol reactivo preferiblemente se obtienen por tratamiento de un ácido nucleico que contiene un disulfuro 3' o 5' con un agente reductor, que preferiblemente no competirá en reacciones posteriores (es decir, no reaccionará con una funcionalidad yodoacetimido. Pueden sintetizarse ácidos nucleicos modificados con disulfuro de acuerdo con una diversidad de métodos. Por ejemplo, un ácido nucleico puede modificarse en el extremo 3' ó 5' por reacción con un reactivo modificador que contiene disulfuro. Como alternativa, un cebador tiolado puede unirse de forma enzimática o no enzimática al ácido nucleico. Una funcionalidad 5'-fosforamidato también puede proporcionar un punto de unión para un tiol o una citosina o desoxicitosina que contiene disulfuro. Los ejemplos de agentes reductores apropiados para la reducción de un ácido nucleico modificado con disulfuro incluyen: tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (preferible a una concentración en el intervalo de 1-100 mM (más preferiblemente aproximadamente 10 mM)) se hace reaccionar a un pH en el intervalo de 3-6 (más preferiblemente aproximadamente 4,5), a una temperatura en el intervalo de 20-45ºC (más preferiblemente aproximadamente 37ºC) durante un período de tiempo en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 horas (más preferiblemente durante aproximadamente 5 horas); ditiotreitol (preferiblemente una concentración en el intervalo de 25 a 100 mM (dependiendo de si el reactivo se aísla o no) se hace reaccionar a un pH en el intervalo de 6-10 (más preferiblemente aproximadamente 8) y a una temperatura en el intervalo de 25-45ºC (más preferiblemente aproximadamente 37ºC durante un tiempo enel intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 horas (más preferiblemente aproximadamente 5 horas). TCE proporciona una ventaja en el bajo pH en el que es reactivo. Este bajo pH protona eficazmente los tioles, suprimiendo de esta manera las reacciones nucleófilas de los tioles y produciendo menos reacciones secundarias que con otros agentes reductores de disulfuro que se emplean a un pH superior.
Como se describe adicionalmente en el ejemplo 1, presentado más adelante, un agente de reticulación bifuncional preferido es aminobenzoato de N-succinimidil(4-yodoacetilo) (SIAB). Otros agentes de reticulación incluyen, aunque no se limitan a, dimaleimida, ácido ditio-bis-nitrobenzoico (DTNB), tioacetato de N-succinimidil-S-acetilo (SATA), propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltiol) (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) y 6-hidracinonicotimida (HYNIC) también pueden usarse en el nuevo proceso. Como ejemplos adicionales de reactivos de reticulación véase, por ejemplo, Wong "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking", CRC Press (1991), y Hermanson, "Bioconjugate Techniques" Academic Press (1995).
En realizaciones preferidas, el ácido nucleico se inmoviliza usando el resto enlazador fotoescindible que se escinde durante la espectrometría de masas. En los ejemplos de agentes de reticulación fotoinestables incluyen, aunque no se limitan a, ácido 3-amino-(2-nitrofenil)propiónico (Brown et al. (1995) Molecular Diversity, pp. 4-12 y Rothschild et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 361-66).
En otra realización de los métodos para detectar alteraciones en una secuencia de ácido nucleico diana proporcionados en este documento y los métodos de inmovilización, un ácido nucleico monocatenario complementario al ácido nucleico diana se inmoviliza en una superficie a través de un enlazador que incluye un enlace de grupo tiol-funcionalidad reactiva con tiol y un resto enlazador escindible, preferiblemente escindible de forma selectiva.
Enlazadores
Un sitio de detección diana puede unirse directamente a un soporte sólido a través de un enlace reversible o irreversible entre una funcionalidad apropiada (L') en la molécula de ácido nucleico diana (T) y una funcionalidad apropiada (L) en la molécula de captura. Un enlace reversible puede ser tal que se escinda en las condiciones de espectrometría de masas (es decir, un enlace fotoescindible tal como un complejo de transferencia de carga o un enlace inestable que se forma entre radicales orgánicos relativamente estables).
Los enlazadores fotoescindibles son enlazadores que se escinden tras la exposición a la luz (véase, por ejemplo, Goldmacher et al. (1992) Bioconj. chem. 3:104-107), liberando de esta manera el agente dirigido tras la exposición a la luz. Se conocen enlazadores fotoescindibles que se escinden tras la exposición a la luz (véase por ejemplo, Hazum et al. (1981) en Pept. Proc. Eur. Pept. Symp., 16ª, Brunfeldt, K (Ed), pp. 105-110, que describe el uso de un grupo nitrobencilo como grupo protector fotoescindible para cisteína; Yen et al. (1989) Makromol. Chem 190: 69-82, que describe copolímeros fotoescindibles solubles en agua, incluyendo copolímero de hidroxipropilmetacrilamida, copolímero de glicina, copolímero de fluoresceína y copolímero de metilrodamina; Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107, que describe un agente de reticulación y un reactivo que experimenta degradación fotolítica tras la exposición a una luz casi UV (350 nm); y Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol 42: 231-237, que describe reactivos de reticulación de cloruro de nitrobenciloxicarbonilo que producen enlaces fotoescindibles), liberando de esta manera el agente de dirección tras la exposición a la luz. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico se inmoviliza usando el resto enlazador fotoescindible que se escinde durante la espectrometría de masas.
Además, el enlace puede formarse siendo L' un grupo amónio cuaternario, en cuyo caso, preferiblemente, la superficie del soporte sólido lleva cargas negativas que repelen el esqueleto de ácido nucleico cargado negativamente y de esta forma facilita la desorción requerida para el análisis por un espectrómetro de masas. La desorción puede realizarse por el calor creado por el pulso láser y/o dependiendo de L' por absorción específica de energía láser que está en resonancia con el cromóforo de L'.
De esta manera, la química L-L' puede ser de un tipo de enlace disulfuro (escindible químicamente, por ejemplo, por mercaptoetanol o ditioeritrol), un sistema de biotina/estreptavidina, un derivado heterobifuncional de un grupo tritil éter (véase, por ejemplo, Köster et al (1990) "A Versatile Acid-Labile Linker for Modification of Synthetic Biomolecules", Tetrahedron Letters 31: 7095) que puede escindirse en condiciones moderadamente ácidas así como en condiciones de espectrometría de masas, un grupo levulinilo escindible en condiciones casi neutras con un tampón hidracinio/acetato, un enlace arginina-arginina o lisina-lisina escindible por una enzima endopeptidasa tal como tripsina o un enlace pirofosfato escindible por una pirofosfatasa, o un enlace ribonucleotídico entre la secuencia de oligodesoxinucleótidos que puede escindirse, por ejemplo, por una ribonucleasa o álcali.
Las funcionalidades L y L' también pueden formar un complejo de transferencia de carga y de esta forma formar el enlace L-L' temporal. Como en muchos casos la "banda de transferencia de carga" puede determinarse por espectrometría UV/vis (véase, por ejemplo, Organic Charge Transfer Complexes por R. Foster, Academic Press, 1969), la energía láser puede cambiarse por la energía correspondiente de la longitud de onda de transferencia de carga, de esta manera, puede iniciarse una desorción específica del soporte sólido. Los especialistas en la técnica reconocerán que varias combinaciones pueden servir este propósito y que la funcionalidad de donador puede estar en el soporte sólido o acoplada con la molécula de ácido nucleico a detectar y viceversa.
En otra estrategia, puede generarse un enlace L-L' reversible por medio de la formación homolítica de radicales relativamente estables. Bajo la influencia del pulso láser, se producirá una desorción (como se ha descrito anteriormente) así como ionización en la posición del radical. Los especialistas en la técnica reconocerán que pueden seleccionarse otros radicales orgánicos y que, en relación con las energías de disociación necesarias para escindir homolíticamente el enlace entre ellos, puede seleccionarse una longitud de onda láser correspondiente (véase, por ejemplo, Reactive Molecules por C. Wentrup, John Wiley & Sons, 1984).
Cuando se realiza secuenciación con exonucleasa usando MS MALDI-TOF, una molécula de ADN monocatenaria inmovilizada a través de su extremo 5' en un soporte sólido se degrada unilateralmente con una exonucleasa de proceso 3' y el peso molecular del nucleótido degradado se determina secuencialmente. La secuenciación de Sanger inversa revela la secuencia de nucleótidos del ADN inmovilizado. Añadiendo un enlazador escindible selectivamente, no sólo puede determinarse la masa de los nucleótidos libres, si no también, tras la eliminación de los nucleótidos por lavado, puede detectarse la masa del fragmento restante por MALDI-TOF tras la escisión del ADN del soporte sólido. Usando enlazadores escindibles selectivamente, tales como los enlazadores escindibles químicamente y fotoescindibles proporcionados en este documento, puede seleccionarse que esta escisión se produzca durante las etapas de ionización y volatilización de MALDI-TOF. Esta misma base lógica se aplica para una cadena inmovilizada 5' de un ADN bicatenario que se degrada mientras está en un dúplex. De forma similar, esto también se aplica cuando se usa una exonucleasa de proceso 5' y el ADN se inmoviliza a través del extremo 3' en el soporte sólido.
Como se ha indicado, en este documento se contemplan al menos tres versiones de inmovilización: 1) el ácido nucleico diana se amplifica o se obtiene (la secuencia diana o la secuencia de ADN circundante debe conocerse para obtener cebadores para amplificar o aislar); 2) el ácido nucleico cebador se inmoviliza en el soporte sólido y el ácido nucleico se hibrida con el mismo (esto es para detectar la presencia o secuenciar una secuencia diana en una muestra); o 3) un ADN bicatenario (amplificado o aislado) se inmoviliza a través del enlace con una cadena predeterminada, el ADN se desnaturaliza para eliminar el dúplex y después se añade una alta concentración de un cebador o ADN complementario con identidad cadena arriba del sitio diana y se produce un desplazamiento de cadena y el cebador se hibrida con la cadena inmovilizada.
En las realizaciones en las que el ácido nucleico del cebador se inmoviliza en el soporte sólido y el ácido nucleico diana se hibrida con el mismo, la inclusión del enlazador escindible permite que el ADN del cebador se inmovilice en el extremo 5' de forma que el 3'-OH esté disponible para la síntesis de ácido nucleico (extensión) y la secuencia del ADN diana "hibridado" pueda determinarse porque el molde hibridado puede retirarse por desnaturalización y los productos de ADN extendidos escindirse del soporte sólido por MS MALDI-TOF. De forma similar para 3), la cadena de ADN inmovilizada puede alargarse cuando se hibrida con el molde y escindirse del soporte. De esta manera, pueden realizarse secuenciación de Sanger y extensión de oligobases de cebador (PROBE), como se analiza más adelante, usando un cebador inmovilizado de una secuencia de ADN cadena arriba conocida complementaria a una región invariable de una secuencia diana. SE obtiene el ácido nucleico de la persona y la secuencia de ADN de una región variable (deleción, inserción, mutación sin sentido que produce predisposición genética o enfermedades, o la presencia de ADN viral/bacteriano o fúngico) no sólo se detecta, si no que también se determina la secuencia real y la posición de la mutación.
En otros caso, el ADN diana debe inmovilizarse y el cebador debe hibridarse. Esto requiere la amplificación de un ADN mayor basándose en la secuencia conocida y después la secuenciación de los fragmentos inmovilizados (es decir, los fragmentos extendidos se hibridan pero no se inmovilizan en el soporte como se ha descrito anteriormente). En estos casos, no es deseable incluir un enlazador porque el espectro de MALDI-TOF es el del ADN hibridado; no es necesario escindir el molde inmovilizado.
En este documento se puede utilizar cualquier enlazador conocido por los especialistas en la técnica para inmovilizar ácidos nucleicos a soportes sólidos para enlazar el ácido nucleico a un soporte sólido. Los enlazadores preferidos en este documento son los enlazadores selectivamente escindibles, particularmente aquellos que se ejemplifican en este documento. Otros enlazadores incluyen, enlazadores escindibles de ácido, tales como los enlazadores bismaleimidoetoxi propano, y de tritilo inestables en ácido.
También se pueden usar enlazadores escindibles de ácido, enlazadores fotoescindibles y enlazadores termosensibles, particularmente cuando sea necesario escindir el agente diana para permitir que sea más fácilmente accesible a la reacción. Los enlazadores escindibles de ácido incluyen, aunque no se limitan a, bismaleimidoetoxi propano; y enlazadores de dihidrazida de ácido adípico (véase, por ejemplo, Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584-589) y conjugados de transferrina inestables en ácido que contienen una parte suficiente de transferrina para permitir la entrada a la ruta cíclica intracelular de transferrina (véase, por ejemplo, Welhöner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 4309-4314).
Enlazadores fotoescindibles
Se proporcionan enlazadores fotoescindibles. En particular, se proporcionan enlazadores fotoescindibles como sus derivados de fosforamidita para usar en la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos. Los enlazadores contienen restos o-nitrobencilo y enlazadores fosfato que permiten la escisión fotolítica total de los conjugados en pocos minutos tras la radiación con luz ultravioleta. Las longitudes de onda ultravioletas usadas se seleccionan de manera que la radicación no dañe a los oligonucleótidos y son preferiblemente de aproximadamente 350-380 nm, más preferiblemente 365 nm. Los enlazadores fotoescindibles proporcionados en este documento poseen una eficacia de acoplamiento comparable con la de los monómeros de fosforamidita utilizados habitualmente (véase, Sinha et al. (1983) Tetrahedron Lett. 24: 5843-5846; Sinha et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 4539-4557; Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49: 6123-6194; y Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191).
En una realización, los enlazadores fotoescindibles tienen la fórmula I:
1
en la que R^{20} es \omega-(4,4'-dimetoxitritiloxi)alquilo o \omega-hidroxialquilo; R^{21} se selecciona entre hidrógeno, alquilo, arilo, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo y carboxi; R^{22} es hidrógeno o (dialquilamino)(\omega-cianoalcoxi)P-; t es 0-3; y R^{50} es alquilo, alcoxi, arilo o ariloxi.
En una realización preferida, los enlazadores fotoescindibles tienen la fórmula II:
2
en la que R^{20} es \omega-(4,4'-dimetoxitritiloxi)alquilo o \omega-hidroxialquilo o alquilo; R^{21} se selecciona entre hidrógeno, alquilo, arilo, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo y carboxi; R^{22} es hidrógeno o (dialquilamino)(\omega-cianoalcoxi)P-; t es 0-3; y X^{20} es hidrógeno, alquilo u OR^{20}.
En realizaciones particularmente preferidas, R^{20} es 3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)propilo, 3-hidroxipropilo o metilo; R^{21} se selecciona entre hidrógeno, metilo y carboxi; R^{22} es hidrógeno o (diisopropilamino) (2-cianoetoxi)P-; y X^{20} es hidrógeno, metilo o OR^{20}. En una realización más preferida, R^{20} es 3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)propilo, R^{21} es metilo; R^{22} es (diisopropilamino)(2-cianoetoxi)P-; y X^{20} es hidrógeno. En otra realización más preferida, R^{20} es metilo; R^{21} es metilo; R^{22} es (diisopropilamino)(2-cianoetoxi)P-; y X^{20} es 3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)propoxi.
En otra realización, los enlazadores fotoescindibles tienen la fórmula III:
3
en la que R^{23} es hidrógeno o (dialquilamino)(\omega-cianoalcoxi)P-; y R^{24} se selecciona entre \omega-hidroxialcoxi, \omega-(4,4'-dimetoxitritiloxi)alcoxi, \omega-hidroxialquilo y \omega-(4,4'-dimetoxitritiloxi)alquilo y está sustituido o no sustituido en la cadena de alquilo o alcoxi con uno o más grupos alquilo; cada r y s es, independientemente, 0-4; y R^{50} es alquilo, alcoxi, arilo o ariloxi. En ciertas realizaciones, R^{24} es \omega-hidroxialquilo o \omega-hidroxialquilo o \omega-(4,4'-dimetoxitritiloxi)alquilo, y está sustituido en la cadena de alquilo con un grupo metilo.
En las realizaciones preferidas, R^{23} es hidrógeno o (diisopropilamino) (2-cianoetoxi)P-; y R^{24} se selecciona entre 3-hidroxipropoxi, 3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)propoxi, 4-hidroxibutilo, 3-hidroxi-1-propilo, 1-hidroxi-2-propilo, 3-hidroxi-2-metil-1-propilo, 2-hidroxietilo, hidroximetilo, 4-(4,4'-dimetoxitritiloxi)butilo, 3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)-1-propilo, 2-(4,4'-dimetoxitritiloxi)etilo, 1-(4,4'-dimetoxitritiloxi)-2-propilo, 3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)-2-metil-1-propilo y 4,4'-dimetioxitritiloximetilo.
En las realizaciones más preferidas R^{23} es (diisopropilamino) (2-cianoetoxi)P-; r y s son 0; y R^{24} se selecciona entre 3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)propoxi, 4-hidroxibutilo, 3-hidroxi-1-propilo, 1-hidroxi-2-propilo, 3-hidroxi-2-metil-1-propilo, 2-hidroxietilo, hidroximetilo, 4-(4,4'-dimetoxitritiloxi)butilo, 3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)-1-propilo, 2-(4,4'-dimetoxitritiloxi)etilo, 1-(4,4'-dimetoxitritiloxi)-2-propilo, 3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)-2-metil-1-propilo y 4,4'-dimetioxitritiloximetilo. R^{24} es más preferiblemente 3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)propoxi.
Preparación de enlazadores fotoescindibles A. Preparación de enlazadores fotoescindibles de fórmulas I o II
Los enlazadores fotoescindibles de fórmulas I o II se pueden preparar por los métodos descritos a continuación, modificando los métodos en pequeña extensión eligiendo los materiales de partida apropiados o mediante otros métodos conocidos por los especialistas en la técnica.
En los enlazadores fotoescindibles de fórmula II en los que X^{20} es hidrógeno, los enlazadores se pueden preparar de la siguiente manera. Alquilación de 5-hidroxi-2-nitrobenzaldehído con un haluro de \omega-hidroxialquilo, por ejemplo, bromuro de 3-hidroxipropilo, seguido de detección del alcohol resultante por ejemplo, un silil éter, proporciona un 5-(\omega-sililoxialcoxi)-2-nitrobenzaldehído. La adición de un compuesto organometálico al aldehído da un alcohol bencílico. Los compuestos organometálicos que se pueden usar incluyen trialquilaluminios (para enlazadores en los que R^{21} es alquilo), tales como trimetilaluminio, borohidruros (para enlazadores en los que R^{21} es hidrógeno), tales como borohidruro sódico, o cianuros metálicos (para enlazadores en los que R^{21} es carboxi o alcoxi carbonilo), tales como cianuro potásico. En el caso de cianuros metálicos, el producto de la reacción, una cianohidrina, se hidrolizaría entonces en condiciones ácidas o básicas en presencia de agua o de un alcohol para dar los compuestos de interés.
El grupo sililo de la cadena lateral de los alcoholes bencílicos resultantes se puede intercambiar entonces por un grupo 4.4'-dimetoxitritilo por desililación con, por ejemplo, fluoruro de tetrabutilamonio, para dar el alcohol correspondiente, seguido de reacción con cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo. La reacción con por ejemplo 2-cianoetildiisopropilclorofosforamidita da los enlazadores en los que R^{22} es (dialquilamino)(\omega-cianoalcoxi)P-.
En el siguiente esquema se muestra un ejemplo específico de una síntesis de un enlazador fotoescindible de fórmula II, que también demuestra el uso del enlazador en la síntesis de oligonucleótidos. Este esquema sólo pretende ser ilustrativo y no limitar el alcance de la invención. Se proporcionan los detalles experimentales de estas transformaciones sintéticas en los ejemplos.
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La síntesis de los enlazadores de fórmula II en los que X^{20} es OR^{20}, la 3,4-dihidroxiacetofenona se protege selectivamente en el hidroxilo en posición 4 por reacción con, por ejemplo, carbonato potásico y un cloruro de sililo. Se pueden usar ésteres de benzoato, propiofenonas, butirofenonas, etc, en lugar de la acetofenona. La 4-sililoxi-3-hidroxiacetofenona resultante se alquila después con un haluro de alquilo (para enlazadores en los que R^{20} es alquilo) en el hidroxilo en posición 3 y se desilila con, por ejemplo, fluoruro de tetrabutilamonio para dar 3-alcoxi-4-hidroxiacetofenona. Este compuesto se alquila después en el hidroxilo en posición 4 por reacción con un haluro de \omega-hidroxialquilo, por ejemplo, bromuro de 3-hidroxipropilo, para dar una 4-(\omega-hidroxialcoxi)-3-alcoxiacetofenona. El alcohol de la cadena lateral se protege entonces como éster, por ejemplo, un acetato. Este compuesto se nitra después en la posición 5 con, por ejemplo, ácido nítrico concentrado para proporcionar las 2-nitroacetofenonas correspondientes. La saponificación del éster de la cadena lateral con por ejemplo, carbonato potásico, y reducción de la cetona con, por ejemplo, borohidruro sódico, en cualquier orden, da un alcohol 2-nitro-4-(\omega-hidroxialcoxi)-5-alcoxibencílico.
La protección selectiva del alcohol de la cadena lateral como el éter 4,4'-dimetoxitritilo correspondiente se realiza después por reacción con cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo. La reacción adicional con por ejemplo, 2-cianoetildiisopropilclorofosforamidita da los enlazadores en los que R^{22} es (dialquilamino)(\omega-cianoalcoxi)P-.
En el siguiente esquema se muestra un ejemplo específico de una síntesis de un enlazador fotoescindible de fórmula II. Este esquema se pretende que sólo sea ilustrativo y que no limite de ninguna manera el alcance de la invención. Los procedimientos experimentales detallados para las transformaciones mostradas se encuentran en los ejemplos.
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B. Preparación de enlazadores fotoescindibles de fórmula II
Los enlazadores fotoescindibles de fórmulas III se pueden preparar por los métodos descritos a continuación, modificando los métodos en pequeña extensión eligiendo los materiales de partida apropiados o mediante otros métodos conocidos por los especialistas en la técnica.
En general, los enlazadores fotoescindibles de fórmula III se preparan a partir de compuestos \omega-hidroxialquilo- o alcoxiarilo, en particular \omega-hidroxialquilo o alcoxi-bencenos. Estos compuestos están disponibles en el mercado o se pueden preparar a partir de un haluro de \omega-hidroxialquilo (por ejemplo, bromuro de 3-hidroxipropilo) y cualquier fenillitio (para los \omega-hidroxialquilbencenos) o fenol (para los \omega-hidroxialcoxibencenos). La acilación del grupo \omega-hidroxilo (por ejemplo en forma de un éster de acetato) seguido deacilación de Friedel-Crafts para el anillo aromático con cloruro de 2-nitrobenzoílo proporciona una 4-(\omega-acetoxi-alquilo o alcoxi)-2-nitrobenzofenona. La reducción de la cetona con, por ejemplo, borohidruro sódico y la saponificación del éster de la cadena lateral se realizan en cualquier orden para dar un 2-nitrofenil-4-(hidroxi-alquil o alcoxi)fenilmetanol. La protección del grupo hidroxilo terminal como el éter de 4,4'-dimetoxitritilo correspondiente se consigue por reacción con cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo. El grupo hidroxilo bencílico se hace reaccionar entonces con, por ejemplo, 2-cianoetildiisopropilclorofosforamidita para dar los enlazadores de fórmula II en los que R^{23} es (dialquilamino)(\omega-cianoalcoxi)P-. Otros enlazadores fotoescindibles de fórmula III se pueden preparar sustituyendo 2-fenil-1-propanol o 2-fenilmetil-1-propanol por el \omega-hidroxi-alquilo o alcoxi-bencenos en la síntesis anterior. Estos compuestos están disponibles en el mercado, aunque se pueden preparar también por reacción de por ejemplo, bromuro de fenilmagnesio o bromuro de bencilmagnesio, con el oxirano necesario (es decir, óxido de propileno) en presencia de ión cuproso catalítico.
Enlazadores químicamente escindibles
Se puede utilizar una gran variedad de enlazadores químicamente escindibles para introducir un enlace escindible entre el ácido nucleico inmovilizado y el soporte sólido. Los enlazadores inestables al ácido son actualmente enlazadores químicamente escindibles preferidos para espectrometría de masas, especialmente MS MALDI-TOF, debido a que el enlace inestable al ácido se escinde durante el acondicionamiento del ácido nucleico tras la adición de la solución matricial 3-HPA. El enlace inestable al ácido se puede introducir como un grupo enlazador diferente, por ejemplo, los grupos tritilo inestables al ácido o se puede incorporar en un enlazador de ácido nucleico sintético introduciendo uno o más puentes internucleósido de sililo usando diisopropilsililo, formándose así análogos oligonucleotídicos con uniones de diisopropilsililo. El enlace diisopropilsililo sustituye al enlace fosfodiéster en la estructura del ADN y en condiciones moderadamente ácidas tales como 1,5% de ácido trifluoroacético (TFA) o 3-HPA/1% TFA solución matricial MALDI-TOF, da como resultado la introducción de uno o más roturas intracatenarias en la molécula de ADN. Los métodos para preparar los precursores y análogos de oligonucleótidos con enlaces de diisopropilsililo son conocidos por los especialistas en la técnica (véase por ejemplo, Saha et al (1993) J. Org. chem. 58: 7827-7831). Estos análogos de oligonucleótido se pueden preparar fácilmente usando métodos de síntesis de oligonucleótidos en estado sólido usando desoxirribonucleósidos derivatizados con diisopropilsililo.
Modificación de la masa de ácidos nucleicos
En ciertas realizaciones, se pueden usar ácidos nucleicos modificados en posiciones distintas del extremo 3'- o 5'-. La modificación del resto azúcar de un nucleótido en posiciones distintas de la posición 3' y 5' es posible mediante métodos convencionales. También se pueden modificar las bases del ácido nucleico, por ejemplo modificando C-5 de dT con un brazo enlazador, por ejemplo como el descrito en F. Eckstein, ed., "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach", IRL Press (1991). Dicho brazo enlazador se puede modificar para incluir un resto tiol. Como alternativa, se pueden usar ácidos nucleicos con estructuras modificadas (por ejemplo, fosforamidato de ADN) de manera que el grupo tiol se puede unir al centro de nitrógeno proporcionado por la estructura de fosfato modificada.
En las realizaciones preferidas, la modificación de un ácido nucleico, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, no afecta sustancialmente a la capacidad del ácido nucleico o de la secuencia nucleica para que se hibride con su complemento. Por lo tanto, cualquier modificación debería evitar preferiblemente la modificación sustancial de las funcionalidades del ácido nucleico que son responsables del apareamiento de bases de Watson y Crick. El ácido nucleico se puede modificar de manera que haya presente un grupo tiol no terminal, y el ácido nucleico, cuando se inmoviliza en el soporte, puede aparear las bases autocomplementariamente para formar una estructura "horquilla" que tiene una región dúplex.
Soportes sólidos y sustratos
Los ejemplos de soportes insolubles y sustratos para usar en ese documento incluyen, aunque no se limitan a, perlas, (gel de sílice, vidrio de porosidad controlada, perlas magnéticas, perlas Sephadex/Sepharose, perlas de celulosa, etc.), capilares, soportes planos tales como filtros de fibra de vidrio, superficies vítreas, superficies metálicas (acero, oro, plata, aluminio, silicio y cobre), materiales plásticos incluyendo placas o membranas de múltiples pocillos (por ejemplo de polietileno, polipropileno, poliamida, difluoruro de polivinilideno), obleas, colectores, boquillas (por ejemplo, series de boquillas adecuados para la síntesis o análisis combinatorios) o perlas en picaduras de superficies planas tales como obleas (por ejemplo obleas de silicio) con o sin placas de filtro.
Espectrometría de masas
Una vez inmovilizados, los ácidos nucleicos se pueden analizar mediante diversos medios incluyendo, por ejemplo, técnicas espectrométricas tales como UV/VIS, IR, fluorescencia, quimioluminiscencia o espectroscopía RMN, espectrometría de masas u otros métodos conocidos en la técnica o combinaciones de los mismos. Los formatos de espectrómetro de masas preferidos incluyen técnicas de ionización (I) tales como desorción mediante láser asistida por matriz (MALDI), electropulverización continua o por pulsos (ESI) y métodos relacionados (por ejemplo, pulverización de iones o termopulverización) o impacto masivo de aglomerados (MCI); estas fuentes de iones se pueden ajustar con formatos de detección incluyendo tiempo de vuelo lineal o de tipo reflectrón, cuádruplo sencillo o múltiple, sector magnético sencillo o múltiple, transresonancia ciclotrónica de iones por transformada de Fourier (FTICR), atrapamiento de iones y combinaciones de los mismos para dar un detector híbrido (por ejemplo, atrapamiento de iones-tiempo de vuelo). Para la ionización, se pueden utilizar numerosas combinaciones de matriz/longitud de onda (MALDI) o combinaciones de disolvente (ESI).
Preparación de series de ADN
En este documento se proporcionan métodos y sistemas para preparar series de material de muestra para análisis mediante una herramienta de diagnóstico. Por ejemplo, la figura 1 ilustra un sistema para preparar series de material de muestra para análisis mediante una herramienta de diagnóstico. La figura 1 describe un sistema 10 que incluye un procesador de datos 12, un controlador de movimiento 14, un ensamblaje de brazo robótico 16, un elemento de monitor 18A, una unidad central de procesamiento 18B, una placa de microtitulación de material fuente 20, un alojamiento de la plataforma 22, un brazo robótico 24, una plataforma 26, un controlador de presión 28, un conducto 30, un ensamblaje de montaje 32, un ensamblaje de boquillas 38 y elementos sustrato 34. En la vista mostrada en la figura 1, también se ilustra que el ensamblaje robótico 16 puede incluir un elemento de montaje móvil 40 y una ranura que se desliza horizontalmente 42. El brazo robótico 24 puede pivotar opcionalmente alrededor de la boquilla 36 para aumentar el intervalo del movimiento del brazo 24 de manera que el brazo 24 puede colocar el ensamblaje de boquillas 38 por encima de la placa fuente 20.
El procesador de datos 12 descrito en la figura 1 puede ser un sistema procesador de datos digitales convencional tal como un sistema de ordenador compatible IBM PC que es adecuado para procesar los datos y para ejecutar instrucciones de programa que proporcionarán información para controlar el movimiento y la operación del ensamblaje robótico 16. Será evidente para un especialista en la técnica que la unidad de procesador de datos 12 puede ser cualquier tipo se sistema adecuado para procesar un programa de señales de instrucciones que operarán el ensamblaje robótico que está integrado en el alojamiento robótico 16. Opcionalmente el procesador de datos 12 puede ser un ensamblaje microcontrolado que está integrado en el alojamiento robótico 16. En otras realizaciones alternativas, el sistema 10 no necesita ser programado y puede ser un ordenador sencillo que tiene una memoria física para almacenar instrucciones para operar el ensamblaje robótico 16.
En la realización descrita en la figura 1, hay un controlador 14 que se acopla electrónicamente entre el procesador de datos 12 y el ensamblaje robótico 16. El controlador descrito 14 es un controlador de movimiento que conduce los elementos motores del ensamblaje robótico 16 para colocar el brazo robótico 24 en una posición seleccionada. Adicionalmente, el controlador 14 puede proporcionar instrucciones al ensamblaje robótico 16 para dirigir el controlador de presión 28 para controlar el volumen de fluido inyectado desde los elementos de boquilla individuales del ensamblaje de boquillas descrito 38. El diseño y construcción del controlador de movimiento descrito 14 sigue principios bien conocidos en la técnica de la ingeniería eléctrica, y se pueden llevar a la práctica cualquier elemento controlador adecuado para conducir el ensamblaje robótico 16 sin alejarse del alcance del mismo.
El ensamblaje robótico 16 descrito en la figura 1 se acopla electrónicamente al controlador 14. El ensamblaje robótico descrito 16 es un sistema articulado que incluye un tablero XY para mover el brazo robótico en el plano XY y además incluye un accionador en el eje X para mover el brazo robótico ortogonalmente con respecto al plano XY. El ensamblaje robótico 16 descrito en la figura 1 incluye un brazo 24 que monta sobre la plataforma XY que mueve el brazo en el plano definido por los ejes X e Y. En la realización descrita, el tablero XY se monta sobre el accionador Z para mover toda el tablero a lo largo del eje Z ortoganal al plano XY. En este sentido, el ensamblaje robótico proporciona tres grados de libertad que permite al ensamblaje de boquillas 38 disponerse en cualquier posición sobre los sustratos 34 y la placa fuente 20 que en la figura 1 se muestran situados en la plataforma 26 montada sobre el ensamblaje robótico 16.
El ensamblaje robótico descrito 16 sigue los principios bien conocidos en la técnica de la ingeniería eléctrica y es sólo un ejemplo de un ensamblaje robótico adecuado para mover un ensamblaje de boquillas a posiciones adyacentes al sustrato y a la placa fuente tal como se el sustrato 34 descrito.
En consecuencia, será aparente para un especialista en la técnica que se pueden realizar sistemas robóticos alternativos siguiendo las descripciones de este documento sin alejarse del alcance del mismo.
La figura 1 describe una realización de un ensamblaje robótico 16 que incluye un controlador de presión 28 que conecta mediante un conducto 30 al montaje 32 que conecta con el ensamblaje de boquillas 38. En esta realización el montaje 32 tiene un canal interior para acoplamiento fluido del conducto 30 con el ensamblaje de boquillas 38. En consecuencia, el controlador de presión 28 se acopla por fluidez con el conducto 30 y el montaje 32 al ensamblaje de horquillas 38. En este sentido el controlador 14 puede enviar señales al controlador de presión 28 para controlar selectivamente una presión de fluido suministrada al ensamblaje de boquillas 38.
La figura 2 describe una realización de un ensamblaje de boquillas 50 adecuado para realizar el sistema descrito en la figura 1 que incluye el controlador de presión 28. En la realización descrita, el ensamblaje de boquillas 50 incluye un alojamiento formado por una parte superior 52 y una parte inferior 54 que se unen mediante los tornillos 56A y 56B para definir un volumen de la cámara interior 58. La figura 2 describe además que para cerrar herméticamente a los fluidos el volumen de la cámara interior 52 el alojamiento puede incluir un elemento hermético descrito en la figura 2 como una junta de anillo en O 60 que se sitúa entre el bloque superior y el bloque inferior 54 que rodea completamente el perímetro del volumen de la cámara interior 58. La figura 2 describe además que el ensamblaje de boquillas 50 incluye una pluralidad de vesícula 62A-62D, cada una de las cuales incluye una perforación axial que se extiende en toda su longitud para formar las cámaras de retención descritas 64A-64D. Cada una de las vesículas descritas se extiende a través de la abertura respectiva 68A-68D dispuesta en el bloque inferior 54 del alojamiento.
Como también se muestra en la realización descrita, cada una de las vesículas 62A-62D tiene una parte de reborde superior que se sitúa contra un elemento hermético 70A-70B para formar un cierre hermético estricto para fluido entre la vesícula y el bloque inferior 54 para evitar que el fluido pase a través de las aberturas 68A-68D. Para mantener el cierre hermético estricto, el ensamblaje de boquillas descrito 50 incluye además una serie de elementos de desviación 74A-74D descrito en la figura 2 como muelles que en las realizaciones descritas, están en estado comprimido para forzar al elemento de reborde de las vesículas 62A-62D contra sus elementos herméticos respectivos 70A-70D. Como se muestra en la figura 2, los elementos de desviación 74A-74D se extienden entre las vesículas y el bloque superior 52. Cada uno de los muelles 74A-74D se puede montar de manera fija a un soporte elástico 76A-76D mediante el que los elementos de muelle se pueden unir al bloque superior 52. El bloque superior 52 incluye además una abertura 78 descrita en la figura 2 como una abertura dispuesta centralmente que incluye una perforación roscada para recibir una pieza de estampación 80 que se puede montar de manera rotatoria en la abertura 78.
Como también se describe en la figura 2, la pieza de estampación 80 está unida mediante un conducto a la válvula 82 que puede conectar la pieza de estampación 80 a un conducto 84 que se puede acoplar a una fuente de presión o como alternativa se puede acoplar la pieza de estampación 80 a un conducto 86 que proporciona el venteo de la cámara interior 58. Una perforación central 88 se extiende por todo la pieza de estampación 80 y se acopla al elemento de tubo que conecta además a la válvula 82 para acoplarse fluida y selectivamente al volumen de la cámara interior 58 a una fuente de presión o a una salida de venteo.
El ensamblaje de boquillas 50 descrito anteriormente y representado en la figura 2 dispuesto por encima de un elemento sustrato 90 que incluye una pluralidad de pocillos 92 que se atacan químicamente en la superficie superior del sustrato 90. Como se ilustra en la figura 2, el paso de las vesículas 62A-62D es tal que cada vesícula está espaciada de las vesículas adyacentes mediante una distancia que es un múltiplo entero de la distancia de paso entre los pocillos 92 con ataque químico en la superficie superior del sustrato 90. Como se observará de la siguiente descripción, este espaciado facilita la distribución en paralelo del fluido de manera que el fluido se puede distribuir en una pluralidad de pocillos en una sola operación. Cada una de las vesículas se puede preparar con acero inoxidable, sílice, material polimérico o cualquier otro material adecuado para retener una muestra fluida. En un ejemplo, se utilizan 16 vesículas en el ensamblaje, que se preparan de cobre endurecido con berilio, revestimiento de oro sobre placa de níquel. Tienen 43,2 mm de longitud y el eje de la vesícula se gradúa a 0,46 mm del diámetro externo con una punta cóncava. Se elige una boquilla como esta porque la precisión de la puntería puede ser de aproximadamente 501 micrómetros. Sin embargo, se hará evidente que se puede utilizar cualquier tipo de boquilla adecuada para el dispositivo, incluyendo, aunque no se limita a geometrías planas, con forma de estrella, cóncava, punta sólida, punta semihueca, ángulo en uno o ambos lados u otras geometrías diferentes.
La figura 3 muestra desde una perspectiva lateral el bloque inferior 54 del ensamblaje de boquillas 50 descrito en la figura 2. La figura 3 muestra las dimensiones aproximadas de un ensamblaje de horquillas. Como se muestra, el bloque inferior 54 tiene una placa base 98 y un saliente que lo rodea 100. La placa base 98 es de aproximadamente 3 mm de espesor y el saliente 100 es de aproximadamente 5 mm de espesor.
La figura 4 muestra desde una perspectiva aérea la estructura general y dimensiones de un bloque inferior 54 adecuado para usar con el ensamblaje de boquillas 50 mostrado en la figura 2. Como se muestra en la figura 4, el bloque inferior 54 incluye una matriz 4 x 4 de aberturas 68 para proporcionar 16 aberturas cada una de ellas adecuada para recibir una vesícula. Como se describe anteriormente con referencia a la figura 2, el espaciado entre la abertura 68 es típicamente un múltiplo entero de la distancia entre los pocillos en una superficie del sustrato así como los pocillos de una placa fuente. En consecuencia, un ensamblaje de boquillas que tiene el bloque inferior 54 descrito en la figura 4 puede distribuir fluido hasta en 16 pocillos simultáneamente. La figura 4 también muestra las dimensiones generales de un bloque inferior 54 de manera que cada lado del bloque 54 es generalmente de una longitud de 22 mm y el espaciado entre la abertura 68 es de aproximadamente 4,5 mm. Dicho espaciado es adecuado para usar con un sustrato en el que el fluido se tiene que distribuir en posiciones a aproximadamente 500 \mum de distancia, como se ejemplifica por el sustrato 90 de la figura 2. La figura 4 también muestra que el bloque inferior 54 puede incluir una ranura de anillo en O opcional 94 adaptada para recibir un elemento hermético de anillo en O tal como el elemento hermético 60 descrito en la figura 2. Se entiende que dicho elemento de ranura 94 puede potenciar y mejorar el cierre hermético del fluido formado por el elemento hermético 60.
El bloque de boquillas se puede fabricar de acero inoxidable pues este material se puede taladrar con precisión a aproximadamente +25 \mum, aunque también se pueden usar diversos materiales de sonda, tales como laminado G10, PMMA u otros materiales adecuados. El bloque de boquillas puede contener cualquier número de aberturas y se muestra con 16 receptáculos que mantienen a las 16 boquillas en su sitio. Para aumentar la precisión de puntería de cada boquilla, se puede poner un lugar de alineación opcional por debajo del bloque de manera que aproximadamente 6 mm de la punta de la boquilla se dejan expuestos para permitirles introducirse en los pocillos de una placa de microtitulación. La implantación de las sondas en la herramienta descrita se diseña para coordinarla con una placa de microtitulación de 384 pocillos, de manera que el espaciado de centro a centro de las sondas es 4,5 mm. Se eligió una serie de 4 x 4 sondas ya que produciría una serie que se ajustaría en menos de una pulgada cuadrada, que es el intervalo de desplazamiento de una plataforma XY de MS MALDI-TOF utilizado por el cesionario. El ensamblaje de herramienta de boquilla se termina con una cubierta de acero inoxidable sobre el lado superior del dispositivo que después se une al brazo Z del robot.
Con referencia a la figura 5, el ensamblaje robótico 16 utiliza un ensamblaje de herramienta de boquilla 38 que se configura de manera similar al ensamblaje de herramienta de boquilla 50 descrito en la figura 2. El controlador de presión 28 controla selectivamente la presión en la cámara 58. Con esta realización, un programa de control opera sobre el procesador de datos 12 para controlar el ensamblaje robótico 16 de una manera tal que el ensamblaje 16 imprima una serie de elementos sobre los sustratos 34.
En una primera etapa, figura 5A, el programa puede dirigir el ensamblaje robótico 16 para mover el ensamblaje de boquillas 38 a que se disponga sobre la placa fuente 20. El ensambles robótico 16 entonces hundirá el ensamblaje de boquillas en la placa fuente 20 que puede ser una placa fuente de ADN de 384 pocillos. Como se muestra en la figura 4, el ensamblaje de boquillas puede incluir 16 boquillas diferentes tal que el ensamblaje de boquillas 50 hundirá 16 boquillas en 16 pocillos diferentes de la placa fuente 20 de ADN de 384 pocillos. A continuación el procesador de datos 12 dirigirá el controlador de movimiento 14 para operar el ensamblaje robótico 16 para mover el ensamblaje de boquillas a una posición por encima de la superficie del sustrato 34. El sustrato 34 puede ser cualquier sustrato adecuado para recibir una muestra de material y puede estar formado de silicio, plástico, metal o cualquier otro material adecuado. Opcionalmente el sustrato tendrá una superficie plana aunque como alternativa puede incluir una superficie con picaduras, una superficie con ataque químico con pocillos o cualquier otra tipografía de superficie. El programa que opera los datos del procesador 12 puede dirigir entonces el ensamblaje robótico, mediante el controlador de movimiento 14, para dirigir el controlador de presión 28 para generar una presión negativa en el volumen de la cámara interior 58. En esta realización práctica, la presión interior positiva forzará al fluido de las cámaras de retención de vesículas 62 para inyectar el fluido desde las vesículas y hacia el pocillo respectivo 92 del sustrato
90.
El programa que opera los datos del procesador 12 puede dirigir también el controlador 14 para controlar al controlador de presión 28 para controlar el llenado de las cámaras de retención con material de fuente de la placa fuente 20. El controlador de presión 28 puede generar una presión negativa en el volumen de la cámara interior 58 del ensamblaje de boquillas. Esto provocará que el fluido suba hacía las cámaras de retención de las vesículas 62A-62D. El controlador de presión 28 puede regular la presión mediante un control de bucle abierto o de bucle cerrado para evitar que haya un exceso de fluido en las cámaras de retención y que se derrame en el volumen de la cámara interior 58. Los sistemas de control por bucle para controlar la presión se conocen bien en la técnica y se puede utilizar cualquier controlador adecuado. Dicho derramamiento puede provocar contaminación cruzada, particularmente si el material fuente extraído de la placa fuente 20 varía de un pocillo a otro.
En una realización práctica alternativa de la invención, cada una de las cámaras de retención 64A-64D es suficientemente pequeña para permitir que las cámaras se llenen por acción capilar. En dicha realización, el ensamblaje de boquillas puede consistir en una serie de agujas estrechas perforadas, tales como agujas de acero inoxidable que se extienden a lo largo de aberturas en el bloque inferior 54. Las agujas que se hunden en las soluciones fuentes se llenarán por acción capilar. En una realización, la longitud de capilaridad que se tiene que llenar a presión atmosférica se determina aproximadamente mediante:
H = \frac{2\gamma}{PGR}
en la que H es la altura, gamma es la tensión superficial, P es la densidad de la solución, G es la fuerza gravitacional y R es el radio de la aguja. Por lo tanto, el volumen de fluido que puede retener cada vesícula se puede controlar seleccionando las dimensiones de la perforación interior. Se entiende que a temperatura ambiente el agua llenará una longitud de 15 cm de un capilar con un radio de 100 \mum. Por lo tanto, una pequeña aguja perforada con volumen de nanolitros se llenará completamente, aunque no debería sobrepasarse la capacidad porque la fuerza capilar se entiende que es demasiado pequeña para formar un menisco en la parte superior del orificio de la aguja. Esto evita la contaminación cruzada debido al derramamiento. En una realización, las vesículas del ensamblaje de boquillas se pueden proveer con cámaras interiores de diferentes tamaños para retener y distribuir diferentes volúmenes de fluido.
En una realización alternativa, para disminuir el volumen de líquido que se extrae en las cámaras de retención de las vesículas, se puede proporcionar una pequeña presión positiva en el volumen de la cámara interior 58 mediante el controlador de presión 28. La fuerza hacia abajo creada por la presión positiva se puede usar para contrarrestar la fuerza capilar que va hacia arriba. En este sentido, se puede controlar el volumen de fluido que se extrae mediante fuerza capilar en las cámaras de retención de las vesículas.
La figura 5B muestra que el fluido en el interior de las cámaras de retención de la aguja se puede distribuir mediante una pequeña presión positiva introducida mediante la perforación central 88 que se extiende por toda la pieza de estampación 80. Regulando el pulso de presión que se introduce en el volumen de la cámara interior 58, el fluido se puede inyectar en forma de pulverizador o mediante formación de gotas en la punta de la aguja. Se entiende que la velocidad de distribución, de gotas frente a pulverizador, depende en parte de la presión aplicada por el controlador de presión 28. En una realización práctica, la presión se aplica en el intervalo entre 10 x 133,32 m^{-1} \cdot kg \cdot s^{-2} y 1.000 x 133,32 m^{-1} \cdot kg \cdot s^{-2} (10 y 1,000 Torr de presión atmosférica).
Para entonces el procesador de datos 12 puede ejecutar un programa de ordenador que controla y regula el volumen de fluido distribuido. El programa puede dirigir el controlador 28 para inyectar un volumen definido de fluido generando un pulverizador o formando una gota que se asienta en el extremo de la vesícula, y que puede entrar en contacto con la superficie de un sustrato para distribuir el fluido allí.
Las figuras 5C y 5D muestran que las primeras etapas mostradas en las figuras 5A-5B se pueden realizar de nuevo, esta vez en una posición sobre la superficie del sustrato que está desviada con respecto a la posición anterior. En el proceso descrito, la herramienta de boquilla está desplazada por una distancia igual a la distancia entre dos pocillos 92. Se hará evidente que se pueden utilizar otras técnicas de impresión con desplazamientos sin alejarse del alcance de la invención.
Se entenderá que se consiguen grandes ventajas del ensamblaje de boquillas descrito en la figura 2. Por ejemplo, el enjuagado entre sucesos de distribución es directo, sólo necesita sucesos simples o múltiples de llenado y vaciado de las boquillas con una solución de enjuagado. Además, como todas las cámaras de retención se llenan hasta su capacidad total, la precisión de los volúmenes distribuidos varía sólo de acuerdo con las dimensiones internas de la aguja que se pueden controlar cuidadosamente durante la producción de la boquilla. Además el dispositivo tiene un coste eficaz, atribuyéndose el mayor gasto a las agujas, sin embargo como no se necesita contacto con la superficie, las agujas están muy poco expuestas a deformación física o estrés, lo que hace raro la sustitución y les proporciona una larga vida.
Como alternativa, la deposición del material de muestra sobre la superficie del sustrato puede incluir técnicas que utilizan ensamblajes de herramienta de boquilla que tienen elementos boquilla sólidos que se extienden en un bloque en el que un ensamblaje robótico hunde los elementos boquilla sólidos del ensamblaje de boquillas en una superficie de material de muestra para humedecer los extremos distales de las boquillas con los materiales de muestra. Posteriormente el ensamblaje robótico puede mover el ensamblaje de boquillas hasta una posición por encima del sustrato y después hacer descender el ensamblaje de boquillas contra la superficie del sustrato para poner en contacto las boquillas húmedas individuales contra la superficie para marcar el material de la superficie del sustrato.
Las figuras 6A y 6B describen otro sistema alternativo para distribuir material sobre o a la superficie del sustrato. En particular, la figura 6A describe un dispositivo de impresión por inyección 110 que incluye un elemento capilar 112, un elemento transductor 114 y un orificio (que no se muestra) 118, un conducto de fluido 122 y un montaje 124 que se conecta con un ensamblaje de brazo robótico tal como el brazo robótico 24 descrito en la figura 1. Como también se muestra en la figura 6A, el ensamblaje de inyección 110 es adecuado para inyectar desde el orificio 118 una serie de gotas 120 de un material de muestra para distribuir un material de muestra sobre la superficie 128.
El capilar 112 del ensamblaje de inyección 110 puede ser un capilar de vidrio, un capilar plástico o cualquier otro alojamiento adecuado que pueda llevar una muestra de fluido y que permita que la muestra de fluido se inyecte por acción de un elemento transductor, tal como el elemento transductor 114. El elemento transductor 114 descrito en la figura 6A es un elemento transductor piezoeléctrico que se forma alrededor del parámetro del capilar 112 que puede transformar un pulso eléctrico recibido del generador de pulso en el interior del ensamblaje robótico 16 para provocar que el fluido se inyecte desde el orificio 118 del capilar 112. Un ensamblaje de inyección como este que tiene un elemento transductor piezoeléctrico se fabrica en MicroFab Tecnhnology, Inc., of Germany. Se puede usar cualquier ensamblaje de inyección, sin embargo, que sea adecuado para distribuir volúmenes definidos y controlados del fluido incluyendo aquellos que usan transductores piezoeléctrico, transductores eléctricos, transductores electrorestrictivos, transductores magnetorestrictivos, transductores electromecánicos o cualquier otro elemento transductor adecuado. En la realización descrita el capilar 112 tiene un conducto de fluido 122 para recibir el material fluido. En una realización opcional, el fluido se puede extraer hacia el capilar mediante la acción de una presión de vacío que extraerá el fluido a través del orificio 118 cuando el orificio 118 se sumerja en una fuente de material fluido. Otras realizaciones del ensamblaje de inyección 110 se pueden realizar con la invención sin alejarse del alcance de la misma.
La figura 6B ilustra otro ensamblaje alternativo adecuado para llevar a cabo sobre el brazo robótico de un ensamblaje robótico tal como el ensamblaje 16 descrito en la figura 1. La figura 6B ilustra cuatro ensamblajes de inyección conectados conjuntamente, 130A-130D. De manera similar al ensamblaje de boquillas de la figura 2, el ensamblaje de inyección descrito en la figura 6B se puede utilizar para la distribución en paralelo del material fluido. Será obvio para un especialista en la técnica de la ingeniería eléctrica que cada uno de los ensamblajes de inyección 130A-130D puede operar independientemente de los otros, para permitir la distribución selectiva de fluido entre ensamblajes de inyección seleccionados. Además, cada uno de los ensamblajes de inyección 130A-130D se puede controlar independientemente para seleccionar el volumen de fluido que se distribuye desde cada uno respectivamente de los ensamblajes 130A-130D. Se pueden realizar otras modificaciones y alteraciones a los ensamblajes descritos en la figura 6B sin alejarse del alcance de la invención.
También se proporcionan métodos para analizar rápidamente los materiales de muestra. Para esto las series de muestras se pueden formar sobre una superficie de sustrato de acuerdo con cualquiera de las técnicas analizadas anteriormente. Las series de muestras se analizan entonces por espectrometría de masas para recoger datos del espectro que sean representativos de la composición de las muestras de la serie. Se entiende que los métodos anteriores proporcionan procesos que permiten la distribución rápida de volúmenes definidos y controlados de material de analito. En particular, estos procesos permiten distribuir volúmenes de fluido de nanolitros e inferiores. Estas técnicas de posición de volúmenes pequeños general conjuntos de muestras adecuados para el análisis por espectrometría de masas. Por ejemplo, los volúmenes pequeños dan una buena reproducibilidad de las características de las manchas, tales como velocidades de evaporación y dependencia reducida de las condiciones atmosféricas tales como la presión atmosférica y la luz.
Continuando con el ejemplo mostrado en la figura 5, las series se pueden preparar cargando oligonucleótidos (0,1-50 ng/III) de diferentes secuencias o concentraciones en los pocillos de una placa fuente 20 de microtitulación de 96 pocillos; el primer pocillo se puede reservar para mantener la solución matricial. Un sustrato 34 tal como un sustrato de tipo chip de silicio con picaduras, se puede situar en la plataforma 26 del ensamblaje robótico 16 y se puede alinear manualmente para orientar la matriz de pocillos alrededor de una serie de ejes de referencia. El programa de control ejecutado en el procesador de datos 12 puede recibir las coordenadas del primer pocillo de la placa fuente 20. El brazo robótico 12 puede hundir el ensamblaje de boquillas 38 en la placa fuente 20 de manera que cada una de las 16 boquillas se sumerja en uno de los pocillos. Cada vesícula se puede llenar por acción capilar de manera que todo el volumen de la cámara de retención contiene fluido. Opcionalmente, el programa que se ejecuta en el procesador de datos 12 puede dirigir el controlador de presión para llenar la cámara interior 58 de un ensamblaje de boquillas 38 con una presión de desviación positiva que contrarrestará en parte la fuerza de la acción capilar para limitar o reducir el volumen de fluido que se extrae hacia la cámara de retención.
Opcionalmente, el ensamblaje de boquillas 38 se puede hundir en los mismos 16 pocillos de la placa fuente 20 y marcar sobre un segundo sustrato diana. Este ciclo se puede repetir sobre los sustratos diana que se deseen. A continuación el brazo robótico 12 puede hundir el ensamblaje de boquillas 38 en una solución de lavado y después hundir el ensamblaje de boquillas en 16 pocillos diferentes de la placa fuente 20, y marcar sobre el sustrato diana desplazado una distancia del conjunto inicial de 16 marcas. De nuevo se puede repetir esto sobre los sustratos diana deseados. Se puede repetir todo el ciclo para preparar una serie 2 x 2 de cada vesícula para producir una serie de 8 x 8 marcas (2 x 2 elementos/vesícula x 16 vesículas = 64 elementos totales marcados). Sin embargo, se hará evidente para un especialista en la técnica que el proceso adecuado para formar las series se puede llevar a la práctica con la presente invención sin alejarse del alcance de la misma.
Se pueden cargar oligonucleótidos de diferentes secuencias o concentraciones en los pocillos de hasta tres placas fuente de microtitulación de 384 pocillos diferentes; se puede reservar un conjunto de 16 pocillos para la solución matricial. Los pocillos de dos placas se llenan con solución de lavado. Se pueden cargar cinco placas de microtitulación sobre la plataforma del ensamblaje robótico 16. Se puede poner una pluralidad de sustratos diana en contacto con un conjunto opcional de boquillas montadas en paralelo o alineadas dispuestas sobre la plataforma 26 y proporcionadas para alinear los sustratos a lo largo de una serie de ejes de referencia. Si la matriz y el oligonucleótido no están premezclados, el ensamblaje de boquillas se puede utilizar para marcar en primer lugar la solución matricial sobre todos los sustratos diana deseados. En una etapa posterior, la solución de oligonucleótidos se puede marcar con el mismo patrón que el material matricial para redisolver la matriz. Como alternativa, se puede preparar una serie de muestras colocando la solución de oligonucleótido en la primera oblea, seguido de la solución matricial, o por una premezcla de las soluciones de la matriz de los oligonucleótidos.
Después de depositar las series de muestra sobre la superficie del sustrato, las series se pueden analizar usando cualquier variedad de medios (por ejemplo, técnicas espectrométricas, tales como UV/VIS, IR, fluorescencia, quimioluminiscencia, espectrometría RMN o espectrometría de masas. Por ejemplo, posterior a cualquier proceso de distribución, los sustratos cargados de muestras se pueden situar en una placa fuente MALDI-TOF y mantenerlos allí con una serie de soportes de policarbonato montados con tornillos biselados. En una realización práctica, la placa se puede transferir sobre el extremo de una sonda para mantener una resolución de 1 \mum, un desplazamiento de 1'' en la plataforma xy (Newport) en la zona fuente de un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo. Será evidente para un especialista en la técnica que se puede utilizar cualquier herramienta de espectrometría de masas adecuada con la presente invención sin alejarse del alcance de la misma.
Los formatos de espectrómetro de masas preferidos para usar con las series descritas en este documento incluyen técnicas de ionización (I) incluyendo, aunque no se limitan a, desorción de láser asistida por matriz (MALDI), electropulverización continua por pulsos (ESI) y métodos relacionados (por ejemplo, pulverización de iones o termopulverización), o impacto masivo de aglomerados (MCI); estas fuentes de iones se pueden ajustar con formatos de detección incluyendo tiempo de vuelo de tipo reflectrón lineal o no lineal (TOF), cuádruplo sencillo o múltiple, sector magnético sencillo o múltiple, resonancia ciclotrónica de iones por transformada de Fourier (FTICR), atrapamiento de iones y combinaciones de los mismos, por ejemplo, atrapamiento de iones-tiempo de vuelo. Para la ionización, se pueden utilizar numerosas combinaciones de matriz/longitud de onda (MALDI) o combinaciones de disolvente (ESI). Se han detectado niveles subatómicos de proteína usando por ejemplo ESI (Valaskovic, G.A. et al., (1996) Science 273: 1199-1202) o espectrometría de masas MALDI (Li, L. et al., (1996) J. Am. Chem Soc 118: 1662-1663).
Por lo tanto, se entenderá que en los procesos descritos en este documento se puede utilizar pulverización de alta presión sin contacto completo o formación de gotas a baja presión con contacto parcial. En el último caso, el único contacto tendrá lugar entre la gota y las paredes del pocillo o la superficie plana hidrófila del sustrato 34. En ninguna realización práctica se necesita que haya contacto entre la punta de la aguja y la superficie.
Realizaciones preferidas
En una realización preferida, se pueden inmovilizar covalentemente una molécula de ácido nucleico en un soporte de sílice funcionalizando el soporte con una funcionalidad amino (por ejemplo por derivatización de un soporte con un reactivo tal como 3-aminopropil-trietoxisilano (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl). Se pueden usar otros oxisilanos u ortosilicatos funcionalizados, y están disponibles en el mercado (por ejemplo en Gelest, Inc., Tullytown, PA). Por ejemplo, se puede usar 3-mercaptopropiltrietoxisilano para funcionalizar una superficie de silicio con grupos tiol. La sílice funcionalizada con amino se puede hacer reaccionar después con un reactivo heterobifuncional tal como N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato (SIAB) (Pierce, Rockford, IL). Otros reactivos homo-y heterobifuncionales que se pueden utilizar están disponibles en el mercado, por ejemplo en Pierce. Finalmente, un ácido nucleico funcionalizado con un grupo tiol (por ejemplo en el extremo 5' terminal) se unió covalentemente al soporte de sílice derivatizada por reacción de la funcionalidad tiol de la molécula de ácido nucleico con la funcionalidad yodoacetilo del soporte.
En ciertas realizaciones, el ácido nucleico se puede hacer reaccionar con el agente de reticulación para formar un conjugado reticulante/ácido nucleico, que se hace reaccionar después con un soporte funcionalizado para proporcionar un ácido nucleico inmovilizado. Como alternativa, el reticulante se puede combinar con el ácido nucleico y se proporciona un soporte sólido funcionalizado en un recipiente que permite la reacción prácticamente simultánea del agente de reticulación con el ácido nucleico y el soporte sólido. En esta realización, generalmente será necesario usar un reticulante heterobifuncional, es decir, un reticulante con dos funcionalidades diferentes que pueden reaccionar selectivamente con cada uno del ácido nucleico y el soporte sólido funcionalizado.
Los métodos proporcionados en este documento son útiles para producir series espacialmente dirigibles de ácidos nucleicos inmovilizados sobre soportes insolubles. Por ejemplo, los métodos se pueden usar para proporcionar conjuntos de diferentes ácidos nucleicos inmovilizados en boquillas dispuestas en una serie. En otra realización, se puede escindir selectivamente un grupo protector fotoescindible del soporte insoluble (por ejemplo, fotolitografía) para proporcionar partes de una superficie activada para inmovilizar un ácido nucleico. Por ejemplo, una superficie de silicio modificada con tratamiento con 3-mercaptopropil-trietoxisilano para proporcionar grupos silano, se puede bloquear con un grupo protector fotoescindible (para ejemplos de grupos protectores fotoescindibles, véase por ejemplo la publicación PCT WO 92/10092, o McCray et al.. (1989) Ann. Rev. Biophys. Chem. 18: 239-270), y se puede desbloquear selectivamente por radiación de las áreas seleccionadas de la superficie, por ejemplo usando una máscara de fotolitografía. Un ácido nucleico modificado para contener un grupo reactivo con tiol se puede unir entonces directamente al soporte, o como alternativa, se puede hacer reaccionar un reactivo de reticulación reactivo con tiol con el soporte modificado con tiol, seguido de (o prácticamente simultáneamente con) la reacción con un ácido nucleico para proporcionar ácidos nucleicos inmovilizados. Una base o secuencia de ácido nucleico, una vez inmovilizada en un soporte de acuerdo con los métodos descritos en este documento, se pueden modificar adicionalmente de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico se puede alargar realizando síntesis de ácido nucleico en fase sólida de acuerdo con técnicas convencionales, incluyendo técnicas combinatorias.
Se describen soportes insolubles que comprenden ácidos nucleicos. Preferiblemente los ácidos nucleicos se unen covalentemente a una superficie del soporte insoluble mediante al menos un átomo de azufre, es decir, los ácidos nucleicos se unen covalentemente a la superficie mediante un resto enlazador que incluye al menos un átomo de azufre. Dichos ácidos nucleicos enlazados covalentemente se producen fácilmente por los métodos descritos en este documento. Los soportes insolubles se pueden usar en diversas aplicaciones incluyendo aquellas que implican hibridación y secuenciación.
En realizaciones preferidas, los ácidos nucleicos unidos covalentemente están presentes en la superficie del soporte insoluble con una densidad de al menos aproximadamente 20 fmol/mm^{2}, más preferiblemente al menos 75 fmol/mm^{2}, aún más preferiblemente al menos aproximadamente... fmol/mm^{2}, incluso aún más preferiblemente al menos aproximadamente 100 fmol/mm^{2} y más preferiblemente al menos aproximadamente 150 fmol/mm^{2}.
En otro aspecto, se proporcionan bibliotecas combinatorias de ácidos nucleicos inmovilizados, unidos covalentemente a un soporte sólido según se ha descrito.
Aún en otro aspecto, se describe un kit para ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. En una realización, el kit comprende una cantidad apropiada de: i) un agente reticulante reactivo con tiol; y ii) un reactivo modificador de la superficie para modificar una superficie con una funcionalidad (preferiblemente distinta de tiol) que puede reaccionar con el agente reticulante reactivo con tiol. El kit puede incluir opcionalmente un soporte insoluble, por ejemplo una superficie sólida, por ejemplo microperlas magnéticas para usar en ácidos nucleicos inmovilizados. El kit puede incluir también un reactivo para modificar un ácido nucleico con una funcionalidad tiol.
En otra realización, el kit comprende un reactivo para modificar la superficie de un soporte con un resto tiol, y un reactivo reticulante con tiol que puede reaccionar con un resto tiol de un soporte. En ciertas realizaciones, el kit incluye también un soporte insoluble, por ejemplo una superficie sólida por ejemplo microperlas magnéticas para usar en ácidos nucleicos inmovilizados.
Los kits descritos en este documento pueden incluir opcionalmente también tampones apropiados; los envases para contener los reactivos; y/o instrucciones de uso.
Aún en otra realización, los soportes insolubles unidos covalentemente con los ácidos nucleicos, por ejemplo la superficie total o los formatos de series que se pueden dirigir espacialmente o predirigibles, se pueden usar en diversas aplicaciones químicas de ácido nucleico en fase sólida incluyendo que no se limita a síntesis de ácido nucleico (química y enzimáticamente), hibridación y/o extensión y en métodos de diagnóstico basados en la detección de ácido nucleico y en análisis de polimorfismo (véase, por ejemplo la patente de Estados Unidos Nº 5.605.798). En consecuencia, se proporcionan en este documento métodos de hacer reaccionar moléculas de ácido nucleico en los que las moléculas de ácido nucleico se movilizan sobre una superficie haciendo reaccionar un derivado que contiene tiol de la molécula de ácido nucleico con un soporte insoluble que contiene un grupo reactivo con tiol o haciendo reaccionar un soporte insoluble que contiene tiol con un derivado que contiene un grupo reactivo con tiol de la molécula de ácido nucleico y después haciendo reaccionar adicionalmente las moléculas de ácido nucleico inmovilizadas.
En una realización particular, el ácido nucleico inmovilizado se hace reaccionar además por hibridación con un ácido nucleico que es complementario con el ácido nucleico inmovilizado o con una parte del mismo. En otra realización, el ácido nucleico inmovilizado se hace reaccionar adicionalmente por extensión de un ácido nucleico que está hibridado con el ácido nucleico inmovilizado o con una parte del mismo. Se pueden usar reacciones de extensión como estas por ejemplo en métodos de secuenciación de moléculas de ADN que están inmovilizadas en un soporte insoluble usando los procesos descritos en este documento. Por lo tanto, en este documento también se describen métodos para determinar la secuencia de una molécula de ADN en un sustrato en el que se inmoviliza un derivado que contiene tiol de una molécula de ADN en la superficie de un soporte insoluble que contiene grupos reactivos con tiol y se hibrida con un ácido nucleico monocatenario complementario a la parte de ADN inmovilizado antes de realizar la síntesis de ADN en presencia de uno o más didesoxinucleótidos.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que se limitan al campo del análisis por espectrometría de masas.
Ejemplo 1 Unión de alta densidad de ADN a obleas de silicio Materiales y métodos
Todos los reactivos, a menos que se indique otra cosa, se obtuvieron de Aldrich Chemical, Milwaukee, WI.
Preparación de la superficie de silicio
Se lavaron obleas de silicio con etanol, se flamearon sobre un mechero bunsen y se sumergieron en una solución anhídra de 3-aminopropiltrietoxisilano al 25% (en volumen) en tolueno durante 3 horas. Después se retiró la solución de silano y las obleas se lavaron tres veces con tolueno y tres veces con dimetilsulfóxido (DMSO). Después las obleas se incubaron en una solución anhídra 10 mM de N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato (SIAB) (Pierce Chemical, Rockford, IL) en DMSO anhídro. Después de la reacción, se retiró la solución de SIAB y las obleas se lavaron tres veces con DMSO.
Como era imposible controlar la condensación de SIAB y del grupo amino mientras en el soporte sólido de la oblea, la reacción se realizó en disolución para determinar el tiempo de reacción óptimo. Se utilizó cromatografía en capa fina (TLC) (placas de sílice reforzadas con vidrio con un indicador fluorescente a 254 nm) (Baker, Phillispsburg, NF) usando cloroformo: metanol 95:5 (Baker, Phillipsburg, NJ) que permitió la separación de los dos materiales de partida. Fue posible visualizar el material de partida SIAB con luz ultravioleta de longitud de onda larga (302 nm); el 3-aminopropiltrietoxisilano no era activo con luz ultravioleta, por lo tanto, la placa se pulverizó con una solución de ninhidrina que reacciona con aminas primarias para revelar una mancha púrpura tras calentar. Se ejecutó una reacción a microescala en cloroformo/DMSO usando un ligero exceso molar de SIAB en comparación con 3-aminopropiltrietoxisilano y se controló con las condiciones de TLC mencionadas anteriormente.
Modificaciones oligonucleotídicas
La reducción del disulfuro de los oligodesoxinucleótidos que contienen 3'- o 5'-disulfuro (Operon Technologies, Alameda, CA o Oligo etc., Wilsonville, OR) se controlóusando FPLC (Pharmacia, Piscataway, NJ); puede observarse una modificación en el tiempo de retención del oligodesoxinucleótido tras la escisión del disulfuro. Se investigaron diversos métodos de reducción para determinar las condiciones óptimas. En un caso, el oligodesoxinucleótido que contiene disulfuro (31,5 nmol, 0,5 mM) se incubó con ditiotreitol (DTT) (Pierce Chemical, Rockford, IL) (6,2 mmol, 100 mM) a pH 8,0 y 37ºC. Con la reacción de escisión prácticamente completa, el oligodesoxinucleótido que contiene tiol libre se aisló usando una columna Chromaspin-10 (Clontech, Palo Alto, CA) pues el DTT puede competir en la reacción posterior. Como alternativa, se ha usado tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (Pierce Chemical, Rockford, IL) para escindir el disulfuro. El oligodesoxinucleótido que contiene disulfuro (7,2 nmol, 0,36 mM) se incubó con TCEP en un tampón a pH 4,5 a 37ºC. No es necesario aislar el producto después de la reacción pues TCEP no reacciona competitivamente con la funcionalidad yodoacetamido. Se usaron concentraciones variables de TCEP para la reacción de escisión para determinar las condiciones óptimas para la reacción de conjugación.
Acoplamiento de la sonda
A cada oblea que se le había derivatizado para contener la funcionalidad yodoacetamido como se ha descrito anteriormente, se le añadió solución acuosa 10 mM del oligodesoxinucleótido libre que contiene tiol en tampón fosfato 100 mM, pH 8; se dejó que la reacción continuara durante un mínimo de cinco horas a temperatura ambiente con una humedad relativa del 100%. Tras la reacción, se retiró la solución de oligodesoxinucleótido y las obleas se lavaron dos veces en tampón 5 X SSC (citrato sódico 75 mM, cloruro sódico 750 mM, pH 7) con formamida al 50% (USB, Cleveland, OH) a 65ºC durante 1 hora cada uno.
Determinación radioquímica de la densidad de la sonda
Para determinar la cantidad de ADN unido covalentemente a la superficie o la cantidad de una secuencia complementaria hibridada, se utilizaron sondas radiomarcadas. En los casos en los que se tenía que inmovilizar un oligodesoxinucleótido que contenía un 5'-disulfuro, el extremo 3' se radiomarcó usando una enzima transferasa terminal y didesoxinucleósido trifosfato radiomarcado; en una reacción convencional, se incubaron 15 pmol (0,6 \muM) del oligodesoxinucleótido que contiene 5'-disulfuro con 50 \muCi (16,5 pmol, 0,66 \muM) de [\alpha-^{32}P] didesoxiadenosina-5' trifosfato (ddATP) (Amersham, Arlington Height, IL) en presencia de 2-mercaptoetanol 0,2 mM. Tras la adición de 40 unidades de enzima desoxinucleotidiltransferasa terminal (USB, Cleveland, OH), la reacción se permitió que continuara durante una hora a 37ºC. Después de este tiempo, la reacción se detuvo por inmersión del vial en un baño de agua a 75ºC durante diez minutos, y el producto se aisló usando una columna Chromaspin-10 (Clontech, Palo Alto, CA). De manera similar, se radiomarcó un oligodesoxinucleótido que contenía 5'-disulfuro con ^{35}S.
En los casos en los que se tenía que inmovilizar un oligodesoxinucleótido que contiene 3'-disulfuro, el extremo 5' se radiomarcó usando polinucleótido quinasa de T4 y un nucleósido trifosfato radiomarcado. Por ejemplo, se incubaron 15 pmol (0,6 \muM) de el oligodesoxinucleótido que contiene 3'-disulfuro con 50 \muCi (16,5 pmol, 0,66 \muM) de [\lambda^{32}P] adenosina-5' trifosfato (ATP) (Amersham, Arlington Height, IL) en presencia de Tris-HCL 50 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 10 mM, 2-mercaptoetanol 10 mM. Tras la adición de 40 unidades de polinucleótido quinasa de T4, la reacción se permitió que continuara durante una hora a 37ºC. La reacción se detuvo por inmersión del vial en un baño de agua a 75ºC durante diez minutos; después se aisló el producto usando una columna Chromaspin-10 (Clontech, Palo 
\hbox{Alto,
CA).}
Para determinar la densidad de la sonda inmovilizada covalentemente, se añadió el oligodesoxinucleótido que contiene disulfuro elegido a una cantidad traza de la misma especie que se había radiomarcado como se ha descrito anteriormente. El disulfuro se escindió, la sonda se inmovilizó en obleas funcionalizadas con yodoacetamido, las obleas se lavaron y después se expusieron a un análisis con Phosphorimager (sistema de detección y cuantificación de radiactividad) (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Para cada uno de los diferentes oligodesoxinucleótidos utilizados, se prepararon manchas de referencia sobre poliestireno en el que se conocía la cantidad molar de oligodesoxinucleótido; estas manchas de referencia se expusieron también al Phosphorimager. Tras explorar la pantalla, se determinó la cantidad (en moles) de oligodesoxinucleótido unido a cada chip comparando los conteos de actividades específicas de las referencias.
Hibridación y eficacia
A una oblea que se había funcionalizado con una sonda inmovilizada se le añadió una solución de una secuencia complementaria (10 \muM) en NaCl 1 M y tampón TE. La oblea y la solución se calentaron a 75ºC y se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de este tiempo, la solución se retiró y la oblea se lavó dos veces con tampón TE.
Para terminar la cantidad de oligonucleótido hibridado la inmovilización de la sonda se realizó en primer lugar como se ha descrito anteriormente excepto que la sonda se marcó con ^{35}S en lugar de ^{32}P. La densidad de la sonda inmovilizada se determinó con el Phosphorimager. A continuación, se incubó la misma oblea en tampón TE, NaCl 1 M, y su cadena complementaria (10 \muM) que se había radiomarcado con ^{32}P. La hibridación se realizó como se ha descrito anteriormente. Después de un lavado para retirar las uniones no específicas, la oblea y la referencia se expusieron a un análisis con Phosphorimager con una pieza de hoja de cobre entre la pantalla y la oblea. La hoja de cobre sirve para bloquear la señal de ^{35}S, mientras que deja pasar libremente la señal de ^{32}P. Después se determinó la cantidad molar de oligonucleótido hibridado, revelándose así el porcentaje de sonda inmovilizada covalentemente que está disponible para la hibridación.
Análisis espectrométrico de masas MALDI-TOF
Como se ha descrito anteriormente, las obleas que contenían oligodesoxinucleótido inmovilizado no radiomarcado (nombre: TCUC; secuencia GAATTCGAGCTCGGTACCCGG; peso molecular; 6455Da; SEC ID Nº: 1) se sintetizaron y se hibridó una secuencia complementaria (nombre: MJM6; secuencia: CCGGGTACCGAGCTCGAATTC; peso molecular 6415 Da; SEC ID Nº: 2). La obleas se lavaron en tampón de citrato amónico 50 mM para intercambio catiónico para retirar los iones sodio y potasio de la estructura del ADN (Pieles, U. et al., (1993) Nucl. Acids Res., 21:3191-3196). Una solución matricial de ácido 3-hidroxipicolínico (3-HPa, 0,7 M en acetonitrilo al 50%, citrato amónico al 10%; Wu, K.J., et al. (1993) Rapid commun. Mass Spectrom., 7:142-146) se marcó sobre la oblea y se permitió secar a temperatura ambiente. Las obleas se unieron directamente a la sonda de muestra de un espectrómetro de masas TOF de tipo reflectrón Finnigan MAT (Bremen, Alemania) Visión 2000 usando una cinta conductora. El reflectron posee una fuente de iones de 5 keV y una postaceleración de 20 keV; se utilizó un láser de nitrógeno; y todos los datos del espectro se tomaron en modo de ión positivo.
Resultados Química superficial
Utilizando química de modificación de dióxido de silicio estándar, se hizo reaccionar una oblea de silicio con 3-aminopropiltrietoxisilano para producir una capa uniforma de grupos amino primarios en la superficie. Cómo se muestra en la figura 7, la superficie se expuso entonces a un reticulante heterobifuncional dando como resultado grupos yodoacetamido sobre la superficie. Fue posible determinar el tiempo óptimo de reacción de esta reacción en solución usando TLC. El reticulante SIAB se visualizó con luz ultravioleta de longitud de onda larga (302 nm) para revelar una mancha con un valor R_{f} de 0,58. El 3-aminopropiltrietoxisilano no era activo con luz ultravioleta, por lo tanto se usó ninhidrina para revelar una mancha púrpura que indicaba la presencia de una amina primaria en la línea basal. Se ejecutó una reacción a microescala usando un ligero exceso molar de SIAB en comparación con 3-aminopropiltrietoxisilano; el análisis por TLC después de aproximadamente un minuto puso de manifiesto una nueva mancha visible con luz ultravioleta de longitud de onda larga con una valor de R_{f} de 0,28. No había evidencia de una mancha púrpura tras la pulverización con ninhidrina, por lo tanto todo el 3-aminopropiltrietoxisilano como material de partida se había consumido en la reacción. La luz ultravioleta puso de manifiesto también que el exceso de SIAB permanecía tras la reacción. A partir de estos resultados se determinó que la reacción había finalizado después de aproximadamente un minuto. En todos los casos, las obleas funcionalizadas con yodoacetamido se usaron inmediatamente para minimizar la hidrólisis de la funcionalidad yodoacetamido inestable. Adicionalmente, todas las manipulaciones adicionales de la oblea se realizaron en la oscuridad pues la funcionalidad del yodoacetamido es sensible a la luz.
La reducción de disulfuro del oligonucleótido modificado se controló observando una modificación en el tiempo de retención en FPLC en fase inversa. Se determinó que después de cinco horas en presencia de DTT (100 mM) o TCEP (10 mM), el disulfuro se redujo completamente a tiol libre. Si la reacción de DTT se hubiera dejado continuar durante un mayor tiempo, se hubiera formado un dímero de oligonucleótidos en el que los pares de tioles libres habrían reaccionado. Dicha dimerización se observó también cuando se retiró el DTT después de la terminación de la reacción de escisión. Esta dimerización no se observó cuando se utilizó TCEP como reactivo de escisión pues esta reacción se realiza a pH 4,5, estando así los tioles libres completamente protonados inhibiendo la dimeriza-
ción.
Inmediatamente después de la escisión de disulfuro, se incubó el oligonucleótido modificado con las obleas funcionalizadas con yodoacetamido. Para asegurar la desprotonación total del tiol, la reacción de acoplamiento se realizó a pH 8.0. Se analizó la densidad superficial de la sonda conseguida mediante esta química de obleas de silicio usando sondas radiomarcadas y un Phosphorimager. La densidad superficial de la sonda se controló también como función de la concentración de TCEP usada en la reacción de escisión de disulfuro (figura 8). Usando TCEP 10 mM para escindir el disulfuro y las otras condiciones de reacción descritas anteriormente, fue posible conseguir de manera reproducible una densidad superficial de 250 fmol por milímetro cuadrado de superficie. Se realizaron experimentos idénticos a los descritos anteriormente excepto que la sonda de oligonucleótido carecía de una modificación tiol; las densidades superficiales de menos de 5 fmol por milímetro cuadrado de superficie pusieron de manifiesto que los enlaces no específicos eran mínimos y que el acoplamiento de la sonda ocurría más probablemente según se ha propuesto en la 
\hbox{figura 7.}
Hibridación
Después de la unión de las sondas marcadas con ^{35}S a la superficie de las obleas y determinar la densidad de conjugación como se ha descrito anteriormente, se realizó la hibridación de oligonucleótidos marcados con ^{32}P; la eficacia de hibridación y la densidad se determinaron usando el Phosphorimager y una hoja de cobre. Se determinó experimentalmente que la hoja de cobre bloquea el 98,4% de la señal de ^{35}S, mientras que permite detectar completamente la señal de ^{32}P. La secuencia complementaria hibridada de manera reproducible para dar 150 fmol por milímetro cuadrado de superficie; esto corresponde aproximadamente a un 40% de las sondas conjugadas disponibles por hibridación; de manera similar, se utilizó una secuencia no complementaria en este esquema dando menos de 5 fmol por milímetro cuadrado de superficie en la unión no específica.
Se plantea la hipótesis de que las interferencias estéricas entre los oligonucleótidos firmemente empaquetados sobre la superficie plana inhiben las eficacias de hibridación en más de un 40%. Teniendo esto en mente, se incorporó una molécula espaciadora entre el extremo de la región de hibridación del oligonucleótido y el soporte. Los espaciadores elegidos son una serie de secuencias poli dT que cuya longitud varía de 3 a 25. Tras examinar estas muestras con radiomarcadores y el Phosphorimager, se determinó que el 40% estaba aún con la máxima hibridación que podría conseguirse.
Análisis MS MALDI-TOF
Las obleas se funcionalizaron con sondas, se hibridaron secuencias complementarias y las muestras se analizaron en condiciones MALDI estándar como se ha descrito anteriormente. El análisis puso de manifiesto que sólo la cadena hibridada (MJM6) se observó en el espectro de masas con una relación de masa a carga de 6415,4; la relación de masa a carga teórica es 6415 (figura 9). Como no hubo señal en una relación de masa carga de 6455, se determinó que la cadena conjugada con la oblea (TCUC) no se desorbió pues la unión yodoacetamido era lo suficientemente estable como para aguantar el láser y permanecer intacta. Se observó una señal adicional a una relación de masa a carga de 6262,0. Esta señal resulta de una despurinación de guanosinas pues se sabe que el ADN es susceptible de perder bases purínicas durante el proceso MALDI (Nordoff, E., et al., (1992) Rapid Commun. Mass Spectrom. 6: 771-776). Los cristales de muestra sobre la oblea no se distribuyeron homogéneamente, haciendo necesario hacer un registro minucioso para conseguir una buena mancha. Debido a esta falta de homogeneidad, la resolución de masa varió aunque generalmente varía en el intervalo de 200-300 para el oligonucleótido desorbido en el espectro de masas. En un conjunto de experimentos, se hibridaron secuencias no complementarias a la oblea; tras un lavado como se ha descrito anteriormente, el análisis por MS MALDI-TOF puso de manifiesto que había tenido lugar una hibridación no específica mínima pues no se detectó señal.
Ejemplo 2 Inmovilización de dianas de ADN amplificado a obleas de silicio
Las obleas de silicio conjugadas con SIAB se usaron también para analizar fragmentos libres específicos de ADN que contenían tiol de una secuencia diana de ADN amplificado particular.
Como se muestra en la figura 10, se usó un oligodesoxinucleótido 23-mer que contenía una unión 5'-disulfuro [comprado en Operon Technologies; SEC ID Nº. 3] que es complementario a la región 3' de un molde de ADN genómico humano con 112 bp [Genebank Acc. Nº: Z52259; SEC ID Nº: 4] como cebador junto con un cebador 49-mer disponible en el mercado, que es complementario a una parte del extremo 5' del ADN genómico [comprado en Operon Technologies; SEC ID Nº: 5], en reacciones PCR para amplificar un producto de ADN con 135 pb que contenía una unión 5'-disulfuro unida sólo a una de las cadenas del dúplex de ADN [SEC ID Nº: 6].
Las reacciones de amplificación PCR se realizaron usando Amplitaq® GoldKit® [Perkin Elmer Nº de catálogo N808-0249]. Brevemente, se incubaron 200 ng de ADN genómico humano con 112 bp con 10 \muM de cebador 23-mer y 8 \muM de cebador 49-mer disponible en el mercado, dNTPs 10 mM, 1 unidad de ADN polimerasa Amplitaq Gold en el tampón proporcionado por el fabricante y se realizó PCR en un termociclo.
El enlace 5' disulfuro del producto PCR resultante se redujo completamente usando TCEP 10 mM como se describe en el Ejemplo 1 para generar un grupo 5'-tiol libre. La cadena de ADN que contiene el grupo tiol libre se conjugó a la superficie de la oblea de silicio mediante un enlazador SIAB básicamente como se ha indicado en la figura 7.
La oblea de silicio conjugada con el ADN que contiene tiol con 135 pb se incubó con un oligonucleótido 12-mer complementario [SEC ID Nº: 7] y los fragmentos de ADN hibridados específicamente se detectaron usando análisis MS MALDI-TOF. El espectro de masas puso de manifiesto una señal con una relación de masa a carga experimental observada de 3618,33; la relación de masa a carga teórica de la secuencia oligomérica 12-mer es 3622,4 Da.
Por lo tanto, una molécula diana de ADN específica que contiene una unión 5'-disulfuro se puede amplificar. Las moléculas se inmovilizan sobre una oblea de silicio derivatizada con SIAB usando los métodos descritos en ese documento y los oligonucleótidos complementarios específicos se pueden hibridar con estas moléculas diana y detectar usando análisis MS MALDI-TOF.
Ejemplo 3 Detección de mutantes con espectrochip en el gen ApoE
Este ejemplo describe la hibridación de un molde inmovilizado, la extensión del cebador y la espectrometría de masas para detectar el gen de apolipoprotreína E de tipo salvaje y mutante con propósitos de diagnóstico. Este ejemplo demuestra que las moléculas de ADN inmovilizadas que contienen una secuencia específica se pueden detectar y distinguir usando una extensión de cebador de cebadores específicos con alelo no marcados y análisis de los productos de extensión usando espectrometría de masas.
Un molde de ADN sintético de 50 bases complementario a la secuencia de codificación del alelo 3 del gen de la apolipoproteína E de tipo salvaje: 5'-GCCTGGTACACTGCCAGGCGCTTCTGAGGTCATCGGCATCGCGCGGAGGAG-3' [SEC ID Nº: 17] o complementario al gen de la apolipoproteína E mutante que leva una transición G \rightarrow A en el codón 158:
CCTGGTACACTGCCAGGCGCTTCTGAGGTCATCGGCATCGCGCGGAGGAG-3' [SEC ID Nº: 18] que contiene un grupo tiol libre 3' se acopló para separar obleas de silicio derivatizadas con SIAB esencialmente como se ha indicado en la figura 7 y como se describe en los ejemplos 1 y 2.
Un cebador oligonucleotídico 21-mer:
5'-GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3' [SEC ID Nº: 19] se hibridó a cada uno de los moldes inmovilizados y el cebador se extendió usando un kit disponible en el mercado [por ejemplo Secuenasa® o Termosecuenasa®, U.S. Biochemical Corp]. La adición de ADN polimerasa Secuenasa o ADN polimerasa Termosecuenasa en presencia de tres desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs; dATP, dGTP, dTTP) y didesoxirribonucleósido citosina trifosfato (ddCTP) en tampón de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante dio como resultado una extensión de una sola base del cebador 21-mer unido al molde inmovilizado que codifica el gen de la apolipoproteína E de tipo salvaje y una extensión de tres bases del polímero 21-mer unido al molde inmovilizado que codifica la forma mutante del gen de la apolipoproteína E.
Las obleas se analizaron por espectrometría de masas como se ha descrito en este documento. La secuencia de apolipoproteína de tipo salvaje da como resultado un espectro de masas que se distingue de el del cebador con una extensión de una sola base (22-mer) con una relación o una proporción de masa a carga de 6771,17 Da (la proporción de masa a carga teórica es de 6753,5 Da) con respecto al cebador 21-mer original con una proporción de masa a carga de 6499,64 Da. La secuencia de apolipoproteína E mutante da como resultado un espectro de masas que se distingue de el del cebador con una extensión de tres bases (24-mer) con una proporción de masa a carga de 7386,9 (la proporción de masa carga teórica es de 7386,9) con respecto al cebador original 21-mer con una proporción de masa a carga de 6499,64 Da.
Ejemplo 4 Preparación de series de ADN usando herramientas de distribución en serie y en paralelo
Se usaron herramientas de distribución pL-nL en serie y en paralelo accionadas mediante un robot para generar series de ADN con 10-10^{3} elementos en chips < 1 pulgada cuadrada ((25,4)^{2} mm^{2}) con superficies planas o alteradas geométricamente (por ejemplo con pocillos) para análisis por espectrometría de masas de ionización por desorción con láser asistida por matriz. En lo anterior una "pipeta piezoeléctrica" (capilar con diámetro interno de 70 \mum) distribuye gotas sencillas o múltiples de aproximadamente 0,2 nl de la matriz, y después del analito, sobre el chip; se ha obtenido el espectro de algo tan pequeño como 0,2 fmol de ADN 36-mer usando este procedimiento. A pesar de la rápida evaporación (< 5 s), los microcristales de ácido 3-hidroxipicolínico matricial que contenían el analito se produjeron de manera rutinaria dando como resultado una mayor reproducibilidad que la obtenida normalmente con preparaciones de mayor volumen; las 100 manchas de cinco fmol de un 23-mer en pocillos 800 \mum dieron un espectro de masas que se interpretó fácilmente, con señales de ión precursor 99/100 que tenían una proporción de señal a ruido mayor de 5. En un segundo planteamiento, las sondas de una placa de microtitulación de 384 pocillos se distribuyeron 16 a la vez en los pocillos del chip o sobre superficies planas usando una serie boquillas cargadas con muelles que transfieren aproximadamente 20 nl al chip por contacto superficial; el análisis MS de los elementos de la serie depositados con el método en paralelo son comparables en términos de sensibilidad y resolución con los depositados usando el método en serie.
Descripción del distribuidor piezoeléctrico en serie
El sistema experimental desarrollado a partir de un sistema comprado en Microdrop GmbH, Norderstedt Alemania y que puede incluir un elemento conductor piezoeléctrico que envía una señal pulsátil a un elemento piezoeléctrico unido a y que rodea a un capilar de vidrio que contiene la solución que se va a distribuir; un transductor de presión para cargar (mediante presión negativa) o vaciar (mediante presión positiva) el capilar; una plataforma xyz robótica y un conductor de robot para maniobrar el capilar para la carga, descarga, distribución y limpieza, un estroboscopio y un conductor pulsado a la frecuencia del elemento piezo para permitir la visualización de las características de la gota "suspendida"; plataformas diferentes para la fuente y las placas de designación o muestras diana (es decir chip de silicio); una cámara montada sobre el brazo robótico para observar la carga de la placa de designación; y una estación de datos que controla la unidad de presión, el robot xyz y el conductor piezoeléctrico.
Descripción del distribuidor en paralelo
La herramienta de boquilla robótica consiste en 16 sondas alojadas en un bloque de sondas y montadas en una plataforma xyz robótica. La plataforma robótica era un sistema articulado que permite colocar las bandejas de muestra por debajo de los brazos del robot. La propia unidad articulada está compuesta por brazos X e Y que se mueven 250 y 400 mm, respectivamente, guiados mediante servomotores lineales sin escobillas con retroalimentación posicional proporcionada mediante codificadores ópticos lineales. Se monta un eje Z conducido por un tornillo de plomo (movimiento vertical 50 mm) al eje xy que se desliza por la unidad articulada y está controlado por un servomotor rotatorio en línea con una retroalimentación posicional mediante un codificador óptico rotatorio montado en el motor. El área de trabajo del sistema se equipa con una placa herramienta deslizante que sostiene 5 placas de microtitulación (más a menudo, dos placas de solución de lavado y tres placas de muestra para un máximo de 1152 soluciones oligonucleotídicas diferentes) y hasta diez obleas de 20 x 20 mm. Las obleas se colocaron con precisión en la placa contra dos boquillas montadas en paralelo y se aseguraron al vacío. Todo el sistema se encerró en un alojamiento de plexi-glass por seguridad y se montó sobre un marco soporte de acero para amortiguar los cambios térmicos y vibracionales. El control de movimiento se consiguió utilizando un controlador de movimiento comercial que era un servocontrolador de 3 ejes y que se integró al ordenador; el código de programación para las aplicaciones específicas se escribe según se necesite.
Las muestras se distribuyeron con el sistema en serie sobre diversas superficies que sirvieron como dianas en el análisis MALDI-TOF incluyendo [1] una muestra diana de acero inoxidable plana según se suministra para uso rutinario en Thermo Bionalysis Visión 2000; [2] la misma diana de acero inoxidable con nanopicaduras micromecanizadas; [3] obleas de silicio (Si) planas; [4] obleas de silicio planas pulidas; obleas de silicio con picaduras rugosas (configuración 3-6 pLm); [6] chips de silicio (a) 12 x 12 o (b) 18 x 18) mm con (a) series 10 x 10 o (b) 16 x 16) de pocillos de ataque químico, cada uno de 800 x 800 1 lm en un lado con profundidades que varían de 99-400 (o (b) 120) micrómetros, picadura (a) 1,0 (o (b) 1,125) mm; [7] chips de silicio de 15 x 15 mm con series 28 x 28 de pocillos de ataque químico cada uno de 450 x 450 micrómetros en un lado con profundidades que varían de 48-300 micrómetros, picadura 0,5 mm; [8] policarbonato plano u otros plásticos; [9] oro y otros metales; [10] membranas; [11] superficies plásticas bombardeadas con oro u otros materiales conductores. El volumen distribuido se controla entre 10^{-10} a 10^{-6} l ajustando el número de gotas distribuidas.
Preparación y distribución de muestras 1. En serie
Se cargaron oligonucleótidos (0,1-50 ng/microlitro de diferentes secuencias o concentraciones en pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos; el primer pocillo se reservó para la solución matricial; se puso un chip con picaduras (diana 6a en sección de dianas MALDI) sobre la plataforma y se alineó manualmente. En el software de control del robot (para Windows) se introdujeron las coordenadas del primer pocillo, el tamaño del conjunto (es decir el número de manchas en x e y) y el espaciado entre los elementos, y el número de gotas de 0,2 nl por elemento del conjunto. El capilar se llenó con aproximadamente 10 microlitros de H_{2}O, automáticamente se movió a la vista de una cámara iluminada con luz estroboscópica para comprobar la integridad y la limpieza de la punta mientras estaba en modo pulsátil continuo y se cerró. El capilar se llenó entonces con la solución matricial, de nuevo se comprobó al estroboscopio y después se usó para marcar un conjunto sobre superficies planas o con picaduras. Para estudios de reproducibilidad en diferentes modos MS, se distribuyó típicamente una serie 10 x 10 de gotas de 0,2-20 nl. El capilar se vació aplicando una presión positiva, opcionalmente enjuagando con agua y llevando a la oligoplaca fuente en la que se extraen aproximadamente 5 \mul de oligosintético 0,05-2,0 \muM. El capilar se rastreó en serie sobre cada una de las manchas de la matriz añadiendo 0,2-20 nl de solución acuosa a cada uno.
2. En paralelo
Los programas en paralelo se escribieron para controlar un conjunto realizando impresión offset; para preparar un conjunto de 64 elementos sobre 10 obleas, por ejemplo, la herramienta se sumergió en 16 pocillos de una placa fuente de ADN de 384 pocillos, se desplazó a la diana (por ejemplo silicio, plástico, metal y la muestra se marcó mediante contacto superficial; la herramienta se sumergió entonces en los mismos 16 pocillos y se marcó sobre un segundo objetivo; ese ciclo se repitió en las 10 obleas. A continuación, la herramienta se sumergió en solución de lavado, después se sumergió en 16 pocillos de la placa fuente y se marcó sobre un desplazamiento diana de 2,25 mm con respecto al conjunto inicial de 16 manchas; de nuevo se repitió esto para las 10 obleas; el ciclo completo se repitió para preparar una serie 2 x 2 para cada boquilla para producir una serie 8 x 8 de manchas (2 x 2 elementos/boquilla X 16 boquillas = 64 elementos manchados en total).
Para preparar series para análisis MS, se cargaron oligonucleótidos de diferentes secuencias o concentraciones en los pocillos de hasta tres placas de microtitulación de 384 pocillos diferentes, se reservó un conjunto de 16 pocillos para la solución matricial. Los pocillos de dos placas se llenaron con solución de lavado. Las cinco placas de microtitulación se cargaron sobre la placa de herramienta deslizante. Se pusieron diez obleas en contacto con las boquillas sobre la placa herramienta y se hizo el vacío. En los casos en los que la matriz y el oligonucleótido no están premezclados, la herramienta boquilla se usó para marcar la solución de matriz en primer lugar sobre todos los elementos deseados de la serie de las diez obleas. Para este ejemplo, se creó una serie de 16 x 16, de manera que la herramienta puede marcar cada una de las 16 obleas 16 veces, con un desplazamiento de 1,125 mm. A continuación, la solución de oligonucleótido se marcó con el mismo modelo para redisolver la matriz. De manera similar, se puede preparar una serie colocando la solución de oligonucleótido sobre la oblea en primer lugar, seguido de la solución matricial, o premezclando la matriz y las soluciones de oligonucleótido.
Espectrometría de masas
Posteriormente a cualquier esquema de distribución, los chips cargados se mantuvieron en una placa fuente
MALDI-TOF con un conjunto de soportes de policarbonato montados con tornillos biselados. La placa se transfirió al extremo de una sonda para mantener una resolución de 1 \mum, un desplazamiento de 1'' en el plano xy (Newport) en la zona de la fuente con un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo. El instrumento, que normalmente funciona con una extracción de 18-26 kV pudo funcionar en modo reflectron con campo lineal o curvado y con un modo de extracción continuo o retrasado.
Resultados Distribución en serie con la pipeta piezoeléctrica
Aunque la administración de una solución saturada 3HPA puede dar como resultado la obstrucción de la punta según se evapora el disolvente de la interfaz capilar-aire, la premezcla de ADN y la matriz diluye suficientemente la matriz de manera que permanece en disolución mientras se obtuvieron pulverizadores estables que se pueden mantener hasta que el capilar se vacía; con una solución matricial diluida (en H_{2}O) 1:1, fue posible una pulverización continua durante más de 10 minutos. Desconectando el elemento piezo de manera que el capilar permaneció inactivo durante más de 5 minutos, y reactivando el elemento piezo no dio como resultado la obstrucción del capilar.
Los experimentos iniciales usando dianas de muestra de acero inoxidable según proporciona Finnigan Vision 2000 el sistema MALDI-TOF ejecutados en modo reflectron utilizaron una solución de premezcla de matriz y ADN antes de distribuirla sobre la muestra diana. En un único pocillo de microtitulación se mezclaron 50 \mul de solución matricial saturada, 25 \mul de una solución de 51 \mul de 12-mer (ATCG)3 y 25 \mul de una solución de 51 \mul de 28-mer (ATCG)7. Un conjunto de series 10 x 10 de gotas de 0,6 \mul se distribuyó directamente sobre un disco diana de muestra Finnigan Vision 2000; el espectro de masas MALDI-TOF se obtuvo a partir de un elemento sencillo del conjunto que contenía 750 atomoles de cada uno de los dos oligonucleótidos. El espectro de masas interpretable se ha obtenido para ADN de una longitud de 53-mer (350 mol cargados, no mostrado) usando este método.
El espectro de masas se obtuvo también a partir de ADN microdistribuidos en los pocillos de un chip de silicio. La figura 11 muestra un chip de silicio de 12 x 12 mm con 100 pocillos atacados químicamente, las dimensiones de máscara y tiempo de ataque se ajustaron de manera que se obtuvieron pocillos con geometría fustum (es decir, parte superior de pirámide plana invertida) con 800 x 800 \mum (superficie superior) y 100 \mum de profundidad. Opcionalmente, los pocillos pueden ser rugosos o con picaduras. Como se ha descrito anteriormente, el borde del chip se alineó contra una superficie levantada en la plataforma para definir el sistema de coordenadas x e y con respecto al capilar. (Las alternativas incluyen alineación óptica, rutinas de reconocimiento de modelos de inteligencia artificial y alineamiento manual basado en clavijas). En cada pocillo se distribuyeron 20 gotas (\sim5 nl) de solución matricial 3-HPA sin analito; para la solución de CH_{3}CN al 50% utilizada, los tiempos de evaporación para cada gota fueron del orden de 5-10 segundos. Tras la evaporación del disolvente, cada gota matricial microdistribuida observada con un estereomicroscopio 120X apareció generalmente como un disco amorfo plano "lechoso"; dichos aspectos son consistentes con los de las gotas a partir de las cuales se obtuvo el espectro de la figura 3b. Tras vaciar la punta, enjuagar y volver a llenar con solución acuosa 1,4 \mum de ADN 23-mer (M, (calc) = 6967 Da), el capilar se dirigió por encima de cada una de las 100 manchas de la matriz en las que se distribuyó la solución acuosa de ADN de 5 nl directamente sobre las gotas matriciales. Utilizando visualización mediante una cámara CCD, pareció que la solución acuosa de analito se mezcló y se redisolvió con la matriz (la evaporación completa llevó aproximadamente 10 segundos a temperatura y humedad ambiente). Las superficies matriciales amorfas se transformaron en superficies microcristalinas verdaderas, con características cristalinas del orden de < 1 \mum.
Consistente con la cristalización mejorada conseguida mediante el método de redisolver la matriz, la consecución del espectro de masas parece más reproducible que con las soluciones de matriz premezclada más analito; cada una de los espectros de masa interpretados de las 100 manchas de cinco fmol de 23-mer obtenidas (figura 12), con señales de ión precursor 99/100 que tienen proporciones de señal a ruido mayores de 5; dicha reproducibilidad se obtuvo también con superficies las planas de silicio y metales ensayadas (no mostrados). Los espectros de la figura 12 se obtuvieron en un instrumento TOF lineal que funciona a 26 kV. Tras la calibración interna del espectro izquierdo superior (pocillo "k1") usando iones moleculares con carga simple y doble, y aplicando esta calibración a los otros 99 espectros como calibración externa (figura 13), se obtuvo una desviación típica < 9 Da con respecto al peso molecular medio, correspondiente a una desviación típica relativa de \sim0,1%.
Distribución en paralelo con la herramienta de boquilla robótica
Se prepararon series con impresión offset como se ha descrito anteriormente. La velocidad de las plataformas X e Y es 35 pulgadas/s (88,9 cm/s) y la velocidad de la plataforma Z es de 5,5 pulgadas/s (14,0 cm/s). Es posible mover las plataformas X e Y a velocidad máxima para disminuir los ciclos temporales, sin embargo, la velocidad de la plataforma Z debe disminuir antes del contacto superficial con la oblea para evitar dañarla. A dichas velocidades de los ejes, el ciclo temporal aproximado para marcar 16 elementos (una impresión de la herramienta de las mismas soluciones) sobre todas las 10 obleas es de 20 segundos, de manera que una serie de 256 elementos llevaría \sim5,3 minutos. Cuando se ponen diferentes soluciones de oligonucleótidos diferentes sobre el conjunto, se debe incorporar una etapa adicional de lavado para lavar la punta del boquilla antes de sumergirlo en otra solución, por lo que el ciclo temporal aumentaría de 25 segundos o 6,7 minutos para las 10 obleas.
La administración de muestras por la herramienta se examinó usando soluciones radiomarcadas y el Phosphorimager descrito anteriormente; se determinó que cada boquilla administraba aproximadamente 1 nl de líquido. La reproducibilidad mancha a mancha es alta. Se preparó una serie de 256 elementos oligonucleotídicos de secuencia y concentración variables sobre obleas de silicio planas usando la herramienta de boquilla y la oblea se analizó mediante MS MALDI-TOF.
Ejemplo 5 Uso de inmovilización de ácido nucleico de alta densidad para generar series de ácido nucleico
Utilizando el procedimiento de unión de alta densidad descrito en el ejemplo 1, se creó una serie de oligómeros de ADN apta para análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF sobre una oblea de silicio que tiene una pluralidad de posiciones, por ejemplo depresiones o parches, sobre su superficie. Para generar el conjunto, se movilizó un cebador oligonucleotídico que contenía tiol sólo en las posiciones seleccionadas de la oblea [por ejemplo véase la figura 14]. Cada posición de la serie contenía uno de los tres oligómeros diferentes. Para demostrar que los oligómeros inmovilizados diferentes se pueden detectar y distinguir por separado, se hibridaron tres oligonucleótidos distintos de diferentes longitudes que son complementarios a cada uno de los tres oligómeros de la serie sobre la oblea y se analizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF.
Oligodesoxinucleótidos
Se sintetizaron tres conjuntos de pares de oligodesoxinucleótidos complementariosen los que un miembro del par de oligonucleótido complementario contiene una unión disulfuro 3'- ó 5'- (comprado en Operon Technologies u Oligos, etc.]. Por ejemplo, el oligómero 1 [d(CTGATGCGTCGGATCATCTTTTTT-SS); SEC ID Nº: 8] contiene una unión 3'-disulfuro mientras que el oligómero 2 [d(SS-CCTCTTGGGAACTGTGTAGTATT); un derivado 5'-disulfuro de la SEC ID Nº: 3] y el oligómero 3 [d(SS-GAATTCGAGCTGGTACCCGG); un derivado 5'-disulfuro de la SEC ID Nº: 1] conteniendo cada uno una unión 5'-disulfuro.
Los oligonucleótidos complementarios a los oligómeros 1-3 se diseñaron para que fueran de diferentes longitudes y que se pudieran resolver fácilmente uno de otro durante el análisis por MS MALDI-TOF. Por ejemplo, se sintetizó un oligonucleótido 23-mer [SEC ID Nº: 9] complementario a una parte del oligómero 1, un oligonucleótido 12-mer [SEC ID Nº:7] se sintetizó de manera complementaria a una parte del oligómero 2 y un 21-mer [SEC ID Nº: 2; secuencia denominada "MJM6" en el ejemplo 1] se sintetizó de manera complementaria a una parte del oligómero 3. Además, se sintetizó un cuarto oligonucleótido 29-mer [SEC ID Nº: 10] que carece de complementariedad con cualquiera de los tres oligómeros. Este cuarto oligonucleótido se usó como control negativo.
Química superficial del silicio e inmovilización de ADN (a) Serie 4 x 4 (posición 16)
Se compró una oblea de silicio de 2 x 2 cm^{2} que tiene 256 depresiones o pocillos individuales en forma de un conjunto de pocillos 16 x 16, de un suministrador comercial [Accelerator Technology Corp., College Station, Texas]. Los pocillos eran de 800 x 800 \mum^{2}, 120 \mum^{2} de profundidad, con un paso de 1,125. La oblea de silicio se hizo reaccionar con 3-aminopropiltrietoxisilano para producir una capa uniforme de aminas primarias sobre la superficie y después se expuso al reticulante heterobifuncional SIAB dando como resultado funcionalidades yodoacetamido sobre la superficie [por ejemplo, véase la figura 7].
Para preparar los oligómeros para acoplar a las diversas posiciones del conjunto de silicio, el enlace disulfuro de cada oligómero se redujo completamente usando TCEP 10 mM según se describe en el ejemplo 1, y el ADN se resuspendió a una concentración final de 10 \muM en una solución de tampón fosfato 100 mM, pH 8,0. Inmediatamente después de la reducción del enlace disulfuro, los grupos tiol libres del oligómero se acoplaron a la funcionalidad yodoacetamido a las 16 posiciones sobre la oblea usando las condiciones de acoplamiento de sonda prácticamente como se ha descrito en la figura 7. Para conseguir separar el acoplamiento en las 16 posiciones diferentes de la oblea, no se lavó toda la superficie de la oblea con la solución de oligonucleótido si no que se añadió una alícuota de aproximadamente 30 nl de un oligómero modificado predeterminado en paralelo con cada una de las 16 posiciones (es decir depresiones) de los 256 pocillos de la oblea para crear un conjunto 4 x 4 de ADN inmovilizado usando una herramienta de boquilla como se describe en este documento (véase, por ejemplo, la descripción detallada y el ejemplo 4 proporcionados en este documento).
Por lo tanto, como se muestra en la figura 14, uno de los oligómeros 1-3 modificados se inmovilizó covalentemente a cada uno de los 16 pocillos diferentes de los 256 pocillos de la oblea de silicona creándose por lo tanto un conjunto 4 x 4 inmovilizado. Por ejemplo, el oligómero 1 se conjugó en una posición del pocillo en la esquina superior izquierda del conjunto 4 x 4 y el oligómero 2 se conjugó en la posición adyacente y así sucesivamente. En la figura 14 se muestra una ilustración del conjunto completo.
Para llevar a cabo la reacción de hibridación, los tres oligonucleótidos complementarios y el oligonucleótido de control negativo se mezclaron a una concentración final de 10 \muM para cada oligonucleótido en 1 ml de tampón TE [Tris-HCL 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mm] suplementado con NaCl 1 M, y la solución se calentó a 65ºC durante 10 minutos. Inmediatamente después, toda la superficie de la oblea de silicio se lavó con 800 \mul de la solución de oligonucleótido calentada. Los oligonucleótidos complementarios se hibridaron con los oligómeros inmovilizados incubando el conjunto de silicio a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de la incubación a 4ºC durante al menos 10 minutos. Alternativamente, la solución de oligonucleótidos se puede añadir a la oblea que después se calienta y se deja enfriar para que se produzca la hibridación. En la figura 15 se muestra una ilustración de los oligonucleótidos complementarios hibridados a oligómeros específicos inmovilizados convalentemente en cada posición.
La serie hibridado se lavó entonces con una solución de tampón citrato amónico 50 mM para intercambio catiónico para retirar los iones sodio y potasio de la estructura de ADN (Pieles, U, et al., 81993) Nucl. Acids Res., 21:3191-3196). Se añadió una alícuota de 6 nl de una solución matricial de ácido 3-hidroxipicolínico [ácido 3-hidroxipicolínico 0,7 M-10% citrato amónico en 50% acetonitrilo; véase Wu et al., Rapid Commun. Mass Sectrom. 7: 142-146 (1993)] a cada posición del conjunto usando una pipeta piezoeléctrica según se ha descrito en este documento.
Se dejó que la solución se secara a temperatura ambiente y después se añadió una alícuota de 6 nl de agua a cada posición usando una pipeta piezoeléctrica para resuspender el complejo matriz-ADN seco, de manera que tras el secado a temperatura ambiente el complejo matriz-ADN forma una superficie cristalina uniforme sobre el fondo de la superficie de cada posición.
Análisis MS MALDI-TOF
El análisis MS MALDI-TOF se realizó en serie en cada una de las 16 posiciones del conjunto de hibridación ilustrado en la figura 15, básicamente según se describe en el ejemplo 1. El espectro de masas resultante de los oligonucleótidos que se hibridan específicamente con cada una de las 16 posiciones de la serie de hibridación de ADN se muestra en la figura 16. El espectro de masas puso de manifiesto una señal específica en cada posición representativa de la relación de masa a carga experimental observada correspondiente a la secuencia nucleotídica complementaria específica.
Por ejemplo, en las posiciones que tienen sólo el oligómero 1 conjugado con las mismas, el espectro de masas puso de manifiesto una señal predominante con una relación de masa a carga experimental observada de 7072,4 aproximadamente igual a la de 23-mer; la relación de masa a carga teórica de 23-mer es 7072,6 Da. De manera similar, la hibridación específica del oligonucleótido 12-mer con la serie, se observó una relación de masa a carga experimental de 3618,33 Da (teórico 3622,4 Da), se detectó sólo en aquellas posiciones conjugadas con el oligómero 2 mientras que la hibridación específica de MJM6 (relación de masa a carga experimental observada de 6415,4) se detectó sólo en aquellas posiciones de la serie conjugadas con el oligómero 3 [teórico 6407,2 Da].
Ninguna de las posiciones de la serie puso de manifiesto una señal que correspondiera con el oligonucleótido 29-mer de control negativo (relación de masa a carga teórica de 8974,8) indicando que las moléculas de ADN diana específicas se pueden hibridar con oligómeros inmovilizados covalentemente a posiciones específicas sobre la superficie de la serie de silicio y se pueden controlar individualmente una pluralidad de ensayos de hibridación utilizando análisis MS MALDI-TOF.
(b) Serie 8 x 8 (posición 64)
Se compró una oblea de silicio de 2 x 2 cm^{2} que tiene 256 depresiones o pocillos individuales que forman un conjunto de 16 x 16 pocillos, en un suministrador comercial [Accelerator Technology Corp., College Station, Texas]. Los pocillos eran de 800 x 800 \mum^{2}, 120 \mum de profundidad con un paso de 1,125. La oblea de silicio se hizo reaccionar con 3-aminopropiltrietoxisilano para producir un capa uniforme de aminas primarias sobre la superficie y después se expuso al reticulante heterobifuncional SIAB dando como resultado funcionalidades yodoacetamido sobre la superficie [por ejemplo, véase la figura 7].
Siguiendo los procedimientos descritos anteriormente para preparar series de ADN de 16 posiciones, se inmovilizaron los oligómeros 1-3 en 64 posiciones formando una serie 8 x 8 en la oblea de silicio de 256 pocillos, se hibridaron con oligonucleótidos complementarios y se analizaron mediante análisis MS MALDI-TOF. La figura 17 muestra el espectro masas de la serie de ADN de la posición 64 analizado en serie mediante análisis MALDI-TOF. Como se muestra para el ensayo en la posición 16, la hibridación específica del oligonucleótido complementario cada uno de los oligómeros que contenían tiol inmovilizados se observó en cada una de las posiciones de la serie de
ADN.
Ejemplo 6 Extensión de los cebadores de ADN hibridados unidos a moldes de ADN inmovilizados en una oblea de silicio
Las obleas se silicio derivatizadas con SIAB se pueden utilizar también para reacciones de extensión de cebador del molde de ADN inmovilizado usando los procedimientos descritos básicamente en la Patente de Estados Unidos Nº 5.605.798.
Como se muestra en la figura 18, un oligonucleótido 27-mer [SEC ID Nº: 11] que contiene un grupo 3'-tiol libre se acopló a una oblea de silicio derivatizada con SIAB como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, en el ejemplo 1. Se hibridó un cebador oligonucleotídico 12-mer [SEC ID Nº: 12], al oligonucleótido inmovilizado y el cebador se extendió usando un kit disponible en el mercado [por ejemplo, Secuenasa o Termosecuenasa, U.S. Biochemical Corp]. La adición de la ADN polimerasa Secuenasa o ADN polimerasa Termosecuenasa en presencia de tres desoxirribonucleósidos trifosfato [dNTP, dATP, dGTP, dCTP) y didesoxirribonucleósido timidina trifosfato (ddTTP) en tampón de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante dio como resultado una extensión de tres bases del cebador 12-mer mientras aún está unido a la oblea de silicio. La oblea se analizó posteriormente por espectrometría de masas MALDI-TOF como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la figura 18, en el espectro de masas resulta claramente distinguible el 15-mer [SEC ID Nº: 13], del 12-mer original sin extender lo que indica que la extensión específica se puede realizar sobre la superficie de una oblea de silicio que se puede detectar usando análisis MS MALDI-TOF.
Ejemplo 7 Efecto de la longitud del enlazador sobre la extensión de polimerasa de cebadores de ADN hibridados unidos a moldes de ADN inmovilizados en una oblea de silicio
Se investigó el efecto de la distancia entre la superficie de silicio conjugada con SIAB y el dúplex de ADN formado por hibridación del ADN diana con el molde oligomérico inmovilizado, así como la elección de la enzima [por ejemplo, véase la figura 19].
Se conjugaron dos obleas de silicio derivatizadas con SIAB al extremo 3' de dos oligonucleótidos que contenían tioles libres con una secuencia de ADN idéntica excepto por una secuencia de espaciador poli dT de tres bases incorporada en el extremo 3' [SEC ID Nos.: 8 y 11]. Estos dos oligonucleótidos se sintetizaron y cada uno se inmovilizó por separado a la superficie de una oblea de silicio mediante un reticulante SIAB [por ejemplo, véase la figura 7]. Cada oblea se incubó con un oligonucleótido 12-mer [SEC ID Nos: 12, 14 y 15] complementarios a partes de las secuencias de nucleótidos comunes a ambos oligonucleótidos, desnaturalizando a 75ºC y enfriando lentamente la oblea de silicio. Después las obleas se analizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF según se ha descrito anterior-
mente.
Como se ha mostrado previamente en la figura 18, se observó una extensión específica de tres bases del oligonucleótido de 12-mer unido usando el cebador oligomérico cuando hay un espaciador de nueve bases entre el dúplex de ADN y la superficie [SEC ID Nº: 12]. Como se muestra en la figura 19, se observaron resultados similares cuando las longitudes del espaciador de ADN entre el resto SIAB y el dúplex de ADN fueron de 0, 3, 6 y 12. Los resultados del análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF de las obleas se muestran en la figura 20. Además, la figura 19 muestra también que la reacción de extensión se puede realizar usando diversas ADN polimerasas. Por lo tanto, el enlazador SIAB se puede acoplar directamente al molde de ADN o puede incluir una secuencia de enlazador sin realizar la extensión del cebador del ADN hibridado.
Ejemplo 8 Detección de moléculas de ácido nucleico bicatenario mediante desplazamiento e hibridación con un ácido nucleico complementario inmovilizado
Este ejemplo describe la inmovilización de un cebador 24-mer y la hibridación específica de una molécula dúplex de ADN monocatenario, permitiendo la amplificación de una molécula diana seleccionada en fase disolución y que permite la detección de moléculas bicatenarias.
Un cebador de ADN 24-mer CTGATGCGTC GGATCATCTT TTTT [SEC ID Nº: 8], que contiene un grupo 3'-tiol libre se acopló a un oblea de silicio derivatizada con SIAB prácticamente como se ha indicado en la figura 7 y como se describe los ejemplos 1 y 2.
Un oligonucleótido sintético 18-mer 5'-CTGATGCGTCGGATCATC-3' [SEC ID Nº: 16] se premezcló con un oligonucleótido 12-mer 5'-GATGATCCGACG-3' [SEC ID Nº: 12] que tiene una secuencia que es complementaria a la parte de 12 bases del oligonucleótido de 18-mer. La mezcla de oligonucleótidos se calentó a 75ºC y se enfrió lentamente a temperatura ambiente para facilitar la formación de una molécula dúplex:
5'-CTGATGGCGTCGGATCATC-3' [SEC ID Nº: 16]
3'-GCAGCCTAGTAG-5' [SEC ID Nº: 12]
La hibridación específica de la cadena 12-mer de la molécula dúplex con el cebador 24-mer inmovilizado se realizó mezclando 1 \mum de la molécula dúplex usando las condiciones de hibridación descritas en el ejemplo 6.
Las obleas se analizaron por espectrometría de masas según se ha descrito anteriormente. La hibridación específica se detectó en un espectro de masas de 12-mer con una relación de masa a carga de 3682,78 Da.
Ejemplo 9 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimetoxitritilpropoxi)fenil)-1-O-((2-cianoetoxi)-diisopropilaminofosfino)etano A. 2-Nitro-5-(3-hidroxipropoxi)benzaldehído
Se calentó a reflujo 3-bromo-1-propanol (3,34 g, 24 mmol) en 80 ml de acetonitrilo anhidro con 5-hidroxi-2-nitrobenzaldehído (3,34 g, 20 mmol), K_{2}CO_{3} (3,5 g) y KI (100 mg) durante una noche (15 horas). La mezcla se reacción se enfrió a temperatura ambiente y se le añadieron 150 ml de cloruro de metileno. La mezcla se filtró y el residuo sólido se lavó con cloruro de metileno. La solución orgánica combinada se evaporó a sequedad y se redisolvió en 100 ml de cloruro de metileno. La solución resultante se lavó con solución saturada de NaCl y se secó sobre sulfato sódico. Se obtuvieron 4,31 g (96%) del producto deseado después de retirar el disolvente al vacío.
R_{f} = 0,33 (diclorometano/metanol, 95/5).
UV (metanol) máximo: 313,240 (soporte), 215 nm; mínimo: 266 nm.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 10,28 (s, 1H), 8,17 (d, 1H), 7,35 (d, 1H), 7,22 (s, 1H), 4,22 (t, 2H), 3,54 (t, 2H), 1,90 (m, 2H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}) \delta 189,9, 153,0, 141,6, 134,3, 127,3, 118,4, 114,0, 66,2, 56,9, 31,7.
B. 2-Nitro-5-(3-O-t-butildimetilsililpropoxi)benzaldehído
Se disolvió 2-nitro-5-(3-hidroxipropoxi)benzaldehído (1 g, 4,44 mmol) en 50 ml de acetonitrilo anhídro. A esta solución se le añadió 1 ml de trietilamina, 200 mg de imidazol y 0,8 g (5,3 mmol) de tBDMSCI. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Se añadió metanol (1 ml) para detener la reacción. El disolvente se retiró al vacío y el residuo sólido se redisolvió en 100 ml de cloruro de metileno. La solución resultante se lavó con solución saturada de bicarbonato sódico y después con agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y el disolvente se retiró al vacío. La mezcla bruta se sometió a un columna rápida de gel de sílice con cloruro de metileno para dar 1,44 g (96%) de 2-nitro-5-(3-O-t-butildimetilsililpropoxi)benzaldehído.
R_{f} = 0,67 (hexano/acetato de etilo, 5/1).
UV (metanol), máximo: 317, 243, 215 nm; mínimo: 235, 267 nm.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 10,28 (s, 1H), 8,14 (d, 1H), 7,32 (d, 1H), 7,20 (s, 1H), 4,20 (t, 2H), 3,75 (t, 2H), 1,90 (m, 2H), 0,85 (s, 9H), 0,02 (s, 6H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}) \delta 189,6, 162,7, 141,5, 134,0, 127,1, 118,2, 113,8, 65,4, 58,5, 31,2, 25,5, -3,1, -5,7.
C. 1-(2-Nitro-5-(3-O-t-butildimetilsililpropoxi)fenil)etanol
Se disolvió 2-nitro-5-(3-O-t-butildimetilsililpropoxi)benzaldehído secado al alto vacío (1,02 g, 3 mmol) en 50 ml de cloruro de metileno anhidro. Se añadió gota a gota trimetilalumínio 2 M en tolueno (3 ml) durante 10 minutos y se mantuvo la mezcla de reacción a temperatura ambiente. Se agitó adicionalmente durante 10 minutos y la mezcla se vertió en 10 ml de agua enfriada con hielo. La emulsión se separó de la fase acuosa y se secó sobre 100 g de sulfato sódico para retirar el resto del agua. El disolvente se retiró al vacío y la mezcla se aplicó a una columna de gel de sílice con un gradiente de metanol en cloruro de metileno. Se aislaron 0,94 g (86%) del producto deseado.
R_{f} = 0,375 (hexano/acetato de etilo, 5/1).
UV (metanol), máximo: 306, 233, 206 nm; mínimo: 255, 220 nm.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 8,00 (d, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,00 (d, 1H), 5,49 (b, OH), 5,31 (c, 1H), 4,19 (m, 2H), 3,77 (t, 2H), 1,95 (m, 2H), 1,37 (d, 3H), 0,86 (s, 9H), 0,04 (s, 6H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}) \delta 162,6, 146,2, 139,6, 126,9, 112,9, 112,5, 64,8, 63,9, 58,7, 31,5, 25,6, 24,9, -3,4, -5,8.
D. 1-(2-Nitro-5-(3-hidroxipropoxi)fenil)etanol
Se disolvió 1-(2-Nitro-5-(3-O-t-butildimetilsililpropoxi)fenil)etanol (0,89 g, 2,5mmol) en 30 ml de THF y se añadieron 0,5 mmol de NBu_{4}NF con agitación. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas y el disolvente se retiró al vacío. El residuo restante se aplicó a una columna de gel de sílice con un gradiente de metanol en cloruro de metileno. Se obtuvo 1-(2-nitro-5-(3-hidroxipropoxi)fenil)etanol (0,6 g) (99%).
R_{f} = 0,17 (diclorometano/metanol, 95/5).
UV (metanol), máximo: 304, 232, 210 nm; mínimo: 255, 219 nm.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 8,00 (d, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,00 (d, 1H), 5,50 (d, OH), 5,28 (t, OH), 4,59 (t, 1H), 4,17 (t, 2H), 3,57 (m, 2H); 1,89 (m, 2H), 1,36 (d, 2H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}) \delta 162,8, 146,3, 139,7, 127,1, 113,1, 112,6, 65,5, 64,0, 57,0, 31,8, 25,0.
E. 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimetoxitritilpropoxi)fenil)etanol
Se co-evaporó 1-(2-nitro-5-(3-hidroxipropoxi)fenil)etanol (0,482 g, 2 mmol) con piridina anhidra dos veces y se disolvió en 20 ml de piridina anhidra. La solución se enfrió en un baño de agua enfriada con hielo y se le añadieron 750 mg (2,2 mmol) de DMTCI. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche y se añadieron 0,5 ml de metanol para detener la reacción. El disolvente se retiró al vacío y el residuo se co-evaporó con tolueno dos veces para retirar las trazas de piridina. El residuo final se aplicó a una columna de gel de sílice con un gradiente de metanol en cloruro de metileno que contenía gotas de trietilamina para dar 0,96 g (89%) del producto deseado 1-(2-nitro-5-(3-O-4,4'-dimetoxitritilpropoxi)fenil)etanol.
R_{f} = 0,50 (diclorometano/metanol, 99/1).
UV (metanol), máximo: 350 (soporte), 305, 283, 276 (soporte) 233, 208 nm; mínimo: 290, 258, 220 nm.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 8,00 (d, 1H), 6,82-7,42 (ArH), 5,52 (d, OH), 5,32 (m, 1H), 4,23 (t, 2H), 3,71 (s, 6H), 3,17 (t, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}) \delta 162,5, 157,9, 157,7, 146,1, 144,9, 140,1, 139,7, 135,7, 129,5, 128,8, 127,6, 127,5, 127,3, 126,9, 126,4, 113,0, 112,8, 112,6, 85,2, 65,3, 63,9, 59,0, 54,8, 28,9, 24,9.
F. 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimetoxitritilpropoxi)fenil)-1-O-((2-cianoetoxi)-diisopropilaminofosfino)etano
Se secó 1-(2-nitro-5-(3-O-4,4'-dimetoxitritilpropoxi)fenil)etanol (400 mg, 0,74 mmol) a alto vacío y se disolvió en 20 ml de cloruro de metileno anhidro. A esta solución se le añadieron 0,5 ml de N,N-diisopropiletilamina y 0,3 ml (1,34 mmol) de 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamidita. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se añadieron 0,5 ml de metanol para detener la reacción. La mezcla se lavó con solución saturada de bicarbonato sódico y se secó sobre sulfato sódico. El disolvente se retiró al vacío y una columna rápida de gel de sílice con 1% de metanol en cloruro de metileno que contenía gotas de trietilamina dio 510 mg (93%) de la fosforamidita deseada.
R_{f} = 0,87 (diclorometano/metanol, 99/1).
Ejemplo 10 1-(4-(3-O-4,4'-Dimetoxitritilpropoxi)-3-metoxi-6-nitrofenil)-1-O-((2-cianoetoxi)-diisopropilaminofosfino)etano A. 4-(3-Hidroxipropoxi)-3-metoxiacetofenona
Se calentó a reflujo 3-bromo-1-propanol (53 ml, 33 mmol) en 100 ml de acetonitrilo anhidro con 4-hidroxi-3-metoxiacetofenona (5 g, 30 mmol), K_{2}CO_{3} (5 g) y KI (300 mg) durante una noche (15 horas). Se añadió cloruro de metileno (150 ml) a la mezcla de reacción después de enfriar a temperatura ambiente. La mezcla se filtró y el residuo sólido se lavó con cloruro de metileno. La solución orgánica combinada se evaporó hasta sequedad y se redisolvió en 100 ml de cloruro de metileno. La solución resultante se lavó con solución saturada de NaCl y se secó sobre sulfato sódico. Se obtuvieron 6,5 g (96,4%) del producto deseado tras retirar el disolvente al vacío.
R_{f} = 0,41 (diclorometano/metanol, 95/5).
UV (metanol), máximo: 304, 273, 227, 210 nm; mínimo: 291, 244, 214 nm.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 7,64 (d, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,04 (d, 1H), 4,58 (b, OH), 4,12 (t, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,56 (t, 2H), 2,54 (s, 3H), 1,88 (m, 2H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}) \delta 196,3, 152,5, 148,6, 129,7, 123,1, 111,5, 110,3, 65,4, 57,2, 55,5 31,9, 26,3.
B. 4-[3-Acetoxipropoxi)-3-metoxiacetofenona
Se secó 4-(3-hidroxipropoxi)-3-metoxiacetofenona (3,5 g, 15,6 mmol) y se disolvió en 80 ml de acetonitrilo anhidro. A esta mezcla se le añadieron 6 ml de trietilamina y 6 ml de anhídrido acético. Después de 4 horas, se añadieron 6 ml de metanol y el disolvente se retiró al vacío. El residuo se disolvió en 100 ml de diclorometano y la solución se lavó con solución diluida de bicarbonato sódico y después con agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se el disolvente se retiró. El residuo se aplicó a una columna de gel de sílice con cloruro de metileno para dar 4,1 g de 4-(3-acetoxipropoxi)-3-metoxiacetofenona (98,6%).
R_{f} = 0,22 (diclorometano/metanol, 99/1).
UV (metanol), máximo: 303, 273, 227, 210 nm; mínimo: 290, 243, 214 nm.
\newpage
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 7,62 (d, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,08 (d, 1H), 4,12 (m, 4H), 3,82 (s, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,04 (m, 2H), 2,00 (s, 3H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}) \delta 196,3, 170,4, 152,2, 148,6, 130,0, 123,0, 111,18, 110,4, 65,2, 60,8, 55,5, 27,9, 26,3, 20,7.
C. 4-(3-Acetoxipropoxi)-3-metoxi-6-nitroacetofenona
Se añadió en porciones 4-(3-acetoxipropoxi)-3-metoxiacetofenona (3,99 g, 15 mmol) a 15 ml de HNO_{3} al 70% en baño de agua y la temperatura de reacción se mantuvo a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se añadieron 30 g de hielo machacado. Esta mezcla se extrajo con 100 ml de diclorometano y la fase orgánica se lavó con solución saturada de bicarbonato sódico. La solución se secó sobre sulfato sódico y el disolvente se retiró al vacío. La mezcla bruta se aplicó a una columna de gel de sílice con un gradiente de metanol en cloruro de metileno para dar 3,8 g (81,5%) del producto deseado 4-(3-acetoxipropoxi)-3-metoxi-6-nitroacetofenona y 0,38 g (8%) del producto ipso-sustituido 5-(3-acetoxipropoxi)-4-metoxi-1,2-dinitrobenceno.
El producto secundario ipso-sustituido 5-(3-acetoxipropoxi)-4-metoxi-1,2-dinitrobenceno:
R_{f} = 0,47 (diclorometano/metanol, 99/1).
UV (metanol), máximo: 334, 330, 270, 240, 212 nm; mínimo: 310, 282, 263, 223 nm.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 7,36 (s, 1H), 7,34 (s, 1H), 4,28 (t, 2H), 4,18 (t, 2H), 4,02 (s ,3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}) \delta 170,9, 152,2, 151,1, 117,6, 111,2, 107,9, 107,1, 66,7, 60,6, 56,9, 28,2, 20,9.
Producto deseado 4-(3-acetoxipropoxi)-3-metoxi-6-nitroacetofenona:
R_{f} = 0,29 (diclorometano/metanol, 99/1).
UV (metanol), máximo: 344, 300, 246, 213 nm; mínimo: 320, 270, 227 nm.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 7,62 (s, 1H), 6,74 (s, 1H), 4,28 (t, 2H), 4,20 (t, 2H), 3,96 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}) \delta 200,0, 171,0, 154,3, 148,8, 138,3, 133,0, 108,8, 108,8, 66,1, 60,8, 56,6, 30,4, 28,2, 20,9.
D. 1-(4-(3-Hidroxipropoxi)-3-metoxi-6-nitrofenil)etanol
Se añadió 4-(3-acetoxipropoxi)-3-metoxi-6-nitroacetofenona (3,73 g, 12 mmol) en 150 ml de etanol y 6,5 g de K_{2}CO_{3}. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas y la TLC con metanol al 5% en diclorometano indicó la finalización de la reacción. A esta misma mezcla de reacción se le añadieron 3,5 g de NaBH_{4} y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió acetona (10 ml) para reaccionar con el resto de NaBH_{4}. El disolvente se retiró al vacío y el residuo se recogió en 50 g de gel de sílice. La mezcla de gel de sílice se aplicó sobre la parte superior de una columna de gel de sílice con metanol al 5% en cloruro de metileno para dar 3,15 g (97%) del producto deseado 1-(4-(3-hidroxipropoxi)-3-metoxi-6-nitrofenil)etanol. El producto intermedio 4-(3-hidroxipropoxi)-3-metoxi-6-nitroacetofenona después de la desprotección:
R_{f} = 0,60 (diclorometano/metanol, 95/5).
Producto final 1-(4-(3-hidroxipropoxi)-3-metoxi-6-nitrofenil)etanol:
R_{f} = 0,50 (diclorometano/metano, 95/5).
UV (metanol), máximo: 344, 300, 243, 219 nm; mínimo: 317, 264, 233 nm.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 7,54 (s, 1H), 7,36 (s, 1H), 5,47 (d, OH), 5,27 (m, 1H), 4,55 (t, OH), 4,05 (t, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,55 (c, 2H), 1,88 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}) \delta 153,4, 146,4, 138,8, 137,9, 109,0, 108,1, 68,5, 65,9, 57,2, 56,0, 31,9, 29,6.
E. 1-(4-(3-O-4,4'-Dimetoxitritilpropoxi)-3-metoxi-6-nitrofenil)etanol
Se co-evaporó 1-(4-(3-hidroxipropoxi)-3-metoxi-6-nitrofenil)etanol (0,325 g, 1,2 mmol) con piridina anhidra dos veces y se disolvió en 15 ml de piridina anhidra. Lasolución se enfrió en un baño de agua enfriada con hielo y se añadieron 450 mg (1,33 mmol) de DMTCl. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche y se añadieron 0,5 ml de metanol para detener la reacción. El disolvente se retiró al vacío y el residuo se co-evaporó con tolueno dos veces para retirar las trazas de piridina. El residuo final se aplicó a una columna de gel de sílice con un gradiente de metanol en cloruro de metileno que contenía gotas de dietilamina para dar 605 mg (88%) del producto deseado 1-(4-(3-O-4,4'-dimetoxitritilpropoxi)-3-metoxi-6-nitrofenil)etanol.
R_{f} = 0,50 (diclorometano/metanol, 95/5).
UV (metanol), máximo: 354, 302, 282, 274, 233, 209 nm; mínimo: 322, 292, 263, 222 nm.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 7,54 (s, 1H), 6,8-7,4 (ArH), 5,48 (d, OH), 5,27 (m, 1H), 4,16 (t, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,72 (s, 6H), 3,15 (t, 2H), 1,98 (t, 2H), 1,37 (d, 3H).
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}) \delta 157,8, 153,3, 146,1, 144,9, 138,7, 137,8, 135,7, 129,4, 128,7, 127,5, 127,4, 126,3, 112,9, 112,6, 108,9, 108,2, 85,1, 65,7, 63,7, 59,2, 55,8, 54,8, 29,0, 25,0.
F. 1-(4-(3-O-4,4'-Dimetoxitritilpropoxi)-3-metoxi-6-nitrofenil)-1-O-((2-cianoetoxi)-diisopropilaminofosfino)etano
Se secó 1-(4-(3-O-4,4'-dimetoxitritilpropoxi)-3-metoxi-6-nitrofenil)etanol (200 mg, 3,5 mmol) a alto vacío y se disolvió en 15 ml de cloruro de metileno anhidro. A esa solución se le añadieron 0,5 ml de N,N-diisopropiletilamina y 0,2 ml (0,89 mmol) de 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamidita. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se añadieron 0,5 ml de metanol para detener la reacción. La mezcla se lavó con solución saturada de bicarbonato sódico y se secó sobre sulfato sódico. El disolvente se retiró al vacío y en una columna rápida de gel de sílice con un 1% de metanol en cloruro de metileno que contenía gotas de trietilamina se obtuvieron 247 mg (91,3%) de la fosforamidita deseada 1-(4-(3-O-4,4'-dimetoxitritilpropoxi)-3-metoxi-6-nitrofenil)-1-O-((2-cianoetoxi)-diisopropilaminofosfino)etano.
R_{f} = 0,87 (diclorometano/metanol, 99/1).
Ejemplo 11 Síntesis de oligonucleótido
Los conjugados oligonucleotídicos que contenían un enlazador fotoescindible se prepararon mediante síntesis de ácido nucleico en fase sólida (véase: Sinha et al. Tetrahedron Lett. 1983, 24, 5843-5846; Sinha et al. Nucleic Acids Res., 1984, 12, 4539-4557; Beaucage et al. Tetrahedron 1993, 49, 6123-6194; y Matteucci et al. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 3185-3191) en condiciones estándar. Además se utilizó un largo periodo de acoplamiento para la incorporación de la unidad fotoescindible y el grupo amino 5' terminal. La eficacia de acoplamiento se detectó midiendo la absorbancia de liberación del catión DMT y los resultados indicaron una eficacia de acoplamiento comparable con la de la fosforamidita 1-(2-nitro-5-(3-O-4,4'-dimetoxitritilpropoxi)fenil)-1-O-((2-cianoetoxi)-diisopropilaminnofosfino)etano o 1-(4-(3-O-4,4'-dimetoxitritilpropoxi)-3-metoxi-6-nitrofenil)-1-O-((2-cianoetoxi)-diisopropilaminofosfino)etano con la de los fosforamidita nucleósidos habituales. La desprotección de la base protección y liberación de los conjugados de dicho soporte sólido se realizó con amónio concentrado a 55ºC durante una noche. La desprotección de la base y la protección de otros conjugados se realizó mediante la desprotección rápida con reactivos AMA. La purificación de los conjugados MMT-activado se realizó mediante HPLC (tritilo-activado) usando acetato de trietilamonio 0,1 M, pH 7,0 y gradiente de acetonitrilo (5% a 25% en 20 minutos). Se redujo el volumen del conjugado protegido MMT o DMT recogido, se destritiló con ácido acético acuoso al 80% (40 minutos, 0ºC), se desaló y se almacenó a -20ºC.
Ejemplo 12 Estudio de fotólisis
En un caso típico, 2 nmol de conjugado oligonucleotídico que contenía un enlazador fotoescindible en 200 \mul de agua destilada se irradió con una lámpara ultravioleta delongitud de onda larga (Blak Ray XX-15 UV lamp. Ultraviolet products, San Gabriel, CA) a una distancia de 10 cm (pico de emisión a 365 nm, intensidad de la lámpara = 1,1 mW/cm^{2} a una distancia de 31 cm). La mezcla resultante se analizó por HPLC (tritilo-desactivado) usando acetato de trietilamonio 0,1 M, pH 7,0 y un gradiente de acetonitrilo. El análisis mostró que el conjugado se escindía del engarce en pocos minutos tras la radiación ultravioleta.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: SEQUENOM, INC.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 11555 Sorrento Valley Road
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: San Diego
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: California
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 92212
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
INVENTOR/SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Maryanne J. O'Donnell
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 3855 Nobel Drive
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: San Diego
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: California
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 92122
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
INVENTOR/SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Charles r. Cantor
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 11 Bay State Road
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Boston
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: Massachusetts
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 02215
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
INVENTOR/SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Daniel P. Little
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 393 Glendale Lake rd.
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Patton
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: Pennsylvania
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 18668
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
INVENTOR/SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Hubert Köster
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 8636 Via Mallorca Drive
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: La Jolla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: California
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 92037
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS DE ALTA DENSIDAD Y SISTEMAS Y MÉTODOS PARA PREPARAR Y ANALIZAR ELEMENTOS DE UNA SERIE DE ANALITOS DE PEQUEÑO VOLUMEN
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 15
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Brown, Martin, Haller & McClain
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 1660 Union Street
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: San Diego
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: CA
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 92101-2926
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Ninguno
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: Attorney Docket Nº. 7352-2001PC
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 de noviembre de 1997
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: Attorney Docket Nº. 7352-2001B
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 8 de octubre de 1997
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/746.055
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 de noviembre de 1996
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/786.988
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 de enero de 1997
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/787.639
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 de enero de 1997
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Seidman, Stephanie L
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 33.779
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 7352-2001PC
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 619-238-0999
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 619-238-0062
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TELEX:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAATTCGAGC TCGGTACCCG G 
\hfill
21 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGGGTACCG AGCTCGAATT C 
\hfill
21 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCTTGGGA ACTGTGTAGT ATT 
\hfill
23 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 112 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGCTGTCTC TCTCCCTCTC TCATACACAC ACACACACAC ACACACACAC 
\hfill
60 
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACACACACAC TCACACTCAC CCACANNNAA ATACTACACA GTTCCCAAGA GG 
\hfill
112 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATACGACT CACTATAGGG CGAAGGCTGT CTCTCTCCCT CTCTCATAC 
\hfill
49 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 135 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATACGACT CACTATAGGG CGAAGGCTGT CTCTCTCCCT CTCTCATACA CACACACACA 
\hfill
60 
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACTCACACT CACCCACANN NAAATACTAC 
\hfill
120 
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACAGTTCCCA AGAGG 
\hfill
135 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATACTACAC AG 
\hfill
12 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGATGCGTC GGATCATCTT TTTT 
\hfill
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATGATCCGA CGCATCAGAA TGT 
\hfill
23 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCTAGCTG GGCCGAGCTA GGCCGTTGA 
\hfill
29 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGATGCGTC GGATCATCTT TTTTTTT 
\hfill
27 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATGATCCGA CG 
\hfill
12 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATGATCCGA CGCAT 
\hfill
15 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAAAAGATG AT 
\hfill
12 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCCGACGC AT 
\hfill
12 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGATGCGTC GGATCATC 
\hfill
18 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCTGGTACA CTGCCAGGCG CTTCTGCAGG TCATCGGCAT CGCGGAGGAG 
\hfill
50 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCTGGTACA CTGCCAGGCA CTTCTGCAGG TCATCGGCAT CGCGGAGGAG 
\hfill
50 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATGCCGATG ACCTGCAGAAG 
\hfill
21

Claims (60)

1. Un método para formar una serie de un material sobre una superficie de un sustrato y analizar el material en la serie, que comprende:
proporcionar una vesícula o una pluralidad de vesículas que comprenden un fluido que incluye;
sin poner en contacto la superficie con la vesícula, disponer la vesícula o la pluralidad de vesículas adyacentes a una primera posición o una primera pluralidad de posiciones en la superficie de un sustrato;
suministrar un volumen de nanolitros definido y controlado del fluido en la primera posición o en la primera pluralidad de posiciones de la superficie del sustrato formando de esta manera una serie de material sobre la superficie del sustrato; y
realizar un análisis de espectrometría de masas del material en cada posición de la serie,
donde, si sólo se proporciona una vesícula, entonces después de la etapa de suministrar un volumen de nanolitros definido y controlado del fluido y antes de realizar el análisis de espectrometría de masas, el método comprende además:
desplazar la vesícula hasta una pluralidad de posiciones adyacentes a la superficie del sustrato y suministrar un volumen de nanolitros definido y controlado del fluido en la pluralidad de posiciones, formando de esta manera una serie del material.
2. Un método de la reivindicación 1, en el que la vesícula comprende una cámara interior que contiene el fluido, y volumen de nanolitros definido y controlado del fluido se suministra proporcionando una presión mecánica al interior de la vesícula para inyectar un volumen de fluido de nanolitros desde la cámara.
3. Un método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el fluido comprende una matriz para espectrometría de masas.
4. Un método de la reivindicación 1 ó 2, en el que cada posición de la serie comprende una matriz para espectrometría de masas.
5. Un método de la reivindicación 4, en el que antes de la etapa de proporcionar una vesícula o pluralidad de vesículas que comprenden un fluido que incluye el material, la matriz se deposita en cada posición de la serie mediante un método que comprende:
proporcionar una vesícula o una pluralidad de vesículas que comprenden un fluido que incluye una matriz para espectrometría de masas;
disponer la vesícula o la pluralidad de vesículas adyacentes a una primera posición o una primera pluralidad de posiciones en la superficie de un sustrato sin poner en contacto la superficie del sustrato con la vesícula; y
suministrar un volumen de nanolitros definido y controlado del fluido en la primera posición o en la primera pluralidad de posiciones de la superficie del sustrato,
donde, si sólo se proporciona una vesícula, entonces después de la etapa de suministrar un volumen de nanolitros definido y controlado del fluido y antes de realizar el análisis de espectrometría de masas, el método comprende además:
desplazar la vesícula hasta una pluralidad de posiciones adyacentes a la superficie del sustrato y suministrar un volumen de nanolitros definido y controlado del fluido en la pluralidad de posiciones, formando de esta manera una serie de la matriz.
6. Un método de la reivindicación 2, en el que la vesícula comprende un elemento piezoeléctrico que proporciona la presión para inyectar el volumen de nanolitros del fluido desde la cámara.
7. Un método de la reivindicación 1, en el que la etapa de desplazar la vesícula incluye la etapa de arrastrar la vesícula a través de la superficie del sustrato.
8. Un método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la vesícula o pluralidad de vesículas es parte de un ensamblaje de vesículas que tiene una pluralidad de vesículas dispuestas en una serie para distribuir el fluido a una primera pluralidad de posiciones sobre la superficie del sustrato.
9. Un método de la reivindicación 8, que comprende además, antes de realizar el análisis de espectrometría de masas:
desplazar la vesícula a una pluralidad de posiciones adyacentes a la superficie del sustrato y administrar un volumen de nanolitros definido y controlado del fluido a la pluralidad de posiciones, en el que la etapa de desplazar la vesícula incluye una etapa de determinar una señal de desplazamiento representativa de una distancia para desplazar el ensamblaje de vesículas que contiene la vesícula a una posición próxima a la primera pluralidad de
posiciones.
10. Un método de la reivindicación 9, en el que la etapa de desplazar la vesícula incluye la etapa de desplazar el ensamblaje de vesículas sobre la superficie de sustrato y distribuir el fluido sobre el mismo para formar una serie de posiciones que tienen fluido inyectado sobre las mismas.
11. El método de la reivindicación 9, en el que la etapa de desplazar la vesícula incluye una etapa de determinar una señal de desplazamiento representativa de una distancia para desplazar el ensamblaje de vesículas que contiene la vesícula a una posición próxima a la primera pluralidad de posiciones.
12. Un método de la reivindicación 2, que incluye la etapa adicional de extraer un fluido de lavado en la cámara de la vesícula para enjuagar la cámara.
13. Un método de la reivindicación 2, que incluye la etapa adicional de poner en contacto la vesícula con una fuente de material fluido para llenar la cámara por acción capilar.
14. Un método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el sustrato comprende un material seleccionado entre el grupo compuesto por silicio, un metal, un plástico, una membrana, un material polimérico y un polímero injertado con
metal.
15. Un método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el sustrato en un material de sustrato funcionalizado químicamente.
16. Un método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el sustrato está funcionalizado con perlas.
17. Un método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el sustrato está funcionalizado con un material dendrítico.
18. El método de la reivindicación 1, en el que:
la vesícula es un aparato que comprende una pluralidad de vesículas dispuestas en la forma de una serie para distribuir un líquido desde las mismas, en el que cada vesícula tiene una cámara interior que contiene un fluido que incluye el material; y
la distribución se realiza aplicando presión para controlar que cada una de las cámaras inyecte un volumen de nanolitros del fluido desde cada vesícula sobre la superficie de un sustrato alineado con las vesículas, depositándose así una serie del fluido sobre la superficie del sustrato.
19. Un método de la reivindicación 18, que comprende además las etapas:
(a) alinear la pluralidad de vesículas en una segunda pluralidad de posiciones adyacentes a la superficie del sustrato;
(b) repetir la distribución aplicando presión para controlar que cada una de las cámaras inyecte un volumen de nanolitros del fluido desde cada vesícula sobre la superficie de un sustrato alineado con las vesículas, depositándose de esta manera una serie del fluido sobre la superficie del sustrato; y
(c) repetir opcionalmente las etapas (b) y (c) para distribuir el fluido en series de posiciones adicionales sobre la superficie del sustrato.
20. Un método de la reivindicación 18 ó 19, en el que el fluido comprende un disolvente y una matriz para espectrometría de masas.
21. Un método de la reivindicación 20, incluyendo la etapa adicional de esperar un periodo de tiempo predeterminado para permitir que el disolvente que comprende la matriz para espectrometría de masas se evapore del fluido inyectado sobre la superficie del sustrato dejando la matriz para espectrometría de masas depositada sobre la
superficie.
22. Un método de las reivindicaciones 18 ó 19, que comprende además distribuir un disolvente que comprende una matriz para espectrometría de masas en las mismas posiciones en las que se deposita el analito mediante un método que comprende:
alinear la pluralidad de vesículas en las mismas posiciones en las que se deposita el analito, conteniendo las cámaras de las vesículas un fluido que comprende el disolvente que incluye una matriz para espectrometría de masas;
\newpage
distribuir un volumen de nanolitros definido y controlado del fluido que comprende el disolvente que incluye una matriz para espectrometría de masas en cada una de las posiciones en las que se deposita el analito.
23. Un método de la reivindicación 19, en el que la etapa de alineamiento de la pluralidad de vesículas incluye la etapa de arrastrar las vesículas a través de la superficie del sustrato.
24. Un método de la reivindicación 19 en el que la etapa de alineamiento de la pluralidad de vesículas incluye la etapa de determinar una señal de desplazamiento representativa de una distancia para desplazar dichas vesículas para alinearlas en una posición adyacente a la primera pluralidad de posiciones.
25. Un método de la reivindicación 18, que incluye la etapa adicional de extraer un fluido de lavado en las cámaras para enjuagar las cámaras.
26. Un método de la reivindicación 18, en el que:
cada vesícula tiene una cámara con una perforación suficientemente estrecha para permitir que la cámara se llene con un fluido por acción capilar; y
las vesículas se ponen en contacto con una fuente de fluido hasta que se llenen, al menos parcialmente, las cámaras con un volumen de fluido mediante acción capilar.
27. Un método de la reivindicación 26, en el que:
las cámaras de las vesículas se conectan a una fuente de presión; y
se aplica una presión positiva desde una fuente de presión a la cámara para desplazar parcialmente un volumen de fluido que llena la cámara por acción capilar.
28. Un método de la reivindicación 18, en el que:
las cámaras de las vesículas se conectan a una fuente de presión que aplica una presión negativa a la cámara;
el fluido se introduce en las vesículas por contacto con una fuente de fluido con cámaras al menos parcialmente llenas con un volumen de fluido por presión negativa.
29. Un método de la reivindicación 18, en el que el sustrato comprende material seleccionado entre el grupo constituido por sílice, vidrio, celulosa, silicio, metal, plástico, polímero y polímero injertado con metal.
30. Un método de la reivindicación 18, en el que la superficie del sustrato está funcionalizada químicamente, funcionalizada con perlas o funcionalizada con dendritas de material capturado.
31. Un método de la reivindicación 18, en el que:
las cámaras de las vesículas se conectan a una fuente de presión; y
controlar que las vesículas inyectan el fluido por la aplicación de una presión positiva a las cámaras de la vesículas mediante una fuente de presión.
32. Un método de las reivindicaciones 18 ó 31, en el que la presión en la cámara de la vesícula es suficiente para dar como resultado la inyección de un pulverizado del fluido desde la vesícula.
33. Un método de las reivindicaciones 18 ó 31, en el que la presión en la cámara de la vesícula se selecciona para que de como resultado la inyección de gotas de fluido desde la vesícula.
34. Un método de la reivindicación 18, en el que cada vesícula comprende un ensamblaje que tiene un elemento capilar para dirigir el fluido hacia la superficie del sustrato y un elemento transductor para aplicar presión a la vesícula para distribuir el fluido.
35. Un método de la reivindicación 34, en el que el elemento transductor se selecciona entre el grupo constituido por transductores piezoeléctricos, eléctricos, electro-restrictivos, magneto-restrictivos y electromecánicos.
36. El método de la reivindicación 1, que es robótico.
37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-36, en el que la superficie del sustrato que comprende la serie de material es plana.
38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-37, en el que el fluido comprende un oligonucleótido.
39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-38, en el que el volumen de nanolitros es un volumen de subnanolitros e inferiores.
40. Un sustrato que comprende una superficie que incluye un material depositado en una pluralidad de posiciones del mismo, en el que:
el material comprende una matriz para el análisis por espectrometría de masas, y
el material depositado está en una cantidad que resulta de la deposición de un volumen de nanolitros definido y controlado que contiene el material sobre la superficie.
41. El sustrato de la reivindicación 40, en el que:
el material depositado en una pluralidad de posiciones en la superficie del sustrato forma una serie de manchas sobre el mismo; y
las características de cada mancha resultante de la deposición del material son reproducibles en la serie de manchas.
42. El sustrato de la reivindicación 40, en el que el material comprende la matriz para realizar la espectrometría de masas por desorción con láser asistida por matriz (MALDI) o la matriz para espectrometría de masas y un ácido nucleico.
43. El sustrato de la reivindicación 40 ó 41, en el que el volumen distribuido es de 0,2-20 nl.
44. El sustrato de la reivindicación 40 ó 41, en el que el volumen de nanolitros es un volumen de volumen de subnanolitros e inferiores.
45. Un sustrato de la reivindicación 40, en el que la pluralidad de posición comprende una serie.
46. Un sustrato de la reivindicación 40, que comprende gel de sílice, un vidrio de porosidad controlada, un material magnético, dextranos reticulados, agarosa, celulosa, vidrio, metal, plástico, una membrana, material polimérico, silicio o un polímero injertado con metal.
47. Un sustrato de la reivindicación 46, en el que el metal se selecciona entre el grupo constituido por acero, oro, plata, aluminio y cobre.
48. Un sustrato de la reivindicación 40, seleccionado entre el grupo constituido por capilares, un capilar, soportes planos y membranas.
49. Un sustrato de la reivindicación 40, que comprende silicio.
50. Un sustrato de la reivindicación 49, que es una oblea de silicio.
51. Un sustrato de la reivindicación 48, en el que la membrana comprende polietileno, polipropileno, poliamida o difluoruro de polivinilideno.
52. Un sustrato de la reivindicación 40, en el que la superficie del sustrato está funcionalizada químicamente, funcionalizada con perlas o funcionalizada con árboles dendríticos de material capturado.
53. El sustrato de la reivindicación 40, en el que las posiciones están distanciadas aproximadamente 500 \mum.
54. El sustrato de la reivindicación 40 que comprende una superficie plana hidrófila.
55. El sustrato de la reivindicación 40, en el que el material matricial en cada posición forma una estructura cristalina.
56. El sustrato de la reivindicación 40, en el que la superficie sobre la que se deposita el material es plana.
57. El sustrato de la reivindicación 40, en el que el material se deposita en pocillos dispuestos en la superficie del sustrato.
58. El sustrato de la reivindicación 40, que comprende una serie de boquillas, en el que el material se deposita en el extremo de la boquilla.
59. El sustrato de la reivindicación 40 que es menor de (25,4)^{2} mm^{2}.
60. El sustrato de la reivindicación 40 que es 12 x 12 mm, 15 x 15 mm, 18 x 18 mm o 20 x 20 mm.
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