JP5036042B2 - 質量分析サンプルの調製方法、リボ核酸のイオン化方法、リボ核酸の質量分析方法、及び細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法 - Google Patents
質量分析サンプルの調製方法、リボ核酸のイオン化方法、リボ核酸の質量分析方法、及び細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法 Download PDFInfo
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Description
図2に示すフローチャートを参照して、第1の実施例に係る質量分析サンプルの調製方法について説明する。
超純水を溶媒とし、3-ヒドロキシピコリン酸を50mg/ml、25mg/ml及び10mg/mlのそれぞれの濃度で、アセトニトリルを50%(v/v)、25%(v/v)及び10%(v/v)のそれぞれの濃度で含む9種のマトリックス溶液を調整した。また超純水を溶媒とし、クエン酸アンモニウムの濃度が50mg/ml、25mg/ml及び10mg/mlの3種の添加剤溶液を調整した。なお9種のマトリックス溶液及び3種の添加剤溶液のそれぞれは、体積濃度0.1%(v/v)でトリフルオロ酢酸を含む。
第1の実施例と同じサンプル溶液及び添加剤溶液を準備した。次に第1の実施例と同じ有機合成された19塩基RNAを超純水で溶解し、19塩基RNAの濃度が1,000×10-9mol/l、500×10-9mol/l、100×10-9mol/l、50×10-9mol/l、25×10-9mol/l、12.5×10-9mol/l、及び6.25×10-9mol/lの7種類のサンプル溶液を調製した。その後、第1の実施例と同様にサンプルプレート上に第1マトリックス層、第2マトリックス層、サンプル層、及び添加剤層を形成し、第3の実施例に係る質量分析サンプルを得た。
まずアセトニトリルを体積濃度が25%(v/v)となるよう超純水で希釈した。次に希釈されたアセトニトリルにクエン酸アンモニウムを濃度が50×10-3mol/lとなるように加え、さらに3-ヒドロキシピコリン酸を飽和するまで加えて、第1の比較例に係るマトリックス溶液を得た。次に第1の比較例に係るマトリックス溶液をサンプルプレート上に0.5μl滴下して乾燥させ、第1の比較例に係る結晶マトリックス層を形成させた。その後、第3の実施例と同様に調製された0.5μlのサンプル溶液をマトリックス層上に滴下し乾燥させて、第1の比較例に係る質量分析サンプルを得た。
まず濃度が100%のアセトニトリルに2,4,6-トリヒドロキシアセトフェノン(フルカ社)を濃度が250×10-3mol/lとなるように加え、第2の比較例に係るマトリックス溶液を得た。次にクエン酸アンモニウムを濃度が300×10-3mol/lとなるよう超純水で溶解し、第2の比較例に係る添加剤溶液を得た。その後、マトリックス溶液と添加剤溶液とを1:1の割合で混合して第1の混合液を得た。さらに第1の混合液と第3の実施例と同じサンプル溶液とを1:1で混合し、第2の混合液を得た。その後、サンプルプレート上に第2の比較例に係るマトリックス溶液を0.5μl滴下して乾燥させ、第2の比較例に係る結晶マトリックス層を形成させた。さらに結晶マトリックス層上に1μlの第2の混合液を滴下し乾燥させて、第2の比較例に係る質量分析サンプルを得た。
配列がAUCAUCAUCGの有機合成RNAを超純水で溶解し、有機合成RNAの濃度が1×10-6mol/lのサンプル溶液を調製した。また第1の実施例と同じマトリックス溶液とサンプル溶液を調製した。次に第1の実施例に係る質量分析サンプルの調製方法と同様に質量分析サンプルを調製した。なおサンプル溶液を0.5μl滴下したので、サンプルプレート上の有機合成RNAの全物質量は500×10-15molであった。その後、質量分析サンプルを、株式会社島津製作所製の四重極イオントラップ型MALDI-TOF-MS装置でMS/MS分析した。なおプリカーサイオンの開裂にはアルゴンガスを用いた。MALDI-TOF-MS装置の測定パラメータは、チューニングモードをネガティブに、スペクトルデータの取り込み周期を5Hzに設定した。またレーザの照射強度を調節するパラメータを115〜120(無単位)に、スペクトルデータの積算数を200に、レーザのショット回数を2回に、測定レンジを中(Middle)に設定した。またアルゴンガスとプリカーサイオンの衝突エネルギを調節するパラメータであるCIDコントロールを120に設定した。
マウスの肝臓細胞から、ホモジナイザを用いたAGPC(acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)法により、 rRNA、tRNA、及びmRNAを含む全RNA(total RNA)を抽出した。次に抽出した全RNAをフィルタ膜(ミリポア社、YM-100)でろ過し、低分子量のRNA画分を粗精製した。さらに低分子量のRNA画分をポリアクリルアミドの濃度が15%(w/v)のゲルに電気泳動させた。その後、20塩基のRNAが泳動される位置のゲルを切り出し、切り出されたゲルを溶出して、miRNAの粗精製画分を得た。次にmiRNAの粗精製画分をエタノールで沈殿させ、沈殿したmiRNAを超純水で溶解することにより、濃度2.4×10-6mol/lでmiRNAを含む第5の実施例に係るサンプル溶液を調製した。また第1の実施例と同じマトリックス溶液と添加剤溶液を調製した。
図58に示すフローチャートを参照して、第6の実施例に係る質量分析サンプルの調製方法について説明する。
本明細書の配列表に記載された配列番号1乃至4は、以下の配列を示す。
11…イオン化部
12…イオントラップ部
13…飛行時間分析部
14…制御部
21…第1マトリックス層
22…第2マトリックス層
23…サンプル含有層
23…有機合成
24…サンプル添加剤含有層
111…サンプルプレート
112…レーザ光源
113…イオンレンズ
121…第1のエンドキャップ電極
122…イオントラップ空間
123…第2のエンドキャップ電極
124…リング電極
125…リフレクタ電極
131…検出器
Claims (16)
- 10乃至50mg/mlの濃度で3−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分に前記マトリックス溶液を更に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が2回供給され乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させるステップ
とを含むことを特徴とする質量分析サンプルの調製方法。 - 10乃至50mg/mlの濃度で3−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させるステップ
とを含むことを特徴とする質量分析サンプルの調製方法。 - 前記マトリックス溶液の溶媒が、水及びアセトニトリルを含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の質量分析サンプルの調製方法。
- 前記マトリックス溶液における前記アセトニトリルの体積濃度が10乃至50%であることを特徴とする請求項3に記載の質量分析サンプルの調製方法。
- 前記添加剤溶液における前記クエン酸アンモニウムの濃度が10乃至50mg/mlであることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1項に記載の質量分析サンプルの調製方法。
- 1回目の前記マトリックス溶液の供給量、2回目の前記マトリックス溶液の供給量、前記サンプル溶液の供給量、及び前記添加剤溶液の供給量が同じであることを特徴とする請求項1に記載の質量分析サンプルの調製方法。
- 10乃至50mg/mlの濃度で3−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分に前記マトリックス溶液を更に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が2回供給され乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、前記リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップ
とを含むことを特徴とするリボ核酸のイオン化方法。 - 10乃至50mg/mlの濃度で3−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させるステップと、
前記添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、前記リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップ
とを含むことを特徴とするリボ核酸のイオン化方法。 - 10乃至50mg/mlの濃度で3−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分に前記マトリックス溶液を更に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が2回供給され乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、前記リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップと、
前記リボ核酸のプロトン脱離イオンの飛行時間を測定し、前記リボ核酸のプロトン脱離イオンの質量電荷比を測定するステップ
とを含むことを特徴とするリボ核酸の質量分析方法。 - 10乃至50mg/mlの濃度で3−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分にリボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させるステップと、
前記添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、前記リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップと、
前記リボ核酸のプロトン脱離イオンの飛行時間を測定し、前記リボ核酸のプロトン脱離イオンの質量電荷比を測定するステップ
とを含むことを特徴とするリボ核酸の質量分析方法。 - 前記3−ヒドロキシピコリン酸の濃度が25乃至50mg/mlであることを特徴とする請求項9又は10のいずれか1項に記載のリボ核酸の質量分析方法。
- 前記プロトン脱離イオンの価数が2であることを特徴とする請求項11に記載のリボ核酸の質量分析方法。
- 細胞から低分子リボ核酸を抽出するステップと、
10乃至50mg/mlの濃度で3−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分に前記マトリックス溶液を更に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が2回供給され乾燥した部分に前記低分子リボ核酸を含むサンプル溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記サンプル溶液が乾燥した部分にクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給し乾燥させるステップと、
前記添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、前記低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップと、
前記低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンの飛行時間を測定し、前記低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンの質量電荷比を測定するステップ
とを含むことを特徴とする細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法。 - 細胞から低分子リボ核酸を抽出するステップと、
10乃至50mg/mlの濃度で3−ヒドロキシピコリン酸を含むマトリックス溶液をサンプルプレート上に供給し乾燥させるステップと、
前記マトリックス溶液が乾燥した部分に前記低分子リボ核酸を含むサンプル溶液を供給し、さらにクエン酸アンモニウムを含む添加剤溶液を供給して乾燥させるステップと、
前記添加剤溶液が乾燥した部分にレーザを照射し、前記低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンを生成させるステップと、
前記低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンの飛行時間を測定し、前記低分子リボ核酸のプロトン脱離イオンの質量電荷比を測定するステップ
とを含むことを特徴とする細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法。 - 前記低分子リボ核酸が非コードRNAであることを特徴とする請求項13又は14に記載の細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法。
- 前記非コードRNAがマイクロRNAであることを特徴とする請求項15に記載の細胞由来の低分子リボ核酸の質量分析方法。
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