DE10027794A1

DE10027794A1 - Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Info

Publication number: DE10027794A1
Application number: DE10027794A
Authority: DE
Inventors: Elmar Heinzle; Min-Jung Kang; Andreas Tholey; Klaus Hollenmeyer; Bernhard Hauer
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2000-06-07
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2001-12-13
Also published as: AU2001281809A1; JP2003536070A; WO2001094924A2; EP1287343A2; WO2001094924A3; US20030164449A1; CA2411727A1; US7445885B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen von nichtpolymeren Edukten zu nichtpolymeren Produkten mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie, bevorzugt in Gegenwart eines internen Standards auf einem speziellen Trägermaterial.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen von nichtpolymeren Edukten zu nichtpolymeren Produkten mit Hilfe der MALDI-TOF-Massen spektrometrie bevorzugt in Gegenwart eines internen Standards auf einem speziellen Trägermaterial.

Der Erfolg beim Screenen nach neuen enzymatischen Reaktionen hängt im großen Ausmaß vom Zufall ab. In einem solchen Screening müssen sehr viele Organismen nach der gewünschten enzymatischen Aktivität durchgemustert werden, bis die gewünschte Enzym aktivität gefunden wird. Für das Screening dieser Enzym aktivitäten sind daher schnelle, einfache, hochempfindliche und hochspezifische Analysenverfahren erforderlich.

Ein Hauptproblem beim Screening nach neuen enzymatischen Aktivitäten ist die rasche und einfache Identifizierung der in der enzymatischen Reaktion entstehenden Produkte und/oder gegebenenfalls die Abnahme des eingesetzten Edukts. In der Regel werden zur Analyse der Produkte Trennverfahren wie die Dünn schichtchromatographie (= DC), die Hochdruckflüssigkeitschromato graphie (= HPLC) oder die Gaschromatographie (= GC) verwendet. Auch Verfahren wie NMR, die nach einer Aufarbeitung über zum Beispiel Salzfällung und/oder anschließender Chromatographie anwendbar sind, können zur Analyse verwendet werden. Diese Verfahren sind zeitaufwendig und lassen nur einen beschränkten Probendurchsatz zu, so daß derartige Analysenverfahren im sogenannten High-Throughput-Screening (= HTS), bei dem zu nächst nach der gewünschten Reaktion gescreent wird, keine Anwendung finden. Von Vorteil bei diesen Methoden ist, daß sie Informationen sowohl über Produkt als auch gegebenenfalls über die Abnahme des Edukts liefern.

Um einen höheren Probendurchsatz im HTS zu ermöglichen, werden vielfach indirekte, leicht meßbare Verfahren wie Farbreaktionen im sichtbaren Bereich, Trübungsmessungen, Fluoreszenz, Leitfähig keitsmessungen etc. verwendet. Diese sind zwar im Prinzip sehr empfindlich, aber auch störanfällig. Von Nachteil hierbei ist vor allem, daß bei diesem Vorgehen viele falsch positive Proben analysiert werden und da es sich um indirekte Nachweisverfahren handelt, keine Informationen über Produkt und/oder Edukt vor liegen. Um diese falsch Positiven beim weiteren Vorgehen aus schließen zu können, werden in der Regel weitere Analysen verfahren nach dem ersten Screening wie beispielsweise DC, HPLC oder GC verwendet. Dies ist wiederum sehr zeitaufwendig.

Generell kann gesagt werden, daß die Verbesserung der Empfind lichkeit und der Aussagekraft der Detektionsverfahren bezüglich der Reaktionsprodukte zu einer Verlangsamung in der Geschwindig keit eines Tests führt.

MALDI-TOF-MS (= Matrix-unterstützte Laserdesorption-Ionisation mit time-of-flight-Massenspektrometrie) stellt ein rasches und einfaches Verfahren dar, das breit für die Analyse von großen, nichtflüchtigen Biomolekülen wie im besonderen Peptiden, Proteinen, Oligonukleotiden und Oligosacchariden oder sonstigen Polymeren Anwendung findet. Auch hochmolekulare Materialien wie Kohleteer, Huminsäure, Fulvinsäure oder Kerogene wurden mit MALDI analysiert (Zenobie and Knochenmus, Mass Spec. Rev., 1998, 17, 337-366).

Ein Problem bei der MALDI-MS ist die Quantifizierung der Meßergebnisse, dies liegt daran, daß die Signalintensität in hohem Maße von der Homogenität der aufgegebenen Probe und der Bestrahlungsdichte des Lasers abhängt (Ens et al., Rapid Commun. Mass Spectrom, 5, 1991: 117-123), wobei die Intensität in erster Näherung exponentiell mit steigender Laserenergie ansteigt (Ens et al., Rapid Commun. Mass Spectrom, 5, 1991: 117-123). Wird die Signalintensität zu hoch, so kann es unter Umständen zu einer Sättigung des Signals am Detektor kommen, was eine Quantifizierung ebenfalls ausschließt. Neben diesen physikalisch- technisch-bedingten Problemen gibt es weitere Gründe, welche eine quantitative Auswertung von MALDI-Messungen erschweren. So können beispielsweise Fragmente der gesuchten Ionen oder Moleküladdukte auftreten. Das größte Problem bei der quantitativen MALDI-MS stellt jedoch die Inhomogenität der Proben dar. Die Qualität eines MALDI-Spektrums ist in starkem Maße von der Morphologie der untersuchten Probe abhängig (Garden & Sweedler, Anal. Chem. 72, 2000: 30-36). Dabei können signifikante Unterschiede in Bezug auf das Auftreten von Signalen, die Intensität, die Auflösung und die Massengenauigkeit beobachtet werden, sobald man eine MALDI-Probe an verschiedenen Stellen untersucht (Cohen & Chait, Anal. Chem., 68, 1996: 31-37; Strupat et al., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 111, 1991: 89-102; Amado et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 1997: 1347-1352). Diese Inhomogenitäten beruhen auf einer ungleichen Verteilung von Matrix und Analyt auf dem Probentarget, was durch das ungleiche Kristallisationsverhalten dieser beiden Komponenten verursacht wird. Um diese Inhomogeni täten zu beseitigen oder zu minimieren - was gleichbedeutend mit der Bildung einer mikrokristallinen, homogenen Probentopologie ist - wurde bereits eine Reihe von Vorschlägen erarbeitet. Diese beinhalten beispielsweise die Verwendung von Comatrices (Gusev et al., Anal. Chem., 67, 1995: 1034-1041), Multi-Layer- Präparationen, die Verwendung von Lösungsmittelgemischen und Elektrospray-Präparationen (Hensel et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 1997: 1785-1793) (eine Zusammenstellung dieser Versuche findet sich in der Referenz von Garden & Sweedler, Anal. Chem. 72, 2000: 30-6). All diese Ansätze haben jedoch Limitierungen und sind deshalb nicht breit anwendbar. Die Quantifizierung ist deshalb nach wie vor ein Problem.

Für die MALDI (= Matrix-unterstützte Laserdesorption-Ionisation) werden die Proben in der Regel in dünner Schicht auf eine Metalloberfläche aufgebracht und dann mit einem gepulsten Laser bestrahlt. Über eine Fokussierung der emittierten Ionen kann die Auflösung der Massenspektren im unteren Massenbereich bis etwa 5000 D erhöht werden.

Duncan et al. (Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 7, 1993: 1090-1094) beschreibt die Analyse der niedermolekularen polaren Verbindungen 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Acetylcholin und des Peptids Ac-Ser-Ile-Arg-His-Tyr-NH₂ mit Hilfe von MALDI in Gegenwart der entsprechenden über ¹³C bzw. ²H markierten Ver bindungen bzw. über ein ähnliches Peptid als interner Standard.

Von Goheen et al. (J. Mass Spec., Vol. 32, 1997: 820-828) wird die Verwendung von MALDI-TOF-MS zur Analyse der folgenden nieder molkularen Verbindungen beschrieben:
Zitronensäure, Propionsäure, Buttersäure, Oxalsäure und Stearin säure, Ethylendiamintetraessigsäure (= EDTA), N-(2-hydroxyethyl)- ethylendiamintriessigsäure (= HEDTA), Ethylendiamine-N,N'-di essigsäure (= EDDA) und Nitrilotriessigsäure (= NTA) sowie Sulfat-, Nitrat-, Nitrit- und Phosphat-Salze. Als Matrix in allen Experimenten wird 2,5-Dihydroxybenzoesäure verwendet.

Von Nachteil bei beiden Methoden ist, daß sie nur für die Messung von Reinsubstanzen geeignet sind. Diese Problematik wird in der Diskussion von Duncan et al. angesprochen, dort wird zur Über windung dieser Schwierigkeit die Reinigung der Meßproben vor geschlagen.

Insgesamt ist die MALDI-TOF-MS jedoch eine interessante ein fache und rasche Methode, die spezifische Informationen über die analysierten Substanzen gibt, so daß die Verwendung der MALDI- TOF-MS zur Messung von enzymatischen Reaktionen mit nieder molekularen Substanzen wünschenswert wäre. Speziell wäre ihre Verwendung im High-Throughput-Screening wünschenswert.

Es bestand daher die Aufgabe, ein Verfahren zur Analyse Enzym- katalysierter Reaktionen unter Verwendung der MALDI-TOF-Massen spektrometrie zu entwickeln.

Diese Aufgabe wurde ein Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen von nichtpolymeren Edukten zu nichtpolymeren Produkten gelöst, dadurch gekennzeichnet, daß das Edukt und Produkt der Enzym-katalysierten Umsetzung mit Hilfe der MALDI- TOF-Massenspektrometrie analysiert wird, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Enzym-katalysierte Umsetzung eines nichtpolymeren Edukts zu einem nichtpolymeren Produkt,
b) Analyse des Edukts oder Produkts oder des Edukts und Produkts während oder nach der Enzym-katalysierten Umsetzung (a) mit der MALDI-TOF-Massenspektroskopie.

Unter Enzym-katalysierten Umsetzungen sind enzymatische Reaktionen mit ganzen Zellen zu verstehen, die pflanzlichen, tierischen, bakteriellen oder pilzlichen Ursprungs sein können, auch Hefezellen sind geeignet. Die enzymatische Umsetzung kann mit ruhenden, wachsenden, permeabilisierten oder immobilisierten Zellen bzw. Mikroorganismen erfolgen. Auch Enzyme sind für die Enzym-katalysierte Umsetzung geeignet. Diese Enyzme können noch in den permeabilisierten Zellen oder Mikroorganismen enthalten sein oder aber in sogenannten Rohextrakten vorhanden sein. Für eine raschere und in der Regel auch Nebenprodukt freiere Umsetzung werden angereinigte oder gereinigte Enzyme verwendet, die in der Umsetzung als freie oder immobilisierte Enzyme ver wendet werden können. Bevorzugt wird die Reaktion mit freien, angereinigten, gereinigten oder immobilisierten Enzymen durch geführt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorteilhaft Enzyme der Enzymklassen 1 bis 6 (International Union of Biochemistry and Molecular Biology = IUB) verwendet, bevorzugt werden die Enzym klassen 1 bis 4, besonders bevorzugt die Enzymklasse 3 wie die Klassen 3.1 (Reaktion mit Esterbindungen), 3.2 (Glycosidasen), 3.3 (Reaktion mit Etherbindungen), 3.7 (Reaktion mit Kohlenstoff- Kohlenstoff-Bindungen), 3.11 (Reaktion mit Kohlenstoff-Phosphor bindungen), ganz besonders bevorzugt sind Enzyme wie Lipasen, Esterasen oder Phosphatasen wie Phytasen. Weitere vorteilhafte Enzyme sind in der Enzymklasse 6 zu finden.

Nichtpolymere Edukte und nichtpolymere Produkte im erfindungs gemäßen Verfahren sind Verbindungen, die vor allem keine Peptide, Proteine, Oligo- oder Polynukleotide oder Oligo- oder Poly saccharide oder künstliche oder natürliche Polymere sind. Diese nichtpolymeren Edukte oder nichtpolymeren Produkte haben eine Molmasse von kleiner 1000 D (= Dalton), bevorzugt kleiner 800 D, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 D.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können neben der Analyse von Edukt und Produkt in der Reaktion vorteilhaft Enzym reaktionen verfolgt werden, das heißt es können Enzymkinetiken aufgestellt werden. Weiter kann der K_m-Wert, der V_max-Wert, die Selektivität des Enzyms, die Ausbeute der Reaktion bestimmt werden sowie die Auswirkung von Inhibitoren auf die Enzymreaktion verfolgt werden. Auch können mögliche Reaktionsparameter wie die Temperatur oder der pH auf die Enzym-katalysierte Reaktion unter sucht werden.

Eine Reinigung der Reaktionslösungen des erfindungsgemäßen Verfahrens vor der Analyse mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist nicht erforderlich. Die Reaktion kann direkt gemessen werden. Dies gilt auch für komplexe Probengemische. Auch müssen für die Reaktion keine Reinsubstanzen verwendet werden, obwohl dies natürlich möglich ist.

Vorteilhaft können Edukte und/oder Produkte, die im MALDI-TOF-MS nur schlecht oder gar nicht nachweisbar sind vor der Analyse derivatisiert werden (siehe Beispiele) und so schließlich analysiert werden. Die Derivatisierung kann vor oder nach der enzymatischen Reaktion erfolgen. Eine Derivatisierung ist besonders vorteilhaft in Fällen, in denen in hydrophobe bzw. flüchtige Verbindungen beispielsweise wie Ester, Amide, Lactone, Aldehyde, Ketone, Alkohole etc. hydrophile Gruppen eingeführt werden, die vorteilhaft noch eine ionisierbare Funktionalität tragen. Beispiele für derartige Derivatisierungen sind Umsetzungen von Aldehyden oder Ketonen zu Oximen, Hydrazonen oder deren Derivaten oder Alkoholen zu Estern beispielsweise mit symmetrischen oder gemischten Anydriden. Dies erweitert das Nach weisspektrum des Verfahrens signifikant. Die Derivatisierung nach Ablauf der enzymatischen Umsetzung ermöglicht die direkte Messung des Originalsubstrats der enzymatischen Reaktion. Durch die Verwendung der MALDI-TOF-MS können dadurch auch Substanzen analysiert werden, die keinen Chromophor enthalten. Dies ist gegenüber anderen Verfahren ein erheblicher Vorteil, da für beispielsweise übliche Detektionsverfahren beispielsweise über eine visuelle Erkennung in der Regel artifizielle Substrate, die beispielsweise einen Chromophor enthalten, verwendet werden müssen. Diese führen bei einer Optimierung auf diese Reaktion möglicherweise nicht zu einer Verbesserung der gewünschten natürlichen enzymatischen Umsetzung, da die Optimierung dieser artifiziellen Reaktion nicht die natürlichen Verhältnisse wider spiegelt.

Vorteilhaft wird im erfindungsgemäßen Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Reaktionen ein interner Standard zugesetzt. Dieser interne Standard ermöglicht vorteilhaft die Quanti fizierung der niedermolekularen Verbindungen in der Reaktions lösung. Dieser Standard kann der Enzym-katalysierten Umsetzung vor Beginn, während oder nach Abschluß der enzymatischen Reaktion zugesetzt werden. Edukt und Produkt oder gegebenenfalls weitere Zwischenprodukte der Reaktion können so analysiert und letztlich quantifiziert werden. Die Zwischenprodukte sind letztlich auch als Produkte des zu Beginn der Reaktion eingesetzten Edukts zu verstehen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können demnach auch Enzymreaktionen verfolgt bzw. analysiert werden, die auf einanderfolgende Reaktionen katalysieren. Diese können durch ein Enzym oder durch mehrere Enzyme katalysiert werden. Auch Neben produkte können analysiert werden.

Als internen Standard werden vorteilhaft markierte Substanzen verwendet, prinzipiell sind aber auch den Edukten und/oder Produkten ähnliche chemische Verbindungen als interner Standard geeignet. Derartige ähnliche chemische Verbindungen sind bei spielsweise sogenannten Verbindungen einer homologen Reihe, deren Mitglieder sich nur durch beispielsweise eine zusätzliche Methylengruppe unterscheiden. Als interner Standard werden bevor zugt durch mindestens ein Isotop ausgewählt aus der Gruppe ²H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³³S, ³⁴S, ³⁶S, ³⁵Cl, ³⁷Cl, ²⁹Si, ³⁰Si, ⁷⁴Se Oder deren Mischungen markiertes Edukt, Produkt oder eine weitere markierte chemische Verbindung verwendet. Vorteilhaft wird das Edukt durch mindestens ein Isotop ausgewählt aus der ²H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³³S ³⁴S, ³⁶S, ³⁵Cl, ³⁷Cl, ²⁹Si, ³⁰Si, ⁷⁴Se oder deren Mischungen markiert. Bevorzugt wird aus Kostengründen und aus Gründen der Zugänglichkeit ²H oder ¹³C als Isotop verwendet. Diese internen Standard brauchen für die Analyse nicht komplett, das heißt vollmarkiert zu sein. Eine Teilmarkierung ist völlig aus reichend. Ein Abstand der Markierung von größer/gleich 3 Dalton bis kleiner/gleich 10 Dalton ist vorteilhafterweise ausreichend. Eine Messung ist aber auch unter 3 Dalton oder über 10 Dalton prinzipiell möglich, wobei aber bei kleinen Abständen eventuell Überlagerungen mit den Isotopen des Analyten oder bei größeren Abständen eventuell Isotopeneffekte auftreten können. Dies erschwert die Messungen macht sie aber nicht unmöglich. Vorteil haft wird auch im Falle eines markierten internen Standards eine Substanz gewählt, die eine möglichst hohe Homologie, das heißt strukturelle Ähnlichkeit, zu der zu messenden chemischen Verbindung hat. Je höher die strukturelle Ähnlichkeit ist, desto besser sind die Meßergebnisse und desto genauer kann eine Quantifizierung der Verbindung erfolgen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren und besonders für die Quantifizierung der in der Reaktion vorhandenen Edukte, Produkte, Zwischenprodukte oder Nebenprodukte ist es vorteilhaft, den internen Standard in einem günstigen Verhältnis zu dem zu messenden Edukt, Produkt, Zwischenprodukt oder Nebenprodukt ein zusetzen. Verhältnisse von Analyt (= zu bestimmende Verbindung) zu internem Standard größer 1 : 15 führen zu keiner Verbesserung der Meßergebnisse, sind jedoch prinzipiell möglich. Vorteilhaft wird ein Verhältnis von Analyt zu internem Standard in einem Bereich von 0,1 bis 15 eingestellt, bevorzugt in einem Bereich von 0,5 bis 10, besonders bevorzugt in einem Bereich von 1 bis 5.

Vorteilhaft werden die Analysenproben auf einen möglichst kleinen Raum bzw. auf einen möglichst kleinen Durchmesser konzentriert, um eine weitere Verbesserung der Meßpunktsauflösung bzw. Meß genauigkeit zu erreichen.

Die Reaktionsproben im erfindungsgemäßen Verfahren können manuell oder vorteilhaft automatisch mit üblichen Laborrobotern vor bereitet werden. Auch die Analyse mit MALDI-TOF-MS kann manuell oder vorteilhaft automatisch durchgeführt werden. Durch die Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die MALDI- Massenspektrometrie vorteilhaft zum schnellen Screening Enzym- katalysierter Reaktionen im sogenannten High-Throughput-Screening verwendet werden. Dabei zeichnet sich die MALDT-TOF-MS durch eine hohe Empfindlichkeit bei geringstem Probenverbrauch aus. Mit Methode können als rasch neue Enzymaktivitäten sowie neue Mutanten bekannter Enzyme nach einer Mutagenese beispielsweise über nach einer klassischen Mutagenese mit chemischen Agentien wie NTG, Strahlung wie UV-Strahlung oder Röntgenstrahlung oder nach einer sogenannten site-directed mutagenesis, PCR-Mutagenese oder dem sogenannten gene shuffling gefunden werden.

Vorteilhaft werden für das erfindungsgemäße Verfahren Träger materialien mit einem Rauhigkeitswert bzw. einer Rauhigkeitszahl von R_z größer 1, bevorzugt größer 2, besonders bevorzugt größer 3, ganz besonders bevorzugt größer 4 verwendet. Dabei bedeutet R_z die gemittelte Rauhtiefe (µm) als arithmetisches Mittel aus den Einzelrauhtiefen fünf aneinandergrenzenden Einzelmeßstrecken. Die Rauhtiefe wird nach DIN 4768 ermittelt. Diese Trägermaterialien sind polierte, beschichtete oder bedampfte Trägermaterialien oder polierte und beschichtete oder polierte und bedampfte Träger materialien. Die Träger bestehen aus einem Material ausgewählt aus der Gruppe Glas, Keramik, Quarz, Metall, Stein, Kunststoff, Gummi, Silicium, Germanium oder Porzellan. Bevorzugt besteht das Material aus Metall oder Glas.

Zur Ermittlung weiterer Analysendaten kann im erfindungsgemäßen Verfahren die Analyse zusätzlich mit Hilfe des metastabilen Zerfalls nach der Ionisierung oder des stoß-induziertem Zerfalls erfolgen. Dadurch können weitere Massendaten gewonnen werden, die die Identifizierung der vorhandenen Edukte, Produkte, Neben produkte oder Zwischenprodukte erleichtern bzw. ermöglichen.

Vorteilhaft wird im erfindungsgemäßen Verfahren die Dynamik des Markierungsmusters und die Konzentration von Edukt und Produkt gemessen. Dadurch können Enzymkinetiken analysiert werden. Es können so K_m und V_max eines Enzyms bestimmt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiele Beispiel 1 Lipase-katalysierte Umsetzung von rac. Phenylethyl amin (= PEA) zum 2-Methoxy-N-[(1R)-1-phenylethyl] acetamid (= MET)

Schema I

Die Versuche wurden, so weit in den einzelnen Beispielen nichts anderes beschrieben wurde, wie folgt durchgeführt:

Matrix/Analyt-Verhältnis = 50 (mg/mg)
Lösungsmittel: 50% EtOH/50% H₂O/1% HOAc/0,1% TFA (v : v : v : v)
Interner Standard (IS): d₅-PEA
V_ges = 1 ml
Stocklösungen:

- DHB: 140 mg/ml
- PEA: 35 mg/ml
- d₅-PEA: 35 mg/ml

Pipettierschema:

- Probenaufgabe mit nano-Plotter
- Messung: manuell, 13 Positionen mit je 25 Schuß

Die Versuchsergebnisse werden in Fig. 2 wiedergegeben.

In allen Versuchen wurde PEA quantitativ bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß sich MET quantitativ bestimmen läßt, wenn man PEA als internen Standard einsetzt, jedoch waren die Fehler wegen des unterschiedlichen molekularen Aufbaus der beiden Verbindungen und den damit verbundenen unterschied lichen Ionisierungs- und Flugeigenschaften deutlich größer.

Ein ähnliches Verhalten wurde beobachtet, wenn man PEA gegen Phenylmethylamin als internen Standard bestimmt (Fig. 1a). Die besten Ergebnisse wurden erhalten, wenn der interne Standard eine möglichst hohe molekulare Homologie, das heißt strukturelle Ähnlichkeit, zum Analyten aufweist, wie beispielsweise d₅-PEA zu PEA (Fig. 1b).

Beispiel 2 Einfluß des Verhältnisses von Analyt zu internem Standard auf die Quantifizierung? a) Messung über einen größeren relativen Konzentrationsbereich (0,1- bis 10-fach)

In diesem Experiment wurde das Verhältnis von Analyt zu Standard von 0,1-fach bis 10-fach variiert. Das Ergebnis ist in Fig. 2 zu sehen. Die Probenaufgabe erfolgte mittels nano-Plotter, die Messung durch manuelles Anfahren der Spots im MALDI. Je Spot wurden 13 Positionen zu je 25 Schuß vermessen, die dann auf summiert wurden. Alle Konzentrationen wurden jeweils 4mal bestimmt. Die absolute Konzentration des internen Standards betrug 0.14 mg/ml.

- Proben werden nach dem oben angegebenen Pipettierschema (Beispiel 1) präpariert, und in eine 96-well-Plate überführt.
- Der nano-Plotter ist so programmiert, daß je Konzentration 50 µl der Probenlösung aufgezogen werden; je Konzentration werden dann vier Spots auf verschiedene Felder des MALDI- Targets gespottet (Vierfachbestimmung).
- Das genaue Volumen jedes Spots wurde nicht bestimmt, es liegt jedoch in der Größenordnung von 0.5 nl.
- Um eine reproduzierbare Tropfenbildung am nano-Plotter zu gewährleisten wurden die Parameter für den Piezokristall mit Hilfe des am nano-Plotter befindlichen Stroboskops und anschließender Betrachtung der Spots mit Binokular-Mikroskop variiert. Typische Werte für den PEA-Versuch waren dabei:
- - f = 150 Hz (Pumpfrequenz)
- - T = 20 µs (Pulsbreite)
- - U = 60 V (Amplitude)

Die Bildung von Satellitenspots - ein bekanntes Phänomen bei dieser Probenaufgabetechnik - konnte in vielen Fällen beobachtet werden, beeinflußte die Meßergebnisse jedoch nicht. Die optimalen Werte variieren stark, je nach Konzentrationsverhältnissen!

In Fig. 2 wird die quantitative Bestimmung von PEA gegen d₅-PEA als interner Standard wiedergegeben. Deutlich zu sehen ist eine Sättigung der Kurve bei zu großem Verhältnis zwischen Analyten und internem Standard.

Nach einem linearen Anstieg wird eine deutliche Sättigung der Kurve beobachtet. Der Grund hierfür ist in der unterschiedlichen Signalintensität der beiden Signale bei großem Konzentrations unterschied zu suchen. So kann beispielsweise das Signal des Analyten bei hohem Analyt/Standard-Verhältnis (= A/IS) am Detektorlimit liegen (256 counts/shot), während das Signal des internen Standards gerade über dem geforderten Qualitätskriterium des Signal/Rausch-Verhältnisses liegt.

b) Messung in einem engen relativen Konzentrationsbereich

In diesem Experiment wurde das Verhältnis von Analyt zum internen Standard von 0,1-fach bis 2-fach variiert. Das Ergebnis ist in Fig. 3 [Messung von PEA gegen d₅-PEA als interner Standard in einem relativen Konzentrationsbereich (A/IS) von 0,1-fach bis 2-fach) zu sehen. Zur Probenvorbereitung und Messung fanden die gleichen Parameter Anwendung wie beim vorherigen Experiment (Bei spiel 2a). Es zeigte sich wie in Beispiel 2a im unteren Bereich eine deutliche lineare Abhängigkeit des Verhältnisses der Signal intensitäten von A und IS von der relativen Konzentration beider Komponenten. Dieser Bereich ist dadurch auch für Enzymassays vorteilhaft. Da die Anfangskonzentrationen in einem Enzymassay bekannt sind, kann die Konzentration des internen Standards bzw. das Verhältnis von Analyt beispielsweise dem Produkt zum internen Standard leicht berechnet werden, um in einem günstigen Ver hältnis zum Analyt zu sein. Die relative Standardabweichung lag bei diesem Experiment in der Regel bei unter 5%.

Beispiel 3 Probenaufbringung mit einem nano-Plotter

Durch Probenpräparation mittels nano-Plotter soll eine möglichst geringe Menge des Matrix/Analyt-Gemischs aufgebracht werden und eine möglichst schnelle Verdampfung des Lösungsmittels bewirkt werden, wodurch die Entmischung beider Komponenten vermindert werden soll.

Es konnte gezeigt werden, daß der nano-Plotter eine einfache und schnelle Präparation von MALDI-Proben erlaubt, mit der reproduzierbare Ergebnisse bei der Quantifizierung erhalten werden können. Die Matrixkristalle sind gegenüber der manuellen Präparation deutlich kleiner. Außerdem scheint die Verteilung des Analyten in der Matrix etwas homogener zu sein als bei einer manuellen Präparation (Daten nicht gezeigt). Oft bildeten sich bei dieser Präparationsart jedoch "spiegeleiartige" Strukturen aus, daß heißt, Matrix und Analyt bilden einen Ring, in dessen Mitte kein (oder zumindest deutlich weniger) ionisierbares Material zu finden ist. Die Ausbildung solcher Strukturen scheint von der Konzentration von Matrix/Analyt und dem verwendeten Lösungsmittel abhängig zu sein. Generelle Regeln konnten in diesem Zusammenhang nicht aufgestellt werden, jedoch läßt sich sagen, daß dieses Phänomen auch bei der manuellen Präparation zu beobachten ist.

Es konnten jedoch zwei Unterschiede zwischen der manuellen und der nano-Präparation ausgemacht werden. So konnte gezeigt werden, daß bei manueller Präparation ein etwas größerer Bereich im Verhältnis von Analyt und internem Standard zu einer linearen Korrelation führt, während bei der Präparation mittels nano- Plotter schon früh die oben beschriebene Sättigung (Beispiel 2, Fig. 2) eintritt. Im Gegensatz dazu war die relative Standard abweichung bei der nano-Präparation geringer als bei der manuellen Präparation. Beide Methoden liefern vergleichbare und befriedigende Ergebnisse. Alle Beispiele wurden sowohl manuell als auch automatisch durchgeführt.

Automatisierte Datenaufnahme

Für die automatisierte Datenaufnahme wurde das in der Steuerungs software des Bruker-Reflex-III-MALDI-TOF-Massenspektrometers enthaltene Programm AutoXecute^TM, das die automatisierte Aufnahme vom MALDI-Spektren erlaubt, verwendet. Die Parameter dieser Soft ware konnten für die Messung von niedermolekularen Verbindungen optimiert werden. Dabei wurden unter anderem folgende Punkte bei der automatischen Datenaquisition beachtet: Sättigungseffekte der Signale der Matrix; des Analyten oder des internen Standards; Sättigung des Detektorlimits; Laserintensität; Auflösung der Peaks; Signal/Rausch-Verhältnis; Basislinienrauschen und Summierung der geeigneten Signale.

Die folgenden Parameter wurden für die automatisierte Daten aufnahme verwendet:

- Laser-Stärke (laser attenuation): 69 - 63
- Aufnahmeformat: große Spirale
- Zahl der summierten Peaks: 100
- Optimaler Bereich für das A/IS-Verhältnis: 1-5
- Auflösung ≧ 1400
- Signal/Rausch-Verhältnis < 6
- Basislinienrauschen = 200 a. i.

In Fig. 4 wird exemplarisch eine Kalibriergerade gezeigt, die mittels dieser Parameter aufgenommen wurde. Die Proben waren identisch mit den in Beispiel 2b (Fig. 3) gemessenen. Die Probenpräparation erfolgte mittels nano-Plotter, die Aufnahmespirale wurde nicht für diese kleinen Probentropfen optimiert, so daß eine große Zahl der Laserschüsse die Proben nicht traf (je Konzentration wurden vier Spots vermessen). Trotzdem wurde ein analoges Ergebnis zu der in Fig. 3 gezeigten klassischen Aufnahmetechnik erhalten, bei dieser klassischen Aufnahmetechnik wurden die Meßspots manuell angefahren bzw. anvisiert und an 13 verschiedenen Positionen mit je 25 Laser schüssen beschossen. Die Signale dieser 13 × 25 Messungen wurden vom MALDI aufaddiert und stellen das Ergebnis einer Einzel messung dar. Auch bei manueller Probenpräparation wurden analoge Ergebnisse erhalten. Die Verwendung des AutoXecute^TM-Programms erlaubt also die automatisierte Quantifizierung niedermolekularer Verbindungen.

Beispiel 4 Einfluß der Targetbeschaffenheit

Um mögliche Auswirkungen der Targetbeschaffenheit auf die Proben homogenität zu untersuchen, wurden vier verschiedene MALDI-Targets eingesetzt:

- Nichtpoliertes Metalltarget
- Poliertes Metalltarget
- Nickel-bedampftes Glastarget
- Hydrophob gecoatete Platte mit kleinen Löchern (die Löcher ihrerseits haben die gleiche Beschaffen heit wie das unpolierte Target).

Die Versuche wurden wie unter Beispiel 1 und 2 beschrieben durchgeführt. Das unpolierte Target erwies sich sowohl bei der manuellen als auch bei der Präparation mittels nano-Plotter als ungeeignet, da die auf der Oberfläche vorhandenen Rillen eine inhomogene Kristallisation verursachten.

Beim Einsatz des nano-Plotters konnten keine Unterschiede bezüglich der Probenhomogenität und der Analytverteilung in der Matrix zwischen dem polierten Metalltarget und dem Glastarget festgestellt werden, so daß in diesem Fall der Einsatz beider Platten zu äquivalenten Ergebnissen bei der Quantifizierung führt. Bei sehr kleinen Probenspots hatte das Glastarget jedoch den Vorteil, das die Spots im Videomikroskop des MALDI-Geräts besser zu sehen waren.

Ergebnisse

Es wurde jeweils ein Profil des Analyt/IS-Verhältnisses im Quer schnitt eines manuell aufgetragenen Spots bei unterschiedlichen Konzentrationen aufgetragen (Fig. 5a + 5b, 6a + 6b). Fig. 5 gibt das Profil der Analyt/interner Standard (= A/IS)-Verteilung im Querschnitt einer Probe auf dem mit Nickel bedampften Glas target wieder. Fig. 5a zeigt die manuelle Auftragung, Fig. 5b die automatische Auftragung.

Ein Vergleich von Fig. 5a + 5b mit Fig. 6a + 6b zeigt, daß die Verteilung von Analyt und Standard beim Glastarget bei manueller Präparation nicht so homogen ist wie beim polierten Target.

Es ist zu beobachten, daß die Intensitätsverteilung bei niedrigen Analyt/Matrixkonzentrationen nicht gleichmäßig ist, sondern daß die höchste Signalintensität am Rand der Spots beobachtet werden kann ("Spiegelei-Form"). Bei höherer Konzentration werden auch im Zentrum des Spots ausreichend starke Signale detektiert. Dieses Verhalten wird analog bei der Präparation mit dem nano-Plotter beobachtet.

In Fig. 7a) bis c) ist zu sehen, daß die Kalibriergeraden unabhängig von der Target-Beschaffenheit vergleichbar sind. Fig. 7a) - c) zeigt die quantitative Analyse von PEA (7 µg/ml bis 1400 µg/ml) gegen d₅-PEA (140 µg/ml) als internem Standard auf verschiedenen Targets. Die Proben wurden manuell aufgetragen (0.34 µl pro well). Die durchschnittliche Standardabweichung betrug für alle drei Targets etwa 10%. Die besten Werte (relative Standardabweichung ≦ 5%) wurden wie bereits oben beschrieben bei A/IS-Verhältnissen zwischen 1 und 5 erhalten. Sehr gute Ergebnisse konnten auch bei der Verwendung des Targets mit kleinen hydrophilen Löchern erhalten werden (R² = 0.9994). Durch die Konzentration der Probe auf einer kleineren Fläche wird somit ein Zugewinn an Genauigkeit erreicht.

Beispiel 5 Lipase-katalysierte Darstellung von enantiomeren reinem 1S,2S-Methoxycyclohexanol (MC)

Als Modellreaktion für eine auf MALDI-TOF-MS beruhende Methode zum quantitativen Screening enzymatischer Reaktionen wurde die folgende in Schema II dargestellte und durch eine Lipase katalysierte Reaktion verwendet.

Schema II

Lipase-katalysierte Darstellung von enantiomeren reinem 1S,2S-Methoxycyclohexanol (MS)

Zur Etablierung eines Screening Assays mit der in Schema II dargestellten Reaktion wurden zunächst geklärt, ob es über haupt möglich ist, die an der Reaktion beteiligten Moleküle mittels MALDI-MS zu detektieren. Außerdem wurden eine Reihe verschiedener Matrices untersucht, die ihrerseits saure beziehungsweise basische Eigenschaften aufweisen und die Detektion ermöglichen bzw. verbessern sollten. Die unter suchten Verbindungen der Reaktion waren:

- Vinyllaureat (L)
- Methoxycyclohexanol (MC)
- Methoxycyclohexanollaureat (MCL).

Zusätzlich wurde in einem Fall versucht, durch Zugabe von NaCl die Bildung von Natriumaddukten zu induzieren. Bei zwei Matrices wurde zusätzlich SDS zugegeben.

Es wurde in allen Fällen versucht, sowohl im positiven als auch im negativen Modus zu messen.

In Tabelle 1 sind die molaren Massen und die zu erwartenden Ionen (berechnet) der einzelnen Verbindungen aufgeführt.

Tabelle 1

Theoretisch zu erwartende Signale

In Tabelle 2 sind die unterschiedlichen Matrices aufgeführt, mit denen die Messungen durchgeführt wurden sowie die Ergebnisse dieser Messungen.

Tabelle 2

Verwendete Matrices und Ergebnisse der Messungen im positiven und negativen Modus. +: Signal detektiert, -: Signal nicht gefunden, * Überlappung eines (theoretischen) Signals mit einem Signal der Matrix

Meßbedingungen

- Messung im positiv- und negativ-mode
- Alle Matrixlösungen wurden frisch angesetzt:
- - CCA, SA, DHB, Dithranol/AgTFA: in 90% Acetonitril/10% Wasser/0,1% TFA
- - 2-Amino-5-Nitropyridin: in 90% Acetonitril/10% Wasser
- Das Matrix zu Analyt-Verhältnis (M/A) wurde variiert:
- - M/A = 100 (mg/mg)
- - M/A = 30 (mg/mg)
- - M/A = 1 (mg/mg)
- Von den Analyten wurden Stocklösungen (Acetonitril) her gestellt.

Bewertung der Ergebnisse

Trotz der Variation der Bedingungen (Matrices, Lösungsmittel, pH) konnten weder im positiven noch im negativen Modus Signale der Analyten detektiert werden. Als mögliche Ursachen hierfür kommt möglicherweise die Flüchtigkeit der Analyten unter den Bedingun gen der MS in Frage (Hochvakuum). Eine andere mögliche Erklärung kann in der apolaren Natur der Verbindungen liegen, die sie für eine Analyse mit MALDI nur sehr schwer zugänglich machen. Um die Reaktion verfolgen zu können, wurde deshalb das Methoxycyclohexa nol derivatisiert. Methoxycyclohexanol (= MC) wurde zur Messung in der MALDI-MS zu den entsprechenden Methoxycyclohexanol-benzoe sulfonsäureestern (MCS) derivatisiert.

Die Derivatisierung des Methoxycyclohexanols hatte zwei Haupt aufgaben. Zum einen sollte das Derivat dadurch weniger flüchtig werden, zum anderen sollte eine ionisierbare Gruppierung in das Molekül eingeführt werden. Vorversuche mit verschiedenen aromati schen Säurechloriden (Benzoylchlorid, p-Nitro-Benzoylchlorid) führten nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Die Umsetzung der Alkoholfunktion mit einem gemischten Anhydrid (2-Sulfo-benzoe säureanhydrid (SBA, Bagree et al., FEBS Lett., 120, 1980: 275-277) erbrachte schließlich den gewünschten Erfolg. Schema III gibt die Derivatisierung schematisch wieder.

Schema III

Die Stereochemie des Methoxycyclohexanols wurde nicht berück sichtigt. In der Modellreaktion wurde folgende enantiomerenreine Verbindung eingesetzt:

Versuchsdurchführung

- Methoxycyclohexanol (MC) = 130,1 g/mol
- 2-Sulfobenzoesäureanhydrid = 184,17 g/mol
- d₃-MC = 134,1 g/mol (berechnet als d₄, da Hydroxyl funktion ebenfalls deuteriert)
- 1. Vorlegen von 0,5 g (3,84 mmol) Methoxycyclohexanol (MC)
- 2. Lösen von 777,9 mg (1,1 eq., 4.224 mmol) 2-Sulfo-benzoe säureanhydrid in 0,5 ml Acetonitril (löst sich im Verlauf der Reaktion vollständig)
- 3. Zugabe von Lösung 2) zu 1)
- 4. Schütteln bei RT für 2 Stunden
- 5. Wenn Probe auskristallisiert: Auflösen in 2 ml Acetonitril/ 1 ml Wasser (löst sich sehr gut)
- 6. Vorbereitung MALDI-Probe

Vorschrift für die Darstellung des Standards (d₃

-MCS): analog,
Einwaage (d₃

-MC): 515 mg.

MALDI-Probenpräparation a) Theoretisch zu erwartende Massen des Derivates

M_{monoisotopisch}

: 314.08
[M+H] +: 315.09
[M+Na] +: 337.07
(M-H] -: 313.07

b) Suche nach der geeigneten Matrix

Es wurden unterschiedliche Matrizes untersucht, die entweder saure oder basische Eigenschaften aufweisen. Gemessen wurde im negativ- mode.

Tabelle 3

Matrices für die Messung des derivatisierten Methoxy cyclohexanols (MCS)

Der Analyt wurde in allen Matrices gefunden, die besten Resultate und die geringste Störung durch Matrixsignale ergab sich jedoch eindeutig bei der Verwendung von ATT.

c) Erhalten beim Spotten im nano-Plotter

Die Proben wurden mittels eines nano-Plotters auf das MALDI- Target aufgespottet, wobei die Bedingungen der früher ver wendeten DHB/PEA-Lösungen Verwendung fanden (siehe Pipettier schema und Nano-Plotterbeschreibung, Beispiel 1). Es wurden teil weise Satellitenpeaks beobachtet, die die Messung jedoch in keiner Weise beeinträchtigen. Die Peaks waren homogen (optischer Eindruck aus MALDI-Mikroskop und Binokular).

Bei der späteren Messung konnten keine gravierenden Unterschiede des A/IS-Verhältnisses innerhalb der Spots ausgemacht werden (abgesehen von der normalen Variation).

d) Probenpräparation für quantitative MALDI

Da die reale Konzentration des Analyten nach der Reaktion (= Ausbeute oder Umsatz) unbekannt war, wurden die verschiedenen Lösungen in unterschiedlichen Volumenverhältnissen miteinander gemischt.

Als Matrixlösung wurde eine gesättigte Lösung von ATT in AcCN/H₂O (1 : 1, v : v) verwendet. Eine Berechnung des genauen Matrix/Analyt- Verhältnisses war auf diesem Wege nicht möglich, es wurde jedoch über den ganzen Meßbereich konstant gehalten.

MALDI-Messung a) Meßbedingungen

- negativ- mode
- reflector- mode
- verwendet wurde ein poliertes Target

b) MALDI-Spektrum des derivatisierten Methoxycyclohexanols (MCS)

In Fig. 8 ist ein MALDI-Spektrum eines Gemisches von unmarkiertem (MCS, m/z = 311,01) und markiertem (d₃-MCS, m/z = 316,02) derivatisiertem Methoxycyclohexanol gezeigt (Matrix: ATT).

Fragmente oder Addukte konnten unter den gewählten Meßbedingungen nicht beobachtet werden. Zur späteren quantitativen Auswertung wurde nur der monoisotopische Peak herangezogen, die Isotopen- peaks wurden vernachlässigt.

c) Quantitative Messung

Es wurden 12 Positionen pro Spot beschossen, wobei jeweils 25 Schuß aufaddiert wurden; die Summe der 12.25 Schuß wurde dann ausgewertet. Je Konzentration wurden vier Spots beschossen. Dabei wurden zwei Ausreißer ermittelt (bei rel. Konz. 0,2 und rel. Konz. 1,4), die in Fig. 9 nicht berücksichtigt wurden.

Fig. 9 gibt die Ergebnisse der quantitativen MALDI von MCS gegen d₃-MCS als internem Standard wieder.

Es konnte eine lineare Korrelation zwischen dem Verhältnis von Signalintensität des Analyten zur Intensität des internen Standards in Abhängigkeit von der relativen Konzentration der beiden zueinander beobachtet werden. Die Derivatisierungs reaktion und die verwendeten MALDI-Parameter (Matrix etc.) erlaubten eine quantitative Auswertung der Reaktion. Dies wurde mit einer kommerziell erhältlichen Lipase (Boehringer, Mannheim) bestätigt.

Durchführung

- 1,01 mmol (200 mg) Vinyllaurat und 1,01 mmol Methoxycyclo hexanol (1,01 mmol) gemischt. Es wurde enantiomerenreines MC eingesetzt.
- - Probe geteilt:
  a) Kontrolle b) Enzymreaktion
- Zugabe von 50 mg Enzym zu b). Enzym: Chirazym L-2, c.-f., C2, Lyo, Boehringer Mannheim; Lipase aus Candida antarctica, Fraktion B, ungef. 4,5 kU/g carrier
- Zugabe von je 250 µl Hexan
- 24 h bei RT geschüttelt
- Lösungen über Fritte abgesaugt, nachgewaschen mit je 250 µl AcCN
- Zugabe von je 0,5 mmol d₃-Methoxycyclohexan (67 mg, berechnet als d₄-MC)
- Zugabe von je 1,5 mmol 2-Sulfobenzoesäureanhydrid (SBA, 276,6 mg) in 500 µl AcCN
- 20 h gerührt
- (Rotverfärbung der Ansätze beobachtet)
- Zugabe von je 27 µl Wasser (= 1,5 mmol) zum Abstoppen der Derivatisierung
- Ansatz MALDI-Probe, Matrix: sat. ATT, AcCN/Wasser, 1 : 1
- a) 20 µl Probe + 50 µl Matrix + 150 µl AcCN (M/A: niedrig)
- b) 20 µl Probe + 100 µl Matrix + 100 µl AcCN (M/A: mittel)
- c) 20 µl Probe + 200 µl Matrix (M/A: hoch)
- Probenauftragung auf Target: nano-Plotter, poliertes Target
- MALDI-Messung, Bedingungen wie bei Modellreaktion

Ergebnisse

Es konnte eine deutliche Abnahme der Menge an Methoxycyclohexanol nach der Enzymreaktion gegenüber der Kontrollreaktion nach gewiesen werden (Fig. 10). Dabei konnte auch gezeigt werden, daß das M/A-Verhältnis keinen großen Einfluß auf dieses Ergebnis hatte. Die Spektrenqualität war bei niedrigem M/A-Verhältnis lediglich deutlich schlechter ausgeprägt (deutlich schlechteres Signal-Rausch-Verhältnis), wodurch sich auch die geringe Abweichung gegenüber den Messungen bei mittlerem beziehungsweise hohem M/A-Verhältnis erklären lassen (Fig. 11). Fig. 11 gibt den prozentualen Umsatz des enantiomerenreinen Methoxycyclo hexanols, gemessen bei verschiedenen Matrix/Analyt-Verhältnissen wieder. Die Abweichung bei geringem M/A-Verhältnis ist wahr scheinlich auf das schlechte Signal-Rausch-Verhältnis bei dieser Meßreihe zurückzuführen.

Beispiel 6 Kinetik einer Lipase- katalysierten Reaktion in Mikro titerplatten: immobilisierte BASF-Lipase

Die oben spezifizierte Racematspaltung von Methoxycyclohexanol wurde in diesem Experiment in einer Mikrotiterplatte durch geführt, an die eine Lipase aus Burkholderia plantarii nicht kovalent immobilisiert wurde (BASF, DSMZ 8246).

Versuchsdurchführung

- Mischen von 2 g Methoxycyclohexanol und 2,26 g Vinyllaurat (V_ges = 4,275 ml), 200 µl dieser Lösung entsprechen 93,5 mg MC
- In jedes well der Mikrotiterplatte wurden 200 µl dieser Mischung pipettiert, die Platte wurde mit Plate sealer verschlossen, abgedeckt und bei Raumtemperatur (= 28°C) bei 150 U/min auf dem Rundschüttler inkubiert
- Zum Zeitpunkt t wurde aus einem well 80 µl entnommen (dies entspricht 37,4 mg = 2,875.10^-4 mol MC). (Des weiteren wurden 100 µl zum gleichen Zeitpunkt in ein GC-Probenglas überführt, mit Ethylacetat (1 ml) überschichtet und bei -20°C gelagert bis zur GC-Analyse).
- Zur 80-ml-Probe wurde jeweils 38.6 mg d₃-MC zupipettiert (= 2.875 . 10^-4 mol)
- Diese Proben wurden bis zur vollständigen Beendigung der Enzymreaktion bei -20°C zwischengelagert, so daß alle Derivatisierungsansätze zur gleichen Zeit begannen.
- Es wurden jeweils 179 mg SBA in 400 ml Acetonitril zupipettiert; die Ansätze wurden dann bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt.
- 20 µl der Derivatisierungslösung wurden dann jeweils mit 200 µl gesättigter ATT-Lsg (Wasser/AcCN, 1 : 1) vermischt und mittels des nano-Plotters auf das polierte Metalltarget gespottet.

Ergebnisse

Es konnte ein deutlicher Abfall der Gesamtmenge an Methoxy cyclohexanol im Verlaufe der Enzymreaktion mit immobilisierter Lipase detektiert werden (Fig. 12).

Bei der Messung wurde die Gesamtmenge des nach der Reaktion noch vorhandenen MC bestimmt, das sowohl als racemisches Edukt als auch als enatiomerenreines Produkt vorliegt. Mit der vorge stellten Methode konnte eine Abnahme der Gesamtmenge an Methoxy cyclohexanol um 18% nach einer Reaktionszeit von 30 h gemessen werden.

Aus den Ergebnissen der gesamten Versuche läßt sich folgendes ableiten:

- Die Signalaufnahme sollte vorteilhaft bei einem Signal/ Rausch-Verhältnis größer als 3 erfolgen; als Qualitätsmerkmal sollte dieses Verhältnis vorteilhaft größer als 10 sein, was unter den untersuchten Bedingungen auch ohne weiteres erreicht wird.
- Die Laser-Stärke (Attenuation) sollte vorteilhaft möglichst schwach gewählt werden ("above threshhold") um das Über steuern am Detektor und eine übermäßige Fragmentierung des Analyten zu vermeiden.
- Oft ist von Vorteil, während einer Meßreihe die Anpassung der Veränderung der Laser-Attenuation vorzunehmen, um ein Über steuern der Signalintensitäten zu vermeiden (z. B. rel. Conc = 0,1, Attn: 60/61; rel. conc. = 10, Attn.: 65/66). Diese Option ist auch im AutoXecute^TM-Programm von Bruker vorhanden.
- Durch Aufweitung des Lasers sind weniger Schußpositionen pro Spot notwendig, es ist jedoch nicht möglich, einen Tropfen mit einer Laserposition zu bedecken.
- Homogenität der Proben waren mit nano-Plotter größer als die bei der manuellen Probenpräparation
- Die relativen Fehler liegen bei Verwendung des nano-Plotters unter 5%. Optimale Ergebnisse werden für die Lipase Reaktion in einem engen Konzentrationsbereich gezeigt. Dies bedeutet, daß die Konzentration des Analyten vorteilhaft zwischen dem 0.1-fachen und dem doppelten der Konzentration des internen Standards liegen soll.
- Unpolierte Metalltargets sind wegen der Rillen auf der Oberfläche den polierten Targets in Bezug auf eine homo gene Probenpräparation deutlich unterlegen und für eine quantitative Messung daher ungeeignet. Für eine qualitative Messung aber geeignet.

Falls in den Beispielen nicht anders beschrieben, wurden die Versuche mit folgenden Geräten bzw. Chemikalien durchgeführt:

MALDI-Massenspektrometer:

- Bruker Reflex III MALDI-TOF, Bruker, Bremen
- N₂-Laser, λ = 337 nm
- Scout 384-well-Target
- wahlweise:
- - poliertes Bruker-Standard-Metalltarget oder
- - Bruker-Glastarget (Prototyp) oder
- - Bruker-Standard-Metalltarget

Nano-Plotter:

- GeSim- Mikropipettiersystem Nano-Plotter, Typ: P30-x-D
- Gesellschaft für Silizium-Mikrosysteme mbH, Großerkmanns dorf/Rossendorf
- Piezoelektrische Mikropipette der gleichen Firma

Chemikalien:

- 2,5-DHB: Aldrich
- ATT: Aldrich
- 2-Sulfobenzoesäure-Anhydrid: Fluka
- alle anderen Chemikalien: BASF (wenn nicht anders angegeben im Text)

Claims

1. Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen von nichtpolymeren Edukten zu nichtpolymeren Produkten, dadurch gekennzeichnet, daß das Edukt und Produkt der Enzym-katalysierten Umsetzung mit Hilfe der MALDI-TOF-Massen spektrometrie analysiert wird, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein interner Standard, vor Beginn der Enzym-katalysierten Umsetzung oder während oder nach Abschluß der - katalysierten Umsetzung zugesetzt wird und Edukt und Produkt in Gegenwart dieses internen Standards analysiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Edukte oder Produkte mit einer Molmasse < 1000 Dalton analysiert werden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß das Edukt oder Produkt oder das Edukt und Produkt der Enzym-katalysierten Reaktion quantifiziert wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, daß für die Enzym-katalysierte Umsetzung freie oder immobilisierte Enzyme, Rohextrakte oder ganze Zellen verwendet werden.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, daß die Analyse auf einem Trägermaterial mit einem Rauhigkeitswert R_z < 1 durchgeführt wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, daß die Analyse auf einem polierten, beschichteten oder bedampften Trägermaterial oder auf einem poliertem und beschichteten oder polierten und bedampften Trägermaterial durchgeführt wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekenn zeichnet, daß der Träger aus einem Material, ausgewählt aus der Gruppe Glas, Keramik, Quarz, Metall, Stein, Kunststoff, Gummi, Silicium, Germanium oder Porzellan besteht.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekenn zeichnet, daß das Produkt vor der Analyse derivatisiert wird.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekenn zeichnet, daß das Verfahren manuell oder automatisch durch geführt wird.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekenn zeichnet, daß das Verfahren in einem High Throughput Screening verwendet wird.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekenn zeichnet, daß als interner Standard durch mindestens ein Isotop, ausgewählt aus der Gruppe ²H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³³S, ³⁴S, ³⁶S, ³⁵Cl, ³⁷Cl, ²⁹Si, ³⁰Si, ⁷⁴Se oder deren Mischungen markiertes Edukt, Produkt oder eine weitere markierte chemische Verbindung verwendet wird.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekenn zeichnet, daß als Edukt durch mindestens ein Isotop, aus gewählt aus der Gruppe ²H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³³S, ³⁴S, ³⁶S, ³⁵Cl, ³⁷Cl, ²⁹Si, ³⁰Si, ⁷⁴Se oder deren Mischungen markiertes Edukt verwendet wird.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekenn zeichnet, daß die Analyse zusätzlich mit Hilfe des meta stabilen Zerfalls nach der Ionisierung oder des stoß induzierten Zerfalls erfolgt.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekenn zeichnet, daß die Dynamik der Markierungsmuster und Konzentration von Edukt und Produkt gemessen wird.