DE60317314T2 - Verfahren und gerät für die identifikation und zuordnung von biomolekülen - Google Patents

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Description

  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zum Identifizieren oder Quantifizieren von Polypeptiden. Spezifischer kann diese Erfindung verwendet werden, um Polypeptide zu identifizieren oder zu quantifizieren, die unter Verwendung eines porösen Trägers, z. B. unter Verwendung von Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), aufgetrennt wurden. Die vorliegende Erfindung kann außerdem verwendet werden, um nicht aufgetrennte Proteine aus irgendeiner anderen 1- oder 2-dimensionalen Anordnung (Array) von Proteinen zu identifizieren, z. B. Proteine, die an eine Membran adsorbiert wurden, ebenso wie Proteine in einer Gewebescheibe oder einem Organ-Blot, oder Proteine aus Zellen, die auf einer Bakterien- oder Gewebekultur-Platte wachsen, oder aus einer Mikrotiterplatte, die Proteine aus 1- oder 2-dimensionalen Gelen enthält, oder Proteine aus Chromatographie-Fraktionen. Die Technik, die aufgetrennte Polypeptide beinhaltet, ist besonders nützlich bei biochemischen Studien, wo es das Ziel ist, rasch einige zehn bis hunderte der am häufigsten vorkommenden Proteine in einer biologischen Probe zu identifizieren oder zu quantifizieren, und dabei einige Informationen über das Ausgangsmolekulargewicht der identifizierten Proteine zurück zu behalten. Die Technik, die keine Vorauftrennung der Polypeptide beinhaltet, kann verwendet werden, um zu bestimmen, welche Proteine die häufigsten in verschiedenen Teilbereichen irgendeiner zweidimensionalen Protein-Anordnung sind. Die relative Quantifizierung der aufgetrennten Proteine aus einer oder mehreren Proben wird durchgeführt, indem man stabile Isotopenmarkierung der Proteine vor der Auftrennung, dem Elektroblotting, Verdau und der Massenanalyse, verwendet.
  • 2. Beschreibung der verwandten Technik
  • Biochemiker sind oft daran interessiert, die Haupt-Proteinbestandteile biologischer Proben festzustellen, und sie sind üblicherweise daran interessiert, zu wissen, welche Proteine sich zwischen einer experimentellen Probe und einer Kontrollprobe verändert haben. In den letzten zehn Jahren sind Gelelektrophorese, gefolgt von Peptid-Massen-Fingerprinting (PMF) oder Tandem-Massenspektrometrie (MS-MS), zu den Verfahren der Wahl zur Durchführung dieser Analysen geworden. Typischerweise wird Gelelektrophorese durchgeführt, um die Proteine aufzutrennen, und das gesamte Gel wird mit Coomassie Brillant Blau angefärbt. Nach dem Untersuchen des Gelmusters bestimmt der Wissenschaftler, welche Stücke analysiert werden sollen. Es werden dann manuelle oder automatisierte Verfahren verwendet, um die Gelstücke auszuschneiden, die das/die Protein(e) von Interesse enthalten. Nach mehreren Runden des Waschens wird das gesamte Gelstück jeweils getrennt mit einer Protease, für gewöhnlich Trypsin, verdaut, und die Produkte des Verdaus werden aus jedem Gelstück extrahiert, konzentriert, entsalzt und getrennt der massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Die Massenspektren werden oft auf eine vollautomatische Weise gesammelt, und es ist spezielle Software kommerziell verfügbar, um automati sche Proteinidentifizierungen durchzuführen. Die Roboter, die die anfänglichen Schritte der Probenpräparation durchführen, sind ebenfalls kommerziell erhältlich, aber teuer. Zusätzlich muss der Wissenschaftler nachverfolgen, wie jede Probe während aller dieser Schritte mit dem ursprünglichen Gel zusammenhing, was viele Gelegenheiten der Verwirrung mit sich bringt. In vielen Fällen werden die Proben während dieser Verfahren versehentlich in unterschiedlichem Ausmaß mit exogenen Verunreinigungen verunreinigt. Diese Verfahren erfordern typischerweise mehrere Tage zur Durchführung, einschließlich typischerweise eines Proteaseverdauschritts über Nacht. Da diese Techniken arbeitsintensiv sind und ein hohes Maß an Training für den Durchführenden erfordern, werden Proteinidentifizierungen dieser Art hauptsächlich von großen pharmazeutischen Firmen und von Kernlabors durchgeführt, die dem ursprünglichen Forscher einen beträchtlichen Betrag pro analysiertem Stück berechnen. Zusätzlich sind diese Techniken ineffizient dabei, Proteine in nahe gelegenen Stücken zu identifizieren, da das Ausschneiden der Polypeptidbanden aus dem Gel sequentiell erfolgen muss, und der Prozess des Ausschneidens das Gel verschieben kann, was es schwierig machen kann, nachfolgende Schritte des Ausschneidens zu kontrollieren. Außerdem treten Verluste auf, wenn die Polypeptide an den Wänden des Röhrchens anhaften.
  • Eine Quantifizierung wird typischerweise entweder an den Proteinen durchgeführt, bevor oder nachdem sie auf dem Gel aufgetrennt wurden. Es werden typischerweise drei Verfahren verwendet:
    • 1. Anfärbung mit Coomassie- oder Silberfärbung oder fluoreszenten Farbstoffen: Derzeit erfordert dies das Vollsaugen des Gels in einer Lösung, enthaltend Protein-anfärbende Verbindungen, die im sichtbaren Licht oder ultravioletten Licht visualisiert werden, nachdem der überschüssige Farbstoff aus dem Gel weggewaschen wurde, ein Verfahren, das typischerweise einige zehn Minuten bis Stunden benötigt.
    • 2. Tag-Markierung der Proteine vor der Auftrennung: Fluoreszente Protein-Derivate können erzeugt werden, indem man die Proteine mit fluoreszenten Farbstoffen umsetzt, bevor man sie auf einem Gel auftrennt. Die Natur des fluoreszenten Farbstoffs kann die Mobilität des Proteinderivats bei der Auftrennung auf dem Gel jedoch verändern, was dadurch zu Fehlern führt. Nach der Auftrennung wird die Fluoreszenzintensität gemessen, wie beschrieben z. B. von Berggren et al., Proteomics 1: 54–65 2001; und Tonge et al., Proteomics 3: 377–396, 2001.
    • 3. Tag-Markierung von Proteinen mit radioaktiven Isotopen: Die radioaktive Markierung von Proteinen vor der Auftrennung ist weithin gebräuchlich. Die Visualisierung erfolgt typischerweise durch die Exposition des Gels mit den aufgetrennten radioaktiv markierten Proteinen gegenüber einem photographischen Film. Das Ausmaß der Exposition ist relativ zur Menge der Radioaktivität an dem Protein. Jedoch ist die Verwendung radioaktiver Tags aufgrund vorschriftsmäßiger Erwägungen im Hinblick auf den Zugang zu, die Exposition gegenüber und die Entsorgung von radioaktiven Materialien nicht erstrebenswert. Zusätzlich können viele proteomische Proben (z. B. Serumproben) nicht biosynthetisch markiert werden, und es muss zusätzliche Chemie durchgeführt werden, um Radioaktivität in die Probe einzuführen.
  • Alle drei vorstehend genannten Verfahren erfordern zusätzliche Schritte zur Färbung, Entfärbung, zum Waschen und zur Abbildung, was bedeutet, dass mehr Zeit benötigt wird, um die Ergebnisse zu erhalten. Quantitative Messungen erfordern Vergleiche mit Standard-Proteinen, die in derselben Weise markiert und aufgetrennt werden, sodass zusätzliche Experimente durchgeführt werden müssen.
  • Jüngst, aufgrund von Anstiegen bei der Auflösung Matrix-assistierter Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometern (MALDI-TOF MS) ist es möglich geworden, schwere stabile Isotope für quantitative Zwecke zu nutzen. Bei diesen Versuchen enthält eine Kontrollprobe Proteine, die mit normalen Aminosäuren markiert wurden, wogegen die experimentelle Probe Proteine enthält, die mit schweren Isotopen angereicherte Atome beinhalten (oder umgekehrt), insbesondere Deuterium, C-13, N-15 und O-18 (siehe Veenstra et al., J Am Soc Mass Spectrom 11: 78–82, 2000). Die beiden Proben werden vor der Protein- oder Peptid-Auftrennung miteinander gemischt, und dann über das Massenspektrometer unterschieden. Alternativ werden die schweren Atome an spezifische Aminosäureseitenketten angefügt, indem man Protein-Modifikationsreagenzien verwendet, die in zwei verschiedenen Isotopenformen vorliegen, wie beschrieben von Gygi et al., Nat. Biotechnol 17: 994–999, 1999. In diesem Fall kann der chemische Modifikationsschritt entweder vor oder nach dem Proteinverdau stattfinden. In vielen Fällen haben Strategien der Isotopenanreicherung Gele insgesamt vermieden, und zwar aufgrund der oben beschriebenen Schwierigkeiten bei den Schritten der Probenverarbeitung. Stattdessen werden die Proteine vor der Peptidauftrennung als eine Probe verdaut, und die Proteinidentifizierung erfolgt auf dem Niveau der einzelnen Peptide, wobei MS-MS-Techniken verwendet werden. Aus Kostengründen wird diese Technologie nicht gebräuchlich verwendet, wenn es das Ziel ist, die relative Mengenbestimmung einer begrenzten Anzahl von Proteinen durchzuführen. Zusätzlich geht sämtliche Information über das Ausgangsmolekulargewicht der Proteine verloren, wenn die Proteine zu Beginn des Versuchs verdaut werden, und das „intakte" Molekulargewicht ist oft von entscheidendem Interesse für Biochemiker.
  • Eine zweite, damit nicht verwandte Technik der Protein-Analyse beinhaltet die direkte Identifizierung von Proteinen aus ganzen Geweben oder Kolonien. In der Vergangenheit wurden Proteine typischerweise aus Kolonien, Geweben und Gewebeschnitten extrahiert, indem man die Zellen, die die Probe ausmachten, physikalisch aufbrach. Jedoch, wie offenbart im US-Patent 5,808,300 , ist es nun möglich, Proteine, die direkt aus Geweben abgetragen werden, durch Mas senspektrometrie zu analysieren. Jedoch ist es nahezu unmöglich, intakte Proteine im Vergleich mit ihren Peptidgegenstücken zu identifizieren.
  • Jüngst wurde eine Technik zum Durchführen paralleler Proteinidentifikationen, genannt „molekularer Scanner", und ohne das Erfordernis der Gelfärbung, des Ausschneidens von Flecken, der Extraktion und Peptidisolation, im US-Patent 6,221,626 beschrieben. Es wurde eine Elektroblotting-Sandwichanordnung beschrieben, umfassend eine hydrophile Membran, die eine immobilisierte Protease enthält, angeordnet zwischen einem Elektrophoresegel und einer hydrophoben Sammelmembran, die die Peptid-Fragmente absorbiert. Die hydrophobe Membran wurde später mit einer MALDI-ionisierbaren Matrix behandelt, die die MALDI-Analysen der gespaltenen Polypeptide als immobilisierte Proben direkt von der Membran aus erlaubte. Somit werden alle Proteine, die in dem Gel vorhanden waren, simultan unter Verwendung von Techniken prozessiert, die mit Massenspektrometrie kompatibel sind. In diesem Patent war der elektrische Strom, der verwendet wurde, um die Peptidfragmente zur Sammelmembran zu treiben, entweder gepulst, oder er war Wechselstrom, was eine spezielle Elektroblotting-Ausrüstung erforderte. Außerdem ist die Verwendung dieser Art von elektrischem Strom nicht erstrebenswert, da sie die Zeitspanne erhöht, die benötigt wird, um die Proben weiterzuverarbeiten. Diese Technik wurde nachfolgend verfeinert, wie beschrieben in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO 00/45168 , um dabei einen Verdauschritt im Gel zu beinhalten. Jedoch war keine dieser zwei Techniken für bestimmte Anwendungen vollständig zufriedenstellend. Beispielsweise gab es technische Schwierigkeiten, konsistente und empfindliche Massensignale zu erhalten, wenn man die oben beschriebenen Originaltechniken verwendete. Außerdem wurden keine Techniken beschrieben, die eine simultane Proteinidentifizierung und die Verwendung schwerer Isotope für die Proteinquantifizierung erlaubten. Diese Einschränkungen haben es sowohl weniger erstrebenswert als auch schwieriger für Biochemiker gemacht, den „molekularen Scanner" auf gelegentlicher Basis zu verwenden.
  • Entsprechend wäre es erstrebenswert, ein Verfahren bereitzustellen, um molekulare Scanner-Experimente durchzuführen, die keinerlei spezialisierte Gerätschaften erfordern, sodass diese Technik auf biochemische Routine-Analysen angewandt werden kann. Zusätzlich wäre es erstrebenswert, ein Mittel zu entwickeln, um schwere Isotope für die Proteinquantifizierung zu verwenden, ohne alle Informationen darüber zu verlieren, wie das Ausgangsmolekulargewicht des Proteins in der Probe war. Das Verfahren, das wir im Folgenden beschreiben, erfüllt diese Erfordernisse.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung oder Quantifizierung von Polypeptiden aus einer Proteinprobe.
  • Die Erfindung ist in den begleitenden Ansprüchen definiert.
  • Bei einer Ausführungsform werden die Proteine auf einem Gel aufgetrennt und durch den Verdau mit einem Enzym während der Elektroelution in Peptidfragmente gespalten. Die Peptidfragmente können dann auf der Oberfläche einer zusammengesetzten Einfangmembran abgelagert werden.
  • Bei einer Ausführungsform wird eine zusammengesetzte Einfangmembran zum Sammeln von Peptidfragmenten derart hergestellt, dass die eingefangenen Fragmente auf einer äußeren Oberfläche der zusammengesetzten Einfangmembran, angrenzend an die Verdaumembran, konzentriert werden. Dies wird erreicht durch das Vorbehandeln einer PVDF-Membran, die mit einem quaternären Amin modifiziert wurde, mit einer Kombination aus Nitrocellulose und MALDI-Matrix.
  • Bei einer Ausführungsform werden die Proteine mit schweren stabilen Isotopen markiert, um die relative Quantifizierung von Proteinen bereitzustellen. Die Technik der Markierung der Aminogruppen von Lysinresten mit Deuterium-besetzten oder nicht mit Deuterium versehenen Acetylgruppen ist mit der Natriumdodecylsulfat-(SDS)-PAGE kompatibel und erlaubt eine simultane relative Proteinquantifizierung.
  • Bei einer Ausführungsform bewirkt eine Fokussiertechnik, dass die verdauten Polypeptide auf einer diskreten Zone auf der Einfangmembran abgelagert werden. Auf diese Weise ist es nicht notwendig, die gesamte Membran zu scannen, um die elektrisch abgelagerten Peptide zu finden.
  • Bei einer Ausführungsform des hier beschriebenen molekularen Scanners wird das Spaltungsmittel immobilisiert und als „Füllung" in einem „Elektroblot-Sandwich" zwischengeschaltet angeordnet zwischen einem Träger, wie etwa einem Auftrenngel, oder einem Gel, das zuvor mit einem Tiergewebe in Kontakt gebracht wurde, als einer Scheibe des „Sandwichs", und einer zusammengesetzten Einfangmembran, beispielhaft vertreten als eine konventionelle Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran, geeignet modifiziert gemäß der vorliegenden Erfindung, als der anderen „Scheibe" des Sandwichs. Auf diese Weise werden die Fragmente auf der Oberfläche der zusammengesetzten Einfangmembran gesammelt und können dann in einer geeigneten Weise für die MALDI-TOF MS formuliert werden. Es ist lediglich notwendig, dass das Elektroblotting so ausgeführt wird, dass die Proteine eine hinreichend lange Verweildauer in der Nähe des immobilisierten Spaltungsmittels haben, um sicherzustellen, dass eine vernünftige Menge der Fragmente produziert wird, jedoch nicht so lange, dass unerwünschte Diffusion ermöglicht wird. Dies ist leicht erreichbar, indem man die Spannung und die Pufferlösung, die beim Elektroblotting verwendet werden, anpasst. Weiterhin wird hohe enzymatische Aktivität erhalten, indem man das Spaltungsenzym sicher an der hydrophilen Membran immobilisiert, während man den Selbstverdau (Spaltung des Enzyms durch sich selbst) minimiert.
  • In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung kann die Zeit, die derzeit notwendig ist, um Analysen des hier beschriebenen Typs durchzuführen, reduziert werden, sodass die gesamte Analyse, vom Gel bis zum Beginn der massenspektrometrischen Analyse, an einem einzigen Tag durchgeführt werden kann. Die gleiche Vorrichtung kann verwendet werden, um Polypeptide von anderen Quellen als Gelen zu analysieren, z. B. von Gewebe-Bluts oder Gewebescheiben, chromatographischen Fraktionen, Spots, die aus 2D-Gelen entnommen sind, etc. Die Einfachheit dieses Systems zur Durchführung paralleler Proteinverdaue und zum Einfangen auf Oberflächen, die für direkte MALDI-Analysen geeignet sind, machen dieses attraktiv als ein Proben-Präparationsverfahren für die Analyse von Spots oder Scheiben bzw. Stücken, die aus Gelen ausgeschnitten wurden, oder für Proteinfraktionen beliebiger Art.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine schematische Ansicht einer Ausführungsform des „Blotting"-Sandwichs, die bei der Erfindung verwendet werden kann.
  • Die 2a und 2b sind schematische Ansichten anderer Ausführungsformen des „Blotting"-Sandwichs, die bei der Erfindung verwendet werden können.
  • Die 3a und 3b zeigen die MALDI-TOF MS-Spektren, die von vier verschiedenen Standard-Proteinen erhalten wurden, d. h. von Myosin, BSA, Ovalbumin und Carboanhydrase.
  • Die 4 zeigt 12 MALDI-Spektren, erhalten von aufeinander folgenden Positionen eines 1D-SDS-PAGE-Minigels eines E. coli-Lysats. Jedes Spektrum war um 500 Mikrometer abgetrennt.
  • 5 zeigt zwei verschiedene Beispiele von MALDI-TOF MS-Spektren von Peptidpaaren, die für die Isotopen-markierte Proteinquantifizierung verwendet werden können. Die linke Tafel von 5 zeigt ein Peptidpaar mit einem acetylierten Lysinrest aus einem Protein (Trypsin-Inhibitor), das in einem Verhältnis von 2:1 gemischt wurde, nachdem es getrennt mit der Wasserstoffform von Acetat und der Deuterium-haltigen Form von Acetat markiert worden war. In der rechten Tafel von 5 wurde ein anderes Peptid mit drei acetylierten Lysinresten aus dem gleichen Protein (Trypsin-Inhibitor), getrennt markiert mit der Wasserstoffform von Acetat und der Deuterium-haltigen Form von Acetat, in einem Verhältnis von 1:3 gemischt.
  • 6a zeigt ein orthogonales (o)-MALDI-MS-MS-Spektrum eines E. coli-Peptids aus 30S-ribosomalem Protein (Swiss Prot Zugangsnummer #P02349).
  • 6b zeigt ein MALDI-TOF MS-MS-Spektrum, erhalten von einem Peptidion (1639,94 m/z), abgeleitet aus humanem Serumalbumin, das aus dem Serum mittels 10-Gel-Elektrophorese abgetrennt wurde.
  • 7 ist eine schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform, die nützlich ist, um verdaute Polypeptide auf einer diskreten Zone auf der Einfangmembran zu fokussieren.
  • Die 8a und 8b zeigen ein Gewebebild eines Hühnerherzens, gewonnen unter Verwendung der vorliegenden Erfindung.
  • 9a und 9b zeigen schematische Ansichten einer anderen Ausführungsform, die nützlich im Zusammenhang mit Mikrotiterplatten ist.
  • 10 ist ein MALDI-TOF MS-Spektrum von Peptiden, gefunden an der Position #92 eines 10-Gels von E. coli-Lysat.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren bereit, um das Spaltungsmittel zu immobilisieren und um die zusammengesetzte Einfangmembran auszubilden. Dies erlaubt, dass das zu spaltende Polypeptid kontinuierlich in Kontakt mit dem Spaltungsmittel durchtritt, und zwar in einem einzelnen Durchgang anstatt diskontinuierlich, entweder in einer Richtung oder in zwei Richtungen. Weiterhin ist es nicht notwendig, den Verdauprozess vor dem Elektroblotting in dem Auftrenngel zu starten, wie es zuvor in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO 00/45168 beschrieben wurde.
  • Das immobilisierte Spaltungsmittel hat eine höhere Kapazität, die Peptidfragmentbildung zu bewirken, als das immobilisierte Spaltungsmittel aus dem Stand der Technik. Zusätzlich wird die zusammengesetzte Einfangmembran durch eine Prozedur ausgebildet, die sicherstellt, dass die Peptidfragmente auf der Oberfläche der zusammengesetzten Einfangmembran isoliert werden, die der hydrophilen Membran gegenüberliegt, anstatt im Inneren der zusammengesetzten Einfangmembran.
  • Gemäß einem spezifischen Aspekt der Erfindung werden verbesserte Verfahren bereitgestellt, um Polypeptide zu identifizieren, die durch Gelelektrophorese aufgetrennt oder von einer ein- oder zweidimensionalen Protein-Anordnung aus auf eine Membran geblottet wurden, z. B. aus einem intakten Gewebe oder einer bakteriellen Zellkultur, wobei die Verfahren folgendes umfassen:
    • a) Bereitstellen wenigstens einer hydrophilen Membran angrenzend an das Gel, auf der wenigstens ein Reagens immobilisiert ist, welches befähigt ist, ein Polypeptid zu spalten. Im Falle einer Protease wird die hydrophile Membran durch die Zugabe von hohen Salzkonzentrationen und eines Proteaseinhibitors behandelt, um hohe Konzentrationen der Protease abzulagern, während der Selbstverdau der Protease minimiert wird.
    • b) Bereitstellen einer zusammengesetzten Einfangmembran, die geeignet ist, um darauf Polypeptidfragmente zu empfangen, die durch Elektroblotting darauf übertragen werden. Die zusammengesetzte Einfangmembran ist jenseits der hydrophilen Membran in einer Richtung der Bewegung der Peptidfragmente der Polypeptide (für gewöhnlich Kathode zu Anode) positioniert. Die zusammengesetzte Einfangmembran wird durch die Zugabe von Verbindungen modifiziert, die das Einfangen der Peptide fördern, wie etwa Nitrocellulose und einem Matrixmaterial, das die Ionisation von Peptiden für die MALDI-Analyse unterstützt, wie etwa alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (HCCA).
    • c) Elektroblotting der Polypeptide von dem Auftrenngel durch die hydrophile Membran oder Membranen unter Bedingungen, die wirksam sind, um zu bewirken, dass die Polypeptide durch das Spaltungsreagens in Fragmente gespalten werden, auf die zusammengesetzte Einfangmembran. Dieser Schritt erfolgt während eines einzelnen Durchgangs unter konstantem unidirektionalem elektrischem Strom.
    • d) Identifizieren der Fragmente, die an der zusammengesetzten Einfangmembran gesammelt wurden, durch MALDI-TOF MS und MALDI-TOF MS-MS und, anhand der Identifizierung der Fragmente, Identifizierung des Polypeptids, aus dem diese hervorgingen.
  • Das Verfahren kann erweitert werden durch:
    • e) Bereitstellung einer relativen Quantifizierung der identifizierten Polypeptide, indem man die Proteine vor der Auftrennung mit Reagenzien markiert, die in unterschiedlicher Weise stabile Isotope enthalten, die durch Massenspektrometrie unterschieden werden können. Beispielsweise können intakte Proteine mit N-Hydroxysuccinimyl-acetat (NHSA) behandelt werden, das mit Lysin-Seitenketten reagiert. Das NHSA kann so synthetisiert werden, dass die Acetat-Markierungsgruppe entweder 3 Deuteriumatome oder 3 Wasserstoffatome enthält. Die Proben werden dann vor der Gelelektrophorese, dem Verdau, Einfangen und der MS-Analyse zusammengemischt. Die relative Menge der Proteine in der Kontrolle im Vergleich zu der experimentellen Probe kann dann abgeleitet werden durch das Messen der relativen Intensitäten jedes Paars von Peptiden, wie gemessen durch MS. Für jedes Protein wird die Mehrheit der Peptide, die detektiert werden, in Form dieser Paare vorliegen (wobei die Hauptausnahmen Peptide sind, die mit Argininresten enden und denen außerdem Argininreste vorangehen), was bedeutet, dass das Expressionsniveau jedes Proteins auf vielen einzelnen Peptidmessungen basieren wird.
  • Weiterhin ist das derart beschriebene Verfahren gleichermaßen auf die Analyse von Proteinen anwendbar, die aus Geweben und Gewebescheiben oder Zellkultur stammen.
  • Der Begriff „Einfangmembran", wie er hier verwendet wird, besitzt eine breite Bedeutung, da dies besonders wichtig für die Durchführung der Erfindung ist. Die Membran kann selbsttragend oder nicht-selbsttragend sein, und sie kann eine poröse Membran, ein Film, eine Beschichtung oder Platte sein. Die Membran wird normalerweise porös gegenüber dem Elektroblotting-Puffer sein, um es zu ermöglichen, dass Strom zur Elektrode hin oder von dieser weg geleitet werden kann, jedoch kann sie alternativ selbst die Elektrode darstellen oder in direkter elektrischer Kommunikation mit der Elektrode stehen.
  • Der Begriff „Identifizieren", wie hier verwendet, ist nicht als synonym mit der Bestimmung der Sequenz aufzufassen und beinhaltet das partielle Identifizieren des Polypeptids oder das Charakterisieren des Polypeptids als ähnlich zu oder verschieden von einem bekannten Protein. Weiterhin beinhaltet der Begriff das Durchführen einer versuchsweisen Identifizierung, basierend auf dem Wahrscheinlichsten einer kleinen Menge von Möglichkeiten. Die Sequenz kann bestimmt werden durch Tandem-MS-MS-Verfahren für die Identifizierung unbekannter Proteine oder die Bestätigung bekannter Proteine.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft die Identifizierung und Quantifizierung von Polypeptiden, die bereits durch Gelelektrophorese aufgetrennt wurden, oder die Identifizierung von Proteinen, die aus einer ein- oder zweidimensionalen Protein-Anordnung extrahiert wurden, z. B. einem Gewebe oder einer Gewebescheibe durch Elektroblotting. Die Natur oder die Quelle der zu identifizierenden Polypeptide ist nicht entscheidend. Es können z. B. natürlich vorkommende Proteine sein, Proteine, die durch rekombinante DNA-Technologie erzeugt wurden, oder Polypeptide, die durch Peptidsynthese erzeugt wurden, oder große Peptide, die aus der teilweisen Spaltung von Polypeptiden stammen. Der Kürze halber wird die Erfindung im Folgenden mit Bezug auf Proteine beschrieben. Das Extrapolieren auf andere Polypeptide wird als durch die folgende Beschreibung verstanden und einbezogen betrachtet.
  • Die Zusammensetzung des Gels, auf dem die Proteine aufgetrennt werden, ist nicht entscheidend, jedoch wird es üblicherweise ein Polyacrylamidgel sein. Es können sämtliche konventionellen Gele und Auftrennungsbedingungen verwendet werden, einschließlich reduzierender und nicht-denaturierender Bedingungen. Es kann sich um ein- oder zweidimensionale Gele handeln. (Bei 2D-Gelen werden die Proteine in einer Dimension durch ihre Ladung und in der anderen Dimension durch ihre Molekülmasse aufgetrennt). Andere geeignete Weisen der Auftrennung beinhalten Kapillarelektrophorese, Kapillarelektrochromatographie, dynamische Feldgradientenfokussierung, isoelektrische Fokussierung, Flüssigchromatographie einschließlich Affinitätschromatographie, Dünnschichtchromatographie, sowie Elektrophorese unter Verwendung von Agarosegelen oder Stärkegelen.
  • Die Erfindung kann verwendet werden mit einem oder mehreren Proteinen, die zusammen auf dem Gel vorliegen, z. B. 1 bis 3000, und bevorzugt 1 bis 200 Proteine. Dies beinhaltet Proteine, die in unterschiedlichen Molekulargewichtsauftrennungen auf einem 1D-Gel vorliegen, oder die mit ähnlichen Molekulargewichten jedoch in parallelen Spuren oder Bahnen auf dem 1D-Gel vorliegen, ebenso wie solche, die durch 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt wurden. Normalerweise findet das Elektroblotting überall in der Richtung von Kathode nach Anode statt, da die meisten Proteine bei dem pH, der beim Elektroblotting verwendet wird, negativ geladen sind. Um weiterhin sicherzustellen, dass die Polypeptide und ihre Fragmente in Richtung der Anode wandern, kann eine kleine Menge eines Additivs, das dem Peptid eine negative Ladung verleiht, wie etwa SDS oder dergleichen, zu den Transferpuffern hinzugegeben werden. Die Konzentration darf nicht signifikant in die Bindung des Peptids an die Membran oder in die Aktivität des immobilisierten Spaltungsreagens (z. B. Trypsin) eingreifen, jedoch muss es in einer hinreichenden Konzentration vorliegen, um mit den Polypeptiden und ihren Fragmenten zu interagieren, um eine negative Nettoladung zu verleihen. Die bevorzugte Konzentration liegt üblicherweise zwischen etwa 0,001 und etwa 0,1% w/v, und bevorzugt zwischen 0,005 und etwa 0,02%, am bevorzugtesten bei 0,01% w/v. In Abhängigkeit vom pH des verwendeten Elektroblotting-Puffers, können positiv und negativ geladene Fragmente erhalten werden und in entgegengesetzte Richtungen wandern, hin zur Katode bzw. Anode.
  • 1, 2a und 2b stellen beispielhaft einige Sandwich-Anordnungen dar, die für das Elektroblotting nützlich sind. 1 zeigt eine Versuchsanordnung, bei der eine anodische Sammelschicht bevorzugt eine zusammengesetzte Einfangmembran 14 mit einem multimodalen Einfangmechanismus ist. Es versteht sich, dass unter verschiedenen pH-Bedingungen einige Polypeptidfragmente in Richtung einer kathodischen Sammelschicht wandern können. Somit beinhaltet die Erfindung die mögliche Bereitstellung anodischer und kathodischer Sammelschichten mit einer oder mehreren hydrophilen Membranen 13, die jeweils zwischen diesen angeordnet sind, und eines Auftrenngels 11 (2b). In 1 gibt es wenigstens eine einzelne hydrophile Membran 13, bevorzugt eine modifizierte Polyethersulfon-Membran mit einem geeigneten Protein-Spaltungsreagenz, wie etwa Cyanogenbromid, 3-Brom-3-methyl-2-(2-nitrophenylmercapto)-3H-indol (BNPS-Skatol) oder dergleichen, bevorzugt mit einem Proteaseenzym, z. B. Trypsin, das darauf immobilisiert ist, angeordnet zwischen dem Gel 11 und der zusammengesetzten anodischen Einfangmembran 14, die aus Materialien wie etwa PVDF, Nylon oder Nitrocellulose ausgebildet sein kann, und die am bevorzugtesten eine zusammengesetzte Einfangmembran aus chemisch modifiziertem PVDF ist, auf der die Proteinfragmente gesammelt werden. In 2a gibt es zwei aufeinander folgende hydrophile Membranen 13, bevorzugt modifizierte Polyethersulfon-Membranen, jede mit darauf immobilisiertem Trypsin, angeordnet zwischen dem Gel 11 und der anodischen Sammelschicht, die wiederum bevorzugt eine zusammengesetzte Einfangmembran aus chemisch modifiziertem PVDF ist. 2b zeigt eine ähnliche Anordnung, bei der es Verdaumembranen 13 auf beiden Seiten des Gels 11 gibt, und sowohl eine anodische als auch eine kathodische Einfangmembran.
  • In größerem Detail werden die Anode und die Kathode vom Rest des Sandwichs durch eine saugfähige Schicht 12 getrennt, die mit der Blotting-Flüssigkeit vollgesogen wird, wobei die Flüssigkeit in elektrischem Kontakt mit den Elektroden gehalten wird, und diese ist bevorzugt ein Filterpapier. Die Art der Elektroden und der saugfähigen Schichten, die in der Anordnung verwendet werden, ist nicht entscheidend, und es kann jedweder Typ sein, der in konventioneller Weise beim Elektroblotting verwendet wird.
  • Die „Füllung" des Sandwichs kann die Form einer oder mehrerer Membranen 13 (definiert wie in 2a gezeigt) annehmen, die hinreichend hydrophil in ihrem Charakter sind, sodass die Proteine und Fragmente davon nicht dazu neigen, an der Membran fest zu kleben. Diese Membran kann jedwede Schicht sein, die gegenüber der Elektroblotting-Flüssigkeit porös ist, und befähigt, das Polypeptid-Spaltungsreagens daran zu immobilisieren, ob nun an der Oberfläche davon oder in den Spalten oder Mikrohöhlen darin, die für die Elektroblotting-Flüssigkeit zugänglich sind (und daher für das zu spaltende Polypeptid). Die Membran ist typischerweise 100 bis 600 Mikrometer dick; so ist beispielsweise eine Gelman US450-Membran (Pall Life Sciences) etwa 150 Mikrometer dick. Typischerweise wird die Anzahl solcher Membranen, die in das Sandwich einbezogen sind, 1 bis 7 betragen. Bei konventioneller Dicke der Membranen werden häufig 4 Membranen verwendet. Am besten werden diese direkt oder gegeneinander benachbart angeordnet, d. h. eine auf der anderen. Die hydrophile(n) Membran(en) werden bevorzugt mit „aktiven Carbonyl-" oder Carbonsäuregruppen oder Derivaten hiervon bereitgestellt, die gegenüber Aminogruppen reaktiv sind, die in den Enzymen vorkommen. „Aktive Carbonyl"-modifizierte oder Carboxyl-modifizierte PVDF-Membranen oder Polyethersulfon-Membranen mit Aldehyd-Aktivierung sind besonders bevorzugt.
  • Eine Aldehyd-aktivierte Membran wird verwendet, um das Polypeptid-Spaltungsreagenz, wie etwa eine Protease, zu immobilisieren. Um die Spaltungsaktivität zu verstärken, wird ein Verfahren beschrieben, das die Menge an aktivem proteolytischem Enzym steigert, das an der hydrophilen Membran zu immobilisieren ist. Die Immobilisierungsbedingungen beinhalten die Zugabe von Salzen, wie etwa Natriumsulfat oder dergleichen, in Konzentrationen zwischen etwa 0,1 und etwa 1,5 M, bevorzugt zwischen etwa 1,1 und etwa 1,5 M, und eines Proteaseinhibitors, wie etwa Benzamidin oder dergleichen (im Falle von Trypsin) zu dem Reaktionsgemisch, um sicherzustellen, dass aktives Enzym an der Membran immobilisiert wird. Die bei dieser Reaktion gebildete Schiff-Base wird dann mit Natrium-Cyanoborhydrid (oder einem anderen geeigneten Reduktionsmittel) reduziert, um eine kovalente irreversible Anheftung zu erzeugen. Der Proteaseinhibitor wird dann von der Membran entfernt, wie etwa mit 1 M Natriumchlorid, sodass das immobilisierte Spaltungsreagens frei ist, das Polypeptid zu verdauen, um Peptidfragmente auszubilden.
  • Da es schwierig wäre, alle aktiven Gruppen, die an der Oberfläche einer Membran vorhanden sind, mit einem Enzym umzusetzen, und da es nicht erstrebenswert ist, es den Polypeptiden zu gestatten, mit diesen freien aktiven Gruppen zu reagieren, werden die restlichen aktiven Gruppen (die ansonsten frei wären) bevorzugt abgedeckt, bevor die Membran verwendet wird, z. B. mit Ethanolamin, oder, bei Aldehyd-aktivierten Membranen, mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) und Natrium-Cyanoborhydrid, wodurch Endungen wie etwa --CO--NH--CH2-CH2--OH bereitgestellt werden, die relativ hydrophil sind. Es können andere konventionelle hydrophile Abdeck-Gruppen verwendet werden. Alternativ können PVDF-Membranen oder Glasfaserpapier durch Isothiocyanat funktionalisiert werden, das die Reaktion mit epsilon-Aminogruppen von Lysinresten in den Enzymen erlaubt. Für diesen Zweck werden die PVDF-Membranen mit NaOH vorbehandelt, um ethylenische Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in der Polymerkette (durch Eliminieren eines Moleküls von HF) bereitzustellen. Die vorbehandelten PVDF-Membranen werden dann unter basischen Bedingungen mit einem Dinukleophil umgesetzt, wie etwa mit Ethylendiamin, 1,10-Diaminodecan oder 2-Aminoethanthiol, wodurch Wasserstoffatome im Polymer durch --X--(CH2)n-NH2-Gruppen substituiert werden, wobei X --S-- oder --NH-- ist, und n 2 bis 10 beträgt. Dieses Polymer mit Amin-terminierten Seitenketten wird dann mit 1,4-Phenylendiisothiocyanat (DITC) oder 3,5-Dichlor-1,4-phenylendiisothiocyanat (DCDITC) umgesetzt, um die erforderlichen Isothiocyanat-terminierten Seitenketten in guter Ausbeute zu erhalten. Mit DITC umgesetzte Glasfaserblätter liefern eine andere Form von Membran.
  • Eine weitere Form von Membran wird über Arylamingruppen PVDF-funktionalisiert, wobei die Arylamingruppen mit einer Carbonsäure-Seitenkette oder dem Carboxy-Terminus des Enzyms reagieren, bevorzugt in Gegenwart eines Carbodiimids, wie etwa 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid. Eine andere Form von hydrophiler Membran, die als Füllung des Sandwichs verwendet werden kann, ist ein dünner Film oder eine Beschichtung aus Agarosegel. Die epsilon-Aminogruppen von Lysinresten in dem Enzym werden behandelt, um Aminoxygruppen zu erhalten, die mit Aldehydgruppen reagieren, die durch milde Oxidation des Agarosegels erzeugt werden, wobei somit das Enzym kovalent an die Agarose gebunden wird.
  • Das Spaltungsreagens wird normalerweise und bevorzugt immobilisiert, indem man in Gegenwart eines Enzyminhibitors, der anschließend entfernt wird, eine kovalente Anheftung vornimmt. Jedoch sind andere Formen der Immobilisierung nicht von der Verwendung bei dieser Erfindung ausgenommen, solange das Enzym in Lösung in der Elektroblotting-Flüssigkeit nicht hinreichend frei wird, um einen Selbstverdau durchzumachen. (Es versteht sich, dass die Gegenwart selbstverdauter Enzymfragmente sich störend auf die Analyse der Fragmente des zu analysierenden Proteins auswirken könnte). Somit könnte das Enzym beispielsweise physikalisch in den Poren eines porösen Blatts aus hydrophilem Polymer eingeschlossen werden. Alternativ könnte die Membran ein darauf immobilisiertes Enzym besitzen, wobei die Immobilisierung durch Mittel erfolgt, die Affinitätsbindung umfassen. Somit könnte das Enzym kovalent an Avidin oder Streptavidin angeheftet werden, und das resultierende Konjugat könnte durch Affinitätsbindung zwischen Avidin/Streptavidin und Biotin an eine biotinylierte Membran angeheftet werden. Alternativ könnte Avidin oder Streptavidin an die Membran angeheftet werden, und das Enzym könnte umgesetzt werden, um Biotinyl-Endungen zur Reaktion mit einer Membran bereitzustellen, an die Avidin oder Streptavidin angeheftet wurde.
  • Bevorzugt ist das Spaltungsmittel ein Enzym und am bevorzugtesten und üblicher Weise eines, das die Hauptkette des Polypeptids spaltet, insbesondere Trypsin. Trypsin schneidet Proteine an der Carboxylseite von Lysin und Arginin. Andere, weniger spezifische Endoproteasen, z. B. Pepsin oder Chymotrypsin, sind verwendbar, ebenso wie die hochspezifischen Enzyme Lys-C, Arg-C oder Glu-C. Bei Phosphoproteinen kann eine Phosphatase nützlich sein, entweder alleine oder in Kombination mit Proteasen; somit können die Enzyme auch solche beinhalten, die mit Proteinseitenketten reagieren. Es kann mehr als ein Enzym auf der Membran immobilisiert werden. Beispielsweise kann es hilfreich sein, eine partielle Spaltung von den Polypeptid-Termini aus durchzuführen, z. B. unter Verwendung einer Carboxypeptidase oder Aminopeptidase in Verbindung mit einer Endoproteinase. Carboxypeptidase Y ist ein besonders nützliches derartiges Enzym.
  • Die Konzentration an Spaltungsreagenz, das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung auf der Verdaumembran immobilisiert wird, ist hinreichend hoch, sodass nach einem einzigen Durchgang der Probe durch die Membran das gesamte oder weitgehend das gesamte Protein in der Probe verdaut wurde und die Probe frei oder weitgehend frei von unverdautem Protein ist. Bei einem Versuch, das Ausmaß des Verdaus abzuschätzen, wurde ein E. coli-Lysat auf einem präparativen Gel aufgetrennt. Unter Verwendung einer Bio-Rad Mini-Ganzgel-Elutionsvorrichtung (Mini whole gel eluter) wurde das aufgetrennte Lysat aus dem Auftrenngel einem Elektroblotting unterzogen und in Fraktionsröhrchen gesammelt. Die Fraktionen wurden dann einer 1D-Gelauftrennung unterzogen, gefolgt von Coomassie-Färbung, was eine „Molekulargewichtsleiter" der aufgetrennten Fraktionen zeigt. Da die Mini-Ganzgel-Elutionsvorrichtung Elektroelution verwendet, wurde ein zweiter Versuch durchgeführt, bei dem eine Membran, die das immobilisierte Spaltungsreagens enthält, zwischen dem Auftrenngel und den Sammel-Reservoirs angebracht wurde. Es wurden einzelne Fraktionen aus beiden Versuchen verglichen, indem man jede der Fraktionen der 1D-Gelanalyse unterzog. Die Erwartung war die, dass, wenn es einen unzureichenden Verdau bei demjenigen Versuch gab, bei dem die Spaltungsmembran verwendet wurde, intaktes Protein bei der zweiten 1D-Gelanalyse beobachtet werden würde. Die Fraktion, die aus dem Versuch ohne die Spaltungsmembran erhalten wurde, wurde seriell verdünnt, um eine relative Abschätzung dafür zu ergeben, wie viel intaktes Protein in dem 1D-Gelvergleich verblieb. Für diesen Versuch wurde anstelle der Färbung mit Coomassie die empfindlichere Sypro Ruby-Fluoreszenzfärbung verwendet. Es wurde herausgefunden, dass die Menge an Protein, die in der Fraktion verblieb, die der Spaltungsmembran ausgesetzt worden war, geringer war als bei der am stärksten verdünnten Fraktion aus dem Versuch, der die Spaltungsmembran nicht benutzte. Es wurde abgeschätzt, dass über 95% des Proteins beim Einzeldurchgang durch die Membran mit dem immobilisierten Trypsin verdaut wurde.
  • Außerdem war früher ein oszillierender Strom notwendig, um eine hinreichende Verweildauer der Probe beim in Kontakttreten mit dem Spaltungsreagens zu gewährleisten, um einen adäquaten und wirksamen Verdau zu bewirken. In Anbetracht der gesteigerten Konzentration an Spaltungsreagens auf der Verdaumembran in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist ein oszillierender Strom nicht länger notwendig. Obwohl quantitative Messungen der Konzentration an Spaltungsreagenz, das auf der Membran immobilisiert ist, schwierig sind und in Abhängigkeit vom verwendeten Messverfahren variieren können, sind Mengenniveaus an Trypsin im Bereich von etwa 20 μg/cm2, wie gemessen durch den BAPNA-Assay, erreichbar, im Vergleich zu konventionellen Mengenniveaus von immerhin nur etwa 8 μg/cm2. Diese relativ hohen Mengenniveaus an Spaltungsreagens gemäß der vorliegenden Erfindung haben zu einem signifikanten Anstieg der Effektivität des Verdauprozesses geführt.
  • Um die Gegenwart bestimmter proteinchemischer Modifikationen, wie etwa Kohlenhydraten mit Glucosyl-, N-Acetylglucosaminyl- und Sialyl-Gruppen, zu untersuchen, sind Enzyme, die diese Ketten schneiden, wie etwa Glucosidase, N-Acetylglucosaminidase bzw. Neuraminidase, nütz lich für die Erfindung, insbesondere in Kombination mit Proteasen. In solchen Fällen kann es erstrebenswert sein, Proben zu analysieren, bei denen nur Proteasen verwendet werden, und, separat, Ansätze in Kombination mit diesen zusätzlichen Enzymen.
  • Die Spaltungsreagenzien sind nicht auf Enzyme beschränkt, sondern beinhalten auch chemische Reagenzien, z. B. Cyanogen-Bromid, die durch Einschluss in einer porösen Matrix physikalisch immobilisiert werden können.
  • Die anodische zusammengesetzte Einfangmembran 14 (und die zusammengesetzte Einfangmembran der kathodischen Sammelschicht, falls verwendet) kann jedwede zusammengesetzte Einfangmembran sein, die beim Elektroblotting verwendet wird, wie etwa PVDF, Nylon oder Nitrozellulose oder dergleichen, mit oder ohne Modifikatoren. Die Modifikatoren können alle möglichen Chemikalien beinhalten, die nicht störend in die nachfolgende Analyse durch Massenspektrometrie eingreifen, z. B. Polymere oder Gruppierungen, die entweder mit der Carboxyl- oder Aminogruppierung interagieren, um die Peptidfragmente an der Oberfläche der zusammengesetzten Einfangmembran zu immobilisieren.
  • Eine bevorzugte Einfangmembran ist eine zusammengesetzte Membran, bestehend aus PVDF, modifiziert mit einem quaternären Amin, die von der Millipore Corporation (Bedford, MA) als Immobilon CD erhältlich ist. In Übereinstimmung mit einem wichtigen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird diese Membran bevorzugt mit Nitrocellulose und HCCA modifiziert, um eine Hybrid-Membran mit multiplen Peptid-Interaktionsmodi zu erzeugen, die die Peptidfragmente einfängt und deren Ionisierung unterstützt, wenn eine Exposition gegenüber Laser-Desorption erfolgt, wie es beispielsweise beim MALDI-Ionisationsverfahren der Fall ist.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Einfangmembran 14 zuvor mit einem Gemisch aus Nitrocellulose und HCCA, gelöst in Aceton, behandelt. Dies hat den Effekt, ein wirksameres Einfangsubstrat für die neu ausgebildeten Peptide zu erzeugen, wodurch in hohem Maße die Empfindlichkeit und Robustheit der nachfolgenden MS-Detektion erhöht wird. Repräsentative Massenspektren, die von einigen als Molekulargewichtsstandard dienenden Proteinen erhalten wurden, sind in den 3a und 3b gezeigt. Jedes dieser Proteine wurde automatisch identifiziert, wobei hierfür das Datenbank-Suchprogramm „Protein Prospector" (University of California, San Francisco) verwendet wurde. In 4 wurde ein E. coli-Lysat auf ein SOS-PAGE-Minigel geladen, und Spektren wurden alle 0,5 mm in stromabwärtiger Richtung des Gels aufgenommen. Es sind zwölf aufeinanderfolgende Spektren gezeigt. Man kann sehen, dass viele Peptide in verschiedenen angrenzenden Stücken detektierbar sind. Das typische Muster ist derart, dass jede Masse am stärksten in einem Stück vertreten ist, und dann, jedoch schwächer, in den angrenzenden Stücken detektierbar ist. Dies ist exakt die Art von Verteilung, die man bei einer Probe erwarten würde, die viele hundert Proteine aufweist; jedes Protein würde eine Verteilung von Peptiden erzeugen, die eine etwa Gauß'sche Verteilung von Intensität gegenüber Distanz haben würden, und das Gesamt-Massenspektrum würde aus der Summe dieser Gauß'schen Verteilungen bestehen. Wir sind in der Lage gewesen, mit Sicherheit mehr als 4 Proteine aus den Individuellen Spektren zu identifizieren, indem wir Software verwendeten, wie sie im ebenfalls anhängigen US-Patent der Anmelde-Seriennummer 09/745,920, beschrieben ist.
  • Mit stabilen Isotopen markierte Reagenzien für den Zweck der Markierung zweier verschiedener Präparationen von Proteinen, z. B. aus zwei verschiedenen Proteinfraktionen, Proteine, isoliert aus Zellen von normalem gegenüber erkranktem Gewebe, Proteine, isoliert aus mutanten Zellen gegenüber wildtypischen Zellen, etc. können zusammen mit dem Kit dieser Erfindung verwendet werden, um quantitative Informationen zu erhalten. Diese Methodik ist in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO 00/11208 beschrieben worden. ICATTM-Reagenzien, die kommerziell bei Applied Biosystems erhältlich sind, sind ein Beispiel solcher Isotopen-markierter Reagenzien, die für die differentielle Markierung von Proteinen verwendet werden können. Zusätzlich ist die relative Quantifizierung exprimierter Proteine, die unter Verwendung von ICAT-Reagenzien auf 1D-Gelen aufgetrennt wurden, außerdem demonstriert worden, wie in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO 02/090929 beschrieben. Die typische Prozedur des Gelschneidens, des Verdaus im Gel und des Peptidmassen-Fingerprintings wurde verwendet, um die Proteine in den Gelstücken zu identifizieren und zu quantifizieren. Andere Isotopen-Markierungsreagenzien beinhalten Reagenzien, die mit anderen Aminosäureseitenketten reagieren, z. B. Aminogruppen oder Carbonsäuregruppen. Beispielsweise reagieren Ester von N-Hydroxysuccinamid, bei denen die Estergruppe eine beliebige Kombination stabiler Isotope von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Halogen enthält, mit Aminogruppen und markieren das Protein dadurch mit einer Gruppierung, die die stabile Isotopen-Markierung enthält, und die durch Massenspektrometrie unterscheidbar ist. Da diese stabilen Isotope wenig Wirkung auf die Intensitäten besitzen, die durch Massenspektrometer gemessen werden, zeigt das Verhältnis der leichten und der schweren Form der Peptide die relative Häufigkeit des Proteins an, von dem dieses Peptid in den beiden Ausgangsproben abgeleitet wurde. Beispielsweise können Vergleiche von Proteinexpressionsprofilen von normalen und malignen Zellen in der Identifizierung von Proteinen resultieren, deren Anwesenheit oder Abwesenheit charakteristisch und diagnostisch für den malignen Zustand ist.
  • In 5 sind kleine Regionen zweier verschiedener MALDI-TOF-Spektren gezeigt, bei denen Paare von Peptiden vorliegen. Bei diesen Experimenten wurde das Protein Trypsin-Inhibitor entweder mit nicht-Deuterium-markiertem NHSA oder mit dreifach Deuterium-markiertem NHSA markiert, in einem Verhältnis von entweder 2:1 oder 1:3 gemischt und mit dem Verfahren und den Apparat behandelt, das/der in dieser Erfindung beschrieben ist. Die von diesem Versuch abgeleiteten Peptide wurden unter Verwendung eines MALDI-TOF-Spektrometers analysiert, und die Verhältnisse der Intensitäten der Peptide mit und ohne die schweren Isotope wurden gemessen und mit dem ursprünglichen Startgemisch verglichen. In der linken Tafel wurden die Proben von Trypsin-Inhibitor in einem Verhältnis von 2:1 gemischt, bevor die Trennung durch Gelelektrophorese und das Elektroblotting durch die Verdaumembran erfolgten. Die Einfangmembran 14, die das Gemisch schwerer und leichter Formen der Peptide enthält, wurde der MS-Analyse unterzo gen. Die rechte Tafel stammt von einem davon verschiedenen Versuch, bei dem die Proben des Trypsin-Inhibitors in einem Verhältnis von 1:3 gemischt wurden und der gleichen Prozedur unterzogen wurden, wie oben beschrieben. In der linken Tafel enthält das angezeigte Peptid einen einzelnen Lysinrest, und daher trennen 3 Masseneinheiten die beiden Peptide voneinander. Aufgrund des natürlichen Auftretens von C-13 und anderen schweren Isotopen überlappt die Masse von 1581 (Peptid mit leichtem Isotop) teilweise die Massenhülle des Peptids mit dem schweren Isotop, wie gezeigt. Das Peptid in der rechten Tafel besitzt 3 Lysinreste. Alle drei Lysine sind acetyliert worden, was bewirkt, dass das modifizierte Peptidpaar um 9 Masseneinheiten getrennt vorliegt (3 Deuteriumatome × 3 Lysinreste), was selbst bei einer Masse von 2170 hinreichend ist, dass die Isotopen-Hülle für jede Peptidform vollständig nicht-überlappend ist. Da alle Lysinreste im ursprünglichen Protein acetyliert wurden, spaltet Trypsin das Protein nur an Argininresten, was die Anzahl von Fragmenten verringert, die aus jedem Protein unter Verwendung der verlässlichsten Endoproteinase, Trypsin, erzeugt werden können, und was das Molekulargewicht vieler der Peptide erhöht. Dies macht es möglich, einen größeren Prozentanteil der Primärstruktur jedes Proteins durch Massenspektrometrie zu detektieren.
  • In 6a, ist ein MS-MS-Spektrum, das unter Verwendung eines QSTAR®-MS-Systems mit oMALDI-Ionenquelle (Applied Biosystems) aufgenommen wurde, für eines der tryptischen Peptide gezeigt, die von einem Protein in einem E. coli-Lysat erhalten wurden, das unter Verwendung eines 1D-Gels aufgetrennt wurde. Das fragliche Spektrum passte zu dem von E. coli stammenden 30S-ribosomalen Protein S1-Peptid DRVEDATLVLSVGDEVEAK, dies unter Verwendung der MS-Tag-Routine des Programms Protein Prospector. In 6b ist das MS-MS-Spektrum eines Peptid-Ions, das von einem Serumprotein stammt, das auf einem 1D-Gel aufgetrennt wurde, aufgenommen unter Verwendung eines Tandem-Flugzeit-MALDI MS, dem 4700 Protein-Analysator mit TOF-TOFTM Optik (Applied Biosystems), gezeigt. Das Spektrum passte zu dem humanen Serumalbumin-Peptid VPQVSTPTLVEVSR.
  • Im Gegensatz zum US-Patent 6,221,626 und der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO 00/45168 , fördern Verbesserungen der Immobilisierung der Enzyme an der Verdaumembran die Spaltungsaktivität, und somit besteht keine Notwendigkeit eines Generators von gepulstem Strom oder Wechselstrom. Der elektrische Strom, der bei dem Elektroblotting angewendet wird, ist somit bevorzugt ein kontinuierlicher Gleichstrom. Alternativ kann ein gepulster Strom, d. h. ein Gleichstrom mit Intervallen, in denen kein Strom durchgeleitet wird, oder ein Wechselstrom mit Schwerpunkt auf der Richtung Kathode zu Anode, d. h. hauptsächlich ein Kathoden-zu-Anodenstrom, jedoch mit Intervallen, in denen Strom in der entgegengesetzten Richtung geleitet wird, ebenfalls verwendet werden. Variationen dieser Schemata sind möglich im allgemeinen Geist der Idee zur Durchführung eines langsamer als normal verlaufenden Elektroblottings, was Zeit ermöglicht, damit die Spaltung an der/den hydrophilen Membran(en) stattfindet, während keine so große Verzögerung bei der Fortbewegung der Proteine und Fragmente von dem Auftrenngel zu der Sammelmembran verursacht wird, die eine unnötige laterale (seitliche) Diffusion verursacht würde, was einen Verlust an Auflösung bewirken würde. Es ist bevorzugt, einen gepulsten oder kontinuierlichen Gleichstrom zu verwenden, da die Zeit für das Peptid zur Wanderung zu der zusammengesetzten Einfangmembran wesentlich reduziert wird, und da die Geräteausstattung, um dies zu erreichen, in breitem Maße verfügbar ist.
  • Die Elektroblotting-Flüssigkeit ist bevorzugt eine gepufferte Lösung, die ein Detergens enthält, und sie kann für diesen Zweck jedweder konventionelle Puffer sein, wie etwa Tris/Glycerin mit Methanol, SDS oder 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure (CAPS) mit Methanol. Die Wanderungsrichtung der Fragmente hängt im wesentlichen vom pH des Puffers und der Detergenskonzentration ab. Für die meisten Zwecke wird ein alkalischer Puffer geeignet sein, da viele hydrolytische Enzyme am besten bei alkalischem pH funktionieren. Einige Enzyme jedoch, wie etwa Pepsin, erfordern einen sauren pH. Unter solchen Bedingungen werden die Fragmente zur Kathode wandern, und ein kationisches Detergens, wie etwa CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid), ist bevorzugt.
  • Peptide, die von der Hauptkette des Proteins stammen, werden auf der Einfangmembran gesammelt. Sie werden dann bevorzugt durch MALDI-TOF MS oder Tandem-MS/MS in einer konventionellen Weise analysiert. Beispiele solcher MS-Techniken sind in den US-Patenten Nr. RE 37485 ; 5,760,393 und 6,348,688 beschrieben. Diese Analyse kann als einen zusätzlichen Schritt beinhalten, die Membran ein zweites Mal mit Matrix zu behandeln. Die Probe wird im MALDI-Massenspektrometer durch UV- oder IR-Laserlicht in der Dampfphase angeregt. Die Ionen werden durch die Verdampfung erzeugt und bilden eine „Ionen-Fahne". Die Ionen werden in einem elektrischen Feld beschleunigt und gemäß ihrer Fortbewegungszeit entlang einer gegebenen Distanz aufgetrennt, was eine Masse/Ladungs-(m/z)-Ablesung ergibt, die sehr empfindlich ist. MALDI-Massenspektrometer, die für diese Analyse geeignet sind, sind kommerziell bei Applied Biosystems (Foster City, CA) erhältlich.
  • Bei dieser Erfindung wird das oben beschriebene Verfahren auf das Scannen der Fragmente von vielen Proteinen gleichzeitig angewandt. Somit kann man viele Proteine gleichzeitig auf der PAGE laufen lassen, wobei sie dem Verfahren der Erfindung unterworfen werden, um eine Anordnung von Spots auf der Sammelmembran zu produzieren und die Anordnung wie folgt zu analysieren. Die zusammengesetzte Einfangmembran wird geschnitten und auf der MALDI-TOF MS-Probenplatte mit Silikonschmiere, leitfähigem Band, doppelseitigem Band oder einem aushärtenden Leim fixiert. Ein eine organische Matrix ausbildendes Reagens wird zu der Membran auf der Probenplatte hinzugeben, und die Probe wird dann an der Luft getrocknet. Die Probenplatte wird in das MALDI-TOF MS- oder Tandem-MS/MS-Instrument eingesetzt. Eine automatisierte Bewegung der Probenplatte von einer ersten zu einer zweiten Position wird von einem Computerprogramm gesteuert. An jeder Position wird ein MALDI-TOF MS-Spektrum erzeugt, die Spektralinformation wird in digitaler Form gesammelt, und die beobachteten Daten oder die Massenliste von Peptiden wird auf einen Suchalgorithmus für den Peptid-Abgleich heruntergeladen. Bei Tandem-MS/MS-Massenspektrometern werden Peptidsequenzdaten durch Kollisions induzierte Dissoziation des Peptidions zur Ausbildung von Peptidionenfragmenten abgeleitet, deren Massen dann in einem zweiten Massen-Analysator beobachtet werden.
  • Es ist dann einfach, eine automatisierte Ausgabe der Ergebnisse zu erhalten, die auflistet, welche Proteine durch die Verwendung von Software identifiziert wurden, die durch die Verkäufer des MS-Instruments geliefert wird, sowie durch kommerziell verfügbare Datenbank-Suchmaschinen. Ein kommerziell erhältliches Programm ist der zuvor diskutierte Protein Prospector.
  • Es ist daher offenkundig, dass die vorliegende Erfindung großes Potential für die automatisierte Identifizierung und/oder partielle Charakterisierung vieler Proteine gleichzeitig besitzt. Letztendlich stellt die Erfindung bei dieser bevorzugten Ausführungsform einen praktischen „molekularen Scanner" bereit, der für biochemische Routineanalysen nützlich sein wird.
  • Wenn das Massenspektrometer verwendet wird, um Bilder elektrisch geblotteter Proteine aufzunehmen, ist zu erwarten, dass große Oberflächen der Einfangmembran leer sein können, da wenige Polypeptide an der entsprechenden Region des Gels vorlagen, das elektrisch geblottet wurde. Um Zeit auf der Ebene der Datengewinnung zu sparen, und um die Empfindlichkeit zu erhöhen, zeigt 7 eine andere Ausführungsform, die nützlich ist, um verdaute Polypeptide auf eine diskrete Zone der Einfangmembran zu fokussieren. Wie gezeigt, kann eine nicht-leitfähige Bahn 15 mit Schlitzen oder Löchern zwischen dem Gel 11 und der Einfangmembran 14 angeordnet werden, um das Elektroblotting auf spezifische Regionen auf der Einfangmembran zu fokussieren oder einzugrenzen. Im Fall einer 1D-SDS-PAGE wird keine räumliche Auflösung durch dieses Mittel geopfert, solange die Richtung des Schlitzes parallel zur Richtung der Elektrophorese ist. Somit hätte die ideale nicht-leitfähige Bahn Schlitze, die auf jeder Spur des 1D-Gels zentriert vorliegen. Die korrespondierende Vorrichtung für 2D-Gele würde aus einer Reihe räumlich regelmäßig angeordneter bzw. beabstandeter Löcher bestehen. Diese Bahn würde die Fläche, die gescannt werden muss, reduzieren, auf Kosten von etwas räumlicher Auflösung. Die nicht-leitfähige Bahn 15 könnte entweder vor oder nach der Spaltungsmembran 13 angeordnet werden, in Abhängigkeit davon, welche Position als am produktivsten ermittelt würde.
  • In der Biochemie ist die Fähigkeit zur Quantifizierung von Unterschieden der Proteinhäufigkeit zwischen zwei Proben von beträchtlichem Interesse. Bei einer Ausführungsform kann diese Erfindung mit analytischen Reagenzien und auf Massenspektrometrie basierenden Verfahren verwendet werden, wobei diese Verfahren die Reagenzien für die schnelle und quantitative Analyse von Proteinen oder der Proteinfunktion in Gemischen von Proteinen verwenden. Das analytische Verfahren kann für die qualitative und insbesondere für die quantitative Analyse von allgemeinen Proteinexpressionsprofilen in Zellen und Geweben, d. h. für die quantitative Analyse von Proteomen, verwendet werden. Das Verfahren kann außerdem verwendet werden, um nach Proteinen zu screenen und Proteine zu identifizieren, deren Expressionsniveau in Zellen, Geweben oder biologischen Flüssigkeiten beeinflusst wird durch einen Stimulus (z. B. die Verabreichung eines Wirkstoffs oder den Kontakt mit einem potentiell toxischen Material), durch eine Ver änderung in der Umwelt (z. B. Nahrungsmenge, Temperatur, Zeitverlauf) oder durch eine Veränderung eines Zustands oder Zellzustands (z. B. Krankheitszustand, Malignität, positionsspezifische Mutation, Gen-Knockdowns und -Knockouts) im Bezug auf die Zelle, das Gewebe oder den Organismus, aus dem die Probe stammt. Die bei einem solchen Screen identifizierten Proteine können als Marker für den veränderten Zustand fungieren. Beispielsweise können Vergleiche von Proteinexpressionsprofilen normaler und maligner Zellen in der Identifizierung von Proteinen resultieren, deren Anwesenheit oder Abwesenheit charakteristisch und diagnostisch für den malignen Zustand ist.
  • Ebenfalls offenbart ist die Analyse von Proteinen, die einem direkten Elektroblotting von Geweben oder Gewebestücken bzw. Gewebescheiben aus unterzogen werden. Jüngst sind intakte Proteine von Geweben durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert worden, und zwar durch direkte Abtragung von den Geweben, wie offenbart im US-Patent 5,808,300 . Sobald die Ionisation erfolgt ist, wird die Masse der intakten Proteine, und, unter günstigen Umständen, die Masse von Fragmenten, die zufällig im Massenspektrometer erzeugt werden, gemessen. Diese Massen werden dann verwendet, um das Protein zu identifizieren. Jedoch ist zu erwarten, dass in vielen Fällen solche günstigen Fragmente nicht detektierbar sein werden, und es wird notwendig sein, auf Proteasen zurückzugreifen, um die Proteine zu spalten, um in effizienterer Weise Peptide zu erzeugen, die bei der Identifizierung des Proteins verwendet werden können. Bei dieser Anwendung des molekularen Scanners können Proteine in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung durch die Polypeptid-Spaltungsmembran 13 elektrisch geblottet werden, um Peptide zu erzeugen, die dann an der Einfangmembran 14 zu Identifizierungszwecken gesammelt werden. Ebenso wie bei den Massen des intakten Proteins kann ein Bild des Gewebes rekonstruiert werden, basierend auf der Analyse der Peptidmassen, die von Proteinen stammen, die mit der vorliegenden Apparatur elektrisch geblottet, verdaut und eingefangen wurden. Die 8a und 8b zeigen Bilder einer Scheibe von Hühnerherz, rekonstruiert auf Basis der Verteilung zweier willkürlich gewählter Peptidionen (m/z 1253 und 2448), beobachtet, nachdem die Gewebescheibe dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren unterzogen wurde. Es wurde eine Gesamtheit von 6561 (81 × 81) Spektren aufgenommen und analysiert. Die Ionenintensitäten werden für jedes der Peptidionen in den 8a und 8b unter Verwendung einer Grauabstufung wiedergegeben. Diese vorläufigen Ergebnisse zeigen an, dass eine deutlich abgegrenzte Verteilung der Peptide 1253 und 2448 beobachtet werden kann. Das Massenspektrometer, das verwendet wird, kann ein klassisches MALDI-TOF-Massenspektrometer sein, oder es kann ein Tandem-Massenspektrometer sein, das gewünschte Elternionen auswählt, gefolgt von MS-MS-Fragmentierung.
  • Andere Proben, die Proteine enthalten, können ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise können Kolonien von Bakterien oder eukaryotischen Zellen unter Verwendung des Kits auf die Expression von rekombinantem Protein hin durchmustert werden. Die Kolonien würden zuerst auf eine Membran geblottet, und diese Membran könnte anstelle des Polyacrylamidgels 11 in die Kassette eingesetzt werden. Es ist anzumerken, dass es nicht entscheidend ist, dass die Proteine effizient aus der Blotting-Membran übertragen werden, solange eine hinreichende Menge an Peptiden eingefangen wird. Eine zweite Anwendung könnte auf der Ebene liegen, die Spezies individueller Kolonien von Mikroorganismen zu bestimmen, die aus Umweltproben isoliert werden. Alle Proben auf einer Bakterienplatte könnten parallel weiterverarbeitet werden. Alternativ könnten Kolonien von einer großen Anzahl von Platten auf eine zweite Platte transferiert werden, um eine zweidimensionale Anordnung von Kolonien zu erzeugen. Auf diese Weise könnten hunderte bis tausende von Kolonien gleichzeitig weiterverarbeitet werden, und das Massenspektrometer könnte so betrieben werden, dass es Spektren von den bekannten Koordinaten des zweidimensionalen Arrays sammelt.
  • Bei einer anderen Ausführungsform, die mit Bezug auf die 9a und 9b beschrieben wird, könnten die Proteine ihren Ursprung in einer Mikrotiterplatte 24 haben, die mit Filtern unter jedem Well 22 ausgestattet ist. Eine Vielfachelektrode 25 mit z. B. 96 Leitern könnte von oben in jedes der 96 Wells eintauchen, wie in 9b gezeigt. Solange die Wells einen Puffer enthalten, der für das Blotting geeignet ist, ist es möglich, die Protein-enthaltende Lösung 23 durch die Filter auf die Protease-enthaltende Spaltungsmembran 13 und dann auf die Einfangmembran 14 elektrisch zu eluieren. Die Protein-enthaltenden Lösungen 23 können eine beliebige Lösung darstellen, die ein oder mehrere Proteine enthält, einschließlich Zell- und Gewebelysaten, aus Flüssigchromatographie gesammelte Fraktionen, einschließlich Abtrennungen von Affinitäts- und Kapillar-Elektrochromatographie oder Kapillarelektrophorese, die in die Filterplatte 24 eingebracht werden können. Alternativ, falls erstrebenswert, könnten die Proteine auf ein Festphasenharz absorbiert werden, um den Pufferaustausch hin zu einem geeigneten Puffer vor dem Elektroblotting zu erleichtern. Die Luftblasen, die anfänglich unter den Filtern eingeschlossen werden, könnten durch einen positiven Druck von unten, z. B. unter Verwendung von im Überschuss appliziertem Transferpuffer zum Starten des elektrischen Kontakts, entfernt werden. Nachdem der Transfer abgeschlossen ist, kann das Massenspektrometer auf diejenigen Gebiete der Einfangmembran 14 fokussiert werden, die in Linie mit den Auslässen des jeweiligen Filters angeordnet waren. Ein sehr ähnlicher Aufbau kann implementiert werden, wenn die Proteine ursprünglich in Stücken von Polyacrylamid 21 eingefangen werden, ebenso wie nach dem Ausschneiden Protein-enthaltender Banden oder Flecken aus traditionellen 1- oder 2-dimensionalen Gelen. In diesem Fall könnte die obere Vielfachelektrode 25 mit kleinen Öffnungen ausgestattet werden, die so konzipiert sind, dass sie einen gewissen Gegendruck bereitstellen, um die Aufgabe zu erleichtern, eingeschlossene Luftblasen zu entfernen, indem Druck von unterhalb der Filterplatte 24 appliziert wird.
  • Optional kann jede beliebige Kombination der Komponenten zusammen oder getrennt verwendet werden, insbesondere jedwede der folgenden: Matrix-ausbildendes Reagens für MALDI-TOF (nicht optional), Elektroblotting-Puffer, Protease-Spaltungsschicht(en), Sammelschicht(en), bevorzugt zusammengesetzte Einfangschicht(en), umfassend (eine) Membran(en), die mit Poly meren, wie etwa Nitrocellulose, und MALDI-Matrizes vorbehandelt wurden, und PAGE-Materialien. Andere optionale Komponenten können Mikrotiter-Filterplatten und Vielfachelektroden beinhalten, um das Elektroblotting von den Mikrotiterplatten aus zu erleichtern.
  • Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine zwischengeschaltete Affinitäts-Einfangmembran zwischen der Verdaumembran und der Einfangmembran angeordnet. Diese zwischengeschaltete Membran fängt eine Untergruppe (einen Teilsatz) der elektrisch geblotteten Peptide ein, beispielsweise die Untergruppe der Peptide, die mit Biotin modifiziert wurden. Diese Peptide werden dann von der zwischengeschalteten Membran abgelöst und bei einer zweiten Runde des Elektroblottings auf eine zweite Einfangmembran übertragen. Die Selektion einer Untergruppe von Peptiden basiert auf ihren Interaktionen mit spezifischen Reagenzien, wie etwa Antikörpern, Streptavidin, Metallchelation, DNA, RNA und PNA. Beispielsweise können Proteine vor der Auftrennung durch 1D- oder 2D-Gelelektrophorese mit ICAT-Reagenzien (enthaltend Biotin) markiert werden. Beim Elektroblotten der aufgetrennten Proteine und der nachfolgenden enzymatischen Spaltung unter Verwendung von immobilisiertem Trypsin an der hydrophilen Membran, können die resultierenden Peptide, die Biotin enthalten, auf einer zwischengeschalteten Membran, an der Streptavidin immobilisiert ist, selektiert werden. Die Peptide, die kein Biotin enthalten, wandern zu der Nitrocellulose/Matrix-modifizierten Einfangmembran für die Analyse. Durch Austauschen der modifizierten Einfangmembran durch eine neue, zweite, modifizierte Einfangmembran und Veränderung der Elektroblotting-Bedingungen (d. h. Veränderung beim Puffer oder pH) werden die Biotin-enthaltenden Peptide von der zwischengeschalteten Streptavidin-Membran entfernt und auf der neuen modifizierten Einfangmembran für die Massenanalyse eingefangen. Diese Selektion spezifischer Peptide auf Basis ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften erlaubt die Subfraktionierung dieser Peptide in einem Zweistufenverfahren, bei dem mit ICAT-Reagens markierte Peptide im Hinblick auf Identität und relative Quantifizierung isoliert werden.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Die Wörter „Immobilon", „Trans-Blot" und „Voyager" sind Handelsmarken.
  • BEISPIELE Materialien und Methoden
  • Chemikalien. Gelman US450-Membranen mit Polyethersulfon wurden von Pall Life Sciences (Ann Arbor, MI) erworben. Niedrig-Bereich-("Low-Range")-SDS-PAGE-Standard-PVDF-Membranen wurden von Bio-Rad (Richmond, Calif., USA) erworben. Trifluoressigsäure (TFA), Tris und Trypsin wurden von Sigma (St-Louis, Mo., USA) erworben. Das Trypsin stammte aus Rinder-Pankreas und wurde mit L-1-Tosylamid-2-phenylethyl-chlormethylketon (TPCK) behandelt, um die Chymotrypsin-artige Aktivität zu reduzieren, die für gewöhnlich in Trypsin vorliegt.
  • Acetonitril (HPLC-Qualität), Calciumchlorid, Ethanolamin, Glycin und L-BAPNA (N-Benzoyl-L-arginin-4-nitroanilid-hydrochlorid) wurde ebenfalls von Sigma erworben.
  • 1-D- und 2-D-PAGE. Für das 1-D-PAGE-Verfahren wurde eine Mini-Protean II Elektrophorese-Apparatur (Bio-Rad, Richmond, Calif., USA) verwendet. Die SDS-PAGE wurde im wesentlichen gemäß dem Verfahren, das in Laemmli, Nature 277: 680–685, 1970 beschrieben wurde, durchgeführt, mit einem 10% Polyacrylamidgel von BioRad. Eine Mini-Ganzgel-Elutionsvorrichtung (Bio-Rad) wurde verwendet, um die elektrisch eluierten Proteine wiederzugewinnen. Die verwendeten Proteinproben waren SDS-PAGE-Standards mit weitem Bereich von Sigma. Dabei handelte es sich um Sojabohnen-Trypsininhibitor (20,1 kDa), Carboanhydrase vom Rind (28,9 kDa), Ovalbumin vom Huhn (42,7 kDa), Serumalbumin vom Rind (66,4 kDa), E. coli beta-Galactosidase (116 kDa) und Myosin (205 kDa). FITC-BSA wurde fluoreszent gemacht, indem man es mit Fluorescein-Isothiocyanat markierte. FITC-markiertes BSA wurde verwendet, um eine qualitative und quantitative Bestimmung des Verdaus und Transfers des Proteins nach der Exposition gegenüber der Gelelektrophorese vorzunehmen. Die Proteinwanderung wurde für 60–90 Minuten bei 100 V auf einer einzigen Spur durchgeführt.
  • Kovalente Anheftung von Trypsin und Blocken der Gelman US450-Membran
  • Benzamidin-HCl (2 mg/ml), TPCK-behandeltes Trypsin (1 mg/ml) und NaBH3CN (10 mg/ml) wurden in 0,5 M Na2SO4, 100 mM Na2HPO4, pH 7,4 gelöst, um mit 0,1 ml pro cm2 eine Gelman/Pall US450-Polyethersulfon-Membran zu beschichten. Diese Aldehyd-aktivierte Membran ist eine jüngst eingeführte, kommerziell erhältliche, modifizierte Polyethersulfon-Membran. Diese Gruppen sind reaktiv gegenüber Nukleophilen, wie etwa Amingruppen von Proteinen oder Peptiden. Es wurde ein entsprechendes Volumen an 1,5 M Na2SO4, 100 mM Na2HPO4, pH 7,4 Puffer hinzugegeben, und man ließ die Reaktion bei RT für 16–18 Stunden unter Schütteln bei 75 rpm ablaufen. Die Abdeckung erfolgte durch die Zugabe von 0,2 M Tris und 5 mg/ml an NaBH3CN. Die Membranen wurden feucht und im Kühlschrank gelagert, oder sie wurden unter Verwendung von Glycerollösung getrocknet.
  • Messung der Trypsin-Aktivität: BAPNA-Assay: Eine 8 mm Durchmesser aufweisende Scheibe einer Trypsin-Verdaumembran (0,5 cm2) wurde zu 3 ml an 0,92 mM BAPNA hinzugegeben und für 30 min bei RT auf einem Orbitalmischer inkubiert. Man quenchte die Reaktion mit 0,5 ml einer 30%igen Essigsäure, und die Trypsin-Aktivität wurde bei 410 nm überwacht und mit Lösungen bekannter Trypsin-Aktivität verglichen.
  • Herstellung der zusammengesetzten Membran – Einfangmembran: Immobilon CD ist eine PVDF-Membran mit quaternären funktionellen Ammoniumgruppen und ist erhältlich bei der Millipore Corporation (Redford, MA). Diese Membran wurde in einer Lösung aus 20 mg/ml Nitrocellulose, 10 mg/ml HCCA, 50% Isopropanol und 50% Aceton vollgesogen. Die Membran wurde dann vollständig getrocknet und in Transblotting-Puffer (unten beschrieben) erneut benetzt.
  • Der verwendete Transblotting-Puffer bestand aus 12 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 100 mM Glycin und 0,01% SDS, pH 8,3. Das Blotten erfolgte auf einer Mini-Trans-Blot-Elektrophorese-Transferzelle (Bio-Rad, Redmond, CA, USA) für 3 bis 3,5 Stunden bei 6 bis 7 V bei Raumtemperatur.
  • Transblotting-Protokoll: Um den enzymatischen Verdau des Proteins während des Elektroblottens durchzuführen, wurden bis zu sieben Schichten aus Trypsin-immobilisierter Membran zwischen dem Polyacrylamidgel (der Proteinquelle) und der zusammengesetzten Einfangmembran als der Sammeloberfläche angeordnet, um einen Transblot-Verdau-Sandwich herzustellen (1 und 2a und 2b). Nach der Prozedur des Elektroblotting-Transfers wurden die zusammengesetzten Sammelmembranen, auf denen die Fragmente des verdauten Proteins gesammelt wurden, für 10 bis 30 Minuten in deionisiertem Wasser gewaschen, bevor die MS-Analyse erfolgte.
  • Herstellung der Membran vor der MALDI-TOF Analyse: Kleine Stücke der zusammengesetzten Einfangmembran (1 × 1 mm) und größere Stücke (mindestens 40 mm im Quadrat), die das Gebiet von Interesse enthielten, wurden aus der zusammengesetzten Einfang-Sammelmembran ausgeschnitten und auf einer einstellbaren MALDI-Probenplatte mit einem härtbaren Leim oder mit einer Silikon-Vakuumschmiere fixiert. Zusätzliche Matrix wurde wie folgt auf der Einfangmembran appliziert: 1 Mikroliter an 10 mg HCCA pro ml in 50% Acetonitril, 0,1% TFA-Lösung wurde zu der anodischen zusammengesetzten Einfangmembran hinzugegeben, oder alternativ wurde die zusätzliche Matrix-Lösung auf die Einfangmembran aufgesprüht, bevor diese auf der MALDI-Platte befestigt wurde.
  • MALDI-TOF-Ausrüstung und Versuchsbedingungen: Die zusammengesetzten Membranen wurden mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer Voyager STR oder mit einem Voyager DEPRO (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA), ausgestattet mit einem 337-nm-Stickstofflaser, analysiert. Der Analysator wurde im Reflektor-Modus bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV, einer Verzögerungszeit der Ionenextraktion von 125 ns und einer Niedrigmassen-Schranke, die auf 800 Da fixiert war, verwendet. Die Laserenergie wurde geringfügig oberhalb des Schwellenwerts für die Produktion von Molekülionen eingestellt. Die Spektren wurden bei einer Summierung von 10 bis 1000 aufeinander folgenden Laserschüssen ohne irgendeine Glättungsprozedur erhalten (4). Für 6a wurden die Spektren auf einem QSTAR PULSAR Hybrid Q-TOF MS (Applied Biosystems) im Interface mit einer orthogonalen MALDI-Ionenquelle aufgenommen; für 6b wurden die Spektren auf einem 4700 Protein Analyzer (Applied Biosystems) aufgenommen.
  • Prozedur
    • 1) Zuerst Laufen lassen des 1D- oder 2D-Gels
    • 2) Vollsaugen lassen des Gels, der Spaltungsmembran, der Einfangmembran und der Filterpapier-Polster im Transferpuffer für 2–5 Minuten
    • 3) Herstellen eines "Sandwichs", beginnend mit der Bodenschicht auf der Anode in folgender Reihenfolge: Filterpapier-Polster, Einfangmembran, Spaltungsmembran(en), Gel, Filterpapier-Polster
    • 4) Zusammenfügen und Transfer bei 7 V für 3,5 Stunden
    • 5) Auseinanderbauen, Abspülen der Einfangmembran mit Wasser, Trocknen, Besprühen mit Matrix-Lösung
    • 6) Trocknen der Einfangmembran und Applizieren auf MALDI-Platte mit Vakuum-Schmiere
    • 7) Scannen im MALDI-TOF MS (–20 Minuten pro Spur, um 161 Spektren bei 250 um Auflösung mit einem 20 Hz Laser aufzunehmen)
  • Ergebnisse
  • Trypsin wurde kovalent an Gelman US450 Aldehyd-aktivierte Membranen angeheftet. Die Dichte an Oberflächenenzym wurde durch einen BAPNA-Test mit 4,6–10,9 Mikrogramm an aktivem Trypsin pro Quadratzentimeter bestimmt. Die Aktivität der Trypsin-gebundenen Gelman US450 Membranen blieb stabil, wenn diese in der Tris-HCl/CaCl2/NaN3-Lösung mit 20% Glycerol bei 4°C für Zeitspannen von bis zu einem Monat gelagert wurden.
  • Versuche, bei denen zwei oder mehr Trypsin-gebundene Membranen zwischengeschaltet wurden, jeweils die eine auf der anderen befindlich, angeordnet zwischen dem Polyacrylamidgel und der anodischen zusammengesetzten Einfangmembran, zeigten weder einen offenkundigen Verlust an Protein noch einen Verlust an Auflösung bei den Elektrotransfer-Prozeduren.
  • Mit FITC markiertes BSA wurde verwendet, um den Verdau und den Transfer des Proteins nach Exposition gegenüber der Gelelektrophorese qualitativ und quantitativ zu bestimmen. Nach der Auftrennung mittels der SDS-PAGE wurden vier Proteine, Rinderserum-Albumin (BSA), Ovalbumin aus Huhn, Carboanhydrase aus Rind und Myosin, die in derselben Bahn in der SDS-PAGE liefen, einem Transblotting durch bis zu sieben Trypsin-gebundene Membranen auf eine Polyethersulfon-Membran unterzogen. Ein Beispiel ist in den 3a und 3b gezeigt. Die oben genannten Proteine wurden über die MALDI-TOF MS (Voyager STR) Spektren ihrer Peptidfragmente korrekt identifiziert, wenn eine automatische Interpretation mit Protein Prospector erfolgte. Ein E. coli-Lysat wurde unter Verwendung von 1D-Gelelektrophorese aufgetrennt und an verschiedenen Positionen auf der Einfangmembran mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert, nachdem das Elektroblotting und der Verdau unter Verwendung des in dieser Erfindung beschriebenen Verfahrens und Apparates durchgeführt worden waren. Ein repräsentatives Spektrum und Peptid-Identifikationsdaten, die an der Position #92 (relative Distanz vom Ausgangspunkt auf einer Einfangmembran) des Gels gewonnen wurden, sind in 10 bzw. Tabelle 1 gezeigt, dies unter Verwendung der Software ChemApplex, wie beschrieben in der ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung der Seriennummer 09/745,920. Proteine, die durch die ChemApplex-Software an Position #92 identifiziert wurden, sind in Tabelle 2 aufgelistet. Ein Hühnerherz wurde gefroren, und es wurde eine Querschnittscheibe mittels einer Rasierklinge erhalten. Das Gewebe wurde direkt auf die Spaltungsmembran aufgebracht, und der „Sandwich" wurde zusammengebaut wie oben beschrieben. Die Einfangmembran wurde gescannt, und die Verteilung von zwei Peptidionen wird in den 8a und 8b gezeigt. Tabelle 1 An Position #92 identifizierte Peptide
    Figure 00250001
    Figure 00260001
    Tabelle 2 An Position #92 identifizierte Proteine
    # acc Protein mw m Tri % Ch % I ppw
    1 P04475 Dnak 68992 7 501 24 20 12
    2 P05825 Ferrienterobactin-Rezeptor 82112 5 451 18 10 8
    3 Z00760 bovines Trypsin na 3 404 60 5 16
    4 P09373 Formiat-Acetyltransferase 1 85234 9 378 20 16 12
    5 P27302 Transketolase 1 72211 5 33 21 4 19
    6 P02996 Elongationsfaktor g 77458 4 31 17 4 19
    Summe 59
  • Wobei die Spaltenüberschriften in den Tabellen 1 und 2 folgendes darstellen: Tabelle 1
    # Reihenfolge in der Proteinliste
    acc Swiss Prot Zugangsnummer
    accM Alternative SwissProt Zugangsnummer (für ein Protein mit niedrigerem Rang)
    #m Protein-Listennummer für die alternative Zugangsnummer
    #r Rang im Bezug auf die Masse, sortiert nach Intensität; 1 ist die Masse mit der größten Intensität
    int Intensität der Masse
    tri Zusammengesetzter Trefferwert für die Übereinstimmung, kombinierend Intensität, ChemScore und Massenfehler auf der Peptidebene
    ch ChemScore des Peptids
    theo Molekulargewicht des Peptids, basierend auf dessen Sequenz
    maldi gemessenes Molekulargewicht für die Masse
    ppm Fehler in "parts per million" zwischen "theo" und "maldi"
    < Aminosäure, die unmittelbar dem vorgeschlagenen Peptid in der Proteinsequenz vorangeht
    Sequenz Sequenz des Peptids
    > Aminosäure nach dem Peptid in der Proteinsequenz
    mod Abkürzung für "Modifikation an Resten im Peptid"
    p Anzahl an im Bezug auf Trypsin fehlenden Spaltungen im Peptid
    Tabelle 2
    # Reihenfolge in der Proteinliste
    acc Swiss Prot Zugangsnummer
    Protein Name des Proteins
    mw Molekulargewicht des Proteins
    m Anzahl der dem Protein zugeordneten Peptide
    tri Zusammengesetzter Trefferwert für die Übereinstimmung, kombinierend Intensität, ChemScore und Massenfehler auf der Proteinebene
    % Ch Prozentualer, dem Protein zugeordneter ChemScore
    % I Prozentuale zugeordnete Intensität
    ppw Nach Intensität gewichteter mittlerer ppm-Fehler für die zugeordneten Peptide

Claims (17)

  1. Verfahren zum Identifizieren oder Quantifizieren von Polypeptiden aus einer Proteinprobe, welches folgendes umfaßt: Abtrennen von Polypeptiden aus der Proteinprobe, um einen Träger bereitzustellen, der die Polypeptide enthält, Bereitstellen wenigstens einer Verdaumembran, die zu dem Träger benachbart ist und auf der wenigstens ein Polypeptid-spaltendes Reagens in einer Menge immobilisiert ist, die wirksam ist, um eine ausreichende Menge an Polypeptiden zu verdauen, um eine anschließende Identifizierung von Polypeptiden in der Probe nach einem einzigen Hindurchtritt der Polypeptide durch die Membran zu ermöglichen, Bereitstellen wenigstens einer Einfangmembran in der Richtung der Migration von Peptidfragmenten der Polypeptide während des Elektroblottens abstromig von der wenigstens einen Verdaumembran, vor der Stufe des Elektroblottens Aufbringen eines MALDI-Matrixmaterials auf die Einfangmembran, Elektroblotten der Polypeptide von dem Träger durch die wenigstens eine Verdaumembran, Sammeln der Fragmente auf der wenigstens einen Einfangmembran und Identifizieren oder Quantifizieren der gesammelten Fragmente mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin das Identifizieren des Polypeptids, aus welchem die Fragmente ursprünglich stammten, umfaßt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Träger ein Elektrophoresegel ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin das Modifizieren der Einfangmembran durch Zugabe von Nitrozellulose umfaßt, um das Einfangen von Peptiden zu fördern.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das MALDI-Matrixmaterial Alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure umfaßt.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin das Markieren der Proteine mit schweren stabilen Isotopen vor der Auftrennung in die Polypeptide umfaßt.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Spaltungsreagens kovalent an die Verdaumembran gebunden ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Verdaumembran aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer modifizierten PVDF-Membran und einer modifizierten Polyethersulfonmembran, und wobei das Spaltungsreagens eine Protease ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Protease Trypsin ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Spaltungsreagens auf der Verdaumembran in der effektiven Menge durch die folgenden Stufen immobilisiert wird: Zugeben eines Salzes, eines Proteaseinhibitors und Umsetzen des Spaltungsreagens mit der Membran unter Bildung einer Schiff-Base, Reduzieren der Schiff-Base mit einem Reduktionsmittel und Entfernen des Proteaseinhibitors von der Membran.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, welches weiterhin das Abdecken restlicher aktiver Gruppen auf der Oberfläche der Membran umfaßt.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin das Fokussieren des Einfangens der Fragmente auf eine diskrete Zone der Einfangmembran umfaßt.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Fragmente auf eine diskrete Zone der Einfangmembran fokussiert werden, indem man eine nicht-leitfähige Bahn zwischen dem Träger und der Einfangmembran bereitstellt, wobei die Bahn wenigstens einen Schlitz oder ein Loch aufweist, durch welchen bzw. welches die Fragmente fließen.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin die Bereitstellung einer zwischengelagerten Einfangmembran zwischen der Verdaumembran und der Einfangmembran umfaßt, um einen Teilsatz der Polypeptide einzufangen.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, welches weiterhin das Freisetzen des eingefangenen Teilsatzes von Polypeptiden und das Elektroblotten des Teilsatzes auf eine zweite Einfangmembran umfaßt.
  16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Träger kein Spaltungsreagens aufweist.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Mehrzahl benachbarter Verdaumembranen vorhanden ist.
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