DE102012011648A1

DE102012011648A1 - Analyse von Mikroben aus Mikrokolonien mittels MALDI-Massenspektrometrie

Info

Publication number: DE102012011648A1
Application number: DE102012011648A
Authority: DE
Inventors: Jochen Franzen; Jens Boßmeyer
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2013-12-12
Anticipated expiration: 2032-06-09
Also published as: GB2505984B; DE102012011648B4; GB2505984A; US20130337502A1; GB201310137D0; US8835176B2

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren für die massenspektrometrische Identifizierung von Mikroben, insbesondere den Zellaufschluss der Mikroben und die Präparation der Mikrobenproteine für eine Spektrenaufnahme mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI). Mikroben aus Mikrokolonien, die in der Regel nach nur sechs- bis achtstündiger Kultivierung entstanden sind, werden direkt auf dem Agar auf physikalischem oder chemischem Wege durch Zerstörung der Zellwände aufgeschlossen. Die freigesetzten Proteine werden dann durch direkten Kontakt mit Kontaktflächen auf Probenträgern auf diese übertragen; dabei kann auch Elektrophorese eingesetzt werden. Die Kontaktflächen können metallisch nackt oder auch mit stark Protein-adsorptiven Substanzen wie beispielsweise Zellulosenitrat (Schießbaumwolle, Kollodiumwolle) oder α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (HCCA) beschichtet sein. Sind die Proteine auf den Kontaktflächen fest adsorbiert, so können sie mit Wasser abgewaschen werden, um Salze, Detergentien und andere Substanzen, die den MALDI-Prozess der Ionisierung beeinträchtigen, wegzuwaschen. Die Proteine werden dann auf den Kontaktflächen der Probenträger mit Matrixsubstanzen zu MALDI-Proben präpariert; die Probenträger werden dann, gegebenenfalls eingepasst in Adapterplatten, einem MALDI-Massenspektrometer zur Aufnahme der Massenspektren zugeführt. Die Mikroben werden durch Ähnlichkeitsvergleiche der Massenspektren dieser Mikrobenproteine mit Referenzspektren identifiziert.

Description

Anwendungsgebiet
Die Erfindung betrifft Verfahren für die massenspektrometrische Analyse von Mikroben aus Kolonien auf Nährmitteloberflächen, insbesondere in einem Massenspektrometer mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI).
Stand der Technik
Die routinemäßig schnelle und fehlerfreie Analyse von Mikroorganismen spielt insbesondere in der klinischen und außerklinischen Infektionsdiagnostik, in der Hygieneüberwachung in Krankenhäusern oder Badegewässern, in der Lebensmittelanalytik, bei der Überwachung und Regelung von biotechnologischen Prozessen oder in der forschenden Mikrobiologie eine wichtige Rolle. Zu den Mikroorganismen, die hier kurz als Mikroben bezeichnet werden, zählen alle mikroskopisch kleinen Lebewesen, beispielsweise einzellige Pilze (z. B. Hefen), Algen oder Protozoen (z. B. Plasmodien als Malaria-Erreger), wenn auch meist der Schwerpunkt der Identifizierungsarbeit auf Bakterien liegt.
Die Identifizierung der Mikroben bedeutet im Prinzip die Bestimmung der Art und damit die Einordnung der Mikroben in das taxonomische Hierarchieschema: Domäne (Bakterien, Archäen, Eukaryoten), Reich, Abteilung, Klasse, Ordnung, Familie, Gattung und Art (Spezies). Da die Bezeichnung „Art” im deutschsprachigen Raum vielfach und in wechselnden Bedeutungen gebraucht wird, wird hier vorwiegend die Bezeichnung „Spezies” gebraucht. Neben der taxonomischen Identifizierung kann die Analyse von Mikroben auch deren Charakterisierung in Bezug auf andere Eigenschaften umfassen, beispielsweise auf die Pathogenität eines Mikroorganismus (Fähigkeit, eine Krankheit auszulösen) oder auf die Resistenz eines Mikroorganismus gegenüber Antibiotika.
Für massenspektrometrische Identifizierungsverfahren werden in der Regel Mikroben aus Analysenproben auf Nährmedien in Petrischalen zu Kolonien herangezüchtet. Die Zeitdauer von der Anlieferung der Analysenproben im Untersuchungslabor bis zur Identifizierung der Spezies wird im Wesentlichen durch diese Zeitdauer der Kultivierung vorgegeben, da die eigentliche massenspektrometrische Bestimmung nur Minuten dauert. Die Zeitdauer für diese Kultivierung beträgt gegenwärtig oft zwischen 18 bis 24 Stunden. Diese Zeitdauer ist für viele Anwendungen zu lang, insbesondere für Anwendungen in der medizinischen Diagnostik. Es besteht daher ein dringender Bedarf, die für die massenspektrometrische Identifizierung benötigte Zeitdauer wesentlich, insbesondere auf einen Arbeitstag, zu verkürzen.
Für die gegenwärtig durchgeführten Verfahren befindet sich das Nährmedium für die Anzucht üblicherweise in einem Agar in einer Petrischale (Agar-Platten), wodurch eine Züchtung von jeweils reinen „Isolaten” in getrennten Kolonien erreicht wird. Agar ist ein gelatinöses Galactose-Polymer mit weit über 90 Prozent Wasser. Das Agar selbst ist unverdaulich und wird von Mikroben kaum angegriffen. Da die Mikroben gegenwärtig überwiegend manuell entnommen werden, sollten die Kolonien für eine sichere Entnahme der Mikroben Durchmesser von mindestens einem halben Millimeter, besser von mindestens einem Millemeter aufweisen. Die Zeitdauer der Züchtung von Kolonien dieser Größe dauert je nach Wachstumskraft der Mikroben viele Stunden oder manchmal sogar Tage; für die klinisch bedeutsamen Spezies werden die Proben auf Agar-Platten gegenwärtig normalerweise etwa 18 bis 24 Stunden kultiviert. Überlagern oder mischen sich die Kolonien, so werden in einer zweiten Züchtung getrennte Kolonien gewonnen.
Bei der manuellen Präparation einer MALDI-Probe wird eine kleine Menge einer ausgewählten Kolonie von der Nährmitteloberfläche auf einen Probenträger übertragen, wozu in der Praxis oft ein hölzerner Zahnstocher verwendet wird, der danach entsorgt wird. Die übertragene Mikrobenmenge wird dann für eine spätere Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) mit einer stark angesäuerten Lösung einer üblichen Matrixsubstanz (meist α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure, HCCA, aber auch 2,5-Dihydroxybenzoesäure, DHB) beträufelt (Matrixlösung). Die Säure (meist Ameisensäure oder Trifluor-Essigsäure) greift die Zellwände an, worauf das organische Lösungsmittel (meist Acetonitril) der Matrixlösung in die mikrobiellen Zellen eindringen und deren geschwächte Zellwände osmotisch platzen lassen kann. Das Zerstören der an sich widerstandsfähigen Zellwände wird „Aufschluss” genannt; durch den Aufschluss werden die löslichen Proteine aus der Zelle freigesetzt. Anschließend wird die Probe durch Verdunstung des Lösungsmittels getrocknet, wobei das gelöste Matrixmaterial auskristallisiert. Die freigesetzten löslichen Proteine der Mikroben, in geringem Umfang auch andere Substanzen der Zelle, werden dabei während der Kristallisation in die Matrixkristalle eingebaut. Es entsteht dabei auf dem Probenträger eine Probenpräparation, die im Folgenden „MALDI-Probe” genannt wird.
Die MALDI-Proben mit den eingebauten Analytmolekülen werden in einem Massenspektrometer mit fokussierten UV-Laserlichtblitzen von wenigen Nanosekunden Dauer beschossen, wobei in den Verdampfungsplasmen Ionen der Analytmoleküle entstehen, die dann im Massenspektrometer nach Ionenmassen voneinander getrennt und gemessen werden können. Für die massenspektrometrische Identifizierung von Mikroben werden derzeit zur Erzielung höchster Empfindlichkeit einfache Flugzeitmassenspektrometer ohne Reflektor verwendet.
Das Massenspektrum ist das Profil der Massenwerte der Analytionen aus den Mikroben. Es handelt sich dabei ganz vorwiegend um Proteinionen, wobei die Ionen mit nützlichster Information für die Identifizierung Massen zwischen etwa 3000 Dalton bis 15000 Dalton haben. Die Proteinionen sind bei diesem Verfahren ganz überwiegend nur einfach geladen (Ladungszahl z = 1), weshalb hier auch einfach von der Masse m der Ionen gesprochen werden kann, statt immer den Begriff der „ladungsbezogenen Masse” m/z zu verwenden, wie es eigentlich in der Massenspektrometrie notwendig ist. Die Identifizierung wird durch Ähnlichkeitsvergleiche der von den Mikroben aufgenommenen Massenspektren mit Referenzspektren einer Referenzbibliothek durchgeführt, siehe dazu das Dokument DE 10 2010 006 450 A1 (M. Kostrzewa), das auch eine detaillierte Schilderung des massenspektrometrischen Verfahrens enthält. Es sind heute in der Medizin verwendbare Referenzbibliotheken mit Referenzmassenspektren von einigen Tausend Mikrobenstämmen kommerziell erhältlich.
Das massenspektrometrische Verfahren zur Identifizierung ist sehr robust; Änderungen der Züchtungsbedingungen oder der Präparationsverfahren wirken sich praktisch nicht auf die Identifizierungsergebnisse aus, weil für jede Spezies praktisch nur genetisch vorgegebene Proteine mit genetisch vorgegebenen Häufigkeiten analysiert werden. Etwa 60 bis 85 Prozent der Proteine stammen aus den Ribosomen, die je nach Spezies eine feste Anzahl zwischen 40 und 60 verschiedener Proteine enthalten. Bakterienzellen enthalten jeweils mehrere Zehntausend identische Ribosome, Zellen von Eukarioten mehrere Hunderttausend. Die Häufigkeiten der gemessenen Proteine hängen daher nicht von Nährbedingungen oder Reife der Kolonie ab, wie es beispielsweise bei Lipoproteinen oder bei den als Energiespeicher dienenden Fettsäuren der Fall ist. Die Robustheit des Verfahrens erlaubt es, Mikroben aus sehr jungen, aus reifen oder sogar aus überalterten Kolonien für die Identifizierung zu verwenden, wobei etwa gleiche Identifizierungserfolge erreicht werden.
Bisher gilt als Faustregel, dass mindestens etwa 10⁵ Mikroben für die Präparation der MALDI-Probe auf der Probenplatte benötigt werden, um eine sichere massenspektrometrische Identifizierung der Mikroben zu gewährleisten. Diese Menge ist kaum mit dem bloßen Auge erkennbar. Mengen zwischen 10⁵ und 10⁷ sind besonders geeignet. Für Eukariotenzellen mit mehreren Hunderttausend Ribosomen ist es bereits gelungen, von einzelnen Zellen brauchbare Massenspektren aufzunehmen. Für Bakterien aber, deren harte Zellwände einen besonderen Aufschluss verlangen, ist es bisher nur in Einzelfällen gelungen, von nur 10³ Individuen oder weniger genügend gute Massenspektren für eine Identifizierung zu erzeugen.
Das massenspektrometrische Verfahren der Identifizierung hat sich als außerordentlich erfolgreich erwiesen. Es ist ab vollendeter Kultivierung sehr schnell, und die Sicherheit für eine richtige Identifizierung ist weit größer als diejenige der bisher angewandten mikrobiologischen Identifizierungsverfahren, wie in verschiedenen Studien nachgewiesen werden konnte.
Das Bestreben nach Automatisierung hat zu Vorrichtungen geführt, die die manuelle Übertragung durch eine maschinelle Übertragung mit einem kleinen Stempelstäbchen ersetzt. So hat das Fraunhofer-Institut für Fabrikbetrieb und -automatisierung (Magdeburg) einen Roboter namens „MiRob” entwickelt, der diese Aufgabe übernehmen kann (siehe: O. Lange et el. (2008) "MIROB: automatic rapid identification of micro-organisms in high through-put", Industrial Robot: An International Journal, Vol. 35 Iss: 4, pp. 311–315 oder Patent DE 10 2004 020 885 B2 ). Der Roboter wird als MiRob 300i von der Firma Mess-, Prüf- und Handlungs-Systeme GmbH, Reutlingen, hergestellt. Auch hier werden, wie schon bei der manuellen Übertragung, die Mikroben von der Kolonie durch ein Werkzeug, hier das Stempelstäbchen, mittelbar auf den massenspektrometrischen Probenträger übertragen. Die Kolonien sollen auch hier einen Mindestdurchmesser von 0,5 Millimetern haben. Die bisher verwendeten Übertragungswerkzeuge (Zahnstocher, Stempelstäbchen) sind für den einmaligen Gebrauch bestimmt.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Mikroben anzugeben, deren Zeitbedarf von der Anlieferung von zu untersuchenden Proben (Analysenproben) bis zur Identifizierung gegenüber gegenwärtigen Verfahren wesentlich, bevorzugt auf einen Arbeitstag, verkürzt ist. Das Verfahren soll zudem zuverlässig und automatisierbar sein und wenig Verbrauchsmaterial benötigen.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Mikroben auf einer Nährmitteloberfläche in einem Massenspektrometer mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption bereit, mit den Schritten: (a) Mikroben werden auf der Nährmitteloberfläche aufgeschlossen, (b) die durch den Aufschluss freigesetzten Mikrobenproteine werden durch direkten Kontakt auf eine Kontaktfläche eines Probenträgers übertragen, (c) die übertragenen Mikrobenproteine werden auf der Kontaktfläche des Probenträgers zu einer MALDI-Probe präpariert, und (d) der Probenträger mit der MALDI-Probe wird dem Massenspektrometer zur Analyse zugeführt. Anstelle der Ionisierung durch MALDI können auch andere Ionisierungsarten verwendet werden, bei denen sich die zu ionisierenden Substanzen auf einem Probenträger befinden, wie beispielsweise die Clusterionisierung nach EP 1 200 984 B1 , Desorption Electrospray Ionization (DESI) nach WO 2005/094389 A2 oder Matrix Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (MALDESI) nach DE 10 2004 002 729 A1 . Dabei kann die Präparation einer massenspektrometrischen Probe aus dem Aufschluss der Mikroben und der Übertragung von Mikrobenproteinen auf den Probenträger bestehen.
Mikroben aus Mikrokolonien, die in der Regel nach nur sechs- bis achtstündiger Kultivierung entstanden sind und dann etwa einen Durchmesser von 50 bis 200 Mikrometer aufweisen, werden direkt auf der Nährmitteloberfläche, wie z. B. einer Agaroberfläche, auf physikalischem oder chemischem Wege durch Zerstörung der Zellwände aufgeschlossen. Die freigesetzten Proteine werden dann durch direkten Kontakt mit Kontaktflächen auf Probenträgern auf diese übertragen; die Übertragung kann durch Elektrophorese unterstützt werden. Die Kontaktflächen können metallisch nackt oder auch mit stark Protein-adsorptiven Substanzen wie beispielsweise Zellulosenitrat (Schießbaumwolle, Kollodiumwolle) oder α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (HCCA) beschichtet sein. Sind die Proteine auf den Kontaktflächen fest adsorbiert, so können sie kräftig mit Wasser gewaschen werden, um Salze, Detergentien und andere Substanzen, die den MALDI-Prozess der Ionisierung beeinträchtigen, wegzuwaschen. Die Proteine werden dann auf den Kontaktflächen der Probenträger mit Matrixsubstanzen zu MALDI-Proben präpariert; die Probenträger werden dann, gegebenenfalls eingepasst in Adapterplatten, einem MALDI-Massenspektrometer zur Aufnahme der Massenspektren zugeführt. Die Mikroben werden durch Ähnlichkeitsvergleiche der Massenspektren dieser Mikrobenproteine mit Referenzspektren identifiziert.
Die aufgeschlossenen Mikroben können stirnseitig mit einem stiftförmigen Probenträger (Probenträgerstift) in Kontakt gebracht werden. Die Kontaktfläche des stiftförmigen Probenträgers ist so klein, dass nur Mikrobenproteine einer einzelnen Kolonie auf den stiftförmigen Probenträger übertragen werden. Der stiftförmige Probenträger wird nach der Übertragung von Mikrobenproteinen bevorzugt so in eine Adapterplatte eingebracht, dass die Stirnseite des stiftförmigen Probenträgers mit der Oberfläche der Adapterplatte im Wesentlichen formschlüssig fluchtet. Im Wesentlichen formschlüssig bedeutet hier, dass eine massenspektrometrische Analyse in einem MALDI Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Ioneneinschuss mit hinreichender Auflösung möglich ist. Mikroben von unterschiedlichen Kolonien können jeweils auf einen von mehreren stiftförmigen Probenträger übertragen werden, die zusammen in eine Adapterplatte eingebracht und in der Adapterplatte dem Massenspektrometer zugeführt werden. Es ist auch möglich, dass Mikroben aus einer Kolonie auf mehrere stiftförmige Probenträger übertragen werden. Die Stirnseiten der stiftförmigen Probenträger weisen bevorzugt Oberflächen von weniger als neun Quadratmillimeter, insbesondere von weniger als vier Quadratmillimeter auf.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren unter Verwendung von stiftförmigen Probenträgern besteht beispielsweise aus den folgenden Schritten: Aufnahme eines Bildes der Nährmitteloberfläche, Ermittlung der Positionen von Kolonien aus dem Bild, Aufschluss der Mikroben an den ermittelten Positionen, Übertragung der aufgeschlossenen Mikrobenproteine an den ermittelten Positionen auf jeweils einen stiftförmigen Probenträger, Einführung der stiftförmigen Probenträger in eine Adapterplatte, Präparation von MALDI-Proben der Mikrobenproteine auf den stiftförmigen Probenträgern, Einschleusen der Adapterplatte in ein Massenspektrometer und Spektrenaufnahmen mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption an den Positionen der stiftförmigen Probenträger in der Adapterplatte.
Die aufgeschlossenen Mikroben können auch mit einem plattenförmigen Probenträger (Probenträgerplatte) in Kontakt gebracht werden. Die Kontaktfläche des plattenförmigen Probenträgers ist so groß, dass Mikrobenproteine von mehreren Kolonien gleichzeitig auf den plattenförmigen Probenträger übertragen werden können. Dabei wird die Kontaktfläche in bevorzugter Weise parallel zur Nährmitteloberfläche ausgerichtet und dort aufgesetzt oder leicht aufgepresst. Ein oder mehrere plattenförmige Probenträger können nach der Übertragung auf einer Adapterplatte angeordnet werden und dort fixiert werden, beispielsweise durch mechanische oder magnetische Kräfte. Die Kontaktfläche eines plattenförmigen Probenträgers kann beispielsweise einen Durchmesser etwa ein bis acht Zentimeter aufweisen, insbesondere an den Innendurchmesser einer für die Aufzucht verwendeten Petrischale angepasst sein.
Bei der Verwendung eines plattenförmigen Probenträgers kann die Nährmitteloberfläche vor oder nach dem Aufschluss der Mikroben abgebildet werden und die Lage des plattenförmigen Probenträger zur Nährmitteloberfläche während der Kontaktübertragung bestimmt werden. Aus dem Bild und der Lage können die Positionen der übertragenen Mikrobenproteine auf dem Probenträger ermittelt werden. Die MALDI-Proben werden bevorzugt nur an den ermittelten Positionen präpariert und die massenspektrometrische Analysen werden nur an den präparierten MALDI-Proben durchgeführt. Es ist allerdings auch möglich, dass auf der gesamten Kontaktfläche des Probenträgers eine Matrixschicht präpariert wird und dass die massenspektrometrischen Analysen nur an den ermittelten Positionen durchgeführt werden. Des Weiteren kann beim Aufbringen der zu untersuchenden Analysenprobe auf die Nährmitteloberfläche die Spur des Aufbringens aufgezeichnet werden und die massenspektrometrischen Analysen nur entlang der aufgezeichneten Spur durchgeführt werden.
Die Erfindung gibt somit Verfahren zur Aufnahme von Massenspektren der Mikrobenproteine an, die zur Identifizierung geeignet sind und für die meisten der klinisch bedeutsamen Mikroben mit einer Kultivierungszeit von maximal etwa acht Stunden auskommen, so dass das massenspektrometrischen Analyseverfahren weniger als einen Arbeitstag benötigt. In dieser kurzen Zeit werden auf Agar nur Mikrokolonien mit etwa 10³ bis 10⁵ Individuen gebildet. Auch für langsam wachsende Mikroben, die bisher viele Tage kultiviert werden mussten, kann die Zeitdauer für eine Identifizierung auf die Hälfte oder sogar ein Viertel der bisher benötigten Zeit reduziert werden.
Der Zellaufschluss der Mikroben, also die Zerstörung ihrer Zellwände, kann physikalisch durch Ultraschall, durch elektromagnetische Strahlung (z. B. durch Infrarotstrahlung) oder hohen Druck bewirkt werden. Es ist möglich, dass die Positionen von Kolonien auf der Nährmitteloberfläche ermittelt werden, Kolonien ausgewählt werden und der Ultraschall oder die Infrarotstrahlung jeweils lokal begrenzt auf die ausgewählten Kolonien einwirkt. Beispielsweise kann eine eng fokussierte Infrarotstrahlung aus Laserdioden die Mikroben zum Platzen bringen. Ultraschall mit 20 bis 30 Kilohertz kann mit einer Mikrospitze in sehr kurzer Zeit einen gezielten Zellaufschluss aller Mikroben einer Mikrokolonie bewirken, ohne die Proteine im Inneren der Zelle zu schädigen. Auch eine mechanische Zerstörung ist möglich: Bei der Stickstoff-Dekompressionsmethode wird zunächst durch hohen Druck Stickstoff in den Mikroben gelöst; eine schnelle Dekompression lässt dann die Mikroben bersten.
Die Mikroben können aber auch durch die Zugabe einer Substanz, die in der Regel in gelöster Form vorliegt, chemisch aufgeschlossen werden. Ein chemischer Zellaufschluss kann beispielsweise durch das Enzym Lysozym (auch Muramidase genannt) erreicht werden; das Enzym greift das Muramingerüst (die Peptidoglycanhülle) von bakteriellen Zellwänden an. Für gramnegative Bakterien muss zunächst etwas Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugegeben werden, bevor das Lysozym wirken kann. Eine abschließende Zugabe von Octoxinol 9 (Triton^® X-100), einem nichtionischen Tensid aus der Gruppe der Octylphenolethoxylate, lysiert dann die Zellwand. Die Zellwand kann auch durch Säuren wie Ameisensäure oder Trifluoressigsäure so geschwächt werden, dass die Zugabe eines Lösungsmittel-Wasser-Gemisches in die Zellen eindringen und sie osmotisch zum Platzen bringen kann. Wie bei einem lokal begrenzten physikalischen Aufschluss ist es auch hier möglich, dass die Positionen von Kolonien auf der Nährmitteloberfläche ermittelt werden, Kolonien ausgewählt werden und die aufschließende Substanz jeweils lokal begrenzt zu den ausgewählten Kolonien gegeben wird. Andererseits kann die aufschließende Substanz auch über der Nährmitteloberfläche versprüht werden.
Die Kontaktfläche der Probenträger kann beispielsweise die Oberfläche einer beliebig geformten Probenträgerplatte von etwa ein bis acht Zentimeter Durchmesser sein, die durch leichtes Aufpressen auf eine Agar-Oberfläche gleichzeitig die Mikrobenproteine vieler aufgeschlossener Kolonien aufnehmen kann, oder aber auch nur die stirnseitige Oberfläche eines dünnen Probenträgerstiftes mit nur etwa zwei Millimeter Durchmesser für die Abnahme von Mikrobenproteinen aus jeweils nur einer ausgewählten Mikrokolonie.
Die Oberfläche der Nährmedien wird bevorzugt vor dem Aufschluss der Mikroben abgebildet, um Informationen über die Lage der Kolonien, insbesondere der Mikrokolonien, zu erhalten. Die Positionsdaten können zur Steuerung des physikalischen oder chemischen Aufschlusses und zur Steuerung der Übertragung der Mikrobenproteine von den Nährmedien auf die Kontaktfläche dienen, insbesondere der Übertragung auf dünne Probenträgerstifte. Die Positionsdaten aus dem digitalen Bild können aber auch zur Steuerung der Abtastung größerer Probenträgerplatten mit dem Laserstrahl während der Spektrenaufnahme dienen. Die Nährmitteloberfläche wird bevorzugt mittels lichtoptischer Messverfahren abgebildet, besonders bevorzugt mit einem Auflichtmikroskop im sichtbaren Spektralbereich. Das lichtoptische Messverfahren kann auch eine ortsaufgelöste Messung von Streulicht, der Raman-Streuung oder der Fluoreszenz sein. Die Abbildung der Nährmitteloberfläche erfolgt bevorzugt vor dem Aufschluss der Mikroben, kann aber auch nach einem ganzflächigen Aufschluss der Mikroben erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zeichnen sich dadurch gegenüber dem Stand der Technik aus, dass sie durch den Wegfall von Übertragungswerkzeugen weniger Verbrauchsmaterial benötigen und damit kostengünstiger sind. Gegenüber dem händischen Übertragen der Mikroben von verschiedenen Analysenproben auf einen massenspektrometrischen Probenträger lassen sich durch die direkte Kontaktübertragung Fehler in der Probenzurordnung ausschließen, indem ein Identifizierungskennzeichen der Analysenprobe, das auf dem Träger des Nährmittels gespeichert ist, jeweils bei der Übertragung automatisch auf den jeweils verwendeten massenspektrometrischen Probenträger übertragen wird. Durch die Übertragung der Mikrobenproteine mittels einer protein-adsorptiven Beschichtung können MALDI Massenspektren mit geringer Signalunterdrückung der Mikrobenproteine aufgenommen werden, insbesondere bei einer zusätzlichen Aufreinigung der Oberfläche nach der Übertragung der Mikrobenproteine.
Beschreibung der Abbildungen
gibt ein Beispiel für einen einfachen Probenträgerstift (3) wieder, mit einer als Kontaktfläche dienenden Stirnfläche, die eine zentrale Belegung (1) mit einer Protein-adsorptiven Schicht und einen Rand (2) aufweist, der unbeschichtet, aber beispielsweise auch hydrophob beschichtet sein kann. Der Probenträgerstift (3) hat in diesem Beispiel einen Durchmesser von etwa zwei Millimeter und ist etwa acht Millimeter lang.
zeigt eine Probenträgerplatte (5) mit Kontaktfläche (4) und Positionsmarkierungen (7) auf der Kontaktfläche. Die Probenträgerplatte (5) ist in diesem Beispiel rund, kann aber sonst beliebige Formen beliebiger Größe zwischen einem und acht Zentimeter Durchmesser haben. Die Fläche der probenträgerplatte entspricht bevorzugt der Fläche des Nährmediums, also etwa der Form und Fläche einer Petrischale.
In ist dargestellt, wie die Probenträgerstifte (3) in eine Adapterplatte (10) so eingesteckt sind, dass ihre Stirnflächen mit der Oberfläche der Adapterplatte fluchten.
zeigt eine Adapterplatte (12) mit fluchtend eingefügten Probenträgerplatten (5). Die Probenträgerplatten (5) haben auf der Rückseite Griffstücke (6), mit denen sie von einem Robotersystem ergriffen und auf die Nährmittelplatten aufgedrückt werden können.
gibt eine Vorrichtung für den Aufschluss der Mikroben einer Kolonie in einer Petrischale (22) und zur Übertragung der Mikrobenproteine auf Probenträgerstifte (3) wieder. Die Vorrichtung hat eine Fußplatte (20), auf der sich zwei horizontal in zwei Richtungen wirkende Bewegungseinheiten (23) und (24) befinden, mit der sich die Petrischale (22) und ein Vorratsbehälter (29) für Probenträgerstifte genau positionieren lassen. An der Trägersäule (21) sind eine Kamera (25) und ein Gelenk (26) mit zwei starren Armen befestigt. An den Armen befinden sich Halterungen (27) und (28) für Werkzeuge, mit denen sich je nach eingesetztem Verfahren Ultraschallspitzen, Mikrodispenser oder Probenträgerstifte senkrecht bewegen lassen, beispielsweise um sie auf das Agar aufzusetzen. Probenträgerstifte können aus dem Vorratsbehälter (29) entnommen und wieder zurückgesteckt werden. Das Gelenk (26) lässt sich zwischen festen Winkelpositionen drehen, um die verschiedenen Werkzeuge über dem Agar positionieren zu können, wobei die Feinjustierung der Position durch die Bewegungseinheit (23) vorgenommen wird, gesteuert durch Positionsdaten aus dem Bild der Kamera (25).
stellt eine Petrischale (30) in Aufsicht dar, mit einer Spur (31) einer manuell aufgetragenen Analytlösung. Der Vorgang des Auftragens kann digital fotografiert werden, und das Bild (oder die Videoaufnahme) kann, nach Kultivierung der Mikroben zum gezielten Aufschluss der Mikroben längs der Spur und zur Steuerung der Laserabtastung auf der Kontaktoberfläche der Probenträgerplatte während der massenspektrometrischen Analyse dienen.
Bevorzugte Ausführungsformen
Für die nachfolgend geschilderten Ausführungsformen wird eine Analysenprobe mit unbekannten Mikroben, meist Bakterien, in üblicher Weise auf Agar in einer Petrischale aufgestrichen und für sechs bis acht Stunden bei optimaler Temperatur (meist 37° Celsius) in einem Brutschrank kultiviert. Die meisten der klinisch bedeutsamen, pathogenen Mikroben teilen sich nach Zeitspannen zwischen 15 und 45 Minuten; es wachsen dabei auf der Nährmitteloberfläche Mikrokolonien, die theoretisch bei 10 Generationen etwa 10³ Individuen und bei 20 Generationen etwa 10⁶ Individuen enthalten können; wobei aber bei höheren Generationszahlen das Wachstum auf dem Agar so stark eingeschränkt ist, dass die theoretischen Werte nicht erreicht werden. Außerdem gibt es auch klinisch bedeutsame Ausnahmen mit langsamem Wachstum, die einer besonderen Behandlung bedürfen.
Der Zellaufschluss kann bevorzugt in einer Vorrichtung vorgenommen werden, wie sie in dargestellt ist. Die Petrischale (22) wird dabei mit Klammern auf der Bewegungseinrichtung (23) befestigt. Bevor die Mikroben aufgeschlossen werden, ist es zweckmäßig, mit einer hoch auflösenden Digitalkamera (25) (oder einem Auflichtmikroskop) stark vergrößerte Bilder der Oberfläche des Nährmediums in der Petrischale (22) aufzunehmen, um die Positionen von Mikrokolonien bestimmen zu können. Mikrokolonien mit nur 1000 Bakterien haben etwa 0,05 Millimeter Durchmesser; bei richtiger Beleuchtung und Vergrößerung können diese fotografisch erkannt werden. Die Positionsdaten der Mikrokolonien können durch Bilderkennungsverfahren automatisch ermittelt werden; dabei kann durch vorgegebene Parameter für eine Charakterisierung der Mikrokolonien auch eine Auswahl der Mikrokolonien für eine Identifizierung automatisiert werden. Die Parameter können insbesondere Größe, Form, Reflektionsstärke und Farbe der Mikrokolonien betreffen. Es können aber auch die Mikrokolonien durch Anklicken ihrer Position auf einem Bildschirm, der das Bild wiedergibt, visuell festgelegt und dabei für einen Zellaufschluss und eine Übertragung der freigesetzten Proteine ausgewählt werden.
Es werde hier zunächst ein Verfahren beschrieben, das mit einem Zellaufschluss der Mikroben ausgewählter Mikrokolonien durch Ultraschall arbeitet. Dazu wird ein Ultraschallgerät mit 20 bis 30 Kilohertz verwendet, das mit einem Boosterhorn von 12,5 bis 8 Zentimeter Länge aus Titan mit einer Mikrospitze ausgestattet ist, dessen Stirnfläche einen Durchmesser von nur etwa einem Millimeter hat. Die Länge muss gerade λ/2 betragen, um in Resonanz schwingen zu können und eine hohe Schwingungsamplitude bis zu einem Mikrometer zu liefern. Die Mikrospitze ist beispielsweise an der Halterung (28) befestigt, die durch Drehung des Gelenks (26) über die Petrischale (22) schwenken kann. Die Mikrokolonie wird durch die Bewegungsvorrichtung (23) genau unter die Mikrospitze gefahren; die Bewegungseinrichtung (23) für die Petrischale wird dabei mit Hilfe der Positionsdaten aus den Bildern der Kamera (25) gesteuert. Die Spitze wird mit Wasser befeuchtet auf die Kolonie aufgesetzt. Nach dem Aufsetzen der Ultraschallspitze werden die Zellwände der Mikroben durch die Bildung von Kavitationen in wenigen Sekunden zerstört; die löslichen Proteine werden freigesetzt.
Sofort nach dem Zellaufschluss wird, bevorzugt mit der gleichen Vorrichtung nach , die auch die Ultraschall-Mikrospitze aufgesetzt hat, durch die Halterung (27) ein stiftförmiger Probenträger (3) aufgesetzt, um die freien Proteine an die Kontaktfläche zu binden. Die Übertragung verwendet kleine Probenträgerstifte (3), wie sie in wiedergegeben werden. Die Vorrichtung nach ermöglicht die Entnahme der Probenträgerstifte (3) aus einem positionierbaren Vorratsbehälter (29) und ihr Zurückstecken. Die Probenträgerstifte (3) werden mit ihrer Stirnfläche zentral auf jeweils eine aufgeschlossene Mikrokolonie aufgesetzt oder bei Vorhandensein eines Flüssigkeitstropfens mit diesem in Kontakt gebracht, um die Proteine aus den Mikrokolonien durch Kontakt auf die Stirnflächen der Probenträgerstifte (3) zu übertragen. In ist ein Probenträgerstift (3) mit zwei Millimeter Durchmesser gezeigt; die Stirnfläche sollte maximal etwa neun, vorzugsweise weniger als vier Quadratmillimeter betragen. Die Probenträgerstifte (3) müssen aus elektrisch leitendem Material bestehen, beispielsweise aus Metall oder auch aus leitendem Kunststoff. Sie können später passgenau in entsprechende Aufnahmelöcher geeigneter Adapterplatten (10), die sich für das Einschleusen in das MALDI-Massenspektrometer eignen, eingesetzt werden. Die Stirnflächen der Probenträgerstifte (3) können nackt sein, aufgeraut oder glatt; die Stirnflächen können aber auch in besonderer Weise mit Protein-adsorptiven Schichten (1) präpariert sein, wie in gezeigt, mit einem Rand (2), der entweder unbelegt oder hydrophob beschichtet ist. Die Probenträgerstifte (3) sind in der Regel für einmaligen Gebrauch bestimmt, wie es für diagnostische Verfahren vorteilhaft ist. Die Präparation für den MALDI-Prozess und die Laserdesorption selbst finden auch auf dieser Stirnfläche statt.
Als Protein-adsorptive Schichten können beispielsweise dünne Auftragungen von Zellulosenitraten dienen, wie sie als Blotmembranen in der Gel-Elektrophorese verwendet werden. Dazu kann eine geringe Menge Schießbaumwolle (vorwiegend Zellulosetrinitrat) oder Kollodiumwolle (vorwiegend Zellulosedinitrat) in viel Aceton gelöst wie ein dünner Lack aufgetragen und getrocknet werden. Die Zellulosenitratschicht sollte höchstens ein Mikrometer dick sein. Diese Zellulosenitratschichten binden die Proteine durch Adsorption außerordentlich fest, so dass die Schichten nach Belegung mit den Proteinen gründlich mit Wasser gewaschen werden können. Die Probenträgerstifte mit den Zellulosenitratschichten werden befeuchtet und auf die aufgeschlossene Mikrobenkolonie aufgesetzt. Ein mehrfaches Betupfen oder eine Hin- und Herbewegung hilft, die Proteine schneller auf der Kontaktfläche zu binden.
Die Proteinübertragung kann in einer besonderen Ausführungsform durch Elektrophorese unterstützt werden. Dazu ist die Mikrobenkolonie vor oder nach dem Aufschluss mit einer Lösung von SDS (Natriumdedecylsulfat) zu beträufeln. Die Moleküle von SDS lagern sich an die freigesetzten Proteine an und bilden einen negativen Ladungsüberschuss. Ist das Agar in der Petrischale (22) mit einer Elektrode unterlegt, so kann man mit einer positiven Spannung am Probenträgerstift (3) die freien Proteine quantitativ aus dem Agar herausziehen und an der Zellulosenitratschicht binden. Das SDS lässt sich dann von der Stirnfläche des Probenträgerstifts (3) vollständig abwaschen, ohne dass dabei Proteine verloren gehen. Dieses Verfahren eignet sich besonders, wenn das Agar sich durch das Aufsetzten der Ultraschallsonde verflüssigt, aber nach Beendigung der Beschallung wieder schnell geliert und die freigesetzten Proteine einschließt.
Bei der anschließenden Präparation der Proteine auf den Zellulosenitratschichten zu MALDI-Proben soll das Lösungsmittel für die Matrixsubstanz auch Aceton oder Acetonitril enthalten, um die dünne Zellulosenitratschicht aufzulösen und die Proteine wieder freizusetzen. Bei der Verdampfung der Lösungsmittel und der Kristallisation der Matrixsubstanz werden die Proteinmoleküle wie üblich in die Matrixkristalle eingebaut.
Das in der MALDI-Probe verbleibende Zellulosenitrat stört den MALDI-Vorgang der Ionisierung nicht, da es selbst wie eine Matrixsubstanz wirkt. Es ist bereits vorgeschlagen worden, Zellulosenitrat allein oder in Mischungen mit anderen Matrixsubstanzen für die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption zu verwenden; siehe dazu das Dokument DE 196 17 011 C2 (C. Köster und J. Franzen, 1996). Es ist bisher nicht untersucht worden, ob die Dünnschicht aus Zellulosenitrat mit den adsorbierten Proteinmolekülen bereits allein und eigenständig als MALDI-Probe verwendet werden kann. Es ist aber möglich, eine lackartige Schicht aus einer Mischung von Zellulosenitrat mit HCCA herzustellen. Diese kann dann sowohl für die Adsorption wie auch für die Ionisierung verwendet werden.
Eine andere Variante einer Protein-adsorptiven Schicht besteht aus Matrixmaterial, beispielsweise wasserunlöslichem HCCA (α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure). Eine HCCA-Dünnschicht adsorbiert ebenfalls Proteine so fest, dass Salze, Detergentien und andere störende Substanzen vorsichtig abgewaschen werden können. Nach dem Trocknen kann die HCCA-Dünnschicht mit etwas Acetronitril angelöst werden. Beim Verdunsten des Acetonitrils rekristallisiert die Dünnschicht und baut die Proteinmoleküle in die Dünnschicht ein.
Es soll jetzt ein Verfahren für den Zellaufschluss auf chemischem Wege betrachtet werden. Ein chemischer Zellaufschluss mit Lysozym (einer Muramidase) greift enzymatisch das Muramingerüst der Peptidoglycanhülle der bakteriellen Zellwände an. Es gibt mehrere Typen von Lysozymen mit ähnlichem Aufbau und gleicher Wirkungsweise. Da gram-negative Bakterien eine äußere Zellmembran mit Lipopolysacchariden besitzt, die von den Lysozymen nicht durchdrungen werden kann, muss zunächst etwas Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) eingesetzt werden. Dieses löst die Lipopolysaccharide auf, so dass das Lysozym wirken kann. Eine abschließende Zugabe von Octoxinol 9 (Triton^® X-100), einem nichtionischen Tensid aus der Gruppe der Octylphenolethoxylate, lysiert dann die Zellwand und verhindert gleichzeitig eine Aggregation der Proteine.
Mit Mikrodispensern (zum Beispiel Piezo-Mikrodispenser) können die verschiedenen Lösungen mit EDTA, Lysozym oder Octoxinol 9 einzeln oder gemischt auf einzelne Mikrokolonien aufgebracht werden. Der Mikrodispenser kann beispielsweise an der Halterung (28) der Vorrichtung aus angebracht sein. Sind die Mikroben einer Kolonie aufgeschlossen, so können die freigesetzten Proteine wie oben geschildert auf die Stirnfläche eines Probenträgerstiftes übertragen werden. EDTA und Octoxinol 9 können dann leicht abgewaschen werden. Das Lysozym (etwa 14, 3 Kilodalton) kann im Massenspektrum auftauchen; das muss bei der Identifizierung durch Ähnlichkeitsvergleiche mit Referenzspektren berücksichtigt werden.
Die Zellwand kann auch durch Säuren wie Ameisensäure oder Trifluoressigsäure so geschwächt werden, dass die Zugabe eines Lösungsmittel-Wasser-Gemisches in die Zellen eindringen und sie osmotisch zum Platzen bringen kann.
Der Einsatz von Probenträgerstiften für die Übernahme der Proteine aus wenigen ausgesuchten Kolonien hat den Vorteil, dass die Petrischale mit dem Nährmittel weiter kultiviert werden kann, um später auch langsam wachsende Mikroben identifizieren zu können.
Die Präparation der übertragenen Proteine auf den Stirnflächen der Probenträgerstifte (3) findet am besten dann statt, wenn die Probenträgerstifte (3) in die Adapterplatte (10) eingesetzt sind; die Präparation kann dann in Pipettierautomaten erfolgen. Die Präparation der freigesetzten Proteine mit der Matrixsubstanz erfolgt bei HCCA-Dünnschichten einfach durch einen Tropfen (etwa 0,5 Mikroliter) Acetonitril, der die Dünnschicht ein wenig löst und beim Verdunsten ein Rekristallisieren bewirkt. Dabei werden die Proteine in die HCCA-Dünnschichten eingelagert. Bei Nitrozelluloseschichten muss jetzt die Lösung der Matrixsubstanz zugeführt werden. Für das Aufbringen der kleinen Flüssigkeitsmengen hat sich ein berührungsloses Aufbringen bewährt, wobei ein kleiner Tropfen, der gesteuert aus einer zentralen Kanüle herausgedrückt wird, durch einen kurzen Druckstoß eines Gases aus einer konzentrisch angeordneten zweiten Kanüle den Tropfen löst und auf das Ziel fallen lässt.
Die Präparation für 96 Proben kann in weniger als zehn Minuten durchgeführt werden. Die Adapterplatte (10) mit den fertig präparierten MALDI-Proben kann dann durch eine Vakuumschleuse in die Ionenquelle eines Massenspektrometers eingeführt werden. Die Aufnahme der Massenspektren, jeweils zusammengesetzt aus Hunderten von Einzelspektren, benötigt in modernen MALDI-Massenspektrometern nur etwa eine Sekunde pro Probe. Kann das Identifizierungsprogramm genügend schnell arbeiten, so können die Identifizierungsergebnisse für 96 MALDI-Proben in weniger als fünf Minuten nach Einschleusen der Adapterplatte vorliegen. Die Gesamtzeit der Arbeiten nach Abschluss der Kultivierung, also Aufschluss, Kontaktübertragung, Probenpräparation, Spektrenaufnahme und Identifizierung, beträgt also etwa eine halbe Stunde.
Eine weitere Ausführungsform des Übertragungsverfahrens betrifft die gleichzeitige Kontaktübertragung der Proteine aus vielen Kolonien bzw. Mikrokolonien auf die Kontaktfläche (4) einer größeren Probenträgerplatte (5). Der Zellaufschluss kann dabei für einzelne Kolonien einzeln durch Ultraschall oder chemisch durchgeführt werden, wie oben geschildert, er kann aber auch für alle Kolonien auf dem Agar gleichzeitig erfolgen. Der gleichzeitige Zellaufschluss wird am besten chemisch mit Aerosolen der notwendigen Lösungen durchgeführt, wobei die Tröpfchen der Aerosole auf dem Agar abgelagert werden, um eine gleichmäßige Präparation ohne starke seitliche Verschmierungen der Proteine zu erhalten. Flächige Präparationsverfahren dieser Art und entsprechende Vorrichtungen sind im Dokument DE 10 2006 059 695 B3 (M. Schürenberg, identisch mit GB 2 446 251 A und US 2008/0142703 A1 ) wiedergegeben.
Eine als Beispiel dienende runde Ausführungsform der Probenträgerplatte (5) ist in gezeigt. Die Probenträgerplatte (5) kann aber im Prinzip eine beliebig geformte Platte von etwa ein bis acht Zentimeter Durchmesser sein, die durch Aufsetzen oder leichtes Aufpressen auf die Nährmittel-Oberfläche gleichzeitig die Proteine mehrerer aufgeschlossener Mikrokolonien aufnehmen kann. Die Probenträgerplatte (5) kann manuell, aber beispielsweise auch durch eine Vorrichtung aufgedrückt werden, wobei auch der Aufpressdruck und die parallele Ausrichtung gesteuert werden kann. Die Oberfläche (4) dieser Probenträgerplatte (5) kann in ähnlicher Weise wie die der Probenträgerstifte präpariert sein, um die Proteine möglichst gut zu binden. Sie kann beispielsweise mit den gleichen stark adsorptiven Schichten belegt sein wie die Probenträgerstifte. Auch hier kann die Elektrophorese für die Übertragung der Proteine eingesetzt werden. Die Probenträgerplatten (5) tragen auf ihrer Vorder- und Rückseite Markierungen (7), die der Positions- und Lagebestimmung dienen. Zweckmäßigerweise nimmt eine Kamera ein digitales Bild der Rückseite der Probenträgerplatte im aufgesetzten Zustand auf, um die Positionen relativ zu den Kolonien auf dem Agar zu dokumentieren. Aus diesem Bild können die Positionen der übertragenen Mikrokolonien auf der Vorderseite ermittelt werden.
Die Probenträgerplatten (5) können ebenfalls in besonders geformte Adapterplatten (12) eingesetzt werden, wobei die Adapterplatten (12) eine Außenkontur haben, die für das Einschleusen in die Ionenquelle des Massenspektrometers erforderlich ist. Aus den Positionen der auf der Vorderseite der Probenträgerplatten sichtbaren Markierungen können die Positionen der Mikrobenproteine aus den Kolonien relativ zur Adapterplatte bestimmt werden. Mit Kenntnis dieser Positionen lässt sich der Laserstrahl für die Spektrenaufnahme so steuern, dass nur die Stellen abgetastet werden, die Proteine aus den aufgeschlossenen Mikrokolonien enthalten. Die Spektrenaufnahme von den Probenträgerplatten kann im Prinzip auch in einem Abrastern der ganzen Kontaktoberfläche bestehen, was aber in der Regel zu viel Zeit kostet. Es ist daher besser, sich auf die Positionsdaten aus den Digitalbildern zu stützen und nur die erkannten Positionen der Mikrokolonien und deren enge Umgebung in die Spektrenaufnahme einzubeziehen.
Eine besondere Ausführungsform der Spektrenaufnahme an größeren Probenträgerplatten kann darin bestehen, die Massenspektren nur längs der Spur (31) der auf die Nährmitteloberfläche in einer Petrischale (30) aufgestrichenen Analysenproben zu nehmen ( ). Dazu ist es erforderlich, das Aufstreichen der Analysenprobe auf die Agar-Platte fotografisch festzuhalten, beispielsweise mit einer lange geöffneten Verschlusszeit oder mit einer Video-Kamera. Der Zellaufschluss erfolgt am besten chemisch auf der ganzen Oberfläche des Nährmittels. Das Abfahren der Spur ohne vorherige Abbildung der Nährmitteloberfläche ermöglicht es, Mikroben auch in Mikrokolonien zu identifizieren, die noch nicht in einem entsprechenden Bildern erkennbar sind, ohne den gesamten Probenträger massenspektrometrisch analysieren zu müssen. Es ist zudem möglich die MALDI Proben nur entlang der ermittelten Spur zu präparieren.
Die geschilderten Verfahren des Aufschlusses, der Übertragung und Präparation können in vielfältiger Weise abgeändert oder erweitert werden. So können insbesondere nach Abnahme der Mikrobenproteine durch Probenträgerstifte oder Probenträgerplatten die verbleibenden Mikroben der nicht aufgeschlossenen Mikrobenkolonien in den Petrischalen weiter kultiviert werden, um auch langsamer wachsende Mikroben zu entdecken und identifizieren zu können, wenn auch nach längerer Kultivierungsdauer. Dabei kann es zweckmäßig sein, die schnell wachsenden Mikroben in nicht aufgeschlossenen Kolonien abzutöten oder mechanisch zu entfernen. Auch hier helfen die Digitalbilder, die nach der kurzen Kultivierungsperiode aufgenommen wurden, um nach längerer Kultivierung weitere Kolonien zu entdecken. Diese können dann ebenso wie die ursprünglichen Mikrokolonien aufgeschlossen, mit Probenträgerstiften oder Probenträgerplatten abgenommen und identifizierend analysiert werden.
Besteht der Verdacht auf die Anwesenheit besonders langsam wachsender, aber gefährlicher Mikroben, so können in einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens die Petrischalen mit den Nährmitteln in geeigneten Zeitabständen, beispielsweise alle acht Stunden, wiederholt auf das Wachsen von Mikrokolonien untersucht werden. Sind dabei störende Mikroben mit schnellem Wachstum vorhanden, die nicht interessieren, so können die Mikrokolonien dieser Mikroben in diesen Untersuchungsperioden abgetötet oder vollkommen entnommen werden. Dadurch wird die Gefahr gemindert, dass die schnell wachsenden Mikroben die langsam wachsenden überwuchern. Die langsam wachsenden Mikroben können an vorgegebenen Merkmalen erkannt werden, beispielsweise an ihrem langsamen Wachstum, aber auch an anderen Merkmalen wie Form und Farbe der Kolonien. Sie werden dann auf dem Agar aufgeschlossen, ihre Proteine werden durch Kontaktübertragung von der Nährmitteloberfläche auf Probenträgerstifte abgenommen und nach Präparation zu MALDI-Proben der Analyse in einem MALDI-Massenspektrometer zugeführt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

DE 102010006450 A1 [0008]
DE 102004020885 B2 [0012]
EP 1200984 B1 [0014]
WO 2005/094389 A2 [0014]
DE 102004002729 A1 [0014]
DE 19617011 C2 [0039]
DE 102006059695 B3 [0047]
GB 2446251 A [0047]
US 2008/0142703 A1 [0047]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

siehe: O. Lange et el. (2008) ”MIROB: automatic rapid identification of micro-organisms in high through-put”, Industrial Robot: An International Journal, Vol. 35 Iss: 4, pp. 311–315 [0012]

Claims

Ein Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Mikroben auf einer Nährmitteloberfläche in einem Massenspektrometer mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption, mit den Schritten: (a) Mikroben werden auf der Nährmitteloberfläche aufgeschlossen, (b) die durch den Aufschluss freigesetzten Mikrobenproteine werden durch direkten Kontakt auf eine Kontaktfläche eines Probenträgers übertragen, (c) die übertragenen Mikrobenproteine werden auf der Kontaktfläche des Probenträgers zu einer MALDI-Probe präpariert, und (d) der Probenträger mit der MALDI-Probe wird dem Massenspektrometer zur Analyse zugeführt.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein stiftförmiger Probenträger stirnseitig mit den aufgeschlossenen Mikroben in Kontakt gebracht wird, wobei die Kontaktfläche des stiftförmigen Probenträgers so klein ist, dass nur Mikrobenproteine einer einzelnen Kolonie auf den stiftförmigen Probenträger übertragen werden.
Ein Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der stiftförmige Probenträger nach der Übertragung der Mikrobenproteine so in eine Adapterplatte eingebracht wird, dass die Stirnseite des stiftförmigen Probenträgers mit der Oberfläche der Adapterplatte im Wesentlichen formschlüssig fluchtet.
Ein Verfahren nach Anspruch 3, mit den Schritten: – Aufnahme eines Bildes der Nährmitteloberfläche, – Ermittlung der Positionen von Kolonien aus dem Bild, – Aufschluss der Mikroben an den ermittelten Positionen, – Übertragung der aufgeschlossenen Mikrobenproteine an den ermittelten Positionen auf jeweils einen stiftförmigen Probenträger, – Einführung der stiftförmigen Probenträger in eine Adapterplatte, – Präparation von MALDI-Proben aus den Mikrobenproteinen auf den stiftförmigen Probenträgern, – Einschleusen der Adapterplatte in ein Massenspektrometer und Spektrenaufnahmen mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption an den Positionen der stiftförmigen Probenträger in der Adapterplatte.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Stirnseiten der stiftförmigen Probenträger Oberflächen von weniger als neun Quadratmillimeter, vorzugsweise weniger als vier Quadratmillimeter aufweisen.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein plattenförmiger Probenträger mit den aufgeschlossenen Mikroben in Kontakt gebracht wird, wobei die Kontaktfläche des plattenförmigen Probenträgers so groß ist, dass Mikrobenproteine von Mikroben aus mehreren Kolonien gleichzeitig auf den plattenförmigen Probenträger übertragen werden.
Ein Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährmitteloberfläche vor oder nach dem Aufschluss der Mikroben abgebildet wird, dass die Lage des plattenförmigen Probenträger zur Nährmitteloberfläche während der Kontaktübertragung bestimmt wird und dass aus dem Bild und der Lage die Positionen der Mikrobenproteine auf dem Probenträger ermittelt werden.
Ein Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass MALDI-Proben nur an den ermittelten Positionen präpariert werden und dass die massenspektrometrische Analysen nur an den präparierten MALDI-Proben durchgeführt werden oder dass auf der gesamten Kontaktfläche des Probenträgers eine Matrixschicht präpariert wird und dass die massenspektrometrischen Analysen nur an den ermittelten Positionen durchgeführt werden.
Ein Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass beim Aufbringen der zu untersuchenden Analysenprobe auf die Nährmitteloberfläche die Spur des Aufbringens aufgezeichnet wird und dass die massenspektrometrischen Analysen nur entlang der aufgezeichneten Spur durchgeführt wird.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroben vor dem Aufschluss weniger als 8 Stunden auf Nährmitteloberfläche kultiviert werden.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroben auf der Nährmitteloberfläche physikalisch durch Ultraschall, Infrarotstrahlung oder hohen Druck aufgeschlossen werden.
Ein Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Positionen von Kolonien auf der Nährmitteloberfläche ermittelt werden, Kolonien ausgewählt werden und der Ultraschall oder die Infrarotstrahlung jeweils lokal begrenzt auf die ausgewählten Kolonien einwirkt.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroben durch Zugabe einer Substanz chemisch aufgeschlossen werden.
Ein Verfahren, nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Positionen von Kolonien auf der Nährmitteloberfläche ermittelt werden, Kolonien ausgewählt werden und die aufschließende Substanz jeweils lokal begrenzt zu den ausgewählten Kolonien gegeben wird.
Ein Verfahren nach Anspruch 13 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz eine Säure oder das Enzym Lysozym ist.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontaktfläche des Probenträgers eine Protein-adsorptiven Beschichtung aufweist.
Ein Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Protein-adsorptive Beschichtung aus Zellulosenitrat oder α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (HCCA) besteht.
Ein Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenproteine durch Elektrophorese auf die Protein-adsorptiven Beschichtungen gezogen werden.
Ein Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Mikroben auf einer Nährmitteloberfläche in einem Massenspektrometer, mit den Schritten: (a) Mikroben werden auf der Nährmitteloberfläche aufgeschlossen, (b) die durch den Aufschluss freigesetzten Mikrobenproteine werden durch direkten Kontakt auf eine Kontaktfläche eines Probenträgers übertragen, (c) der Probenträger mit den übertragenen Mikrobenproteinen wird dem Massenspektrometer zur Analyse zugeführt.