DE102007060438B4

DE102007060438B4 - Untersuchung einzelner biologischer Zellen

Info

Publication number: DE102007060438B4
Application number: DE200710060438
Authority: DE
Inventors: Sören-Oliver Deininger
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2007-12-14
Publication date: 2011-09-22
Anticipated expiration: 2027-12-15
Also published as: EP2232523B1; DE102007060438A1; WO2009077106A3; EP2232523A2; ES2711499T3; US20100255531A1; WO2009077106A2; US8822142B2

Abstract

Verfahren zur Untersuchung einzelner biologischer Zellen mit den Schritten a) Aufbringen der Zellen möglichst ohne Überlappung auf eine Trägerplatte, b) Bestimmung der Lagekoordinaten der Zellen auf der Trägerplatte, c) Überdecken der Trägerplatte mit einer Kristallschicht aus Matrixmaterial, d) Aufnahme von Massenspektren von mindestens einem Teil der Zellen unter Verwendung der Lagekoordinaten, mit Ionisierung der Zellbestandteile durch matrixunterstützte Laserdesorption, und e) Auswertung der Massenspektren in Bezug auf Art, Zustand oder andere Unterscheidungsmerkmale der einzelnen Zellen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Untersuchung einzelner Zellen aus Körperflüssigkeiten, Abstrichen oder Geweben in Bezug auf Art, Zustand oder andere Unterscheidungsmerkmale.
Die Erfindung besteht darin, die Zellen möglichst ohne Überlappung auf einem massenspektrometrischen Probenträger abzulagern, die Lagekoordinaten der Zellen zu bestimmen, den Probenträger mit Kriställchen einer Matrixsubstanz überwachsen zu lassen, nach Ansteuerung der Lagekoordinaten durch den Bewegungsapparat eines Massenspektrometers Massenspektren der einzelnen Zellen mit Ionisierung der Zellbestandteile durch matrixunterstützte Laserdesorption aufzunehmen und die Massenspektren für die Untersuchung der Art, des Zustands oder anderer Unterscheidungsmerkmale der Zellen zu verwenden.
Stand der Technik
Die bildgebende Massenspektrometrie an histologischen Dünnschnitten oder anderen flächigen Proben mit Ionisierung der interessierenden Moleküle durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) hat jüngst einen außergewöhnlichen Aufschwung erlebt. Dabei werden in der Regel Verteilungen bestimmter Proteine gemessen, die allein oder in Verbindung mit anderen Proteinen als Biomarker für die Darstellung verschiedener Organe und vor allem für die Charakterisierung der Stress- oder Krankheitszustände einzelner Bereiche der flächigen Probe dienen können. Diese Stress- oder Krankheitszustände können heute mit keinem anderen Verfahren so sicher und schnell chakterisiert werden. Ein solches Verfahren ist in der Offenlegungsschrift DE 10 2004 037 512 A1 (D. Suckau et al.) dargestellt.
Dünnschnitte werden dabei in der Regel auf besondere Objektträger aufgebracht, deren Transparenz eine mikroskopische Beobachtung erlaubt und die eine leitende Schicht besitzen, um später im Massenspektrometer ein definiertes Potential für die Beschleunigung der dort erzeugten Ionen bereitzustellen.
Die flächige Probe auf dem Objektträger muss dabei in besonderer Weise mit einer Schicht aus Matrixkriställchen überschichtet werden, um eine gute Ionisierbarkeit der Proteine, aber auch anderer interessierender Substanzen, zu gewährleisten. Ein besonders günstiges Belegungsverfahren ist in der Offenlegungsschrift DE 10 2006 059 695 B3 (M. Schürenberg) beschrieben. Dieses Feinsprüh- oder Benebelungsverfahren führt optisch gesteuert und daher reproduzierbar zu einer dichten Überdeckung mit einer etwa 20 bis 50 Mikrometer dicken Schicht von Matrixkriställchen, wobei insbesondere die Proteinmoleküle aus der Probe mit an die Oberfläche der Schicht genommen werden. Die Matrixschicht ergibt in Verbindung mit besonderen Laserstrahlprofilen überraschenderweise und gegen bisherige Lehre eine sehr hohe Empfindlichkeit, so dass selbst sehr kleine Bereiche des histologischen Dünnschnitts einer Analyse der wichtigsten Proteine unterzogen werden können. Nach herrschender Lehre wird nur ein Analytion aus 10 000 Analytmolekülen gebildet; die Ausbeute der Schicht an feinen Matrixkriställchen für Proteinionen liegt aber anscheinend, in Verbindung mit besonderen Laserstrahlprofilen, aus bisher ungeklärten Gründen um mindestens einen Faktor 100, möglicherweise einen Faktor 1000 höher.
Bei Verwendung besonders geformter Laserstrahlprofile, wie sie beispielsweise in der Offenlegungsschrift DE 10 2004 044 196 A1 (A. Hase et al.) dargelegt sind, können die Analysen der Proteine auf einen Bezirk von nur etwa fünf Mikrometer Durchmesser eingeschränkt werden. Das Laserstrahlprofil besteht im Wesentlichen aus einer oder mehrerer Laserstrahlspitzen mit nur je fünf Mikrometer Durchmesser oder weniger. Die Ortsauflösung bei der Messung der Verteilungen von Molekülen in den flächigen Proben liegt wegen leichter lateraler Diffusion beim Aufbringen der Matrixbeschichtung meist bei etwas höheren Werten von etwa 20 Mikrometern, was für die meisten Anwendungen völlig ausreicht.
Für eine gute Messung mit hoher Empfindlichkeit und guter Genauigkeit für die Konzentrationsmessung genügt aber nicht die Aufnahme eines Einzelspektrums, das auf einem einzelnen Laserschuss beruht, es sind vielmehr zwischen 20 und 500 Einzelspektren zu einem Summenspektrum zu addieren. Wenn im Folgenden der Begriff „Massenspektrum” verwendet wird, wird darunter immer dieses Summenspektrum verstanden. Bei voller Ausschöpfung der Ortsauflösung durch einen Rasterabstand der Messungen von 20 Mikrometern bedeutet das, dass pro Quadratzentimeter Dünnschnitt 250 000 Massenspektren aufzunehmen sind, die aus vielen Millionen Einzelspektren zusammengesetzt werden müssen. Beträgt die Aufnahmegeschwindigkeit ein Massenspektrum pro Sekunde, beispielsweise durch 200 Einzelspektren, die mit 200 Hertz aufgenommen werden, so dauert dieses Verfahren etwa 70 Stunden pro Quadratzentimeter.
Selbstredend können auch geringere Ortsauflösungen gewählt werden, so können beispielsweise für Körperquerschnitte von Mäusen oder Ratten mit Rasterabständen von 200 bis 500 Mikrometer sehr gute Verteilungen der Analytsubstanzen auf die einzelnen Organe und Organzwischenräume gemessen werden, wobei nur 2500 bzw. 400 Massenspektren pro Quadratzentimeter aufzunehmen sind, die aber immer noch Hunderttausend bis eine Million Einzelspektren umfassen können. Es ist auch in diesem Falle eine hohe Frequenz der Spektrenaufnahme mit möglichst mehr als 1000 Einzelspektren pro Sekunde wünschenswert, wobei jedoch diese Einzelspektren nicht von einem einzelnen Punkt genommen werden dürfen, um eine Überhitzung der Matrixschicht an dieser Stelle zu vermeiden. Es ist daher zweckmäßig, die Aufnahmekoordinaten ständig zu variieren und in besonders kritischen Fällen Aufnahmerate herabzusetzen, beispielsweise nur 200 Einzelspektren pro Sekunde aufzunehmen.
Nun sind aber nicht nur massenspektrometrische Untersuchungen der Gewebezustände von Bereichen histologischer Dünnschnitte interessant, sondern auch Untersuchungen einzelner Zellen aus Abstrichen, aus Körperflüssigkeiten oder aus Geweben. Die Untersuchungen können sich auf die Feststellung der Art der Zellen richten, aber auch auf den Stress-, Krankheits- oder Infektionszustand der einzelnen Zellen. Auch die einfache Feststellung von Unterscheidungsmerkmalen ist interessant, wobei die Gründe für die Unterscheidungsmerkmale nicht einmal bekannt sein müssen.
Für diese Untersuchungen sind die Zellen, soweit sie nicht bereits in Körperflüssigkeiten verteilt vorliegen, in voneinander getrennter Form in eine Flüssigkeit zu bringen. Es sind Apparaturen für besondere Präparation der Zellen aus Flüssigkeiten auf Objektträger im Handel. Dabei werden die Zellen durch sachtes Zentrifugieren auf einen kleinen Bereich des Objektträgers aufgebracht, beispielsweise auf einen Quadratzentimeter, wobei sie ohne Zerstörung flach gepresst werden und einen Durchmesser von etwa 20 Mikrometer annehmen. Auch die Zellen aus Geweben, beispielsweise aus Knochenmark, können durch besondere Verfahren in Flüssigkeiten verteilt und dann auf Objektträger aufgebracht werden. Sind genügend wenig Zellen in der Flüssigkeit, so treten nur wenige Überlappungen auf, so dass der Mediziner die Zellen unter dem Mikroskop einzeln betrachten kann. „Genügend wenig” Zellen heißt hier etwa einige Hundert bis maximal etwa 10 000 Zellen pro Quadratzentimeter. Das Optimum für möglichst prozentual wenige Überlappungen liegt bei etwa 3000 Zellen pro Quadratzentimeter.
Das analytische Ziel einer solchen Untersuchung liegt sehr häufig darin, das Vorkommen von einigen wenigen entarteten, beispielsweise tumorösen, Zellen unter viele normalen Zellen festzustellen; bei visueller Inspektion durch den Mediziner eine mühsame und sehr ermüdende Aufgabe. Färbemethoden sind nicht für alle diese Fälle bekannt und häufig auch nicht sehr kontrastreich; die visuelle Erkennung tumoröser Zellen unterliegt vielen subjektiven Einflüssen und ist kaum objektivierbar. Es wird daher nach automatisierbaren Verfahren für diese Aufgabe gesucht.
Gewebebereiche mit entarteten, beispielsweise tumorösen Zellen in Dünnschnitten können grundsätzlich anhand ihrer Massenspektren als solche erkannt werden, obwohl diese Gewebebereiche meist noch mit größeren Anteilen, häufig bis zu 80 Prozent, gesunder Zellen durchmischt sind. So liegt es nahe, die Objektträger mit den aufgebrachten Zellen genauso wie Dünnschnitte mit Matrixmaterial zu überschichten und dann im Massenspektrometer durch ein Rasterverfahren abzutasten, um Massenspektren der einzelnen Zellen zu erhalten. Um auf diese Weise die einzelnen Zellen ausnahmslos alle der Analyse zuzuführen, muss die Abtastung dicht sein, mit einem Rasterabstand von höchstens 20 Mikrometern. Das führt bei einem Quadratzentimeter Fläche zu der oben erwähnten Zahl von 250 000 Massenspektren mit Millionen von Einzelspektren und der oben erwähnten Zeit von 70 Stunden, obwohl sich auf der Fläche nur etwa 1000 bis 10 000 Zellen befinden mögen. Die überwiegende Anzahl der Massenspektren ist leer.
Solche Verfahren sind überhaupt nur bei Verwendung von Festkörperlasern möglich. Die meist bisher verwendeten Stickstoff-Laser haben Lebensdauern von nur etwa einer Million Laserschüssen. Die Festkörperlaser haben eine wesentlich höhere Standfestigkeit; bedürfen aber besonderer Maßnahmen für die Strahlformung, die aber auch zum Vorteil der Analytik ausgeführt sein können. Es sind bereits Massenspektrometer im Handel, die mit Festkörperlasern arbeiten.
Unter dem Begriff „Zustand der Zellen” soll hier der Zustand in Bezug auf einen Stress, eine krankhafte Veränderung, einen infektiösen Befall oder eine sonstige Veränderung gegenüber einem Normalzustand der gleichen Art von Zellen verstanden werden. Wie schon erwähnt, sind bei diesem Verfahren Tumorzellen von besonderer Bedeutung; tumoröses Gewebe lässt sich massenspektrometrisch deutlich von gesundem Gewebe unterscheiden. Ganz allgemein muss sich der Zustand als Konzentrationsmuster von Substanzen, die massenspektrometrisch in dieser Zelle nachgewiesen werden können, zu erkennen geben. Die Substanzen können dabei Peptide oder Proteine sein, die unter- oder überexprimiert sind und so ein charakteristisches Muster bilden, sie können aber auch posttranslationale Modifikationen von Proteinen sein, oder Abbauprodukte (Metabolite), oder Ansammlungen sonstiger Substanzen wie beispielsweise Lipide im Gewebe.
In der Offenlegungsschrift DE 10 2004 021 904 A1 wird zur Erzeugung einer Analyseanordnung mit einer Vielzahl von diskreten, separaten Messbereichen als ”Spotting”-Verfahren vorgeschlagen, die von einem Träger durch das ”Spotting” zu übertragenden Proben gezielt mit einem Laser zu bestrahlen, um durch den dadurch hervorgerufenen Impulsübertrag die Proben berührungslos auf einen weiteren Träger der Analyseanordnung zu übertragen. Dort sollen sie einer nachfolgenden biologischen, biochemischen oder chemischen Analyse unterzogen werden. Die Positionen der übertragenen Proben werden vor der Übertragung durch einen Anwender festgelegt und in einer Abbildungsmatrix gespeichert.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, einzelne Zellen möglichst automatisiert auf Art oder Zustand zu untersuchen.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung macht von der überraschenden Erkenntnis Gebrauch, dass sich tatsächlich einzelne Zellen massenspektrometrisch untersuchen lassen. Durch die eingangs geschilderten Maßnahmen lässt sich die Empfindlichkeit des massenspektrometrischen Nachweises so weit steigern, dass aus den nur etwa 10⁸ Molekülen einer Zelle, mit etwa 10⁷ Molekülen für das häufigste Protein und nur etwa 10⁵ Molekülen für ein Protein an einer gewünschten Nachweisgrenze, auswertbare Massenspektren gewinnen lassen.
Die Erfindung besteht darin, die zu untersuchenden Zellen möglichst ohne Überlappung auf einer Trägerplatte abzulagern, die Lagekoordinaten der Zellen zu bestimmen, die Trägerplatte mit Matrixkriställchen zu überdecken, durch Ansteuerung der Lagekoordinaten der einzelnen Zellen Massenspektren aufzunehmen und die Massenspektren für die Untersuchung der Zellen zu verwenden. Die Untersuchung kann sich auf Art, Zustand oder andere Unterscheidungsmerkmale der Zellen richten, wobei der Zustand durch Stress, Krankheit oder Infektion erzeugt sein kann.
Die Massenspektren der Einzelzellen verschiedener Zellzustände unterscheiden sich dabei deutlicher voneinander als die Massenspektren von Gewebegebieten in Dünnschnitten, weil letztere meist Mischspektren enthalten. So unterscheiden sich Massenspektren aus isolierten tumorösen und gesunden Einzelzellen noch deutlicher als entsprechende Gewebebereiche in Dünnschnitten.
Durch eine günstige Strahlprofilierung kann die Aufnahmezeit für 3000 Summenspektren der 3000 Zellen bei einer Aufnahmerate von nur 200 Einzelspektren pro Sekunde auf 20 Minuten eingeschränkt werden; bei höheren Laserpulsraten auf noch kürzere Zeiten.
Die Zellen können durch sachtes Zentrifugieren auf die Trägerplatte aufgebracht werden, wofür es kommerziell vertriebene Geräte gibt. Als Trägerplatte kann beispielsweise ein besonders präparierter Objektträger verwendet werden. Die Zellen können aber auch durch andere Techniken, beispielsweise durch einfachen Abstrich, aufgebracht werden. Für die Bestimmung der Lagekoordinaten eignen sich besonders mikroskopische Aufnahmen oder digitale Kontaktabzüge entsprechend dem Stand der Technik; auch hier gibt es einfache technische Geräte im Handel. Der Kontrast lässt sich durch Anfärben, bei mikroskopischer Aufnahme auch durch Dunkelfeldbeleuchtung oder Phasenkontrast erhöhen. Es sind Färbungstechniken und -mittel bekannt, die bei MALDI nicht stören. Bildauswertungsprogramme können für den vorliegenden Zweck neben den Mittelpunktskoordinaten der Zellen auch andere Parameter wie Durchmesser und Überlappungsparameter bestimmen. Für das Aufbringen der Matrixschicht gibt es ebenfalls kommerzielle Geräte, wobei die Geräte aber je nach verwendeten Verfahren verschiedene Empfindlichkeiten durch verschiedene Ionisierungsausbeuten ergeben. Es sind weiterhin MALDI-Massenspektrometer kommerziell erhältlich, die eine genügende Genauigkeit für die Bewegung des Probenträgers und genügend Geschwindigkeit für die Aufnahme der Massenspektren bieten.
Für die Bestimmung des Zustands der Zellen und anderer Unterscheidungsmerkmale aus den Spektrendaten gibt es ebenfalls geeignete Programme. Der Zustand lässt sich schlussendlich durch einen Zustandswert oder Zustandsvektor auf einer ein- oder mehrdimensionalen Zustandsskala ablesen; die Berechnung des Zustandswertes oder Zustandsvektors stützt sich auf das Vorkommen oder Nichtvorkommen der Signale für einzelne Proteine und aus den Intensitätsverhältnissen der Signale zueinander. Dabei können für die Berechnung eines Zustandswertes durchaus komplizierte Ausdrücke aus den Signalstärken I(m) verwendet werden, wobei I die Intensität und m die Masse der Ionen dieses Signals bedeutet.
Die Art der Berechnung des Zustandswertes kann als parametrisierte Formel vorgegeben sein, es kann aber auch eine Klassen bildende mathematisch-statistische Analyse mit oder ohne anfängliche Unterweisung eingesetzt werden (Supervised or unsupervised learning programs). Zustandswerte oder Zustandsvektoren können zur Falschfarbendarstellung der Zustände auf einem mikroskopischen Abbild verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
zeigt einen Ausschnitt aus einer Trägerplatte mit Zellen, die durch mildes Zentrifugieren aufgebracht wurden. Jede der platt gedrückten, fast runden Zellen trägt einen Zellkern, der sich jeweils etwa in der Mitte der Zelle befindet.
Beste Ausführungsformen
Zum ersten bezieht sich die Erfindung auf die Bestimmung der Art oder Identität der Zellen, also der Zugehörigkeit zu einem Organ oder einem Gewebe. Die Massenspektren der Zellen verraten in der Regel die Herkunft der Zellen, also das Organ oder das Gewebe, dem die Zelle entstammt, wobei häufig sehr fein die Herkunft aus bestimmten Organbereichen festgestellt werden kann.
Zum zweiten dient die Erfindung der Feststellung des Zustands einzelner Zellen, wobei der Zustand durch einen besonderen chemischen oder physikalischen Stress, durch krankhafte Entartung oder durch Infektion einer bestimmten Art von Zellen hervorgerufen sein kann. Chemischer Stress kann zum Beispiel durch Pharmaka, physikalischer Stress durch Temperatur- oder Strahlungseinwirkung erzeugt werden, beide können zu starker Schädigung der Zelle führen.
Zum dritten kann die Erfindung für Untersuchungen vieler einzelner Zellen auf bekannte oder unbekannte, bisher nicht entdeckte Unterschiede zwischen verschiedenen, nicht zu selten besetzten Klassen von Zellen eingesetzt werden. Die Unterschiede zwischen den Klassen können anhand unterschiedlicher Merkmale, die sich in den Massenspektren zeigen, durch statistische Programme automatisch festgestellt werden. Diese Merkmalsunterschiede mögen auf verschiedene Unterarten der Zellen eines Gewebes oder Organs, auf Unterschiede ihrer Funktion oder auf andere Unterschiede, beispielsweise Unterschiede durch verschiedene Ernährung, zurückzuführen sein.
Die Arten der Zellen, viele ihrer Zustände und andere Merkmale spiegeln sich in der quantitativen oder sogar qualitativen Zusammensetzung der Substanzen im Inneren der Zellen wieder, so dass die Unterschiede in aller Regel durch MALDI-Massenspektren bestimmbar sind.
Die Erfindung ist beispielsweise dann von besonderer Bedeutung, wenn es um das automatisierte Auffinden von Tumorzellen geht, insbesondere um das Auffinden sehr weniger Tumorzellen in einer überwältigenden Mehrheit von gesunden Zellen. Es ist dabei überraschend, dass aus den Bestandteilen einer einzigen Zelle, insbesondere aus den Proteinen, durch eine Ionisierung vermittelst der matrixunterstützten Laserdesorption so gut auswertbare Massenspektren gewonnen werden können, dass eine solche Aufgabe lösbar wird.
Das Grundschema der Erfindung besteht in einer Untersuchung vieler einzelner biologischen Zellen in folgenden Schritten:

a) Aufbringen der Zellen auf eine Trägerplatte,
b) Bestimmung der Lagekoordinaten der Zellen,
c) Aufbringen einer Kristallschicht aus Matrixmaterial,
d) Aufnahme von Massenspektren von mindestens einem Teil der Zellen unter Verwendung der Lagekoordinaten, mit einer Ionisierung der Zellbestandteile durch matrixunterstützter Laserdesorption und
e) Auswertung der Massenspektren in Bezug auf Art, Zustand oder andere Unterscheidungsmerkmale der Zellen.

Die Zellen werden in Schritt a) möglichst isoliert voneinander auf eine geeignete Trägerplatte aufgebracht, beispielsweise einen Objektträger, der sich auch als massenspektrometrischer Probenträger verwenden lässt. Die Oberfläche der Trägerplatte kann zur Erzeugung eines definierten elektrischen Potentials im Massenspektrometer elektrisch leitend sein. Es muss die Trägerplatte aber nicht unbedingt transparent sein, es können auch andere, beispielsweise metallische Trägerplatten verwendet werden, soweit es möglich ist, genügend gute Abbilder der aufgebrachten Zellen zu erzeugen.
Die Zellen können in Schritt a) beispielsweise durch moderates Zentrifugieren aus einer Flüssigkeit, beispielsweise direkt aus einer Körperflüssigkeit, aufgebracht werden. Dabei ist darauf zu achten, dass nicht mehr als etwa 10 000 Zellen pro Quadratzentimeter aufgebracht werden, um die Anzahl von Überlappungen klein zu halten. Günstig ist eine Zahl von etwa 3000 Zellen pro Quadratzentimeter, aber es gibt auch sinnvolle diagnostische oder erforschende Anwendungen, bei denen nur etwa hundert oder weniger Zellen aufgebracht werden. Die Zellen können bereits in der Flüssigkeit bei der Entnahme aus dem Körper enthalten sein, aber auch erst als voneinander getrennte Gewebezellen in die Flüssigkeit eingebracht werden, beispielsweise Zellen von Biopsien aus dem Knochenmark. Die Zellen aus Geweben können durch Lösen der interzellulären Bindungen, beispielsweise durch enzymatisches Trennen, vereinzelt werden. Die Zellen können des weiteren mit einem Zellsortierer ausgewählt werden oder auch nicht. Das milde Zentrifugieren drückt die Zellen platt auf den Träger, ohne sie zu zerstören; sie nehmen dabei eine fast kreisrunde Form mit einem Durchmesser von etwa 15 bis 25 Mikrometer an, mit dem Zellkern fast genau in der Mitte der Zelle. Die aufgebrachten Zellen werden in der Regel anschließend getrocknet, wodurch sie fest an die Trägerplatte gebunden werden.
Es können die Zellen in Schritt a) aber auch durch andere Verfahren aufgebracht werden, so durch Abstriche, durch einfaches Absedimentieren einer Flüssigkeit mit anschließendem Abgießen und Trocknen, oder durch laserunterstützte Mikrodissektion. Durch das Trocknen werden die zunächst lose aufliegenden Zellen ebenfalls flach auf den Träger angeheftet und eingeschrumpft.
Sind die Zellen auf die Trägerplatte aufgebracht, so können sie mit optischen Mitteln, so etwa mit einem Mikroskop, betrachtet werden. Ein schematisches Abbild ist in gezeigt. Zur Erhöhung des Kontrasts können Einfärbungen vorgenommen werden; es sind Färbemittel bekannt, die die massenspektrometrische Aufnahme durch MALDI nicht stören. Besonders günstig ist ein Mikroskop mit Dunkelfeldbeleuchtung, die die Zellen hell vor dunklem Hintergrund zeigen. Durch mikroskopische Aufnahmen, aber auch durch direkte Kontaktabzüge in relativ einfachen Geräten, können digitale Bilder erzeugt werden, wobei möglichst eine Auflösung von etwa zwei Mikrometer erreicht werden soll. Diese digitalen Bilder können für die Bestimmung der Lagekoordinaten der Zellen herangezogen werden.
Bildverarbeitende Computerprogramme sind bekannt und weit verbreitet. Mit ihnen können die Mittelpunkte der kreisförmigen Zellen bestimmt werden, aber auch andere Parameter, wie beispielsweise Durchmesser, Unrundheit, Überlappungsstärke und Überlappungsrichtung. Die Lagekoordinaten und zugehörigen Parameter werden in einer computergeführten Liste abgelegt, die später als Grundlage für die Messung der Massenspektren dient. Die Lagekoordinaten werden auf besondere Markierungspunkte auf der Trägerplatte bezogen, die später auch bei der massenspektrometrischen Messung erkannt werden können.
Ist die Liste der Lagekoordinaten erstellt, so kann die Trägerplatte mit den aufgebrachten Zellen in Schritt c) in geeigneter Weise mit der Schicht von Matrixkriställchen überzogen werden. Ein günstiges Verfahren ist in der oben bereits zitierten Offenlegungsschrift DE 10 2006 059 695 B3 (M. Schürenberg) beschrieben. Dabei werden stoßweise voneinander isolierte Nebeltröpfchen aus Matrixlösung auf der Trägerplatte abgesetzt, aus denen sich beim Trocknen feinste Matrixkriställchen bilden, die jeweils fast bis zur Trocknung gebracht werden. Der Vorgang wird durch die Messung von Streulicht gesteuert. Durch das wiederholte schichtweise Aufbringen jeweils voneinander getrennter Nebeltröpfchen werden Proteine aus den Zellen extrahiert und allem Anschein nach in sehr gereinigter Form an die Oberfläche der Kristallschicht transportiert, so dass sich im MALDI-Verfahren eine Ionisierung mit extrem hoher Ausbeute an Proteinionen ergibt. Die Trägerplatte gleicht schließlich einer fein bereiften Landschaft, die Zellen sind nicht mehr sichtbar. Die Dicke der Schicht richtet sich nach dem Optimum der Ionisierungsausbeute, sie ist erstaunlicherweise mit etwa 20 bis 50 Mikrometer relativ dick. Die laterale Verschmierung der Proteine durch Querdiffusion ist relativ gering und beträgt weniger als 15 Mikrometer.
Die massenspektrometrische Messung der Proteinprofile geschieht vorzugsweise im Vakuum der Massenspektrometer, obwohl es auch einigermaßen erfolgreiche Versuche gibt, die Ionen außerhalb des Massenspektrometers in Umgebungsgas durch MALDI zu erzeugen. MALDI-Flugzeitmassenspektrometer sind meist mit genügend präzisen Bewegungsvorrichtungen für die Trägerplatten ausgestattet.
Die einzelnen Zellen, deren Lagekoordinaten bekannt sind, werden durch den Bewegungsapparat der Ionenquelle des Massenspektrometers in den Fokuspunkt des fest montierten UV-Pulslasers gefahren. Dabei kann eine Auswahl getroffen werden: entweder werden nur die vollständig voneinander isolierten Zellen vermessen, oder auch die Zellen, die sich nicht stärker als mit einem bestimmten Schwellenwert überlappen. Bei sich überlappenden Zellen können sich durch die Querdiffusion der Proteinmoleküle leicht Mischspektren ergeben, die möglicherweise keine eindeutigen Aussagen zulassen. Bei überlappenden Zellen können die Zellen dezentral so angefahren werden, dass Mischspektren nach Möglichkeit vermieden werden. Bei sehr großen Zellen erweist es sich als günstig, nicht das Zentrum der Zelle anzufahren, da hier in der überwiegenden Anzahl der Fälle der Zellkern sitzt, dessen Erhebung die Proteine der Zelle verdrängt.
Es werden für die Ionisierung UV-Pulslaser mit Laserpulsdauern von 0,1 bis 10 Nanosekunden verwendet, wobei kurze Laserpulse vorzuziehen sind, da sie die Ausbeute an Ionen erhöhen.
Durch besondere Optiken lassen sich Laserfokusdurchmesser von 5 Mikrometer und weniger erzeugen, wobei sich wahlweise entweder einzelne oder auch mehrere synchron auftretende Fokuspunkte erzeugen lassen. Für die vorliegende Aufgabe ist es beispielsweise günstig, drei oder vier Fokuspunkte in dreieckiger oder quadratischer Anordnung mit Mittelpunkts-Abständen von etwa 10 Mikrometer voneinander zu verwenden, da mit der Anzahl von Fokuspunkten die absolute Anzahl der jeweils gebildeten Ionen steigt. Es sollten aber wiederum nicht mehr Fokuspunkte sein, da sonst die Ausrichtung auf eine einzige Zelle nicht mehr möglich ist. Von Schuss zu Schuss sollten die Laserfokuspunkte jeweils etwas verschoben werden, um kein Schmelzen der Matrixkristalle zu erzeugen. Dabei soll eine Bewegungsart generiert werden, die möglichst die Fläche der Zelle in aufeinander folgenden Laserschüssen gleichmäßig überstreicht, beispielsweise eine kreisende Zykloidenbewegung.
Durch vier Fokuspunkte kann die Anzahl von Einzelspektren, die zur Erzeugung eines gut auswertbaren Massenspektrums notwendig sind, auf etwa 50 Spektren reduziert werden. Mit einer Laserpulsrate von 200 Hertz lassen sich somit pro Sekunde etwa drei Massenspektren aufnehmen, die zu drei Zellen gehören, wobei die Verfahrzeiten der Trägerplatte eingerechnet sind. Sind auf einer Trägerplatte 3000 Zellen aufgebracht, so sind etwa 20 Minuten notwendig, um Massenspektren aller Zellen aufzunehmen. Das sind sehr annehmbare Zeiten, die einen routinemäßigen Einsatz des Verfahrens empfehlen. Diese Zeiten können mit einer visuellen Inspektion konkurrieren, zumal das Verfahren weniger ermüdet. Das Verfahren ist vor allem objektiver und vollkommen reproduzierbar. Die Irrtumswahrscheinlichkeit für eine falsche Bestimmung ist erheblich herabgesetzt. Es gibt für die Beurteilung keine Ermessensspielräume mehr.
Für die Auswertung der Massenspektren sind Programme entwickelt worden, die bisher für bildgebende Massenspektrometrie an Gewebedünnschnitten eingesetzt wurden. Diese Programme entsprechen also dem Stande der Technik und sind dem Fachmann bekannt. Sie sind beispielsweise in der Lage, durch die Werteskala der Zustandswerte oder, bei mehrdimensionaler Auswertung der Zustandsvektoren, bestimmte Zustände der Zellen eines Gewebes zu charakterisieren, wobei die Zustandswerte als mathematische Ausdrücke berechnet werden, die aus den Signalen I(m) in beliebiger Weise zusammengesetzt sein können. Die Zustandswerte können eindimensional oder als Zustandsvektoren auch mehrdimensional sein, es ist damit eine Zuordnung zu verschiedenen Arten- und Zustandsklassen möglich. Die günstigste Form der mathematischen Ausdrücke zur Berechnung der Zustandswerte kann durch eine mathematisch-statistische Analyse von Massenspektren gewonnen werden, die aus genau charakterisierten Zellen verschiedener Arten oder Zustände gewonnen wurden.
Die Programme zur Auswertung der Massenspektren können aber auch durch mathematisch-statistische Programme, die selbständig Klassen anhand verschiedener Unterscheidungsmerkmalen ermitteln können, solche Klassen bestimmende Ausdrücke für die Unterscheidungsmerkmale berechnen zu lassen. Dabei kann man Klassen vorgeben, zum Beispiel durch Markierung der betreffenden Zellen im digital angezeigten Bild („supervised learning programs”). Andere Programme bilden die Klassen selbständig („unsupervised learning programs”, „Cluster-Analysis”). Auch diese Verfahren gehören zum Stand der Technik.
Es wird hier häufig unter dem Begriff „Massenspektrum” ein Proteinprofil verstanden. Dazu ist anzumerken, dass es sich auch um Profile von Substanzen handeln kann, die nicht Proteine sind, oder neben den Proteinen auch andere Substanzen enthalten. Sehr häufig treten beispielsweise Lipide auf, die ebenfalls im Ruf stehen, charakteristische Muster für tumoröses Material zu liefern. Die Begriffe „Proteinprofil” und „Proteine der Zelle” sollen daher stets so verstanden werden, dass auch andere Substanzen eingeschlossen sein können.
Die Bestimmung des Zustands von Einzelzellen ist aber nicht nur auf das Auffinden von tumorösen Zellen beschränkt. So können auch infizierte Zellen gefunden werden, beispielsweise durch Viren, Chlamydien oder Rikettsien infizierte Zellen. Auch abgestorbene Zellen können erkannt werden, häufig kann sogar der Grund für ihren Zelltod gefunden werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, einzelne Zellen auf ihre Art, Herkunft oder Zustand zu untersuchen, wobei die wichtigsten nachgesuchten Zustände krankhafte oder infektiöse Entartungen sind, allen voran tumorartige Entartungen. Der Vorteil liegt in der objektiven Beurteilung ohne die üblichen subjektiven Ermessungsspielräume. Tumoröse Zellen sind in aller Regel sehr klar anhand ihrer Massenspektren zu erkennen, noch klarer, als das bisher schon für Gewebebereiche in Dünnschnitten der Fall ist, da die Gewebegebiete in Dünnschichten immer auch gesunde Zellen enthalten und daher Mischspektren liefern.
Dieses Verfahren bietet aber noch einen weiteren Ausblick: Es lassen sich die Objektträger mit den aufgebrachten Zellen vorsichtig mit Lösungsmittel waschen, um die Schicht aus Matrixkriställchen zu entfernen. Es ist dann, trotz der zwischenzeitlichen Aufnahme der Massenspektren, wieder praktisch der Originalzustand hergestellt. Die Verletzung der Zellen und die Extraktion eines Teils der Bestandteile ist praktisch nicht festzustellen. Dieses Präparat kann jetzt durch beliebige Färbemethoden eingefärbt werden und steht dann für visuelle Kontrollen, aber auch für Lehr- oder Lernzwecke zur Verfügung. Die visuellen Kontrollen können jetzt mit Kenntnis der massenspektrometrischen Untersuchungen vorgenommen werden. Es kann insbesondere auch gelernt werden, wie sich verschiedene Zustände visuell darstellen.
Eine Aufnahme dieses Bildes kann, wie auch die ursprüngliche Aufnahme der Zellen für die Bestimmung der Lagekoordinaten, mit einem Bild aus Falschfarben überlagert werden, das die Arten oder Zustande der Zellen wiedergibt, wie es für Dünnschnitte üblich ist. Insbesondere können die Zellen des nachträglich oder ursprünglich gewonnenen Abbildes mit arten- oder zustandsbezogenen Falschfarben eingefärbt werden, wodurch die Arten oder Zustände der Zellen sichtbar werden. Diese Abbilder können insbesondere sehr eindrucksvoll auf Computer-Bildschirmen dargestellt werden, beispielsweise auf dem Bildschirm desjenigen Computers, der auch die Berechnung der Arten- oder Zustandszugehörigkeit berechnet.
Das Verfahren hat die Kraft, sich zu einem Standardverfahren für die Untersuchung von Einzelzellen zu entwickeln.
Das hier geschilderte Verfahren kann vom einschlägigen Fachmann in Kenntnis der Erfindung in vielfältiger Weise abgeändert werden. Einige dieser Abänderungen sind bereits oben geschildert; es gibt aber durchaus weitere Variationen, die auf der grundlegenden Basis der isolierten Abscheidung und der Bestimmung der Lagekoordinaten die gewünschten informationsreichen Massenspektren für einzelne Zellen für die Identifizierung ihrer Art oder ihres Zustands erzeugen können. Diese abgewandelten Verfahren sollen hier in dieser Erfindung mit eingeschlossen sein.

Claims

Verfahren zur Untersuchung einzelner biologischer Zellen mit den Schritten a) Aufbringen der Zellen möglichst ohne Überlappung auf eine Trägerplatte, b) Bestimmung der Lagekoordinaten der Zellen auf der Trägerplatte, c) Überdecken der Trägerplatte mit einer Kristallschicht aus Matrixmaterial, d) Aufnahme von Massenspektren von mindestens einem Teil der Zellen unter Verwendung der Lagekoordinaten, mit Ionisierung der Zellbestandteile durch matrixunterstützte Laserdesorption, und e) Auswertung der Massenspektren in Bezug auf Art, Zustand oder andere Unterscheidungsmerkmale der einzelnen Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerplatten Objektträger sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen durch Zentrifugieren auf die Trägerplatte aufgebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen auf der Trägerplatte angefärbt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lagekoordinaten der Zellen aus einer Abbildung der Zellen auf der Trägerplatte ermittelt und auf Bezugsmarken bezogen werden, die sich auch im Massenspektrometer erkennen lassen.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildung mit einem Mikroskop gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass im Mikroskop eine Dunkelfeldbeleuchtung oder eine Phasenkontrasteinrichtung verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Auftrag der Matrixkristalle durch das Absetzen eines Nebels aus Matrixlösung geschieht.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionisierung der Bestandteile einer Zelle durch matrixunterstützte Laserdesorption mit einem UV-Puls-Festköperlaser mit geformtem Strahlprofil erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Strahlprofil mehrere Fokuspunkte nebeneinander enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Massenspektrum einer Zelle aus der Summe von 20 bis 500 Einzelspektren besteht.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Massenspektrum jeder Zelle ein Zustandwert oder ein Zustandsvektor berechnet wird, der Art, Zustand oder andere Unterscheidungsmerkmale der Zelle charakterisiert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach der massenspektrometrischen Untersuchung einiger oder aller Zellen die Trägerplatte von der Schicht aus Matrixkriställchen befreit wird, so dass die Zellen, wahlweise nach Färbung, für eine visuelle Inspektion in Kenntnis der massenspektrometrischen Ergebnisse zur Verfügung stehen.
Darstellungsverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass einzelne biologische Zellen gemäß einem Verfahren nach Anspruch 1 untersucht werden, und dass in einem Abbild der Zellen auf der Trägerplatte die Zellen mit arten- oder zustandsbezogenen Falschfarben eingefärbt werden, wodurch die Arten oder Zustande der Zellen erkennbar werden.