DE102004037512A1 - Massenspektrometrische Gewebezustandsdifferenzierung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft die Bestimmung und Visualisierung der Ortsverteilung von Gewebezuständen in histologischen Gewebeschnitten aus ortsaufgelöst aufgenommenen massenspektrometrischen Signalen. DOLLAR A Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das den Gewebezustand für die Gewebepunkte als Zustandskenngröße bestimmt, wobei die Zustandskenngröße als mathematischer oder logischer Ausdruck aus mindestens zwei Massensignalen dieses Gewebepunktes berechnet wird, und den Gewebezustand als Graustufen- oder Falschfarbendarstellung in einer oder zwei Dimensionen anzeigt.

Description

• Die Erfindung betrifft die Bestimmung und Visualisierung der Ortsverteilung von Gewebezuständen in histologischen Gewebeschnitten aus ortsaufgelösten massenspektrometrischen Signalen.
• Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das den Gewebezustand für die Gewebeorte als Zustandskenngröße bestimmt, wobei die Zustandskenngröße als mathematischer oder logischer Ausdruck aus mehreren Massensignalen dieses Gewebeortes berechnet wird, und den Gewebezustand als Graustufen- oder Falschfarbendarstellung in einer oder zwei Dimensionen anzeigt.
• Unter dem Begriff „Gewebezustand" soll hier der Zustand eines kleinen Teilgebietes eines Gewebeschnittes in Bezug auf einen Stress, eine krankhafte Veränderung, einen infektiösen Befall oder eine sonstige Veränderung gegenüber einem Normalzustand dieses Gewebes verstanden werden. Der Gewebezustand muss sich dabei als Konzentrationsmuster von Substanzen, die massenspektrometrisch in diesem kleinen Teilgebiet nachgewiesen werden können, zu erkennen geben. Die Substanzen können dabei Peptide oder Proteine sein, die unter- oder überexprimiert sind und so ein Muster bilden, sie können aber auch posttranslationale Modifikationen von Proteinen, deren Abbauprodukte (Metabolite), oder Ansammlungen sonstiger Substanzen im Gewebe einschließen.
• Die Massenspektrometrie mit Ionisierung der Proben durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) wird seit mehreren Jahren erfolgreich zur Molekulargewichtsbestimmung, Identifizierung und zur strukturellen Charakterisierung von Proteinen eingesetzt. Hierbei wird in der Regel das Protein gelöst und mit einer Lösung einer Matrixsubstanz wie Sinapinsäure gemischt auf den Probenträger aufgebracht. Hiernach verdampft das Lösungsmittel und die Matrixsubstanz kristallisiert, wobei das Protein in den Matrixkristallen mitkristallisiert. Ein Beschuss der so gewonnen Probe mit kurzen Laserlichtpulsen ausreichender Energie führt zur Energieabsorption durch die Matrixsubstanz, die dadurch explosionsartig verdampft, wobei die Proteine in die Gasphase des Massenspektrometers mitgerissen und durch Protonierung ionisiert werden. Die Ionen werden dann im Massenspektrometer nach ihren Masse-zu-Ladungsverhältnissen (m/z) getrennt und als Massenspektrum gemessen. Aus dem Massenspektrum lässt sich ihre Masse bestimmen. Da die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption im Wesentlichen nur einfach geladene Ionen liefert, werde im Folgenden vereinfachend nur von der „Massenbestimmung" und nicht von der Bestimmung der Masse-zu-Ladungsverhältnissen und demgemäß einfach von der „Masse" der Ionen statt ihres m/z-Verhältnisses gesprochen.
• Diese Analysen können an biologischen Proben, wie beispielsweise Gewebehomogenaten, lysierten Bakterien oder Bioflüssigkeiten (Urin, Blutserum, Lymphe, Spinalflüssigkeit, Tränen, Sputum) durchgeführt werden, wobei die Proben im Allgemeinen vorher einer hinreichenden Fraktionierung durch chromatographische oder elektrophoretische Techniken unterworfen werden.
• Die Proben werden dabei zweckmäßigerweise von störenden Verunreinigungen wie bestimmten Puffern, Salzen oder Detergenzien befreit, die die Effizienz der MALDI-Analysen herabsetzen. Die Analyse biologischer Proben beinhaltet in der Regel einen erheblichen Aufwand in der Probenvorbereitung, insbesondere, wenn dabei auch die Information über die Verteilung eines Proteins in verschiedenen Bereichen eines Gewebes erzielt werden soll. „Laser Capture Microdissection" etwa vermag dies zu leisten, aber die oben erwähnt aufwändige Aufarbeitung ist weiterhin notwendig, dazu kommt die Schwierigkeit, genug Material für eine derartige Analyse zu gewinnen.
• Die bildgebende massenspektrometrische Analyse (Imaging Mass Spectrometry, IMS) vermeidet einen derartigen Aufwand. Hierzu wird ein Gewebedünnschnitt beispielsweise mit einem Mikrotom aus einem Gewebestück eines interessierenden Organs eines menschlichen oder tierischen Individuums hergestellt und auf einen Objektträger aufgelegt. Daraufhin wird die Oberfläche des Präparats mit einer Laserenergie absorbierenden Matrix versehen, dies kann beispielsweise durch pneumatisches Sprühen auf ein sich bewegenden Träger erfolgen ( US 5,770,272 ; Biemann et al.). Für die nachfolgende massenspektrometrische Aufnahme gibt es zwei verschiedene Verfahren: Das Rasterscan-Verfahren und die stigmatische Abbildung der Ionen eines kleinen Bereichs.
• Das Rasterscan-Verfahren stellt durch Abrastern eines Gewebedünnschnitts mit gut fokussierten Laserstrahlpulsen in einem MALDI-Massenspektrometers ein ein- oder zweidimensionales Intensitätsprofil für einzelne Proteine auf, die in den Massenspektren nachweisbar sind (US 5,808,300; Caprioli). Jeder Rasterpunkt wird also mindestens einmal mit einem fein fokussierten Laserlichtpuls bestrahlt und liefert ein Massenspektrum, das einen breiten Molekulargewichtsbereich abdecken kann, beispielsweise 1 bis 30 Kilodalton. Es ist dann durch entsprechende Software möglich, eine Ionenmasse, die ein Peptid oder ein Protein darstellt, oder einen kleinen Massenbereich um diese Masse herum in den Spektren zu definieren und deren Intensitätsverteilung in einer graphischen Darstellung über die Fläche des Gewebedünnschnitts darzustellen. Hiermit ist es beispielsweise gelungen, die Verteilung von Neuropeptiden im Rattenhirn mit bestimmten morphologischen Auffälligkeiten zu korrelieren oder die Verteilung von β-Amyloidpeptiden im Hirn von Alzheimer-Tiermodellen darzustellen. Es lassen sich räumlich genau definierte Hirnbereiche mit „Alzheimer-Plagues" darstellen (Stoeckli M, Staab D, Staufenbiel M, Wiederhold KH, Signor L, Anal Biochem. 2002, 311, 33–39: Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry).
• Das Verfahren der stigmatischen Abbildung bestrahlt mit dem Laserpuls eine definierte Fläche von bis zu 200 mal 200 Mikrometern, wobei die über der Fläche gebildeten Ionen Punkt für Punkt ionenoptisch auf einen ortsauflösenden Detektor abgebildet werden. Bisher können durch selektive Auswahl einzelner Ionenmassen damit Verteilungsbilder dieser Ionenmassen aufgenommen werden (S. L. Luxembourg et al., Anal. Chem. 2003; 75, 1333–41); es ist aber zu erwarten, dass sich durch sehr schnelle Kameras ganze Massenspektren für jeden Punkt der Fläche aufnehmen lassen werden.
• Ein erheblicher Nachteil beider Verfahrens besteht nun darin, dass bislang nur einzelne Merkmale in derartigen Spektren analytisch verwertet wurden, wie ein in hoher Konzentration vorliegendes Peptid, das besonders typisch für bestimmte Gewebezustände innerhalb einer Gewebeprobe ist. Dieses Vorgehen schränkte das Verfahren bislang ein und verhinderte eine breitere Anwendung auf solche Gewebezustände, die sich nicht auf das Auftreten eines einzigen Peptids oder Proteins zurückführen lassen.
• Unabhängig von derartigen bildgebenden Verfahren hat sich die gezielte Suche nach „Markern" als interessanter Bereich der klinisch orientierten Forschung entwickelt (W. Pusch et al., Pharmacogenetics 2003; 4, 463–476). Hier werden typischerweise Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin oder Spinalflüssigkeit, aber auch Gewebeextrakte, durch Extraktion mit chromatographischen Phasen, Festphasenextraktion oder andere selektive Verfahren in Grobfraktionen mit weniger komplexer Analytzusammensetzung aufgearbeitet und dann massenspektrometrisch charakterisiert. Die hierbei erhaltenen Massenspektren zeigen ein mehr oder weniger komplexes Muster, das von Peptiden und Proteinen herrührt. Durch Vergleich der Massenspektren von Proben gesunder und kranken Individuen gelingt es in Einzelfällen, einzelne Peptide oder Proteine zu finden, die charakteristisch für den Krankheitszustand der Individuen sind.
• Interessante Unterscheidungsmerkmale, die besser statistisch abgesichert sind, werden sich nach allgemeiner Überzeugung aber erst entdecken lassen, wenn dieses Verfahren an Dutzenden oder Hunderten von Proben zweier so genannter Kohorten von Individuen durchgeführt wird: Einer Kohorte, die als Referenz dient und einer Kohorte, in der man bestimmte Auffälligkeiten oder Abweichungen in den Spektren erwartet, da hier ein bestimmtes Krankheitsbild wie Darmkrebs oder Prostatakrebs vorliegt.
• Mit diesem Ansatz wurden erste Erfolge mit der Entdeckung von Proteinsignalen verzeichnet, die im Falle der Proben von Kranken deutlich und statistisch signifikant hervortraten. Es herrscht in der Literatur aber ein heftiger Streit darüber, ob diese Marker zur Diagnose verwendet werden dürfen oder nicht, da bisher nicht erwiesen werden konnte, ob diese Marker nicht vielleicht einfach Anzeichen für die Art der Medikation der Kranken oder für eine allgemeine, mit der Krankheit verbundene Stresssituation sein könnten. Die amerikanische FDA (Food and Drug Administration) verlangt inzwischen als Minimum für eine Zulassung solcher Marker für allgemein-diagnostische Zwecke, das als Marker gefundene Protein eindeutig zu identifizieren und über die Kenntnis des Proteins und seiner Funktion (oder seines Abbaupfades, wenn es sich um ein Abbauprodukt handelt) mindestens die Plausibilität einer Verbindung mit der betreffenden Krankheit herzustellen.
• Es ist natürlich das Ziel dieser Analysen, eine frühe Vorhersage über eine mögliche Entstehung oder Proliferation verschiedener Krankheiten in der Zukunft eines Individuums zu machen. Es besteht dabei die Hoffnung, beispielsweise Krebs schon in einer sehr frühen Phase zu erkennen und damit eine erheblich bessere Chancen zu haben, ihn zu bekämpfen.
• In der Regel enthalten die Massenspektren der verschiedenen Kohorten aber keine einfachen Merkmale wie einige wenige einzelne Signale, die sich in den Kohorten deutlich in ihrer Intensität unterscheiden. Es müssen daher in der Regel aufwändige mathematisch-statistische Analysen der Massenspektren der verschiedenen Kohorten durchgeführt werden. Für diese mathematisch-statistischen Analysen bieten sich verschiedenartige Verfahren an. Diese Verfahren untersuchen, ob sich die Kohorten der gesunden und der kranken Patienten eindeutig und statistisch signifikant anhand von Merkmalsgruppen in den Massenspektren voneinander unterscheiden lassen.
• So kann beispielsweise eine Hauptkomponentenanalyse (PCA = Principal Component Analysis) bestimmen, ob sich Kohorten von kranken Individuen, möglichst sogar von mehreren Kohorten mit mehreren verwandten Krankheiten, von einander und von Kohorten von gesunden Referenzindividuen unterscheiden lassen. Wenn dies zutrifft, kann ein weiteres mathematisches Berechnungsverfahren aus den massenspektrometrischen Signalen krankheitsspezifische Zustandsunterscheidungskenngrößen berechnen, die eindeutig den Zustand eines Individuums in Bezug auf eine bestimmte Krankheit erkennen lassen. Durch entsprechende mathematische Transformationen kann man beispielsweise erreichen, dass die krankheitsspezifischen Zustandsunterscheidungskenngrößen den Zahlenbereich von minus unendlich bis plus unendlich überstreichen, wobei alle Werte kleiner Null einem gesunden Zustand entsprechen, und alle Werte über Null einem kranken. Eine sehr einfache Unterscheidungskenngröße kann beispielsweise ein einfaches Konzentrationsverhältnis zweier Proteine sein, hier gibt es den Zahlenbereich von Null bis unendlich. Oder die Zustandsunterscheidungskenngrößen werden so transformiert, dass sie den Zahlenbereich von Null bis Eins überstreichen: gesunder Zustand nahe Null, kranker Zustand nahe Eins. Das detaillierte Berechnungsverfahren zur Berechnung der Zustandsunterscheidungskenngrößen (sowohl der Algorithmus wie auch die Parametergrößen) wird gespeichert und dient später zur diagnostischen Aussage über diese Krankheit anhand von Massenspektren, die an Proben dieses Individuums aufgenommen wurden.
• Genetische Algorithmen (GA) erzeugen einen Entscheidungspfad, längs dessen sich der Krankheitszustand eines Individuums bestimmen lässt. Aus dem Entscheidungspfad lässt sich ein logischer Ausdruck gewinnen, der sich wiederum in eine Zustandsunterscheidungskenngröße transformieren lässt. Auch dieser logische Berechnungsverfahren wird gespeichert und dient später für diagnostische Aussagen an anderen Proben.
• Als weitere Verfahren zur Untersuchung der Differenzierung sind unter anderem bekannt: Lineare Diskrimanzanalyse (LDA), Support Vector Machines (SVM), Neuronale Netzwerke (NN), Learning Vector Quantifikation (LVQ).
• Aus den Ergebnissen solcher statistischer Analysen lassen sich letztlich detaillierte Berechnungsverfahren (Algorithmen plus Parametersätze) zur Berechnung von Zustandsunterscheidungskenngrößen gewinnen, die sich als mathematische oder logische Ausdrücke darstellen, in die jeweils mehrere Spektrensignale eingehen. Darunter können sich auch sehr schwache Spektrensignale befinden. Durch die Zustandsunterscheidungskenngrößen scheinen auch subtilere Differenzen zwischen Proben verschiedener Kohorten darstellbar zu sein, die Anzahl der nötigen Proben geht allerdings leicht in die Tausende.
• Dabei ist ein erhebliches Problem, dass die Variation der Ionensignale in den einzelnen Massenspektren auch innerhalb einer Kohorte (Patienten oder Gesunde) groß ist und beispielsweise die Altersverteilung in einer Gruppe oder die geschlechtsspezifische Verteilung einen erheblich größeren Einfluss haben können als der Effekt, der untersucht werden soll. Einer der Gründe hierfür liegt darin, dass die Untersuchung von Körperflüssigkeiten nur ein entferntes – oder auch indirektes – Bild von dem Krankheitsgeschehen am Wirkungsort (beispielsweise dem Tumor oder dem Gehirn im Falle neurodegenerativer Erkrankungen) liefert. Das Problem der Markersuche würde sich nach gegenwärtigen Erwartungen vereinfachen lassen, wenn es gelänge, gesunde und kranke Proben eines einzelnen Individuums miteinander vergleichen zu können, was sich aber für Körperflüssigkeiten als Proben wegen deren Homogenisierung im Körper ausschließt und sich nur allenfalls als zeitliche Variation über größere Zeitläufe hinweg feststellen lässt.
• Aufgabe der Erfindung
• Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das einerseits massenspektrometrische Gewebezustandsdifferenzierung visuell darstellen und andererseits Zustandsunterscheidungskenngrößen für den Unterschied zwischen gesunden und kranken Gewebebereichen anhand von ortsaufgelöst aufgenommenen massenspektrometrischen Signalen des untersuchten Gewebes leichter als durch kohortenweise analysierte Proben herausarbeiten kann.
• Beschreibung der Erfindung
• Die Erfindung besteht aus dem Verfahren des Anspruchs 1 mit seinen Verfahrensschritten. Günstige Ausführungsformen sind durch die weiteren Ansprüche gegeben.
• Die Erfindung stellt zunächst ein Verfahren bereit, das für die Visualisierung der räumlichen Verteilung von Gewebezuständen histologischer Proben geeignet ist. Es besteht aus folgenden Schritten:
• a) Erzeugung mindestens einer histologischen Probe als Gewebeschnitt,
• b) Präparation der Proben für massenspektrometrische Analysen,
• c) ortsverteilte Erfassung von massenspektrometrischen Signalen längs einer oder zwei Dimensionen der Proben,
• d) Berechnung von ortszugehörigen Zustandsunterscheidungskenngrößen aus den massenspektrometrischen Signalen, und
• e) graphische Darstellung der Ortsverteilung der Zustandsunterscheidungskenngrößen für mindestens eine der Proben.
• Die Berechnung erfolgt zweckmäßigerweise in einem Computer; die Gewebedarstellung auf einem Bildschirm. Dem Bild der Zustandsunterscheidungskenngrößen kann dabei ein mikroskopisches Bild des Gewebeschnittes (oder der Gewebeschnitte) ortsgetreu unterlegt werden, wobei beispielsweise das mikroskopische Bild als Farbdichtebild (Helligkeit), die Zustandsunterscheidungskenngrößen als Falschfarbtöne dargestellt werden (Beispiel: blaues Gewebe ist gesund; rotes ist krank).
• Dabei kann die Berechnung der ortszugehörigen Zustandsunterscheidungskenngrößen auf detaillierte Berechnungsverfahren (Algorithmen und Parametersätze) zurückgreifen, die vorher an Kohorten von gesunden und kranken Gewebehomogenisaten gewonnen wurden.
• Da, wie oben dargestellt, diese Berechnungsverfahren aber auf stark variierenden Proben verschiedener Individuen beruhen und daher eine klare Erkennbarkeit verwischen können, soll eine weitere Ausführungsform der Erfindung auf die Unterschiede zwischen gesundem und krankem Gewebe des gleichen Individuums abstellen. Es kann erwartet werden, dass die direkte Analyse eines Tumorgewebes und des umgebenden gesunden Gewebes in der Probe eines Individuums ungleich spezifischere Unterschiede zwischen gesund und krank aufzeigen könnte. So können in der Darstellung eines oder mehrerer Gewebestücke auf dem Bildschirm Bereiche angegeben werden, die als gesund beziehungsweise krank angesehen werden (1A), und aus den Massenspektren dieser Bereiche können eigenständig im Computer durch vorgegebene Entwicklungsverfahren Berechnungsverfahren für Zustandsunterscheidungskenngößen entwickelt werden, die dann auf alle Punkte des Gewebes angewendet werden, worauf die Zustandsunterscheidungskenngrößen dann im Gewebebild dargestellt werden (1B). Das Berechnungsverfahren kann beispielsweise einem vorher ermittelten Algorithmus folgen, wobei nur der Parametersatz optimiert wird, etwa durch so genanntes „supervised learning".
• Zum weiteren können die ortsaufgelösten Massenspektren auch von einer Substanzkopie, also nicht vom Gewebe selbst, aufgenommen werden. Die Peptide oder Proteine eines Gewebeschnittes können beispielsweise auf eine Blotmembran übertragen werden. Sie können aber auch auf eine Oberfläche übertragen werden, die mit einer oder mehreren Sorten von Antikörpern belegt sind. Es ist damit möglich, auch Peptide oder Proteine sehr geringer Konzentrationen in ihrer räumlichen Verteilung darzustellen. Die Gewebezustandskenngrößen können damit auf Verhältnisunterschiede von posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierungen oder Glycosylierungen, oder auf Abbauformen von Proteinen ausgedehnt werden.
• Beschreibung der Abbildungen
• 1: Schematischer Dünnschnitt eines Mäusegehirns mit verschiedenen funktionalen Bereichen. In 1A wurden 2 kreisförmige Areale festgelegt, deren punktweise aufgenommenen Massenspektren zur Entwicklung des Berechnungsverfahrens für die Zustandsunterscheidungskenngrößen verwendet werden. In 1B ist die Kenngrößenverteilung über dem gesamten Gewebeschnitt dargestellt.
• Bevorzugte Ausführungsformen
• Eine bevorzugte Ausführungsform beginnt mit der Herstellung eines Gewebedünnschnitts, vorzugsweise von einem tief gefrorenen Gewebestück mit einem Mikrotom. Der Gewebedünnschnitt wird auf einen geeigneten Träger aufgebracht. Der Träger kann beispielsweise ein gläserner Objektträger sein, dessen Oberfläche für die spätere Verwendung im Massenspektrometer mit einer durchsichtigen, jedoch leitenden Oberflächenbeschichtung versehen ist. Jedoch können auch andere Träger, beispielsweise metallische Träger oder Träger aus elektrisch leitendem Kunststoff, verwendet werden. Der Gewebedünnschnitt kann dann in üblicher Form angefärbt werden, wobei aber darauf zu achten ist, eine Färbung zu verwenden, die eine spätere massenspektrometrische Analyse der Gewebebestandteile nicht stört. Auch Fluoreszenzfärbungen können verwendet werden, wenn sie die massenspektrometrische Analyse nicht einschränken.
• Sodann wird von dem Gewebedünnschnitt eine mikroskopische Aufnahme in Durchsicht oder Aufsicht gemacht, die später zum Unterlegen der Ergebnisbilder dient. Vor der Aufnahme können vorzugsweise auf dem Träger Markierungen angebracht werden, die sowohl optisch wie auch massenspektrometrisch erkennbar sind, um eine spätere ortsgetreue Justierung zu ermöglichen. Viele Massenspektrometer besitzen eine Betrachtungseinheit für die Proben, die gleichfalls für die ortsgetreue Justierung verwendet werden kann.
• Der Gewebedünnschnitt wird sodann mit einer Lösung einer geeigneten Matrixsubstanz für die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption besprüht. Das Sprühen kann beispielsweise auf einer Einrichtung erfolgen, die den Objektträger unter dem Sprühstrahl so bewegt, dass eine gleichmäßige Sprühschicht entsteht. Dabei ist darauf zu achten, dass nicht durch ein Verlaufen der aufgesprühten Flüssigkeit die Ortstreue der Substanzen gestört wird. Die auskristallisierende Matrixsubstanz nimmt dabei aus dem Dünnschnitt solche Substanzen auf, die während der Kristallisation in die Kriställchen selbst oder in Korngrenzen zwischen den Kriställchen eingebaut werden können.
• Die Auswahl der Matrixsubstanz kann dabei in hohem Maße beeinflussen, welche Biomoleküle hier in den Spektren zu Signalen führen. Proteine werden so beispielsweise mit 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) oder Sinapinsäure (SA), Peptide mit α-Cyano-4-hydroxy-zimtsäure (CCA), Nukleinsäuren mit 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA) und Saccharid tragende Strukturen mit DHB oder Trihydroxyacetophenon für die MALDI-MS Analytik präpariert.
• In einer anderen, ebenfalls günstigen Ausführungsform kann die ortsaufgelöste Massenspektrometrie an einer Kopie statt am originären Gewebeschnitt vorgenommen werden. So kann beispielsweise der feuchte Gewebedünnschnitt vor oder nach der mikroskopischen Aufnahme mit einer Blotmembran in Kontakt gebracht werden. Blotmembranen sind aus der zweidimensionalen Gelelektrophorese bekannt, sie können Proteine und Peptide in besonderer Weise ortsfest affin binden. Die Substanzen können durch einfache Diffusion, aber auch elektrophoretisch auf die Blotmembran überführt werden. Als Blotmembran für massenspektrometrische Analysen können besonders vorteilhaft Dinitrozellulosemembranen verwendet werden. Für die massenspektrometrische Analyse werden dann diese Blotmembranen statt der Gewebedünnschnitte verwendet.
• Statt einer Blotmembran als Kopiermedium zu verwenden, kann auch eine Oberfläche verwendet werden, die dicht mit einem Antikörper belegt ist. Es lassen sich damit verschiedene Mutanten, Modifikationsformen oder auch Abbauformen eines einzigen Proteins aus dem Gewebe herausziehen und ortsaufgelöst analysieren, selbst wenn das Protein nur in sehr geringer Konzentration im Gewebe vorkommt. Dabei können erfindungsgemäß die Verhältnisse der Mutanten, Modifikationsformen oder Abbauformen als Gewebezustandskenngrößen dargestellt werden. Es ist beispielsweise interessant und sehr aussagekräftig zu sehen, wie ein Protein an einigen Stellen bevorzugt einfach phosphoryliert, an anderen Stellen im Gewebe dagegen dreifach phosphoryliert vorkommt.
• Es kann die Oberfläche des Kopiermediums aber auch mit mehreren Antikörpern für das gleichzeitige Fischen nach mehreren Proteinen belegt werden. Wir dabei nicht bis zur Sätti gung gefischt, so können die Verhältnisse der Proteine wiederum als Gewebezustandsunterscheidungskenngrößen dargestellt werden.
• Die Proben, entweder die präparierten Gewebedünnschnitte oder die präparierten Kopien, werden dann in das Massenspektrometer eingeführt. Es werden dann die massenspektrometrischen Aufnahmen durchgeführt, entweder im Rasterscanverfahren mit fein fokussiertem Laserlichtpulsstrahl oder im Aufnahmeverfahren mit stigmatischer Abbildung der breitflächig erzeugten Ionen.
• Der Rasterscan besteht aus einer punktweisen Aufnahme der Massenspektren, wobei in jedem Punkt der Gewebeprobe (oder Blotmembranprobe) durch den fein fokussierten Laserstrahl eine oder vorzugsweise viele Aufnahmen des Massenspektrums vorgenommen werden. Die Massenspektren werden dabei addiert, um eine höhere Messdynamik zu erreichen und auch um die Statistik des Massensignale zu verbessern. Die Durchmesser der „Punkte" entsprechen in etwa dem Durchmesser des Laserfokusses, oder genauer: dem Durchmesser des Laserstrahles auf der Probe, der durch eine Fokussierung eingestellt werden kann. Es lassen sich für Rasterzwecke normalerweise Durchmesser von etwa 10 bis 50 Mikrometer einstellen. YAG Laser gestatten aber auch Fokusdurchmesser unter einem Mikrometer, Anwendungen sind aber nicht bekannt. Für jeden Punkt des Rasters werden die Summenspektren gespeichert. Für eine Gewebefläche von einem Quadratmillimeter kann es somit 400 bis 10 000 Massenspektren geben, wobei es normalerweise etwa 1000 bis 2000 Spektren sein werden.
• Das Raster ist im allgemeinen aus quadratisch, parallelogramm- oder bienenwabenartig angeordneten Messpunkten zusammengesetzt, kann aber natürlich auch einer speziellen Morphologie der Probe folgend auf derartige Muster verzichten, wie dies beispielsweise bei einem mehrere Millimeter langen Axon eines Ganglions hilfreich wäre. Wichtig ist hierbei alleine, dass die Abstände der Messpunkte der Größe der vom Laser bestrahlten Fläche entsprechend angepasst sind.
• Durch MALDI punktweise erzeugte Ionen können mit Massenspektrometern unter Verwendung verschiedenster Massenanalysatoren untersucht werden. Meist werden Flugzeitanalysatoren (time-of-flight mass spectrometer; TOF-MS) mit oder ohne Ionenreflektor eingesetzt. Es können aber auch Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss verwendet werden. Auch Ionenfallen und Fouriertransform-Ionenzyklotronresonanz (FT-ICR) werden zunehmend verwendet.
• Die stigmatische Abbildung erzeugt von einer bestrahlten Fläche von etwa 100 bis 200 Mikrometer Durchmesser auf einem ortsauflösenden Detektor etwa 100 bis 2000 ortsaufgelöste Massensignale. Dazu werden Flugzeitmassenspektrometer mit besonderer Ionenoptik für stigmatische Abbildungen verwendet. Die heutige Technik besteht darin, für jeden Laserpuls nur das Ionenstromsignal über einen kleinen Massenbereich aufzunehmen, und die übrigen Massenbereiche auszublenden, da die Zeitauflösung der Detektoren keine andere Messweise erlaubt. Für andere Massenbereiche müssen die Messungen jeweils wiederholt werden. Die Auswahl der Massenbereiche wird auf diejenigen Massen abgestimmt, die sich in vorhergehenden Untersuchungen als bedeutungsvoll erwiesen haben. Es ist jedoch zu erwarten, dass es in Zukunft besser zeitauflösende Kameras geben wird. Es wird dann möglich sein, für eine Vielzahl von Punkten die vollen Massenspektren aufzunehmen, wobei die Frage nach dem Massenauflösungsvermögen noch offen ist. Die Ortsauflösung dieses Verfahrens verspricht besser zu sein als das des Rasterscans. Größere Flächen werden mosaikartig nacheinander aufgenommen.
• Nach den Messungen liegen dann für jeden Gewebepunkt vollständige oder massenselektierte Massenspektren vor. Aus diesen Daten lassen sich für jeden Punkt die Gewebezustandsunterscheidungskenngrößen berechnen. Dabei werden die detaillierten Berechnungsverfahren eingesetzt, bestehend aus Algorithmen und Parametersätzen, die in Voruntersuchungen an Kohorten von Proben gewonnen wurden. Diese Gewebezustandskenngrößen werden dann – vorzugsweise über der Darstellung des mikroskopischen Bildes – graphisch dargestellt.
• Eine bevorzugte Darstellung dieses Gewebebildes besteht darin, das mikroskopische Bild, das die Struktur des Gewebes zeigt, für die Farbdichte (Helligkeit des Bildes) zu verwenden, und die Gewebezustandskenngröße für den Farbton einzusetzen. Dann können beispielsweise gesunde Partien des Gewebes in blau, kranke Partien in rot, die Gewebestrukturen in hell-dunkel der jeweiligen Farbe dargestellt werden. Eine solche Darstellung ergibt für das Auge eine höhere Ortsauflösung der Gewebezustandskenngrößen, als es den Messungen entspricht.
• In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die Berechnungsverfahren für die Gewebezustandsgrößen aber auch anhand der Massenspektren des Gewebes selbst (oder zweier verschiedener Gewebestücke) entwickelt oder zumindest verfeinert werden. Dazu können in der Gewebedarstellung auf dem Bildschirm Bereiche angegeben werden, die als gesund beziehungsweise krank angesehen werden (1A). Aus den Massenspektren dieser Bereiche können eigenständig im Computer durch vorgegebene Leitlinien Berechnungsverfahren für Zustandsunterscheidungskenngrößen entwickelt werden. Das Berechnungsverfahren kann beispielsweise einem vorher ermittelten Algorithmus folgen, wobei nur der Parametersatz optimiert wird. Für solche Optimierungen sind verschiedenartige Lernverfahren bekannt. Es kann aber nach einem vorgegebenem Entwicklungsschema das Berechnungsverfahren neu selbständig im Computer entwickelt werden. Das verbesserte oder neu entwickelte Berechnungsverfahren wird sodann auf alle Punkte des Gewebes angewandt, worauf die berechneten Zustandsunterscheidungskenngrößen im Gewebebild dargestellt werden (1B).
• Es kann auch interessant sein mehr als zwei Spektrengruppen miteinander zu vergleichen. In diesem Falle werden im Gewebeschnitt oder über mehrere Gewebeschnitte verteilt mehrere gruppendefinierende Areale markiert, und die Kenngrößen werden so bestimmt, dass die Gruppen voneinander unterschieden werden können.
• Eine weitere Ausführungsform vermeidet die Akquisition von Spektren, die analytisch nicht genutzt werden sollen, wenn die Regionen, die miteinander verglichen werden sollen, klar erkennbar sind. So kann es zum Beispiel im Falle eines räumlich begrenzten Tumors ausreichend sein, diesen und einen repräsentativen kleinen Teil des gesunden Gewebes im Abbild des Gewebeschnittes zu markieren. Nur diese beiden Areale, die für eine Bestimmung der Kenngrößen herangezogen werden sollen, werden dann tatsächlich auch vermessen.
• In weiteren Ausführungsformen können auch dreidimensionale Abbildungen eines Gewebes, beispielsweise durch mehrere Schichten von Gewebedünnschnitte, aufgenommen und erfindungsgemäß dargestellt werden.

Claims (12)

1. Verfahren für die Detektion und Visualisierung der räumlichen Verteilung von Gewebezuständen histologischer Proben, bestehend aus folgenden Schritten: a) Erzeugung mindestens einer histologischen Probe als Gewebeschnitt, b) Präparation der Proben für massenspektrometrische Analysen auf einem Träger, c) ortsaufgelöste Erfassung von massenspektrometrischen Signalen längs einer oder zwei Dimensionen der Proben, d) Berechnung von ortszugehörigen Zustandsunterscheidungskenngrößen aus den massenspektrometrischen Signalen, und e) graphische Darstellung der Ortsverteilung der Zustandsunterscheidungskenngrößen für mindestens eine der Proben.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die graphische Darstellung der Ortsverteilung der Zustandsunterscheidungskenngrößen durch Helligkeitsstufen oder Falschfarben erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der graphischen Darstellung der Ortsverteilung der Zustandsunterscheidungskenngrößen ein mikroskopisches Bild des Gewebeschnittes ortsgetreu unterlegt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das mikroskopische Bild des Gewebeschnittes als Farbdichte und die Ortsverteilung der Gewebezustandsunterscheidungskenngrößen als Farbton dargestellt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das detaillierte Berechnungsverfahren für die Zustandsunterscheidungskenngrößen aus vorhergehenden mathematischen Analysen an größeren Anzahlen von Probenmessungen gewonnen wurde.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das detaillierte Berechnungsverfahren für die Zustandsunterscheidungskenngrößen aus mathematischen Analysen der massenspektrometrischen Signale zweier festzulegender Gebiete des Gewebeschnittes gewonnen wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Festlegung der beiden Gebiete für die mathematischen Analysen der massenspektrometrischen Signale auf der Wiedergabe des Bildes des Gewebeschnittes auf dem Computerbildschirm erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation der Probe für massenspektrometrische Analysen eine Überführung von Substanzen vom Gewebeschnitt auf ein Kopiermedium umfasst, und dass die Gewinnung der ortsaufgelösten massenspektrometrischen Signale der Substanzen von der Oberfläche des Kopiermediums erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Kopiermedium eine Blotmembran ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Kopiermedium eine Oberfläche ist, die mit Antikörpern belegt ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewinnung der massenspektrometrischen Signale eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption verwendet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren an mehreren zusammengehörigen Gewebedünnschnitten durchgeführt wird und dass die Gewebezustandskenngrößen dreidimensional dargestellt werden.