-
Die
Erfindung betrifft das Aufbringen von Matrixsubstanzen auf Oberflächen für eine ortsaufgelöste massenspektrometrische
Messung von Substanzverteilungen in oder auf diesen Oberflächen, insbesondere
in histologischen Gewebedünnschnitten,
mit einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption.
-
Die
Erfindung stellt ein Verfahren bereit, eine Lösung der Matrixsubstanz ohne
Gasunterstützung vibrativ
zu vernebeln und die Nebeltröpfchen
vorzugsweise zyklisch auf der zu untersuchenden Oberfläche abzusetzen.
-
Stand der
Technik
-
Der
Zustand eines Gewebeschnittes in Bezug auf krankhafte Veränderung,
infektiösen
Befall, Stoffwechsel-Anomalien oder medikamentösen Stress kann sich gegenüber einem
Normalzustand dieses Gewebes durch Veränderung der Substanzzusammensetzung
bemerkbar machen. Der Gewebezustand kann sich somit als Konzentrationsmuster von
Substanzen zu erkennen geben. Sind die Konzentrationen hoch genug,
so können
diese Konzentrationsmuster massenspektrometrisch nachgewiesen werden.
Die Substanzen können
dabei Peptide oder Proteine sein, die unter- oder überexprimiert sind
und so ein ungewöhnliches
Muster bilden, sie können
aber auch posttranslationale Modifikationen von Proteinen, deren
Abbauprodukte (Metabolite), oder Ansammlungen sonstiger Substanzen
im Gewebe darstellen.
-
Die
Massenspektrometrie mit Ionisierung der Proben durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI)
wird seit mehreren Jahren erfolgreich zur Molekulargewichtsbestimmung,
zur Identifizierung und zur strukturellen Charakterisierung von
Substanzen, insbesondere von Proteinen oder Peptiden, eingesetzt.
Hierbei wird in der Regel das Protein gelöst und mit einer Lösung einer
Matrixsubstanz wie beispielsweise Sinapinsäure gemischt auf den Probenträger aufgebracht.
Hiernach verdampft das Lösungsmittel
und die Matrixsubstanz kristallisiert, wobei das Protein in den
Matrixkristallen in Form einzelner, weit voneinander getrennter
Moleküle
mitkristallisiert. Ein Beschuss der so gewonnen Probe mit kurzen
Laserlichtpulsen ausreichender Energie führt zur Energieabsorption durch
die Matrixsubstanz, die dadurch explosionsartig verdampft, wobei
die Proteine in das umgebende Vakuum des Massenspektrometers mitgerissen
und durch Protonierung ionisiert werden. Es gibt mehrere Dutzend
Matrixsubstanzen, die prinzipiell geeignet sind; ein halbes Dutzend
verschiedener Matrixsubstanzen hat dabei größere Verbreitung gefunden,
wobei sich für
verschiedene analytische Aufgaben jeweils andere Matrixsubstanzen als
optimal erwiesen haben.
-
Die
Ionen werden im Massenspektrometer nach ihrem Verhältnis von
Masse zu Ladung (m/z, auch „ladungsbezogene
Masse" genannt)
getrennt und als Massenspektrum gemessen. Aus dem Massenspektrum
lässt sich
ihre ladungsbezogene Masse m/z und daraus ihre physikalische Masse
m bestimmen. Da die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption
im Wesentlichen nur einfach geladene Ionen liefert, werde im Folgenden
vereinfachend nur von der „Massenbestimmung" und nicht von der
Bestimmung der ladungsbezogenen Masse und demgemäß einfach von der „Masse" m der Ionen statt
ihres m/z-Verhältnisses
gesprochen.
-
Die
massenspektrometrischen Analysen können an einzeln gewonnenen,
homogenen biologischen Proben, wie beispielsweise Gewebehomogenaten,
lysierten Bakterien oder Bioflüssigkeiten
(Urin, Blutserum, Lymphe, Spinalflüssigkeit, Tränen, Sputum)
durchgeführt
werden, wobei die Proben im Allgemeinen vorher einer hinreichenden
Fraktionierung durch chromatographische oder elektrophoretische Techniken
unterworfen werden.
-
Die
Proben werden dabei insbesondere von störenden Verunreinigungen wie
bestimmten Puffern, Salzen oder Detergenzien befreit. Diese Beseitigung
störender
Verunreinigungen der verschiedensten Arten ist besonders wichtig,
da diese die Ionenausbeute der MALDI-Ionisierung für die Analytsubstanzen
herabsetzen können.
Der Einfluss der Verunreinigungen ist nicht vollkommen verstanden: so
kann beispielsweise beobachtet werden, dass häufig durch eine pure Verdünnung der
Probe, also einer Verdünnung
der Verunreinigung wie auch der Analytsubstanz gegenüber der
Matrixsubstanz eine wesentliche Verbesserung des Massenspektrums
in Bezug auf die Detektierbarkeit der Analytsubstanzen erreicht
wird. Das Verhältnis
von Analyt zu Verunreinigung blieb dabei konstant, was auf einen
Einfluss der Verunreinigungen in höherer als nur linearer Ordnung,
auf Sättigungseffekte
oder andere Unterdrückungseffekte
für die
Ionisierung der Analytsubstanzen hinweist. Dabei scheint das einfache
Bild, dass Verunreinigungen erfolgreich gegen die Analytsubstanzen
um die Protonenquellen konkurrieren, nicht stimmig zu sein. Insbesondere
die Anwesenheit von Detergenzien scheint die Ionisierung ganz allgemein zu
behindern, ohne dass dabei herausragende Anteile an Ionen dieser
Detergenzien gebildet werden.
-
Die
Analyse biologischer Proben beinhaltet somit in der Regel einen
erheblichen Aufwand in der Probenvorbereitung, insbesondere, wenn
dabei auch die Information über
die Verteilung eines Proteins in verschiedenen Bereichen eines Gewebes
durch die Messung einzeln entnommener Proben erzielt werden soll. „Laser
Capture Microdissection" etwa
vermag dies zu leisten, aber die oben erwähnte aufwändige Aufarbeitung ist weiterhin
notwendig, dazu kommt die Schwierigkeit, genug Material für eine derartige
Analyse zu gewinnen.
-
Die
bildgebende massenspektrometrische Analyse (Imaging Mass Spectrometry,
IMS) vermeidet einen derartigen Aufwand. Hierzu wird ein Gewebedünnschnitt
mit einer Dicke von 10 bis 20 Mikrometern beispielsweise mit einem
Gefrier-Mikrotom aus einem tiefgefrorenen Gewebestück eines
interessierenden Organs eines menschlichen, tierischen oder pflanzlichen
Individuums hergestellt und auf einen elektrisch leitenden Probenträger aufgelegt,
beispielsweise einen leitend beschichteten Glas-Objektträger. Dabei
schmilzt der Dünnschnitt
und breitet sich glatt auf dem Probenträger aus. Die Verfahren dazu
sind dem Fachmann bekannt. Auf den getrockneten Dünnschnitt
wird sodann mit einem geeigneten Verfahren, das auch eine Reduzierung
der störenden Einflüsse von
Verunreinigungen beinhalten kann, eine Schicht eines Matrixmaterials
aus einer Matrixlösung
aufgebracht. Nach dem Trocknen der Matrixschicht wird der Objektträger direkt
in das Massenspektrometer eingebracht. Für die nachfolgende massenspektrometrische
Aufnahme gibt es zwei verschiedene Verfahren: Das Rasterscan-Verfahren
und die stigmatische Abbildung der Ionen eines kleinen Bereichs.
-
Das
Rasterscan-Verfahren stellt durch Abrastern eines Gewebedünnschnitts
mit gut fokussierten Laserstrahlpulsen in einem MALDI-Massenspektrometers
ein ein- oder zweidimensionales Intensitätsprofil für einzelne Proteine auf, die
in den Massenspektren nachweisbar sind (
US 5,808,300 ; Caprioli). Jeder Rasterpunkt
wird also mindestens einmal mit einem fein fokussierten Laserlichtpuls
von weiniger als 50 Mikrometer Durchmesser bestrahlt und liefert ein
Massenspektrum, das einen breiten Molekulargewichtsbereich abdecken
kann, beispielsweise 1 bis 30 Kilodalton. Es ist dann durch entsprechende
Software möglich,
eine Ionenmasse, die ein Peptid oder ein Protein darstellt, oder
einen kleinen Massenbereich um diese Masse herum in den Spektren
zu definieren und deren Intensitätsverteilung
in einer graphischen Darstellung über die Fläche des Gewebedünnschnitts
darzustellen. Hiermit ist es beispielsweise gelungen, die Verteilung
von Neuropeptiden im Rattenhirn mit bestimmten morphologischen Auffälligkeiten
zu korrelieren oder die Verteilung von β-Amyloidpeptiden im Hirn von
Alzheimer-Tiermodellen darzustellen. Es lassen sich räumlich genau
definierte Hirnbereiche mit „Alzheimer-Plagues" darstellen (Stoeckli
M, Staab D, Staufenbiel M, Wiederhold KH, Signor L, Anal Biochem.
2002, 311, 33-39:
Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections
using mass spectrometry).
-
Das
Verfahren der stigmatischen Abbildung bestrahlt mit dem Laserpuls
eine definierte Fläche von
bis zu 200 mal 200 Mikrometern, wobei die über der Fläche gebildeten Ionen Punkt
für Punkt
ionenoptisch auf einen ortsauflösenden
Detektor abgebildet werden. Bisher können durch selektive Auswahl
einzelner Ionenmassen damit Verteilungsbilder dieser Ionenmassen
aufgenommen werden (S. L. Luxembourg et al., Anal. Chem. 2003; 75,
1333-41); es ist aber zu erwarten, dass sich durch sehr schnelle
Kameras ganze Massenspektren für
jeden Punkt der Fläche
aufnehmen lassen werden.
-
In
beiden Fällen,
dem Rasterscan und der stigmatischen Abbildung, ist es wie oben
beschrieben erforderlich, die Oberfläche des Präparats mit einem Laserenergie
absorbierenden und Analytmoleküle
ionisierenden Matrixmaterial zu beschichten. Dieses Aufbringen des
Matrixmaterials ist nicht trivial, da (a) eine laterale Verschmierung
der Analytsubstanzen vermieden werden soll, (b) die Analytmoleküle möglichst
aus dem Präparat
extrahiert und in die Kristalle des Matrixmaterials eingebaut werden
müssen,
und (c) ein günstiges
Verhältnis
von Analytmolekülen
zu Verunreinigungen zu erzielen ist. Das Matrixmaterial wird dabei
stets in gelöster
Form aufgebracht und kristallisiert während eines Trocknungsvorgangs.
Als Lösungsmittel
dienen meist Mischungen aus Wasser und organischem Losungsmittel, beispielsweise
Acetonitril. Reines Wasser kann in der Regel die Matrixsubstanzen
nicht lösen.
-
Das
Lösungsmittel
muss also aus dem Dünnschnitt
Analytmoleküle
extrahieren und vertikal in die überstehende
Lösung
transportieren, ohne sie dabei lateral zu verteilen. Hierzu sind
insbesondere die organischen Anteile des Lösungsmittels wichtig, wenn
sich auch viele Analytmoleküle
in Wasser lösen lassen.
Zunächst
muss das Lösungsmittel
in die Dünnschicht
eindringen. Es beginnen dann die Lösungen an der Oberfläche langsam
zu trocknen, wodurch die Matrixmaterialien auskristallisieren. Durch den
Trocknungsvorgang werden die Lösungsmittel aus
der Dünnschicht
wieder herausgezogen, wobei wahrscheinlich Kapillarkräfte und
vor allem die Osmose eine Rolle spielen. Dabei werden auch Analytmoleküle in die überstehende,
trocknende Lösung transportiert.
Es ist für
den MALDI-Prozess vorteilhaft, wenn die zu ionisierenden Analytmoleküle in die Kristalle
des Matrixmaterials eingelagert werden, zumindest aber müssen die
Analytmoleküle
in dichter Berührung
mit den Matrixmaterialien stehen, beispielsweise durch Ablagerung
an den Korngrenzen der Kristalle.
-
Das
Aufbringen der Matrixmaterialien kann beispielsweise durch pneumatisches
Sprühen
einer Matrixlösung
in Form feiner Sprühtröpfchen auf
den Dünnschnitt
erfolgen, wie es in
US 5,770,272 (Biemann
et al.) beschrieben ist. Die Lösung
muss, wie oben beschrieben, vor dem Auskristallisieren des Matrixmaterials
für eine
gewisse Zeit auf dem Dünnschnitt
stehen, damit das Lösungsmittel
in das Dünnschnitt-Präparat eindringen
kann und die Analytmoleküle,
also vorwiegend die Proteine und Peptide, aus dem Dünnschnitt
extrahiert werden können
und somit die Chance haben, in die Kristalle eingebaut zu werden.
Das pneumatische Sprühen
hat nun aber den Nachteil, die sehr dünnflüssigen Sprühtröpfchen durch den Gasstrom des
pneumatischen Sprühens unvermeidbar
makroskopisch über
den Dünnschnitt zu
bewegen und somit durch laterale Verschmierung die Ortsgenauigkeit
der massenspektrometrischen Analyse zu vermindern.
-
Das
pneumatische Sprühen
kann auch für andere
Arten von Oberflächen,
deren Substanzverteilungen zu messen sind, eingesetzt werden. So
ist es für
die Dünnschicht-Chromatographie
eingesetzt worden (
DE
199 37 438 C2 ; Maier-Posner und Franzen; entsprechend
US 6,414,306 B1 ).
-
Die
Entwicklung des pneumatischen Sprühens für Dünnschnitt-Präparate hat
ergeben, dass es günstig
ist, jeweils nur sehr wenig Matrixlösung in einem Sprühgang aufzusprühen, und
diese Sprühvorgänge sehr
häufig
zu wiederholen. In jedem Sprühvorgang
werden große
Anzahlen einzelner Sprühtröpfchen aufgebracht,
jedoch nicht so viele, dass die Sprühtröpfchen auf der Oberfläche zu einem
Flüssigkeitsfilm
ineinander fließen
können.
Zwischen den einzelnen Sprühvorgängen sollen
die aufgesprühten Tröpfchen langsam,
etwa in 30 Sekunden, trocknen können.
So wird beispielsweise für
einige Sekunden gesprüht,
worauf eine Trocknungszeit von etwa 30 Sekunden abgewartet wird.
Dabei wird ein vorsichtig dosierter Gasstrom für das Trocknen eingestellt.
Die Sprühvorgänge müssen dabei
typischerweise hundert bis zweihundert Mal wiederholt werden, um
gut auswertbare Massenspektren zu erhalten. Bei zu wenigen Sprühzyklen
sind die Analytsignale in den Massenspektren deutlich schwächer oder
fehlen vollständig.
-
Obwohl
dieses Verfahren natürlich
automatisierbar ist, wird es mangels kommerziell erhältlicher Geräte meist
manuell durchgeführt,
in der Regel mit so genannten Airbrush-Pistolen. Es erfordert sehr viel
Geduld und Geschick, da es Stunden dauert. Auch bei Verwendung selbst
gebauter Automaten ist es nicht zufrieden stellend reproduzierbar.
Der Gasstrom beim pneumatischen Sprühen transportiert die Tröpfchen über makroskopische
Distanzen, das heißt,
bis zu mehreren Millimetern weit. Bei zu „nassem" Sprühen
vereinigen sich die Tröpfchen
zu einem Flüssigkeitsfilm,
in dem sich durch den Gasstrom eine radial nach außen gerichtete
Strömung ausbildet,
die die Analytmoleküle
delokalisiert. Das andere Extrem ist ein zu „trockenes" Sprühen,
bei dem das Lösungsmittel
bereits in der Flugphase vollständig
abdampft und die Matrix als trockener Kristallschauer auf den Dünnschnitt
trifft. In diesem Fall können
keine Analytmoleküle
in die Matrix eingebaut werden. Es ist sehr schwierig, einen Mittelweg
zwischen diesen beiden Extremen zu finden. Wegen der flächigen Ausbreitung
der auf die Oberfläche
aufgeblasenen Tröpfchen
wird die laterale Auflösung
auf etwa 200 Mikrometer begrenzt. Der zum pneumatischen Sprühen verwendete
Gasstrom übernimmt
bereits ein erstes Trocknen der zersprühten Tröpfchen, wobei das organische
Lösungsmittel
als erstes aus den Tröpfchen
entweicht. Es bleibt ein größerer Wasseranteil,
der aber nicht so gut für
das Extrahieren der Proteine aus der Dünnschnittoberfläche geeignet ist.
Es ist daher notwendig, mit einem großen Anteil an organischem Lösungsmittel
und geringer Konzentration des Matrixmaterials zu arbeiten, was
aber den Prozess verlängert..
-
Wegen
der Nachteile des pneumatischen Sprühens ist ein anderes Verfahren
entwickelt worden, das diesen Nachteil von Sprühtröpfchen im Gasstrom nicht hat:
das Aufgingen einzelner Tröpfchen durch
so genannte Nanospotter. Das Nanospotten kann durch Piezo- oder
Solenoidspotter erfolgen. Es können
Tröpfchen
mit typischen Volumen von 100 Picolitern bis 10 Nanolitern berührungslos
auf den Dünnschnitt
aufgeschossen werden. Es hat sich dabei herausgestellt, dass sich
Tröpfchen
von 10 bis 30 Mikrometer Durchmesser am besten eignen. Sehr viel
kleinere Tröpfchen
trocknen zu schnell, um die Analytmoleküle aus dem Gewebe effizient
extrahieren zu können.
Auch hier muss die Flüssigkeit
für etwa
30 Sekunden auf den Dünnschnitt
einwirken können,
bevor durch das Trocknen der Tröpfchen
die Matrixmaterialien vollständig
auskristallisieren.
-
Die
Positioniergenauigkeit der Nanospotter erlaubt es, die Tröpfchen mit
einer lateralen Wiederholungspräzision
der Spotterposition von wenigen Mikrometern aufzubringen, wobei
aber, abhängig
von der näheren
Umgebung des Dünnschnitts,
die Tröpfchen
in statistisch verteilter Richtung um mehrere Mikrometer seitlich
abgelenkt werden. Es können
zwar die Tröpfchen
genau aufeinander gespottet werden, aber ihre Position entspricht
nicht unbedingt dem angesteuerten Raster. Es ist ein kommerziell
vertriebener Nanospotter auf dem Markt. Es hat sich hierfür ein Verfahren
herausgebildet, die Tröpfchen
in einem sehr genauen Positionierungsraster mit einem Abstand von
jeweils etwa 150 bis 200 Mikrometern aufzubringen. Der Abstand ist
so groß gewählt, dass
die Tröpfchen
nicht in einander laufen. Die Tröpfchengröße von etwa
20 Mikrometer Durchmesser (etwa zehn Picogramm) ergibt dabei Beschussflecken
von etwa 100 Mikrometer Durchmesser. Jeder einzelne dieser Rasterpunkte
wird in Zeitabständen
von je etwa 30 Sekunden wieder beschossen; dieser Beschuss wird für jeden
Rasterpunkt einige Hundert Mal wiederholt. Auch hier dauert das
Verfahren des Aufbringen der Matrixsubstanz einige Stunden.
-
Die
mit diesem Verfahren des Nanospottens erhaltenen Massenspektren
sind von hoher Güte, das
Verfahren ist aber wegen der Benutzung eines sehr teuren Gerätes nicht
billig. Es ergeben sich sehr viel bessere Massenspektren der Analytsubstanzen als
mit dem pneumatischen Sprühverfahren,
und eine leicht bessere laterale Auflösung von etwa 100 bis 150 Mikrometer,
bedingt durch das Raster des Spottens. Die massenspektrometrische
Messung erfordert allerdings eine Bilderkennung für die Positionierung
jedes einzelnen Fleckens mit Matrixkristallen. Da sich der MALDI-Prozess
der Ionisierung von Analytmolekülen
gut mit Laserfokuspunkten von etwa 30 Mikrometer Durchmesser durchführen lässt, ist
dieses Verfahren des Nanospottens nicht optimal an die erreichbare
laterale Auflösung
der MALDI-Massenspektrometrie angepasst.
-
Aufgabe der
Erfindung
-
Es
ist die Aufgabe der Erfindung, Vorrichtungen und Verfahren für ein Aufgingen
einer quasihomogenen Matrixkristallschicht auf Oberflächen bereitzustellen,
die einerseits preiswert arbeiten und andererseits eine gute laterale
Auflösung
für die
massenspektrometrische Messung der Analytverteilungen in oder auf
diesen Oberflächen
ergeben.
-
Beschreibung
der Erfindung
-
Die
Erfindung besteht aus dem Verfahren des Anspruchs 1 mit seinen Verfahrensschritten. Günstige Ausführungsformen
sind durch die weiteren Ansprüche
gegeben. Eine Vorrichtung ist in Anspruch 14 wiedergegeben.
-
Die
Erfindung stellt zunächst
ein einfaches Grundverfahren für
das Aufbringen einer Matrixkristallschicht auf die Oberfläche eines
Targets bereit, an dem die Ortsverteilung von Analytmolekülen auf
oder in der Targetoberfläche
massenspektrometrisch mit Hilfe einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption
gemessen werden soll. Das Verfahren soll folgende Schritte umfassen:
- (a) Bereitstellen einer Lösung der Matrixsubstanz,
- (b) Bereitstellen eines Targets, und
- (c) vibratives Vernebeln der Matrixlösung zu einer Wolke aus Nebeltröpfchen und
Absetzenlassen der Nebeltröpfchen
auf die Oberfläche
des Targets.
-
Ist
die Tröpfchendichte,
die sich auf dem Target absetzt, genügend klein und trocknen die
abgesetzten Tröpfchen
genügend
schnell auf, so kann das Vernebeln kontinuierlich erfolgen, bis
genügend
Matrixmaterial aufgebracht ist. Es hat sich jedoch als günstig herausgestellt,
die Matrixlösung
nur in kurzen Stößen zu vernebeln
und kurze Intervalle für
ein mindestens teilweises Trocknen der abgesetzten Nebeltröpfchen einzuschieben.
Die Stöße des Vernebelns können zwischen
0,5 und 5 Sekunden lang sein, optimal sind etwa ein bis zwei Sekunden.
Die Intervalle des Trocknens können
zwischen 10 und 60 Sekunden lang, optimal sind 20 bis 40 Sekunden.
-
Als „Target" können hier
sowohl Dünnschnitt-Präparate wie
auch andere Präparate
verstanden werden, die an der Oberfläche oder im Material direkt
unterhalb der Oberfläche
Analytsubstanzen in nicht-homogener Verteilung besitzen, wobei diese
Analytsubstanzen massenspektrometrisch analysiert und ihre Ortsverteilungen
bestimmt werden sollen. Ein solches Target kann beispielsweise auch
eine chromatographische Dünnschicht,
eine gelelektrophoretische Membran oder eine Blotmembran sein. Eine
Blotmembran kann eine Kopie mit Analytsubstanzen aus einer Dünnschnitt-Präparation sein.
Die massenspektrometrische Analyse kann einfach nur die Bestimmung
des Molekulargewichts betreffen, kann aber auch eine weitergehende
Identifizierung der Analytsubstanz umfassen.
-
Unter
einer „vibrativen" Vernebelung soll
verstanden werden, dass die Matrixlösung durch einen vibrierenden
Körper
unter Abschütteln
der Lösungströpfchen von
seiner Oberfläche
vernebelt wird, insbesondere ohne Zuhilfenahme eines pneumatischen Zerstäubens. Das
vibrative Vernebeln hat den großen
Vorteil, dass die Nebeltröpfchen
nicht in einem pneumatisch erzeugten Gasstrom fliegen müssen und
so keiner Zwangstrocknung unterliegen.
-
Eine
solche vibrative Vernebelung kann leicht durch eine dünne, elastische
Folie geschehen, die zu Vibrationen in einem ihrer Obertöne angeregt wird.
Es wird vorzugsweise eine Metallfolie von etwa 0,1 bis 0,2 Millimeter
Stärke
verwendet. Wenn diese Folie in ein „Fußbad" aus Matrixlösung eintaucht, so wird die
Matrixlösung
automatisch und in Sekundenbruchteilen an der vibrierenden Folie
heraufgezogen und vernebelt. Die Anregung kann über einen piezoelektrischen
Kristall erfolgen, auf den die Folie aufgeklebt ist; die günstigsten
Frequenzen liegen im Bereich von etwa 50 bis 200 Kilohertz, beispielsweise bei
etwa 120 bis 140 Kilohertz für
eine Metallfolie von 20 Millimeter Breite, 40 Millimeter Länge und
0,2 Millimeter Dicke. Es ist dabei eine Resonanz eines Obertones
zu suchen, diese ist für
eine optimale Vernebelung auf etwa 0,5 Kilohertz genau einzuhalten.
-
Die
Nebeltröpfchen
werden von den Schwingungsbäuchen
der Folie her abgeschüttelt,
sie haben Durchmesser, die bei etwa 10 bis 30 Mikrometer liegen.
Es werden dabei auch größere Tröpfchen gebildet,
wahrscheinlich durch den Zusammenschluss von kleineren Tröpfchen.
Die schwereren Tröpfchen können durch
ihre höhere
Sinkgeschwindigkeit so ausgesondert werden, dass sie nicht die Oberfläche des
Targets erreichen. Die Wolke aus Nebeltröpfchen dehnt sich selbständig aus,
weil durch ein geringes Verdampfen der Nebeltröpfchen so lange eine Vergrößerung des
Gasvolumens der Wolke stattfindet, bis durch die Abkühlung der
Tröpfchen
deren Dampfdruck dem Gasdruck in der Wolke entspricht. Diese selbständige Vergrößerung der
Wolke mit den Nebeltröpfchen
ist ein weiterer wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens.
-
Unter „Absetzenlassen" soll hier verstanden werden,
dass sich die Nebeltröpfchen
entweder von selbst aus der Wolke auf die Oberfläche des Targets absetzen, oder
dass die Nebeltröpfchen
aktiv zum Target geführt
werden. Das Absetzen der Nebeltröpfchen
ohne Zutun kann durch die Schwerkraft auf ein liegenden Target erfolgen,
aber auch durch Auftriebskräfte
innerhalb der Wolke aus Nebeltröpfchen
auf ein hängendes
Target (die Lösungsmitteldämpfe sind spezifisch
leichter als Luft). Die aktive Führung
kann durch einen leichten Gasstrom oder nach elektrischer Aufladung
durch ein elektrisches Feld bewirkt werden. Eine elektrische Aufladung
der Nebeltröpfchen
ist durch ein Abschütteln
in einem elektrischen Feld, aber auch durch die Zuführung geladener
Teilchen, beispielsweise durch Betastrahlen, möglich. Geladene Nebeltröpfchen haben
den weiteren Vorteil, dass sie keine Neigung besitzen, sich zu größeren Tröpfchen zusammenzuschließen. Auch
Mischformen aktiver Führung
der Nebeltröpfchen
und automatischem Absetzen sind möglich.
-
Das „mindestens
teilweise Trocknen" in
den Intervallen zwischen den Vernebelungsstößen besteht darin, die Trocknung
der Tröpfchen
bis zur deutlichen Kristallbildung abzuwarten, wobei sich aber durchaus
noch kleinere Reste an Flüssigkeit
oder Feuchtigkeit zwischen den Kristallen oder im Targetmaterial
befinden können.
Es ist zweckmäßig und
hat sich besonders bewährt,
nach einigen Zyklen der Vernebelung, des Absetzens und des Trocknens
längere
Pausen von einigen Minuten für
ein vollständiges
Durchtrocknen einzulegen. Es kann für das „mindestens teilweise Trocknen" wie auch für das vollständige Durchtrocknen
ein leichter, getrockneter und gefilterter Gasstrom durch die Kammer
geleitet werden, die die Vernebelungsvorrichtung und die Vorrichtung
für das
Halten des Targets umschließt.
-
Die
Zyklen des Vernebelns, Absetzenlassens und Trocknens müssen bei
Dünnschnitt-Präparaten
insgesamt sehr häufig,
in der Regel mindestens hundert Mal, vorzugsweise etwa zweihundert
Mal wiederholt werden, um gut massenspektrometrisch messbare Signale
zu erhalten. Es scheint hier eine Belegungsschwelle für die massenspektrometrische Messbarkeit
der Analytsubstanzen zu geben. Erst bei Überschreiten der Schwelle kommt
es zu brauchbaren Massenspektren mit gut auswertbaren Signalen der
Analytsubstanzen. Eine gute Belegung mit feinen Matrixkristallen
sieht wie ein feiner Raureif-Überzug aus;
die Gewebeunterschiede des Dünnschnitts
sind allenfalls noch durch das Profil, nicht mehr durch Farbunterschiede
zu sehen. Es ist bisher nicht bekannt, warum eine solch dicke Beschichtung
für gute
massenspektrometrische Ergebnisse erfor derlich ist. Es kann jedoch
vermutet werden, dass hier Reinigungsprozesse ablaufen. Für andere
Arten von Targets, beispielsweise für Blotmembranen, die sich gut
waschen lassen, muss die Anzahl der Belegungszyklen nicht so hoch
sein.
-
Es
ist ein weiterer besonderer Vorteil dieses Verfahrens, dass durch
die statistische Ortsverteilung der aufgebrachten Tröpfchen nach
und nach eine vollständige Überdeckung
des Targets erreicht wird. Durch das sachte Absetzen fließen die
Tröpfchen
auch nicht weit auseinander: der Bedeckungsfleck eines abgesetzten
Tropfens hat auf einer etwa 10 Mikrometer dicken Dünnschnitt-Präparation
einen Durchmesser von etwa 50 Mikrometern. Die laterale Auflösung liegt
ebenfalls bei etwa 50 Mikrometern und ist daher deutlich besser
als bei den Verfahren nach dem jetzigen Stand der Technik.
-
Beschreibung
der Abbildungen
-
Die 1 zeigt,
wie in der Kammer (1) neben dem Traget (2) auf
der Haltevorrichtung (3) auch der Vibrator enthalten ist,
bestehend aus der Haltevorrichtung (4), dem Piezokristall
(5) und der Vibrationsfolie (6). Die Vibrationsfolie
(6) taucht in das Fußbad
(7) mit Matrixlösung,
deren Pegel durch die Vorratsflasche (8) mit Matrixlösung (9)
konstant hoch gehalten wird. Durch Vibration entsteht die Nebelwolke
(14), die sich von selbst bis über das Target (2) ausdehnt
und deren Tröpfchen
sich auf das Target (2) absetzen. Die Nebelwolke kann notfalls
auch durch einen schwachen Luftstrom (15) geführt werden.
Der Luftstrom (15) entsteht durch leichtes Ansaugen am Stutzen
(13), der Luft durch das Feinstfilter (10) und den
Kanal (11) in die Kammer saugt und durch das Leitblech
(12) zum Target (2) führt.
-
Bevorzugte
Ausführungsformen
-
Eine
bevorzugte Ausführungsform
beginnt mit der Herstellung eines Gewebedünnschnitts, vorzugsweise von
einem tiefgefrorenen Gewebestück mit
einem Mikrotom. Der Gewebedünnschnitt
wird auf einen geeigneten Träger
aufgebracht. Der Träger kann
beispielsweise ein gläserner
Objektträger
sein, dessen Oberfläche
für die
spätere
Verwendung im Massenspektrometer mit einer durchsichtigen, jedoch
elektrisch leitenden Oberflächenbeschichtung versehen
ist. Solche leitenden Schichten sind dem Fachmann bekannt. Jedoch
können
auch andere Träger,
beispielsweise metallische Träger
oder Träger
aus elektrisch leitendem Kunststoff, verwendet werden. Der tiefgefrorene
Gewebedünnschnitt
breitet sich auf dem Träger
bei Raumtemperatur durch Schmelzen sofort flach aus und haftet auf
dem Träger durch
Adhäsion.
Auch nach einem Trocknen haftet das Dünnschicht-Präparat fest
auf dem Träger.
Der Gewebedünnschnitt
kann in üblicher
Form angefärbt werden,
wobei aber darauf zu achten ist, eine Färbung zu verwenden, die eine
spätere
massenspektrometrische Analyse der Gewebebestandteile nicht stört. Auch
Fluoreszenzfärbungen
können
verwendet werden, wenn sie die massenspektrometrische Analyse nicht
einschränken.
Bei Färbungen,
die massenspektrometrisch stören,
wird nur jeder zweite Schnitt angefärbt und nur die ungefärbten Schnitte
werden massenspektrometrisch analysiert.
-
Sodann
wird von dem Gewebedünnschnitt eine
mikroskopische Aufnahme in Durchsicht oder Aufsicht gemacht, die
später
zum Unterlegen der Ergebnisbilder dient. Vor der Aufnahme können vorzugsweise
auf dem Träger
Markierungen angebracht werden, die optisch und möglichst
auch massenspektrometrisch erkennbar sind, um eine spätere ortsgetreue
Justierung zu ermögli chen.
Viele Massenspektrometer besitzen eine Betrachtungseinheit für die Proben,
die gleichfalls für
die ortsgetreue Justierung verwendet werden kann.
-
Der
Gewebedünnschnitt
auf dem Träger
(2), hier des Weiteren als „Taget" bezeichnet, wird sodann in eine Kammer
(1) gebracht, in der sich auch die Vernebelungsvorrichtung
befindet. Das Target (2) kann beispielsweise auf einer
Vorrichtung (3) befestigt werden, die das Target (2)
unter der Vernebelungswolke (14) so bewegt, dass eine gleichmäßige Belegung
mit Nebeltröpfchen
entsteht. Dabei ist darauf zu achten, dass die Belegung nicht so
dicht wird, dass durch ein Zusammenfließen der abgesetzten Tröpfchen die
Ortstreue der Substanzen gestört
wird. Erzeugt die Vernebelung einen sehr dünnen Nebel, so kann kontinuierlich
vernebelt werden. Bei dichter Vernebelung, wie sie durch die oben
beschriebene Vernebelungseinrichtung meist gegeben ist, genügen im Allgemeinen
etwa ein bis zwei Sekunden Vibration, um eine Nebelwolke richtiger
Dichte zu erzeugen, wobei dann aber Trocknungsintervalle eingeschaltet
werden müssen.
-
Das
Target (2) muss aber nicht bewegt werden, es können auch
ohne solche Bewegung sehr gute und gleichmäßige Belegungen erzielt werden, selbst
wenn das Absetzen der Tröpfchen
aus der Nebelwolke (14) nur durch die Gravitation, also
durch ein eigenständiges
Sinken der Tröpfchen
durch die Schwerkraft geschieht. Auch eine Belegung mit Nebeltröpfchen durch
Auftriebsvorgänge
innerhalb der Nebelwolke kann sich eine richtige und gleichmäßige Belegungsdichte
ohne Bewegung des Targets ergeben. Über andere Verfahren, die Tröpfchen der
Nebelwolke zum Target zu führen,
wird unten berichtet.
-
Die
Vernebelungsvorrichtung ist ebenfalls sehr einfach. Sie besteht
aus einem piezoelektrischem Kristall (5), der in der Kammer
(1) durch eine Vorrichtung (4) fest gehaltert
ist und über
Spannungszuführungen
mit einer hochfrequenten Wechselspannung versehen werden kann. Auf
dem Piezokristall (5) ist die Metallfolie (6)
befestigt, im einfachsten Fall durch Aufkleben mit einem Kleber,
der den verwendeten Lösungsmitteln
widersteht. Die Metallfolie (6) ist etwa 20 mal 40 mal
0,2 Millimeter groß.
Es können
natürlich
auch Folien aus anderen Materialien verwendet werden, auch hier
ist eine Lösungsmittelresistenz
erforderlich. Metallfolien haben sich aber bisher am besten bewährt.
-
Die
Frequenz der Hochfrequenzspannung am Piezokristall (5)
wird so gewählt,
dass ein Oberton der Schwingungen der Metallfolie (6) in
Resonanz getroffen wird. Es entsteht dann ein Muster an Schwingungsknoten
und Schwingungsbäuchen
auf der Folie. Für
eine Metallfolie der genannten Dimensionen liegt eine günstige Frequenz
zwischen etwa 120 und 140 Kilohertz, auf jeden Fall aber im Bereich von
etwa 50 bis 200 Kilohertz. Die Frequenz ist auf etwa 0,5 Kilohertz
genau einzuhalten, um in Resonanz zu bleiben.
-
Die
Metallfolie (6) taucht am unteren Ende für ein, zwei
Millimeter in ein Fußbad
(7) aus Matrixlösung
ein. Das Fußbad
(7) wird nach Art einer Vogeltränke durch ein Vorratsfläschchen
(8) mit Matrixlösung
(9) auf gleichem Pegelstand gehalten. Sobald die Metallfolie
(6) in Schwingungen versetzt wird, kriecht die Matrixlösung aus
dem Fußbad
(7) an der Metallfolie (6) hoch und wird an den
Schwingungsbäuchen
jeweils in Form kleiner Nebeltröpfchen
abgeschüttelt.
Bei der angegebenen Frequenz entsteht eine Nebelwolke (14),
in der etwa 90 Prozent der Nebeltröpfchen einen Durchmesser zwischen
10 und 30 Mikrometer haben. Jedoch entstehen auch einige größere Tröpfchen,
wahrscheinlich durch Zusammenschluss von kleineren Tröpfchen in
der Nebelwolke (14). Diese größeren Tröpfchen sinken aber durch die
Schwerkraft viel schneller ab und können so ausgeschieden werden,
bevor sie das Target (2) erreichen.
-
Wird
die Vibration eingeschaltet, so entsteht praktisch sofort eine Nebelwolke
(14) mit Tröpfchen der
Matrixlösung.
Durch eine Vibration von ein bis zwei Sekunden Dauer entsteht eine
Wolke (14) von einigen Zentimetern Durchmesser. Die Wolke
(14) breitet sich von selbst in der Kammer (1)
auch über das
Target (2) hinweg aus. Dabei sinken die Tröpfchen langsam
durch die Schwerkraft ab und können sich
auf dem Target (2) absetzen.
-
Die
einzelnen Tröpfchen,
die sich auf dem Target (2) absetzen, fließen auf
Dünnschnitt-Präparationen
zu Feuchtigkeitsflecken von etwa 50 Mikrometer Durchmesser auseinander.
Sie sind statistisch über
die Oberfläche
verteilt. Aus einer Wolke (14), die durch ein bis zwei
Sekunden Vibration entsteht, setzen sich nicht so viele Tröpfchen ab,
dass eine merklich starke Überlappung
von Feuchtigkeitsflecken entstünde:
die Tröpfchen
bleiben also ganz überwiegend
voneinander getrennt. Durch den Vorgang der Vernebelung hat sich
nun der Raum über
dem Target (2) mit Lösungsmittel
angereichert. Dadurch ist – in wünschenswerter
Weise – ein
sofortiges Trocknen der Feuchtigkeitsflecken erschwert. Das Trocknen geht
nur sehr langsam vor sich. Das Lösungsmittel hat
Zeit, in das Target (2) einzudringen, das Targetmaterial
zum Quellen zu bringen und Analytmoleküle zu lösen.
-
Durch
das Trocknen erhöht
sich die Konzentration des Matrixmaterials in der überstehenden Flüssigkeit:
das Matrixmaterial beginnt sich in Form einzelner Kriställchen aus
der Flüssigkeit
auszuscheiden. Durch diesen Trocknungsvorgang wird nun auch Flüssigkeit
aus dem Target zurückgeholt,
im Wesentlichen durch Osmose, zum Teil aber auch durch die Kapillarwirkung
der Zwischenräume
zwischen den Matrixkriställchen.
Dabei werden auch die gelösten
Analytmoleküle
transportiert. Diese können in
die Kriställchen
eingebaut, aber auch in Korngrenzen abgelagert werden.
-
Wird
dieser Vorgang des Vernebelns, Absetzens der Tröpfchen und Trocknens etwa zehn
bis zwanzig Mal wiederholt, so findet eine vollständige Überdeckung
des Targets mit Matrixkriställchen
statt. Die dabei auftretenden Überlappung
neuer Tröpfchen
auf alte, schon getrocknete Flecken scheint dabei die laterale Auflösung kaum
zu stören.
Ist das Target eine Dünnschnitt-Präparation,
und wird das Target (2) nach nur zwanzig Belegungszyklen
einer massenspektrometrischen Analyse mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption
(MALDI) unterzogen, so bleiben die Analytmoleküle im Massenspektrum unsichtbar.
-
Über den
Grund für
diesen Misserfolg kann nur spekuliert werden. Es werden wohl durch
das Lösungsmittel
nicht nur die Analytmoleküle
gelöst,
sondern auch viele andere Substanzen der Dünnschnitt-Präparationen.
Der Dünnschnitt
enthält
Salze und viele andere Substanzen, die sich im Gewebe befinden,
darunter auch viele Substanzen, die den MALDI-Ionisierungsprozess
stören.
Diese werden vermutlich ebenso wie die Analytmoleküle in die
Kristallschicht transportiert und dort abgesetzt.
-
Erst
wenn der Vorgang des Vernebelns, Absetzens der Tröpfchen und
Trocknens etwa mindestens hundert, möglichst sogar zweihundert Mal
wiederholt wird, stellt sich ein Erfolg ein. Es liegt dann auf der
Dünnschicht-Präparation
eine sichtbare, weiße
Schicht aus Matrixkriställchen.
Sie sieht wie eine verschneite Landschaft aus: es ist alles weiß bedeckt.
Es können
jetzt sehr gute Massenspektren der Analytsubstanzen, also der Proteine
und Peptide aus der Dünnschnitt-Präparation,
gewonnen werden, wenn auch nicht bekannt ist, warum. Es mag daran liegen,
dass jetzt Analytsubstanzen und Verunreinigungen einfach beide verdünnt wurden,
oder daran, dass diese Substanzen voneinander durch Rekristallisationseffekte
oder durch verschiedene Wanderungsgeschwindigkeit in der Matrixkristallschicht
getrennt wurden, Der Effekt an sich ist aber nicht neu: er tritt
auch bei den bisherigen Verfahren zur Belegung mit Matrixmaterial
auf.
-
Das
Absetzen der Tröpfchen
aus der Nebelwolke (14) kann auch durch verschiedene Maßnahmen
aktiv unterstützt
werden, beispielsweise, um größere Targetflächen gleichmäßig zu bedecken.
So können
beispielsweise die Tröpfchen
durch ein Abschütteln
in einem elektrischen Feld, etwa durch eine Gleichspannung zwischen
Target (2) und vibrierender Metallfolie (6), elektrisch
geladen und dann im elektrischen Feld geführt werden. Die Ladung kann auch
durch ionisierende Strahlung aufgebracht werden, beispielsweise
durch einen Beta-Strahler. Eine Aufladung der Tröpfchen wirkt auch in anderer
Weise günstig:
so wird durch eine Aufladung der Tröpfchen weitgehend verhindert,
dass sich kleinere Tröpfchen zu
größeren Tröpfchen zusammenschließen.
-
Ein
sehr einfache Art zur Führung
der Nebelwolke ist ein schwacher, durch kleine Führungsbleche (12)
geführter
Gasstrom (15). Dazu ist beispielsweise unter dem Vibrator
eine Öffnung
(11) angebracht, durch den ein geringer Strom gut in einem Feinstfilter
(10) von Staub gereinigter Luft in die Kammer gesaugt werden
kann. Das Ansaugen kann beispielsweise durch einen Stutzen (13)
geschehen, der an anderer Stelle in der Kammer (1) angebracht
ist. Der Luftstrom (15) kann durch Führungsbleche (12) so
gelenkt werden, dass er die Nebelwolke (14) zum Target
(2) führt.
Dieser Luftstrom (15) kann insbesondere auch zur Steuerung
des Trocknungsvorganges verwendet werden.
-
Es
hat sich als besonders günstig
herausgestellt, wenn nach fünf
bis zehn Zyklen des Vernebelns, Absetzens der Tröpfchen und Trocknens eine Pause
eingelegt wird, in der das bisher belegte Target (2) stark
durchgetrocknet wird. Dazu kann auch ein verstärkter Luftstrom (15)
eingeschaltet werden. Die Pause kann einige Minuten betragen.
-
Das
Belegen von Dünnschnitt-Präparationen dauert
grundsätzlich
sehr lange. Wenn ein Zyklus des Vernebelns, Absetzens der Tröpfchen und
Trocknens nur etwa 30 Sekunden dauert, und alle zehn Zyklen für nur zwei
Minuten stark getrocknet wird, so dauern zweihundert Zyklen etwa
2,5 Stunden. Es ist somit zweckmäßig, den
Vorgang zu automatisieren. Das kann durch eine einfache Elektronik
geschehen, die die Steuerung von Vibration und Absaugen der Luft übernimmt,
aber auch durch eine Rechnersteuerung mit einem Programm, dessen
Parameter sich optimal an die jeweiligen Verhältnisse anpassen lassen.
-
In
der langen Zeitspanne bis zur endgültigen Belegung können in
der Belegungskammer Änderungen
eintreten, die den optimalen Belegungsvorgang stören. So kann sich beispielsweise
die Mischung des Lösungsmittels
im Fußbad
(7) ändern.
Dieses besteht meist aus einem organischen Anteil an Lösungsmittel,
beispielsweise Acetonitril oder Methanol, und Wasser. Die bevorzugte
Verdampfung des organischen Lösungsmittels
verstärkt
den Wasseranteil und erhöht
damit die Neigung des Matrixmaterials, auszukristallisieren. Es
kann durchaus ein Auskristallisieren bereits auf der Vibrationsfolie
(6) geschehen, wodurch sich die Resonanzfrequenz ändert. Dem
kann entgegengewirkt werden, wenn von Zeit zu Zeit, beispielsweise
in den Trocknungspausen, etwa reines Lösungsmittel in programmierter Menge
zum Fußbad
(7) der Lösung
zugegeben wird. Es kann durchaus zweckmäßig sein, diese Zugabe dazu
zu verwenden, durch ein Anspritzen der Vibrationsfolie (6)
eine Kristallbildung auf der Folie zu beseitigen. Dazu kann in die
Kammer (1) eine (hier nicht gezeigte) Spritzvorrichtung
eingebaut werden.
-
Es
kann die Matrixlösung
(9) aus einer Vorratsflasche (8) der Vibrationsfolie
(6) auch ganz anders als über das Fußbad (7) zugeführt werden.
Beispielsweise kann die Vibrationsfolie (6) durch winzige Löcher porös gestaltet
sein, und die Matrixlösung
(9) kann über
ein schwammartiges Material der Folie (6) in direkter Berührung von
hinten zugeführt
werden. Vibratoren dieser Art waren früher als Inhalatoren in Gebrauch.
-
Die
Auswahl der Matrixsubstanz kann in hohem Maße beeinflussen, welche Biomoleküle hier
als Analytmoleküle
in den Spektren zu Signalen führen. Proteine
werden so beispielsweise mit 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB)
oder Sinapinsäure
(SA), Peptide mit α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CCA),
Nukleinsäuren
mit 3-Hydroxypicolinsäure
(3-HPA) und Saccharid tragende Strukturen mit DHB oder Trihydroxyacetophenon
für die
MALDI-Analytik präpariert.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann die ortsaufgelöste
Massenspektrometrie an einer Kopie statt am originären Gewebeschnitt
vorgenommen werden. So kann beispielsweise der feuchte Gewebedünnschnitt
vor oder nach der mikroskopischen Aufnahme mit einer Blotmembran
in Kontakt gebracht werden. Blotmembranen sind aus der zweidimensionalen
Gelelektrophorese bekannt, sie können Proteine
und Peptide in besonderer Weise ortsfest affin binden. Die Substanzen
können
durch einfache Diffusion, aber auch elektrophoretisch auf die Blotmembran überführt werden.
Als Blotmembran für massenspektrometrische
Analysen können
besonders vorteilhaft Dinitrozellulosemembranen verwendet werden.
Für die
massenspektrometrische Analyse werden dann diese Blotmembranen statt
der Gewebedünnschnitte
verwendet und mit dem erfindungsgemäßen Belegungsverfahren mit
Matrixschichten belegt. Die Verwendung von Blotmembranen hat durchaus
Vorteile: da die Analytsubstanzen relativ fest in der Blotmembran
gehalten werden, können
sie in geeigneten Flüssigkeiten
gewaschen und so von einem großen
Teil der Verunreinigungen befreit werden. Der Belegungsvorgang kann
dann bedeutend weniger Zyklen umfassen und trotzdem sehr gute Massenspektren
der Analytsubstanzen ergeben.
-
Statt
eine Blotmembran als Kopiermedium zu verwenden, kann auch eine Oberfläche verwendet werden,
die dicht mit Antikörpermolekülen für ausgewählte Proteine
oder Peptide belegt ist. Es lassen sich damit verschiedene Mutanten,
Modifikationsformen oder auch Abbauformen eines einzigen Proteins aus
dem Gewebe herausziehen und ortsaufgelöst analysieren, selbst wenn
das Protein nur in sehr geringer Konzentration im Gewebe vorkommt.
Dabei können
die Verhältnisse
der Mutanten, Modifikationsformen oder Abbauformen zueinander gemessen werden.
Es ist beispielsweise interessant und sehr aussagekräftig zu
sehen, wie ein Protein an einigen Stellen bevorzugt einfach phosphoryliert,
an anderen Stellen im Gewebe dagegen dreifach phosphoryliert vorkommt.
Es kann die Oberfläche
des Kopiermediums aber auch mit mehreren Antikörpern für das gleichzeitige Fischen
nach mehreren Proteinen belegt werden. Dabei darf nicht bis zur
Sättigung
gefischt werden, wenn die Verhältnisse
der Proteine untereinander bewahrt werden sollen.
-
Eine
andere Art von Targets sind chromatographische Dünnschichten (TLC = thin layer
chromatography). Auch hier werden die Verteilungen der Analytsubstanzen
gemessen. Nach dem Stand der Technik werden hier bisher pneumatische
Sprühverfahren
zum Aufbringen der Matrixschicht verwendet.
-
Die
Targets, also entweder die präparierten Gewebedünnschnitte,
präparierten
Kopien oder chromatographische Dünnschichten,
werden nach Belegen mit Matrixschichten in das Massenspektrometer
eingeführt.
Es werden dann die massenspektrometrischen Aufnahmen durchgeführt, entweder
im Rasterscanverfahren mit fein fokussiertem Laserlichtpulsstrahl
oder im Aufnahmeverfahren mit stigmatischer Abbildung der breitflächig erzeugten
Ionen.
-
Der
Rasterscan besteht aus einer punktweisen Aufnahme der Massenspektren,
wobei in jedem Punkt des Targets durch den fein fokussierten Laserstrahl
eine oder vorzugsweise viele Aufnahmen des Massenspektrums vorgenommen
werden. Die Massenspektren werden dabei addiert, um eine höhere Messdynamik
zu erreichen und auch um die Statistik des Massensignale zu verbessern.
Die Durchmesser der „Punkte" entsprechen in etwa
dem Durchmesser des Laserfokusses, oder genauer: dem Durchmesser des
Laserstrahles auf der Probe, der durch eine Fokussierung eingestellt
werden kann. Es lassen sich für
Rasterzwecke normalerweise Durchmesser von etwa 20 bis 50 Mikrometer
einstellen. Für
jeden Punkt des Rasters werden die Summenspektren gespeichert. Für eine Gewebefläche von
einem Quadratmillimeter kann es somit 400 bis 2 500 Massenspektren
geben, wobei normalerweise aber nicht über 400 Spektren hinausgegangen
wird.
-
Das
Raster ist im allgemeinen aus quadratisch, parallelogramm- oder
bienenwabenartig angeordneten Messpunkten zusammengesetzt, kann aber
natürlich
auch einer speziellen Morphologie des Targets folgend auf derartige
Muster verzichten, wie dies beispielsweise bei einem mehrere Millimeter
langen Axon eines Ganglions hilfreich wäre. Wichtig ist hierbei alleine,
dass die Abstände
der Messpunkte der Größe der vom
Laser bestrahlten Fläche
entsprechend angepasst sind.
-
Durch
MALDI erzeugte Ionen können
mit Massenspektrometern unter Verwendung verschiedenster Massenanalysatoren
untersucht werden. Meist werden Flugzeitanalysatoren (time-offlight mass
spectrometer; TOF-MS) mit oder ohne Ionenreflektor eingesetzt. Es
können
aber auch Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss verwendet
werden. Auch Ionenfallen und Fouriertransform-Ionenzyklotronresonanz
(FT-ICR) werden zunehmend verwendet.
-
Die
stigmatische Abbildung erzeugt von einer bestrahlten Fläche von
etwa 200 Mikrometer Durchmesser auf einem ortsauflösenden Detektor etwa
10 bis 20 ortsaufgelöste
Massensignale. Dazu werden Flugzeitmassenspektrometer mit besonderer Ionenoptik
für stigmatische
Abbildungen verwendet. Die heutige Technik besteht darin, für jeden
Laserpuls nur das Ionenstromsignal über einen kleinen Massenbereich
aufzunehmen, und die übrigen
Massenbereiche auszublenden, da die Zeitauflösung der Detektoren keine andere
Messweise erlaubt. Für
andere Massenbereiche müssen
die Messungen jeweils wiederholt werden. Die Auswahl der Massenbereiche
wird auf diejenigen Massen abgestimmt, die sich in vorhergehenden
Untersuchungen als bedeutungsvoll erwiesen haben. Es ist jedoch
zu erwarten, dass es in Zukunft besser zeitauflösende Kameras geben wird. Es
wird dann möglich
sein, für
eine Vielzahl von Punkten die vollen Massenspektren aufzunehmen,
wobei die Frage nach dem Massenauflösungsvermögen noch offen ist. Die Ortsauflösung dieses
Verfahrens verspricht besser zu sein als das des Rasterscans. Größere Flächen werden
mosaikartig nacheinander aufgenommen.
-
Nach
den Messungen liegen dann für
jeden Gewebepunkt vollständige
oder massenselektierte Massenspektren vor. Geeignete Bildverfahren
lassen es zu, bestimmte Analytsubstanzen anhand ihrer Ionenmassen
auszuwählen
und als zweidimensionales Bild darzustellen. Es können auch
gleichzeitig mehrere Analytsubstanzen in mehreren Farben dargestellt
werden. Die Darstellung kann mit einer mikroskopischen Aufnahme
des Gewebedünnschnitts
unterlegt werden.
-
Aus
den massenspektrometrischen Daten lassen sich aber auch für jeden
Punkt besondere „Gewebezustandsunterscheidungskenngrößen" berechnen. Dazu
werden detaillierte Berechnungsverfahren eingesetzt, bestehend aus
Algorithmen und Parametersätzen,
die in Voruntersuchungen an Kohorten von Proben als „Biomarker" gewonnen wurden.
Diese Gewebezustandskenngrößen werden dann – vorzugsweise über der
Darstellung des mikroskopischen Bildes – graphisch dargestellt. Solche Verfahren
sind in der Offenlegungsschrift
DE
10 2004 037 512.7 (entsprechend
GB 0 515 914.0 ) dargelegt.
-
In
weiteren Ausführungsformen
können
auch dreidimensionale Abbildungen eines Gewebes, beispielsweise
durch mehrere Schichten von Gewebedünnschnitte, aufgenommen werden.