DE102019114829A1 - Massenspektrometrische Bestimmung von Gewebezuständen - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Bestimmung und Visualisierung der räumlichen Verteilung von Gewebezuständen einer Gewebeprobe und ist dadurch gekennzeichnet, dass an einer Vielzahl von Probenorten der Gewebeprobe jeweils eine Massen/Mobilitäts-Karte aufgenommen wird, an jedem Probenort die Signalhöhen an kennzeichnenden Signalstellen in der zugehörigen Massen/Mobilitäts-Karte ermittelt werden und daraus mittels eines mathematisch-statistischen Klassifizierungsalgorithmus ein Gewebezustand für den jeweiligen Probenort berechnet wird und die räumliche Verteilung der für die Probenorten berechneten Gewebezustände graphisch dargestellt wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft die Bestimmung und Visualisierung der Ortsverteilung von Gewebezustände in Gewebeproben, beispielsweise histologischen Gewebeschnitten, aus ortsaufgelösten massenspektrometrischen Signalen.
  • Stand der Technik
  • Die Histologie ist die Lehre von den menschlichen, tierischen und pflanzlichen Geweben, insbesondere deren Struktur und Funktion. Eine histologische Klassifizierung eines Gewebes ist gleichbedeutend mit der Bestimmung des Gewebezustandes, der sich auf Art und Differenzierungen des Gewebes, bakterielle und parasitäre Krankheitserreger im Gewebe, den Krankheitszustand des Gewebes oder eine sonstige Veränderung gegenüber einem Normalzustand beziehen kann. Der Begriff „Histologie“ schließt im Folgenden auch die Untersuchung von Gewebeproben auf Krankheitszustände („Histopathologie“) ein. Die Krankheitszustände von Gewebe betreffen entzündliche Erkrankungen, Stoffwechselerkrankungen und den Nachweis von Tumoren, insbesondere die Differenzierung zwischen gut- und bösartigen Tumorformen.
  • Die Gewebezustände werden im histologischen Routinebetrieb anhand lichtoptischer Bilder von Gewebeschnitten bestimmt, die mit Hilfe von Mikroskopen oder Scannern aufgenommen werden. Die Gewebeschnitte sind dabei nur wenige Mikrometer dick und werden angefärbt, um den Kontrast in den lichtoptischen Bildern zu erhöhen und Strukturen in den Gewebeschnitten sichtbar zu machen. Die Histologie ist bisher überwiegend eine morphologische Diagnostik, denn die Gewebezustände werden anhand des Erscheinungsbildes und Färbungsverhaltens von Gewebe- und auch Zellstrukturen bestimmt. Da in der Regel ein lichtoptisches Bild eines ganzen Gewebeschnittes aufgenommen wird, ist es möglich und üblich, Gewebezustände an verschiedenen Orten des Gewebeschnittes, also ortsaufgelöst, zu bestimmen.
  • Der Gewebezustand spiegelt sich auch auf molekularer Ebene in Konzentrationsmustern von biologischen Substanzen, wie z.B. Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden oder Zuckern (Glykanen), wieder. Ein molekulares Muster kann sich dadurch ergeben, dass biologische Substanzen in bestimmten Gewebezuständen unter- oder überexprimiert sind. Insbesondere Proteine können beispielsweise in charakteristischer Weise durch posttranslationale Modifikationen modifiziert vorliegen, z.B. durch Phosphorylierung, Glykolisierung oder Silanisierung. Die Suche nach Substanzen, die charakteristisch für Krankheiten sind (sogenannte Biomarker), hat sich in den letzten Jahren zu einem vielbeachteten Gebiet der klinischen Forschung entwickelt. Dazu werden die biologischen Substanzen in Körperflüssigkeiten (z.B. Blut, Urin oder Spinalflüssigkeit) oder homogenisierten Gewebeproben typischerweise durch Festphasenextraktion oder chromatographische Trennverfahren in Fraktionen aufgeteilt und danach massenspektrometrisch untersucht. Die gemessenen Massenspektren zeigen ein mehr oder weniger komplexes Signalmuster, das meistens von Peptiden, Proteinen und Lipiden herrührt.
  • Das Massenspektrum einer Gewebeprobe weist einen hohen molekularen Informationsgehalt mit einer Vielzahl von Signalen auf, wobei der Gewebezustand in der Regel nicht durch ein einzelnes Signal, sondern nur durch ein Signalmuster festgelegt ist. Es gibt eine Vielzahl unterschiedlicher mathematisch-statistischer Klassifizierungsalgorithmen, mit denen aus dem hochdimensionalen Signalmuster eines gemessenen Massenspektrums einer Gewebeprobe dessen Zustand bestimmt werden kann, z.B. Neuronale Netze (Linear Vector Quantization (LVQ), Neural Gas (NG), Self-Organizing Map (SOM)), Support-Vector-Maschinen (SVM), Genetische Algorithmen zur Clusteranalyse, Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analysis), Entscheidungsbäume oder Nächste-Nachbarn-Klassifikatoren (k-Nearest-Neighbor).
  • Bevor der Gewebezustand einer Gewebeprobe mit einem Klassifizierungsalgorithmus bestimmt werden kann, werden erst einmal Massenspektren von vielen Gewebeproben, die unterschiedliche Gewebezustände aufweisen und deren Gewebezustand jeweils bekannt ist, gemessen und daraufhin untersucht, ob sich mit dem Klassifizierungsalgorithmus Gewebezustände anhand der gemessenen Massenspektren überhaupt unterscheiden lassen. Falls für die Parameter des Klassifizierungsalgorithmus Einstellungen gefunden werden, mit denen Gewebezustände in den Massenspektren unterschieden werden, können diese Parametereinstellungen verwendet werden, um ein Massenspektrum einer zu untersuchenden Gewebeprobe einer der Klassen zuzuordnen und damit den Gewebezustand der zu untersuchenden Gewebeprobe zu bestimmen.
  • Einige Klassifizierungsalgorithmen ermöglichen Aussagen darüber, welche Signale der Massenspektren für eine Klassifizierung relevant sind. Mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) wird beispielsweise eine Reduktion auf solche Signale durchgeführt, die einen großen Einfluss auf die Varianz der hochdimensionalen Signalmuster haben und die damit oft einen hohen Informationsgehalt aufweisen. Bei den sogenannten überwachten Klassifizierungsalgorithmen, wie z.B. den Support-Vector-Maschinen, ist es zudem notwendig, dass die Massenspektren in einer Trainingsphase des Klassifizierungsalgorithmus jeweils einer vorher bekannten Klasse (z.B. krank oder gesund) zugeordnet werden, diese „Trainingsspektren“ also ein Label tragen.
  • In den vergangenen Jahren hat sich eine bildgebende Massenspektrometrie etabliert, mit der histologische Gewebeschnitte anstelle von homogenisierten Gewebeproben untersucht werden, und zwar bevorzugt mit MALDI-Flugzeitmassenspektrometern (MALDI = matrix assisted laser desorption/ionization). Aus den Patentschriften DE 10 2006 019 530 B4 und DE 10 2006 059 695 B3 sind verschiedene Verfahren und Vorrichtungen bekannt, mit denen Gewebeschnitte auf MALDI-Probenträger präpariert werden können. Dazu wird beispielsweise eine Matrixlösung durch vibratives Vernebeln in Form von kleinen Tröpfchen auf einem Gewebeschnitt aufgebracht, wo das Lösungsmittel verdampft und die Matrixsubstanz zusammen mit aus dem Gewebeschnitt extrahierten Substanzen kristallisiert. Für die Messung von ortsaufgelösten MALDI-Massenspektren wird in der Regel ein Rasterscan-Verfahren nach Caprioli ( US 5,808,300 A ) verwendet. Teilbereiche des Gewebeschnittes können aber auch ionenoptisch abgebildet werden (Luxembourg et al., Analytical Chemistry, 76(18), 2004, 5339 - 5344: „High-Spatial Resolution Mass Spectrometric Imaging of Peptide and Protein Distributions on a Surface"). In beiden Fällen ergibt sich aus den Signalen jedes Massenintervalls, das in den Massenspektren aufgelöst wird, ein entsprechendes Massenbild des Gewebeschnittes. Die molekularen Informationen des Gewebeschnittes liegen ortsaufgelöst vor.
  • Der Patentschrift DE 10 2004 037 512 B4 ist zu entnehmen, dass für einen Gewebeschnitt Massenspektren ortsaufgelöst gemessen werden und dass aus jedem der ortsaufgelösten Massenspektren (oder Teilen davon) jeweils ein ortsaufgelöster Gewebezustand am entsprechenden Ort des Gewebeschnittes berechnet wird. Es wird damit nicht ein Gewebezustand einer (homogenisierten) Gewebeprobe bestimmt, sondern ein Zustandsbild des Gewebeschnittes. Die ortsaufgelösten Gewebezustände, als Bildpunkte des Zustandsbildes, werden mit den bereits erwähnten mathematisch-statistischen Klassifizierungsalgorithmen berechnet. Die Informationen der vielen gemessenen Massenbilder des Gewebeschnittes werden in einem einzelnen Zustandsbild zusammengeführt und damit für den Anwender optisch leicht erfassbar.
  • Die ortsaufgelösten Massenspektren eines zu untersuchenden Gewebeschnittes können dazu dienen, die Parameter des Klassifizierungsalgorithmus festzulegen, bevor die Gewebezustände in anderen Bereichen des zu untersuchenden Gewebeschnittes bestimmt werden. Bei überwachten Klassifizierungsalgorithmen muss dazu der Gewebezustand der ortsaufgelösten Massenspektren, mit denen der Klassifizierungsalgorithmus trainiert wird, allerdings vorher bekannt sein. Die Parametereinstellungen des Klassifizierungsalgorithmus können aber auch bereits evaluiert vorliegen, z.B. aus vorhergehenden Untersuchungen von ortsaufgelösten Massenspektren anderer gleichartiger Gewebeschnitte oder von Massenspektren homogenisierter gleichartiger Gewebeproben.
  • Aus der Druckschrift WO 2016/142696 A1 ist eine Plattform für die bildgebende Massenspektrometrie bekannt, mit der ein Gewebe direkt bei Umgebungsdruck abgebildet werden kann. Ein bildgebendes Verfahren umfasst dabei eine automatische Probennahme an einer Vielzahl von Probenorten, wobei an den Probenorten ein Aerosol, Rauch oder Dampf von der Gewebeprobe erzeugt wird. Es werden an den Probenorten Massenspektren und/oder Mobilitätsspektren aufgenommen, die dem jeweiligen Probenort zugeordnet sind, wobei die erhaltenen Massenspektren und/oder Mobilitätsspektren verwendet werden, um ein Klassifizierungsmodell zu konstruieren, zu trainieren oder zu verbessern und anzuwenden.
  • Aufgrund der großen Anzahl von verschiedenen Substanzen in einer Gewebeprobe und der damit verbundenen Vielzahl von Signalen, ist es leider häufig schwierig, charakteristische Substanzen (Biomarker), insbesondere solche mit geringer Konzentration, in ortsaufgelösten Massenspektren bzw. Mobilitätsspektren mit Sicherheit zu erkennen und deren Signalstärke zu ermitteln. Das ist ein Grund, weshalb die Klassifizierungsgüte von Gewebezuständen in den nach dem Stand der Technik berechneten Zustandsbildern gegenüber einer Klassifizierung aus homogenisierten Gewebeproben geringer ist. Bei jeder Art von Klassifizierung, also auch bei der Bestimmung von Gewebezuständen, treten verschiedene Arten von Zuordnungsfehlern auf. Aus diesen ergeben sich statistische Kenngrößen, die die Güte der Klassifizierung festlegen.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren für die Bestimmung und Visualisierung der räumlichen Verteilung von Gewebezuständen einer Gewebeprobe bereitzustellen, in der die Bestimmung der ortsaufgelösten Gewebezustände eine verbesserte Klassifizierungsgüte gegenüber dem Stand der Technik aufweist.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Bestimmung und Visualisierung der räumlichen Verteilung von Gewebezuständen einer Gewebeprobe bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass
    • - an einer Vielzahl von Probenorten der Gewebeprobe jeweils eine Massen/Mobilitäts-Karte aufgenommen wird,
    • - an jedem Probenort die Signalhöhen an kennzeichnenden Signalstellen in der zugehörigen Massen/Mobilitäts-Karte ermittelt werden und daraus mittels eines mathematisch-statistischen Klassifizierungsalgorithmus ein Gewebezustand für den jeweiligen Probenort berechnet wird; und
    • - die räumliche Verteilung der für die Probenorte berechneten Gewebezustände graphisch dargestellt wird.
  • Die Anzahl der kennzeichnenden Signalstellen, die für die Berechnung der Gewebezustände verwendet werden, ist bevorzugt weniger als 5, 10, 20, 50 oder 100. Die Anzahl der verschiedenen Gewebezustände (Klassen) kann beispielsweise 2, 3, 4 oder 5 sein. An den Probenorten kann jeweils auch mehr als eine Massen/Mobilitäts-Karte aufgenommen werden, wobei eine Massen/Mobilitäts-Karte insbesondere mittels einer Auftragung der Ionenmobilität über der Ionenmasse gebildet wird. Der mathematisch-statistische Klassifizierungsalgorithmus kann eine Hauptkomponentenanalyse (PCA), ein genetischer Algorithmus (GA), eine Lineare Diskriminanzanalyse (LDA), eine Support Vector Machine (SVM), eine Support Vector Regression (SVR), ein neuronales Netzwerk (NN) oder eine Learning Vector Quantifikation (LVQ) umfassen.
  • Die Probenorte können im Wesentlichen die ganze Gewebeprobe abdecken oder nur eine gerade oder gekrümmte Linie der Gewebeprobe. Die Probenorte können ein echtes Teilgebiet oder mehrere voneinander getrennte Teilgebiete auf der Gewebeprobe abdecken. Ein Anwender kann die Probenorte, an denen jeweils eine Massen/Mobilitäts-Karte aufgenommen werden soll, auf einem lichtoptischen Bild einer zweiten Gewebeprobe festlegen, deren Gewebeart der Gewebeart der zu untersuchenden Gewebeprobe entspricht oder die aus einer benachbarten Entnahmestelle im Gewebe stammt.
  • Die graphische Darstellung der räumlichen Verteilung der berechneten Gewebezustände erfolgt bevorzugt durch Helligkeitsstufen oder Falschfarben. Die graphische Darstellung der räumlichen Verteilung der berechneten Gewebezustände kann insbesondere einem lichtoptischen Bild der Gewebeprobe unterlegt werden, insbesondere einem mikroskopischen Bild mit höherer Ortsauflösung, wobei die Gewebeprobe bevorzugt erst nach der Aufnahme der Massen/Mobilitäts-Karten angefärbt wird und das lichtoptische Bild von der angefärbten Gewebeprobe aufgenommen wird.
  • Die Gewebeprobe ist bevorzugt ein mit Formalin fixierter und in Paraffin eingebetteterv (FFPE) Gewebeschnitt nach einer Renaturierung, ein frischer gefrorener Gewebeschnitt, ein Abdruck eines Gewebeschnittes oder einer der Probenbereiche auf einem Tissue Microarray (TMA) nach einer Renaturierung. Es können auch mehrere Gewebeproben in Form von benachbarten Gewebeschnitten untersucht werden, wobei die räumliche Verteilung der berechneten Gewebezustände der Gewebeproben dreidimensional dargestellt werden.
  • Die (ionischen) Signale an den Signalstellen stammen von mindestens zwei chemisch unterscheidbaren Substanzen, insbesondere von isomerischen Substanzen mit gleicher Summenformel. Verschiedene Substanzklassen, wie z.B. Peptide, Glykane und Lipide, werden in einer Massen/Mobilitäts-Karte zumindest teilweise getrennt und die mindestens zwei chemisch unterscheidbaren Substanzen stammen bevorzugt aus einer der Substanzklassen. Die Peptide können dabei zumindest teilweise durch einen enzymatischen Verdau der Proteine der Gewebeprobe erzeugt werden, insbesondere mittels einer Trypsin-Präparation der histologischen Probe vor der Aufnahme der Massen/Mobilitäts-Karten. Die Glykane können zumindest teilweise durch eine Deglykolisierung von Glykoproteinen der Gewebeprobe erzeugt werden, insbesondere mittels einer PNGase-Präparation der histologischen Probe vor der Aufnahme der Massen/Mobilitäts-Karten.
  • Die Auswahl und Ermittlung der kennzeichnenden Signalstellen kann auf unterschiedliche Arten erfolgen.
  • In einer ersten bevorzugten Ausführungsform wird an einer Vielzahl von Probenorten einer gleichartigen Gewebeprobe jeweils eine Massen/Mobilitäts-Karte aufgenommen, wobei der Gewebezustand zumindest für einen Teil der Probenorte der gleichartigen Gewebeprobe und damit der zugehörigen Massen/Mobilitäts-Karte bekannt ist. Die Signalhöhen werden an einer ersten Signalstelle in den Massen/Mobilitäts-Karten mit bekanntem Gewebezustand ermittelt und dem jeweils bekannten Gewebezustand zugeordnet, wobei die erste Signalstelle eine der kennzeichnenden Signalstellen wird, wenn die Gewebezustände über die Verteilung der Signalhöhen an der ersten Signalstelle hinreichend unterscheidbar sind (univariante statistische Analyse). Diese univariante-statistische Analyse wird des Weiteren an einer Vielzahl von weitern Signalstellen durchgeführt. In bevorzugter Weise wird für die univariante Analyse mehr als eine gleichartige Gewebeprobe verwendet.
  • In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform ist der Gewebezustand zumindest für einen Teil der Probenorte der zu untersuchenden Gewebeprobe und damit der zugehörigen Massen/Mobilitäts-Karten bekannt. Die Signalhöhen werden an einer ersten Signalstelle in den Massen/Mobilitäts-Karten mit bekanntem Gewebezustand ermittelt und dem jeweils bekannten Gewebezustand zugeordnet, wobei die erste Signalstelle eine der kennzeichnenden Signalstellen wird, wenn die Gewebezustände über die Verteilung der Signalhöhen an der ersten Signalstelle hinreichend unterscheidbar sind (univariante statistische Analyse). Diese univariante-statistische Analyse wird des Weiteren an einer Vielzahl von weiteren Signalstellen durchgeführt.
  • In beiden Ausführungsformen kann in der univarianten-statistischen Analyse für jede untersuchte Signalstelle eine Grenzwertoptimierungskurve (Receiver-Operating-Characteristic-Kurve, ROC-Kurve) erstellt werden, wobei eine Signalstelle eine der kennzeichnenden Signalstellen wird, wenn die Fläche unter der Grenzwertoptimierungskurve größer als ein vorgegebener Grenzwert ist, insbesondere größer als 0.6, 0.7, 0.8 oder 0.9 ist.
  • Die als kennzeichnend ermittelten Signalstellen und die dazugehörigen Signalhöhen werden bevorzugt für das Training eines überwachten Klassifizierungsalgorithmus verwendet, wobei während des Trainings eine oder mehrere als kennzeichnend ermittelten Signalstellen aussortiert werden können.
  • In einer dritten bevorzugten Ausführungsform wird entweder an einer Vielzahl von Probenorten mindestens einer Gewebeprobe jeweils eine Massen/Mobilitäts-Karte aufgenommen, wobei der Gewebezustand zumindest für einen Teil der Probenorte der mindestens einen Gewebeprobe bekannt ist, oder der Gewebezustand zumindest für einen Teil der Probenorte der zu untersuchenden Gewebeprobe selber bekannt ist. Werden mehrere Gewebeproben verwendet, so sollen sie gleichartig sein. Die Signalhöhen werden an einer Vielzahl von Signalstellen in den Massen/Mobilitäts-Karten mit bekanntem Gewebezustand ermittelt und zusammen mit dem jeweils bekannten Gewebezustand für das Training eines überwachten Klassifizierungsalgorithmus verwendet, wobei die kennzeichnenden Signalstellen erst im Training ermittelt werden.
  • Die Massen/Mobilitäts-Karten werden bevorzugt mit einem massenspektrometrischen System aufgenommen, das einen Speicherionen-Mobilitätsseparator (TIMS-Separator, TIMS = Trapped Ion Mobility Spectrometry) und einen Massenanalysator umfasst. Der Massenanalysator kann ein Flugzeitmassenanalysator, insbesondere mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF), eine elektrostatische Ionenfalle, eine Hochfrequenz-Ionenfalle, ein Ionenzyklotronresonanz-Ionenfalle oder ein Quadrupol-Massenfilter sein.
  • Eine typische Betriebsweise eines TIMS-Separators besteht darin, dass ein Gasstrom die zu analysierenden Ionen gegen eine Rampe einer entgegenwirkenden elektrischen Feldbarriere treibt, so dass die Ionen entsprechend ihrer Mobilität an Stellen entlang der Rampe gespeichert werden. Nach dem Beladen mit Ionen wird der Zufluss weiterer Ionen gestoppt und die Höhe der entgegenwirkenden elektrischen Feldbarriere stetig verringert, so dass Ionenarten in der Reihenfolge ihrer Mobilität die elektrische Feldbarriere passieren können. Ein TIMS-Separator wird üblicherweise im Niederdruckbereich von 2 bis 500 Pa betrieben und verwendet ein elektrisches Hochfrequenzfeld zum radialen Einschließen der Ionen. TIMS-Separatoren werden beispielsweise in den amerikanischen Patentschriften US 6,630,662 (Loboda) und US 7,838,826 (Park) beschrieben und theoretische Grundlagen finden sich im Artikel „Fundamentals of Trapped Ion Mobility Spectrometry“ von Michelmann et al. (J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2015, 26, 14-24).
  • Der TIMS-Separator kann in einem zeitlichen Zoom-Betriebsmodus betrieben werden, wobei die momentane Scangeschwindigkeit des TIMS-Separators an den Mobilitätspositionen der kennzeichnenden Signalstellen jeweils verringert wird und damit die Mobilitätsauflösung dort erhöht wird. Der TIMS-Separator umfasst bevorzugt einen zusätzlichen Speicherbereich, der von dem Separationsbereich räumlich getrennt ist und diesem vorgeschaltet ist, und wird in einem Betriebsmodus mit gleichzeitiger Akkumulation betrieben. In diesem Betriebsmodus werden Ionen eines Probenortes in dem zusätzlichen Speicherbereich akkumuliert, während im Separationsbereich vorher akkumulierte Ionen eines anderen Probenortes nach Mobilität separiert werden, um eine Massen/Mobilitäts-Karte aufzunehmen. Es können dadurch mehr als 5, 10, 20, 50 oder 100 Massen/Mobilitäts-Karten pro Sekunde aufgenommen werden.
  • Die Gewebeprobe wird im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt auf einem Probenträger präpariert, wobei die Ionen an den Probenorten durch eine ortsauflösende Ionenquelle erzeugt werden, insbesondere mittels einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI), Desorption-Elektrospray-Ionisation (DESI), Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorptions-Elektrospray (MALDESI) oder Laserdesorption mit nachfolgender chemischer Ionisierung (LDCI).
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein weiteres Verfahren für die Bestimmung und Visualisierung der räumlichen Verteilung von Gewebezuständen einer Gewebeprobe bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass
    • - eine Vielzahl von Massen/Mobilitäts-Karten in eine elektronische Datenverarbeitungsanlage geladen werden, wobei jede Massen/Mobilitäts-Karte einem Probenort der Gewebeprobe zugeordnet ist;
    • - für jede Massen/Mobilitäts-Karte die Signalhöhen an kennzeichnenden Signalstellen ermittelt werden und daraus mittels eines mathematisch-statistischen Klassifizierungsalgorithmus ein Gewebezustand für den zugeordneten Probenort berechnet wird; und
    • - die räumliche Verteilung der für die Probenorte berechneten Gewebezustände graphisch dargestellt wird.
  • Gegenüber den bekannten Verfahren der bildgebenden Massenspektrometrie sind die Biomarker erfindungsgemäß nicht mehr Signale in ortsaufgelösten eindimensionalen Massenspektren oder Mobilitätsspektren, sondern Signale in ortsaufgelösten zweidimensionalen Massen/Mobilitäts-Karten. Die Aufnahme einer Massen/Mobilitäts-Karte in jedem Probenpunkt entspricht der bekannten massenspektrometrischen Analyse einer homogenisierten Gewebeprobe mit vorgeschaltetem Trennverfahren insofern, als dass die Mobilitätseparation in der Gasphase das Trennverfahren in der Flüssigkeit ersetzt und dadurch eine verbesserte Klassifizierungsgüte für einzelne Probenpunkte erreicht wird.
  • Die Mobilitätsseparation verbessert oder ermöglicht erst die Unterscheidbarkeit zwischen Substanzen, die für einen Gewebezustand charakteristisch sind, und der Vielzahl von nicht charakteristischen Substanzen. Insbesondere ermöglicht es die Verwendung von Massen/Mobilitäts-Karten, dass charakteristische Isomere von nicht-charakteristischen Isomeren unterschieden werden und dadurch erst für eine Berechnung von Gewebezuständen verwendet werden können. Die Mobilitätsseparation verringert zudem die Anforderung an das Auflösungsvermögen des Massenanalysators, da die Auftrennung der Substanzen in zwei Dimensionen erfolgt und nicht vollständig im Massenspektrum erreicht werden muss.
  • Üblicherweise wird in der bildgebenden Massenspektrometrie ein MALDI TOF-Massenanalysator mit axialem Ioneneinschuss (ATOF) verwendet, wobei typischer Weise zwischen 1000 und 10000 Massenspektren pro Sekunde aufgenommen werden und pro Probenort etwa 100 einzelne Massenspektren zu einem Summenspektrum aufaddiert werden. Daraus ergibt sich, dass mit einem ATOF Massenanalysator ohne Mobilitätsseparation typischerweise zwischen 10 und 100 Probenorte pro Sekunde untersucht werden können. Es ist überraschend, dass sich bei der Aufnahme einer Massen/Mobilitäts-Karte die Anzahl der Probenorte, die pro Sekunde untersucht werden können, im Wesentlichen nicht ändert, wenn die Massen/Mobilitäts-Karte mit einem massenspektrometrischen System aufgenommen wird, das einen TIMS-Separator mit zusätzlichem Speicherbereich und einen Massenanalysator mit hinreichend hoher Spektrenaufnahmerate aufweist, wie z.B. ein OTOF-Massenanalysator. Der TIMS-Separator wird dafür vorzugsweise im Betriebsmodus mit gleichzeitiger Akkumulation und einer Separationsrate zwischen 10 und 100 Hz betrieben.
  • Ein weiterer Vorteil des TIMS-OTOF Systems gegenüber dem ATOF-Massenanalysator ist, dass die Aufnahme der Massenspektren im OTOF-Massenanalysator von der Ionisierung entkoppelt ist, d.h., dass die Ionisierung beispielsweise mit einer höheren Wiederholrate als die Spektrenaufnahme ausgeführt werden kann. Eine höhere Wiederholrate der Ionisierung ermöglicht es, dass die Gewebeprobe in der Zeit, die für Analyse des Probenortes vorgesehen ist, vollständig aufgebraucht wird und insbesondere für die MALDI Ionisierung optimale Laserpulsenergien verwendet werden können. Daraus ergeben sich mehr Ionen und bessere Signal-zu-Rausch Verhältnisse insbesondere für Substanzen geringer Konzentration.
  • Das massenspekrometrische System kann zusätzlich zwischen dem TIMS-Separator und dem Massenanalysator einen Massenfilter und eine Fragmentierungszelle aufweisen, sodass ausgewählte Ionenspezies mittels Tandem-Massenspektrometrie untersucht werden können. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht darin, die nach Mobilität separierten Ionen zu fragmentieren und die Fragmentionen mittels daten-unabhängiger Analyse (DIA=data independent analysis) zu analysieren, woraus sich eine dreidimensionale Elternmassen-Fragmentmassen Massen/Mobilitäts-Karte an jedem Probenort ergibt, die für eine Berechnung der Gewebezustände verwendet wird.
  • Figurenliste
    • Die zeigt eine schematische Darstellung eines bevorzugten massenspektrometrischen Systems (100) zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, das eine MALDI-Ionenquelle (101), einen TIMS-Separator (102) und einen OTOF-Massenanalysator (103) aufweist.
    • Die zeigt mehr Details der MALDI-Ionenquelle (101) und des TIMS-Separators (102).
    • Die und zeigen ein Flussdiagramm eines ersten erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Verfahrensschritten (201) bis (206).
    • Die zeigt ein schematisches Flussdiagramm eines zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Verfahrensschritten (301) bis (307).
    • Die zeigt ein schematisches Flussdiagramm eines dritten erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Verfahrensschritten (401) bis (408).
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Obwohl die vorliegende Erfindung in verschiedenen Ausführungsformen beschrieben wird, kann eine Kombination von Merkmalen und Änderungen in Form und Detail vorgenommen werden, ohne von dem durch die beigefügten Ansprüche definierten Umfang der Erfindung abzuweichen. Zum besseren Verständnis der Erfindung wird auf die folgenden Abbildungen verwiesen. Die Elemente in den Abbildungen sind nicht unbedingt maßstabsgetreu dargestellt, sondern sollen in erster Linie die Prinzipien der Erfindung (größtenteils schematisch) veranschaulichen.
  • Die zeigt eine schematische Darstellung eines bevorzugten massenspektrometrischen Systems (100) zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, das eine MALDI-Ionenquelle (101), einen TIMS-Separator (102) und einen OTOF-Massenanalysator (103) aufweist.
  • Die zeigt in einem Ausführungsbeispiel mehr Details der MALDI-Ionenquelle (101) und des TIMS-Separators (102).
  • Die MALDI-Ionenquelle (101) und der TIMS-Separator (102) befinden sich in der Vakuumkammer (1a), die auf einem Druck von 200 Pa gehalten wird. Gas wird über eine Kapillare (3a) in die Vakuumkammer (1a) eingeführt und am Ausgang des TIMS-Separators (102) über die benachbarte Vakuumkammer (1b) am Pumpenanschluss (3b) und am Ausgang (3c) ab gepumpt.
  • Die MALDI-Ionenquelle (101) weist einen x-y Verschiebetisch (4a), einen Probenträger (4b), eine präparierte Gewebeprobe (4c) und ein Lasersystem (4e) auf. Das Lasersystem (4e) fokussiert einen Laserpuls auf die präparierte Gewebeprobe (4c) und erzeugt Ionen (4d) aus einem 10 Mikrometer großen Fleck auf der präparierten Gewebeprobe (4c). Die Probenorte der präparierten Gewebeprobe (4c) werden durch den x-y-Verschiebetisch (4a) nacheinander in den Fokus des Lasersystems (4e) bewegt (Rasterverfahren).
  • Der TIMS-Separator (102) weist einen Hochfrequenz-Ionentrichter (5a), einen Speicherbereich (5c) und einen Separationsbereich (5d) auf.
  • Der Hochfrequenz-Ionentrichter (5a) ist ein quadrupolarer Hochfrequenz-Ionentrichter und ist aus einem Stapel von segmentierten, mit Öffnungen versehenen Elektroden aufgebaut. Jede Elektrode besteht aus vier Segmenten. Die Öffnungen der Elektroden verjüngen sich zu kleineren Durchmessern und bilden so ein Innenvolumen in Form eines Trichters. Die beiden Phasen einer Hochfrequenzspannung werden abwechselnd an benachbarte Segmente jeder einzelnen Elektrode und an benachbarte Segmente benachbarter Elektroden angelegt. Das Hochfrequenzfeld erzeugt ein Pseudopotential, das die in der MALDI-Ionenquelle (101) erzeugten Ionen (4d) auffängt und von der Innenwand des Hochfrequenz-Trichters fernhält. Das Hochfrequenzfeld des quadrupolaren Hochfrequenz-Ionentrichters (5a) ermöglicht einen stetigen Übergang zum Hochfrequenzfeld des Speicherbereiches (5c).
  • Die Ionen werden durch den Gasstrom (5b) in den Speicherbereich (5c) des TIMS-Separators (102) getrieben. Der Gasstrom (5b) wird durch Abpumpen von Gas aus der Vakuumkammer (1a) erzeugt und hat eine Geschwindigkeit von etwa 100 m/s.
  • Der Speicherbereich (5c) als auch der Separationsbereich (5d) sind als segmentierte lineare Hochfrequenz-Quadrupole aufgebaut. Der TIMS-Separator wird im Betriebsmodus mit paralleler Akkumulation betrieben, d.h., dass der TIMS-Separator (102) Ionen im Speicherbereich (5c) akkumuliert, während vorher akkumulierte Ionen im Separationsbereich (5d) zeitlich parallel analysiert werden. Der Gasstrom (5b) treibt Ionen, die aus dem Hochfrequenz-Trichter (5a) austreten, gegen eine Rampe einer entgegenwirkenden elektrischen Feldbarriere des Speicherbereichs (5c), so dass die Ionen axial an Stellen entsprechend ihrer Mobilität entlang der Rampe gespeichert werden. Während der Akkumulation von Ionen im Speicherbereich (5c) treibt der Gasstrom (5b) auch Ionen, die in einer vorherigen Akkumulation angesammelt und in den Separationsbereich (5d) übertragen worden sind, gegen eine Rampe einer entgegenwirkenden elektrischen Feldbarriere des Separationsbereiches (5d), so dass die Ionen axial eingefangen und entsprechend ihrer Mobilität räumlich getrennt werden. Nach dem Beladen des Separationsbereichs (5d) mit zu analysierenden Ionen wird die Höhe der gegenwirkenden elektrischen Feldbarriere stetig verringert, so dass Ionenarten in der Reihenfolge ihrer Mobilität aus dem Separationsbereich (5d) freigesetzt werden.
  • Der Separationsvorgang dauert beispielsweise 50 Millisekunden, in denen der OTOF-Massenanalysator bei einer Spektrenaufnahmerate von 10 kHz eine Massen/Mobilitäts-Karte aufnimmt, die aus 500 Massenspektren besteht.
  • Die und zeigen ein Flussdiagramm eines ersten erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Ausführungsbeispiel mit den Verfahrensschritten (201) bis (206).
  • Im Verfahrensschritt 201 wird ein zu untersuchender Gewebeschnitt (4) auf einem Probenträger (4b) aufgebracht, der eine elektrisch leitfähige Oberfläche aufweist. Dafür wird zuerst das Gewebe durch Gefrieren stabilisiert und mit einem Mikrotom in mehrere etwa zehn Mikrometer dicke Gewebeschnitte geschnitten (nicht dargestellt).
  • Im Verfahrensschritt (202) wird mit einem Piezosprayer (6) eine Matrixschicht auf den Gewebeschnitt (4) aufgebracht und ein präparierter Gewebeschnitt (4c) erzeugt. Die dafür bevorzugt zu verwendenden Vorrichtungen und Verfahren können beispielsweise den Patentschriften DE 10 2006 019 530 B4 und DE 10 2006 059 695 B3 entnommen werden.
  • Im Verfahrensschritt (203) wird der präparierte Gewebeschnitt (4c) mit Laserpulsen eines fokussierten Laserstrahls in x- und y-Richtung abgerastert. Um von einem Probenort zum nächsten zu gelangen, wird der Probenträger (4b) mit einer nicht dargestellten Bewegungsvorrichtung entlang der x- und y-Achse verschoben. Jeder Probenort (xi,yi) wird dabei etwa einige hundertmal bestrahlt. Die in den einzelnen MALDI-Prozessen erzeugten Ionen (4d) werden im Speicherbereich eines TIMS-Separators zwischengespeichert und danach zeitlich nach Mobilität separiert. Die zeitlich separierten Ionen werden in einem OTOF-Massenanalysator analysiert, so dass jedem Probenort (xi,yi) eine ortsaufgelöste Massen/Mobilitäts-Karte MK(xi,yi) zugeordnet ist.
  • Im Verfahrensschritt (204) werden für jede Massen/Mobilitäts-Karte MK(xi,yi) jeweils die Signalhöhen an den kennzeichnenden Signalstellen (S1) bis (S5) ermittelt. Die kennzeichnende Signalstelle (S1) ist dabei durch die zusätzliche Mobilitätsseparation von einer nichtkennzeichnenden Signalstelle (nS) getrennt. Ohne Verwendung einer zweidimensionalen Massen/Mobilitäts-Karte wären die Signale an der kennzeichnenden Signalstelle (S1) und an der nicht kennzeichnenden Stelle (nS) weniger oder gar nicht zu unterscheiden und die Güte der Klassifizierung würde geringer sein.
  • Im Verfahrenschritt (205) wird durch einen mathematisch-statistischen Klassifizierungsalgorithmus (MSBV) aus den an den Signalstellen (S1)-(S5) ermittelten Signalhöhen (I1)-(15) der Gewebezustand GZ(xi,yi) am Probenort (xi,yi) berechnet.
  • Im Verfahrenschritt (206) wird die räumliche Verteilung der an den Probenorten (xi,yi) berechneten Gewebezustände GZ(xi,yi) als Gewebezustandsbild (GZB) graphisch dargestellt, wobei drei Gewebezustände (GZ1), (GZ2) und (GZ3) im Gewebezustandsbild vorhanden sind. Im Vergleich dazu ist ein lichtoptisches Bild derselben Gewebeprobe dargestellt, das nach der Entfernung der Matrixschicht und Anfärbung aufgenommen ist.
  • Die zeigt ein schematisches Flussdiagramm eines zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Ausführungsbeispiel mit den Verfahrensschritten (301) bis (307). Im Verfahrensschritt (301) wird eine MALDI Gewebeprobe präpariert. Im Verfahrensschritt (302) werden Massen/Mobilitäts-Karten an Probenorten der Gewebeprobe aufgenommen. Im Verfahrensschritt (303) werden die Signalhöhen an kennzeichnenden Signalstellen in den Massen/Mobilitäts-Karten ermittelt und im Verfahrensschritt (304) zur Berechnung der Gewebezustände verwendet. Nach der Aufnahme der Massen/Mobilitäts-Karten im Verfahrensschritt (302) wird im Verfahrensschritt (306) die Matrix von der präparierten Gewebeprobe entfernt und die Gewebeprobe einer H&E-Färbung unterzogen. Im Verfahrensschritt (307) wird ein lichtoptisches Bild der angefärbten Gewebeprobe aufgenommen. In dem abschließenden Verfahrensschritt (305) wird die räumliche Verteilung der im Verfahrensschritt (304) berechneten Gewebezustände im lichtoptischen Bild graphisch dargestellt.
  • Die zeigt ein schematisches Flussdiagramm eines dritten erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Ausführungsbeispiel mit den Verfahrensschritten (401) bis (408). Im Verfahrensschritt (401) wird eine erste Gewebeprobe einer H&E-Färbung unterzogen. Im Verfahrensschritt (402) wird ein lichtoptisches Bild der gefärbten Gewebeprobe aufgenommen. Im Verfahrensschritt (403) wird das lichtoptische Bild graphisch dargestellt und Probenorten in dem optischen Bild ausgewählt. Parallel zur Aufnahme des lichtoptischen Bildes wird im Verfahrensschritt (404) eine zweite gleichartige Gewebeprobe aus einer benachbarten Entnahmestelle als MALDI Gewebeprobe präpariert. Nach der Auswahl von Probenorten im Verfahrensschritt (403) werden im Verfahrensschritt (405) an den ausgewählten Probenorten Massen/Mobilitäts-Karten aufgenommen. Im Verfahrensschritt (406) werden die Signalhöhen an kennzeichnenden Signalstellen in den Massen/Mobilitäts-Karten der ausgewählten Probenorte ermittelt und im Verfahrensschritt (407) zur Berechnung der Gewebezustände an den ausgewählten Probenorten verwendet. In dem abschließenden Verfahrensschritt (408) wird die räumliche Verteilung der im Verfahrensschritt (407) berechneten Gewebezustände im lichtoptischen Bild graphisch dargestellt.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • DE 102006019530 B4 [0008, 0048]
    • DE 102006059695 B3 [0008, 0048]
    • US 5808300 A [0008]
    • DE 102004037512 B4 [0009]
    • WO 2016/142696 A1 [0011]
    • US 6630662 [0027]
    • US 7838826 [0027]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Luxembourg et al., Analytical Chemistry, 76(18), 2004, 5339 - 5344: „High-Spatial Resolution Mass Spectrometric Imaging of Peptide and Protein Distributions on a Surface“ [0008]

Claims (14)

  1. Verfahren für die Bestimmung und Visualisierung der räumlichen Verteilung von Gewebezuständen einer Gewebeprobe, dadurch gekennzeichnet, dass - an einer Vielzahl von Probenorten der Gewebeprobe jeweils eine Massen/Mobilitäts-Karte aufgenommen wird; - an jedem Probenort die Signalhöhen an kennzeichnenden Signalstellen in der zugehörigen Massen/Mobilitäts-Karte ermittelt werden und daraus mittels eines mathematisch-statistischen Klassifizierungsalgorithmus ein Gewebezustand für den jeweiligen Probenort berechnet wird; und - die räumliche Verteilung der für die Probenorte berechneten Gewebezustände graphisch dargestellt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeprobe ein Formalinfixierter Paraffin-eingebetteter (FFPE) Gewebeschnitt nach einer Renaturierung, ein frischer gefrorener Gewebeschnitt, ein Abdruck eines Gewebeschnittes oder einer der Probenbereiche auf einem Tissue Microarray (TMA) nach einer Renaturierung ist.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Signale an den Signalstellen von mindestens zwei chemisch unterscheidbaren Substanzen, insbesondere von zwei isomerischen Substanzen mit gleicher Summenformel, stammen.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass verschiedene Substanzklassen in den Massen/Mobilitäts-Karten zumindest teilweise aufgetrennt werden und dass die mindestens zwei chemisch unterscheidbaren Substanzen aus einer Substanzklasse stammen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzklassen Peptide, Glykane und/oder Lipide sind.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide zumindest teilweise durch einen enzymatischen Verdau der Proteine der Gewebeprobe erzeugt werden.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Glykane zumindest teilweise durch eine Deglykolisierung von Glykoproteinen der Gewebeprobe erzeugt werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass - an einer Vielzahl von Probenorten einer Gewebeprobe jeweils eine Massen/Mobilitäts-Karte aufgenommen wird, wobei der Gewebezustand zumindest für einen Teil der Probenorte der Gewebeprobe und damit der zugehörigen Massen/Mobilitäts-Karte bekannt ist, - die Signalhöhen an einer ersten Signalstelle in den Massen/Mobilitäts-Karten mit bekanntem Gewebezustand ermittelt und dem jeweils bekannten Gewebezustand zugeordnet werden, wobei die erste Signalstelle eine der kennzeichnenden Signalstellen wird, wenn die Gewebezustände über die Verteilung der Signalhöhen an der ersten Signalstelle hinreichend unterscheidbar sind (univariante statistische Analyse); und - die univariante-statistische Analyse an einer Vielzahl von weiteren Signalstellen durchgeführt wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass - der Gewebezustand zumindest für einen Teil der Probenorte der zu untersuchenden Gewebeprobe und damit der zugehörigen Massen/Mobilitäts-Karte bekannt ist; - die Signalhöhen ermittelt und an einer ersten Signalstelle in den Massen/Mobilitäts-Karten mit bekanntem Gewebezustand und dem jeweils bekannten Gewebezustand zugeordnet werden, wobei die erste Signalstelle eine der kennzeichnenden Signalstellen wird, wenn die Gewebezustände über die Verteilung der Signalhöhen an der ersten Signalstelle hinreichend unterscheidbar sind (univariante statistische Analyse); und - die univariante-statistische Analyse an einer Vielzahl von weiteren Signalstellen durchgeführt wird.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass in der univarianten-statistischen Analyse für jede untersuchte Signalstelle eine Grenzwertoptimierungskurve (Receiver-Operating-Characteristic-Kurve, ROC-Kurve) erstellt wird und dass eine untersuchte Signalstelle eine der kennzeichnenden Signalstellen wird, wenn die Fläche unter der Grenzwertoptimierungskurve größer als ein vorgegebener Grenzwert ist.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Massen/Mobilitäts-Karten an den Probenorten mit einem massenspektrometrischen System aufgenommen werden, das einen Speicherionen-Mobilitätsseparator (TIMS-Separator) und einen Massenanalysator umfasst.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der TIMS-Separator einen zusätzlichen Speicherbereich umfasst, der von dem Separationsbereich räumlich getrennt ist und diesem vorgeschaltet ist, und in einem Betriebsmodus mit gleichzeitiger Akkumulation betrieben wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass Ionen eines Probenortes in dem zusätzlichen Speicherbereich akkumuliert werden, während eine Massen/Mobilitäts-Karte vorher akkumulierter Ionen eines anderen Probenortes aufgenommen wird.
  14. Verfahren für die Bestimmung und Visualisierung der räumlichen Verteilung von Gewebezuständen einer Gewebeprobe, dadurch gekennzeichnet, dass - eine Vielzahl von Massen/Mobilitäts-Karten in eine elektronische Datenverarbeitungsanlage geladen werden, wobei jede Massen/Mobilitäts-Karte einem Probenort der Gewebeprobe zugeordnet ist; - für jede Massen/Mobilitäts-Karte die Signalhöhen an kennzeichnenden Signalstellen ermittelt werden und daraus mittels eines mathematisch-statistischen Klassifizierungsalgorithmus ein Gewebezustand für den zugeordneten Probenort berechnet wird; und - die räumliche Verteilung der für die Probenorte berechneten Gewebezustände graphisch dargestellt wird.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102019114829A1 (de) * 2019-06-03 2020-12-03 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektrometrische Bestimmung von Gewebezuständen
DE102020111240B3 (de) * 2020-04-24 2021-10-28 Bruker Daltonics GmbH & Co. KG Prozessieren von ortsaufgelösten, Ionen-spektrometrischen Messsignaldaten zur Ermittlung von Molekül-Gehaltsmaßzahlen in flächigen Proben
JP2024515586A (ja) * 2021-04-07 2024-04-10 バンダービルト・ユニバーシティ 低分解能タンデム質量分析を用いた生物学的同定

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5808300A (en) 1996-05-10 1998-09-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for imaging biological samples with MALDI MS
US6630662B1 (en) 2002-04-24 2003-10-07 Mds Inc. Setup for mobility separation of ions implementing an ion guide with an axial field and counterflow of gas
DE102004037512B4 (de) 2004-08-03 2012-11-08 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektrometrische Gewebezustandsdifferenzierung
DE102006019530B4 (de) 2006-04-27 2008-01-31 Bruker Daltonik Gmbh Probenvorbereitung für massenspektrometrische Dünnschnittbilder
DE102006059695B3 (de) 2006-12-18 2008-07-10 Bruker Daltonik Gmbh Präparation einer Matrixschicht für die Massenspektrometrie
EP2128815B1 (de) * 2008-05-07 2011-10-12 PerkinElmer Cellular Technologies Germany GmbH Verfahren zur Analyse der Wirkung einer Testsubstanz auf biologische und/ oder biochemische Proben
US7838826B1 (en) 2008-08-07 2010-11-23 Bruker Daltonics, Inc. Apparatus and method for parallel flow ion mobility spectrometry combined with mass spectrometry
DE102014224916B4 (de) * 2014-12-04 2024-01-18 Bruker Daltonics GmbH & Co. KG Verfahren zur rechnergestützten Analyse eines oder mehrerer Gewebeschnitte des menschlichen oder tierischen Körpers
US9304106B1 (en) * 2015-02-05 2016-04-05 Bruker Daltonik Gmbh High duty cycle trapping ion mobility spectrometer
EP3726562B1 (de) 2015-03-06 2023-12-20 Micromass UK Limited Bildgebungsplattform für umgebungsionisierungsmassenspektrometrie für direkte abbildung aus gesamtgewebe
US11289320B2 (en) * 2015-03-06 2022-03-29 Micromass Uk Limited Tissue analysis by mass spectrometry or ion mobility spectrometry
DE102015106418B3 (de) * 2015-04-27 2016-08-11 Bruker Daltonik Gmbh Messung des elektrischen Stromverlaufs von Partikelschwärmen in Gasen und im Vakuum
US10458944B2 (en) * 2016-06-03 2019-10-29 Bruker Daltonik Gmbh Trapped ion mobility spectrometer with high ion storage capacity
GB2568354B (en) * 2017-09-28 2022-08-10 Bruker Daltonics Gmbh & Co Kg Wide-range high mass resolution in reflector time-of-flight mass spectrometers
DE102017129891B4 (de) * 2017-12-14 2024-05-02 Bruker Daltonics GmbH & Co. KG Massenspektrometrische Bestimmung besonderer Gewebezustände
DE102019109771B4 (de) * 2019-04-12 2022-06-30 Bruker Daltonics GmbH & Co. KG Auswertung komplexer Massenspektrometrie-Daten von biologischen Proben
GB2587249B (en) * 2019-04-15 2023-11-08 Bruker Daltonics Gmbh & Co Kg A method for controlling the mass filter in a hybrid IMS/MS system
DE102019114829A1 (de) * 2019-06-03 2020-12-03 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektrometrische Bestimmung von Gewebezuständen

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US20220277941A1 (en) 2022-09-01
GB202007663D0 (en) 2020-07-08
US11705316B2 (en) 2023-07-18
GB2621256B (en) 2024-06-05
US11367600B2 (en) 2022-06-21
GB2621256A (en) 2024-02-07
GB2587839A (en) 2021-04-14
CN112034030A (zh) 2020-12-04

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