DE112013006178B4

DE112013006178B4 - Verfahren zur Ionenherstellung

Info

Publication number: DE112013006178B4
Application number: DE112013006178.3T
Authority: DE
Inventors: Rainer Karl Cramer
Original assignee: Micromass UK Ltd
Current assignee: Micromass UK Ltd
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2019-08-29
Anticipated expiration: 2033-12-21
Also published as: US20150325422A1; GB201223131D0; GB2523708A; DE112013006178T5; GB201511810D0; GB2523708B; WO2014096847A1; GB2509118A; US9552972B2

Abstract

Verfahren zur Herstellung mehrfach geladener Ionen mit folgenden Schritten;
i) Bereitstellen einer Matrixkomposition mit einem Matrixmaterial und einer nichtflüchtigen Komponente,
ii) Bereitstellen eines Analyten,
iii) Ablagerung der Matrixkomposition und des Analyten auf einer Oberfläche derart, dass diese in engem Kontakt stehen,
iv) Ablatieren der Matrixkomposition und des Analyten, die bzw. der auf der Oberfläche abgelagert ist, mit einem Laser, um mehrfach geladene Analytenionen zu desorbieren, und
v) Leiten der desorbierten, mehrfach geladenen Ionen durch eine beheizte Leitung, worin in Schritt iv), die Matrixkomposition und der Analyt in der Flüssigphase ablatiert werden, und wobei der Laser ein gepulster Laser ist, wobei die Energie pro Puls circa 1-10 µJ beträgt und die Fluenz zwischen 200-2000 J/m² ist.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Ionenherstellung. Die so erzeugten Ionen können auf dem Gebiet der Massenspektrometrie verwendet werden.
In der biologischen Massenspektrometrie (MS), werden vorwiegend zwei Ionisationstechniken zur Analyse von Analyten, die längere Biomoleküle sind, wie beispielsweise Polypeptide, angewandt. Hierbei handelt es sich um Nanoelektronenspray-Ionisation (nanoESI) und matrixunterstütze Laser-Desorption/Ionisation (MALDI). Bei MALDI wird ein Laser zur Ablation eines Matrix/Analyt-Materials und zur Freisetzung der Ionen in die Gasphase genutzt Diese Ionen werden dann in einen Massenanalysator/Spektrometer geleitet. Beide Techniken werden als „weiche“ Techniken angesehen, die die Desorption und Ionisierung intakter molekularer Analytspezies erlauben und somit ihre erfolgreiche massenspektrometrische Analyse. Einer der Hauptunterschiede zwischen diesen Ionisationstechniken liegt in ihrer Möglichkeit zur Herstellung mehrfach geladener Ionen. MALDI generiert typischerweise einfach geladene Ionen, wenn Peptidanalyte verwendet werden, während nanoESI leicht mehrfach geladene Ionen, sogar für Peptide mit Massen so gering wie 1.000 Da (1,66054·10^-24kg), bereitstellt. Die Herstellung von hochgeladenen Ionen ist wünschenswert, da dies die Nutzung von Massenanalysatoren wie beispielsweise Ionenfallen (einschließlich „Orbitraps“) und Hybridquadrupol-Instrumenten, welche typischerweise nur einen limitierten m/Z Bereich bieten (<2000-4000), ermöglicht. Das ermöglicht auch informativere Fragmentierungsspektren unter Verwendung von Techniken, wie zum Beispiel der stoßinduzierten Dissoziation (CID) und der Elektronen-Eintragung/Transfer-Dissoziation in Kombination mit Tandem MS (MS/MS). Die MALDI-Technik kann vorzuziehen sein, da diese eine höhere Toleranz bezüglich Verunreinigungen und Additiven, eine leichtere Handhabung, ein Potential für eine schnelle und automatisierte Probenvorbereitung, und die Fähigkeit der Analyse sowie der MS Bildgebung aufweist. Deshalb stellt MALDI eine Ionisationstechnik dar, die bioanalytische Gebiete abdecken kann, wo ESI weniger geeignet ist Eine MALDI-Technik, die mehrfach geladene Ionen herstellen kann, ist daher wünschenswert.
Frühere MALDI-Verfahren, die einen Laser auf flüssige Matrix/Analyt-Systeme angewandt haben, sind in „Liquid ultra-violet matrix-assisted laser desorption/ionization - mass spectrometry for automated proteomic analysis, R. Cramer und S. Corless Proteomics 2005, 5, 360-370“ und in „Employing target modifications for the investigation of liquid matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, R. Cramer und A.L. Burlingame, Rapid Commun. Mass Spectrom. 14, 53-60 (2000)“ beschrieben. Keines dieser Verfahren erzeugte die gewünschte Mengen an mehrfach geladenen Ionen.
Die WO 2012 / 031 082 A2 beschreibt ein System und Verfahren zur Ionisation von Molekülen für die Massenspektrometrie und Ionenmobilitätsspektroskopie, wobei ein Ionisationssystem einen Kanal mit einem in einem ersten Druckbereich angeordneten Einlass und einem in einem zweiten Druckbereich angeordneten Auslass umfasst. Eine Heizung ist mit dem Kanal gekoppelt und eingerichtet, den Kanal zu erwärmen. Ein Analyt wird in den Kanal eingeführt, wobei der Analyt in dem Kanal ionisiert wird.
Die WO 2010 / 141 763 A1 offenbart Systeme und Verfahren für die Massenspektrometrie mittels Laserspray-Ionisation (LSI). Mittels LSI können bei Atmosphärendruck mehrfach geladene Ionen für die Analyse erzeugt werden wodurch die Analyse von Molekülen mit hohem Molekulargewicht (z-B. 4.000 Da, (6,64216·10^-24kg)) ermöglicht. Die Analyse kann lösungsmittelbasiert oder lösungsmittelfrei sein. Die lösungsmittelfreie Analyse ermöglicht eine verbesserte räumliche Auflösung, die für die Oberflächen- und/oder Gewebeabbildung von Vorteil ist.
Zusammenfassung der Erfindung:
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung mehrfach geladener Ionen bereit, welches die folgenden Schritte aufweist:

i) Bereitstellen einer Matrixkomposition mit einem Matrixmaterial und einer nichtflüchtigen Komponente,
ii) Bereitstellen eines Analyten,
iii) Ablagerung der Matrixkomposition und des Analyten auf einer Oberfläche derart, dass diese in engem Kontakt stehen,
iv) Ablatieren der Matrixkomposition und des Analyten, die bzw. der auf der Oberfläche abgelagert sind, mit einem Laser, um mehrfach geladene Analytenionen zu desorbieren, und
v) Leiten der desorbierten, mehrfach geladenen Ionen durch eine beheizte Leitung,

²

Das Matrixmaterial umfasst Moleküle, welchen es möglich ist Ladung zu transferieren oder Ladung von dem Analyten zu empfangen. Vorzugsweise umfasst das Matrixmaterial Moleküle, die einen Chromophor besitzen, der stark in den UV oder IR Bereichen des Spektrums absorbiert. Viele Matrixmaterialien sind aus dem Stand der Technik bekannt und beispielsweise in den Paragraphen [0133] bis [0154] von WO2012/058248 A2 angegeben und insbesondere unter Paragraph [0137] des Dokuments dargelegt, von denen alle für das hier dargestellte Verfahren genutzt werden können und die hiermit durch Bezugnahme auf selbige zum Bestandteil dieser Offenbarung werden.
Die nichtflüchtige Komponente ist unter Raumbedingungen an der Oberfläche, auf der sie abgelagert wird, eine Flüssigkeit (das heißt, wenn der Laser nicht auf die Komposition und den Analyten aufgebracht wird). Der Dampfdruck der nichtflüchtigen Komponente ist, bei diesen Bedingungen, niedrig genug, dass diese nicht über die Dauer von mehreren Laserbeschüssen bzw. Laserschüssen, zum Beispiel über mindestens eine Minute, verdampft. Das Verfahren kann bei etwa atmosphärischen Bedingungen durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist die Oberfläche, auf welcher die Matrixkomposition und der Analyt abgelagert sind, eine Probenplatte eines Massenspektrometers. In dieser Ausgestaltung sind die Bedingungen, unter denen die nichtflüchtige Komponente als Flüssigkeit verbleiben muss, diejenigen im Inneren der Ionenquelle eines Massenspektrometers. Diese können entweder unterhalb der Raumtemperatur abgekühlt, Raumtemperatur oder bis zu der Temperatur einer beheizten Ionenleitung, die neben der Probenplatte angeordnet ist (siehe 1), sein. In einigen Ausgestaltungen kann diese Temperatur bis zu 400 °C betragen. Das Massenspektrometer kann bei atmosphärischem Druck, mittlerem Vakuum, Hochvakuum oder Ultrahochvakuum, beispielsweise 10^-9 Torr, betrieben werden. In Ausgestaltungen, wo diese Drücke vorherrschen, muss die nichtflüchtige Komponente immer noch flüssig bleiben. Man kann eine passende nichtflüchtige Komponente gemäß erwarteter Temperatur und erwartetem Druck in der Umgebung der Ablagerungsoberfläche wählen.
Die Tatsache, dass die nichtflüchtige Komponente in der flüssigen Form auf der Oberfläche verbleibt, bedeutet, dass der Laser eher an einer flüssigen Matrix- und Analytkomposition als an einer festen Matrix- und Analytkomposition angewandt wird. Dies unterscheidet das Verfahren von den meisten typischen MALDI-Verfahren, die eine feste Matrix- und Analytkomposition einer Laserablation unterziehen. Der Analyt ist der Teil, der derart ionisiert werden muss, dass er mehrfach geladen ist. Viele Arten von Molekülen können mit diesem vorliegenden Verfahren geladen werden. Das Verfahren ist jedoch am zweckdienlichsten zur Bereitstellung mehrfach geladener Ionen von großen Biomolekülen, beispielsweise von Polypeptiden. Die Oberfläche und beheizte Leitung können Teile des Massenspektrometers/Analysators bilden.
Überraschenderweise resultiert der Durchgang der Ionen (freigesetzt von der Matrixkomposition und dem Analyt bei Ablation) durch die beheizte Leitung in einer erhöhten Anzahl von mehrfach geladenen Analytionen, die die Vorrichtung verlassen, als wenn die beheizte Leitung nicht vorhanden wäre. Somit stehen eine größere Anzahl mehrfach geladener Ionen zur Analyse zur Verfügung. Der Mechanismus der Wirkung der beheizten Leitung auf die mehrfach geladenen Ionen, die durch diese hindurch wandern, ist noch nicht bekannt.
Das vorliegende Verfahren stellt eine gute Reproduzierbarkeit bereit und verlängerte die Ionenausbeute über mehrere Laserbeschüsse. Nur eine kleine Laserfluenz ist in dem vorliegenden Verfahren notwendig. Dies hat den Vorteil eines geringen Stromverbrauchs und einer geringen Ablationsrate. Die geringe Ablationsrate hat Vorteile gegenüber Hochfluenzprozessen, wie zum Beispiel der Laserspray-Ionisation (LSI), beispielsweise wird eine Minimierung des Analytverbrauchs erreicht. Dies ist ein klarer Vorteil bei der Handhabung biologischer Substanzen mit sehr geringer Verfügbarkeit. Die Tatsache, dass der Analyt als eine Flüssigkeit hergestellt wird, und der Gegenstand der Ablation auch flüssig ist, ermöglicht Flexibilität bei dem Hinzufügen anderer Komponenten (Additive) zum Bereitstellen eines größeren Bereichs von verschiedenen Probenbedingungen, bzw. -umgebungen.
Die Analytkonzentration in der Matrixkomposition und dem auf der Oberfläche abgelagerten Analyten kann so gering wie 10^-12 M sein.
Die beheizte Leitung kann auf Temperaturen bis zu 400 °C gehalten werden und wird bevorzugt zwischen 200 °C und 250 °C gehalten. Die beheizte Leitung kann eine Röhre sein. Das Matrixmaterial der Matrixkomposition aus Schritt i) ist bevorzugt entweder 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) oder ein Zimtsäurederivat so wie α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA). Die Matrixkomposition aus Schritt i) kann weiter ein Lösungsmittel aufweisen. Das Lösungsmittel kann jegliche Flüssigkeit sein, welche geeignet für die Lösung des Analyten und des Matrixmaterials ist. Das Lösungsmittel kann eine 1:1 Mischung von 10-100 mM Ammoniumphosphatlösung (in Wasser) und Methanol sein. Das Lösungsmittel wird durch die Raumbedingungen bevorzugt an der Oberfläche, auf der es abgelagert ist bzw. wird, verdampft (sogar wenn der Laser nicht auf die Komposition angewandt wird). Das Lösungsmittel verdampft vorzugsweise in ungefähr 15-30 Minuten. Das Lösungsmittel kann eine 1:1 Mischung von 20 mM Ammoniumphosphat (in Wasser) und Methanol aufweisen.
Der Analyt kann ein Peptid, Protein oder anderes Biomolekül oder organische Verbindung sein.
Die nichtflüchtige Komponente kann Glycerol, Triethylamin oder eine ionische Flüssigkeit sein. Die Glycerolkonzentration in der Matrixkomposition aus Schritt i) kann zwischen 15 vol.-% und 85 vol.-% liegen.
Die mehrfach geladenen Ionen, die die beheizte Leitung verlassen, können in einen Massenanalysator eingebracht werden, der vorzugsweise eine Ionenfalle oder einen Quadrupol aufweist. Die Analytkonzentration in der Matrixkomposition und dem auf der Oberfläche abgelagerten Analyten können so gering wie 10^-12 M sein, wobei der Laser ein gepulster Laser mit einer Wiederholungsrate von 10 Hz sein kann und Daten in einem Massenanalysator über mindestens 10 Minuten oder mehr akquiriert werden können. Der Laser kann eine UV- oder IR-Wellenlänge aufweisen.
Eine detaillierte Beschreibung der Erfindung folgt nun rein beispielhaft. Es wird Bezug genommen auf die Zeichnungen:

1 zeigt eine schematische Ansicht einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt ein UV-MALDI-Massenspektrum von MK-Bradykinin bei atmosphärischem Druck (Sequenz: MKRPPGFSPFR), dass a) den m/z Bereich 400 - 1600 und b) den m/z Bereich 1200 - 1600 darstellt. Die Matrix ist eine DHB-basierte flüssige Matrixkomposition, die ~20 % Glycerol vor der Verdampfung des flüchtigen Lösungsmittels enthält.
3 zeigt UV-MALDI-CID-MS/MS-Spektren bei atmosphärischem Druck von den a) doppelt und b) dreifach protonierten MK-Bradykininionen. Die Matrixkomposition ist eine DHB-basierte flüssige Matrix, die ~20 % Glycerol vor der Verdampfung des flüchtigen Lösungsmittels enthält. Die Stoßpotentiale waren jeweils 35 V beziehungsweise 20 V.
4a) zeigt ein totales Ionen-Chromatogramm (TIC) über eine 30 minütige Datenerfassung unter Verwendung einer flüssigen MALDI-Probe mit 500 fmol Melittin.
4b) zeigt ein UV-MALDI-Massenspektrum bei atmosphärischem Druck der Summe aller Scans der Datenerfassung gemäß 4a. Die Matrixkomposition war eine DHB-basierte flüssige Matrix, die ~20 % Glycerol vor der Verdampfung des flüchtigen Lösungsmittels enthält, und die Laserwiederholungsrate betrug 10 Hz.
5a) zeigt ein UV-MALDI-Massenspektrum bei atmosphärischem Druck von 5 pmol Schweineinsulin. Die Matrixkomposition war die DHB-basierte flüssige Matrix, die ~15 % Glycerol vor der Verdampfung des flüchtigen Lösungsmittels enthält.
5b) zeigt ein UV-MALDI-Massenspektrum bei atmosphärischem Druck von 5 pmol Pferderherz-Myoglobin. Die Matrixkomposition war die CHCA-basierte 1-1-10 flüssige Matrix, die ~30 % Glycerol vor der Verdampfung des flüchtigen Lösungsmittels enthält. Der pH-Wert lag über 7, wie mittels eines pH-Papierteststreifen bestimmt wurde. Die detektierten [M+8H]⁸⁺ und [M+9H]⁹⁺ Analytionen können der Apo-Form von Myoglobin zugeordnet werden. In beiden Spektren 5a) und 5b) sind auch verschiedene Polyethylenglykol-Kontaminationsionen sichtbar (womöglich wegen ungünstiger Lagerungsbedingungen der beiden Proben über zwei Jahre als vollständig verdünnte Analytlösungen in Plastikröhrchen).
6 zeigt UV-MALDI-Massenspektren von Melittin bei atmosphärischem Druck. Die Matrixkomposition war eine DHB-basierte (flüssige) Matrix mit der Zugabe von 0, 5 und 10 µL Glycerol zu 50 µL der Matrixstammlösung. Die MALDI-Proben wurden direkt auf der MALDI-Platte hergestellt, zunächst durch punktuelles Aufbringen bzw. Spotten von 0,5 µL der Analytlösung und anschließend 0,5 µL der Matrixlösung. Für die Probenherstellung ohne irgendwelches Glycerol wurden extensive DHB-Cluster detektiert
7 zeigt UV-MALDI-Massenspektren von Melittin bei atmosphärischem Druck. Die Matrixkomposition war die CHCA-basierte 1-1-10 flüssige Matrix mit der Zugabe von 5, 10, 20, 40 und 80 µL Glycerol zu 100 µL der Matrixstammlösung. Die MALDI-Proben wurden direkt auf der MALDI-Platte hergestellt, zunächst durch punktuelles Aufbringen von 0,5 µL der Analytlösung und anschließend 0,5 µL der Matrixlösung. Das Feld rechts unten zeigt die Signalintensitäten der maximalen Peakhöhe extrahiert aus allen 5 Spektren für M⁺, M²⁺ und M³⁺.
8a) zeigt ein extrahiertes Ionenchromatogramm (EIC) mit einem m/z Fenster von 712-715 über eine 30-minütige Akquirierung einer flüssigen MALDI-Probe mit 500 fmol Melittin (siehe 4). Die 8b) und 8c) sind UV-MALDI-Massenspektren bei atmosphärischem Druck, die die Scans der b) ersten Minute und c) letzten Minute der Akquirierung, wie in 8a) gezeigt, kombinieren. Die Matrixkomposition war die DHB-basierte flüssige Matrix, die ~20 % Glycerol vor der Verdampfung des flüchtigen Lösungsmittels enthält. Die Laserwiederholungsrate betrug 10 Hz und die Temperatur des Transferrohrs betrug 225 °C.
9 zeigt ein UV-MALDI-Massenspektrum von 50 fmol Melittin bei atmosphärischem Druck. Die Matrixkomposition war die DHB-basierte flüssige Matrix, die ~20 % Glycerol vor der Verdampfung des flüchtigen Lösungsmittels enthält.
10 zeigt UV-MALDI-Massenspektren von Melittin bei atmosphärischem Druck, die bei verschiedenen Temperauren der Transferröhre akquiriert werden. Die Matrixkomposition war die CHCA-basierte 1-3-5-10 flüssige Matrix.

Die in dieser Offenbarung beschriebenen flüssigen Matrixkompositionen basieren entweder auf 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) oder α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) mit der Zugabe von Glycerol und optional Triethylenamin in verschiedenen Konzentrationen.
Der erste Schritt in der Herstellung der MALDI-Matrixkompositionen ist die Zugabe von 20-100 mM Ammoniumphosphat/Methanol (1:1; v:v) zu der festen UV Matrixkomponente DHB oder CHCA in einem Verhältnis von 10:1 (v[µL]:w[mg]). Den DHB-basierte flüssigen Matrizen wird danach Glycerol zugegeben und die resultierende Mischung wird sorgfältig verwirbelt und dann für 5-10 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Der CHCA-basierten flüssigen Matrix 1-1-10 wird Triethylenamin zu einem Zehntel des Volumens des Ammoniumphosphat/Methanol-Lösungsmittels zugegeben und unter nachfolgender Zugabe verschiedener Volumina an Glycerol verwirbelt, während die CHCA-basierte 1-3-5-10 Matrix durch spezifische Zugabe von Triethylenamin unter Verwendung von 30 % des Volumens des Ammoniumphosphat/Methanol Lösungsmittels und einer weiteren Zugabe von Glycerol zu 50 vol.-% hergestellt wird. Nach jeder Zugabe wird die Mischung sorgfältig verwirbelt und dann für 5-10 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Peptide und Proteine werden in Wasser mit Konzentrationen von 10^-7 bis 10^-3 M aufgelöst. MALDI-Proben werden direkt auf die Zielplatte aus Edelstahl, durch zunächst punktuelles Aufbringen bzw. Spotten von 0,5-1,0 µL der Analytlösung und anschließend 0,5-1,0 µL der Matrixlösung abgelagert. Die Proben werden für 15-30 Minuten unter Raumbedingungen belassen, um die Verdampfung der flüchtigen Lösungsmittelkomponenten zu gestatten. Massenspektren wurden auf einem modifizierten Q-Star Pulsar i Messgerät (AB Sciex, Toronto, Canada) mit einer sonderangefertigten AP-MALDI-Quelle, die auf einem zuvor veröffentlichten Design basiert und in 1 gezeigt wird, akquiriert. Wenn nicht anders angegeben wurden die Massenspektren bei einer Transferrohrtemperatur von 225 °C durch Akkumulierung von ~60 Scans mit einer Scanzeit von 1 Sekunde aufgenommen.
1 zeigt die Ausgestaltung der Ionenquelle, die generell für alle UV-MALDI-MS-Messungen bei atmosphärischem Druck verwendet wird. Die Laser Vorrichtung (12) emittiert einen Lichtpuls einer Wellenlänge von 355 nm (4) von einer Dauer von 10 ns. Der Lichtpuls ist auf die Zielplatte gerichtet (5). Insbesondere ist das Licht auf die Matrixkomposition und den, in der Mitte der Platte disponierten, Analyten (6) gerichtet. Der Laser ablatiert die Komposition und den Analyten und produziert eine Dampffahne von mehrfach geladenen Ionen. Die Platte wird bei einer Spannung von ungefähr 1,5-3 kV gehalten. Das beheizte Transferrohr befindet sich bei einem Potential von rund 250-500 V. Die Potentialdifferenz zieht die Ionendampffahne in das beheizte Transferrohr hinein (1). Das Transferrohr ist mittels eines Heizdrahts (7), der um das Äußere des Rohrs gewickelt ist, beheizt. Die Ionen wandern durch das Rohr und durch das Diskriminator-Interface. Die Einfügung zeigt ein Diagramm des Partikel-Diskriminator-Interfaces (10). Das beheizte Transferrohr (1) hat einen Durchmesser von 2 mm und eine Länge von 40 mm. Es ist abgetrennt von der Standard-ESI-Blende bzw. Öffnungsplatte (3) (mit ihrer flussregulierenden Öffnung (die einen Durchmesser von 250 µm besitzt)) durch einen Keramik Abstandshalter (2), der einen Spalt zwischen dem Ionentransferrohr und der Öffnung von 1 mm Dicke und 4 mm Durchmesser herstellt. Durch einen O-Ring, der den Keramikabstandshalter umgibt, wird die Dichtung verbessert. Das Innere des Massenspektrometers/-analysators (8) wird bei einem Druck von ungefähr 10^-3 bar gehalten. Dies ist niedriger als der Umgebungsdruck. Sobald die Ionen durch das Diskriminator-Interface (10) und einen Skimmer (11) passiert sind, wird ihre Masse mit einem Quadrupol (9) und einer Flugröhre (nicht gezeigt) analysiert.
Der Laser und die verwendete Ionenquelle, die eine gemeinsam gemessene, maximale Laserenergie von circa 10 µJ auf dem Ziel besitzen, ermöglichen eine erreichbare maximale Fluenz von <2000 J/m². Im Vergleich zur Laserspray-Ionisation (LSI), eine kürzlich eingeführte Methode zur laserinduzierten Generierung von mehrfach geladenen Ionen, ist dieser Wert mehr als eine Größenordnung unter dem berichteten Bereich der LSI-Fluenz von 40-150 kJ/m². Ein großer Nachteil von diesen LSI-Strahlungsbedingungen ist die typischerweise schnelle Abreicherung der Probe. Unter Verwendung der vorliegenden Methode können dennoch mehrfach geladene Ionen, mit Laserenergien so gering wie ~1 µJ, die zu einer Fluenz von <200 J/m² führen, erhalten werden, welche in dem Bereich von typischen UV-MALDI-MS-Fluenzen und mehr als zwei Größenordnungen unter dem berichteten LSI-Fluenzbereich sind. Somit kann eine kontinuierliche Analytionensignaldetektion von zehntausenden konsekutiven Laserbeschüssen, mit dem Begleitumstand niedrigen Probenverbrauchs, erreicht werden.
Analyten in dem mittleren femtomol Bereich sind ausreichend um hauptsächlich mehrfach geladene anstatt einfach geladene Ionen mit einem stabilen Analytionenstrahl, für bis zu 36 000 Laserbeschüsse, herzustellen, das heißt für eine Stunde Akquirierung. Ionenladungszustände variierten abhängig von der exakten Natur der flüssigen MALDI-Matrixkomposition, und die Alkali-Kationisierung nahm mit dem Ladungszustand ab, während eine beträchtliche Matrixadduktionen-Formierung nur für einfach geladene Ionen beobachtet wurde.
2 zeigt ein flüssiges UV-MALDI-Massenspektrum unter atmosphärischem Druck von MK Bradykinin (Sequenz: MKRPPGFSPFR), welches einfach, zweifach und dreifach geladene Analytionen zeigt bzw. aufdeckt. Generell ist die Formierung von Adduktionen weit geringer für die mehrfach geladenen Ionen als für einfach geladene Ionen. Wie in 2 gezeigt, werden keine signifikante Adduktionen für das dreifach geladene MK-Bradykinin Ion detektiert, während signifikante Mengen des Analyt/Kation-Clusters mit Alkalimetallen und den Matrix-Chromophor-Komponenten für einfach geladene Ionenspezies detektiert werden. Die Abwesenheit von Adduktionen für mehrfach geladene Ionen ist eine wichtige Beobachtung, da flüssige MALDI-Proben typischerweise eine gute Quelle von Salzkationen sind und so generell eine Kation-Addukt-Formierung unterstützen.
Die Generierung von mehrfach geladenen Peptid Ionen erleichtert sehr ihre Fragmentierung und somit eine Sequenzierung. 3 zeigt die kollisionsinduzierte Dissoziation-(CID)-MS/MS-Fragmentspektren von MF-Bradykinin für die doppelt und dreifach geladenen Ionenspezies. Im Allgemeinen sind diese Fragmentationsspektren, die hauptsächlich Ionenserien des b- und y-Typs und andere assoziierte Fragmentionen, so wie Iminium Ionen, zeigen, ähnlich zu CID-MS/MS-Spektren von doppelt und dreifach geladenen Peptid Ionen, die durch andere weiche Ionisationstechniken generiert werden.
Obwohl die Bildung von mehrfach geladenen Ionen sehr bevorzugt ist, ist es möglich, eine signifikante Menge von einfach geladenen Ionen für Analyten mit geringerer Masse, ähnlich zu anderen Ionisationstechniken wie beispielsweise ESI, zu detektieren. Jedoch sollte betont werden, dass in all den vorliegenden Beispielen, die flüssige Matrixkompositionen in Verbindung mit dem beheizten Transferrohr nutzen, es eher leichter ist den Analyten anhand von mehrfach geladenen Ionenspezies, als einfach geladenen Ionenspezies zu detektieren. Dies geht auch aus den Ergebnissen von zwei Optimierungsexperimenten hervor. Das erste zeigt die optimale Transferrohrtemperatur zur Bereitstellung der höchsten Ausbeuten an mehrfach geladen Analytionen. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt Abgesehen von der Erkenntnis einer optimalen Temperatur von 200-250 °C für die 1-3-5-10 flüssige Matrix, geht aus den Daten auch hervor, dass die Bildung von einfach geladenen Ionen weit weniger durch die Temperatur beeinflusst ist als die Bildung von mehrfach geladenen Spezies. Dies geht auch aus dem zweiten Experiment hervor, welches die optimale Menge an Glycerol in der flüssigen Matrix zeigt. Die Ergebnisse sind in den 6 und 7 gezeigt. Hier verringert sich das Signal der einfach geladenen Ionenspezies tatsächlich, wenn sich die Ausbeuten der mehrfach geladen Ionen erhöhen. Für alle untersuchten flüssigen Matrixkompositionen war die Liquidität der Probe (die durch das Glycerol bereitgestellt wird) eine essentielle Komponente für die Formierung von mehrfach geladenen Ionen. Typischerweise scheint eine ausreichende Menge an Glycerol, die eine vollständig befeuchtete MALDI-Probe sicherstellt, am Besten zu funktionieren.
Das Ändern der Zusammensetzung der flüssigen Matrixkomposition scheint einen Effekt auf den detektierbaren Ladungszustand und ihre Verteilung zu haben. Für Melittin ermöglicht die 1-1-10 Matrixkomposition nur die Detektion von doppelt geladenen Ionenspezies, während ein Wechsel zu DHB-basierten flüssigen Matrixkompositionen die Detektion von dreifach und vierfach geladen Ionen, mit einem vernachlässigbaren Signal für doppelt geladene Spezies, erleichtert. Dies ist in den 6 und 7 gezeigt. Das Potential der DHB-basierten flüssigen Matrixkomposition höher geladene Zustände zu generieren, ist auch für MK-Bradykinin beobachtet worden.
Einer der Vorteile von flüssigen MALDI-Proben ist die relativ stabile Ionendurchflussmenge und Ortsbeständigkeit (der Matrixkomposition und des Analyten) während der Laserablation durch selbstheilende Eigenschaften des Fluids. 4 zeigt das flüssige MALDI-MS-Spektrum und das totale Ionen-Chromatogramm (TIC) von 1800 Scans (halbstündliche Akquirierung) von einer Melittin-Probe. Das extrahierte Ionen-Chromatogramm (EIC) für das [M+4H]⁴⁺ Melittin-Ion zeigt eine vergleichbar stabile Ionenausbeute, und Spektren, die nur aus den Scans der ersten Minute generiert sind, sind praktisch identisch zu der Kombination der Scans in der letzten Minute, siehe 8. In diesem Fall wurden 500 fmol an Melittin und eine Laserpulswiederholungsrate von 10 Hz angewandt, das heißt 18000 Beschüsse für die gesamte Akquirierung mit einem Durchschnittsanalytverbrauch von <30 amol pro Laserbeschuss. Die zufällige Entnahme einzelner Scans während der Akquirierung zeigt, dass jeder Scan (1 sec; 10 Laserbeschüsse) ein ausreichendes Analytsignal-zu-Rausch-Verhältnis zur eindeutigen Detektion der mehrfach geladenen Ionen besitzt.
So geringe Mengen wie 50 fmol von, auf einem Ziel aufgebrachten, Melittin wurden detektiert, siehe 9. Andere getestete Analyte waren Insulin und Myoglobin (siehe 5). Die beobachteten Ladungszustandsverteilungen von diesen drei Analyten scheinen sehr eng zu sein. Somit scheint bzw. scheinen die Generierung spezifischer Ladungszustände und deren Verteilungen aufgrund der Auswahl der Matrixkomposition flexibel und im Vergleich zu ESI unterschiedlich zu sein.

Claims

Verfahren zur Herstellung mehrfach geladener Ionen mit folgenden Schritten; i) Bereitstellen einer Matrixkomposition mit einem Matrixmaterial und einer nichtflüchtigen Komponente, ii) Bereitstellen eines Analyten, iii) Ablagerung der Matrixkomposition und des Analyten auf einer Oberfläche derart, dass diese in engem Kontakt stehen, iv) Ablatieren der Matrixkomposition und des Analyten, die bzw. der auf der Oberfläche abgelagert ist, mit einem Laser, um mehrfach geladene Analytenionen zu desorbieren, und v) Leiten der desorbierten, mehrfach geladenen Ionen durch eine beheizte Leitung, worin in Schritt iv), die Matrixkomposition und der Analyt in der Flüssigphase ablatiert werden, und wobei der Laser ein gepulster Laser ist, wobei die Energie pro Puls circa 1-10 µJ beträgt und die Fluenz zwischen 200-2000 J/m² ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die beheizte Leitung bei einer Temperatur von bis zu 400 °C gehalten wird und bevorzugt zwischen 200 °C und 250 °C gehalten wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die beheizte Leitung eine Röhre oder ein Rohr ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Matrixmaterial der Matrixkomposition aus Schritt i) entweder DHB oder CHCA oder ein anderes Zimtsäurederivat ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Matrixkomposition zusätzlich ein Lösungsmittel aufweist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Lösungsmittel eine 1:1 Mischung von 10-100 mM Ammoniumphosphatlösung (in Wasser) und Methanol aufweist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Analyt ein Peptid, ein Protein oder ein anderes Biomolekül oder organische Verbindung ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die nichtflüchtige Komponente Glycerol, Triethylenamin oder eine ionische Flüssigkeit ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Glycerolkonzentration in der Matrixkomposition zwischen 15 vol.-% und 85 vol.-% liegt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei aus der beheizten Leitung mehrfach geladene Ionen austreten und in einen Massenanalysator hineingeleitet werden, der vorzugsweise eine Ionenfalle oder einen Quadrupol aufweist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Analyt-Konzentration in der Matrixkomposition und dem Analyten, die bzw. der auf der Oberfläche abgelagert ist, größer als 10^-12 M ist, der Laser ein gepulster Laser mit einer Wiederholungsrate von 10 Hz ist und Daten in dem Massenanalysator über mindestens 10 Minuten akquiriert werden.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Analytenmenge in der Matrixkomposition und dem Analyten, die bzw. der auf der Oberfläche abgelagert ist, mehr als 1 attomol beträgt, der Laser ein gepulster Laser mit einer Wiederholungsrate von 10 Hz ist und Daten in dem Massenanalysator für mindestens 10 Minuten erhalten werden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Laser eine Wellenlänge im UV- oder IR-Bereich aufweist.