WO2001094924A2 - Verfahren zur analyse enzym-katalysierter umsetzungen mit maldi-tof-massenspektrometrie - Google Patents

Verfahren zur analyse enzym-katalysierter umsetzungen mit maldi-tof-massenspektrometrie Download PDF

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WO2001094924A2
WO2001094924A2 PCT/EP2001/006416 EP0106416W WO0194924A2 WO 2001094924 A2 WO2001094924 A2 WO 2001094924A2 EP 0106416 W EP0106416 W EP 0106416W WO 0194924 A2 WO0194924 A2 WO 0194924A2
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analysis
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Elmar Heinzle
Min-Jung Kang
Andreas Tholey
Klaus Hollemeyer
Bernhard Hauer
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    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/04—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing enzyme-catalyzed reactions of non-polymeric starting materials to non-polymeric products using MALDI-TOF mass spectrometry, preferably in the presence of an internal standard on a special carrier material.
  • a major problem in the screening for new enzymatic activities is the quick and easy identification of the products formed in the enzymatic reaction and / or, where appropriate, the decrease in the starting material used.
  • Methods such as NMR, which can be used after working up, for example by salt precipitation and / or subsequent chromatography, can also be used for the analysis.
  • HTS high-throughput screening
  • MALDI-TOF-MS matrix-assisted laser desorption ionization with time-of-flight mass spectrometry
  • MALDI-TOF-MS matrix-assisted laser desorption ionization with time-of-flight mass spectrometry
  • the quality of a MALDI spectrum depends to a large extent on the morphology of the sample examined (Garden & Sweedler, Anal. Chem. 72, 2000: 30-36 ).
  • Significant differences in the occurrence of signals, the intensity, the resolution and the mass accuracy can be observed as soon as a MALDI sample is examined at different locations (Cohen & Chait, Anal. Che., 68, 1996: 31-37 ; Strupat et al., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 111, 1991: 89-102; Amado et al., Rapid Commun.
  • the samples are usually applied in a thin layer to a metal surface and then irradiated with a pulsed laser.
  • a pulsed laser By focusing the emitted ions, the resolution of the mass spectra in the lower mass range can be increased to about 5000 D.
  • the MALDI-TOF-MS is an interesting simple and quick method that provides specific information about the analyzed substances, so that the use of the MALDI-TOF-MS for measuring enzymatic reactions with low molecular substances would be desirable. In particular, their use in high-throughput screening would be desirable.
  • the task therefore was to develop a method for analyzing enzyme-catalyzed reactions using MALDI-TOF mass spectrometry.
  • This object was achieved by a process for the analysis of enzyme-catalyzed reactions of non-polymeric starting materials to non-polymeric products, characterized in that the starting material and product of the enzyme-catalyzed reaction are analyzed using MALDI-TOF mass spectrometry, the process comprising the following steps :
  • Enzyme-catalyzed reactions are understood to mean enzymatic reactions with whole cells, which can be of plant, animal, bacterial or fungal origin, and yeast cells are also suitable. The enzymatic conversion can take place with resting, growing, permeabilized or immobilized cells or microorganisms. Enzymes are also suitable for the enzyme-catalyzed implementation. These enzymes can still be contained in the permeabilized cells or microorganisms or they can also be present in so-called crude extracts. For a faster and generally also by-product-free reaction, aria-purified or purified enzymes are used, which can be used in the reaction as free or immobilized enzymes. The reaction is preferably carried out with free, purified, purified or immobilized enzymes.
  • Enzymes of enzyme classes 1 to 6 are advantageously used in the process according to the invention, preference is given to enzyme classes 1 to 4, particularly preferably enzyme class 3 such as classes 3.1 (reaction with ester bonds), 3.2 (glycosidases ), 3.3 (reaction with ether bonds), 3.7 (reaction with carbon-carbon bonds), 3.11 (reaction with carbon-phosphorus bonds), enzymes such as lipases, esterases or phosphatases such as phytases are very particularly preferred. More beneficial Enzymes can be found in enzyme class 6.
  • reaction solutions of the process according to the invention it is not necessary to clean the reaction solutions of the process according to the invention before analysis with MALDI-TOF mass spectrometry.
  • the reaction can be measured directly. This also applies to complex sample mixtures. Also, no pure substances have to be used for the reaction, although this is of course possible.
  • Educts and / or products which are poorly or not at all detectable in MALDI-TOF-MS can advantageously be derivatized before the analysis (see examples) and thus finally analyzed.
  • the derivatization can take place before or after the enzymatic reaction.
  • Derivatization is particularly advantageous in cases in which hydrophilic groups are introduced into hydrophobic or volatile compounds, such as esters, amides, lactones, aldehydes, ketones, alcohols, etc., which advantageously also carry an ionizable functionality.
  • Examples of such derivatizations are reactions of aldehydes or ketones to oximes, hydrazone or their derivatives or alcohols to esters, for example with symmetrical or mixed anhydrides.
  • An internal standard is advantageously added in the method according to the invention for analyzing enzyme-catalyzed reactions.
  • This internal standard advantageously enables the quantification of the low molecular weight compounds in the reaction solution.
  • This standard can be added to the enzyme-catalyzed reaction before, during or after the end of the enzymatic reaction.
  • the starting material and product or, if appropriate, further intermediate products of the reaction can thus be analyzed and ultimately quantified.
  • the intermediate products are ultimately also to be understood as products of the starting material used at the start of the reaction.
  • the method according to the invention can also be used to monitor or analyze enzyme reactions which catalyze the successive reaction. These can be catalyzed by one or more enzymes. By-products can also be analyzed.
  • Labeled substances are advantageously used as the internal standard, but in principle chemical compounds similar to the starting materials and / or products are also suitable as the internal standard. Similar chemical compounds of this type are, for example, so-called compounds of a homologous series, the members of which differ only by, for example, an additional methylene group.
  • an internal standard at least one isotope is preferably selected from the group 2 H,
  • the starting material is advantageously selected from at least one isotope from the 2 H, i3 C, i5 N, 17 0, i8 0, 33 S, 34 s, 36 S, 35 C1, 37 C1, 29 Si, 30 Si, 74 Se or their mixtures marked.
  • 2 H or i3 C is preferably used as the isotope.
  • a distance of the marking from greater than or equal to 3 daltons to less than or equal to 10 daltons is advantageously sufficient.
  • a measurement is also under 3 Dalton or above 10 daltons in principle possible, but which may isotope effects may occur at small distances may be interference with the isotopes of the analyte or at greater distances'. This making the measurements difficult does not make them impossible.
  • a marked internal standard it is also advantageous to choose a substance that has the highest possible homology, that is to say structural similarity, to the chemical compound to be measured. The higher the structural similarity, the better the measurement results and the more accurately the connection can be quantified.
  • a ratio of analyte to internal standard is advantageously set in a range from 0.1 to 15, preferably in a range from 0.5 to 10, particularly preferably in a range from 1 to 5.
  • the analysis samples are advantageously concentrated in the smallest possible space or on the smallest possible diameter in order to achieve a further improvement in the measurement point resolution or measurement accuracy.
  • the reaction samples in the method according to the invention can be prepared manually or advantageously automatically using conventional laboratory robots.
  • the analysis with MALDI-TOF-MS can also be carried out manually or advantageously automatically.
  • MALDI mass spectrometry can advantageously be used for the rapid screening of enzyme-catalyzed reactions in so-called high-throughput screening.
  • the MALDI-TOF-MS is characterized by a high sensitivity with the lowest sample consumption.
  • new enzyme activities and new mutants of known enzymes can be rapidly identified after a mutagenesis, for example via a classic mutagenesis with chemical agents such as NTG, radiation such as UV radiation or X-rays or after a so-called site-directed mutagenesis, PCR mutagenesis or the so-called gene shuffling can be found.
  • Carrier materials with a roughness value or a roughness number of R z greater than 1, preferably greater than 2, particularly preferably greater than 3, very particularly preferably greater than 4 are advantageously used for the process according to the invention.
  • R z means the average roughness depth ( ⁇ m) as the arithmetic mean of the individual roughness depths of five adjacent individual measuring sections. The Roughness depth is determined according to DIN 4768.
  • These carrier materials are polished, coated or vapor-coated carrier materials or polished and coated or polished and vapor-coated carrier materials.
  • the carriers consist of a material selected from the group of glass, ceramic, quartz, metal, stone, plastic, rubber, silicon, germanium or porcelain. The material preferably consists of metal or glass.
  • the analysis can additionally be carried out with the aid of the metastable method
  • the dynamics of the marking pattern and the concentration of starting material and product are advantageously measured in the method according to the invention. This enables enzyme kinetics to be analyzed. In this way, K m and V max of an enzyme can be determined.
  • Matrix / analyte ratio 50 (mg / mg)
  • PEA was determined quantitatively in all experiments. It could be shown that MET can be determined quantitatively if PEA is used as the internal standard, but the errors were significantly greater due to the different molecular structure of the two compounds and the associated different flight and flight characteristics. A similar behavior was observed when PEA against phenylmethylamine was determined as the internal standard ( Figure la). The best results were obtained when the internal standard has the highest possible molecular homology, that is to say structural similarity, to the analyte, such as, for example, ds-PEA to PEA (FIG. 1b).
  • the ratio of analyte to standard was varied from 0.1 to 10 times.
  • the result can be seen in FIG. 2.
  • the sample application was carried out using a nano-plotter, the measurement by manually approaching the spots in the MALDI. 13 positions of 25 shots each were measured per spot, which were then added up. All concentrations were determined 4 times.
  • the absolute concentration of the internal standard was 0.14 mg / ml.
  • Samples are prepared according to the pipetting scheme given above (example 1) and transferred to a 6-well plate.
  • the nano-plotter is programmed so that 50 ⁇ l of the sample solution is drawn up per concentration; For each concentration, four spots are spotted on different fields of the MALDI target (quadruple determination).
  • FIG. 2 shows the quantitative determination of PEA against ds ⁇ PEA as an internal standard. You can clearly see a saturation of the curve if the ratio between analyte and internal standard is too high.
  • Detector limit are (256 counts / shot), while the signal of the internal standard is just above the required quality criterion of the signal / noise ratio.
  • the concentration of the internal standard or the ratio of analyte for example the product to the internal standard, can easily be calculated in order to be in a favorable ratio to the analyte.
  • the relative standard deviation was usually less than 5% in this experiment in '.
  • Example 3 Sample application with a nano plotter
  • Sample preparation using a nano plotter is intended to apply the smallest possible amount of the matrix / analyte mixture and to cause the solvent to evaporate as quickly as possible, thereby reducing the segregation of both components. It could be shown that the nano-plotter allows a simple and quick preparation of MALDI samples, with which reproducible results can be obtained in the quantification.
  • the matrix crystals are significantly smaller compared to manual preparation.
  • the distribution of the analyte in the matrix appears to be somewhat more homogeneous than with a manual preparation (data not shown).
  • "fried egg-like" structures formed with this type of preparation that is, the matrix and analyte form a ring, in the middle of which no (or at least significantly less) ionizable
  • the parameters of this software could be optimized for the measurement of small molecules.
  • the following points were taken into account in the automatic data acquisition: Saturation effects of the signals of the matrix; analyte or internal standard; Saturation of the detector limit; Laser intensity; Resolution of the peaks; Signal / noise ratio; Baseline noise and summation of the appropriate signals.
  • FIG. 4 shows an example of a calibration line that was recorded using these parameters.
  • the samples were identical to those measured in Example 2b ( Figure 3).
  • the sample preparation was carried out by means of a nano plotter, the recording spiral was not optimized for these small sample drops, so that a large number of laser shots did not hit the samples (four spots were measured for each concentration). Nevertheless, an analogous result to the classic recording technique shown in FIG. 3 was obtained. With this classic recording technique, the measurement spots were approached or sighted manually and fired at 13 different positions with 25 laser shots each. The signals from these 13x25 measurements were added up by the MALDI and represent the result of a single measurement. Analogous results were also obtained with manual sample preparation. The use of the AutoXecute TM program thus enables automated quantification of small molecules.
  • Hydrophobically coated plate with small holes (the holes themselves have the same properties as the unpolished target).
  • Figure 5a shows the manual application
  • Figure 5b shows the automatic application.
  • FIGS. 7 a) to c) shows the quantitative analysis of PEA (7 ⁇ g / ml to 1400 ⁇ g / ml) against ds-PEA (140 ⁇ g / ml) as an internal standard on various targets.
  • the samples were applied manually (0.34 ⁇ l per well).
  • the average standard deviation for all three targets was approximately 10%.
  • Example 5 Lipase-catalyzed preparation of enantiomerically pure IS, 2S-methoxycyclohexanol (MC)
  • Table 1 lists the molar masses and the expected ions (calculated) of the individual compounds.
  • Table 2 lists the different matrices with which the measurements were carried out and the results of these measurements.
  • Table 2 Matrices used and results of the measurements in positive and negative mode. +: Signal detected, -: signal not found, * overlap of a (theoretical) signal with a signal of the matrix.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • analyte methoxycyclohexanol (BASF)
  • b derivatization reagent: 2-sulfobenzoic acid cyclic
  • MC Methoxycyclohexanol
  • Table 3 Matrices for the measurement of the derivatized methoxycyclohexanol (MCS).
  • the samples were spotted onto the MALDI target by means of a nano plotter, the conditions of the DHB / PEA solutions previously used being used (see Pipettiersche a and nano plotter description, Example 1). Satellite peaks were observed in some cases, but they did not affect the measurement in any way. The peaks were homogeneous (optical impression from the MALDI microscope and binocular).
  • FIG. 9 shows the results of the quantitative MALDI of MCS against d-MCS as an internal standard.
  • FIG. 10 shows the percentage conversion of the enantiomerically pure methoxycyclohexanol measured at different matrix / analyte ratios. The deviation with a low M / A ratio is probably due to the poor signal-to-noise ratio in this series of measurements.
  • the signal recording should advantageously take place with a signal / noise ratio greater than 3; as a quality feature, this ratio should advantageously be greater than 10, which is easily achieved under the conditions examined.
  • the laser strength (attenuation) should advantageously be chosen as weak as possible (“ajbove threshhold”) in order to avoid oversteering at the detector and excessive fragmentation of the analyte.
  • Scout 384-well target optionally: - polished Bruker standard metal target or - Bruker glass target (prototype) or
  • GeSim micropipetting system nano-plotter type: P30-X-D - Deutschen für Silicon-Mikrosysteme mbH, conerkmanns- dorf / Rossendorf Piezoelectric micropipette from the same company

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen von nichtpolymeren Edukten zu nichtpolymeren Produkten mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie bevorzugt in Gegenwart eines internen Standards auf einem speziellen Trägermaterial.

Description

Verfahren zur Analyse Enzy -katalysierter Umsetzungen mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen von nichtpolymeren Edukten zu nichtpolymeren Produkten mit Hilfe der MALDI-TOF-Massen- spektrometrie bevorzugt in Gegenwart eines internen Standards auf einem speziellen Trägermaterial .
Der Erfolg beim Screenen nach neuen enzymatischen Reaktionen hängt im großen Ausmaß vom Zufall ab. In einem solchen Screening müssen sehr viele Organismen nach der gewünschten enzymatischen Aktivität durchgemustert werden, bis die gewünschte Enzymaktivität gefunden wird. Für das Screening dieser Enzymaktivitäten sind daher schnelle, einfache, hochempfindliche und hochspezifische Analysenverfahren erforderlich.
Ein Hauptproblem beim Screening nach neuen enzymatischen Aktivitäten ist die rasche und einfache Identifizierung der in der enzymatischen Reaktion entstehenden Produkte und/oder gegebenenfalls die Abnahme des eingesetzten Edukts . In der Regel werden zur Analyse der Produkte Trennverfahren wie die Dünnschichtchromatographie (= DC) , die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (= HPLC) oder die Gaschromatographie (= GC) verwendet. Auch Verfahren wie NMR, die nach einer Aufarbeitung über zum Beispiel Salzfällung und/oder anschließender Chromatographie anwendbar sind, können zur Analyse verwendet werden. Diese
Verfahren sind zeitaufwendig und lassen nur einen beschränkten Probendurchsatz zu, so daß derartige Analysenverfahren im sogenannten High-Throughput-Screening (= HTS) , bei dem zunächst nach der gewünschten Reaktion gescreent wird, keine Anwendung finden. Von Vorteil bei diesen Methoden ist, daß sie Informationen sowohl über Produkt als auch gegebenenfalls über die Abnahme des Edukts liefern.
Um einen höheren Probendurchsatz im HTS zu ermöglichen, werden vielfach indirekte, leicht meßbare Verfahren wie Farbreaktionen im sichtbaren Bereich, Trübungsmessungen, Fluoreszenz, Leitfähig- keitsmessungen etc. verwendet. Diese sind zwar im Prinzip sehr empfindlich, aber auch störanfällig. Von Nachteil hierbei ist vor allem, daß bei diesem Vorgehen viele falsch positive Proben analysiert werden.und da es sich um indirekte Nachweisverfahren handelt, keine Informationen über Produkt und/oder Edukt vorliegen. Um diese falsch Positiven beim weiteren Vorgehen aus- schließen zu können, werden in der Regel weitere Analysenverfahren nach dem ersten Screening wie beispielsweise DC, HPLC oder GC verwendet. Dies ist wiederum sehr zeitaufwendig.
Generell kann gesagt werden, daß die Verbesserung der Empfindlichkeit und der Aussagekraft der Detektionsverfahren bezüglich der Reaktionsprodukte zu einer Verlangsamung in der Geschwindigkeit eines Tests führt.
MALDI-TOF-MS (= Matrix-unterstützte Laserdesorption-Ionisation mit time-of-flight Massenspektrometrie) stellt ein rasches und einfaches Verfahren dar, das breit für die Analyse von großen, nichtflüchtigen Biomolekülen wie im besonderen Peptiden, Proteinen, Oligonukleotiden und Oligosacchariden oder sonstigen Polymeren Anwendung findet. Auch hochmolekulare Materialien wie Kohleteer, Huminsäure, Fulvinsäure oder Kerogene wurden mit MALDI analysiert (Zenobie and Knochenmus, Mass Spec . Rev. , 1998, 17, 337-366) .
Ein Problem bei der MALDI-MS ist die Quantifizierung der
Meßergebnisse, dies liegt daran, daß die Signalintensität in hohem Maße von der Homogenität der aufgegebenen Probe und der Bestrahlungsdichte des Lasers abhängt (Ens et al., Rapid Commun. Mass Spectrom, 5, 1991: 117-123), wobei die Intensität in erster Näherung expotentiell mit steigender Laserenergie ansteigt (Ens et al . , Rapid Commun. Mass Spectrom, 5, 1991: 117-123). Wird die Signalintensität zu hoch, so kann es unter Umständen zu einer Sättigung des Signals am Detektor kommen, was eine Quantifizierung ebenfalls ausschließt. Neben diesen physikalisch- technisch-bedingten Problemen gibt es weitere Gründe, welche eine quantitative Auswertung von MALDI-Messungen erschweren. So können beispielsweise Fragmente der gesuchten Ionen oder Moleküladdukte auftreten. Das größte Problem bei der quantitativen MALDI-MS stellt jedoch die Inhomogenität der Proben dar. Die Qualität eines MALDI-Spektrums ist in starkem Maße von der Morphologie der untersuchten Probe abhängig (Garden & Sweedler, Anal. Chem. 72, 2000: 30-36). Dabei können signifikante Unterschiede in Bezug auf das Auftreten von Signalen, die Intensität, die Auflösung und die Massengenauigkeit beobachtet werden, sobald man eine MALDI-Probe an verschiedenen Stellen untersucht (Cohen & Chait, Anal. Che ., 68, 1996: 31-37; Strupat et al . , Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 111, 1991: 89-102; Amado et al . , Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 1997: 1347-1352). Diese Inhomogenitäten beruhen auf einer ungleichen Verteilung von Matrix und Analyt auf dem Probentarget, was durch das ungleiche Kristallisationsverhalten dieser beiden Komponenten verursacht wird. Um diese Inhomogenitäten zu beseitigen oder zu minimieren - was gleichbedeutend mit der Bildung einer mikrokristallinen, homogenen Probentopologie ist - wurde bereits eine Reihe von Vorschlägen erarbeitet . Diese beinhalten beispielsweise die Verwendung von Comatrices (Gusev et al . , Anal. Chem., 67, 1995: 1034-1041), Multi-Layer- Präparationen, die Verwendung von Lösungsmittelgemischen und Elektrospray-Präparationen (Hensel et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 1997: 1785-1793) (eine Zusammenstellung dieser Versuche findet sich in der Referenz von Garden & Sweedler, Anal. Chem. 72, 2000: 30-6). All diese Ansätze haben jedoch Limitierungen und sind deshalb nicht breit anwendbar. Die Quantifizierung ist deshalb nach wie vor ein Problem.
Für die MALDI (= Matrix-unterstützte Laserdesorption-Ionisation) werden die Proben in der Regel in dünner Schicht auf eine Metalloberfläche aufgebracht und dann mit einem gepulsten Laser bestrahlt . Über eine Fokussierung der emitierten Ionen kann die Auflösung der Massenspektren im unteren Massenbereich bis etwa 5000 D erhöht werden.
Duncan et al . (Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 7, 1993: 1090-1094) beschreibt die Analyse der niedermolekularen polaren Verbindungen 3 , 4-Dihydroxyphenylalanin, Acetylcholin und des Peptids Ac-Ser-Ile-Arg-His-Tyr-NH mit Hilfe von MALDI in Gegenwart der entsprechenden über 13C bzw. 2H markierten Ver- bindungen bzw. über ein ähnliches Peptid als interner Standard.
Von Goheen et al . (J. Mass Spec . , Vol. 32, 1997: 820-828) wird die Verwendung von MALDI-TOF-MS zur Analyse der folgenden nieder- molkularen Verbindungen beschrieben:
Zitronensäure, Propionsäure, Buttersäure, Oxalsäure und Stearinsäure, Ethylendiamintetraessigsäure (= EDTA) , N- (2-hydroxyethyl) - ethylendia intriessigsäure (= HEDTA) , Ethylendiamine-N,N' -di- essigsäure (= EDDA) und Nitrilotriessigsäure (= NTA) sowie Sulfat-, Nitrat-, Nitrit- und Phosphat-Salze. Als Matrix in allen Experimenten wird 2 , 5-Dihydroxybenzoesäure verwendet.
Von Nachteil bei beiden Methoden ist, daß sie nur für die Messung von Reinsubstanzen geeignet sind. Diese Problematik wird in der Diskussion von Duncan et al . angesprochen, dort wird zur Überwindung dieser Schwierigkeit die Reinigung der Meßproben vorgeschlagen.
Insgesamt ist die MALDI-TOF-MS jedoch eine interessante ein- fache und rasche Methode, die spezifische Informationen über die analysierten Substanzen gibt, so daß die Verwendung der MALDI- TOF-MS zur Messung von enzymatischen Reaktionen mit nieder- molekularen Substanzen wünschenswert wäre. Speziell wäre ihre Verwendung im High-Throughput-Screening wünschenswert.
Es bestand daher die Aufgabe ein Verfahren zur Analyse Enzym- katalysierter Reaktionen unter Verwendung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie zu entwickeln.
Diese Aufgabe wurde ein Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen von nichtpolymeren Edukten zu nichtpolymeren Produkten gelöst, dadurch gekennzeichnet, daß das Edukt und Produkt der Enzym-katalysierten Umsetzung mit Hilfe der MALDI- TOF-Massenspektrometrie analysiert wird, wobei das Verfahren folgende Schritte umf ßt :
a) Enzym-katalysierte Umsetzung eines nichtpolymeren Edukts zu einem nichtpolymeren Produkt,
b) Analyse des Edukts oder Produkts oder des Edukts und Produkts während oder nach der Enzym-katalysierten Umsetzung (a) mit der MALDI-TOF-Massenspektroskopie.
Unter Enzym-katalysierten Umsetzungen sind enzymatische Reaktionen mit ganzen Zellen zu verstehen, die pflanzlichen, tierischen, bakteriellen oder pilzlichen Ursprungs sein können, auch Hefezellen sind geeignet. Die enzymatische Umsetzung kann mit ruhenden, wachsenden, permeabilisierten oder immobilisierten Zellen bzw. Mikroorganismen erfolgen. Auch Enzyme sind für die Enzym-katalysierte Umsetzung geeignet. Diese Enyzme können noch in den permeabilisierten Zellen oder Mikroorganismen enthalten sein oder aber in sogenannten Rohextrakten vorhanden sein. Für eine raschere und in der Regel auch Nebenprodukt freiere Umsetzung werden arigereinigte oder gereinigte Enzyme verwendet, die in der Umsetzung als freie oder immobilisierte Enzyme verwendet werden können. Bevorzugt wird die Reaktion mit freien, angereinigten, gereinigten oder immobilisierten Enzymen durchgeführt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorteilhaft Enzyme der Enzymklassen 1 bis 6 (International Union of Biochemistry and Molecular Biology = IUB) verwendet, bevorzugt werden die Enzymklassen 1 bis 4, besonders bevorzugt die Enzymklasse 3 wie die Klassen 3.1 (Reaktion mit Esterbindungen), 3.2 (Glycosidasen) , 3.3 (Reaktion mit Etherbindungen) , 3.7 (Reaktion mit Kohlenstoff- Kohlenstoff-Bindungen), 3.11 (Reaktion mit Kohlenstoff-Phosphor- bindungen) , ganz besonders bevorzugt sind Enzyme wie Lipasen, Esterasen oder Phosphatasen wie Phytasen. Weitere vorteilhafte Enzyme sind in der Enzymklasse 6 zu finden.
Nichtpolymere Edukte und nichtpolymere Produkte im erfindungs- gemäßen Verfahren sind Verbindungen, die vor allem keine Peptide, Proteine, Oligo- oder Polynukleotide oder Oligo- oder Poly- saccharide oder künstliche oder natürliche Polymere sind. Diese nichtpolymeren Edukte oder nichtpolymeren Produkte haben eine Molmasse von kleiner 1000 D (= Dalton) , bevorzugt kleiner 800 D, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 D.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können neben der Analyse von Edukt und Produkt in der Reaktion vorteilhaft Enzymreaktionen verfolgt werden, das heißt es können Enzymkinetiken aufgestellt werden. Weiter kann der Km-Wert, der Vmax-Wert, die Selektivität des Enzyms, die Ausbeute der Reaktion bestimmt werden sowie die Auswirkung von Inhibitoren auf die Enzymreaktion verfolgt werden. Auch können mögliche Reaktionsparameter wie die Temperatur oder der pH auf die Enzym-katalysierte Reaktion untersucht werden.
Eine Reinigung der Reaktionslösungen des erfindungsgemäßen Verfahrens vor der Analyse mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist nicht erforderlich. Die Reaktion kann direkt gemessen werden. Dies gilt auch für komplexe Probengemische. Auch müssen für die Reaktion keine Reinsubstanzen verwendet werden obwohl dies natürlich möglich ist.
Vorteilhaft können Edukte und/oder Produkte, die im MALDI-TOF-MS nur schlecht oder gar nicht nachweisbar sind vor der Analyse derivatisiert werden (siehe Beispiele) und so schließlich analysiert werden. Die Derivatisierung kann vor oder nach der enzymatischen Reaktion erfolgen. Eine Derivatisierung ist besonders vorteilhaft in Fällen, in denen in hydrophobe bzw. flüchtige Verbindungen beispielsweise wie Ester, Amide, Lactone, Aldehyde, Ketone, Alkohole etc. hydrophile Gruppen eingeführt werden, die vorteilhaft noch eine ionisierbare Funktionalität tragen. Beispiele für derartige Derivatisierungen sind Umsetzungen von Aldehyden oder Ketonen zu Oximen, Hydrazonen oder deren Derivate oder Alkoholen zu Estern beispielsweise mit symmetrischen oder gemischten Anydriden. Dies erweitert das Nachweisspektrum des Verfahrens signifikant. Die Derivatisierung nach Ablauf der enzymatischen Umsetzung ermöglicht die direkte Messung des Originalsubstrats der enzymatischen Reaktion. Durch die Verwendung der MALDI-TOF-MS können dadurch auch Substanzen analysiert werden, die keinen Chromophor enthalten. Dies ist gegenüber anderen Verfahren ein erheblicher Vorteil, da für beispielsweise übliche Detektionsverfahren beispielsweise über eine visuelle Erkennung in der Regel artifizielle Substrate, die beispielsweise einen Chromophor enthalten, verwendet werden müssen. Diese führen bei einer Optimierung auf diese Reaktion möglicherweise nicht zu einer Verbesserung der gewünschten natürlichen enzymatischen Umsetzung, da die Optimierung dieser artifiziellen Reaktion nicht die natürlichen Verhältnisse widerspiegelt .
Vorteilhaft wird im erfindungsgemäßen Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Reaktionen ein interner Standard zugesetzt. Dieser interne Standard ermöglicht vorteilhaft die Quantifizierung der niedermolekularen Verbindungen in der Reaktionslösung. Dieser Standard kann der Enzym-katalysierten Umsetzung vor Beginn, während oder nach Abschluß der enzymatischen Reaktion zugesetzt werden. Edukt und Produkt oder gegebenenfalls weitere Zwischenprodukte der Reaktion können so analysiert und letztlich quantifiziert werden. Die Zwischenprodukte sind letztlich auch als Produkte des zu Beginn der Reaktion eingesetzten Edukts zu verstehen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können demnach auch Enzymreaktionen verfolgt bzw. analysiert werden, die aufeinanderfolgende Reaktion katalysieren. Diese können durch ein Enzym oder durch mehrere Enzyme katalysiert werden. Auch Nebenprodukte können analysiert werden.
Als internen Standard werden vorteilhaft markierte Substanzen verwendet, prinzipiell sind aber auch den Edukten und/oder Produkten ähnliche chemische Verbindungen als interner Standard geeignet. Derartige ähnliche chemische Verbindungen sind beispielsweise sogenannten Verbindungen einer homologen Reihe, deren Mitglieder sich nur durch beispielsweise eine zusätzliche Methylengruppe unterscheiden. Als interner Standard werden bevorzugt durch mindestens ein Isotop ausgewählt aus der Gruppe 2H,
13C , 15N, 170 , 80 , 33S , 34S , 36S , 35C1 , 37C1 , 29Si / 30Si / 74Se oder deren Mischungen markiertes Edukt, Produkt oder eine weitere markierte chemische Verbindung verwendet. Vorteilhaft wird das Edukt durch mindestens ein Isotop ausgewählt aus der 2H, i3C, i5N, 170, i80, 33S, 34s, 36S, 35C1, 37C1, 29Si, 30Si, 74Se oder deren Mischungen markiert. Bevorzugt wird aus Kostengründen und aus Gründen der Zugänglichkeit 2H oder i3C als Isotop verwendet. Diese internen Standard brauchen für die Analyse nicht komplett, das heißt vollmarkiert zu sein. Eine Teilmarkierung ist völlig ausreichend. Ein Abstand der Markierung von größer/gleich 3 Dalton bis kleiner/gleich 10 Dalton ist vorteilhaferweise ausreichend. Eine Messung ist aber auch unter 3 Dalton oder über 10 Dalton prinzipiell möglich, wobei aber bei kleinen Abständen eventuell Überlagerungen mit den Isotopen des Analyten oder bei größeren Abständen 'eventuell Isotopeneffekte auftreten können. Dies erschwert die Messungen macht sie aber nicht unmöglich. Vorteilhaft wird auch im Falle eines markierten internen Standards eine Substanz gewählt, die eine möglichst hohe Homologie, das heißt strukturelle Ähnlichkeit, zu der zu messenden chemischen Verbindung hat. Je höher die strukturelle Ähnlichkeit ist, desto besser sind die Meßergebnisse und desto genauer kann eine Quantifizierung der Verbindung erfolgen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren und besonders für die Quantifizierung der in der Reaktion vorhandenen Edukte, Produkte, Zwischenprodukte oder Nebenprodukte ist es vorteilhaft den internen Standard in einem günstigen Verhältnis zu dem zu messenden Edukt, Produkt, Zwischenprodukt oder Nebenprodukt einzusetzen. Verhältnisse von Analyt (= zu bestimmende Verbindung) zu internem Standard größer 1:15 führen zu keiner Verbesserung der Meßergebnisse, sind jedoch prinzipiell möglich. Vorteilhaft wird ein Verhältnis von Analyt zu internem Standard in einem Bereich von 0,1 bis 15 eingestellt, bevorzugt in einem Bereich von 0,5 bis 10, besonders bevorzugt in einem Bereich von 1 bis 5.
Vorteilhaft werden die Analysenproben auf einen möglichst kleinen Raum bzw. auf einen möglichst kleinen Durchmesser konzentriert, um eine weitere Verbesserung der Meßpunktsauflösung bzw. Meßgenauigkeit zu erreichen.
Die Reaktionsproben im erfindungsgemäßen Verfahren können manuell oder vorteilhaft automatisch mit üblichen Laborrobotern vorbereitet werden. Auch die Analyse mit MALDI-TOF-MS kann manuell oder vorteilhaft automatisch durchgeführt werden. Durch die Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die MALDI- Massenspektrometrie vorteilhaft zum schnellen Screening Enzymkatalysierter Reaktionen im sogenannten High-Throughput-Screening verwendet werden. Dabei zeichnet sich die MALDI-TOF-MS durch eine hohe Empfindlichkeit bei geringstem Probenverbrauch aus . Mit Methode können als rasch neue Enzymaktivitäten sowie neue Mutanten bekannter Enzyme nach einer Mutagenese beispielsweise über nach einer klassischen Mutagenese mit chemischen Agentien wie NTG, Strahlung wie UV-Strahlung oder Röntgenstrahlung oder nach einer sogenannten site-directed mutagenesis, PCR-Mutagenese oder dem sogenannten gene shuffling gefunden werden.
Vorteilhaft werden für das erfindungsgemäße Verfahren Trägermaterialien mit einem Rauhigkeitswert bzw. einer Rauhigkeitszahl von Rz größer 1, bevorzugt größer 2, besonders bevorzugt größer 3, ganz besonders bevorzugt größer 4 verwendet. Dabei bedeutet Rz die gemittelte Rauhtiefe (μm) als arithmetisches Mittel aus den Einzelrauhtiefen fünf aneinandergrenzenden Einzelmeßstrecken. Die Rauhtiefe wird nach DIN 4768 ermittelt. Diese Trägermaterialien sind polierte, beschichtete oder bedampfte Trägermaterialien oder polierte und beschichtete oder poliertem und bedampften Trägermaterialien. Die Träger bestehen aus einem Material ausgewählt aus der Gruppe Glas, Keramik, Quarz, Metall, Stein, Kunststoff, Gummi, Silicium, Germanium oder Porzellan. Bevorzugt besteht das Material aus Metall oder Glas .
Zur Ermittlung weiterer Analysendaten kann im erfindungsgemäßen Verfahren die Analyse zusätzlich mit Hilfe des metastabilen
Zerfalls nach der Ionisierung oder des stoß-induziertem Zerfalls erfolgen. Dadurch können weiterer Massendaten gewonnen werden, die die Identifizierung der vorhandenen Edukte, Produkte, Nebenprodukte oder Zwischenprodukte erleichtern bzw. ermöglichen.
Vorteilhaft wird im erfindungsgemäßen Verfahren die Dynamik des Markierungsmusters und die Konzentration von Edukt und Produkt gemessen wird. Dadurch können Enzymkinetiken analysiert werden. Es können so Km und Vmax eines Enzyms bestimmt werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert :
Beispiele
Beispiel 1: Lipase katalysierte Umsetzung von rac . Phenylethyl- amin (= PEA) zum 2-Methoxy-N- [ (1R) -1-phenylethyl] acetamid (= MET)
Schema I :
Figure imgf000009_0001
Lipase
H3
Figure imgf000009_0002
(1R- ET) Die Versuche wurden, so weit in den einzelnen Beispielen nichts anders beschrieben wurde, wie folgt durchgeführt:
Matrix/Analyt-Verhältnis= 50 (mg/mg)
Lösungsmittel: 50 % EtOH / 50 % H20 / 1 % HOAc / 0,1 % TFA (v:v:v:v)
Interner Standard (IS) : d5-PEA
Vges - 1 ml
Stocklösungen :
- DHB: 140 mg/ml PEA: 35 mg/ml d5-PEA: 35 mg/ml
Pipettierschema :
Figure imgf000010_0001
Probenaufgabe mit nano-Plotter
Messung: manuell, 13 Positionen mit je 25 Schuß
Die Versuchsergebnisse werden in Figur 2 wiedergegeben.
In allen Versuchen wurde PEA quantitativ bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß sich MET quantitativ bestimmen läßt, wenn man PEA als internend Standard einsetzt, jedoch waren die Fehler wegen des unterschiedlichen molekularen Aufbaus der beiden Verbindungen und den damit verbundenen unterschiedlichen Iohisierungs- und Flugeigenschaften deutlich größer. Ein ähnliches Verhalten wurde beobachtet, wenn man PEA gegen Phenylmethylamin als internen Standard bestimmt (Figur la) . Die besten Ergebnisse wurden erhalten, wenn der interne Standard eine möglichst hohe molekulare Homologie, das heißt strukturelle Ähnlichkeit, zum Analyten aufweist, wie beispielsweise ds-PEA zu PEA (Figur lb) .
Beispiel 2 : Einflußt des Verhältnisses von Analyt zu internem Standard auf die Quantifizierung?
a) Messung über einen größeren relativen Konzentrationsbereich (0,1- bis 10-fach)
In diesem Experiment wurde das Verhältnis von Analyt zu Standard von 0,1-fach bis 10-fach variiert. Das Ergebnis ist in Figur 2 zu sehen. Die Probenaufgabe erfolgte mittels nano-Plotter, die Messung durch manuelles Anfahren der Spots im MALDI. Je Spot wurden 13 Positionen zu je 25 Schuß vermessen, die dann aufsummiert wurden. Alle Konzentrationen wurden jeweils 4 mal bestimmt. Die absolute Konzentration des internen Standards betrug 0.14 mg/ml .
• Proben werden nach dem oben angegebenen Pipettierschema (Beispiel 1) präpariert, und in eine 6-well Plate überführt.
• Der nano-Plotter ist so programmiert, daß je Konzentration 50μl der Probenlösung aufgezogen werden; je Konzentration wird dann vier Spots auf verschiedene Felder des MALDI- Targets gespottet (Vierfachbestimmung) .
• Das genaue Volumen jedes Spots wurde nicht bestimmt, es liegt jedoch in der Größenordnung von 0.5 nl .
• Um eine reproduzierbare Tropfenbildung am nano-Plotter zu gewährleisten wurden die Parameter für den Piezokristall mit Hilfe des am nano-Plotter befindlichen Stroboskops und anschließender Betrachtung der Spots mit Binokular-Mikroskop variiert. Typische Werte für den PEA-Versuch waren dabei:
• f = 150 Hz (Pumpfrequenz)
• T = 20 μs (Pulsbreite)
• U = 60 V (Amplitude) Die Bildung von Satellitenspots - ein bekanntes Phänomen bei dieser Probenaufgabetechnik - konnte in vielen Fällen beobachtet werden, beeinflußte die Meßergebnisse jedoch nicht. Die optimalen Werte variieren stark, je nach Konzentrationsverhältnissen!
In Figur 2 wird die quantitative Bestimmung von PEA gegen ds~PEA als internen Standard wiedergegeben. Deutlich zu sehen ist eine Sättigung der Kurve bei zu großem Verhältnis zwischen Analyten und internem Standard.
Nach einem linearen Anstieg wird eine deutliche Sättigung der Kurve beobachtet. Der Grund hierfür ist in der unterschiedlichen Signalintensität der beiden Signale bei großem Konzentrations- unterschied zu suchen. So kann beispielsweise das Signal des Analyten bei hohem Analyt/Standard-Verhältnis (= A/IS) am
Detektorlimit liegen (256 counts/shot) , während das Signal des internen Standards gerade über dem geforderten Qualitätskriterium des Signal/Rausch-Verhältnisses liegt.
b) Messung in einem engen relativen Konzentrationsbereich
In diesem Experiment wurde das Verhältnis von Analyt zum internen Standard von 0,1-fach bis 2-fach variiert. Das Ergebnis ist in Figur 3 [Messung von PEA gegen ds-PEA als internem Standard in einem relativen Konzentrationsbereich (A/IS) von 0,1-fach bis 2-fach] zu sehen. Zur Probenvorbereitung und Messung fanden die gleichen Parameter Anwendung wie beim vorherigen Experiment (Beispiel 2a) . Es zeigte sich wie in Beispiel 2a im unteren Bereich eine deutliche lineare Abhängigkeit des Verhältnisses der Signal- intensitäten von A und IS von der relativen Konzentration beider Komponenten. Dieser Bereich ist dadurch auch für Enzymassays vorteilhaft. Da die Anfangskonzentrationen in einem Enzymassay bekannt sind, kann die Konzentration des internen Standards bzw. das Verhältnis von Analyt beispielsweise dem Produkt zum internen Standard leicht berechnet werden, um in einem günstigen Verhältnis zum Analyt zu sein. Die relative Standardabweichung lag bei diesem Experiment in' der Regel bei unter 5 %.
Beispiel 3 Probenaufbringung mit einem nano-Plotter
Durch Probenpräparation mittels nano-Plotter soll eine möglichst geringen Menge des Matrix/Analyt-Gemischs aufgebracht werden und eine möglichst schnelle Verdampfung des Lösungsmittels bewirkt werden, wodurch die Entmischung beider Komponenten vermindert werden soll. Es konnte gezeigt werden, daß der nano-Plotter eine einfache und schnelle Präparation von MALDI-Proben erlaubt, mit der reproduzierbare Ergebnisse bei der Quantifizierung erhalten werden können. Die Matrixkristalle sind gegenüber der manuellen Präparation deutlich kleiner. Außerdem scheint die Verteilung des Analyten in der Matrix etwas homogener zu sein als bei einer manuellen Präparation (Daten nicht gezeigt) . Oft bildeten sich bei dieser Präparationsart jedoch "spiegeleiartige" Strukturen aus, daß heißt, Matrix und Analyt bilden einen Ring, in dessen Mitte kein (oder zumindest deutlich weniger) ionisierbares
Material zu finden ist. Die Ausbildung solcher Strukturen scheint von der Konzentration von Matrix/Analyt und dem verwendeten Lösungsmittel abhängig zu sein. Generelle Regeln konnten in diesem Zusammenhang nicht aufgestellt werden, jedoch läßt sich sagen, daß dieses Phänomen auch bei der manuellen Präparation zu beobachten ist.
Es konnten jedoch zwei Unterschiede zwischen der manuellen und der nano-Präparation ausgemacht werden. So konnte gezeigt werden, daß bei manueller Präparation ein etwas größerer Bereich im Verhältnis von Analyt und internem Standard zu einer linearen Korrelation führt, während bei der Präparation mittels nano- Plotter schon früh die oben beschriebene Sättigung (Beispiel 2, Figur 2) eintritt. Im Gegensatz dazu war die relative Standard- abweichung bei der nano-Präparation geringer als bei der manuellen Präparation. Beide Methoden liefern vergleichbare und befriedigende Ergebnisse. Alle Beispiele wurden sowohl manuell als auch automatisch durchgeführt.
Automatisierte Datenaufnahme
Für die automatisierte Datenaufnahme wurde das in der Steuerungs- software des Bruker Reflex III-MALDI-TOF-Massenspektrometers enthalten Programm AutoXecute™ , das die automatisierte Aufnahme vom MALDI-Spektren erlaubt, verwendet. Die Parameter dieser Software konnten für die Messung von niedermolekularen Verbindungen optimiert werden. Dabei wurden unter anderem folgende Punkte bei der automatischen Datenaquisition beachtet: Sättigungseffekte der Signale der Matrix; des Analyten oder des internen Standards; Sättigung des Detektorlimits; Laserintensität; Auflösung der Peaks; Signal/Rausch-Verhältnis; Basislinienrauschen und Summierung der geeigneten Signale . Die folgenden Parameter wurden für die automatisierte Datenaufnahme verwendet :
Laser-Stärke ( laser attenuation) : 69 - 63 - Aufnahmeformat: große Spirale Zahl der summierten Peaks: 100
Optimaler Bereich für das A/IS-Verhältnis: 1 - 5 Auflösung > 1400 Signal/Rausch-Verhältnis > 6 - Basislinienrauschen = 200 a.i.
In Figur 4 wird exemplarisch eine Kalibriergerade gezeigt, die mittels dieser Parameter aufgenommen wurde. Die Proben waren identisch mit denen in Beispiel 2b (Figur 3) gemessenen. Die Probenpräparation erfolgte mittels nano-Plotter, die Aufnahmespirale wurde nicht für diese kleinen Probentropfen optimiert, so daß eine große Zahl der Laserschüsse die Proben nicht traf (je Konzentration wurden vier Spots vermessen) . Trotzdem wurde ein analoges Ergebnis zu der in Figur 3 gezeigten klassischen Aufnahmetechnik erhalten, bei dieser klassischen Aufnähmetechnik wurden die Meßspots manuell angefahren bzw. anvisiert und an 13 verschiedenen Positionen mit je 25 Laserschüssen beschossen. Die Signale dieser 13x25 Messungen wurden vom MALDI aufaddiert und stellen das Ergebnis einer Einzel- messung dar. Auch bei manueller Probenpräparation wurden analoge Ergebnisse erhalten. Die Verwendung des AutoXecute™ -Programms erlaubt also die automatisierte Quantifizierung niedermolekularer Verbindungen.
Beispiel 4: Einfluß der Targetbeschaffenheit
Um mögliche Auswirkungen der Targetbeschaffenheit auf die Probenhomogenität zu untersuchen wurden vier verschiedene MALDI-Targets eingesetzt:
Nichtpoliertes Metalltarget Poliertes Metalltarget Nickel-bedampftes Glastarget
Hydrophob gecoatete Platte mit kleinen Löchern (die Löcher ihrerseits haben die gleiche Beschaffenheit wie das unpolierte Target) .
Die Versuche wurden wie unter Beispiel 1 und 2 beschrieben durchgeführt. Das unpolierte Target erwies sich sowohl bei der manuellen als auch bei der Präparation mittels nano-Plotter als ungeeignet, da die auf der Oberfläche vorhandenen Rillen eine inhomogene' Kristallisation verursachten. Beim Einsatz des nano-Plotters konnten keine Unterschiede bezüglich der Probenhomogenität und der Analytverteilung in der Matrix zwischen dem polierten Metalltarget und dem Glastarget festgestellt werden, so daß in diesem Fall der Einsatz beider Platten zu äquivalenten Ergebnissen bei der Quantifizierung führt. Bei sehr kleinen Probenspots hatte das Glastarget jedoch den Vorteil, das die Spots im Videomikroskop des MALDI-Geräts besser zu sehen waren.
Ergebnisse:
Es wurde jeweils ein Profil des Analyt/IS-Verhältnisse im Querschnitt eines manuell aufgetragenen Spots bei unterschiedlichen Konzentrationen aufgetragen (Figur 5a + 5b, 6a + 6b) . Figur 5 gibt das Profil der Analyt/interner Standard (= A/IS) -Verteilung im Querschnitt einer Probe auf dem mit Nickel bedampften Glastarget wieder. Figur 5a zeigt die manuelle Auftragung, Figur 5b die automatische Auftragung.
Ein Vergleich von Figur 5a + 5b mit Figur 6a + 6b zeigt, daß die Verteilung von Analyt und Standard beim Glastarget bei manueller Präparation nicht so homogen ist wie beim polierten Target.
Es ist zu beobachten, daß die Intensitätsverteilung bei niedrigen Analyt/Matrixkonzentrationen nicht gleichmäßig ist, sondern daß die höchste Signalintensität am Rand der Spots beobachtet werden kann ("Spiegelei-Form"). Bei höherer Konzentration werden auch im Zentrum des Spots ausreichend starke Signale detektiert. Diese Verhalten wird analog bei der Präparation mit dem nano-Plotter beobachtet.
In Figur 7 a) bis c) ist zu sehen, daß die Kalibriergeraden unabhängig von der Target-Beschaffenheit vergleichbar sind. Figur 7 a) - c) zeigt die quantitative Analyse von PEA (7 μg/ml bis 1400 μg/ml) gegen ds-PEA (140 μg/ml) als internem Standard auf verschiedenen Targets . Die Proben wurden manuell aufgetragen (0.34 μl pro well). Die durchschnittliche Standardabweichung betrug für alle drei Targets etwa 10%. Die besten Werte (relative Standardabweichung < 5 %) wurden wie bereits oben beschrieben bei A/IS-Verhältnissen zwischen 1 und 5 erhalten. Sehr gute Ergebnisse konnten auch bei der Verwendung des Targets mit kleinen hydrophilen Löchern erhalten werden (R2=0.9994) . Durch die Konzentration der Probe auf einer kleineren Fläche wird somit ein Zugewinn an Genauigkeit erreicht . Beispiel 5 : Lipase-katalysierte Darstellung von enantiomeren- reinem lS,2S-Methoxycyclohexanol (MC)
Als Modellreaktion für eine auf MALDI-TOF-MS beruhende Methode zum quantitativen Screening enzymatischer Reaktionen wurde die folgende in Schema II dargestellte und durch eine Lipase katalysierten Reaktion verwendet.
Schema II : Lipase-katalysierte Darstellung von enantiomeren- reinem IS, 2S-Methoxycyclohexanol (MS)
Figure imgf000016_0001
(MCL) (MC)
Zur Etablierung eines Screening Assays mit der in Schema II dargestellten Reaktion wurden zunächst geklärt, ob es über- haupt möglich ist, die an der Reaktion beteiligten Moleküle mittels MALDI-MS zu detektieren. Außerdem wurden eine Reihe verschiedener Matrices untersucht, die ihrerseits saure beziehungsweise basische Eigenschaften aufweisen und die Detektion ermöglichen bzw. verbessern sollten. Die unter- suchten Verbindungen der Reaktion waren:
Vinyllaureat (L) Methoxycyclohexanol (MC) Methoxycyclohexanollaureat (MCL) .
Zusätzlich wurde in einem Fall versucht, durch Zugabe von NaCl die Bildung von Natriumaddukten zu induzieren. Bei zwei Matrices wurde zusätzlich SDS zugegeben.
Es wurde in allen Fällen versucht, sowohl im positiven als auch im negativen Modus zu messen. In Tabelle 1 sind die molaren Massen und die zu erwartenden Ionen (berechnet) der einzelnen Verbindungen aufgeführt.
Tabelle 1: Theoretisch zu erwartende Signale
Figure imgf000017_0001
In Tabelle 2 sind die unterschiedlichen Matrices aufgeführt, mit denen die Messungen durchgeführt wurden sowie die Ergebnisse dieser Messungen.
Tabelle 2 : Verwendete Matrices und Ergebnisse der Messungen im positiven und negativen Modus. +: Signal detektiert, -: Signal nicht gefunden, * Überlappung eines (theoretischen) Signals mit einem Signal der Matrix.
Figure imgf000017_0002
Abkürzungen der Tabelle 2
2,5-DHB= 2 , 5-Dihydroxybenzoesäure
SDS = Natriumdodecylsulfat
SA = Sinapinsäure
CCA = α-Cyano-4-hydroxy-zimtsäure Meßbedingungen:
Messung im positiv und negativ mode Alle Matrixlösungen wurden frisch angesetzt: - CCA, SA, DHB, Dithranol/AgTFA: in 90% Acetonitril / 10 %
Wasser / 0,1 % TFA
2-Amino-5-Nitropyridin: in 90 % Acetonitril / 10 % Wasser Das Matrix zu Analyt-Verhältnis (M/A) wurde variiert:
M/A = 100 (mg/mg) - M/A = 30 (mg/mg)
M/A = 1 (mg/mg) Von den Analyten wurden Stocklösungen (Acetonitril) hergestellt .
Bewertung der Ergebnisse:
Trotz der Variation der Bedingungen (Matrices, Lösungsmittel, pH) konnten weder im positiven noch im negativen Modus Signale der Analyten detektiert werden. Als mögliche Ursachen hierfür kommt möglicherweise die Flüchtigkeit der Analyten unter den Bedingungen der MS in Frage (Hochvakuum) . Eine andere mögliche Erklärung kann in der apolaren Natur der Verbindungen liegen, die sie für eine Analyse mit MALDI nur sehr schwer zugänglich machen. Um die Reaktion verfolgen zu können, wurde deshalb das Methoxycyclohexa- nol derivatisiert. Methoxycyclohexanol (= MC) wurde zur Messung in der MALDI-MS zu den entsprechenden Methoxycyclohexanol-benzoe- sulfonsäureesters (MCS) derivatisiert.
Die Derivatisierung des Methoxycyclohexanols hatte zwei Haupt- aufgaben. Zum einen sollte das Derivat dadurch weniger flüchtig werden, zum anderen sollte eine ionisierbare Gruppierung in das Molekül eingeführt werden. Vorversuche mit verschiedenen aromatischen Säurechloriden (Benzoylchlorid, p-Nitro-Benzoylchlorid) führten nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Die Umsetzung der Alkoholf nktion mit einem gemischten Anhydrid (2-Sulfo-benzoe- säureanhydrid (SBA, Bagree et al., FEBS Lett., 120, 1980: 275-277) erbrachte schließlich den gewünschten Erfolg. Schema III gibt die Derivatisierung schematisch wieder. Schema III
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0002
a: Analyt: Methoxycyclohexanol (BASF) b: Derivatisierungsreagenz: 2-Sulfobenzoesäure-cyclisches
Anhydrid (Fluka) c: mit MALDI zu messende Verbindung: 2-Sulfo-benzoylester des Methoxycyclohexanols (MCS) d. Nebenprodukt: 2-Sulfobenzoesäure
Die Stereochemie des Methoxycyclohexanols wurde nicht berücksichtigt . In der Modellreaktion wurde folgende enantiomerenreine Verbindung eingesetzt:
Figure imgf000019_0003
Versuchsdurchführung:
Methoxycyclohexanol (MC) = 130,1 g/mol 2-Sulfobenzoesäureanhydrid = 184,17 g/mol d-MC = 134,1 g/mol (berechnet als d4, da Hydroxyl- funktion ebenfalls deuteriert) 1. Vorlegen von 0,5 g (3,84 mmol) Methoxycyclohexanol (MC)
2. Lösen von 777,9 mg (1,1 eq. , 4.224 mmol) 2-Sulfo-benzoe- säureanhydrid in 0,5 ml Acetonitril (löst sich im Verlauf der Reaktion vollständig)
3. Zugabe von Lösung 2 ) zu 1)
4. Schütteln bei RT für 2 Stunden
5. Wenn Probe auskristallisiert: Auflösen in 2 ml Acetonitril 1 ml Wasser (löst sich sehr gut)
6. Vorbereitung MALDI-Probe
Vorschrift für die Darstellung des Standards (d3-MCS) analog, Einwaage (d-MC) : 515.mg
MALDI-Probenpräparation:
theoretisch zu erwartende Massen des Derivates
M onoisotopisch - 314 . 08
[M+H]+: 315.09 [M+Na]+: 337.07 [M-H]-:313.07
b) Suche nach der geeigneten Matrix
Es wurden unterschiedliche Matrizes untersucht, die entweder saure oder basische Eigenschaften aufweisen. Gemessen wurde im negativ mode .
Tabelle 3 : Matrices für die Messung des derivatisierten Methoxy- cyclohexanols (MCS) .
Figure imgf000020_0001
Der Analyt wurde in allen Matrices gefunden, die besten Resultate und die geringste Störung durch Matrixsignale ergab sich jedoch eindeutig bei der Verwendung von ATT. c) erhalten beim Spotten im nano-Plotter
Die Proben wurden mittels eines nano-Plotters auf das MALDI- Target aufgespottet, wobei die Bedingungen der früher ver- wendeten DHB/PEA-Lösungen Verwendung fanden (siehe Pipettier- sche a und Nano-Plotterbeschreibung, Beispiel 1) . Es wurden teilweise Satellitenpeaks beobachtet, die die Messung jedoch in keiner Weise beeinträchtigen. Die Peaks waren homogen (optischer Eindruck aus MALDI-Mikroskop und Binokular) .
Bei der späteren Messung konnten keine gravierenden Unterschiede des A/IS-Verhältnisses innerhalb der Spots ausgemacht werden (abgesehen von der normalen Variation) .
d) Probenpräparation für quantitative MALDI
Da die reale Konzentration des Analyten nach der Reaktion (= Ausbeute oder Umsatz) unbekannt war, wurden die verschiedenen Lösungen in unterschiedlichen Volumenverhältnissen miteinander gemischt.
Als Matrixlösung wurde eine gesättigte Lösung von ATT in AcCN/H20 (1:1, v:v) verwendet. Eine Berechnung des genauen Matrix/Analyt- Verhältnisses war auf diesem Wege nicht möglich, es wurde jedoch über den ganzen Meßbereich konstant gehalten.
MALDI-Messung :
a) Meßbedingungen - negativ mode reflector mode verwendet wurde ein poliertes Target
b) MALDI-Spektrum des derivatisierten Methyoxycyclohexanols (MCS)
In Figur 8 ist ein MALDI-Spektrum eines Gemisches von unmarkiertem (MCS, m/z = 311,01) und markiertem (d3-MCS, m/z = 316,02) derivatisiertem Methoxycyclohexanol gezeigt (Matrix: ATT) .
Fragmente oder Addukte konnten unter den gewählten Meßbedingungen nicht beobachtet werden. Zur späteren quantitativen Auswertung wurde nur der monoisotopische Peak herangezogen, die Isotopen- peaks wurden vernachlässigt. c) Quantitative Messung
Es wurden 12 Positionen pro Spot beschossen, wobei jeweils 25 Schuß aufaddiert wurden; die Summe der 12*25 Schuß wurde dann ausgewertet. Je Konzentration wurden vier Spots beschossen. Dabei wurden zwei Ausreißer ermittelt (bei rel. Konz. 0,2 und rel. Konz. 1,4), die in Figur 9 nicht berücksichtigt wurden.
Figur 9 gibt die Ergebnisse der quantitativen MALDI von MCS gegen d-MCS als internem Standard wieder.
Es konnte eine lineare Korrelation zwischen dem Verhältnis von Signalintensität des Analyten zur Intensität des internen Standards in Abhängigkeit von der relativen Konzentration der beiden zueinander beobachtete werden. Die Derivatisierungs- reaktion und die verwendeten MALDI-Parameter (Matrix etc . ) erlaubten eine quantitative Auswertung der Reaktion. Dies wurde mit einer kommerziell erhältlichen Lipase (Boehringer, Mannheim) bestätigt.
Durchführung :
1,01 mmol (200 mg) Vinyllaurat und 1,01 mmol Methoxycyclohexanol (1,01 mmol) gemischt. Es wurde enantiomerenreines MC eingesetzt . - Probe geteilt a) Kontrolle b) Enzymreaktion Zugabe von 50 mg Enzym zu b) . Enzym: Chirazym L-2 , c.-f ., C2 , Lyo, Boehringer Mannheim; Lipase aus Candida antarctica, Fraktion B, ungef. 4,5 kU/g carrier - Zugabe von je 250 μl Hexan 24 h bei RT geschüttelt
Lösungen über Fritte abgesaugt, nachgewaschen mit je 250 μl AcCN
Zugabe von je 0,5 mmol d3-Methoxycyclohexan (67 mg, berechnet als d4-MC)
Zugabe von je 1,5 mmol 2-Sulfobenzoesäureanhydrid (SBA, 276,6 mg) in 500 μl AcCN 20 h gerührt
(Rotverfärbung der Ansätze beobachtet) - Zugabe von je 27 μl Wasser (= 1,5 mmol) zum Abstoppen der Derivatisierung Ansatz MALDI-Probe, Matrix: sat. ATT, AcCN/Wasser, 1:1 a) 20 μl Probe + 50 μl Matrix + 150 μl AcCN (M/A: niedrig) b) 20 μl Probe + 100 μl Matrix + 100 μl AcCN (M/A: mittel) c) 20 μl Probe + 200 μl Matrix (M/A: hoch)
Probenauftragung auf Target: nano-Plotter, poliertes Target MALDI-Messung, Bedingungen wie bei Modellreaktion Ergebnisse:
Es konnte eine deutliche Abnahme der Menge an Methoxycyclohexanol nach der Enzymreaktion gegenüber der Kontrollreaktion nach- gewiesen werden (Figur 10) . Dabei konnte auch gezeigt werden, daß das M/A-Verhältnis keinen großen Einfluß auf dieses Ergebnis hatte. Die Spektrenqualität war bei niedrigem M/A-Verhältnis lediglich deutlich schlechter ausgeprägt (deutlich schlechteres Signal-Rausch-Verhältnis) , wodurch sich auch die geringe Abweichung gegenüber den Messungen bei mittlerem beziehungsweise hohem M/A-Verhältnis erklären lassen (Figur 11) . Figur 11 gibt den prozentualen Umsatz des enantiomerenreinen Methoxycyclohexanol gemessen bei verschiedenen Matrix/Analyt-Verhältnissen wieder. Die Abweichung bei geringem M/A-Verhältnis ist wahr- scheinlich auf das schlechte Signal-Rausch-Verhältnis bei dieser Meßreihe zurückzuführen.
Beispiel 6 : Kinetik einer Lipase katalysierten Reaktion in Mikro- titerplatten: immobilisierte BASF-Lipase
Die oben spezifizierte Racematspaltung von Methoxycyclohexanol wurde in diesem Experiment in einer Mikrotiterplatte durchgeführt, an die eine Lipase aus Burkholderia plantarii nicht- kovalent immobilisiert wurde (BASF, DSMZ 8246) .
Versuchdurchführung :
Mischen von 2 g Methoxycyclohexanol und 2,26 g Vinyllaurat (Vges = 4,275 ml), 200 μl dieser Lösung entsprechen 93,5 mg MC
In jedes well der Mikrotiterplatte wurden 200 μl dieser Mischung pipettiert, die Platte wurde mit Plate sealer verschlossen, abgedeckt und bei Raumtemperatur (= 28°C) bei 150 U/min auf dem Rundschüttler inkubiert
Zum Zeitpunkt t wurde aus einem well 80 μl entnommen (dies entspricht 37,4 mg = 2,875 * 10~4 mol MC). (Des weiteren wurden 100 μl zum gleichen Zeitpunkt in ein GC-Probenglas überführt, mit Ethylacetat (1 ml) überschichtet und bei -20°C gelagert bis zur GC-Analyse) .
Zur 80 ml Probe wurde jeweils 38.6 mg d3-MC zupipettiert (= 2.875 * 10"4 mol)
- Diese Proben wurden bis zur vollständigen Beendigung der Enzymreaktion bei -20°C zwischengelagert, so daß alle Derivätisierungsansätze zur gleichen Zeit begannen. Es wurden jeweils 179 mg SBA in 400 ml Acetonitril zupipettiert; die Ansätze wurden dann bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt .
- 20 μl der Derivatisierungslösung wurden dann jeweils mit 200 μl gesättigter ATT-Lsg (Wasser /AcCN, 1:1) vermischt und mittels des nano-Plotters auf das polierte Metalltarget gespottet .
Ergebnisse:
Es konnte ein deutlicher Abfall der Gesamtmenge an Methoxycyclohexanol im Verlaufe der Enzymreaktion mit immobilisierter Lipase detektiert werden (Figur 12) .
Bei der Messung wurde die Gesamtmenge des nach der Reaktion noch vorhandenen MC bestimmt, das sowohl als racemisches Edukt als auch als enatiomerenreines Produkt vorliegt. Mit der vorgestellten Methode konnte eine Abnahme der Gesamtmenge an Methoxy- cyclo-hexanol um 18 % nach einer Reaktionszeit von 30 h gemessen werde .
Aus den Ergebnissen der gesamten Versuche läßt sich folgendes ableiten:
Die Signalaufnahme sollte vorteilhaft bei einem Signal/ Rausch-Verhältnis größer als 3 erfolgen; als Qualitätsmerkmal sollte dieses Verhältnis vorteilhaft größer als 10 sein, was unter den untersuchten Bedingungen auch ohne weiteres erreicht wird.
Die Laser-Stärke (Attenuation) sollte vorteilhaft möglichst schwach gewählt werden ("ajbove threshhold" ) um das Übersteueren am Detektor und eine übermäßige Fragmentierung des Analyten zu vermeiden.
Oft ist von Vorteil während einer Meßreihe die Anpassung der Veränderung der Laser-Attenuation vorzunehmen, um ein Übersteuern der Signalintensitäten zu vermeiden (z.B. rel. Conc = 0,1, Attn: 60/61; rel. conc. = 10, Attn. : 65/66). Diese
Option ist auch im AutoXecute™ -Programm von Bruker vorhanden.
Durch Aufweitung des Lasers sind weniger Schußpositionen pro Spot notwendig, es ist jedoch nicht möglich, einen Tropfen mit einer Laserposition zu bedecken. Homogenität der Proben waren mit nano-Plotter größer als die bei der manuellen Probenpräparation
Die relativen Fehler liegen bei Verwendung des nano-Plotters unter 5 % . Optimale Ergebnisse werden für die Lipase Reaktion in einem engen Konzentrationsbereich gezeigt . Dies bedeutet , daß die Konzentration des Analyten vorteilhaft zwischen dem 0.1-fachen und dem doppelten der Konzentration des internen Standards liegen soll.
Unpolierte Metalltargets sind wegen der Rillen auf der Oberfläche den polierten Targets in Bezug auf eine homogene Probenpräparation deutlich unterlegen und für eine quantitative Messung daher ungeeignet. Für eine qualitative Messung aber geeignet.
Falls in den Beispielen nicht anders beschrieben wurden die Versuche mit folgenden Geräten bzw. Chemikalien durchgeführt:
MALDI-Massenspektrometer :
Bruker Reflex III MALDI-TOF, Bruker, Bremen
N2-Laser, λ = 337 nm
Scout 384-well-Target wahlweise: - poliertes Bruker-Standard-Metalltarget oder - Bruker Glastarget (Prototyp) oder
Bruker Standard-Metalltarget
Nano-Plotter :
GeSim Mikropipettiersystem Nano-Plotter, Typ: P30-X-D - Gesellschaft für Silizium-Mikrosysteme mbH, Großerkmanns- dorf/Rossendorf Piezoelektrsche Mikropipette der gleichen Firma
Chemikalien: - 2,5-DHB: Aldrich
ATT: Aldrich
2-Sulfobenzoesäure Anhydrid: Fluka alle anderen Chemikalien: BASF (wenn nicht anders angegeben im Text)

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen von nichtpolymeren Edukten zu nichtpolymeren Produkten, dadurch gekennzeichnet, daß das Edukt und Produkt der Enzym-katalysierten Umsetzung mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert wird, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt :
a) Enzym-katalysierte Umsetzung eines nichtpolymeren Edukts zu einem nichtpolymeren Produkt,
b) Analyse des Edukts oder Produkts oder des Edukts und Produkts während oder nach der Enzym-katalysierten
Umsetzung (a) mit der MALDI-TOF-Massenspektroskopie.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein interner Standard, vor Beginn der Enzym-katalysierten Umsetzung oder während oder nach Abschluß der Enzymkatalysierten Umsetzung zugesetzt wird und Edukt und Produkt in Gegenwart dieses internen Standards analysiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Edukte oder Produkte mit einer Molmasse < 1000 Dalton analysiert werden.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, daß das Edukt oder Produkt oder das Edukt und Produkt der Enzym-katalysierten Reaktion quantifiziert wird.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Enzym-katalysierte Umsetzung freie oder immobilisierte Enzyme, Rohextrakte oder ganze Zellen verwendet werden.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 , dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse auf einem Trägermaterial mit einem Rauhigkeitswert RZ>1 durchgeführt wird.
Zeichn.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6 , dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse auf einem poliertem, beschichtetem oder bedampften Trägermaterial oder auf einem poliertem und beschichtetem oder poliertem und bedampften Trägermaterial
5 durchgeführt wird.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einem Material ausgewählt aus der Gruppe Glas, Keramik, Quarz, Metall, Stein, Kunststoff,
10 Gummi, Silicium, Germanium oder Porzellan besteht.
. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8 , dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt vor der Analyse derivatisiert wird.
15
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren manuell oder automatisch durchgeführt wird.
20 11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einem High Throughput Screening verwendet wird.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekenn- 25 zeichnet, daß als interner Standard durch mindestens ein
Isotop ausgewählt aus der Gruppe 2H, X3C, i5N, l70, X80, 33S, 34S, 3eS, 35C1, 37C1, 29Si, 30Si, 7 Se oder deren Mischungen markiertes Edukt, Produkt oder eine weitere markierte chemische Verbindung verwendet wird. 30
13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Edukt durch mindestens ein Isotop ausgewählt aus der Gruppe 2H, i3C, i5N, i70, i80, 33S, 3 S, 36S, 35C1, 37C1, 29Si, 30Si, 7 Se oder deren Mischungen markiertes
35 Edukt verwendet wird.
14. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 13 , dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse zusätzlich mit Hilfe des metastabilen Zerfalls nach der Ionisierung oder des stoß-
40 induziertem Zerfalls erfolgt.
15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Dynamik der Markierungsmuster und Konzentration von Edukt und Produkt gemessen wird.
45
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