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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem Substanzgemische
derart für
die Massenspektrometrie präpariert
werden können,
dass sie mittels der ortsaufgelösten
mikroskopischen Oberflächenanalytik
mit einer nutzbaren Lateral-Auflösung von
wenigen Mikrometern untersucht werden können, sowie die mit Hilfe dieses
Verfahrens hergestellten Präparate.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Präparationsmethode
kann die chemische Zusammensetzung von Substanzgemischen in einem
wesentlich kleineren Maßstab
abgebildet werden als bisher. Gleichzeitig wird ein größerer Massenbereich
für die Massenspektrometrie
zugänglich,
so dass auch biologisch relevante Substanzen untersucht werden können.
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[Beschreibung und Einleitung des allgemeinen
Gebietes der Erfindung]
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Gebiete Chemie, Biologie
und Biochemie, Physik und instrumentelle Analytik.
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[Stand der Technik]
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Ziel
der ortsaufgelösten,
mikroskopischen Oberflächenanalytik
ist es, die chemische Zusammensetzung einer Probe oder eines Substanzgemisches
(z. B. einer biologischen Zelle, eines biologischen Gewebes oder
einer Halbleiterprobe) mit hoher Auflösung qualitativ und/oder quantitativ
abzubilden. Anders als ein optisches Mikroskopbild zeigt ein solches
analytisches Bild die Mengenverteilung eines bestimmten Stoffes
innerhalb der Probe als Bild an (z. B. als Graustufenbild). Dies
ist in zweidimensionalen Abbildungen bislang möglich unter Anderem mit Hilfe
lasergestützter,
massenspektrometrischer Verfahren (Lasermikrosondenmassenspektrometrie) mit
einer räumlichen
Auflösung
von 0,5 bis 1 μm
und einer oberen Massengrenze von ca. 500 bis 800 u. Im Gegensatz
zur Lasermikrosondenmassenspektrometrie, bei der eine Probe ohne
Vorbehandlung unmittelbar mit Hilfe eines hoch fokussierten Laserstrahls
abgerastert wird, konnte die so genannte „Scannende Mikrosonden-Matrix-assistierte
Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektrometrie" (SMALDI-MS)), auch
unter dem Begriff "MALDI-Imaging" bekannt, nur mit
einer nutzbaren Lateral-Auflösung
von etwa 25–30 μm betrieben
werden, da bei dieser Methode eine chemische Matrixsubstanz in gelöster Form
zugegeben werden muss, um auch größere Moleküle (wie z. B. Peptide und Proteine) abbilden
zu können.
Der Vermischungsprozess sowie die sich beim Eintrocknen bildenden
Matrixkristalle begrenzen die nutzbare Ortsauflösung auf die genannten 25 bis
30 μm, da
Analytmoleküle
zwangsläufig
in diesem Maße
räumlich
auf der Oberfläche verlagert
werden. Des Weiteren besitzen die Kristalle meist einen Durchmesser
von 5 μm
bis 500 μm,
was die nutzbare Ortsauflösung
ebenfalls begrenzt. Der Vorteil der mechanistisch zu Grunde liegenden
MALDI-Massenspektrometrie liegt im wesentlich größeren Massenbereich, der untersucht
werden kann (bis zu 106 u) und der somit
biologisch relevanten Substanzen wie Proteine, Oligosaccharide und
Lipide zugänglich
macht.
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Verfahren
zur Bedampfung von Proben mit verschiedenen Materialien sind aus
der Elektronenmikroskopie bekannt, eignen sich jedoch nicht für die MALDI-MS,
da in der Elektronenmikroskopie andere Matrixmaterialien wie beispielsweise
Gold verwendet werden, um die Oberfläche leitfähig zu machen.
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Die
Auswahl der Matrixsubstanz für
die MALDI hängt
von der Art der Analytmoleküle
ab; es sind inzwischen weit über
hundert verschiedene Matrixsubstanzen bekannt geworden. Die in hohem Überschuss
eingesetzten Matrixsubstanzen haben dabei unter anderem die Aufgabe,
die Analytmoleküle
möglichst
zu vereinzeln und am Probenträger
anzubinden, während
des Laserbeschusses durch Bildung einer Dampfwolke möglichst
ohne Anlagerung von Matrix- oder anderen Molekülen in die Gasphase zu übertragen,
und schließlich
unter Protonierung oder Deprotonierung zu ionisieren. Für diese
Aufgabe hat es sich als günstig
erwiesen, die Analytmoleküle
vereinzelt in die Kristalle der Matrixsubstanzen bei deren Kristallisation
oder zumindest fein verteilt in die Grenzflächenbereiche zwischen den Kriställchen einzubauen.
Es scheint dabei wesentlich zu sein, die Analytmoleküle voneinander
zu trennen, also keine Cluster von Analytmolekülen in der aufgetragenen Probe
zuzulassen.
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Für das Auftragen
von Analyt und Matrix sind eine Reihe verschiedenartiger Methoden
bekannt geworden. Die einfachste davon ist das Aufpipettieren einer
Lösung,
die Analyt und Matrix enthält,
auf einen gereinigten, metallischen Probenträger. Der Lösungstropfen bildet auf der
Metalloberfläche
(oder seiner Oxidschicht) eine Benetzungsfläche, deren Größe auf hydrophilen
Oberflächen
einem Mehrfachen eines Tropfendurchmessers entspricht. Die Größe hängt von
der Hydrophilie und Mikrostrukturierung der Metalloberfläche und
von den Eigenschaften des Tröpfchens,
insbesondere des Lösungsmittels,
ab. Es bildet sich dabei nach dem Auftrocknen der Lösung ein
Probenfleck aus kleinen Matrixkriställchen in der Größe dieser
Benetzungsfläche,
wobei sich in der Regel aber keine gleichmäßige Belegung der Benetzungsfläche zeigt.
Die Kriställchen der
Matrix beginnen in wässrigen
Lösungen
in der Regel am Innenrand der Benetzung auf der Metallplatte zu
wachsen. Sie wachsen zum Inneren der Benetzungsfläche hin.
Häufig
bilden sie strahlenartige Kristalle, wie zum Beispiel bei 2,5-Dihydroxybenzoesäure (2,5-DHB) oder 3-Hydroxypicolinsäure (HPA), die
sich zum Inneren des Flecks hin oft von der Trägerplatte abheben. Bei Verwendung
von 2,5-DHB ist das Zentrum des Flecks häufig leer oder mit feinen Kriställchen bedeckt,
die aber oft wegen ihrer hohen Konzentration an Alkalisalzen kaum
für die
MALDI-Ionisierung brauchbar sind. Die Beladung mit Analytmolekülen ist
sehr ungleichmäßig. Diese
Belegungsart erfordert daher während
der MALDI-Ionisierung eine visuelle Betrachtung der Probenträgeroberfläche durch
ein Videomikroskop, das bei den meisten kommerziell erhältlichen
Massenspektrometern für
diese Art von Analysen zu finden ist. Ionenausbeute und Massenauflösung schwanken
im Probenfleck von Ort zu Ort. Es ist oft ein mühsamer Vorgang, eine günstige Stelle
des Probenflecks mit guter Analytionenausbeute und guter Massenauflösung zu finden,
und nur Erfahrung und Ausprobieren helfen hier bislang weiter.
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Es
gibt zwar Steuerprogramme für
Massenspektrometer mit Algorithmen zum automatisierten Aufsuchen
der besten Flecken für
die MALDI-Ionisierung, doch sind diese Verfahren mit ihren vielen
Versuchen und Bewertungen notwendigerweise recht langsam. Bei anderen
Auftragungsmethoden ist die Matrixsubstanz bereits vor dem Aufbringen
der Lösungsmitteltröpfchen,
die nun nur die Analytmoleküle enthalten,
auf der Trägerplatte
vorhanden.
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Ist
die Oberfläche
der Probenträgerplatte nicht
hydrophil, sondern hydrophob, so werden zwar kleinere Kristallkonglomerate
gebildet, aber die Tröpfchen
tendieren dazu, beim Eintrocknen in unkontrollierbarer Weise zu
wandern. Der Ort der Kristallkonglomerate ist daher nicht vorauszusagen
und erfordert eine Suche beim MALDI-Prozess. Außerdem besteht die große Gefahr,
dass sich Tröpfchen vereinigen
und so eine getrennte Analyse der Proben unmöglich machen.
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Der
Stand der Technik kennt zahlreiche Verfahren, mit denen auch kleinste
Analytmengen einer MALDI-Analyse zugänglich gemacht werden können und
die es gestatten, MALDI-Probenträgerplatten
in kurzer Zeit mit einer Vielzahl von Analyten zu belegen sowie
einer automatischen MS zugänglich
zu machen. So beschreibt die
DE 196 28 178 C1 ein Verfahren, bei dem eine
MALDI-Probenträgerplatte bereits
mit einer Matrixschicht belegt ist und viele Analyten gleichzeitig – beispielsweise
mit Hilfe einer Multipette – aufgetragen
werden. Da die auf der Matrix frei gesetzten Probentröpfchen mit
Durchmessem von 200 μm
bis 600 μm
sehr klein sind, sind sehr geringe Analytmengen ausreichend. Allerdings
ist es mit dieser Technik nicht möglich, die Oberflächen, auf denen
sich der oder die Analyten befinden, im Mikromaßstab zu untersuchen. Die
DE 197 54 978 A1 beschreibt
eine Methode zur Herstellung und Beladung von MALDI-Probenträgern, bei
dem der Probenträger
aus einem elektrisch leitfähigen
Material besteht, dessen Oberfläche
hydrophob gemacht wird. Anschließend werden rasterförmig angeordnete
hydrophile Ankerbereiche für
die Analyten erzeugt und die hydrophile Lösung der Analyten aufgebracht.
Auch mit diesem Verfahren ist es nicht möglich, Oberflächen, die
Analytengemische enthalten, im Mikromaßstab zu untersuchen. Die Kopplung
von Dünnschichtchromatographie
und Massenspektrometrie wird in der
DE 199 37 438 C2 dargelegt: Dort werden Analyten
auf einer DC-Platte getrennt, die gleichzeitig als Trägerplatte
für die
sich daran anschließende
MS dient; im Anschluss an die DC wird die Trägerplatte mit Matrixlösung versehen
und massenspektrometrisch untersucht. Da die Tröpfchen mit Matrixlösung Durchmesser
zwischen 10 und 50 μm
aufweisen, sind sie für
massenspektrometrische Verfahren mit einer Auflösung von 1 μm zu groß. Die
DE 44 08 034 C1 beschreibt
ein Verfahren zur MALDI-Analyse von Proben, die zuvor mittels 2D-Gelelektrophorese
getrennt wurden. Hierbei werden Probenträgerplatten eingesetzt, die
mit einer optisch glatten, adsorptiven Matrixschicht überzogen
sind. Die Analytproben werden durch direkten Kontakt, bevorzugt
durch elektrophoretischen Transport, von der feuchten Elektrophoreseplatte
auf die Matrix übertragen,
wobei die zweidimensionale Verteilung der Analyten erhalten bleibt.
Die Matrixschicht hat dabei eine Dicke von 300 nm bis 600 nm.
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In
der
DE 100 27 794
A1 wird ein Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen über MALDI-TOF-MS
beschrieben, bei dem eine Matrix und Analyt enthaltende Lösung mit
Hilfe eines Nanoplotters auf ein poliertes, beschichtetes oder bedampftes
Trägermaterial
aufgebracht wird. Dies führt jedoch
zu einer inhomogenen Verteilung des Analyten im auf der Matrix abgesetzten
Probentropfen. Die Herstellung strukturierter Bioprobenträger für die MS-Analyse
ist in der
DE 100
43 042 A1 offengelegt. Dort werden Lösungen aus Biomolekülen und
Matrixsubstanzen auf hydro- oder lyophobe Oberflächen aufgebracht, die hydrophile
Ankerbereiche sowie Affinitätssorbentien
für die
Biomoleküle
enthalten. Auf den hydrophilen Ankerbereichen bilden sich feinkristalline
Matrixkristalle, in die zumindest zum Teil Biomoleküle eingebunden
sind. Ein homogener Einbau der Biomoleküle in die Matrix lässt sich
auf diese Weise jedoch nicht erzielen.
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Des
Weiteren kennt der Stand der Technik Verfahren zur Ionisierung hochmolekularer
Analyte. Die
DE 198
34 070 A1 beschreibt ein solches Verfahren. Da dort flüssige Matrices
verwendet werden, wobei die Matrixflüssigkeit aus einem Ether-Polyol
oder einem Polyether-Polyol besteht, ist die Untersuchung kristalliner
Oberflächen
mit diesem Verfahren nicht möglich.
Die
DE 196 17 011
A1 beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung von Ionen hochmolekularer
Analyte mittels MALDI, bei der die Matrix aus mindestens zwei Komponenten
besteht, von denen eine Komponente durch die Einwirkung der Laserstrahlung
zersetzt wird (Sprengstoff). Hierdurch eignet sich die Methode auch
für Laserfoci
mit Durchmessern im Bereich zwischen 3 μm und 10 μm; innerhalb dieses Fokusdurchmessers
wird jedoch die gesamte Schicht auf einmal bis auf den Probenträger darunter
abgetragen. Damit ist die Methode nicht für eine dreidimensionale Analyse
geeignet.
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In
der
US 5,808,300 wird
ein Verfahren für die
MALDI-Analyse biologischer Proben offenbart. Dabei wird eine Lösung der
zu analysierenden Moleküle
hergestellt und über
Kapillarelektrophorese als lineare Spur auf einem elektrisch leitfähigen Trägermaterial
abgeschieden und getrocknet. Optional kann die Matrix mit dem Analytmaterial
angelöst
und rekristallisiert werden. Diese Methode ist jedoch nur bis zu
Laserfoci größer oder
gleich 25 μm
einsetzbar und daher nicht für
Oberflächenanalysen
im Mikromaßstab
geeignet. In der
DE
102 07 615 A1 wird eine Methode zur Herstellung ultraphober
Oberflächen beschrieben,
auf der hydrophile und/oder oleophile Bereiche reversibel erzeugt
werden können.
Auf diesen Oberflächen
werden zunächst
Lösungen
von MALDI-Matrices abgeschieden und anschließend Analytlösungen aufgebracht.
Durch das Anläsen
und Rekristallisieren der Matrix werden die Analyten in die MALDI-Matrix
eingebaut.
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Die
WO 03/040 715 A offenbart
ein Verfahren zur Präparation
von Proben für
die Massenspektrometrie, insbesondere für MALDI-MS, bei welchem der
Analyt und die Matrix gleichzeitig auf dem Probenträger getrocknet
werden. Dabei kommt es zwingend zu einer Vermischung des Analyts
mit dem Matrixmaterial vor der Trocknung, was zu einer Wanderung
der Analytmoleküle
in der Matrix und somit zu einer Veränderung des dreidimensionalen
Aufbaus der Analytschicht führt.
Eine richtungskontrollierte Inkorporation des Analyts in das Matrixmaterial
erfolgt daher auch bei diesem Verfahren nicht, so dass die Lateralauflösung einer
mit diesen Proben durchgeführten
SMALDI-MS sehr gering ist.
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Aus
der
DE 199 49 735
A1 ist ein Verfahren für
das Prozessieren von Probenmolekülen
in kleinen Mengen von Flüssigkeiten
bekannt, bei dem das Prozessieren in frei auf lyophilen Anken einer
ansonsten lyophoben Trägeroberfläche stehenden
oder an diesen hängenden
Tropfen stattfindet. Dabei bilden der durch die Oberflächenspannung
zusammengehaltene Tropfen, der lyophile Anker, der lyophobe Rand des
Ankers und das den Tropfen umgebende Gas einen Mikroreaktor. Die
anschließende
Probenvorbereitung für
die MS erfolgt ähnlich
zu dem in der
WO 03/040
715 A offenbarten Verfahren. Demnach werden die Trägerplatten,
auf deren lyophilen Ankern mit Trypsin verdaute Protein adsorbiert
sind, mit einer Lösung
kontaktiert, wodurch die später
mit MS zu analysierenden Verdaupeptide der Trägerplatte desorbiert werden
und sich mit der Lösung
vermischen. Dies führt
jedoch auch hier zwangsläufig
zu einer Wanderung der Analytmoleküle in dem Lösungsmittel und somit zu einer
Veränderung
des dreidimensionalen Aufbaus der Analytschicht. Ein richtungskontrollierter
Einbau in die Matrix ist somit auch hier nicht möglich.
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Auch
bei dem in der
GB 2
235 529 A offenbarten Verfahren kommt es zu einer Vermischung des
Analyts mit derm Matrixmaterial derart, dass der dreidimensionale
Aufbau der Analytschicht durch eine hinsichtlich der Richtung nicht
kontrollierte Wanderung der Analytmoleküle in die Matrixschicht verändert wird.
Dabei wird zunächst
ein Substrat auf einen Träger
aufgebracht und daran gebunden, bevor ein in einem Lösungsmittel
gelöster
Analyt auf das Substrat aufgetragen und solange inkubiert wird,
bis der Analyt an das Substrat bindet. Anschließend wird auf das Substrat
ein Tropfen eines in einem Lösungsmittel
gelösten
Matrixmaterials appliziert, wobei das Lösungsmittel Oberflächenschichten
des Substrats mit daran gebundenem Analyt auflöst. Dadurch wird der Analyt
mit dem Matrixmaterial in dem Flüssigkeitstropfen
innig vermischt.
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Für das in
der
DE 199 23 761
C1 offenbarte Verfahren sind innenaustauschende Ankerbereiche auf
dem Probenträger
wesentlich. Hier wird der Analyt in einem Lösungsmittel gelöst und mit
einem ebenfalls in Lösung
befindlichen Matrixmaterial vermischt, bevor diese Mischung getrocknet
wird. Daher ist auch hier kein richtungskontrollierter Einbau des Analyts
in die Matrix gegeben.
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Gleiches
gilt für
die aus der
DE 41 43
071 C2 , der
GB
2 235 528 A sowie der
GB 2 236 184 A bekannten Verfahren. Bei diesen
wird jeweils eine Analytlösung
mit einem Matrixmaterial in Kontakt gebracht, weshalb keine richtungskontrollierte
Inkorporation des Analyts in die Matrix möglich ist.
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Schließlich offenbart
die
DE 196 18 032
C2 ein Verfahren, das Probenträger, die eine vorpräparierte
Matrixschicht aufweisen und die von einer lackartigen Komponente
dicht umschlossen sind. Hier erfolgt die Zugabe des Analyten erst
nach Aufbringung der Matrix.
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Bei
allen Methoden des Standes der Technik mit Ausnahme der
US 5,808,300 wird die Lösung des Analyten
entweder auf einen schon vorher mit Matrix präparierten Probenträger aufgebracht,
oder Matrix- und Analytlösung
werden gemeinsam aufgebracht. Bei diesen Vorgehensweisen kommt es
zwangsläufig zum
Wandern der Analytmoleküle
in der Matrixschicht. Der dreidimensionale Aufbau der Analytschicht
wird dabei in jedem Fall verändert:
Analytmoleküle,
die vor dem Einbau in die Matrix beispielsweise in Richtung der
x-Koordinate in der Reihenfolge A, B, C vorlagen, können nach
dem Einbau in die Matrix z. B. in der Reihenfolge B, C, A vorliegen.
Dies gilt für alle
drei Raumrichtungen, so dass mit den Verfahren des Standes der Technik
eine Richtungskontrolle des Einbaus der Analyten in die Matrix nicht
möglich
ist. Auch die in der
US 5,808,300 beschriebene
Technik, Matrices auf Analyten in Form von Gewebeschnitten aufzubringen,
erlaubt keine solche Richtungskontrolle des Einbaus der Analyten
in die Matrix und gestattet bei der MALDI-Messung daher keine räumlichen Auflösungen im
Bereich von 1 μm.
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Die
vorliegende Erfindung gestattet es erstmals, zu analysierende Substanzgemische
solchermaßen
für die
Massenspektrometrie zu präparieren, dass
Analytmoleküle
richtungskontrolliert in die Matrix eingebaut werden, wobei sich
die räumliche
Umverteilung von Analytmolekülen
in der Matrix in derart engen Grenzen hält, dass bei der scannenden
Mikrosonden-Matrix-assistierten Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektrometrie
eine räumliche
Verschiebung kleiner oder gleich 3 μm ergibt.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Präparation
von Analyten für
die Massenspektrometrie bereit zu stellen, das die Nachteile des
Standes der Technik im Hinblick auf die Größe der Matrixkristalle vermeidet
und einen richtungskontrollierten Einbau der Analytmoleküle in die
Matrix gewährleistet,
wobei unter richtungskontrolliertem Einbau verstanden wird, dass
die Analytmoleküle
in allen drei Raumrichtungen im Wesentlichen in derjenigen relativen
Position zueinander eingebaut werden, in der sie vor Einbau in die
Matrix vorlagen.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren, bei dem zuerst der Analyt auf einen Probenträger aufgebracht,
danach die Matrix auf dem bei Raumtemperatur und Normdruck im Wesentlichen
festen Analyten abgelagert und zuletzt der Analyt oder die Analyten
durch Bedampfung der Matrixschicht mit einem dampfförmigen Lösungsmittel für die Matrix
inkorporiert werden.
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Aufgabe
der Erfindung ist es ferner, eine Vorrichtung zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens
vorzusehen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch den Gegenstand von
Anspruch 15.
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Vorteilhafte
Ausgestaltungen der Vorrichtung ergeben sich durch die Unteransprüche 16 bis
19, wobei die Vorrichtung gemäß Anspruch
17 den Vorteil aufweist, dass die Dicke der Matrix kontrollierbar ist
und die Vorrichtung gemäß Anspruch
18 den Vorteil aufweist, dass der Grad der Integration des Analyten
kontrollierbar ist, so dass insgesamt eine Qualtitätskontrolle
der Präparation
gewährleistet
ist. Die Vorrichtung gemäß Anspruch
19 weist den Vorteil auf, dass damit ein hoher Durchsatz der Präparation erzeugt
werden kann, in dem die Präparation
vergleichbar einer Fließbandproduktion
oder einer Produktion an Rundtischen abläuft.
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Unter
Analyt wird dabei ein Gemisch aus mindestens einer Substanz verstanden,
wobei diese mindestens eine Substanz chemischen und/oder biologischen
und/oder biochemischen Ursprungs ist.
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Dem
Fachmann ist bekannt, dass es sich bei einem Probenträger für die Massenspektometrie
um eine Vorrichtung handelt, die den oder die Analyten aufnimmt
oder auf welchem der Analyt oder die Analyten sowie die Matrix aufgebracht
werden.
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Dem
Fachmann ist bekannt, dass es sich bei der Matrix im Zusammenhang
mit der Matrix-Assistierten Laser Desorptions-Ionisations Massenspektrometrie
(MALDI-MS) um eine Substanz handelt, deren Energieabsorption auf
die Wellenlänge
des Desorptionslasers abgestimmt ist, so dass die Matrix die Energie
des Laserlichtes aufnimmt und den oder die in der Matrix eingebetteten
Analyten mit desorbiert und protoniert, weshalb der Analyt ohne
Fragmentierung in die Gasphase gelangt und analysiert werden kann.
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Die
erfindungsgemäße Präparationsmethode
für die
Mikrobereichsanalytik der Zusam mensetzung von Substanzgemischen
vermeidet die Nachteile des Standes der Technik, indem in einem
ersten Schritt der oder die Analyten auf den Probenträger aufgebracht
werden, im zweiten Schritt die Matrix aufgebracht wird und in einem
dritten Schritt die Inkorporation des oder der Analyten in die Matrix
erfolgt. Aufbringen der Matrix und Inkorporation des Analyten erfolgen
dabei nacheinander und nicht zeitgleich.
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Dem
Fachmann sind zahlreiche Methoden bekannt, mit denen Analyten und/oder
Matrixsubstanzen auf Probenträger
aufgebracht werden können.
Diese Methoden eignen sich sowohl zur Aufbringung des Analyten auf
den Probenträger
(erster Schritt der erfindungsgemäßen Präparationsmethode) als auch
zur Aufbringung der Matrix (zweiter Schritt der erfindungsgemäßen Präparationsmethode),
wobei für
die Aufbringung von Analyt und Matrix jeweils dieselbe oder unterschiedliche
dieser bekannten Methoden verwendet werden können. Diese dem Fachmann bekannten
Methoden sind im Folgenden als Methoden zur Aufbringung der Matrix
angegeben, wobei dem Fachmann bekannt ist, dass er sie auch zur
Aufbringung des oder der Analyten verwenden kann. Bei der erfindungsgemäßen Präparationsmethode
wird die Matrix bevorzugt als Feststoff aufgedampft und anschließend auf
dem oder den Analyten abgelagert. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass
er die Methode des Aufdampfens ebenso zur Aufbringung des Analyten
verwenden kann.
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Die
Integration des Analyten in die Matrix erfolgt beim erfindungsgemäßen Verfahren,
indem der Probenträger
nach dem Aufdampfen der Matrix einem Lösungsmitteldampf ausgesetzt
wird, wobei bevorzugt solche Lösungsmittel
zur Erzeugung des Dampfes verwendet werden, in denen sich die Matrixsubstanz
löst.
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Optional
kann die Matrix, beispielsweise im Falle oxidations- oder zersetzungsempfindlicher Analyten,
einem Gas-Dampf-Gemisch ausgesetzt werden. Dieses Gas-Dampf-Gemisch besteht aus
einem inerten, bei Reaktionsbedingungen nicht kondensierbaren Trägergas („Gas") sowie einer unter Reaktionsbedingungen
kondensierbaren Komponente („Dampf"). Unter inert sind
dabei solche Gase zu verstehen, die im kondensierten Dampf nicht
löslich
sind. Unter Reaktionsbedingungen wird hierbei die gewählte Kombination
aus Druck und Temperatur verstanden.
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Um
die Matrix mit Hilfe des Bedampfungsverfahrens auf den Probenträger aufzubringen,
auf dem sich bereits der oder die Analyten befinden, wird die Matrixsubstanz
in einer Vakuumkammer, die in einem Druckbereich von Atmosphärendruck
bis 1·10–7 mBar evakuiert
werden kann, in einem Behälter
erhitzt. In diesem Druckbereich kann die Matrixsubstanz in die Gasphase
sublimieren und schlägt
sich auf derjenigen Seite des Probenträgers nieder, auf dem sich der
Analyt befindet, wobei der Probenträger in einem Abstand von 5
bis 40 mm über
dem Behälter installiert
ist. Die Installation des Probenträgers erfolgt dabei derart,
dass die Matrixsubstanz sich beim Niederschlagen auf dem oder den
Analyten ablagert. Das Aufdampfen der Matrix erfolgt erfindungsgemäß bei solchen
Drücken
und Temperaturen, bei denen das Matrixmaterial aus dem Vorratsbehälter sublimiert
und sich auf dem Probenträgermaterial
niederschlägt,
ohne dass Matrixsubstanz und/oder Analyt sich zersetzen. Zur Temperaturkontrolle
des Behälters
kann ein Thermofühler
an der Außenwand
des Behälters
angebracht werden. Es sind ein Druckbereich von ca. 100 mBar bis
etwa 1·102 mBar und ein Temperaturbereich von 20°C bis 130°C zu wählen, so
dass innerhalb von 2–15
Minuten eine amorphe Schicht Matrix über dem oder den Analyten auf
dem Probenträger
abgeschieden wird. Die Dicke der abgeschiedenen Matrixschicht kann
beispielsweise dem Fachmann bekannte Methoden wie Massenbestimmung
(Schwingquarzmessung), mechanische Abtastung (Tastschnittverfahren),
optische Interferometre (Tolanski-Interferometer), Elektronenmikroskopie,
Rastertunnelmikroskopie, Rastersondenmikroskopie oder Laserscanning-Mikroskopie bestimmt werden.
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Dieser
zweite Schritt der Präparation
kann auch durch andere dem Fachmann bekannte Techniken ersetzt werden,
die die räumliche
Verteilung des Analyten auf der Oberfläche des Probenträgers nicht oder
nur innerhalb der Auflösung
des Massenspektrometers verändern.
Dazu gehören
Methoden, die die Matrix in einem geeigneten Lösungmittel mit einem Gasstrom
oder mit einem elektrischen Potential versprühen (Elektrospray), Matrix
durch mechanisches Verteilen des Feststoffes aufbringen, durch Stempeln
oder Drucken, Thermotransferverfahren, Laserdruckverfahren, Tintenstrahldruckverfahren, Aufbringen
der Matrix durch Molekularstrahlepitaxie, Elektrodiffusion oder
elektrochemisches Abscheiden. Um die Matrix mittels eines Gasstroms
zu versprühen,
wird die Matrix in einem Lösungsmittel
gelöst und
mittels eines Gasstromes aus einem Lösungsmittelreservior durch
eine Düse
fein zerstäubt
(Gasstrom). Die entstehenden Tropfen im Mikrometerbereich lagern
sich auf dem oder den Analyten ab und trocknen dort sofort ein.
Dem Fachmann ist bekannt, dass durch die Wahl des Abstandes zwischen
Düse und
Probenträger
die Menge des Lösungsmittels,
die die Probe erreicht, bestimmt werden kann und damit auch die
Migration des Analyten auf der Oberfläche. Alternativ können die
Tropfen durch ein elektrisches Feld zwischen Düse und Probenoberfläche erzeugt werden.
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Die
Verfahren werden beispielsweise beschrieben in Herbert Budzikiewicz:
Massenspektrometrie. Eine Einführung.
4. Aufl., VCH, Weinheim, 1998 oder F. Lottspeich, H. Zorbas: Bioanalytik, Spektrum
Akademischer Verlag, 1. Aufl. 1998. Weiterhin können die Matrix-Lösungsmitteltröpfchen auch
durch dem Fachmann bekannte Ultraschallverneblung erzeugt werden.
Hierbei werden aus einem Reservoir an Matrixlösung durch Ultraschall Tröpfchen aus
der Oberfläche
der Matrixlösung
herausgelöst.
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Eine
weitere dem Fachmann bekannte Möglichkeit
zum Auftragen der Matrix ist die mechanische Verteilung der Matrix
durch beispielsweise einen Schaber oder einen Spatel, indem die
Matrix auf die Probe geschüttet
und mit Hilfe des Spatels fein verteilt wird. Die Matrix kann auch
mit Hilfe eines Stempels, auf den die Matrix aufgetragen wird und
der dann auf den Probenträger
gedrückt
wird, oder anderer Druckverfahren auf den Probenträger aufgetragen
werden. Ein weiteres Druckverfahren ist das Laserdruckverfahren,
bei dem die Matrix mit einer Walze auf den Probenträger aufgetragen
und mit einem Laserstrahl erhitzt wird, um auf der Oberfläche zu haften.
Des Weiteren kann die Matrix durch Thermotransfer- oder Tintenstrahldruckverfahren
auf den Probenträger
aufgebracht werden. Die Matrix wird in gelöster Form in einem Reservoir
entweder kurzzeitig erhitzt und durch die Expansion durch eine Düse auf der
Probenträger
gesprüht
oder mit Hilfe eines Piezokristalls durch Anlegen einer elektrischen
Spannung auf den Probenträger
gesprüht.
Die genannten Druckverfahren sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise
in „Der
Brockhaus. Naturwissenschaft und Technik", Version 3.0, CD-ROM, Bibliographisches
Institut & F.A.
Brockhaus AG, Mannheim; Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg,
2003 nachgeschlagen werden.
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Um
eine verbesserte Integration des Analyten in die aufgedampfte Matrixschicht
zu erreichen, werden die Probenträger in einem zweiten Schritt
einer feuchten Umgebung ausgesetzt, so dass ein ausreichender Einbau
des Analyten in die Matrix geschieht und gleichzeitig Migration
minimiert wird. Dies wird erreicht, indem die aufgebrachte Matrixschicht
einem Lösungsmitteldampf
ausgesetzt wird.
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Der
Probenträger
wird dazu zusammen mit einem Lösungsmittelreservoir,
in dem sich ein oder mehrere Lösungsmittel
befinden, in einen gasdichten abgeschlossenen Behälter gegeben.
Dabei ist ein Lösungsmittel
oder Lösungsmittelgemisch
zu wählen,
in welchem die Matrixsubstanz löslich
ist. Das Lösungsmittelreservoir
wird erhitzt, so dass sich in dem Behälter und damit auch über dem
Probenträger ein
Lösungsmitteldampf
ausbildet, wobei bis zur Sättigung
der Behälteratmosphäre mit Lösungsmitteldampf
erhitzt wird. Der Probenträger
kann bis zu 14 Tagen in dem Behälter
verbleiben. Das Ausmaß des richtungskontrollierten
Einbaus des oder der Analyten ist hinreichend, wenn die Matrixteilchen
eine Größe aufweisen,
die in etwa der Auflösung
des gewünschten,
bei der späteren
SMALDI-Messung einzusetzenden Lasers von 0,5 μm bis 3 μm entspricht.
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Die
hinreichende Integration des oder der Analyten in die Matrix kann
beispielsweise durch dem Fachmann bekannte Methoden wie Polarisationsmikroskopie,
Lichtmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie kontrolliert werden.
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Das
Bedampfen der Matrix mit einem Lösungsmitteldampf
löst wahrscheinlich
eine Umkristallisation der Matrixschicht aus. Bei der Kontrolle
des Grades der Umkristallisation der Matrix mit Hilfe der Polarisationsmikroskopie
wird die Absoprtion polarisierten Lichtes gemessen. Umkristallisierte
Bereiche der Matrix erscheinen im Polarisationsmikroskop in unterschiedlichen
Farben, da die spektrale Absorption von Einstrahlrichtung und Wellenlänge abhängig ist.
Vor der Umkristallisation erscheint die Matrixschicht gleichmäßig weiß oder grau
im polarisierten Licht. Die Umkristallisation ist abgeschlossen,
wenn im polarisierten Licht farbige Bereiche mit Ausdehnungen im
Bereich von mindestens 0,5 Mikrometern entstanden sind.
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Mit
Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie kann der Grad der Umkristallisation
verfolgt werden, indem die laterale Gleichmäßigkeit der mikroskopischen Verteilung
von Matrix und Analyt verfolgt wird, welche bei unterschiedlichen
Wellenlängen
fluoreszieren. Während übliche Matrixsubstanzen
meist eine natürliche
Fluoreszenz aufweisen, können
beispielsweise Peptide oder Proteine, die Tryptophan enthalten, über dessen
natürliche
Fluoreszenz beobachtet werden. Des Weiteren sind Methoden bekannt,
um eine Fluoreszenzmarkierung beliebiger Peptide oder Proteine durchzuführen, um
so bei geeigneten Wellenlängen
die Fluoreszenzen von Matrix und Proteinen beobachten zu können. Neben
der lateralen Gleichmäßigkeit
kann außerdem
die erzielte mikroskopische Durchmischung von Analyt und Matrix
kontrolliert werden, indem in der Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie
vor der Umkristallisation nur die bedeckende Matrixschicht beobachtet
wird, während
nach der Umkristallisation sowohl Matrix als auch Analyt über deren
Fluoreszenzsignale beobachtet werden können.
-
Des
Weiteren lässt
sich das Einwirken des Lösungsmitteldampfes
auf die Matrixschicht mit Hilfe einer Quarzwaage verfolgen, indem
die Frequenzverschiebung während
der Befeuchtungsphase bestimmt wird: Die Masse der aufgedampften
Matrixschicht nimmt durch Lösungsmittelaufnahme
zunächst
zu und anschließend
während
der Umkristallisation der Matrix wieder ab. Die Umkristallisation und
der Einbau des Analyten können als
erfolgreich angesehen werden, wenn die Aufnahme von Lösungsmittel über einen
Zeitraum von mehreren Stunden oder Tagen, bevorzugt 3 Stunden bis
14 Tagen, verlief.
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Auf
Grund der guten Löslichkeit
der Matrixsubstanz in dem Lösungsmittel
bzw. in dem Lösungsmittelgemisch
bewirkt der Lösungsmitteldampf
eine Umkristallisation der Matrix. Bei diesem Prozess wird der Analyt
auf der Oberfläche
des Probenträgers
mit in die Matrixschicht eingebaut. Da die Matrixschicht eine Dicke
von 0,5 μm
bis maximal 3 μm
aufweisen sollte, kann durch die Dauer des Umkristallisationsprozesses
die Migration des Analyten derart beschränkt werden, dass der Analyt
zwar vollständig
in die Schicht eindringt, aber sich nicht mehr als ca. 1 μm bis 3 μm von seinem
ursprünglichen
Ort wegbewegt (siehe 18). Die Erzeugung des Lösungsmitteldampfes
kann genauso durch dem Fachmann bekannte Verfahren zum Versprühen des
Lösungsmittels
(siehe auch Versprühen
der Matrix) oder Vernebeln durch Ultraschallverneblung erfolgen
(siehe auch Ultraschallvernebelung der Matrix).
-
Die
Umkristallisation der Matrixschicht kann durch Temperatur und Druck
innerhalb des Behälters beeinflusst
werden. Bei Temperaturen im Bereich von 40 bis 80°C kann eine
Umkristallisation der Schicht innerhalb von 1 bis 5 Tagen beobachtet
werden, wobei die Kontrolle der Umkristallisation wie oben beschrieben
beispielsweise mittels Licht-, Polarisations- oder Fluoreszenzmikroskopie
doer mit Hilfe einer Quarzwaage erfolgt. Durch Erhöhung der
Temperatur kann der Vorgang beschleunigt werden, wobei die Temperatur
so zu wählen
ist, dass chemische Reaktionen und/oder Zersetzungen des oder der Analyten
vermieden werden. Alternativ oder zusätzlich zur Temperaturerhöhung kann
die Umkristallisation auch durch eine Erhöhung des Druckes im Behälter beschleunigt
werden.
-
Durch
beide Schritte der Präparation,
d. h. durch das Aufbringen der Matrix und die anschließende Umkristallisation,
wird eine Matrixschicht erhalten, die sowohl die notwendige Voraussetzung
der Inkorporation des oder der Analyten in die Matrix erfüllt, als
zu einem richtungskontrollierten Einbau des Analyten in die Matrix
führt.
-
Bei
der ortsaufgelösten
Analyse von biologischen oder synthetischen Proben ist die Präparation der
Probe ein entscheidender Schritt, der die erreichbare Empfindlichkeit,
die Massenauflösung
und die effektive räumliche
Auflösung
der Messung limitiert. Unter effektiver räumlicher Auflösung wird
dabei die Auflösung
verstanden, die mit Hilfe des Massenspektrometers (auflösungsbestimmend:
Laserfokus) und der Präparation
der Probe (auflösungsbestimmend: Migration
des oder der Analyten) erreicht werden kann.
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Es
existiert ein prinzipieller Unterschied zwischen einer standardisierten
MALDI-MS Präparation gemäß dem Stand
der Technik und der Präparation einer
Oberfläche
für die
massenspektrometrische Analytik. Bei der Präparation nach einem Verfahren gemäß dem Stand
der Technik liegen der Analyt oder die Analyten in der Regel in
gelöster
Form vor oder werden in eine gelöste
Form gebracht. Dies erleichtert die notwendigen Voraussetzungen
für eine
MALDI-Präparation
erheblich, da in diesem Fall die Probe mit der Matrix gemischt werden
kann oder eine Vermischung des oder der Analyten sowie Matrix auf dem
Probeteller vor dem Auskristallisieren stattfindet. Dadurch findet
eine Separation der einzelnen Analytmoleküle voneinander durch die Matrix
statt. Dem Fachmann ist bekannt, dass die Matrix in einem molaren Überschuss
von etwa 100:1 bis 100000:1 vorliegen vorliegen sollte, um so die
Analytmoleküle räumlich zu
trennen und dadurch die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen
den Analytmolekülen
zu minimieren. Wenn die zu untersuchenden Substanzen auf einer Oberfläche liegen
und/oder an diese Oberfläche
gebunden sind, muss bei der Präparation
erreicht werden, dass eine ausreichende Vermischung des Analyten
und der Matrix stattfindet, um die räumliche Trennung der Moleküle zu gewährleisten.
Eine Bindung an Oberflächen
kann beispielsweise, aber nicht erschöpfend, mittels sog. Anker oder über Beads
stattfinden. Dem Fachmann ist. bekannt, dass eine Vermischung mit
der Matrix prinzipiell nur möglich
ist, wenn die Analyten in der festen Phase auf der Oberfläche vorliegen,
so dass die Matrix in gelöster
Form auf die Oberfläche
einwirken und den oder die Analyten lösen muss. Dies bedeutet gleichzeitig,
dass bei einer MALDI-Präparation
gemäß dem Stand
der Technik die räumliche
Lokalisation der Substanzen durch diesen Schritt vollständig verloren
geht, da die Flüssigkeit
bis zu mehreren Minuten auf der Oberfläche verbleibt, bevor das Lösungsmittel
verdampft. Der Informationsgewinn, der durch die hohe räumliche
Auflösung
eines Gerätes mit
einem hoch fokussierten Laserstrahl und einer daraus resultierenden
räumlichen
Auflösung
im Bereich von möglichen
Fokusmaximum des Laserstrahls erzielt wird, geht dann durch die
Präparation im
Vorhinein verloren (vgl. Spengler B., Hubert, M.: Scanning microprobe
matrix-assisted laser desorption ionization (SMALDI) mass spectrometry:
instrumentation for sub-micrometer resolved LDI and MALDI surface
analysis, Journal of the American Society of Mass Spectrometry;
13 (2002) 735–748).
-
Es
ist also bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
darauf zu achten, dass das Ausmaß der Wegbewegung des Analyten
von seinem jeweiligen Auftragungsort geringer als der Durchmesser
des Laser- oder Ionenstrahlfokus des Massenspektrometer bleibt und
gleichzeitig ein Einbau der Analytmoleküle in die Matrix stattfindet,
um die so vorbereitete Probe in der rasternden Massenspektrometrie
verwenden zu können.
Unter rasternder Massenspektrometrie werden dabei solche massenspektrometrischen
Verfahren verstanden, bei denen der Laserstrahl oder die Ionenstrahlen
oder die Neutralteilchenstrahlen einerseits und Probenoberfläche andererseits
definiert und relativ zueinander bewegt werden, und zwar derart,
dass Massenspektren aller Bereiche der Probenoberfläche aufgenommen
werden und die erhaltenen Massenspektren ihrem jeweiligen Entstehungsort
auf der Probenoberfläche
zugeordnet werden können.
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Weiterhin
kann die vorbereitete Probe auch für mikroskopische Verfahren
der Massenspektrometrie verwendet werden. Darunter versteht man,
dass von der Probe mit Hilfe eines großflächigen Laserstrahls Ionen in
die Gasphase gebracht werden und mit Hilfe einer Ionenoptik diese
Ionen auf einen Detektor derart abgebildet werden, dass sich der
räumliche
Entstehungsort der Ionen und der Abbildungsort einander zuordnen
lassen. Unter großflächig wird
dabei ein Laserstrahl verstanden, der einen Bereich der Probenoberfläche beschießt, welcher
größer ist
als derjenige Bereich ist, in dem der Detektor Ionen im Hinblick
auf ihre unterschiedlichen Entstehungsorte auf der Probenoberfläche trennen
kann. Durch Auslesen einzelner Abbildungsorte des Detektors kann somit
ein Verteilungsbild der Ionen erstellt werden.
-
Dem
Fachmann sind zahlreiche Verfahren bekannt, mit deren Hilfe Analyten
auf einen Probenträger
aufgebracht werden können.
Hierzu zählt
beispielsweise das Aufsprühen
des gelösten
Analyten und anschließendes
Trocknen. Das Trocknen kann hierbei nach dem Fachmann bekannten
Methoden erfolgen, wie beispielweise, aber nicht erschöpfend, bei
Raumtemperatur und Normdruck, bei Temperaturen über Raumtemperatur und/oder
bei Drücken
unter Normaldruck sowie durch Lyophilisieren. Des Weiteren ist dem
Fachmann bekannt, dass biologische Proben, wie beispielsweise Zellen,
Zellbestandteile, Zellextrakte und Gewebeschnitte, durch Aufpressen,
Aufwachsen oder Aufkleben auf den Probenträger aufgebracht werden können. Es
ist ebenso möglich,
Zellen nach dem Fachmann bekannten Verfahren auf dem Probenträger aufwachsen
zu lassen, wobei der Fachmann weiß, dass er ein Probenträgermaterial
zu wählen
hat, auf welchem die aufzuwachsende Zelllinie haftet. Das Aufbringen
biologischer Proben ist beispielsweise in L. Li, R. W. Garden, E.
V. Romanova, and J. V. Sweedler: „In situ sequencing of peptides
from biological tissues and single cells using MALDI-PSD/CID analysis.", Analytical Chemistry;
71 (1999) 5451–5458
beschrieben.
-
Des
weiteren sind dem Fachmann Probenträger bekannt, deren Oberfläche mit
sog. Ankermolekülen
versehen sind, wobei diese Anker gezielt bestimmte Gruppen von Substanzen
aus einem Analytgemisch binden, andere Substanzgruppen jedoch nicht gebunden
werden. Des weiteren sind dem Fachmann Probenträger bekannt, deren Oberfläche mit
sog. Beads versehen sind, wobei diese Beads ihrerseits Ankermoleküle auf ihrer
Oberfläche
besitzen. Durch Ablagern der Beads mit einer Größe von wenigen Nanometern bis
in den Mikrometerbereich lassen sich zur Verfügung stehende Oberflächen die
mit Ankermolekülen
versehen sind stark vergrößern. Des
Weiteren kennt der Fachmann feste Träger, die beispielsweise aus
Kügelchen,
Nadeln, Kämmen oder
Wafern bestehen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
eignet sich für
alle dem Fachmann bekannten Matrixsubstanzen. Hierzu zählen beispielsweise,
aber nicht erschöpfend:
2-Aminobenzoesäure,
3-Aminobenzoesäure,
3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure
(Sinapinsäure),
alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA), 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA),
2,5-Dihydroxybenzoesäure
(2,5-DHB), 2,3-Dihydroxybenzoesäure, 2,4-Dihydroxybenzoesäure, 2,6-Dihydroxybenzoesäure, 3,4-Dihydroxybenzoesäure, 2,5-Dihydroxybenzoesäure, Picolinsäure, 2,4,6-Trihydroxyacetophenon,
2,3,4-Trihydroxyacetophenon, Nitrobenzylalkohol, Nikotinsäure, Ferulasäure, Kaffeesäure, Ellagsäure, cis-o-Cumarsäure, trans-o-Cumarsäure, cis-p-Cumarsäure, trans-p-Cumarsäure, 6-Aza-2-thiothymidin,
Harnstoff, Bernsteinsäure,
Adipinsäure, Malonsäure und
Malononitril.
-
Zur
Herstellung des Lösungsmitteldampfes zur
Umkristallisation der Matrixschicht sowie zur Herstellung dieser
Matrixschicht können
als kondensierbare Komponente dem Fachmann bekannte Lösungsmittel
wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend, Wasser, Methanol, Ethanol,
Aceton, Acetonitril, Propanol, Isopropanol, n-Butanol, iso-Butanol, tert.-Butanol,
Essigsäureethylester,
Benzol, Toluol, 1,2-Dimethylbenzol, 1,3-Dimethylbenzol, 1,4-Dimethylbenzol,
Cyclohexan, Cyclohexanol, Dichlormethan, Chloroform, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Dimethylformamid,
Diethylamin, Phenylethylamin verwendet werden. Weitere Lösungsmittel,
beispielsweise aus den Gruppen der Ester, Ether, Carbonsäuren, Amine,
Aliphaten, Aromaten, Araliphaten und Halogenaliphaten sowie Gemische
aus mindestens zwei Lösungsmitteln
sind dem Fachmann bekannt und können,
ohne den Schutzbereich der Patentansprüche zu verlassen, verwendet
werden. Dabei können diese
Lösungsmittel
ganz oder teilweise deuteriert sein, so dass beispielsweise an Stelle
von Wasser D2O eingesetzt werden kann, um
leicht ablösbare, saure
Protonen in der Matrix- und/oder Analytsubstanz gegen Deuteriumionen
ausgetauscht werden können,
wenn für
einen Austausch der Atmosphäre gesorgt
wird. Deuterierung und Austausch der Atmosphäre sind dem Fachmann bekannt
und können z.
B. in B. Spengler, F. Lützenkirchen,
R. Kaufmann: „On-target
Deuteration for Peptide Sequencing by Laser Mass Spectrometry", Organic Mass Spectrometry,
28 (1993), 1482–1490
nachgeschlagen werden. Zur Herstellung des Gas-Dampf-Gemisches sind
dabei solche Lösungsmittel
oder Lösungsmittelgemische
zu wählen,
in denen die gewählte
Matrixsubstanz löslich
ist.
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Im
Falle des Vorliegens von Analyten, die beispielsweise oxidationsempfindlich
oder leicht zersetzlich sind, kann optional zusätzlich zu dem verdampfbaren
Lösungsmittel
ein Inertgas verwendet werden. Als Inertgas eignen sich beispielsweise
Luft, Stickstoff, Helium, Neon, Argon, Krypton, Xenon, Kohlendioxid
sowie Gemische dieser Gase. Dem Fachmann ist bekannt, dass die Gaszusammensetzung
dieses Inertgases (Trägergases)
während
der Bedampfung verändert
werden kann, beispielsweise durch Austausch eines Gases gegen ein
anderes. So kann beispielsweise Luft gegen Stickstoff ausgetauscht
werden, um Oxidationsreaktionen zu vermeiden.
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Der
Fachmann kennt zahlreiche Probenträgermaterialien, die für die Aufbringung
von Analyten und Matrices für
massenspektrometrische Untersuchungen geeignet sind. Hierzu zählen beispielsweise,
aber nicht erschöpfend,
Gold, Aluminium, Stahl, Silicium, Teflon, Quarz, Metalle, Metalllegierungen, Metalloxide,
PVDF, Cellulose, regenerierte Cellulose, anionisch modifizierte
Cellulose, kationisch modifizierte Cellulose, Nylon, Nitrocellulose
und dem Fachmann bekannte funktionalisierte Oberflächen, die beispielsweise
mit Beads oder Ankermolekülen
beladen sein können.
Unter funktionalisierten Oberflächen
sind dabei solche chemischen Strukturen zu verstehen, welche Analyt-
und/oder Matrixmoleküle selektiv
physikalisch und/oder chemisch binden und/oder chemisch oder biochemisch
mit Anker- und/oder Matrixmolekülen
reagieren. Dem Fachmann ist bekannt, dass er im Falle der Verwendung von
Probenträgermaterialien,
die nicht elektrisch leitfähig
sind, diese mit einem elektrisch leitfähigen Material verbinden muss,
um einen für
die Massenspektrometrie geeigneten Probenträger zu erhalten, falls der
Probenträger
die erste Beschleunigungselektrode innerhalb des Massenspektrometers
darstellen soll. Dem Fachmann ist bekannt, dass Größe und Form
der Probenträger
(beispielsweise rund oder rechteckig) abhängig vom jeweiligen Messsystem und
von den zu messenden Proben ausgewählt werden müssen.
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Unter „mikroskopisch
strukturierten Proben" werden
dabei solche Proben verstanden, deren räumliche Dimensionen nur mit
einem Mikroskop aufgelöst
werden können,
d. h. dass die räumlichen
Dimensionen etwa 1 nm bis 200 μm
betragen.
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Als
hinreichend gleichmäßig werden
gemäß der vorliegenden
Erfindung solche Schichten bezeichnet, die ausschließlich solche
Inhomogenitäten aufweisen,
welche kleiner als der Laserfokus sind, bevorzugt kleiner al 3 μm.
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Dem
Fachmann ist bekannt, dass der Analyt bwz. die Analyten sowie die
Matrixsubstanz auch durch mehrmalige Wiederholung eines einzigen
Verfahrens und/oder durch Kombination mehrerer Verfahren zur Aufbringung
von Analyt bzw. Matrix aufgebracht werden können.
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Zur
Umkristallisation der Matrixschicht eignen sich dem Fachmann bekannte
Lösungsmittelreservoire
wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend: Behälter oder Becher die offen
sind, damit die Lösungsmitteldämpfe entweichen
können;
Materialien, die das Lösungsmittel
aufsaugen, wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend getränkte Tücher aus Papier, Textilmaterialien
oder Kunststoffen sowie Schwämme;
Behälter
oder Becher, aus denen das Lösungsmittel
versprüht
wird oder mittels Druck durch eine Düse oder eine Membran gedrückt wird; Behälter oder
Becher, aus denen mit Hilfe von Ultraschall Tröpfchen in die Gasphase befördert werden (Ultraschallvernebler).
Dem Fachmann ist bekannt, dass diese Lösungsmittelreservoire auch
bei der Präparation
der Matrixschicht einsetzbar sind.
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Werden
die Standardmethoden zur Probenpräparation in Hinblick auf Kristallgröße, Migration und
Verhalten des Analyten bei Einbau in den Kristall untersucht, so
zeigt sich, dass eine Auftrennung und damit eine Migration des Analyten
nach seiner Hydrophobizität
bzw. seiner Polarität
stattfindet. Da die Analyten, hier beispielsweise Peptide, eine
unterschiedliche Polarität
aufgrund ihrer Aminosäurezusammensetzung
vorweisen, ist ihre Affinität
zu den verschiedenen polaren Lösungsmitteln
unterschiedlich. Die Matrix ist in den meisten Fällen in einem Gemisch aus mehreren
Lösungsmitteln
gelöst
(z. B.: Wasser: polares Lösungsmittel,
Ethanol: schwach polares Lösungsmittel).
Bei der Auskristallisation der Probe wird aufgrund des höheren Dampfdruckes
zunächst
vorwiegend das unpolare Lösungsmittel
verdampft und es reichern sich die hydrophilen Anteile des Analyten
im flüssigen
Rest der Probe in der Mitte an, bevor auch dieser eintrocknet. Dieselben
Phänomene
finden auch im Mikromaßstab
statt. Gleichzeitig ist die Geschwindigkeit der Auskristallisation
ein entscheidender Faktor für
die Verhältnisse
in den Kristallen. Werden nun die einzelnen Kristalle untersucht
auf die Verteilung des Analyten, so stehen die gefundenen Ergebnisse
im Gegensatz zu den Untersuchungen die an Matrix-Kristallen von
Horneffer, V.; Forsmann, A.; Strupat, K.; Hillenkamp, F.; Kubitscheck,
U; Localization of analyte molecules in MALDI preparations by confocal
laser scanning microscopy, Analytical Chemistry; 73 (2001) 1016–1022 durchgeführt wurden.
Die Bilder, die von Kristallen mittels konfokaler Mikroskopie gemacht
wurden, weisen nicht auf eine unterschiedliche Verteilung der Analyten
innerhalb des Kristalls hin. Zu diesen Untersuchungen sind die Kristalle
allerdings über
einen viel längeren
Zeitraum gezüchtet
worden und erheblich größer, so
dass von einer Kristallisation aus dem chemischen Gleichgewicht
heraus ausgegangen werden kann. Eine inhomogene Verteilung wird
bei der MALDI-Matrixpräparation
offenbar erst durch die schnelle Eintrocknung der Probe verursacht.
Darauf weisen auch die Messungen in 6 hin.
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Dem
Fachmann ist ohne weiteres ersichtlich, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren
zur Präparation
von Analyten zur automatisierten Herstellung von Präparaten
für analytische
Messungen, bevorzugt für
massenspektrometrische Messungen, eignet.
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[Ausführungsbeispiele]
-
Ausführungsbeispiel
1 ("Migration in
Dried-droplet-Standardpräparation")
-
Die
Kristallisationsprozedur der sogenannten „Dried-droplet" Standardmethode
führt zu
einer etwa ein bis zwei Millimeter großen kreisförmigen Probe, deren Rand aus
größeren Kristallen
und deren innerer Bereich aus feineren Kristallen besteht. Vor der
Präparation
wird der Probenteller (Aluminiumträger mit 8 μm Goldbeschichtung, 20 mm Durchmesser)
wie unten beschrieben intensiv gesäubert, um eine Kontamination
des Tellers mit anderen Substanzen, insbesondere Natrium- und Kaliumionen,
zu vermeiden. Dazu wird auf den Probenteller 5 bis 10 mal 2 bis
5 ml verschiedener Lösungsmittel
(z. B.: Aceton (ACS, Merck, Darmstadt), Isopropanol (LiChrosolv,
Merck, Darmstadt), Wasser (ACS, Sigma-Aldrich, Frankfurt), Ethanol (Uvasol,
Merck, Darmstadt)) aufgetropft und mit einem staubund fusselfreien
Papiertuch (z. B. KimWipes, Kimberly-Clark, Neenah, USA) abgerieben.
Anschließend werden
2 bis 5 ml Ethanol auf den Probenträger getropft und unter einem
heißen
Luftstrom mittels eines Föns
bei ca. 80°C
getrocknet. Auf den noch handwarmen Probenträger werden 0,5 μl der Analytgemischlösung (typische
Konzentrationen: 1·10–7 mol/l bis
5·10–5 mol/l)
getropft. Danach gibt man 0,5 μl 2,5-DHB-Lösung (10
mg/ml in Ethanol/ 0,1% wässriger
TFA, 60:40 V/V) zu dem Tropfen hinzu und vermischt sie. Abhängig von
der gewünschten
Dauer des Kristallisationsvorgangs wird der Probenteller entweder
an der Luft mehrere Minuten oder unter einem heißen Luftstrom in wenigen Sekunden
getrocknet. Die Größe der entstehenden
Kristalle hängt
dabei stark von der Geschwindigkeit des Eintrocknens bzw. der Kristallisation
ab. Wird der Probenteller an Luft getrocknet, entsteht ein ausgeprägter Rand
der Probe, der aus großen,
bis zu mehreren 100 μm
langen Kristallen besteht. Durch die Erhöhung des Wasseranteils auf
bis zu 100% in der Matrixlösung
kann dieser Effekt, gegeben durch den wesentlich geringeren Dampfdruck
des Wassers, noch verstärkt
werden. Da der innere Teil der Probe während der Kristallisation des
Randes immer noch mit Flüssigkeit
bedeckt ist, entstehen die Kristalle im inneren Bereich erst kurz
bevor die Probe eintrocknet. Dabei bildet sich in kurzer Zeit ein
Schicht von vielen sehr kleinen Kristallen. Diese Schicht lässt sich
klar vom Rand der Probe, meist durch einen schmalen Bereich zwischen
Rand und feinkristallinem Innerem, in dem fast keine Kristalle vorhanden
sind, differenzieren. Es kann so schon auf sehr einfache Weise gezeigt
werden, dass durch die Art und Weise des Kristallisationsvorganges
innerhalb der Probe eine Trennung der Analyten vor sich geht. Bereits
der Vergleich zwischen 30 bis 40 aufsummierte Massenspektren nach Ausführungsbeispiel
7 vom Rand bzw. vom inneren Bereich der Probe zeigt 4,
dass die fast unvermeidlichen Verunreinigungen einer Probe durch
Natrium- oder Kaliumionen im Inneren der Probe stärker lokalisiert
sind als am Rand.
-
Ausführungsbeispiel
2 („Langsame
MALDI-Standardpräparation")
-
5 stellt
die Verteilungsbilder eines Peptidgemischs aus dem stark hydrophilen
Liptropin 1–10
und dem stark hydrophoben Anti-Inflammatory Peptid dar. Es wurde
eine „Dried-droplet" Präparation wie
in Ausführungsbeispiel
1 verwendet. 1 μl
Peptidgemisch in Ethanol/Wasser (1:1 v/v, 5·10–5 mol/l)
wurde auf den Probenträger
(Aluminiumträger
mit 8 μm Goldbeschichtung,
20 mm Durchmesser) gegeben und mit 1 μl Matrix (2,5-DHB) in Ethanol/Wasser
(2:3 v/v, 20 μg/ml)
auf dem Teller vermischt. Die Probe kristallisierte dann ca. fünf Minuten
an der Raumluft aus. Durch die langsame Auskristallisation entstanden
am Rand der Probe große
2,5-DHB-Kristalle mit einer Größe bis zu
500 μm.
Dabei wurde ein Bereich von 100 μm
mal 100 μm
mit einer Auflösung
von 1 μm abgerastert.
Die Graustufenverteilungsbilder (vgl. Ausführungsbeispiel 8 und 5)
zeigten eine unterschiedliche Verteilung der Peptidsignale innerhalb
eines großen
Kristalls. Die linke Seite der Bilder wird von einem Kristall dominiert,
der größer ist
als der Bildausschnitt. In der Mitte ist eine schmale Nadel mit einer
Breite von ca. 10 μm
zu sehen. Die Größe der Kristalle
wurde mit einem Olympus BX41 Mikroskop mit integrierter Skala bestimmt.
Während
innerhalb des großen
Kristalls das hydrophile Peptid den oberen rechten Teil dominiert,
ist das hydrophobe Peptid im linken unteren Bereich zu finden. In 5 ist
eine klare Segregation der beiden Analyten durch die verschiedenen
Graustufenbilder dargestellt, während die
Intensität
des Matrixsignals gleichmäßig über den Kristall
verteilt ist.
-
Ausführungsbeispiel
3 („Schnelle
MALDI-Standardpräparation")
-
Anders
als im Ausführungsbeispiel
2 führt eine
abgewandelte Methode dazu, dass innerhalb der Kristalle kaum Segregationseffekte
beobachtet werden. In 6 ist ein Peptidgemisch aus
Dynorphin 1–9
(hydrophob) und Vasopressin [Arg8] (hydrophil) in denselben Lösungsmittelverhältnissen
und mit derselben Matrixlösung
wie in Ausführungsbeispiel
2 mit einer Konzentration von jeweils 5·10–5 mol/l
präpariert
worden. Allerdings wurde nun eine rasche Kristallisation durchgeführt. Durch
das Aufheizen des Probentellers vor der Probenpräparation auf 65°C bis 75°C, bevorzugt
auf 70°C,
bzw. durch Trocknen der Probe unter einem heißen Luftstrom bei 70°C bis 90°C, bevorzugt
80°C, kann
eine sehr schnelle Auskristallisation in etwa 5–10 Sekunden erreicht werden.
Die dadurch entstehenden Kristalle sind erheblich kleiner als die
bei langsamer Kristallisation erzeugten. Die Graustufenbilder des
abgerasterten Bildausschnittes (Erzeugung wie in Ausführungsbeispiel
8) von 100 μm
mal 100 μm
zeigen die Verteilung der beiden Analyten und der Matrix (6).
Innerhalb der Kristalle, die eine Größe von 10 μm bis 50 μm haben, sind die beiden Peptide
weitgehend homogen verteilt. Die Größe der Kristalle wurde mit
einem Olympus BX41 Mikroskop mit integrierter Skala bestimmt. Unter
Einbeziehung der dritten Komponente (Matrix) zeigt sich eine Gleichverteilung
von Analyt und Matrix. Da die Analyten nur an den Stellen gemessen
werden, an denen auch Matrix bzw. ein Matrixkristall vorhanden ist,
ist die Verteilung von der Verteilung der Matrix abhängig, aber
innnerhalb des Kristalls ist das Gemisch der Peptide homogen verteilt.
-
Ausführungsbeispiel
4 („Standardpräparation
unterschiedlich große
Peptide")
-
Auch
im Vergleich unterschiedlich großer Peptide zeigt sich, dass
innerhalb der größeren Matrix-Kristalle
die Analyten inhomogen verteilt sein können und sich während der
Präparation
trennen.
-
Ebenso
können
auch innerhalb mikrokristalliner Matrices die Analyten inhomogen
verteilt sein. Neben der Zeit, die das Matrix-Analyt-Gemisch zum Eintrocknen
benötigt,
der Hydrophobizität
bzw. der Polarität
spielt auch die Größe der Peptide
eine Rolle. Dies wird nach Bouschen, W; Flad, T.; Müller, C. A.,
Spengler, B. Characterization of biological samples by Scanning
Microprobe MALDI (SMALDI) mass spectrometry with 1 μm lateral
resolution, 50th American Society for Mass
Spectrometry Conference; 02.06.–06.06.2002,
Orlando, Florida, in 7 und 8 deutlich.
Die Präparation
der Probe erfolgte dabei wie in Ausführungsbeispiel 3, die Messung
wie in Ausführungsbeispiel
8 beschrieben. Ein Peptidgemisch aus Substanz P, Melittin und humanem
Insulin (Einzelkonzentration je 5·10–5 mol/l,
im Verhältnis Substanze:Melittin:Humaninsulin
= 1:2:4 gemischt) in Wasser/Ethanol (1:1 v/v) wird mit 2,5-DHB (20 mg/ml,
Wasser/Ethanol, 6:4 v/v) wie in Ausführungsbeispiel 1 präpariert.
Es werden 0,5 μl
Analyt und 0,5 μl
auf dem Probenteller gemischt und unter einen warmen Luftstrom (ca.
60°C) in
ca. 1 Minute getrocknet. Die Probe zeigt einen Rand mit großen Kristallen und
einen feinkristallinen inneren Bereich der Probe. Auch hier wurde
ein Bereich von 100 μm
mal 100 μm mit
einer Schrittweite von 1 μm
abgerastert, allerdings ist die räumliche analytische Auflösung dieser Bilder
auf Grund einer Verbesserung der optischen Qualität des Laserfokus
erkennbar höher
als in 5 und 6. In den Graustufen (7)
ist eine inhomogene Verteilung der Analyten innerhalb eines Kristalls
zu erkennen, obwohl bei diesen Peptiden der Unterschied in der Hydrophilie
nicht so groß ist
wie in dem ersten Beispiel.
-
Ausführungsbeispiel
5: Bedampfung
-
Der
erste Schritt zum Aufbringen der Matrix auf die zu untersuchende
Probe besteht im Verdampfen der Matrix als Feststoff und anschließendem Ablagern
auf der Probe. Die Bedampfung der Probenträger erfolgte mit einer Verdampfungsanlage.
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Die
Vakuumbedampfungsanlage JEE-4B von Joel (Japan) (9),
ursprünglich
eingesetzt zur Präparation
von Proben für
die Elektronenmikroskopie, wird hier zur MALDI-Präparation
von biologischen Materialen verwendet.
-
Das
Gerät besteht
aus einer Glasglocke, die mit einer externen Gasballastpumpe (D12,
12 m3/h, Leybold AG, Köln, Deutschland) und einer
internen Öldiffusionspumpe
(130 l/min) evakuiert wird. Der Enddruck bei Einsatz der Öldiffusionspumpe
liegt bei 110–5 mbar,
mit der Gasballastpumpe allein werden 1·10–3 mbar
erreicht. Die Kontrolle des Vakuums erfolgt über eine Vakuummessröhre der
Firma Pfeiffer Vakuum (Asslar, Deutschland, Compact Full Range Gauge).
Mit Hilfe verschiedener Ventile kann das Vakuum in der Glasglocke
stufenlos von Atmosphärendruck
bis 1·10–3 mbar
eingestellt werden. In der Glasglocke befinden sich zwei unabhängige Elektrodensysteme,
die verschiedene Heizfäden
oder Schiffchen aufnehmen können.
Die Elektroden können
mit einen Strom von bis zu 40 A beschickt werden, um eine Verdampfung
der Materialien zu ermöglichen. Bei
der Verdampfung von Matrix wird ein Schiffchen verwendet, in dem
bis zu 50 mg Material erhitzt werden können. Ein Schiffchen ist ein
aus dünngewalztem
Metall bestehender Behälter,
der zwischen zwei Elektroden eingespannt wird und der mittels eines Stromes,
der durch das Schiffchen geleitet wird, erhitzt wird (11).
Dabei ist zur Temperatursteuerung (bis 300°C) ein Thermofühler, der
mittels Widerstandsmessung die Temperatur misst, an dem Schiffchen
angebracht, um eine konstante Temperatur über einen längeren Zeitraum einzustellen.
-
Ausführungsbeispiel
5a: Beständigkeit
von Matrixsubstanzen beim Erhitzen
-
Es
wurden die drei Matrices 2,5-DHB (Schmelzpunkt: 236°C–238°C), Sinapinsäure (Schmelzpunkt:
203°C–205°C) und CHCA
(Schmelzpunkt: 252°C)
verwendet. Alle drei Matrices wurden zunächst auf ihre Beständigkeit
beim Erhitzen untersucht. Dazu wurde ein Probenträger 15 mm
oberhalb des Schiffchens, in dem sich die Matrix befand, mit der
Probenträgerseite
nach unten montiert. Das Schiffchen wurde mit 10 mg bis 60 mg der
jeweiligen Matrixsubstanz befüllt.
Das Erhitzen des Schiffchens erfolgte derart, dass die Temperatur
ausgehend von Raumtemperatur um 10°C pro Minute erhöht wurde. Dabei
konnten mit den angegebenen Mengen an Matrixsubstanz bis zu fünf Proben
präpariert
werden. Schon die ersten Versuche zeigten, dass es nicht notwendig
war, die Matrices bis zum Schmelzpunkt zu erhitzen, da sich bereits
bei niedrigeren Temperaturen durch Sublimation bei Normaldruck eine Schicht
auf dem Probenträger
ablagerte. Schon bei Temperaturen in einem Bereich von 80°C bis 130°C sublimierte
genügend
Material, um eine feinkristalline Schicht auf dem Probenträger zu bilden
(11, rechtes Photo). Beim erstmaligen Erhitzen
der Matrixsubstanz ist darauf zu achten, dass die Temperatur um
maximal 5°C
pro Minute erhöht
wird, da bei stärkerem
Erhitzen das in der Matrixsubstanz enthaltene Kristallwasser zu
schnell verdampft, wodurch das Matrixmaterial schlagartig sublimiert
und bei der anschließend
Resublimation derart große
Matrixkristalle entstehen, dass die Matrixkristalle nicht am Probenträger haften.
-
Ausführungsbeispiel
5b: Massenspektrometrische Messung der Matrixschichten
-
Die
aufgewachsenen Schichten wurden anschließend mit dem Massenspektrometer „Lamms 2000" vermessen, wobei
dieselben Messbedingungen wie in Ausführungsbeispiel 7 gewählt wurden. Die
2,5-DHB-Schicht wurde zunächst
gebildet, indem die Matrix in der Bedampfungsanlage für 9 bis
15 Minuten auf 100°C
bis 140°C
bei Atmosphärendruck
erwärmt
wurde. Bevorzugt wurde bei 130°C
für 12
Minuten bei Atmosphärendruck
erwärmt.
Die Schicht auf dem Träger
zeigte im Massenspektrometer ein Spektrum, das vergleichbar war
zu normal präparierten
MALDI-MS-Spektren (Ausführungsbeispiel
1, 12, oben). Im niedrigen Massenbereich von m/z =
46 u bis 137 u fanden sich in geringer Intensität Abbauprodukte von 2,5-DHB,
wobei unter geringer Intensität
verstanden wird, dass die Signalintensitäten nur um einen Faktor 2 bis
5 über
dem Grundrauschen lagen. Im Gegensatz zu den Massenspektren einer MALDI-Präparation
waren im Spektrum mehr 2,5-DHB-Cluster im Massenbereich von m/z
= 300 u bis 600 u zu sehen.
-
Ausführungsbeispiel
5c: Sublimation der Matrix bei vermindertem Druck
-
Weitere
Versuche zeigten, dass die Bildung von Abbauprodukten und Clustern
unterdrückt
werden konne, wenn die Sublimation der Matrix bei einem reduzierten
Druck und damit auch bei einer reduzierten Temperatur erfolgte (12,
unteres Spektrum). Als optimaler Wert für die Sublimation von 2,5-DHB
ergab sich ein Druckbereich von 5·10–1 mbar
bis 5 mBar, bevorzugt ein Druck von 1 mbar. Daraus folgte für 2,5-DHB
eine Temperaturbereich von 40 bis 60°C, bevorzugt von 48°C, zur Sublimierung.
Der Probenträger
wurde 5 Minuten bedampft. Die beiden anderen Matrices, Sinapinsäure und CHCA,
zeigten ein ähnliches
Verhalten. Sinapinsäure
sublimiert bei Normaldruck ab ca. 90°C, bei einem reduzierten Druck
von 1 mbar bei 45°C.
CHCA sublimiert bei ca. 110°C
unter Normaldruck und bei 1 mbar bei 53°C. In den Massenspektren fanden
sich ebenfalls Abbauprodukte und Cluster der Matrices. Die Schichten,
die auf die Probenträgen aufgedampft wurden,
erwiesen sich als wenig stabil gegenüber mechanischer Belastung
(11, linkes Photo). Schon der Beschuss mit dem
hochfokussierten Stickstofflaserstrahl reichte aus, um größere Teile
aus den Schichten herauszubrechen. Insbesondere war dies bei Sinapinsäure und
CHCA zu beobachten.
-
Bei
einer Laserenergie nahe der Schwelle der Ionendetektion konnten
die Beschädigungen
der Schichten derart reduziert werden, dass Messungen mit einem
Fokusdurchmesser und einer analytischen Auflösung von 0,5 bis 5 μm möglich waren.
Bei einem Laserfokus von 0,8 μm
betrug diese Laserenergie nahe der Schwelle der Ionendetektion ca.
1·1010 W/cm2; bei einem
Laserfokus von 15 μm
ca. 1·107 W/cm2. Der vorher
auf den Probenträger
mit Hilfe eines Filzstiftes aufgebrachte rote Farbstoff des Filzstiftes
verdeutlichte, dass durch das Aufbringen der Matrix nach diesem
Ausführungsbeispiel
eine vor der Präparation
aufgebrachte Substanz nicht über
die analytische Auflösung
hinausgehend migriert. Die deutliche Grenze zwischen Farbstrich
und Goldoberfläche
bleibt auch nach der Bedampfung mit Matrix erhalten und zeigt im
Auflösungsbereich
von 0,5 bis 3 μm
keine Migration. Die Aufnahmen wurden mit einem Olympus BX41 Mikroskop
mit integrierter Skala aufgenommen.
-
Ausführungsbeispiel
5d: Bedampfung von Probenträgern,
auf die zuvor Analyt aufgebracht wurde
-
Um
die erzeugten Matrixschichten in Hinblick auf ihre Fähigkeit
zu überprüfen, mit
ihnen MALDI-Massenspektrometrie von Oberflächen zu betreiben, wurde vor
der Bedampfung nach diesem Ausführungsbeispiel
auf den Probenträger
nach Ausführungsbeispiel
1 ein Gemisch aus den drei Peptiden Substanz P, Melittin und Insulin
aufgebracht. Es wurden die einzelnen Komponenten jeweils mit einer Konzentration
von 1·10–5 mol/l
in Ethanol/Wasser 1:1 (v/v) gelöst
und dann im Verhältnis
1:2:4 (Substanz P:Melittin:Insulin) gemischt. Dieses Gemisch zeigte im
Massenspektrum bei MALDI-Präparation
nach Ausführungsbeispiel
1 ein Massenspektrum mit guter, etwa gleich hohe Signalintensität für alle drei Komponenten.
Auf den Probenträger
wurde 1 μl
des Gemischs aufgebracht. Nach ca. 10 Minuten bei Raumtemperatur
und Normdruck war der Tropfen vollständig eingetrocknet, so dass
eine Bedampfung mit Matrix nach diesem Ausführungsbeispiel durchgeführt werden
konnte. Nach der Bedampfung des Probenträgers mit Matrix (2,5-DHB) wiesen
die Massenspektren zunächst
nur sehr geringe Signalintensitäten
der drei Substanzen auf. Bei Bestrahlungsstärken von etwa 1·107 W/cm2 bis etwa
1·1010 W/cm2 bei einem
Laserfokus von ca. 1 μm,
die üblicherweise
bei MALDI-Messungen mit dem in Anwendungsbeispiel 8 beschriebenen
Gerät verwendet
werden, konnten keine Massensignale der Peptide detektiert werden. Erst
bei fünffach
bis zehnfach erhöhter Bestrahlungsstärke im Bereich
von 5·1010 W/cm2 bis 10·1010 W/cm2 (Anwendungsbeispiel
8) und Aufsummierung von 200 bis 400 Einzelspektren wurden schwache Massensignale
erkennbar (13). Auch bei Geräten mit
Laserfoci von 50 μm
bis 200 μm,
bei denen die Bestrahlungsstärken
im Bereich von 1·106
W/cm2 bis 1·101 W/cm2 liegen, führt erst
eine fünffache
bis zehnfache Verstärkung
der Bestrahlungsstärke
zu einem Messsignal. Die geringe Intensität der Peptidsignale (13)
kann mit der mangelhaften Vermischung der Analyten mit der Matrix
erklärt
werden. Der Einbau des Analyten ist den Matrixkristall ist zwar zur
Messung laut Horneffer, V.; Dreisewerd, K; Ludemann, H. C.; Hillenkamp,
F.; Lage, M.; Strupat, K.; Is the incorporation of analytes into
matrix crystals a prerequiste for matrix-assisted laser desorption/ionisation
mass spectrometry? A study of five positional isomers of dihydroxybenzoic
acid; International Journal of Mass Spectrometry; 187 (1999) 859–870, nicht zwingend
notwendig, allerdings ist, bedingt durch den kleinen Laserfokus,
der Bereich aus dem Matrix und Analyt gleichzeitig desorbiert werden,
sehr klein. Bei der Aufsummierung der Einzelspektren wurde beobachtet,
dass die Signalintensitäten
der Peptide innerhalb von mehreren Einzelmessungen stark schwanken.
Bei mehrfachem Beschuss derselben Probenstelle ist zunächst nur
Matrix im Massenspektrum zu sehen. Nach 5–10 Laserschüssen werden die
Analyten für
2–3 Schüsse im Spektrum
sichtbar. Danach nahm die Signalintensität für diese Probenstelle insgesamt
ab. Dieses Phänomen
deutete auf eine mangelhafte Integration des Analyten in die Matrix
hin. Erst wenn die bedampfte Schicht nahezu abgetragen war, wurden
für wenige
Laserschüsse
Analyt und Matrix gemeinsam desorbiert. Im Anschluss daran war die
Probe an dieser Stelle aufgebraucht.
-
Ausführungsbeispiel
6: Funktion der Matrix nach Bedampfung
-
14 zeigt,
dass die Matrix auch nach der Sublimation gemäß den Ausführungsbeispielen 5 bis 5d chemisch
weitgehend unverändert
vorliegt und ihre Funktion im Desorptions/Ionisationsprozess nach
wie vor erfüllt.
Der Probenträger
wurde dazu nach Ausführungsbeispiel
5d mit einem Tropfen des Peptidgemischs beladen. Nach dem Eintrocknen
des Tropfens wurde die Matrixschicht (2,5-DHB) aufgedampft. Anschließend wurde
die erzeugte Matrixschicht im Bereich des eingetrockneten Tropfens
mit 1 μl
Ethanol/Wasser 1:1 (v/v) wieder aufgelöst und durch einen warmen Luftstrom
(60°C) erneut
getrocknet. Die entstandenen Matrixkristalle zeigten nun das typische
Aussehen einer normalen MALDI-Präparation
nach Ausführungsbeispiel
1. Auch die resultierenden Massenspektren nach Ausführungsbeispiel
7 unterschieden sich nicht von den typischen Massenspektren einer
normalen MALDI-Präparation. Durch
die jetzt wieder mögliche
Reduzierung der Bestrahlungsstärke
wegen des besseren Einbaus der Analyten in die Matrix waren in diesem
Spektrum keine Matrixcluster zu beobachten. Bemerkenswert ist, dass
jetzt auch keine Abbauprodukte der Matrix zu sehen waren (14,
Ausschnitt).
-
Ausführungsbeispiel
7: Befeuchten der Matrix
-
Die
Bedampfung und das anschließende
Lösen und
Umkristallisieren der Matrixschicht zeigte sich als sinnvolle Strategie
zur Matrixpräparation
unter Erhalt von Nachweisempfindlichkeit und Ortsauflösung. Die
Trennung der Präparation
in zwei Schritte (Aufdampfen der Matrix und Integration des Analyten)
stellte dabei einen entscheidenden Punkt dar, um eine weitreichende
Kontrolle über
die Präparationsbedingungen
zur Erzeugung einer homogenen Matrixschicht mit Integration des
Analyten zu erzielen.
-
Um
eine verbesserte Integration des Analyten in die aufgedampfte Matrixschicht
nach Ausführungsbeispiel
5d zu erreichen, wurden die Probenträger einer feuchten Umgebung
ausgesetzt.
-
Dazu
wurden die fertig bedampften Probenträger in einen geschlossenen
Glasbehälter
gegeben. Unter die Probenträger
wurde ein Papiertuch, z. B. Kimwipes (Kimberly-Clark, Neenah, USA)
gelegt, das mit destilliertem Wasser getränkt war. Der Behälter wurde
dann von unten erhitzt, so dass sich eine mit Wasser gesättigte Atmosphäre um den
Probenträger
bildete. Bei der Wahl des Behälters
war zu beachten, dass das gebildete Kondenswasser am Deckel und
am Rand des Behälters
ablief und nicht auf die Probe tropfen kann. Der Behälter wurde
zum Erhitzen etwa 0,5 cm bis 2 cm tief, bevorzugt 1 cm tief, in
ein Sandbad mit Temperaturkontrolle gestellt. Um eine übersättigte Atmosphäre über mehrere
Tage hinweg aufrecht zu erhalten, wurde der Behälter mit einer Verschlussfolie,
z. B. Parafilm M (Karl Hecht KG, Sondheim, Deutschland) zum Abdichten
umwickelt, um ein Austrocknen zu verhindern. Die ersten Versuche
wurden mit 1 ml destilliertem Wasser und einer Temperatur des Sandbades
von 65°C
durchgeführt.
Spätere
Versuche wurden mit 0,5 ml Wasser und höheren Temperaturen von 80°C durchgeführt, da
durch die Reduzierung der zugegebenen Wassermenge die Kondensation
am Deckel begrenzt werden konnte und so die Gefahr von Tropfenbildung
so weit verringert werden, so das keine Tropfen mehr vom Deckel
tropften. Die Temperatur wurde mit einem Thermometer am Boden des
Behälters
gemessen. In den ersten Versuchen zeigte sich nach zwei bis drei
Tagen der Inkubation eine erkennbare Umkristallisation der Matrixschichten
abhängig
von der Wahl der Matrix (15). Während 2,5-DHB
optisch deutliche Veränderungen
aufwies, waren die Veränderungen
bei Sinapinsäure
und CHCA kaum sichtbar. Die Umkristallisation wurde durch optische
Begutachtung mit einem Olympus BX41 Mikroskop mit integrierter Skala
kontrolliert.
-
Die
inkubierten Schichten aus 2,5-DHB kristallisierten wesentlich schneller
um. Schon nach 1 bis 3 Stunden wurden erste optische Veränderungen sichtbar,
und nach 14 Tagen war der Prozess vollkommen abgeschlossen. Das
unterschiedliche Verhalten der drei Matrices ist durch ihre unterschiedlichen
Wasserlöslichkeiten
bedingt. Während
sich Sinapinsäure
und CHCA sehr schlecht in Wasser lösen, ist 2,5-DHB gut wasserlöslich. Die 2,5-DHB-Schicht
wurde durch die Umkristallisation wesentlich stabiler, und das Herauslösen von
großen Teilen
durch mechanische Belastungen oder durch Laserbeschuss wurde verhindert.
-
Ausführungsbeispiel
7a: Verändern
der Kristallisationsgeschwindigkeit
-
Die
Kristallisation konnte durch die Erhöhung der Temperatur der feuchten
Atmosphäre
beschleunigt werden. Versuche mit einer Temperatur von 125°C des Sandbades
führten
schon nach 24 Stunden zur Umkristallisation, und nach drei Tagen
konnte keine weitere Veränderung
der Probenoberfläche festgestellt
werden. Die Veränderungen
der Oberfläche
wurde durch optische Begutachtung mit einem Olympus BX41 Mikroskop
mit integrierter Skala bestimmt. Eine weitere Erhöhung der
Temperatur schien auf Grund der Schmelztemperaturen der verwendeten
Matrices von 200 bis 260°C
nicht mehr sinnvoll. Höhere
Temperaturen als 70°C
am Probenteller sind im Hinblick auf die zu vermessenden Proben
zu vermeiden, da ab diesen Temperaturen die Denaturierung von Proteinen
einsetzt und so bei biologischen Proben unerwünschte Veränderungen eintreten.
-
Ausführungsbeispiel
7b: Kontrolle der räumlichen Verteilung
eines Filzstiftstriches nach Umkristallisation
-
Die
Randbegrenzung eines Filzstiftstriches in 16 (linkes
Photo) zeigt sowohl vor als auch nach der Bedampfung mit Matrix
nach Ausführungsbeispiel
5c und Inkubation mit Wasser (rechtes Photo) nach diesem Ausführungsbeispiel
weiterhin eine scharfe Grenze zwischen Farbe und unbehandeltem Aluminiumprobenträger. Trotz
der Veränderung durch
die Präparation
kann bei dieser Art der Behandlung nach optischer Begutachtung durch
ein Olympus BX41 Mikroskop mit integrierter Skala davon ausgegangen
werden, dass die räumliche
Verteilung der Analyten auf der Oberfläche der Probe innerhalb der
Auflösung
des rasternden Lasers nach Ausführungsbeispiel
7 erhalten bleibt.
-
Ausführungsbeispiel
7c: Kontrolle der räumlichen Verteilung
von Peptiden nach Umkristallisation
-
Die
Veränderung
der Schichten durch Inkubation mit Wasser hängt auch von dem oder den Analyten
selber ab. Schon beim Auftragen von Peptidgemischen auf die Oberfläche nach
Anwendungsbeipiel 1 und anschließender Präparation nach Ausführungsbeispiel
5d und diesem Ausführungsbeispiel (7c)
zeigte sich ein unterschiedliches Kristallisationsverhalten der
Matrix beim Vergleich der Bereiche innerhalb und neben dem aufgetragenen
Peptidgemisch. (17). Auf einem Goldprobenträger, der zuvor
großflächig mit
einem verdünnten
roten Farbstoff bestrichen worden war, wurde 1 μl des wie in Ausführungsbeispiel
5d beschrieben hergestellten Peptidgemischs aus Substanz P, Melittin
und Insulin aufgetragen. Nachdem der Tropfen eingetrocknet war,
wurde der Träger
fünf Minuten
mit 2,5-DHB bei 48°C
in der Bedampfungsanlage bedampft. Danach wurde er 24 Stunden bei
einer Sandbadtemperatur von 125°C
mit Wasser inkubiert. Die Grenze des zuvor eingetrockneten Tropfens
war nach dem Bedampfen mit Matrix und auch nach der Inkubation der Analyten
mit Wasser noch eindeutig zu erkennen (17). Auch
eine Umkristallisation der Matrix war zu beobachten. Dennoch blieb
die scharfe Grenze des vorher aufgegebenen Peptidgemischs nach optischer
Begutachtung durch ein Olympus BX41 Mikroskop mit integrierter Skala
erhalten. Dieses Beispiel zeigt, dass eine Präparation ohne eine merkliche Wanderung
des Peptidgemischs möglich
ist.
-
Ausführungsbeispiel
7d: Messung des erfindungsgemäß präparierten
Analyten mittels SMALDI-Massenspektrometrie
-
18 zeigt,
dass eine räumliche
analytische Auflösung
von etwa 2 μm
mit dieser Präparationsmethode
gemäß Ausführungsbeispiel
7c mittels SMALDI-Massenspektrometrie nach Ausführungsbeispiel 8 erreicht werden
kann. Es wurden zwei Messungen der gleichen Probenstelle durchgeführt. Ein
Bereich von 100 μm
mal 100 μm
wurde mit einer Schrittweite von 1 μm abgerastert. Jeweils ein Laserschuss
pro Rasterschritt wurde auf den Probe abgegeben und ein Massenspektrum
aufgenommen. In 18 sind die Intensitätsverteilungen
für drei
Massen dargestellt. Die obere Reihe zeigt das Massesignal der aufgetragenen
Matrix 2,5-DHB ([2·2,5-DHB-2μ·H2O+H]+ = 273 u),
die mittlere Reihe gehört
zu dem zuvor aufgetragenen verdünnten
roten Farbstoff (m/z = 450 u) und die untere Reihe gehört zum Peptid
Substanz P (m/z = 1348,6 u). Die Verteilung der einzelnen Komponenten
zeigt, dass sowohl die Matrix als auch der rote Farbstoff gleichmäßig verteilt
sind. Da exakt der Rand des eingetrockneten Tropfens abgerastert
wurde, ist Substanz P als ein Analyt des Peptidgemischs nicht gleichmäßig verteilt.
Deutlich ist eine Grenze im oberen Bereich des Bildes von ca. 3 μm Breite
zu sehen, in dem die Intensität
des Substanz P-Massesignals auf Null abfällt. Die erzielten Intensitäten dieser
Messungen fallen deutlich intensiver im Vergleich zur Sprühmethode
aus. Dies lässt
auf einen wesentlich besseren Einbau des Analyten von der Oberfläche in die
entstehenden Matrixkristalle schließen. Eine zweite Messung der
gleichen Probenstelle und gleichen Messbedingungen wie bei der ersten
Messung belegt, dass die Matrixschicht relativ dünn ist (kleiner 2 um), da sie
schon teilweise abgetragen ist. Um eine geringe räumliche
Migration des Analyten zu erreichen, sind diese dünnen Schichten
notwendig. Der Einbau in wesentlich dickere Matrixschichten mit
verwertbaren Signalintensitäten
hat zwangsläufig
eine höhere
Migration zur Folge. Ebenfalls zu sehen ist die erwartete Abhängigkeit
der Intensität
des Peptidsignals vom Matrixsignal. Die Messungen verdeutlichen
die Möglichkeit
einer Aufbereitung komplexer biologischer oder synthetischer Oberflächen mit
der beschriebenen Präparationsmethodik.
Mit dieser Präparationsmethode
erstmals ein Verfahren zur Verfügung,
mit dem SMALDI-Massenspektrometrie mit einer räumlichen analytischen Auflösung von
2 μm durchgeführt werden
kann.
-
Ausführungsbeispiel
8 („Messung
des Analyten durch rasternde Massenspektrometrie")
-
Ein
Probengemisch, das 2,5-Dihydroxybenzoesäure (2,5-DHB), Substanz P (ein
Peptid), Melittin und Insulin enthielt, wurde mittels SMALDI-Flugzeit-MS
untersucht. Die Probenmatrix bestand aus 2,5-DHB.
-
Ausführungsbeispiel
8a: Bestandteile der Messeinrichtung
-
Verwendet
wurde ein Massenspektrometer „LAMMA
2000" (2),
enthaltend:
- – einen Stickstofflaser (N2-Laser): VSL 337 ND-Laser (Laser Science
Inc., Cambridge, Massachusetts, USA), D = 337 nm, Pulswiederholungsrate
10 Hz, Pulsdauer 3 ns, laterale Auflösung = Fokusdurchmesser des
Laserstrahls: 0.6–1.5 μm,
- – eine
Ionenquelle, enthaltend eine Lochblende mit einem Öffnungsdurchmesser
von 7 mm sowie ein Gitter,
- – einen
Ionenführungskanal, Öffnung 4
mm Durchmesser (Innenmaß),
der sich konisch über eine
Strecke von 8 mm auf ein Innenmaß von 6 mm erweiterte,
- – ein
Flugrohr,
- – ein
Feldabschlussgitter,
- – einen
Detektor, bestehend aus einer Doppel-Mikrokanalplatte mit einem
aktiven Durchmesser von 40 mm,
- – X-Y-Z-Piezotisch
(Graf Mikrotechnik, Wertingen), auf dem der Probenträger befestigt
wurde und durch dessen Verschieben des Probenträgers bei ortsfestem Laserstrahl
gerastert wurde. Vor Messbeginn wurde der Verschiebetisch zur einmaligen
Fokussierung des Probenträgers
ein Mal in z-Richtung bewegt. Während
der Messung erfolgte die Bewegung nur in x- und y-Richtung. Rasterweite:
100 μm × 100 μm, minimale
Schrittweite 0.25 μm
- – Mikroprozessorsystem
zur Kontrolle des Verschiebetisches (Motorola 68000 Mikroporzessor, Motorola
Inc., Schaumburg, Illinois)
- – Vakuumpumpen: Ölrotationspumpe
zur Erzeugung des Vorvakuums (Pumpleistung 16 m3/h, Leybold
AG, Köln),
Turbomolekularpumpe zur Erzeugung des Hochvakuums (360 l/s, Leybold
AG, Köln),
Druck in der Vakuumkammer nach Auspumpen ca. 5·10–7 mbar
-
Ausführungsbeispiel
8b: Gewählte
Abstände
innerhalb der Messeinrichtung
-
- a. Lochblende – Probenoberfläche: 3,9
mm
- b. Lochblende – Gitter:
8,6 mm,
- c. Gitter- Ionenführungskanalöffnung:
1,9 mm,
- d. Ionenführungskanalöffnung – Feldabschlußgitter
vor Detektor: 1306 mm und
- e. Feldabschlussgitter – Detektoroberfläche: 20 mm.
-
Ausführungsbeispiel
8c: Gewählte
Potentiale
-
- f. Lochblende: festgelegt auf +10000 V,
- g. Probenteller: +13261 V,
- h. Gitter: –1810
V,
- i. Detektoroberfläche: –1850 V,
- j. Ionenführungskanal,
Flugrohr und Feldabschlussgitter lagen auf Massepotential (0V)
-
Ausführungsbeispiel
8d: Scannen des Probeträgers
-
- Scanbereich: 100 μm × 100 μm
- Scanschrittweite: 1 μm
- Scangeschwindigkeit: 10 Pixel pro Sekunde
- 10000 Massenspektren pro Pixel
-
Ausführungsbeispiel
8e: Vorfokussierung
-
Der
Laserstrahl wurde außerhalb
des Vakuums im Submikrometerbereich vorfokussiert. Hierfür wurden
dem Fachmann bekannte Suprasil®-Quarzlinsen zur Vorfokussierung
mit astigmatischer Korrektur eingesetzt, die den Laserstrahl auf
etwa 10 μm vorfokussierten.
-
Ausführungsbeispiel
8f: Verwendung eines Nd:YLF-Lasers
-
Alternativ
zum Stickstofflaser(N2-Laser) kann ein Nd:YLF-Laser,
beispielsweise Model 421 QD (ADLAS, Lübeck) verwendet werden, Ausstoßenergie
100 μJ pro
Nanosekundenpuls bei 524 nm. Eine Vervierfachung der Frequenz dieses
Lasers wird extern durch einen Temperatur-gesteuerten BBO-Kristall
(Bariumbetaborat zur Erzeugung der zweiten nichtlinearen Oberschwingung)
erreicht. Die endgültige
Pulsenergie beträgt
ca. 15 μJ
bei 262 nm. Der Strahl des Nd:YLF-Lasers besitzt nach Vervierfachung
durch den BBO-Kristall eine streng elliptische Form. In diesem Fall
ist eine spezielle optische Korrektur erforderlich, um eine hohe
numerische Apertur am Eingang der fokussierenden Objektivlinsen
sicher zu stellen. Das Verhältnis
von großem
und kleinem Durchmesser der Ellipse beträgt bei Verwendung dieses Lasers
etwa 1:8. Nach Vorfokussierung mit einer spärischen Linse füllt der
Strahl deshalb nur in der Eingangslinse des Fokussierungsobjektivs
einen schmalen Streifen aus. Aus diesem Grunde wurde eine spezielle
optische Einheit für
die Zirkularisierung entwickelt, die die beiden Strahlachsen unterschiedlich
vorfokussiert (siehe 4). Bei der x-Achse handelt
es sich um die kleine, bei der y-Achse um die große Ellipsenachse.
Beide Achsen werden durch zylindrische Linsen fokussiert, wobei
beide eindimensionalen Foci auf dieselbe Brennebene justiert werden und
auf diese Weise ein kreisförmiges
Strahlenprofil erhalten wird. Die Vorfokussierung des Nd:YLF-Laserstrahls
wurde bereits von Spengler und Hubert publiziert (B. Spengler und
M. Hubert, Scanning Microprobe matrix-Assisted Laser Desorption
Ionization (SMALDI) Mass Spectrometry: Instrumentation for Sub-Micrometer
Resolved LDI and MALDI Surface Analysis, Journal of the American
Society of Mass Spectrometry 2002, 13, 735–748).
-
Ausführungsbeispiel
8g: Peakerkennung und statistische Auswertung
-
Die
erhaltenen Einzelspektren pro Probenposition wurden summiert, anschließend wurden
die Zentroide berechnet und Masse, Peakflächen und Ortskoordinaten zugeordnet.
Danach wurde die Häufigkeitsverteilung
aller detektierten Massen bestimmt. Im Histogrammm wurden die Maxima
bestimmt und die Massenfenster für
die Bilder fest gelegt. Für
jedes Bild wurde der Massenschwerpunkt durch Gewichtung der Einzelmassen
mit den Peakflächen
berechnet, und es wurde die relative Messunsicherheit ermittelt.
-
Ausführungsbeispiel
8h: Bilderstellung
-
Die
Peakflächen
jeder detektierten Masse wurden in 16 Bit Graustufen umgerechnet.
Dabei wurde die gesamte Gruppe von Bildern auf maximalen Kontrast
skaliert, um alle von 2,5-DHB, Substanz P, Melittin und Insulin
erhaltenen Bilder miteinander vergleichen zu können. Parallel dazu wurden
Einzelbilder skaliert, um einen maximalen Kontrast für die Verteilung
jeder einzelnen Substanz zu bekommen.
-
Ausführungsbeispiel
8i: Alternatives Scannen der zu untersuchenden Anaylten
-
Der
X-Y-Z-Verschiebetisch wurde in diesem Versuch nicht bewegt, sondern
der Laser wurde relativ zum Verschiebetisch bewegt. Es wurde ein
Laser mit einem Fokusdurch messer von 0,3 μm bis 0,6 μm verwendet, die Scanschrittweite
betrug ebenfalls 1 μm
(ohne Abbildung).
-
Ausführungsbeispiel
9: Oxidations- oder zersetzungsgefährdete Analyten
-
Wird
das erfindungsgemäße Verfahren
zur Präparation
von Analyten verwendet, die eine oder mehrere Substanzen enthalten,
welche leicht oxidierbar sind und/oder sich leicht zersetzen, empfiehlt
es sich, bei der Behandlung der Matrix mit Lösungsmitteldampf zusätzlich ein
inertes Trägergas
gemäß Anspruch
5 einzusetzen (ohne Abbildung).
-
Ausführungsbeispiel
10: Bevorzugtes Verfahren zur Aufbringung der Matrix
-
Beim
erfindungsgemäßen Verfahren
zur Präparation
von Oberflächen
zur Mikrobereichsanalytik ist es besonders vorteilhaft, die Matrix
mit Hilfe des Bedampfungsverfahrens nach Anspruch 12 aufzubringen,
wobei bevorzugt Schichtdicken der Matrix von 0,5 μm bis 3 μm erzeugt
werden (ohne Abbildung).
-
Im
Folgenden sind 19 Zeichungen aufgeführt.
-
- 1
- Ionenführungskanal
- 2
- Flugrohr
mit Vakuumgehäuse
- 3
- Detektor
- 4
- innenoptische
Anordnung
- 5
- Objektiv
mit zentraler Bohrung
- 6
- X-Y-Z-Piezotisch
und X-Y-Z-Schrittmotortisch
- 7
- Laser
- 8
- CCD-Kamera
(Charge Coupled Device-Kamera)
- 9
- Vorfokussierung
mit astigmatischer Korrektur
- 10
- Dichroitische
Spiegel
- 11
- Lichtquelle
für Probenbeobachtung
- 12
- Verdampfungsanlage
- 13
- Elektroden
zum Anschluss des Schiffchens
- 14
- Vakuumbehälter
- 15
- Stromkontrolle
für Elektroden
- 16
- Temperaturkontrolle
- 17
- Druckkontrolle
- 18
- Probenhalter
- 19
- Schiffchen
- 20
- Probenträger mit
Analyten
- 21
- Temperaturfühler
- 22
- Ventil
- 23
- Behälter mit
Lösungsmittelreservoir
- 24
- Deckel
des Behälters
- 25
- Probenauflage
-
Abbildungslegenden
-
1:
-
Verschiedene
Verfahren zu Präparation
von Oberflächen:
- a) Standardpräparation
- b) Elektrospray
- c) Sprühverfahren
- d) Bedampfungsverfahren
-
Die
mittlere Spalte verdeutlicht die Größe der Migration des Analyten
auf der Oberfläche.
Die rechte Spalte verdeutlicht die Größe der Integration des Analyten
von der Oberfläche
in die Matrixschicht.
-
2:
-
Der
Laserstrahl 7 wird nach astigmatischer Korrektur und Vorfokussierung 9 und
Umlenkung über
dichroitische Spiegel 10 durch ein Objektiv mit zentraler
Bohrung 5 auf den Piezotisch 6 mit dem Probeträger gelenkt.
Die emittierten Ionen werden mittels der innenoptischen Anordnung 4 durch
den Ionenführungskanal 1 und
durch das Flugrohr 2 zum Detektor 3 beschleunigt.
Licht aus einer Lichtquelle zur Probenbeobachtung 11 wird
ebenfalls über
dichroitische Spiegel 10 auf den Probenträger gelenkt; eine
CCD-Kamera 8 erzeugt dabei optische Bilder des untersuchten
Probenbereiches.
-
3:
-
Darstellung
der durch automatische Bildverarbeitung ohne Pre-Scan bzw. ohne
Vorgabe von Massen erhaltenen Abbildungen der Oberflächenverteilungen
von 2,5-DHB, Substanz P, Melittin und Insulin sowie von verschiedenen
isotopomeren, Derivaten und Anlagerungsprodukten derselben.
-
4:
-
- a) Messung großer Kristalle des Randes (30
Messungen gemittelt)
- b) Messung feinkristalline Mitte (30 Messungen gemittelt)
-
5:
-
Dried-droplet
Präparation
mit 2,5-DHB als Matrix: Durch langsame Auskristallisation (ca. 10
Minuten) entstehen große
Kristalle mit unterschiedlicher Verteilung des Analyten. (100 μm × 100 μm, 1 μm Rasterweite)
- a) Verteilungsbild 2,5-DHB, Matrix, m/z 137.1
- b) Verteilungsbild Anti-Inflammatory Peptid, m/z 1084.5, hydrophob
- c) Verteilungsbild Lipotropin 1–10, m/z 950.5, hydrophil
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6:
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Dried-droplet
Präparation
mit 2,5-DHB als Matrix: Durch schnelle Auskristallisation (ca. 10
Sekunden) entstehen kleine Kristalle mit homogener Verteilung des
Analyten. (100 μm × 100 μm, 1 μm Rasterweite)
- a) Verteilungsbild 2,5-DHB, Matrix, m/z 154.1
- b) Verteilungsbild Vasopressin [Arg8], m/z 1137.7, hydrophil
- c) Verteilungsbild Dynorphin 1–9, m/z 1084.5, hydrophob
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7:
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Rand
einer Dried-droplet Präparation
mit 2,5-DHB als Matrix (100 μm × 100 μm, 1 μm Rasterweite)
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8:
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Feinkristalliner
Kristalle im Inneren einer Dried-droplet Präparation mit 2,5-DHB als Matrix (100 μm × 100 μm, 1 μm Rasterschrittweite)
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9:
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Verdampfungsanlage
Jeol JEE-4B 12 mit Vakuumbehälter 14. Die Stromkontrolle 15 der
Elektroden 13 wird zur Temperaturkontrolle 16 des
Schiffchens 19 (nicht sichtbar) benötigt. Die Druckkontrolle 17 wird über das
Ventil 22 gesteuert.
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10:
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Der
Probenteller 20 wird im Probenhalter 18 zur Bedampfung
eingespannt. Zwischen den Elektroden 13 wird das Schiffchen 19 mit
Matrix befüllt
und über
die Stromkontrolle 15 (nicht sichtbar) erhitzt. Über einen
Temperaturfühler 21 kann
die Temperaturkontrolle 16 (nicht sichtbar) erfolgen.
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11:
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Mikroskopische
Aufnahme eines bedampften Probenträgers: Goldprobenträger mit
Farbstoff eines Filzstiftes (oberer Bildteil) und Bedampfung 2,5-DHB
(linker Bildteil)
- a) 650 × 500 μm
- b) 65 × 50 μm
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12:
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Massenspektren
von thermisch sublimierter und rekondensierter Matrix
- a) 2,5-DHB sublimiert bei 130°C
unter Normaldruck in 12 Minuten
- b) 2,5-DHB sublimiert bei 48°C
bei 1 mBar in 5 Minuten
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13:
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- MALDI – Massenspektren
einer Peptid-Mischung nach Bedampfung mit thermisch sublimierter
und re-kondensierter Matrix (2,5-DHB) bei a) hoher und b) mittlerer
Laserintensität
(jeweils 300 Spektren aufsummiert)
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14:
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- MALDI-Massenspektrum von 2,5-DHB/Peptid-Mix nach Anläsen der
Bedampfung mit Ethanol/Wasser 1:1 (30 Spektren aufsummiert)
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15:
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Inkubation
von 2,5-DHB-Schicht mit Wasser
- a) Träger mit
2,5-DHB bedampft
- b) Träger
mit 2,5-DHB bedampft und 3 Tage mit Wasser befeuchtet
- c) Träger
mit 2,5-DHB bedampft und 14 Tage mit Wasser befeuchtet
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16:
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Filzstiftstrich
auf Goldproberträger
a) vor und b) nach Bedampfung mit 2,5-DHB und Befeuchtung (650 × 500 μm)
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17:
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Veränderung
des Randes des Peptidgemischtropfens auf Goldträger (650 × 500 μm)
- a) Nach
Bedampfung mit 2,5-DHB
- b) Nach Inkubation mit Wasser
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18:
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Ionenverteilungsbilder
der Grenze eines präparierten
Peptidgemischs (100 × 100 μm, 1 μm Schrittweite)
- a) 2,5-DHB, m/z 273
- b) Rote Filzstiftfarbe, m/z 450
- c) Substanz P, m/z 1348
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19:
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Behälter 23 zum
Befeuchten des Probenträgers
mit Analyten 20a
- a) Behälter 23 mit
Deckel 24b
- b) Behälter 23 ohne
Deckel mit Probenträger 20 auf
Probenauflage 25