DE102004019043B4 - Präparationsverfahren für die Mikrobereichsanalytik der Zusammensetzung von Substanzgemischen - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie, bei dem in einem ersten Schritt der Analyt oder die Analyte auf einen Probenträger aufgebracht werden, danach eine Matrix auf dem oder den im Wesentlichen festen Analyten abgelagert und zuletzt die Matrix derart mit einem Dampf eines Lösungsmittels der Matrix behandelt wird, dass der Analyt oder die Analyte richtungskontrolliert in die Matrix inkorporiert werden.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem Substanzgemische derart für die Massenspektrometrie präpariert werden können, dass sie mittels der ortsaufgelösten mikroskopischen Oberflächenanalytik mit einer nutzbaren Lateral-Auflösung von wenigen Mikrometern untersucht werden können, sowie die mit Hilfe dieses Verfahrens hergestellten Präparate. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Präparationsmethode kann die chemische Zusammensetzung von Substanzgemischen in einem wesentlich kleineren Maßstab abgebildet werden als bisher. Gleichzeitig wird ein größerer Massenbereich für die Massenspektrometrie zugänglich, so dass auch biologisch relevante Substanzen untersucht werden können.
  • [Beschreibung und Einleitung des allgemeinen Gebietes der Erfindung]
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Gebiete Chemie, Biologie und Biochemie, Physik und instrumentelle Analytik.
  • [Stand der Technik]
  • Ziel der ortsaufgelösten, mikroskopischen Oberflächenanalytik ist es, die chemische Zusammensetzung einer Probe oder eines Substanzgemisches (z. B. einer biologischen Zelle, eines biologischen Gewebes oder einer Halbleiterprobe) mit hoher Auflösung qualitativ und/oder quantitativ abzubilden. Anders als ein optisches Mikroskopbild zeigt ein solches analytisches Bild die Mengenverteilung eines bestimmten Stoffes innerhalb der Probe als Bild an (z. B. als Graustufenbild). Dies ist in zweidimensionalen Abbildungen bislang möglich unter Anderem mit Hilfe lasergestützter, massenspektrometrischer Verfahren (Lasermikrosondenmassenspektrometrie) mit einer räumlichen Auflösung von 0,5 bis 1 μm und einer oberen Massengrenze von ca. 500 bis 800 u. Im Gegensatz zur Lasermikrosondenmassenspektrometrie, bei der eine Probe ohne Vorbehandlung unmittelbar mit Hilfe eines hoch fokussierten Laserstrahls abgerastert wird, konnte die so genannte „Scannende Mikrosonden-Matrix-assistierte Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektrometrie" (SMALDI-MS)), auch unter dem Begriff "MALDI-Imaging" bekannt, nur mit einer nutzbaren Lateral-Auflösung von etwa 25–30 μm betrieben werden, da bei dieser Methode eine chemische Matrixsubstanz in gelöster Form zugegeben werden muss, um auch größere Moleküle (wie z. B. Peptide und Proteine) abbilden zu können. Der Vermischungsprozess sowie die sich beim Eintrocknen bildenden Matrixkristalle begrenzen die nutzbare Ortsauflösung auf die genannten 25 bis 30 μm, da Analytmoleküle zwangsläufig in diesem Maße räumlich auf der Oberfläche verlagert werden. Des Weiteren besitzen die Kristalle meist einen Durchmesser von 5 μm bis 500 μm, was die nutzbare Ortsauflösung ebenfalls begrenzt. Der Vorteil der mechanistisch zu Grunde liegenden MALDI-Massenspektrometrie liegt im wesentlich größeren Massenbereich, der untersucht werden kann (bis zu 106 u) und der somit biologisch relevanten Substanzen wie Proteine, Oligosaccharide und Lipide zugänglich macht.
  • Verfahren zur Bedampfung von Proben mit verschiedenen Materialien sind aus der Elektronenmikroskopie bekannt, eignen sich jedoch nicht für die MALDI-MS, da in der Elektronenmikroskopie andere Matrixmaterialien wie beispielsweise Gold verwendet werden, um die Oberfläche leitfähig zu machen.
  • Die Auswahl der Matrixsubstanz für die MALDI hängt von der Art der Analytmoleküle ab; es sind inzwischen weit über hundert verschiedene Matrixsubstanzen bekannt geworden. Die in hohem Überschuss eingesetzten Matrixsubstanzen haben dabei unter anderem die Aufgabe, die Analytmoleküle möglichst zu vereinzeln und am Probenträger anzubinden, während des Laserbeschusses durch Bildung einer Dampfwolke möglichst ohne Anlagerung von Matrix- oder anderen Molekülen in die Gasphase zu übertragen, und schließlich unter Protonierung oder Deprotonierung zu ionisieren. Für diese Aufgabe hat es sich als günstig erwiesen, die Analytmoleküle vereinzelt in die Kristalle der Matrixsubstanzen bei deren Kristallisation oder zumindest fein verteilt in die Grenzflächenbereiche zwischen den Kriställchen einzubauen. Es scheint dabei wesentlich zu sein, die Analytmoleküle voneinander zu trennen, also keine Cluster von Analytmolekülen in der aufgetragenen Probe zuzulassen.
  • Für das Auftragen von Analyt und Matrix sind eine Reihe verschiedenartiger Methoden bekannt geworden. Die einfachste davon ist das Aufpipettieren einer Lösung, die Analyt und Matrix enthält, auf einen gereinigten, metallischen Probenträger. Der Lösungstropfen bildet auf der Metalloberfläche (oder seiner Oxidschicht) eine Benetzungsfläche, deren Größe auf hydrophilen Oberflächen einem Mehrfachen eines Tropfendurchmessers entspricht. Die Größe hängt von der Hydrophilie und Mikrostrukturierung der Metalloberfläche und von den Eigenschaften des Tröpfchens, insbesondere des Lösungsmittels, ab. Es bildet sich dabei nach dem Auftrocknen der Lösung ein Probenfleck aus kleinen Matrixkriställchen in der Größe dieser Benetzungsfläche, wobei sich in der Regel aber keine gleichmäßige Belegung der Benetzungsfläche zeigt. Die Kriställchen der Matrix beginnen in wässrigen Lösungen in der Regel am Innenrand der Benetzung auf der Metallplatte zu wachsen. Sie wachsen zum Inneren der Benetzungsfläche hin. Häufig bilden sie strahlenartige Kristalle, wie zum Beispiel bei 2,5-Dihydroxybenzoesäure (2,5-DHB) oder 3-Hydroxypicolinsäure (HPA), die sich zum Inneren des Flecks hin oft von der Trägerplatte abheben. Bei Verwendung von 2,5-DHB ist das Zentrum des Flecks häufig leer oder mit feinen Kriställchen bedeckt, die aber oft wegen ihrer hohen Konzentration an Alkalisalzen kaum für die MALDI-Ionisierung brauchbar sind. Die Beladung mit Analytmolekülen ist sehr ungleichmäßig. Diese Belegungsart erfordert daher während der MALDI-Ionisierung eine visuelle Betrachtung der Probenträgeroberfläche durch ein Videomikroskop, das bei den meisten kommerziell erhältlichen Massenspektrometern für diese Art von Analysen zu finden ist. Ionenausbeute und Massenauflösung schwanken im Probenfleck von Ort zu Ort. Es ist oft ein mühsamer Vorgang, eine günstige Stelle des Probenflecks mit guter Analytionenausbeute und guter Massenauflösung zu finden, und nur Erfahrung und Ausprobieren helfen hier bislang weiter.
  • Es gibt zwar Steuerprogramme für Massenspektrometer mit Algorithmen zum automatisierten Aufsuchen der besten Flecken für die MALDI-Ionisierung, doch sind diese Verfahren mit ihren vielen Versuchen und Bewertungen notwendigerweise recht langsam. Bei anderen Auftragungsmethoden ist die Matrixsubstanz bereits vor dem Aufbringen der Lösungsmitteltröpfchen, die nun nur die Analytmoleküle enthalten, auf der Trägerplatte vorhanden.
  • Ist die Oberfläche der Probenträgerplatte nicht hydrophil, sondern hydrophob, so werden zwar kleinere Kristallkonglomerate gebildet, aber die Tröpfchen tendieren dazu, beim Eintrocknen in unkontrollierbarer Weise zu wandern. Der Ort der Kristallkonglomerate ist daher nicht vorauszusagen und erfordert eine Suche beim MALDI-Prozess. Außerdem besteht die große Gefahr, dass sich Tröpfchen vereinigen und so eine getrennte Analyse der Proben unmöglich machen.
  • Der Stand der Technik kennt zahlreiche Verfahren, mit denen auch kleinste Analytmengen einer MALDI-Analyse zugänglich gemacht werden können und die es gestatten, MALDI-Probenträgerplatten in kurzer Zeit mit einer Vielzahl von Analyten zu belegen sowie einer automatischen MS zugänglich zu machen. So beschreibt die DE 196 28 178 C1 ein Verfahren, bei dem eine MALDI-Probenträgerplatte bereits mit einer Matrixschicht belegt ist und viele Analyten gleichzeitig – beispielsweise mit Hilfe einer Multipette – aufgetragen werden. Da die auf der Matrix frei gesetzten Probentröpfchen mit Durchmessem von 200 μm bis 600 μm sehr klein sind, sind sehr geringe Analytmengen ausreichend. Allerdings ist es mit dieser Technik nicht möglich, die Oberflächen, auf denen sich der oder die Analyten befinden, im Mikromaßstab zu untersuchen. Die DE 197 54 978 A1 beschreibt eine Methode zur Herstellung und Beladung von MALDI-Probenträgern, bei dem der Probenträger aus einem elektrisch leitfähigen Material besteht, dessen Oberfläche hydrophob gemacht wird. Anschließend werden rasterförmig angeordnete hydrophile Ankerbereiche für die Analyten erzeugt und die hydrophile Lösung der Analyten aufgebracht. Auch mit diesem Verfahren ist es nicht möglich, Oberflächen, die Analytengemische enthalten, im Mikromaßstab zu untersuchen. Die Kopplung von Dünnschichtchromatographie und Massenspektrometrie wird in der DE 199 37 438 C2 dargelegt: Dort werden Analyten auf einer DC-Platte getrennt, die gleichzeitig als Trägerplatte für die sich daran anschließende MS dient; im Anschluss an die DC wird die Trägerplatte mit Matrixlösung versehen und massenspektrometrisch untersucht. Da die Tröpfchen mit Matrixlösung Durchmesser zwischen 10 und 50 μm aufweisen, sind sie für massenspektrometrische Verfahren mit einer Auflösung von 1 μm zu groß. Die DE 44 08 034 C1 beschreibt ein Verfahren zur MALDI-Analyse von Proben, die zuvor mittels 2D-Gelelektrophorese getrennt wurden. Hierbei werden Probenträgerplatten eingesetzt, die mit einer optisch glatten, adsorptiven Matrixschicht überzogen sind. Die Analytproben werden durch direkten Kontakt, bevorzugt durch elektrophoretischen Transport, von der feuchten Elektrophoreseplatte auf die Matrix übertragen, wobei die zweidimensionale Verteilung der Analyten erhalten bleibt. Die Matrixschicht hat dabei eine Dicke von 300 nm bis 600 nm.
  • In der DE 100 27 794 A1 wird ein Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen über MALDI-TOF-MS beschrieben, bei dem eine Matrix und Analyt enthaltende Lösung mit Hilfe eines Nanoplotters auf ein poliertes, beschichtetes oder bedampftes Trägermaterial aufgebracht wird. Dies führt jedoch zu einer inhomogenen Verteilung des Analyten im auf der Matrix abgesetzten Probentropfen. Die Herstellung strukturierter Bioprobenträger für die MS-Analyse ist in der DE 100 43 042 A1 offengelegt. Dort werden Lösungen aus Biomolekülen und Matrixsubstanzen auf hydro- oder lyophobe Oberflächen aufgebracht, die hydrophile Ankerbereiche sowie Affinitätssorbentien für die Biomoleküle enthalten. Auf den hydrophilen Ankerbereichen bilden sich feinkristalline Matrixkristalle, in die zumindest zum Teil Biomoleküle eingebunden sind. Ein homogener Einbau der Biomoleküle in die Matrix lässt sich auf diese Weise jedoch nicht erzielen.
  • Des Weiteren kennt der Stand der Technik Verfahren zur Ionisierung hochmolekularer Analyte. Die DE 198 34 070 A1 beschreibt ein solches Verfahren. Da dort flüssige Matrices verwendet werden, wobei die Matrixflüssigkeit aus einem Ether-Polyol oder einem Polyether-Polyol besteht, ist die Untersuchung kristalliner Oberflächen mit diesem Verfahren nicht möglich. Die DE 196 17 011 A1 beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung von Ionen hochmolekularer Analyte mittels MALDI, bei der die Matrix aus mindestens zwei Komponenten besteht, von denen eine Komponente durch die Einwirkung der Laserstrahlung zersetzt wird (Sprengstoff). Hierdurch eignet sich die Methode auch für Laserfoci mit Durchmessern im Bereich zwischen 3 μm und 10 μm; innerhalb dieses Fokusdurchmessers wird jedoch die gesamte Schicht auf einmal bis auf den Probenträger darunter abgetragen. Damit ist die Methode nicht für eine dreidimensionale Analyse geeignet.
  • In der US 5,808,300 wird ein Verfahren für die MALDI-Analyse biologischer Proben offenbart. Dabei wird eine Lösung der zu analysierenden Moleküle hergestellt und über Kapillarelektrophorese als lineare Spur auf einem elektrisch leitfähigen Trägermaterial abgeschieden und getrocknet. Optional kann die Matrix mit dem Analytmaterial angelöst und rekristallisiert werden. Diese Methode ist jedoch nur bis zu Laserfoci größer oder gleich 25 μm einsetzbar und daher nicht für Oberflächenanalysen im Mikromaßstab geeignet. In der DE 102 07 615 A1 wird eine Methode zur Herstellung ultraphober Oberflächen beschrieben, auf der hydrophile und/oder oleophile Bereiche reversibel erzeugt werden können. Auf diesen Oberflächen werden zunächst Lösungen von MALDI-Matrices abgeschieden und anschließend Analytlösungen aufgebracht. Durch das Anläsen und Rekristallisieren der Matrix werden die Analyten in die MALDI-Matrix eingebaut.
  • Die WO 03/040 715 A offenbart ein Verfahren zur Präparation von Proben für die Massenspektrometrie, insbesondere für MALDI-MS, bei welchem der Analyt und die Matrix gleichzeitig auf dem Probenträger getrocknet werden. Dabei kommt es zwingend zu einer Vermischung des Analyts mit dem Matrixmaterial vor der Trocknung, was zu einer Wanderung der Analytmoleküle in der Matrix und somit zu einer Veränderung des dreidimensionalen Aufbaus der Analytschicht führt. Eine richtungskontrollierte Inkorporation des Analyts in das Matrixmaterial erfolgt daher auch bei diesem Verfahren nicht, so dass die Lateralauflösung einer mit diesen Proben durchgeführten SMALDI-MS sehr gering ist.
  • Aus der DE 199 49 735 A1 ist ein Verfahren für das Prozessieren von Probenmolekülen in kleinen Mengen von Flüssigkeiten bekannt, bei dem das Prozessieren in frei auf lyophilen Anken einer ansonsten lyophoben Trägeroberfläche stehenden oder an diesen hängenden Tropfen stattfindet. Dabei bilden der durch die Oberflächenspannung zusammengehaltene Tropfen, der lyophile Anker, der lyophobe Rand des Ankers und das den Tropfen umgebende Gas einen Mikroreaktor. Die anschließende Probenvorbereitung für die MS erfolgt ähnlich zu dem in der WO 03/040 715 A offenbarten Verfahren. Demnach werden die Trägerplatten, auf deren lyophilen Ankern mit Trypsin verdaute Protein adsorbiert sind, mit einer Lösung kontaktiert, wodurch die später mit MS zu analysierenden Verdaupeptide der Trägerplatte desorbiert werden und sich mit der Lösung vermischen. Dies führt jedoch auch hier zwangsläufig zu einer Wanderung der Analytmoleküle in dem Lösungsmittel und somit zu einer Veränderung des dreidimensionalen Aufbaus der Analytschicht. Ein richtungskontrollierter Einbau in die Matrix ist somit auch hier nicht möglich.
  • Auch bei dem in der GB 2 235 529 A offenbarten Verfahren kommt es zu einer Vermischung des Analyts mit derm Matrixmaterial derart, dass der dreidimensionale Aufbau der Analytschicht durch eine hinsichtlich der Richtung nicht kontrollierte Wanderung der Analytmoleküle in die Matrixschicht verändert wird. Dabei wird zunächst ein Substrat auf einen Träger aufgebracht und daran gebunden, bevor ein in einem Lösungsmittel gelöster Analyt auf das Substrat aufgetragen und solange inkubiert wird, bis der Analyt an das Substrat bindet. Anschließend wird auf das Substrat ein Tropfen eines in einem Lösungsmittel gelösten Matrixmaterials appliziert, wobei das Lösungsmittel Oberflächenschichten des Substrats mit daran gebundenem Analyt auflöst. Dadurch wird der Analyt mit dem Matrixmaterial in dem Flüssigkeitstropfen innig vermischt.
  • Für das in der DE 199 23 761 C1 offenbarte Verfahren sind innenaustauschende Ankerbereiche auf dem Probenträger wesentlich. Hier wird der Analyt in einem Lösungsmittel gelöst und mit einem ebenfalls in Lösung befindlichen Matrixmaterial vermischt, bevor diese Mischung getrocknet wird. Daher ist auch hier kein richtungskontrollierter Einbau des Analyts in die Matrix gegeben.
  • Gleiches gilt für die aus der DE 41 43 071 C2 , der GB 2 235 528 A sowie der GB 2 236 184 A bekannten Verfahren. Bei diesen wird jeweils eine Analytlösung mit einem Matrixmaterial in Kontakt gebracht, weshalb keine richtungskontrollierte Inkorporation des Analyts in die Matrix möglich ist.
  • Schließlich offenbart die DE 196 18 032 C2 ein Verfahren, das Probenträger, die eine vorpräparierte Matrixschicht aufweisen und die von einer lackartigen Komponente dicht umschlossen sind. Hier erfolgt die Zugabe des Analyten erst nach Aufbringung der Matrix.
  • Bei allen Methoden des Standes der Technik mit Ausnahme der US 5,808,300 wird die Lösung des Analyten entweder auf einen schon vorher mit Matrix präparierten Probenträger aufgebracht, oder Matrix- und Analytlösung werden gemeinsam aufgebracht. Bei diesen Vorgehensweisen kommt es zwangsläufig zum Wandern der Analytmoleküle in der Matrixschicht. Der dreidimensionale Aufbau der Analytschicht wird dabei in jedem Fall verändert: Analytmoleküle, die vor dem Einbau in die Matrix beispielsweise in Richtung der x-Koordinate in der Reihenfolge A, B, C vorlagen, können nach dem Einbau in die Matrix z. B. in der Reihenfolge B, C, A vorliegen. Dies gilt für alle drei Raumrichtungen, so dass mit den Verfahren des Standes der Technik eine Richtungskontrolle des Einbaus der Analyten in die Matrix nicht möglich ist. Auch die in der US 5,808,300 beschriebene Technik, Matrices auf Analyten in Form von Gewebeschnitten aufzubringen, erlaubt keine solche Richtungskontrolle des Einbaus der Analyten in die Matrix und gestattet bei der MALDI-Messung daher keine räumlichen Auflösungen im Bereich von 1 μm.
  • Die vorliegende Erfindung gestattet es erstmals, zu analysierende Substanzgemische solchermaßen für die Massenspektrometrie zu präparieren, dass Analytmoleküle richtungskontrolliert in die Matrix eingebaut werden, wobei sich die räumliche Umverteilung von Analytmolekülen in der Matrix in derart engen Grenzen hält, dass bei der scannenden Mikrosonden-Matrix-assistierten Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektrometrie eine räumliche Verschiebung kleiner oder gleich 3 μm ergibt.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie bereit zu stellen, das die Nachteile des Standes der Technik im Hinblick auf die Größe der Matrixkristalle vermeidet und einen richtungskontrollierten Einbau der Analytmoleküle in die Matrix gewährleistet, wobei unter richtungskontrolliertem Einbau verstanden wird, dass die Analytmoleküle in allen drei Raumrichtungen im Wesentlichen in derjenigen relativen Position zueinander eingebaut werden, in der sie vor Einbau in die Matrix vorlagen.
  • Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren, bei dem zuerst der Analyt auf einen Probenträger aufgebracht, danach die Matrix auf dem bei Raumtemperatur und Normdruck im Wesentlichen festen Analyten abgelagert und zuletzt der Analyt oder die Analyten durch Bedampfung der Matrixschicht mit einem dampfförmigen Lösungsmittel für die Matrix inkorporiert werden.
  • Aufgabe der Erfindung ist es ferner, eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzusehen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch den Gegenstand von Anspruch 15.
  • Vorteilhafte Ausgestaltungen der Vorrichtung ergeben sich durch die Unteransprüche 16 bis 19, wobei die Vorrichtung gemäß Anspruch 17 den Vorteil aufweist, dass die Dicke der Matrix kontrollierbar ist und die Vorrichtung gemäß Anspruch 18 den Vorteil aufweist, dass der Grad der Integration des Analyten kontrollierbar ist, so dass insgesamt eine Qualtitätskontrolle der Präparation gewährleistet ist. Die Vorrichtung gemäß Anspruch 19 weist den Vorteil auf, dass damit ein hoher Durchsatz der Präparation erzeugt werden kann, in dem die Präparation vergleichbar einer Fließbandproduktion oder einer Produktion an Rundtischen abläuft.
  • Unter Analyt wird dabei ein Gemisch aus mindestens einer Substanz verstanden, wobei diese mindestens eine Substanz chemischen und/oder biologischen und/oder biochemischen Ursprungs ist.
  • Dem Fachmann ist bekannt, dass es sich bei einem Probenträger für die Massenspektometrie um eine Vorrichtung handelt, die den oder die Analyten aufnimmt oder auf welchem der Analyt oder die Analyten sowie die Matrix aufgebracht werden.
  • Dem Fachmann ist bekannt, dass es sich bei der Matrix im Zusammenhang mit der Matrix-Assistierten Laser Desorptions-Ionisations Massenspektrometrie (MALDI-MS) um eine Substanz handelt, deren Energieabsorption auf die Wellenlänge des Desorptionslasers abgestimmt ist, so dass die Matrix die Energie des Laserlichtes aufnimmt und den oder die in der Matrix eingebetteten Analyten mit desorbiert und protoniert, weshalb der Analyt ohne Fragmentierung in die Gasphase gelangt und analysiert werden kann.
  • Die erfindungsgemäße Präparationsmethode für die Mikrobereichsanalytik der Zusam mensetzung von Substanzgemischen vermeidet die Nachteile des Standes der Technik, indem in einem ersten Schritt der oder die Analyten auf den Probenträger aufgebracht werden, im zweiten Schritt die Matrix aufgebracht wird und in einem dritten Schritt die Inkorporation des oder der Analyten in die Matrix erfolgt. Aufbringen der Matrix und Inkorporation des Analyten erfolgen dabei nacheinander und nicht zeitgleich.
  • Dem Fachmann sind zahlreiche Methoden bekannt, mit denen Analyten und/oder Matrixsubstanzen auf Probenträger aufgebracht werden können. Diese Methoden eignen sich sowohl zur Aufbringung des Analyten auf den Probenträger (erster Schritt der erfindungsgemäßen Präparationsmethode) als auch zur Aufbringung der Matrix (zweiter Schritt der erfindungsgemäßen Präparationsmethode), wobei für die Aufbringung von Analyt und Matrix jeweils dieselbe oder unterschiedliche dieser bekannten Methoden verwendet werden können. Diese dem Fachmann bekannten Methoden sind im Folgenden als Methoden zur Aufbringung der Matrix angegeben, wobei dem Fachmann bekannt ist, dass er sie auch zur Aufbringung des oder der Analyten verwenden kann. Bei der erfindungsgemäßen Präparationsmethode wird die Matrix bevorzugt als Feststoff aufgedampft und anschließend auf dem oder den Analyten abgelagert. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass er die Methode des Aufdampfens ebenso zur Aufbringung des Analyten verwenden kann.
  • Die Integration des Analyten in die Matrix erfolgt beim erfindungsgemäßen Verfahren, indem der Probenträger nach dem Aufdampfen der Matrix einem Lösungsmitteldampf ausgesetzt wird, wobei bevorzugt solche Lösungsmittel zur Erzeugung des Dampfes verwendet werden, in denen sich die Matrixsubstanz löst.
  • Optional kann die Matrix, beispielsweise im Falle oxidations- oder zersetzungsempfindlicher Analyten, einem Gas-Dampf-Gemisch ausgesetzt werden. Dieses Gas-Dampf-Gemisch besteht aus einem inerten, bei Reaktionsbedingungen nicht kondensierbaren Trägergas („Gas") sowie einer unter Reaktionsbedingungen kondensierbaren Komponente („Dampf"). Unter inert sind dabei solche Gase zu verstehen, die im kondensierten Dampf nicht löslich sind. Unter Reaktionsbedingungen wird hierbei die gewählte Kombination aus Druck und Temperatur verstanden.
  • Um die Matrix mit Hilfe des Bedampfungsverfahrens auf den Probenträger aufzubringen, auf dem sich bereits der oder die Analyten befinden, wird die Matrixsubstanz in einer Vakuumkammer, die in einem Druckbereich von Atmosphärendruck bis 1·10–7 mBar evakuiert werden kann, in einem Behälter erhitzt. In diesem Druckbereich kann die Matrixsubstanz in die Gasphase sublimieren und schlägt sich auf derjenigen Seite des Probenträgers nieder, auf dem sich der Analyt befindet, wobei der Probenträger in einem Abstand von 5 bis 40 mm über dem Behälter installiert ist. Die Installation des Probenträgers erfolgt dabei derart, dass die Matrixsubstanz sich beim Niederschlagen auf dem oder den Analyten ablagert. Das Aufdampfen der Matrix erfolgt erfindungsgemäß bei solchen Drücken und Temperaturen, bei denen das Matrixmaterial aus dem Vorratsbehälter sublimiert und sich auf dem Probenträgermaterial niederschlägt, ohne dass Matrixsubstanz und/oder Analyt sich zersetzen. Zur Temperaturkontrolle des Behälters kann ein Thermofühler an der Außenwand des Behälters angebracht werden. Es sind ein Druckbereich von ca. 100 mBar bis etwa 1·102 mBar und ein Temperaturbereich von 20°C bis 130°C zu wählen, so dass innerhalb von 2–15 Minuten eine amorphe Schicht Matrix über dem oder den Analyten auf dem Probenträger abgeschieden wird. Die Dicke der abgeschiedenen Matrixschicht kann beispielsweise dem Fachmann bekannte Methoden wie Massenbestimmung (Schwingquarzmessung), mechanische Abtastung (Tastschnittverfahren), optische Interferometre (Tolanski-Interferometer), Elektronenmikroskopie, Rastertunnelmikroskopie, Rastersondenmikroskopie oder Laserscanning-Mikroskopie bestimmt werden.
  • Dieser zweite Schritt der Präparation kann auch durch andere dem Fachmann bekannte Techniken ersetzt werden, die die räumliche Verteilung des Analyten auf der Oberfläche des Probenträgers nicht oder nur innerhalb der Auflösung des Massenspektrometers verändern. Dazu gehören Methoden, die die Matrix in einem geeigneten Lösungmittel mit einem Gasstrom oder mit einem elektrischen Potential versprühen (Elektrospray), Matrix durch mechanisches Verteilen des Feststoffes aufbringen, durch Stempeln oder Drucken, Thermotransferverfahren, Laserdruckverfahren, Tintenstrahldruckverfahren, Aufbringen der Matrix durch Molekularstrahlepitaxie, Elektrodiffusion oder elektrochemisches Abscheiden. Um die Matrix mittels eines Gasstroms zu versprühen, wird die Matrix in einem Lösungsmittel gelöst und mittels eines Gasstromes aus einem Lösungsmittelreservior durch eine Düse fein zerstäubt (Gasstrom). Die entstehenden Tropfen im Mikrometerbereich lagern sich auf dem oder den Analyten ab und trocknen dort sofort ein. Dem Fachmann ist bekannt, dass durch die Wahl des Abstandes zwischen Düse und Probenträger die Menge des Lösungsmittels, die die Probe erreicht, bestimmt werden kann und damit auch die Migration des Analyten auf der Oberfläche. Alternativ können die Tropfen durch ein elektrisches Feld zwischen Düse und Probenoberfläche erzeugt werden.
  • Die Verfahren werden beispielsweise beschrieben in Herbert Budzikiewicz: Massenspektrometrie. Eine Einführung. 4. Aufl., VCH, Weinheim, 1998 oder F. Lottspeich, H. Zorbas: Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, 1. Aufl. 1998. Weiterhin können die Matrix-Lösungsmitteltröpfchen auch durch dem Fachmann bekannte Ultraschallverneblung erzeugt werden. Hierbei werden aus einem Reservoir an Matrixlösung durch Ultraschall Tröpfchen aus der Oberfläche der Matrixlösung herausgelöst.
  • Eine weitere dem Fachmann bekannte Möglichkeit zum Auftragen der Matrix ist die mechanische Verteilung der Matrix durch beispielsweise einen Schaber oder einen Spatel, indem die Matrix auf die Probe geschüttet und mit Hilfe des Spatels fein verteilt wird. Die Matrix kann auch mit Hilfe eines Stempels, auf den die Matrix aufgetragen wird und der dann auf den Probenträger gedrückt wird, oder anderer Druckverfahren auf den Probenträger aufgetragen werden. Ein weiteres Druckverfahren ist das Laserdruckverfahren, bei dem die Matrix mit einer Walze auf den Probenträger aufgetragen und mit einem Laserstrahl erhitzt wird, um auf der Oberfläche zu haften. Des Weiteren kann die Matrix durch Thermotransfer- oder Tintenstrahldruckverfahren auf den Probenträger aufgebracht werden. Die Matrix wird in gelöster Form in einem Reservoir entweder kurzzeitig erhitzt und durch die Expansion durch eine Düse auf der Probenträger gesprüht oder mit Hilfe eines Piezokristalls durch Anlegen einer elektrischen Spannung auf den Probenträger gesprüht. Die genannten Druckverfahren sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise in „Der Brockhaus. Naturwissenschaft und Technik", Version 3.0, CD-ROM, Bibliographisches Institut & F.A. Brockhaus AG, Mannheim; Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, 2003 nachgeschlagen werden.
  • Um eine verbesserte Integration des Analyten in die aufgedampfte Matrixschicht zu erreichen, werden die Probenträger in einem zweiten Schritt einer feuchten Umgebung ausgesetzt, so dass ein ausreichender Einbau des Analyten in die Matrix geschieht und gleichzeitig Migration minimiert wird. Dies wird erreicht, indem die aufgebrachte Matrixschicht einem Lösungsmitteldampf ausgesetzt wird.
  • Der Probenträger wird dazu zusammen mit einem Lösungsmittelreservoir, in dem sich ein oder mehrere Lösungsmittel befinden, in einen gasdichten abgeschlossenen Behälter gegeben. Dabei ist ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch zu wählen, in welchem die Matrixsubstanz löslich ist. Das Lösungsmittelreservoir wird erhitzt, so dass sich in dem Behälter und damit auch über dem Probenträger ein Lösungsmitteldampf ausbildet, wobei bis zur Sättigung der Behälteratmosphäre mit Lösungsmitteldampf erhitzt wird. Der Probenträger kann bis zu 14 Tagen in dem Behälter verbleiben. Das Ausmaß des richtungskontrollierten Einbaus des oder der Analyten ist hinreichend, wenn die Matrixteilchen eine Größe aufweisen, die in etwa der Auflösung des gewünschten, bei der späteren SMALDI-Messung einzusetzenden Lasers von 0,5 μm bis 3 μm entspricht.
  • Die hinreichende Integration des oder der Analyten in die Matrix kann beispielsweise durch dem Fachmann bekannte Methoden wie Polarisationsmikroskopie, Lichtmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie kontrolliert werden.
  • Das Bedampfen der Matrix mit einem Lösungsmitteldampf löst wahrscheinlich eine Umkristallisation der Matrixschicht aus. Bei der Kontrolle des Grades der Umkristallisation der Matrix mit Hilfe der Polarisationsmikroskopie wird die Absoprtion polarisierten Lichtes gemessen. Umkristallisierte Bereiche der Matrix erscheinen im Polarisationsmikroskop in unterschiedlichen Farben, da die spektrale Absorption von Einstrahlrichtung und Wellenlänge abhängig ist. Vor der Umkristallisation erscheint die Matrixschicht gleichmäßig weiß oder grau im polarisierten Licht. Die Umkristallisation ist abgeschlossen, wenn im polarisierten Licht farbige Bereiche mit Ausdehnungen im Bereich von mindestens 0,5 Mikrometern entstanden sind.
  • Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie kann der Grad der Umkristallisation verfolgt werden, indem die laterale Gleichmäßigkeit der mikroskopischen Verteilung von Matrix und Analyt verfolgt wird, welche bei unterschiedlichen Wellenlängen fluoreszieren. Während übliche Matrixsubstanzen meist eine natürliche Fluoreszenz aufweisen, können beispielsweise Peptide oder Proteine, die Tryptophan enthalten, über dessen natürliche Fluoreszenz beobachtet werden. Des Weiteren sind Methoden bekannt, um eine Fluoreszenzmarkierung beliebiger Peptide oder Proteine durchzuführen, um so bei geeigneten Wellenlängen die Fluoreszenzen von Matrix und Proteinen beobachten zu können. Neben der lateralen Gleichmäßigkeit kann außerdem die erzielte mikroskopische Durchmischung von Analyt und Matrix kontrolliert werden, indem in der Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie vor der Umkristallisation nur die bedeckende Matrixschicht beobachtet wird, während nach der Umkristallisation sowohl Matrix als auch Analyt über deren Fluoreszenzsignale beobachtet werden können.
  • Des Weiteren lässt sich das Einwirken des Lösungsmitteldampfes auf die Matrixschicht mit Hilfe einer Quarzwaage verfolgen, indem die Frequenzverschiebung während der Befeuchtungsphase bestimmt wird: Die Masse der aufgedampften Matrixschicht nimmt durch Lösungsmittelaufnahme zunächst zu und anschließend während der Umkristallisation der Matrix wieder ab. Die Umkristallisation und der Einbau des Analyten können als erfolgreich angesehen werden, wenn die Aufnahme von Lösungsmittel über einen Zeitraum von mehreren Stunden oder Tagen, bevorzugt 3 Stunden bis 14 Tagen, verlief.
  • Auf Grund der guten Löslichkeit der Matrixsubstanz in dem Lösungsmittel bzw. in dem Lösungsmittelgemisch bewirkt der Lösungsmitteldampf eine Umkristallisation der Matrix. Bei diesem Prozess wird der Analyt auf der Oberfläche des Probenträgers mit in die Matrixschicht eingebaut. Da die Matrixschicht eine Dicke von 0,5 μm bis maximal 3 μm aufweisen sollte, kann durch die Dauer des Umkristallisationsprozesses die Migration des Analyten derart beschränkt werden, dass der Analyt zwar vollständig in die Schicht eindringt, aber sich nicht mehr als ca. 1 μm bis 3 μm von seinem ursprünglichen Ort wegbewegt (siehe 18). Die Erzeugung des Lösungsmitteldampfes kann genauso durch dem Fachmann bekannte Verfahren zum Versprühen des Lösungsmittels (siehe auch Versprühen der Matrix) oder Vernebeln durch Ultraschallverneblung erfolgen (siehe auch Ultraschallvernebelung der Matrix).
  • Die Umkristallisation der Matrixschicht kann durch Temperatur und Druck innerhalb des Behälters beeinflusst werden. Bei Temperaturen im Bereich von 40 bis 80°C kann eine Umkristallisation der Schicht innerhalb von 1 bis 5 Tagen beobachtet werden, wobei die Kontrolle der Umkristallisation wie oben beschrieben beispielsweise mittels Licht-, Polarisations- oder Fluoreszenzmikroskopie doer mit Hilfe einer Quarzwaage erfolgt. Durch Erhöhung der Temperatur kann der Vorgang beschleunigt werden, wobei die Temperatur so zu wählen ist, dass chemische Reaktionen und/oder Zersetzungen des oder der Analyten vermieden werden. Alternativ oder zusätzlich zur Temperaturerhöhung kann die Umkristallisation auch durch eine Erhöhung des Druckes im Behälter beschleunigt werden.
  • Durch beide Schritte der Präparation, d. h. durch das Aufbringen der Matrix und die anschließende Umkristallisation, wird eine Matrixschicht erhalten, die sowohl die notwendige Voraussetzung der Inkorporation des oder der Analyten in die Matrix erfüllt, als zu einem richtungskontrollierten Einbau des Analyten in die Matrix führt.
  • Bei der ortsaufgelösten Analyse von biologischen oder synthetischen Proben ist die Präparation der Probe ein entscheidender Schritt, der die erreichbare Empfindlichkeit, die Massenauflösung und die effektive räumliche Auflösung der Messung limitiert. Unter effektiver räumlicher Auflösung wird dabei die Auflösung verstanden, die mit Hilfe des Massenspektrometers (auflösungsbestimmend: Laserfokus) und der Präparation der Probe (auflösungsbestimmend: Migration des oder der Analyten) erreicht werden kann.
  • Es existiert ein prinzipieller Unterschied zwischen einer standardisierten MALDI-MS Präparation gemäß dem Stand der Technik und der Präparation einer Oberfläche für die massenspektrometrische Analytik. Bei der Präparation nach einem Verfahren gemäß dem Stand der Technik liegen der Analyt oder die Analyten in der Regel in gelöster Form vor oder werden in eine gelöste Form gebracht. Dies erleichtert die notwendigen Voraussetzungen für eine MALDI-Präparation erheblich, da in diesem Fall die Probe mit der Matrix gemischt werden kann oder eine Vermischung des oder der Analyten sowie Matrix auf dem Probeteller vor dem Auskristallisieren stattfindet. Dadurch findet eine Separation der einzelnen Analytmoleküle voneinander durch die Matrix statt. Dem Fachmann ist bekannt, dass die Matrix in einem molaren Überschuss von etwa 100:1 bis 100000:1 vorliegen vorliegen sollte, um so die Analytmoleküle räumlich zu trennen und dadurch die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen den Analytmolekülen zu minimieren. Wenn die zu untersuchenden Substanzen auf einer Oberfläche liegen und/oder an diese Oberfläche gebunden sind, muss bei der Präparation erreicht werden, dass eine ausreichende Vermischung des Analyten und der Matrix stattfindet, um die räumliche Trennung der Moleküle zu gewährleisten. Eine Bindung an Oberflächen kann beispielsweise, aber nicht erschöpfend, mittels sog. Anker oder über Beads stattfinden. Dem Fachmann ist. bekannt, dass eine Vermischung mit der Matrix prinzipiell nur möglich ist, wenn die Analyten in der festen Phase auf der Oberfläche vorliegen, so dass die Matrix in gelöster Form auf die Oberfläche einwirken und den oder die Analyten lösen muss. Dies bedeutet gleichzeitig, dass bei einer MALDI-Präparation gemäß dem Stand der Technik die räumliche Lokalisation der Substanzen durch diesen Schritt vollständig verloren geht, da die Flüssigkeit bis zu mehreren Minuten auf der Oberfläche verbleibt, bevor das Lösungsmittel verdampft. Der Informationsgewinn, der durch die hohe räumliche Auflösung eines Gerätes mit einem hoch fokussierten Laserstrahl und einer daraus resultierenden räumlichen Auflösung im Bereich von möglichen Fokusmaximum des Laserstrahls erzielt wird, geht dann durch die Präparation im Vorhinein verloren (vgl. Spengler B., Hubert, M.: Scanning microprobe matrix-assisted laser desorption ionization (SMALDI) mass spectrometry: instrumentation for sub-micrometer resolved LDI and MALDI surface analysis, Journal of the American Society of Mass Spectrometry; 13 (2002) 735–748).
  • Es ist also bei dem erfindungsgemäßen Verfahren darauf zu achten, dass das Ausmaß der Wegbewegung des Analyten von seinem jeweiligen Auftragungsort geringer als der Durchmesser des Laser- oder Ionenstrahlfokus des Massenspektrometer bleibt und gleichzeitig ein Einbau der Analytmoleküle in die Matrix stattfindet, um die so vorbereitete Probe in der rasternden Massenspektrometrie verwenden zu können. Unter rasternder Massenspektrometrie werden dabei solche massenspektrometrischen Verfahren verstanden, bei denen der Laserstrahl oder die Ionenstrahlen oder die Neutralteilchenstrahlen einerseits und Probenoberfläche andererseits definiert und relativ zueinander bewegt werden, und zwar derart, dass Massenspektren aller Bereiche der Probenoberfläche aufgenommen werden und die erhaltenen Massenspektren ihrem jeweiligen Entstehungsort auf der Probenoberfläche zugeordnet werden können.
  • Weiterhin kann die vorbereitete Probe auch für mikroskopische Verfahren der Massenspektrometrie verwendet werden. Darunter versteht man, dass von der Probe mit Hilfe eines großflächigen Laserstrahls Ionen in die Gasphase gebracht werden und mit Hilfe einer Ionenoptik diese Ionen auf einen Detektor derart abgebildet werden, dass sich der räumliche Entstehungsort der Ionen und der Abbildungsort einander zuordnen lassen. Unter großflächig wird dabei ein Laserstrahl verstanden, der einen Bereich der Probenoberfläche beschießt, welcher größer ist als derjenige Bereich ist, in dem der Detektor Ionen im Hinblick auf ihre unterschiedlichen Entstehungsorte auf der Probenoberfläche trennen kann. Durch Auslesen einzelner Abbildungsorte des Detektors kann somit ein Verteilungsbild der Ionen erstellt werden.
  • Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren bekannt, mit deren Hilfe Analyten auf einen Probenträger aufgebracht werden können. Hierzu zählt beispielsweise das Aufsprühen des gelösten Analyten und anschließendes Trocknen. Das Trocknen kann hierbei nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen, wie beispielweise, aber nicht erschöpfend, bei Raumtemperatur und Normdruck, bei Temperaturen über Raumtemperatur und/oder bei Drücken unter Normaldruck sowie durch Lyophilisieren. Des Weiteren ist dem Fachmann bekannt, dass biologische Proben, wie beispielsweise Zellen, Zellbestandteile, Zellextrakte und Gewebeschnitte, durch Aufpressen, Aufwachsen oder Aufkleben auf den Probenträger aufgebracht werden können. Es ist ebenso möglich, Zellen nach dem Fachmann bekannten Verfahren auf dem Probenträger aufwachsen zu lassen, wobei der Fachmann weiß, dass er ein Probenträgermaterial zu wählen hat, auf welchem die aufzuwachsende Zelllinie haftet. Das Aufbringen biologischer Proben ist beispielsweise in L. Li, R. W. Garden, E. V. Romanova, and J. V. Sweedler: „In situ sequencing of peptides from biological tissues and single cells using MALDI-PSD/CID analysis.", Analytical Chemistry; 71 (1999) 5451–5458 beschrieben.
  • Des weiteren sind dem Fachmann Probenträger bekannt, deren Oberfläche mit sog. Ankermolekülen versehen sind, wobei diese Anker gezielt bestimmte Gruppen von Substanzen aus einem Analytgemisch binden, andere Substanzgruppen jedoch nicht gebunden werden. Des weiteren sind dem Fachmann Probenträger bekannt, deren Oberfläche mit sog. Beads versehen sind, wobei diese Beads ihrerseits Ankermoleküle auf ihrer Oberfläche besitzen. Durch Ablagern der Beads mit einer Größe von wenigen Nanometern bis in den Mikrometerbereich lassen sich zur Verfügung stehende Oberflächen die mit Ankermolekülen versehen sind stark vergrößern. Des Weiteren kennt der Fachmann feste Träger, die beispielsweise aus Kügelchen, Nadeln, Kämmen oder Wafern bestehen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für alle dem Fachmann bekannten Matrixsubstanzen. Hierzu zählen beispielsweise, aber nicht erschöpfend: 2-Aminobenzoesäure, 3-Aminobenzoesäure, 3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure (Sinapinsäure), alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA), 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA), 2,5-Dihydroxybenzoesäure (2,5-DHB), 2,3-Dihydroxybenzoesäure, 2,4-Dihydroxybenzoesäure, 2,6-Dihydroxybenzoesäure, 3,4-Dihydroxybenzoesäure, 2,5-Dihydroxybenzoesäure, Picolinsäure, 2,4,6-Trihydroxyacetophenon, 2,3,4-Trihydroxyacetophenon, Nitrobenzylalkohol, Nikotinsäure, Ferulasäure, Kaffeesäure, Ellagsäure, cis-o-Cumarsäure, trans-o-Cumarsäure, cis-p-Cumarsäure, trans-p-Cumarsäure, 6-Aza-2-thiothymidin, Harnstoff, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Malonsäure und Malononitril.
  • Zur Herstellung des Lösungsmitteldampfes zur Umkristallisation der Matrixschicht sowie zur Herstellung dieser Matrixschicht können als kondensierbare Komponente dem Fachmann bekannte Lösungsmittel wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend, Wasser, Methanol, Ethanol, Aceton, Acetonitril, Propanol, Isopropanol, n-Butanol, iso-Butanol, tert.-Butanol, Essigsäureethylester, Benzol, Toluol, 1,2-Dimethylbenzol, 1,3-Dimethylbenzol, 1,4-Dimethylbenzol, Cyclohexan, Cyclohexanol, Dichlormethan, Chloroform, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Dimethylformamid, Diethylamin, Phenylethylamin verwendet werden. Weitere Lösungsmittel, beispielsweise aus den Gruppen der Ester, Ether, Carbonsäuren, Amine, Aliphaten, Aromaten, Araliphaten und Halogenaliphaten sowie Gemische aus mindestens zwei Lösungsmitteln sind dem Fachmann bekannt und können, ohne den Schutzbereich der Patentansprüche zu verlassen, verwendet werden. Dabei können diese Lösungsmittel ganz oder teilweise deuteriert sein, so dass beispielsweise an Stelle von Wasser D2O eingesetzt werden kann, um leicht ablösbare, saure Protonen in der Matrix- und/oder Analytsubstanz gegen Deuteriumionen ausgetauscht werden können, wenn für einen Austausch der Atmosphäre gesorgt wird. Deuterierung und Austausch der Atmosphäre sind dem Fachmann bekannt und können z. B. in B. Spengler, F. Lützenkirchen, R. Kaufmann: „On-target Deuteration for Peptide Sequencing by Laser Mass Spectrometry", Organic Mass Spectrometry, 28 (1993), 1482–1490 nachgeschlagen werden. Zur Herstellung des Gas-Dampf-Gemisches sind dabei solche Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische zu wählen, in denen die gewählte Matrixsubstanz löslich ist.
  • Im Falle des Vorliegens von Analyten, die beispielsweise oxidationsempfindlich oder leicht zersetzlich sind, kann optional zusätzlich zu dem verdampfbaren Lösungsmittel ein Inertgas verwendet werden. Als Inertgas eignen sich beispielsweise Luft, Stickstoff, Helium, Neon, Argon, Krypton, Xenon, Kohlendioxid sowie Gemische dieser Gase. Dem Fachmann ist bekannt, dass die Gaszusammensetzung dieses Inertgases (Trägergases) während der Bedampfung verändert werden kann, beispielsweise durch Austausch eines Gases gegen ein anderes. So kann beispielsweise Luft gegen Stickstoff ausgetauscht werden, um Oxidationsreaktionen zu vermeiden.
  • Der Fachmann kennt zahlreiche Probenträgermaterialien, die für die Aufbringung von Analyten und Matrices für massenspektrometrische Untersuchungen geeignet sind. Hierzu zählen beispielsweise, aber nicht erschöpfend, Gold, Aluminium, Stahl, Silicium, Teflon, Quarz, Metalle, Metalllegierungen, Metalloxide, PVDF, Cellulose, regenerierte Cellulose, anionisch modifizierte Cellulose, kationisch modifizierte Cellulose, Nylon, Nitrocellulose und dem Fachmann bekannte funktionalisierte Oberflächen, die beispielsweise mit Beads oder Ankermolekülen beladen sein können. Unter funktionalisierten Oberflächen sind dabei solche chemischen Strukturen zu verstehen, welche Analyt- und/oder Matrixmoleküle selektiv physikalisch und/oder chemisch binden und/oder chemisch oder biochemisch mit Anker- und/oder Matrixmolekülen reagieren. Dem Fachmann ist bekannt, dass er im Falle der Verwendung von Probenträgermaterialien, die nicht elektrisch leitfähig sind, diese mit einem elektrisch leitfähigen Material verbinden muss, um einen für die Massenspektrometrie geeigneten Probenträger zu erhalten, falls der Probenträger die erste Beschleunigungselektrode innerhalb des Massenspektrometers darstellen soll. Dem Fachmann ist bekannt, dass Größe und Form der Probenträger (beispielsweise rund oder rechteckig) abhängig vom jeweiligen Messsystem und von den zu messenden Proben ausgewählt werden müssen.
  • Unter „mikroskopisch strukturierten Proben" werden dabei solche Proben verstanden, deren räumliche Dimensionen nur mit einem Mikroskop aufgelöst werden können, d. h. dass die räumlichen Dimensionen etwa 1 nm bis 200 μm betragen.
  • Als hinreichend gleichmäßig werden gemäß der vorliegenden Erfindung solche Schichten bezeichnet, die ausschließlich solche Inhomogenitäten aufweisen, welche kleiner als der Laserfokus sind, bevorzugt kleiner al 3 μm.
  • Dem Fachmann ist bekannt, dass der Analyt bwz. die Analyten sowie die Matrixsubstanz auch durch mehrmalige Wiederholung eines einzigen Verfahrens und/oder durch Kombination mehrerer Verfahren zur Aufbringung von Analyt bzw. Matrix aufgebracht werden können.
  • Zur Umkristallisation der Matrixschicht eignen sich dem Fachmann bekannte Lösungsmittelreservoire wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend: Behälter oder Becher die offen sind, damit die Lösungsmitteldämpfe entweichen können; Materialien, die das Lösungsmittel aufsaugen, wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend getränkte Tücher aus Papier, Textilmaterialien oder Kunststoffen sowie Schwämme; Behälter oder Becher, aus denen das Lösungsmittel versprüht wird oder mittels Druck durch eine Düse oder eine Membran gedrückt wird; Behälter oder Becher, aus denen mit Hilfe von Ultraschall Tröpfchen in die Gasphase befördert werden (Ultraschallvernebler). Dem Fachmann ist bekannt, dass diese Lösungsmittelreservoire auch bei der Präparation der Matrixschicht einsetzbar sind.
  • Werden die Standardmethoden zur Probenpräparation in Hinblick auf Kristallgröße, Migration und Verhalten des Analyten bei Einbau in den Kristall untersucht, so zeigt sich, dass eine Auftrennung und damit eine Migration des Analyten nach seiner Hydrophobizität bzw. seiner Polarität stattfindet. Da die Analyten, hier beispielsweise Peptide, eine unterschiedliche Polarität aufgrund ihrer Aminosäurezusammensetzung vorweisen, ist ihre Affinität zu den verschiedenen polaren Lösungsmitteln unterschiedlich. Die Matrix ist in den meisten Fällen in einem Gemisch aus mehreren Lösungsmitteln gelöst (z. B.: Wasser: polares Lösungsmittel, Ethanol: schwach polares Lösungsmittel). Bei der Auskristallisation der Probe wird aufgrund des höheren Dampfdruckes zunächst vorwiegend das unpolare Lösungsmittel verdampft und es reichern sich die hydrophilen Anteile des Analyten im flüssigen Rest der Probe in der Mitte an, bevor auch dieser eintrocknet. Dieselben Phänomene finden auch im Mikromaßstab statt. Gleichzeitig ist die Geschwindigkeit der Auskristallisation ein entscheidender Faktor für die Verhältnisse in den Kristallen. Werden nun die einzelnen Kristalle untersucht auf die Verteilung des Analyten, so stehen die gefundenen Ergebnisse im Gegensatz zu den Untersuchungen die an Matrix-Kristallen von Horneffer, V.; Forsmann, A.; Strupat, K.; Hillenkamp, F.; Kubitscheck, U; Localization of analyte molecules in MALDI preparations by confocal laser scanning microscopy, Analytical Chemistry; 73 (2001) 1016–1022 durchgeführt wurden. Die Bilder, die von Kristallen mittels konfokaler Mikroskopie gemacht wurden, weisen nicht auf eine unterschiedliche Verteilung der Analyten innerhalb des Kristalls hin. Zu diesen Untersuchungen sind die Kristalle allerdings über einen viel längeren Zeitraum gezüchtet worden und erheblich größer, so dass von einer Kristallisation aus dem chemischen Gleichgewicht heraus ausgegangen werden kann. Eine inhomogene Verteilung wird bei der MALDI-Matrixpräparation offenbar erst durch die schnelle Eintrocknung der Probe verursacht. Darauf weisen auch die Messungen in 6 hin.
  • Dem Fachmann ist ohne weiteres ersichtlich, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Präparation von Analyten zur automatisierten Herstellung von Präparaten für analytische Messungen, bevorzugt für massenspektrometrische Messungen, eignet.
  • [Ausführungsbeispiele]
  • Ausführungsbeispiel 1 ("Migration in Dried-droplet-Standardpräparation")
  • Die Kristallisationsprozedur der sogenannten „Dried-droplet" Standardmethode führt zu einer etwa ein bis zwei Millimeter großen kreisförmigen Probe, deren Rand aus größeren Kristallen und deren innerer Bereich aus feineren Kristallen besteht. Vor der Präparation wird der Probenteller (Aluminiumträger mit 8 μm Goldbeschichtung, 20 mm Durchmesser) wie unten beschrieben intensiv gesäubert, um eine Kontamination des Tellers mit anderen Substanzen, insbesondere Natrium- und Kaliumionen, zu vermeiden. Dazu wird auf den Probenteller 5 bis 10 mal 2 bis 5 ml verschiedener Lösungsmittel (z. B.: Aceton (ACS, Merck, Darmstadt), Isopropanol (LiChrosolv, Merck, Darmstadt), Wasser (ACS, Sigma-Aldrich, Frankfurt), Ethanol (Uvasol, Merck, Darmstadt)) aufgetropft und mit einem staubund fusselfreien Papiertuch (z. B. KimWipes, Kimberly-Clark, Neenah, USA) abgerieben. Anschließend werden 2 bis 5 ml Ethanol auf den Probenträger getropft und unter einem heißen Luftstrom mittels eines Föns bei ca. 80°C getrocknet. Auf den noch handwarmen Probenträger werden 0,5 μl der Analytgemischlösung (typische Konzentrationen: 1·10–7 mol/l bis 5·10–5 mol/l) getropft. Danach gibt man 0,5 μl 2,5-DHB-Lösung (10 mg/ml in Ethanol/ 0,1% wässriger TFA, 60:40 V/V) zu dem Tropfen hinzu und vermischt sie. Abhängig von der gewünschten Dauer des Kristallisationsvorgangs wird der Probenteller entweder an der Luft mehrere Minuten oder unter einem heißen Luftstrom in wenigen Sekunden getrocknet. Die Größe der entstehenden Kristalle hängt dabei stark von der Geschwindigkeit des Eintrocknens bzw. der Kristallisation ab. Wird der Probenteller an Luft getrocknet, entsteht ein ausgeprägter Rand der Probe, der aus großen, bis zu mehreren 100 μm langen Kristallen besteht. Durch die Erhöhung des Wasseranteils auf bis zu 100% in der Matrixlösung kann dieser Effekt, gegeben durch den wesentlich geringeren Dampfdruck des Wassers, noch verstärkt werden. Da der innere Teil der Probe während der Kristallisation des Randes immer noch mit Flüssigkeit bedeckt ist, entstehen die Kristalle im inneren Bereich erst kurz bevor die Probe eintrocknet. Dabei bildet sich in kurzer Zeit ein Schicht von vielen sehr kleinen Kristallen. Diese Schicht lässt sich klar vom Rand der Probe, meist durch einen schmalen Bereich zwischen Rand und feinkristallinem Innerem, in dem fast keine Kristalle vorhanden sind, differenzieren. Es kann so schon auf sehr einfache Weise gezeigt werden, dass durch die Art und Weise des Kristallisationsvorganges innerhalb der Probe eine Trennung der Analyten vor sich geht. Bereits der Vergleich zwischen 30 bis 40 aufsummierte Massenspektren nach Ausführungsbeispiel 7 vom Rand bzw. vom inneren Bereich der Probe zeigt 4, dass die fast unvermeidlichen Verunreinigungen einer Probe durch Natrium- oder Kaliumionen im Inneren der Probe stärker lokalisiert sind als am Rand.
  • Ausführungsbeispiel 2 („Langsame MALDI-Standardpräparation")
  • 5 stellt die Verteilungsbilder eines Peptidgemischs aus dem stark hydrophilen Liptropin 1–10 und dem stark hydrophoben Anti-Inflammatory Peptid dar. Es wurde eine „Dried-droplet" Präparation wie in Ausführungsbeispiel 1 verwendet. 1 μl Peptidgemisch in Ethanol/Wasser (1:1 v/v, 5·10–5 mol/l) wurde auf den Probenträger (Aluminiumträger mit 8 μm Goldbeschichtung, 20 mm Durchmesser) gegeben und mit 1 μl Matrix (2,5-DHB) in Ethanol/Wasser (2:3 v/v, 20 μg/ml) auf dem Teller vermischt. Die Probe kristallisierte dann ca. fünf Minuten an der Raumluft aus. Durch die langsame Auskristallisation entstanden am Rand der Probe große 2,5-DHB-Kristalle mit einer Größe bis zu 500 μm. Dabei wurde ein Bereich von 100 μm mal 100 μm mit einer Auflösung von 1 μm abgerastert. Die Graustufenverteilungsbilder (vgl. Ausführungsbeispiel 8 und 5) zeigten eine unterschiedliche Verteilung der Peptidsignale innerhalb eines großen Kristalls. Die linke Seite der Bilder wird von einem Kristall dominiert, der größer ist als der Bildausschnitt. In der Mitte ist eine schmale Nadel mit einer Breite von ca. 10 μm zu sehen. Die Größe der Kristalle wurde mit einem Olympus BX41 Mikroskop mit integrierter Skala bestimmt. Während innerhalb des großen Kristalls das hydrophile Peptid den oberen rechten Teil dominiert, ist das hydrophobe Peptid im linken unteren Bereich zu finden. In 5 ist eine klare Segregation der beiden Analyten durch die verschiedenen Graustufenbilder dargestellt, während die Intensität des Matrixsignals gleichmäßig über den Kristall verteilt ist.
  • Ausführungsbeispiel 3 („Schnelle MALDI-Standardpräparation")
  • Anders als im Ausführungsbeispiel 2 führt eine abgewandelte Methode dazu, dass innerhalb der Kristalle kaum Segregationseffekte beobachtet werden. In 6 ist ein Peptidgemisch aus Dynorphin 1–9 (hydrophob) und Vasopressin [Arg8] (hydrophil) in denselben Lösungsmittelverhältnissen und mit derselben Matrixlösung wie in Ausführungsbeispiel 2 mit einer Konzentration von jeweils 5·10–5 mol/l präpariert worden. Allerdings wurde nun eine rasche Kristallisation durchgeführt. Durch das Aufheizen des Probentellers vor der Probenpräparation auf 65°C bis 75°C, bevorzugt auf 70°C, bzw. durch Trocknen der Probe unter einem heißen Luftstrom bei 70°C bis 90°C, bevorzugt 80°C, kann eine sehr schnelle Auskristallisation in etwa 5–10 Sekunden erreicht werden. Die dadurch entstehenden Kristalle sind erheblich kleiner als die bei langsamer Kristallisation erzeugten. Die Graustufenbilder des abgerasterten Bildausschnittes (Erzeugung wie in Ausführungsbeispiel 8) von 100 μm mal 100 μm zeigen die Verteilung der beiden Analyten und der Matrix (6). Innerhalb der Kristalle, die eine Größe von 10 μm bis 50 μm haben, sind die beiden Peptide weitgehend homogen verteilt. Die Größe der Kristalle wurde mit einem Olympus BX41 Mikroskop mit integrierter Skala bestimmt. Unter Einbeziehung der dritten Komponente (Matrix) zeigt sich eine Gleichverteilung von Analyt und Matrix. Da die Analyten nur an den Stellen gemessen werden, an denen auch Matrix bzw. ein Matrixkristall vorhanden ist, ist die Verteilung von der Verteilung der Matrix abhängig, aber innnerhalb des Kristalls ist das Gemisch der Peptide homogen verteilt.
  • Ausführungsbeispiel 4 („Standardpräparation unterschiedlich große Peptide")
  • Auch im Vergleich unterschiedlich großer Peptide zeigt sich, dass innerhalb der größeren Matrix-Kristalle die Analyten inhomogen verteilt sein können und sich während der Präparation trennen.
  • Ebenso können auch innerhalb mikrokristalliner Matrices die Analyten inhomogen verteilt sein. Neben der Zeit, die das Matrix-Analyt-Gemisch zum Eintrocknen benötigt, der Hydrophobizität bzw. der Polarität spielt auch die Größe der Peptide eine Rolle. Dies wird nach Bouschen, W; Flad, T.; Müller, C. A., Spengler, B. Characterization of biological samples by Scanning Microprobe MALDI (SMALDI) mass spectrometry with 1 μm lateral resolution, 50th American Society for Mass Spectrometry Conference; 02.06.–06.06.2002, Orlando, Florida, in 7 und 8 deutlich. Die Präparation der Probe erfolgte dabei wie in Ausführungsbeispiel 3, die Messung wie in Ausführungsbeispiel 8 beschrieben. Ein Peptidgemisch aus Substanz P, Melittin und humanem Insulin (Einzelkonzentration je 5·10–5 mol/l, im Verhältnis Substanze:Melittin:Humaninsulin = 1:2:4 gemischt) in Wasser/Ethanol (1:1 v/v) wird mit 2,5-DHB (20 mg/ml, Wasser/Ethanol, 6:4 v/v) wie in Ausführungsbeispiel 1 präpariert. Es werden 0,5 μl Analyt und 0,5 μl auf dem Probenteller gemischt und unter einen warmen Luftstrom (ca. 60°C) in ca. 1 Minute getrocknet. Die Probe zeigt einen Rand mit großen Kristallen und einen feinkristallinen inneren Bereich der Probe. Auch hier wurde ein Bereich von 100 μm mal 100 μm mit einer Schrittweite von 1 μm abgerastert, allerdings ist die räumliche analytische Auflösung dieser Bilder auf Grund einer Verbesserung der optischen Qualität des Laserfokus erkennbar höher als in 5 und 6. In den Graustufen (7) ist eine inhomogene Verteilung der Analyten innerhalb eines Kristalls zu erkennen, obwohl bei diesen Peptiden der Unterschied in der Hydrophilie nicht so groß ist wie in dem ersten Beispiel.
  • Ausführungsbeispiel 5: Bedampfung
  • Der erste Schritt zum Aufbringen der Matrix auf die zu untersuchende Probe besteht im Verdampfen der Matrix als Feststoff und anschließendem Ablagern auf der Probe. Die Bedampfung der Probenträger erfolgte mit einer Verdampfungsanlage.
  • Die Vakuumbedampfungsanlage JEE-4B von Joel (Japan) (9), ursprünglich eingesetzt zur Präparation von Proben für die Elektronenmikroskopie, wird hier zur MALDI-Präparation von biologischen Materialen verwendet.
  • Das Gerät besteht aus einer Glasglocke, die mit einer externen Gasballastpumpe (D12, 12 m3/h, Leybold AG, Köln, Deutschland) und einer internen Öldiffusionspumpe (130 l/min) evakuiert wird. Der Enddruck bei Einsatz der Öldiffusionspumpe liegt bei 110–5 mbar, mit der Gasballastpumpe allein werden 1·10–3 mbar erreicht. Die Kontrolle des Vakuums erfolgt über eine Vakuummessröhre der Firma Pfeiffer Vakuum (Asslar, Deutschland, Compact Full Range Gauge). Mit Hilfe verschiedener Ventile kann das Vakuum in der Glasglocke stufenlos von Atmosphärendruck bis 1·10–3 mbar eingestellt werden. In der Glasglocke befinden sich zwei unabhängige Elektrodensysteme, die verschiedene Heizfäden oder Schiffchen aufnehmen können. Die Elektroden können mit einen Strom von bis zu 40 A beschickt werden, um eine Verdampfung der Materialien zu ermöglichen. Bei der Verdampfung von Matrix wird ein Schiffchen verwendet, in dem bis zu 50 mg Material erhitzt werden können. Ein Schiffchen ist ein aus dünngewalztem Metall bestehender Behälter, der zwischen zwei Elektroden eingespannt wird und der mittels eines Stromes, der durch das Schiffchen geleitet wird, erhitzt wird (11). Dabei ist zur Temperatursteuerung (bis 300°C) ein Thermofühler, der mittels Widerstandsmessung die Temperatur misst, an dem Schiffchen angebracht, um eine konstante Temperatur über einen längeren Zeitraum einzustellen.
  • Ausführungsbeispiel 5a: Beständigkeit von Matrixsubstanzen beim Erhitzen
  • Es wurden die drei Matrices 2,5-DHB (Schmelzpunkt: 236°C–238°C), Sinapinsäure (Schmelzpunkt: 203°C–205°C) und CHCA (Schmelzpunkt: 252°C) verwendet. Alle drei Matrices wurden zunächst auf ihre Beständigkeit beim Erhitzen untersucht. Dazu wurde ein Probenträger 15 mm oberhalb des Schiffchens, in dem sich die Matrix befand, mit der Probenträgerseite nach unten montiert. Das Schiffchen wurde mit 10 mg bis 60 mg der jeweiligen Matrixsubstanz befüllt. Das Erhitzen des Schiffchens erfolgte derart, dass die Temperatur ausgehend von Raumtemperatur um 10°C pro Minute erhöht wurde. Dabei konnten mit den angegebenen Mengen an Matrixsubstanz bis zu fünf Proben präpariert werden. Schon die ersten Versuche zeigten, dass es nicht notwendig war, die Matrices bis zum Schmelzpunkt zu erhitzen, da sich bereits bei niedrigeren Temperaturen durch Sublimation bei Normaldruck eine Schicht auf dem Probenträger ablagerte. Schon bei Temperaturen in einem Bereich von 80°C bis 130°C sublimierte genügend Material, um eine feinkristalline Schicht auf dem Probenträger zu bilden (11, rechtes Photo). Beim erstmaligen Erhitzen der Matrixsubstanz ist darauf zu achten, dass die Temperatur um maximal 5°C pro Minute erhöht wird, da bei stärkerem Erhitzen das in der Matrixsubstanz enthaltene Kristallwasser zu schnell verdampft, wodurch das Matrixmaterial schlagartig sublimiert und bei der anschließend Resublimation derart große Matrixkristalle entstehen, dass die Matrixkristalle nicht am Probenträger haften.
  • Ausführungsbeispiel 5b: Massenspektrometrische Messung der Matrixschichten
  • Die aufgewachsenen Schichten wurden anschließend mit dem Massenspektrometer „Lamms 2000" vermessen, wobei dieselben Messbedingungen wie in Ausführungsbeispiel 7 gewählt wurden. Die 2,5-DHB-Schicht wurde zunächst gebildet, indem die Matrix in der Bedampfungsanlage für 9 bis 15 Minuten auf 100°C bis 140°C bei Atmosphärendruck erwärmt wurde. Bevorzugt wurde bei 130°C für 12 Minuten bei Atmosphärendruck erwärmt. Die Schicht auf dem Träger zeigte im Massenspektrometer ein Spektrum, das vergleichbar war zu normal präparierten MALDI-MS-Spektren (Ausführungsbeispiel 1, 12, oben). Im niedrigen Massenbereich von m/z = 46 u bis 137 u fanden sich in geringer Intensität Abbauprodukte von 2,5-DHB, wobei unter geringer Intensität verstanden wird, dass die Signalintensitäten nur um einen Faktor 2 bis 5 über dem Grundrauschen lagen. Im Gegensatz zu den Massenspektren einer MALDI-Präparation waren im Spektrum mehr 2,5-DHB-Cluster im Massenbereich von m/z = 300 u bis 600 u zu sehen.
  • Ausführungsbeispiel 5c: Sublimation der Matrix bei vermindertem Druck
  • Weitere Versuche zeigten, dass die Bildung von Abbauprodukten und Clustern unterdrückt werden konne, wenn die Sublimation der Matrix bei einem reduzierten Druck und damit auch bei einer reduzierten Temperatur erfolgte (12, unteres Spektrum). Als optimaler Wert für die Sublimation von 2,5-DHB ergab sich ein Druckbereich von 5·10–1 mbar bis 5 mBar, bevorzugt ein Druck von 1 mbar. Daraus folgte für 2,5-DHB eine Temperaturbereich von 40 bis 60°C, bevorzugt von 48°C, zur Sublimierung. Der Probenträger wurde 5 Minuten bedampft. Die beiden anderen Matrices, Sinapinsäure und CHCA, zeigten ein ähnliches Verhalten. Sinapinsäure sublimiert bei Normaldruck ab ca. 90°C, bei einem reduzierten Druck von 1 mbar bei 45°C. CHCA sublimiert bei ca. 110°C unter Normaldruck und bei 1 mbar bei 53°C. In den Massenspektren fanden sich ebenfalls Abbauprodukte und Cluster der Matrices. Die Schichten, die auf die Probenträgen aufgedampft wurden, erwiesen sich als wenig stabil gegenüber mechanischer Belastung (11, linkes Photo). Schon der Beschuss mit dem hochfokussierten Stickstofflaserstrahl reichte aus, um größere Teile aus den Schichten herauszubrechen. Insbesondere war dies bei Sinapinsäure und CHCA zu beobachten.
  • Bei einer Laserenergie nahe der Schwelle der Ionendetektion konnten die Beschädigungen der Schichten derart reduziert werden, dass Messungen mit einem Fokusdurchmesser und einer analytischen Auflösung von 0,5 bis 5 μm möglich waren. Bei einem Laserfokus von 0,8 μm betrug diese Laserenergie nahe der Schwelle der Ionendetektion ca. 1·1010 W/cm2; bei einem Laserfokus von 15 μm ca. 1·107 W/cm2. Der vorher auf den Probenträger mit Hilfe eines Filzstiftes aufgebrachte rote Farbstoff des Filzstiftes verdeutlichte, dass durch das Aufbringen der Matrix nach diesem Ausführungsbeispiel eine vor der Präparation aufgebrachte Substanz nicht über die analytische Auflösung hinausgehend migriert. Die deutliche Grenze zwischen Farbstrich und Goldoberfläche bleibt auch nach der Bedampfung mit Matrix erhalten und zeigt im Auflösungsbereich von 0,5 bis 3 μm keine Migration. Die Aufnahmen wurden mit einem Olympus BX41 Mikroskop mit integrierter Skala aufgenommen.
  • Ausführungsbeispiel 5d: Bedampfung von Probenträgern, auf die zuvor Analyt aufgebracht wurde
  • Um die erzeugten Matrixschichten in Hinblick auf ihre Fähigkeit zu überprüfen, mit ihnen MALDI-Massenspektrometrie von Oberflächen zu betreiben, wurde vor der Bedampfung nach diesem Ausführungsbeispiel auf den Probenträger nach Ausführungsbeispiel 1 ein Gemisch aus den drei Peptiden Substanz P, Melittin und Insulin aufgebracht. Es wurden die einzelnen Komponenten jeweils mit einer Konzentration von 1·10–5 mol/l in Ethanol/Wasser 1:1 (v/v) gelöst und dann im Verhältnis 1:2:4 (Substanz P:Melittin:Insulin) gemischt. Dieses Gemisch zeigte im Massenspektrum bei MALDI-Präparation nach Ausführungsbeispiel 1 ein Massenspektrum mit guter, etwa gleich hohe Signalintensität für alle drei Komponenten. Auf den Probenträger wurde 1 μl des Gemischs aufgebracht. Nach ca. 10 Minuten bei Raumtemperatur und Normdruck war der Tropfen vollständig eingetrocknet, so dass eine Bedampfung mit Matrix nach diesem Ausführungsbeispiel durchgeführt werden konnte. Nach der Bedampfung des Probenträgers mit Matrix (2,5-DHB) wiesen die Massenspektren zunächst nur sehr geringe Signalintensitäten der drei Substanzen auf. Bei Bestrahlungsstärken von etwa 1·107 W/cm2 bis etwa 1·1010 W/cm2 bei einem Laserfokus von ca. 1 μm, die üblicherweise bei MALDI-Messungen mit dem in Anwendungsbeispiel 8 beschriebenen Gerät verwendet werden, konnten keine Massensignale der Peptide detektiert werden. Erst bei fünffach bis zehnfach erhöhter Bestrahlungsstärke im Bereich von 5·1010 W/cm2 bis 10·1010 W/cm2 (Anwendungsbeispiel 8) und Aufsummierung von 200 bis 400 Einzelspektren wurden schwache Massensignale erkennbar (13). Auch bei Geräten mit Laserfoci von 50 μm bis 200 μm, bei denen die Bestrahlungsstärken im Bereich von 1·106 W/cm2 bis 1·101 W/cm2 liegen, führt erst eine fünffache bis zehnfache Verstärkung der Bestrahlungsstärke zu einem Messsignal. Die geringe Intensität der Peptidsignale (13) kann mit der mangelhaften Vermischung der Analyten mit der Matrix erklärt werden. Der Einbau des Analyten ist den Matrixkristall ist zwar zur Messung laut Horneffer, V.; Dreisewerd, K; Ludemann, H. C.; Hillenkamp, F.; Lage, M.; Strupat, K.; Is the incorporation of analytes into matrix crystals a prerequiste for matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry? A study of five positional isomers of dihydroxybenzoic acid; International Journal of Mass Spectrometry; 187 (1999) 859–870, nicht zwingend notwendig, allerdings ist, bedingt durch den kleinen Laserfokus, der Bereich aus dem Matrix und Analyt gleichzeitig desorbiert werden, sehr klein. Bei der Aufsummierung der Einzelspektren wurde beobachtet, dass die Signalintensitäten der Peptide innerhalb von mehreren Einzelmessungen stark schwanken. Bei mehrfachem Beschuss derselben Probenstelle ist zunächst nur Matrix im Massenspektrum zu sehen. Nach 5–10 Laserschüssen werden die Analyten für 2–3 Schüsse im Spektrum sichtbar. Danach nahm die Signalintensität für diese Probenstelle insgesamt ab. Dieses Phänomen deutete auf eine mangelhafte Integration des Analyten in die Matrix hin. Erst wenn die bedampfte Schicht nahezu abgetragen war, wurden für wenige Laserschüsse Analyt und Matrix gemeinsam desorbiert. Im Anschluss daran war die Probe an dieser Stelle aufgebraucht.
  • Ausführungsbeispiel 6: Funktion der Matrix nach Bedampfung
  • 14 zeigt, dass die Matrix auch nach der Sublimation gemäß den Ausführungsbeispielen 5 bis 5d chemisch weitgehend unverändert vorliegt und ihre Funktion im Desorptions/Ionisationsprozess nach wie vor erfüllt. Der Probenträger wurde dazu nach Ausführungsbeispiel 5d mit einem Tropfen des Peptidgemischs beladen. Nach dem Eintrocknen des Tropfens wurde die Matrixschicht (2,5-DHB) aufgedampft. Anschließend wurde die erzeugte Matrixschicht im Bereich des eingetrockneten Tropfens mit 1 μl Ethanol/Wasser 1:1 (v/v) wieder aufgelöst und durch einen warmen Luftstrom (60°C) erneut getrocknet. Die entstandenen Matrixkristalle zeigten nun das typische Aussehen einer normalen MALDI-Präparation nach Ausführungsbeispiel 1. Auch die resultierenden Massenspektren nach Ausführungsbeispiel 7 unterschieden sich nicht von den typischen Massenspektren einer normalen MALDI-Präparation. Durch die jetzt wieder mögliche Reduzierung der Bestrahlungsstärke wegen des besseren Einbaus der Analyten in die Matrix waren in diesem Spektrum keine Matrixcluster zu beobachten. Bemerkenswert ist, dass jetzt auch keine Abbauprodukte der Matrix zu sehen waren (14, Ausschnitt).
  • Ausführungsbeispiel 7: Befeuchten der Matrix
  • Die Bedampfung und das anschließende Lösen und Umkristallisieren der Matrixschicht zeigte sich als sinnvolle Strategie zur Matrixpräparation unter Erhalt von Nachweisempfindlichkeit und Ortsauflösung. Die Trennung der Präparation in zwei Schritte (Aufdampfen der Matrix und Integration des Analyten) stellte dabei einen entscheidenden Punkt dar, um eine weitreichende Kontrolle über die Präparationsbedingungen zur Erzeugung einer homogenen Matrixschicht mit Integration des Analyten zu erzielen.
  • Um eine verbesserte Integration des Analyten in die aufgedampfte Matrixschicht nach Ausführungsbeispiel 5d zu erreichen, wurden die Probenträger einer feuchten Umgebung ausgesetzt.
  • Dazu wurden die fertig bedampften Probenträger in einen geschlossenen Glasbehälter gegeben. Unter die Probenträger wurde ein Papiertuch, z. B. Kimwipes (Kimberly-Clark, Neenah, USA) gelegt, das mit destilliertem Wasser getränkt war. Der Behälter wurde dann von unten erhitzt, so dass sich eine mit Wasser gesättigte Atmosphäre um den Probenträger bildete. Bei der Wahl des Behälters war zu beachten, dass das gebildete Kondenswasser am Deckel und am Rand des Behälters ablief und nicht auf die Probe tropfen kann. Der Behälter wurde zum Erhitzen etwa 0,5 cm bis 2 cm tief, bevorzugt 1 cm tief, in ein Sandbad mit Temperaturkontrolle gestellt. Um eine übersättigte Atmosphäre über mehrere Tage hinweg aufrecht zu erhalten, wurde der Behälter mit einer Verschlussfolie, z. B. Parafilm M (Karl Hecht KG, Sondheim, Deutschland) zum Abdichten umwickelt, um ein Austrocknen zu verhindern. Die ersten Versuche wurden mit 1 ml destilliertem Wasser und einer Temperatur des Sandbades von 65°C durchgeführt. Spätere Versuche wurden mit 0,5 ml Wasser und höheren Temperaturen von 80°C durchgeführt, da durch die Reduzierung der zugegebenen Wassermenge die Kondensation am Deckel begrenzt werden konnte und so die Gefahr von Tropfenbildung so weit verringert werden, so das keine Tropfen mehr vom Deckel tropften. Die Temperatur wurde mit einem Thermometer am Boden des Behälters gemessen. In den ersten Versuchen zeigte sich nach zwei bis drei Tagen der Inkubation eine erkennbare Umkristallisation der Matrixschichten abhängig von der Wahl der Matrix (15). Während 2,5-DHB optisch deutliche Veränderungen aufwies, waren die Veränderungen bei Sinapinsäure und CHCA kaum sichtbar. Die Umkristallisation wurde durch optische Begutachtung mit einem Olympus BX41 Mikroskop mit integrierter Skala kontrolliert.
  • Die inkubierten Schichten aus 2,5-DHB kristallisierten wesentlich schneller um. Schon nach 1 bis 3 Stunden wurden erste optische Veränderungen sichtbar, und nach 14 Tagen war der Prozess vollkommen abgeschlossen. Das unterschiedliche Verhalten der drei Matrices ist durch ihre unterschiedlichen Wasserlöslichkeiten bedingt. Während sich Sinapinsäure und CHCA sehr schlecht in Wasser lösen, ist 2,5-DHB gut wasserlöslich. Die 2,5-DHB-Schicht wurde durch die Umkristallisation wesentlich stabiler, und das Herauslösen von großen Teilen durch mechanische Belastungen oder durch Laserbeschuss wurde verhindert.
  • Ausführungsbeispiel 7a: Verändern der Kristallisationsgeschwindigkeit
  • Die Kristallisation konnte durch die Erhöhung der Temperatur der feuchten Atmosphäre beschleunigt werden. Versuche mit einer Temperatur von 125°C des Sandbades führten schon nach 24 Stunden zur Umkristallisation, und nach drei Tagen konnte keine weitere Veränderung der Probenoberfläche festgestellt werden. Die Veränderungen der Oberfläche wurde durch optische Begutachtung mit einem Olympus BX41 Mikroskop mit integrierter Skala bestimmt. Eine weitere Erhöhung der Temperatur schien auf Grund der Schmelztemperaturen der verwendeten Matrices von 200 bis 260°C nicht mehr sinnvoll. Höhere Temperaturen als 70°C am Probenteller sind im Hinblick auf die zu vermessenden Proben zu vermeiden, da ab diesen Temperaturen die Denaturierung von Proteinen einsetzt und so bei biologischen Proben unerwünschte Veränderungen eintreten.
  • Ausführungsbeispiel 7b: Kontrolle der räumlichen Verteilung eines Filzstiftstriches nach Umkristallisation
  • Die Randbegrenzung eines Filzstiftstriches in 16 (linkes Photo) zeigt sowohl vor als auch nach der Bedampfung mit Matrix nach Ausführungsbeispiel 5c und Inkubation mit Wasser (rechtes Photo) nach diesem Ausführungsbeispiel weiterhin eine scharfe Grenze zwischen Farbe und unbehandeltem Aluminiumprobenträger. Trotz der Veränderung durch die Präparation kann bei dieser Art der Behandlung nach optischer Begutachtung durch ein Olympus BX41 Mikroskop mit integrierter Skala davon ausgegangen werden, dass die räumliche Verteilung der Analyten auf der Oberfläche der Probe innerhalb der Auflösung des rasternden Lasers nach Ausführungsbeispiel 7 erhalten bleibt.
  • Ausführungsbeispiel 7c: Kontrolle der räumlichen Verteilung von Peptiden nach Umkristallisation
  • Die Veränderung der Schichten durch Inkubation mit Wasser hängt auch von dem oder den Analyten selber ab. Schon beim Auftragen von Peptidgemischen auf die Oberfläche nach Anwendungsbeipiel 1 und anschließender Präparation nach Ausführungsbeispiel 5d und diesem Ausführungsbeispiel (7c) zeigte sich ein unterschiedliches Kristallisationsverhalten der Matrix beim Vergleich der Bereiche innerhalb und neben dem aufgetragenen Peptidgemisch. (17). Auf einem Goldprobenträger, der zuvor großflächig mit einem verdünnten roten Farbstoff bestrichen worden war, wurde 1 μl des wie in Ausführungsbeispiel 5d beschrieben hergestellten Peptidgemischs aus Substanz P, Melittin und Insulin aufgetragen. Nachdem der Tropfen eingetrocknet war, wurde der Träger fünf Minuten mit 2,5-DHB bei 48°C in der Bedampfungsanlage bedampft. Danach wurde er 24 Stunden bei einer Sandbadtemperatur von 125°C mit Wasser inkubiert. Die Grenze des zuvor eingetrockneten Tropfens war nach dem Bedampfen mit Matrix und auch nach der Inkubation der Analyten mit Wasser noch eindeutig zu erkennen (17). Auch eine Umkristallisation der Matrix war zu beobachten. Dennoch blieb die scharfe Grenze des vorher aufgegebenen Peptidgemischs nach optischer Begutachtung durch ein Olympus BX41 Mikroskop mit integrierter Skala erhalten. Dieses Beispiel zeigt, dass eine Präparation ohne eine merkliche Wanderung des Peptidgemischs möglich ist.
  • Ausführungsbeispiel 7d: Messung des erfindungsgemäß präparierten Analyten mittels SMALDI-Massenspektrometrie
  • 18 zeigt, dass eine räumliche analytische Auflösung von etwa 2 μm mit dieser Präparationsmethode gemäß Ausführungsbeispiel 7c mittels SMALDI-Massenspektrometrie nach Ausführungsbeispiel 8 erreicht werden kann. Es wurden zwei Messungen der gleichen Probenstelle durchgeführt. Ein Bereich von 100 μm mal 100 μm wurde mit einer Schrittweite von 1 μm abgerastert. Jeweils ein Laserschuss pro Rasterschritt wurde auf den Probe abgegeben und ein Massenspektrum aufgenommen. In 18 sind die Intensitätsverteilungen für drei Massen dargestellt. Die obere Reihe zeigt das Massesignal der aufgetragenen Matrix 2,5-DHB ([2·2,5-DHB-2μ·H2O+H]+ = 273 u), die mittlere Reihe gehört zu dem zuvor aufgetragenen verdünnten roten Farbstoff (m/z = 450 u) und die untere Reihe gehört zum Peptid Substanz P (m/z = 1348,6 u). Die Verteilung der einzelnen Komponenten zeigt, dass sowohl die Matrix als auch der rote Farbstoff gleichmäßig verteilt sind. Da exakt der Rand des eingetrockneten Tropfens abgerastert wurde, ist Substanz P als ein Analyt des Peptidgemischs nicht gleichmäßig verteilt. Deutlich ist eine Grenze im oberen Bereich des Bildes von ca. 3 μm Breite zu sehen, in dem die Intensität des Substanz P-Massesignals auf Null abfällt. Die erzielten Intensitäten dieser Messungen fallen deutlich intensiver im Vergleich zur Sprühmethode aus. Dies lässt auf einen wesentlich besseren Einbau des Analyten von der Oberfläche in die entstehenden Matrixkristalle schließen. Eine zweite Messung der gleichen Probenstelle und gleichen Messbedingungen wie bei der ersten Messung belegt, dass die Matrixschicht relativ dünn ist (kleiner 2 um), da sie schon teilweise abgetragen ist. Um eine geringe räumliche Migration des Analyten zu erreichen, sind diese dünnen Schichten notwendig. Der Einbau in wesentlich dickere Matrixschichten mit verwertbaren Signalintensitäten hat zwangsläufig eine höhere Migration zur Folge. Ebenfalls zu sehen ist die erwartete Abhängigkeit der Intensität des Peptidsignals vom Matrixsignal. Die Messungen verdeutlichen die Möglichkeit einer Aufbereitung komplexer biologischer oder synthetischer Oberflächen mit der beschriebenen Präparationsmethodik. Mit dieser Präparationsmethode erstmals ein Verfahren zur Verfügung, mit dem SMALDI-Massenspektrometrie mit einer räumlichen analytischen Auflösung von 2 μm durchgeführt werden kann.
  • Ausführungsbeispiel 8 („Messung des Analyten durch rasternde Massenspektrometrie")
  • Ein Probengemisch, das 2,5-Dihydroxybenzoesäure (2,5-DHB), Substanz P (ein Peptid), Melittin und Insulin enthielt, wurde mittels SMALDI-Flugzeit-MS untersucht. Die Probenmatrix bestand aus 2,5-DHB.
  • Ausführungsbeispiel 8a: Bestandteile der Messeinrichtung
  • Verwendet wurde ein Massenspektrometer „LAMMA 2000" (2), enthaltend:
    • – einen Stickstofflaser (N2-Laser): VSL 337 ND-Laser (Laser Science Inc., Cambridge, Massachusetts, USA), D = 337 nm, Pulswiederholungsrate 10 Hz, Pulsdauer 3 ns, laterale Auflösung = Fokusdurchmesser des Laserstrahls: 0.6–1.5 μm,
    • – eine Ionenquelle, enthaltend eine Lochblende mit einem Öffnungsdurchmesser von 7 mm sowie ein Gitter,
    • – einen Ionenführungskanal, Öffnung 4 mm Durchmesser (Innenmaß), der sich konisch über eine Strecke von 8 mm auf ein Innenmaß von 6 mm erweiterte,
    • – ein Flugrohr,
    • – ein Feldabschlussgitter,
    • – einen Detektor, bestehend aus einer Doppel-Mikrokanalplatte mit einem aktiven Durchmesser von 40 mm,
    • – X-Y-Z-Piezotisch (Graf Mikrotechnik, Wertingen), auf dem der Probenträger befestigt wurde und durch dessen Verschieben des Probenträgers bei ortsfestem Laserstrahl gerastert wurde. Vor Messbeginn wurde der Verschiebetisch zur einmaligen Fokussierung des Probenträgers ein Mal in z-Richtung bewegt. Während der Messung erfolgte die Bewegung nur in x- und y-Richtung. Rasterweite: 100 μm × 100 μm, minimale Schrittweite 0.25 μm
    • – Mikroprozessorsystem zur Kontrolle des Verschiebetisches (Motorola 68000 Mikroporzessor, Motorola Inc., Schaumburg, Illinois)
    • – Vakuumpumpen: Ölrotationspumpe zur Erzeugung des Vorvakuums (Pumpleistung 16 m3/h, Leybold AG, Köln), Turbomolekularpumpe zur Erzeugung des Hochvakuums (360 l/s, Leybold AG, Köln), Druck in der Vakuumkammer nach Auspumpen ca. 5·10–7 mbar
  • Ausführungsbeispiel 8b: Gewählte Abstände innerhalb der Messeinrichtung
    • a. Lochblende – Probenoberfläche: 3,9 mm
    • b. Lochblende – Gitter: 8,6 mm,
    • c. Gitter- Ionenführungskanalöffnung: 1,9 mm,
    • d. Ionenführungskanalöffnung – Feldabschlußgitter vor Detektor: 1306 mm und
    • e. Feldabschlussgitter – Detektoroberfläche: 20 mm.
  • Ausführungsbeispiel 8c: Gewählte Potentiale
    • f. Lochblende: festgelegt auf +10000 V,
    • g. Probenteller: +13261 V,
    • h. Gitter: –1810 V,
    • i. Detektoroberfläche: –1850 V,
    • j. Ionenführungskanal, Flugrohr und Feldabschlussgitter lagen auf Massepotential (0V)
  • Ausführungsbeispiel 8d: Scannen des Probeträgers
    • Scanbereich: 100 μm × 100 μm
    • Scanschrittweite: 1 μm
    • Scangeschwindigkeit: 10 Pixel pro Sekunde
    • 10000 Massenspektren pro Pixel
  • Ausführungsbeispiel 8e: Vorfokussierung
  • Der Laserstrahl wurde außerhalb des Vakuums im Submikrometerbereich vorfokussiert. Hierfür wurden dem Fachmann bekannte Suprasil®-Quarzlinsen zur Vorfokussierung mit astigmatischer Korrektur eingesetzt, die den Laserstrahl auf etwa 10 μm vorfokussierten.
  • Ausführungsbeispiel 8f: Verwendung eines Nd:YLF-Lasers
  • Alternativ zum Stickstofflaser(N2-Laser) kann ein Nd:YLF-Laser, beispielsweise Model 421 QD (ADLAS, Lübeck) verwendet werden, Ausstoßenergie 100 μJ pro Nanosekundenpuls bei 524 nm. Eine Vervierfachung der Frequenz dieses Lasers wird extern durch einen Temperatur-gesteuerten BBO-Kristall (Bariumbetaborat zur Erzeugung der zweiten nichtlinearen Oberschwingung) erreicht. Die endgültige Pulsenergie beträgt ca. 15 μJ bei 262 nm. Der Strahl des Nd:YLF-Lasers besitzt nach Vervierfachung durch den BBO-Kristall eine streng elliptische Form. In diesem Fall ist eine spezielle optische Korrektur erforderlich, um eine hohe numerische Apertur am Eingang der fokussierenden Objektivlinsen sicher zu stellen. Das Verhältnis von großem und kleinem Durchmesser der Ellipse beträgt bei Verwendung dieses Lasers etwa 1:8. Nach Vorfokussierung mit einer spärischen Linse füllt der Strahl deshalb nur in der Eingangslinse des Fokussierungsobjektivs einen schmalen Streifen aus. Aus diesem Grunde wurde eine spezielle optische Einheit für die Zirkularisierung entwickelt, die die beiden Strahlachsen unterschiedlich vorfokussiert (siehe 4). Bei der x-Achse handelt es sich um die kleine, bei der y-Achse um die große Ellipsenachse. Beide Achsen werden durch zylindrische Linsen fokussiert, wobei beide eindimensionalen Foci auf dieselbe Brennebene justiert werden und auf diese Weise ein kreisförmiges Strahlenprofil erhalten wird. Die Vorfokussierung des Nd:YLF-Laserstrahls wurde bereits von Spengler und Hubert publiziert (B. Spengler und M. Hubert, Scanning Microprobe matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (SMALDI) Mass Spectrometry: Instrumentation for Sub-Micrometer Resolved LDI and MALDI Surface Analysis, Journal of the American Society of Mass Spectrometry 2002, 13, 735–748).
  • Ausführungsbeispiel 8g: Peakerkennung und statistische Auswertung
  • Die erhaltenen Einzelspektren pro Probenposition wurden summiert, anschließend wurden die Zentroide berechnet und Masse, Peakflächen und Ortskoordinaten zugeordnet. Danach wurde die Häufigkeitsverteilung aller detektierten Massen bestimmt. Im Histogrammm wurden die Maxima bestimmt und die Massenfenster für die Bilder fest gelegt. Für jedes Bild wurde der Massenschwerpunkt durch Gewichtung der Einzelmassen mit den Peakflächen berechnet, und es wurde die relative Messunsicherheit ermittelt.
  • Ausführungsbeispiel 8h: Bilderstellung
  • Die Peakflächen jeder detektierten Masse wurden in 16 Bit Graustufen umgerechnet. Dabei wurde die gesamte Gruppe von Bildern auf maximalen Kontrast skaliert, um alle von 2,5-DHB, Substanz P, Melittin und Insulin erhaltenen Bilder miteinander vergleichen zu können. Parallel dazu wurden Einzelbilder skaliert, um einen maximalen Kontrast für die Verteilung jeder einzelnen Substanz zu bekommen.
  • Ausführungsbeispiel 8i: Alternatives Scannen der zu untersuchenden Anaylten
  • Der X-Y-Z-Verschiebetisch wurde in diesem Versuch nicht bewegt, sondern der Laser wurde relativ zum Verschiebetisch bewegt. Es wurde ein Laser mit einem Fokusdurch messer von 0,3 μm bis 0,6 μm verwendet, die Scanschrittweite betrug ebenfalls 1 μm (ohne Abbildung).
  • Ausführungsbeispiel 9: Oxidations- oder zersetzungsgefährdete Analyten
  • Wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Präparation von Analyten verwendet, die eine oder mehrere Substanzen enthalten, welche leicht oxidierbar sind und/oder sich leicht zersetzen, empfiehlt es sich, bei der Behandlung der Matrix mit Lösungsmitteldampf zusätzlich ein inertes Trägergas gemäß Anspruch 5 einzusetzen (ohne Abbildung).
  • Ausführungsbeispiel 10: Bevorzugtes Verfahren zur Aufbringung der Matrix
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Präparation von Oberflächen zur Mikrobereichsanalytik ist es besonders vorteilhaft, die Matrix mit Hilfe des Bedampfungsverfahrens nach Anspruch 12 aufzubringen, wobei bevorzugt Schichtdicken der Matrix von 0,5 μm bis 3 μm erzeugt werden (ohne Abbildung).
  • Im Folgenden sind 19 Zeichungen aufgeführt.
    • 1
    Ionenführungskanal
    2
    Flugrohr mit Vakuumgehäuse
    3
    Detektor
    4
    innenoptische Anordnung
    5
    Objektiv mit zentraler Bohrung
    6
    X-Y-Z-Piezotisch und X-Y-Z-Schrittmotortisch
    7
    Laser
    8
    CCD-Kamera (Charge Coupled Device-Kamera)
    9
    Vorfokussierung mit astigmatischer Korrektur
    10
    Dichroitische Spiegel
    11
    Lichtquelle für Probenbeobachtung
    12
    Verdampfungsanlage
    13
    Elektroden zum Anschluss des Schiffchens
    14
    Vakuumbehälter
    15
    Stromkontrolle für Elektroden
    16
    Temperaturkontrolle
    17
    Druckkontrolle
    18
    Probenhalter
    19
    Schiffchen
    20
    Probenträger mit Analyten
    21
    Temperaturfühler
    22
    Ventil
    23
    Behälter mit Lösungsmittelreservoir
    24
    Deckel des Behälters
    25
    Probenauflage
  • Abbildungslegenden
  • 1:
  • Verschiedene Verfahren zu Präparation von Oberflächen:
    • a) Standardpräparation
    • b) Elektrospray
    • c) Sprühverfahren
    • d) Bedampfungsverfahren
  • Die mittlere Spalte verdeutlicht die Größe der Migration des Analyten auf der Oberfläche. Die rechte Spalte verdeutlicht die Größe der Integration des Analyten von der Oberfläche in die Matrixschicht.
  • 2:
  • Der Laserstrahl 7 wird nach astigmatischer Korrektur und Vorfokussierung 9 und Umlenkung über dichroitische Spiegel 10 durch ein Objektiv mit zentraler Bohrung 5 auf den Piezotisch 6 mit dem Probeträger gelenkt. Die emittierten Ionen werden mittels der innenoptischen Anordnung 4 durch den Ionenführungskanal 1 und durch das Flugrohr 2 zum Detektor 3 beschleunigt. Licht aus einer Lichtquelle zur Probenbeobachtung 11 wird ebenfalls über dichroitische Spiegel 10 auf den Probenträger gelenkt; eine CCD-Kamera 8 erzeugt dabei optische Bilder des untersuchten Probenbereiches.
  • 3:
  • Darstellung der durch automatische Bildverarbeitung ohne Pre-Scan bzw. ohne Vorgabe von Massen erhaltenen Abbildungen der Oberflächenverteilungen von 2,5-DHB, Substanz P, Melittin und Insulin sowie von verschiedenen isotopomeren, Derivaten und Anlagerungsprodukten derselben.
  • 4:
    • a) Messung großer Kristalle des Randes (30 Messungen gemittelt)
    • b) Messung feinkristalline Mitte (30 Messungen gemittelt)
  • 5:
  • Dried-droplet Präparation mit 2,5-DHB als Matrix: Durch langsame Auskristallisation (ca. 10 Minuten) entstehen große Kristalle mit unterschiedlicher Verteilung des Analyten. (100 μm × 100 μm, 1 μm Rasterweite)
    • a) Verteilungsbild 2,5-DHB, Matrix, m/z 137.1
    • b) Verteilungsbild Anti-Inflammatory Peptid, m/z 1084.5, hydrophob
    • c) Verteilungsbild Lipotropin 1–10, m/z 950.5, hydrophil
  • 6:
  • Dried-droplet Präparation mit 2,5-DHB als Matrix: Durch schnelle Auskristallisation (ca. 10 Sekunden) entstehen kleine Kristalle mit homogener Verteilung des Analyten. (100 μm × 100 μm, 1 μm Rasterweite)
    • a) Verteilungsbild 2,5-DHB, Matrix, m/z 154.1
    • b) Verteilungsbild Vasopressin [Arg8], m/z 1137.7, hydrophil
    • c) Verteilungsbild Dynorphin 1–9, m/z 1084.5, hydrophob
  • 7:
  • Rand einer Dried-droplet Präparation mit 2,5-DHB als Matrix (100 μm × 100 μm, 1 μm Rasterweite)
  • 8:
  • Feinkristalliner Kristalle im Inneren einer Dried-droplet Präparation mit 2,5-DHB als Matrix (100 μm × 100 μm, 1 μm Rasterschrittweite)
  • 9:
  • Verdampfungsanlage Jeol JEE-4B 12 mit Vakuumbehälter 14. Die Stromkontrolle 15 der Elektroden 13 wird zur Temperaturkontrolle 16 des Schiffchens 19 (nicht sichtbar) benötigt. Die Druckkontrolle 17 wird über das Ventil 22 gesteuert.
  • 10:
  • Der Probenteller 20 wird im Probenhalter 18 zur Bedampfung eingespannt. Zwischen den Elektroden 13 wird das Schiffchen 19 mit Matrix befüllt und über die Stromkontrolle 15 (nicht sichtbar) erhitzt. Über einen Temperaturfühler 21 kann die Temperaturkontrolle 16 (nicht sichtbar) erfolgen.
  • 11:
  • Mikroskopische Aufnahme eines bedampften Probenträgers: Goldprobenträger mit Farbstoff eines Filzstiftes (oberer Bildteil) und Bedampfung 2,5-DHB (linker Bildteil)
    • a) 650 × 500 μm
    • b) 65 × 50 μm
  • 12:
  • Massenspektren von thermisch sublimierter und rekondensierter Matrix
    • a) 2,5-DHB sublimiert bei 130°C unter Normaldruck in 12 Minuten
    • b) 2,5-DHB sublimiert bei 48°C bei 1 mBar in 5 Minuten
  • 13:
    • MALDI – Massenspektren einer Peptid-Mischung nach Bedampfung mit thermisch sublimierter und re-kondensierter Matrix (2,5-DHB) bei a) hoher und b) mittlerer Laserintensität (jeweils 300 Spektren aufsummiert)
  • 14:
    • MALDI-Massenspektrum von 2,5-DHB/Peptid-Mix nach Anläsen der Bedampfung mit Ethanol/Wasser 1:1 (30 Spektren aufsummiert)
  • 15:
  • Inkubation von 2,5-DHB-Schicht mit Wasser
    • a) Träger mit 2,5-DHB bedampft
    • b) Träger mit 2,5-DHB bedampft und 3 Tage mit Wasser befeuchtet
    • c) Träger mit 2,5-DHB bedampft und 14 Tage mit Wasser befeuchtet
  • 16:
  • Filzstiftstrich auf Goldproberträger a) vor und b) nach Bedampfung mit 2,5-DHB und Befeuchtung (650 × 500 μm)
  • 17:
  • Veränderung des Randes des Peptidgemischtropfens auf Goldträger (650 × 500 μm)
    • a) Nach Bedampfung mit 2,5-DHB
    • b) Nach Inkubation mit Wasser
  • 18:
  • Ionenverteilungsbilder der Grenze eines präparierten Peptidgemischs (100 × 100 μm, 1 μm Schrittweite)
    • a) 2,5-DHB, m/z 273
    • b) Rote Filzstiftfarbe, m/z 450
    • c) Substanz P, m/z 1348
  • 19:
  • Behälter 23 zum Befeuchten des Probenträgers mit Analyten 20a
    • a) Behälter 23 mit Deckel 24b
    • b) Behälter 23 ohne Deckel mit Probenträger 20 auf Probenauflage 25

Claims (21)

  1. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie, bei dem in einem ersten Schritt der Analyt oder die Analyte auf einen Probenträger aufgebracht werden, danach eine Matrix auf dem oder den im Wesentlichen festen Analyten abgelagert und zuletzt die Matrix derart mit einem Dampf eines Lösungsmittels der Matrix behandelt wird, dass der Analyt oder die Analyte richtungskontrolliert in die Matrix inkorporiert werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablagerung der Matrix auf dem oder den festen Analyten und die Behandlung der Matrix mit einem Dampf eines Lösungsmittels der Matrix derart durchgeführt werden, dass sich bei der scannenden Mikrosonden-Matrix-assistierten Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektroskopie eine räumliche Verschiebung der Analytmoleküle in der Matrix von kleiner gleich 3 μm ergibt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix als Feststoff auf den oder die Analyten aufgedampft wird.
  4. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Zweck der richtungskontrollierten Inkorporation des oder der Analyten in die Matrix nacheinander folgende Schritte durchgeführt werden: – den Probenträger in einen im Wesentlichen abgeschlossenen Behälter überführen, wobei der Behälter ein Lösungsmittelreservoir oder eine Vorrichtung zur Aufnahme eines Lösungsmittelreservoirs enthält, – Befüllen des Lösungsmittelreservoirs mit einem Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch und, falls es sich nicht um ein in den Behälter integriertes Lösungsmittelreservoir handelt, Verbringen des gefüllten Lösungsmittelreservoirs in den Behälter, – das Lösungsmittelreservoir erhitzen bis zur Sättigung der Behälteratmosphäre mit Lösungsmitteldampf, – den Probenträger 3 Stunden bis 14 Tage unter der gesättigten Lösungsmitteldampfatmosphäre im Behälter belassen, bis die Integration des oder der Analyten in die Matrixschicht beendet ist, – den die Matrixschicht und den Analyt oder die Analyte enthaltenden Probenträger aus dem Behälter entfernen.
  5. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel oder die Lösungsmittel ausgewählt sind aus der Gruppe: Wasser, Methanol, Ethanol, Aceton, Acetonitril, Propanol, Isopropanol, n-Butanol, iso-Butanol, tert.-Butanol, Essigsäureethylester, Benzol, Toluol, 1,2-Dimethylbenzol, 1,3-Dimethylbenzol, 1,4-Dimethylbenzol, Cyclohexan, Cyclohexanol, Dichlormethan, Chloroform, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Dimethylformamid, Diethylamin, Phenylethylamin, Ester, Ether, Carbonsäuren, Amine, Aliphaten, Aromaten, Araliphaten, Halogenaliphaten.
  6. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ganz oder teilweise deuteriert ist, wobei es sich bevorzugt um D2O handelt.
  7. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Atmosphäre bei der Integration des oder der Analyten in die Matrixschicht zusätzlich zum Lösungsmitteldampf ein Trägergas enthält, ausgewählt aus der Gruppe: Luft, Stickstoff, Helium, Neon, Argon, Krypton, Xenon, Kohlendioxid.
  8. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung des Trägergases während der Integration des oder der Analyten in die Matrixschicht verändert wird.
  9. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Material des Probenträgers aus der aus Metallen, bevorzugt Gold oder Aluminium, Metalllegierungen, Stahl, Silicium, Teflon, Quarz, PVDF, Cellulose, regenerierter Cellulose, anionisch modifizierter Cellulose, kationisch modifizierter Cellulose, Nylon, Nitrocellulose und mit Beads oder Ankermolekülen modifizierten Oberflächen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  10. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Methode zur Aufbringung des oder der Analyten auf den Probenträger aus der aus Aufsprühen und anschließendem Trocknen, Bindung des oder der Analyten an Ankermoleküle oder Beads oder mit Ankermolekülen versehene Beads, Bindung an feste Träger, Bindung an Kügelchen, Bindung an Nadeln, Bindung an Kämme, Bindung an Wafer, Versprühen in einem geeigneten Lösungsmittel mit Hilfe eines Gasstromes, Versprühen in einem geeigneten Lösungsmittel mit Hilfe eines elektrischen Potentials (Elektrospray-Verfahren), mechanisches Verteilen des festen Analyts oder der festen Analyte, Stempeln, Drucken, Laserdruckverfahren, Thermotransferverfahren, Tintenstrahldruckverfahren, Molekularstrahlepitaxie, Elektrodiffusion, elektrochemisches Abscheiden, Ultraschallvernebelung, Sublimieren und anschließendes Niederschlagen, sowie Aufpressen, Aufwachsen oder Kleben bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  11. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Methode zur Ablagerung der Matrix auf dem oder den Analyten aus der aus Versprühen in einem geeigneten Lösungsmittel mit Hilfe eines Gasstromes, Versprühen in einem geeigneten Lösungsmittel mit Hilfe eines elektrischen Potentials (Elektrospray-Verfahren), mechanisches Verteilen der Matrix, Stempeln, Drucken, Laserdruckverfahren, Thermotransferverfahren, Tintenstrahldruckverfahren, Molekularstrahlepitaxie, Elektrodiffusion, elektrochemisches Abscheiden, Ultraschallvernebelung, Sublimieren und anschließendes Niederschlagen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  12. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufbringen des oder der Analyten und/oder die Aufbringung der Matrixsubstanz durch Bedampfung der Probenträgeroberfläche erfolgt, wobei nacheinander folgende Schritte durchgeführt werden: – den oder die Analyten oder die Matrixsubstanz in einen Behälter einer Vakuumkammer bringen, – den Probenträger im Abstand von 5 mm bis 40 mm zu diesem Behälter so in der Vakuumkammer befestigen, dass die zu bedampfende Seite des Probenträgers dem oder den Analyten oder der Matrixsubstanz zugewandt ist, – die Vakuumkammer evakuieren, wobei der Druck innerhalb der Kammer nach erfolgter Evakuierung bevorzugt 100 mBar bis 1·10–2 mBar beträgt, – den Behälter erhitzen, bis der oder die Analyten oder die Matrixsubstanz sublimieren, und anschließend diese Temperatur halten, – den oder die Analyten oder die Matrixsubstanz auf der Probenträgeroberfläche abscheiden, bevorzugt innerhalb von 2 bis 15 Minuten, – die Wärmezufuhr beenden und Vakuumkammer belüften, bis der Druck im Inneren dem Umgebungsdruck entspricht, – den bedampften Probenträger entnehmen.
  13. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufbringen der Matrixsubstanz gemäß dem Verfahren nach Anspruch 12 erfolgt, wobei bevorzugt Schichtdicken von 0,5 μm bis 3 μm erzeugt werden.
  14. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrixsubstanz aus der aus 2-Aminobenzoesäure, 3-Aminobenzoesäure, 3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure (Sinapinsäure), alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA), 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA), 2,5-Dihydroxybenzoesäure (2,5-DHB), 2,3-Dihydroxybenzoesäure, 2,4-Dihydroxybenzoesäure, 2,6-Dihydroxybenzoesäure, 3,4-Dihydroxybenzoesäure, Picolinsäure, 2,4,6-Trihydroxyacetophenon, 2,3,4-Trihydroxyacetophenon, Nitrobenzylalkohol, Nikotinsäure, Ferulasäure, Kaffeesäure, Ellagsäure, cis-o-Cumarsäure, trans-o-Cumarsäure, cis-p-Cumarsäure, trans-p-Cumarsäure, 6-Aza-2-thiothymidin, Harnstoff, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Malonsäure und Malononitril bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  15. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt oder die Analyten und/oder die Matrixsubstanz durch mehrmalige Wiederholung eines Verfahrens und/oder durch Kombination mehrerer Verfahren zur Aufbringung von Analyt und/oder Matrixsubstanz aufgebracht werden.
  16. Verfahren zur Präparation von Analyten für die Massenspektrometrie gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt eine Substanz oder die Analyte Substanzen chemischen, biologischen und/oder biochemischen Ursprungs sind und die Analyse mittels der hochauflösenden scannenden MALDI-Massenspektrometrie erfolgt.
  17. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, aufweisend – eine Halterung (18) für einen Probenträger (20), – sowie Mittel zur Aufbringung eines oder meherer Analyten auf den Probenträger (20), – und Mittel (19) zur Ablagerung einer Matrix auf dem oder den Analyten, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ferner Mittel (23) zur Zuführung eines Dampfes eines Lösungsmittels für die Matrix aufweist.
  18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel (23) zur Zuführung eines Dampfes eines Lösungsmittels für die Matrix in Form eines beheizbaren Flüssigkeitsbades ausgeführt sind.
  19. Vorrichtung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ferner Mittel zur Bestimmung der Dicke der Matrix während der Ablagerung der Matrix auf dem Analyten aufweist, zum Beispiel in Form einer Schwingquarzwaage, die so angeordnet ist, dass die Mittel zur Ablagerung der Matrix auf dem Analyten im Wesentlichen im gleichen Wirkverhältnis zur Wiegefläche der Schwingquarzwaage wie zur Oberfäche des Analyten stehen.
  20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ferner Mittel zur Bestimmung des Grades der Integration des Analyten in die Matrix aufweist, zum Beispiel in Form von Mitteln zur Bestimmung des Volumens der Matrix, welche während des Integrationsvorgangs quillt, oder in Form eines Mikroskops oder in Form eines Fluoreszenzmikroskops im Falle von fluoreszenzmarkierten Analyten oder in Form eines Polarisationsmikroskops im Falle, dass die Integration des Analyten eine Umkristallisation der Matrix auslöst.
  21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Halterung für einen oder mehrere Probenträger (20) relativ zu den Mitteln zum Aufbringen des oder der Analyten und den Mitteln (19) zur Ablagerung einer Matrix auf dem oder den Analyten beweglich ausgebildet ist und die Anordnung so ausgeführt ist, dass der oder die Probenträger (20) – zunächst mit den Mitteln zur Aufbringung eines Analyten auf den oder die Probenträger (20), – danach mit den Mitteln (19) zur Ablagerung einer Matrix auf dem oder den Analyten und den zugeordneten Mitteln zur Bestimmung der Dicke der Matrix, – und danach mit den Mitteln (23) zur Zuführung eines Dampfes mit den zugeordneten Mitteln zur Bestimmung des Grades der Integration des oder der Analyten in die Matrix in Wechselwirkung tritt zur Automatisierung der Präparation.
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