DE4143071C2

DE4143071C2 - Verfahren zur Bereitstellung eines Analytes für eine Untersuchung

Info

Publication number: DE4143071C2
Application number: DE19914143071
Authority: DE
Inventors: Franz Prof Dr Hillenkamp; Michael Dr Karas; Ulrich Dr Giesmann
Original assignee: Finnigan MAT GmbH
Current assignee: Sequenom Inc
Priority date: 1991-12-27
Filing date: 1991-12-27
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2011-12-28
Also published as: GB2262805B; DE4143071A1; GB9224351D0; GB2262805A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung eines Analytes für eine Untersuchung, bei welcher Analytmoleküle in Verbindung mit Matrix-Material mittels Laserdesorption desorbiert werden.

Ein derartiges Verfahren zur Matrix-gestützten Laserdesorption ist aus der DE 40 17 805 A1 bekannt. Gewisse Schwierigkeiten ergeben sich jedoch mit dem bekannten Verfahren bei dem Vorgang, durch welchen Analytmoleküle in eine ausreichend enge Verbindung mit dem Matrix-Material gebracht werden sollen. Zum einen ist das bekannte Verfahren in der Handhabung relativ umständlich, zum anderen ist die Einlagerungsdichte der Analytmoleküle in der Oberfläche des Matrix-Materials für manche Analyseaufgaben nicht hinreichend.

Aus der GB 2 235 528 A ist ein Verfahren bekannt, bei dem das Probenmaterial in einem Lösungsmittel aufgelöst und die Lösung auf das Matrix-Material aufgebracht wird. Die Matrix selbst wird durch Elektrospray-Technik hergestellt. Das Target wird danach der Laserdesorption unterworfen.

Ein ähnliches Verfahren ist aus der GB 2 235 529 A bekannt. Bei diesem Verfahren wird ein Substrat-Material durch eine Elektrospray- Technik auf ein Target aufgebracht. Danach wird die Analytlösung mit dem Substrat-Material in Kontakt gebracht und anschließend eine Lösung des Matrix-Materials aufgebracht. Das Target wird danach der Laserdesorption unterworfen.

Schließlich ist aus der GB 2 236 184 A ein weiteres Verfahren zur Matrix-gestützten Laserdesorption bekannt. Dabei wird das Probenmaterial aufgelöst und die Lösung auf das Matrix-Material aufgebracht. Das Target wird der Laserdesorption unterworfen.

Auch bei den aus den drei GB-Schriften bekannten Verfahren ist die Einlagerungsdichte der Analytmoleküle in der Oberfläche des Matrix-Materials nicht ausreichend oder zu unregelmäßig.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art dahingehend weiterzubilden, daß bei einfacher Handhabung eine verbesserte Bereitstellung des Analytes für die Laserdesorption gewährleistet ist.

Diese Aufgabe wird entweder dadurch gelöst, daß man aus Ma trix-Material bestehende Kristalle züchtet, die Kristalle mit einer Analytlösung in Kontakt bringt und die Kristalle der Laserdesorption unterwirft. Hierbei werden die Kristalle durch gezielte Kristallisation bei langsamer Abkühlung einer gesät tigten Lösung des Matrix-Materials gewonnen.

Alternativ wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man aus pul verförmigem Matrix-Material unter Anwendung von hohem Druck Tabletten formt, eine Probenlösung mit darin gelöstem Analyt direkt mit den Tabletten in Kontakt bringt, die Tabletten trocknet und schließlich der Laserdesorption unterwirft. Der artige Tabletten lassen sich relativ einfach herstellen und eröffnen darüber hinaus die Möglichkeit, nicht wasser- oder alkohollösliche Verbindungen als Matrix-Material zu benutzen.

Gemäß einer weiteren Alternative der vorliegenden Erfindung wird die eingangs genannte Aufgabe dadurch gelöst, daß man aus einer den Analyten enthaltenden Matrix-Lösung Kristalle züchtet und die Kristalle der Laserdesorption unterwirft. Ge mäß dieser Lösung werden also Matrix-Kristalle, wie eingangs beschrieben, aus einer gesättigten Lösung gezüchtet, wobei diese Lösung gleichzeitig den Analyten enthält. Wider Erwar ten ergibt gerade ein langsames Auskristallisieren aus einer Probe-/Matrix-Lösung eine ideale Aufnahme des Analytes (z. B. Protein) in der Matrix, was wiederum zu besonders guten Ergebnissen, insbesondere Laserspektren führt. Die gezüchte ten Kristalle sind hierbei im wesentlichen durch und durch mit Analytmolekülen durchsetzt, so daß eine Vielzahl von "Schüssen" auf die gleiche Kristallstelle zu im wesentlichen identischen Ergebnisspektren führt.

Ein Averaging wird also erleichtert. Selbst geschnittene Kri stalle zeigen an den Trennflächen dieselben Ergebnisspektren wie außenseitig.

Wenn man Kristalle oder gepreßte Tabletten aus reinem Matrix- Material, also feste Körper verwendet, so kann man den Analy ten in Form einer Lösung auf den Matrix-Körper auftropfen, sprühen oder zentrifugieren, wie dies aus der erstgenann ten Druckschrift an sich bekannt ist. Vorteilhafterweise aber taucht man den Matrix-Körper in eine Analytlösung. Vorzugs weise führt man diesen Tauchvorgang über einen definierten Zeitraum hinweg durch.

Wenn man als Matrix-Material ein solches verwendet, das sich in dem Lösungsmittel für den Analyten (z. B. Wasser, Wasser/ Alkohol- oder Wasser/Acetonitril-Mischungen) nicht oder nur schlecht löst, so zeigt sich bei Durchführung eines längeren Tauchvorgangs eine Anreicherung der Analytmoleküle auf der Oberfläche durch Adsorptionsprozesse. Es ergibt sich also eine hohe Konzentration der Analytmoleküle auf der Oberfläche des Matrix-Körpers. Auf diese Weise kann auch aus sehr verdünnten Analytlösungen (10-8 molar) gemessen werden, was von großem Vorteil ist. Darüber hinaus kann durch dieses Verfahren gleichzeitig mit einer Adsorption der Analytmoleküle eine Ab trennung und Reinigung der Analytmoleküle von Verunreinigungen in der Lösung erzielt werden, was ebenfalls von großem Vorteil ist. Für diese Ausführungsform der Erfindung eignet sich - bei Verwendung von Wasser oder von Wasser/Alkohol- oder Was ser/Acetonitril-Mischungen als Lösungsmittel - Antracencarbon säure oder Aminoantracen als Matrix-Material.

Verwendet man ein Matrix-Material, das im Lösungsmittel des Analyten gut bzw. mäßig löslich ist, so muß man den Tauch prozeß relativ schnell bzw. kurzzeitig durchführen. In diesem Fall aber führt der Tauchprozeß zu einem Anlösen einer Ober flächenschicht und zum "Vergraben" der Analytmoleküle in einem dickeren Oberflächenbereich, was wiederum einen ähnlichen po sitiven Effekt wie oben beschrieben, also eine Anreicherung mit Analytmaterial mit sich bringt. In diesem Fall ist man nicht auf eine adsorptive Bindungswirkung der Matrix-Festsub stanz für die Anlaytmoleküle angewiesen.

In jedem Fall ist es von Vorteil, wenn man als Matrix-Material ein solches verwendet, das die Wellenlänge des verwendeten La serlichts absorbiert.

Es ist zwar noch nicht ganz aufgeklärt, wie und mit welchen Kräften Analyt und Matrix auf der molekularen Ebene miteinan der wechselwirken, klar ist jedoch, daß sie in sehr engem, geometrischem Kontakt vorliegen und zusammen desorbiert wer den müssen.

Nachfolgend werden Versuchsbeispiele erläutert.

Beispiel 1

Eine wäßrige Lösung von 2,5-DHB (2,5-Dihydroxy benzoensäure) von 40 g/l wird bei 40°C hergestellt und mit einer Rate von ca. 10-15°C/Tag über mehrere Tage auf Zimmer temperatur abgekühlt. In dieser Zeit bilden sich Kristalle mit bis zu einigen Millimetern Ausdehnung in der Lösung. Die Kristalle werden in der Lösung im Eisschrank aufbewahrt.

Fig. 1 zeigt Spektren des Proteins Cytochrom c, gewonnen durch Summierung der ersten 25 Schüsse und Fig. 2 durch Sum mierung des 75. bis 100. Schusses auf dieselbe Stelle eines 2,5-DHB Kristalls, wobei beim Auskristallisieren das Protein im Massenverhältnis 10^-2 zur Lösung beigegeben wurden.

Fig. 3 zeigt das Spektrum aus dem gleichen Kristall wie die zuvor erläuterten Fig. 1 und 2, wobei der Kristall jedoch vor der Analyse gespalten und die innere Fläche analysiert wurde, hierdurch wird gezeigt, daß das Protein gleichmäßig im gesamten Volumen eingebaut wird und nicht nur an der Oberflä che.

Fig. 4 zeigt das Spektrum des Proteins Peroxidase, eingebaut in einen 2,5-DHB Kristall im Massenverhältnis 4,6×10^-3. Es ist ein Summenspektrum der ersten 35 Schüsse auf dieselbe Stelle der Kristalloberfläche.

Fig. 5 zeigt wieder ein Spektrum von Cytochrom c. In diesem Fall wurde erst ein reiner 2,5-DHB Kristall hergestellt. Die ser Kristall wurde für 10 s in eine wäßrige, 2×10^-5-mo lare Lösung des Proteins getaucht. Danach wurde die Oberflä che des Kristalls analysiert. Das Spektrum ist die Summe aus 15 Einzelspektren aus verschiedenen Orten auf der Oberfläche. Von einem einzelnen Ort können nur 2-3 Spektren gewonnen wer den, dann ist der Analyt vollständig abgetragen.

Fig. 6 zeigt ein Spektrum des Proteins Insulin. In diesem Fall wurden 50 Nanoliter einer 5×10^-5-molaren Insulinlösung auf einen reinen 2,5-DHB Kristall aufgetropft.

Fig. 7 zeigt das Spektrum der Proteine Insulin und Lysozym. Hier wurde unter hohem Druck eine Tablette aus pulverförmiger Nikotinsäure hergestellt. Auf die Tablette wurde für die Ana lyse 1,5 Mikroliter einer 10^-5-molaren Proteinlösung durch Elektrospray aufgesprüht. Danach wurde die Analyse wie eingangs beschrieben vorgenommen.

Aus obigem ergibt sich, daß bei Anwendung des erfindungsgemä ßen Verfahrens bisher nicht verwendbare Matrix-Materialien verwendbar werden und dabei gleichzeitig eine verbesserte Be reitstellung des Analytes sichergestellt wird.

Claims

1. Verfahren zur Bereitstellung eines Analytes für eine Untersuchung, bei welcher Analytmoleküle in Verbindung mit Matrix-Material mittels Laserdesorption desorbiert wer den, dadurch gekennzeichnet, daß man aus Matrix-Material bestehende Kristalle züchtet, die Kristalle mit einer Anlaytlösung in Kontakt bringt und die Kristalle der Laserdesorption unterwirft.

2. Verfahren zur Bereitstellung eines Analytes für eine Untersuchung, bei welcher Analytmoleküle in Verbindung mit Matrix-Material mittels Laserdesorption desorbiert wer den, dadurch gekennzeichnet, daß man aus pulverförmigem Matrix-Material unter Anwendung von hohem Druck Tabletten formt, eine Probelösung mit darin gelöstem Analyt direkt mit den Tabletten in Kontakt bringt, die Tabletten trocknet und der Laserdesorption unterwirft.

3. Verfahren zur Bereitstellung eines Analytes für eine Untersuchung, bei welcher Analytmoleküle in Verbindung mit Matrix-Material mittels Laserdesorption desorbiert wer den, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einer den Analyt enthaltenden Matrix-Lösung Kri stalle züchtet und die Kristalle der Laserdesorption unter wirft.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Körper aus festem Matrix-Material in eine Analyt lösung taucht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Tauchvorgang über einen definierten Zeitraum hin weg durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Analyt in einem Lösungsmittel(-Gemisch) löst, in welchem das Matrix-Material nicht oder nur schlecht löslich ist und den Tauchvorgang so lange durchführt, bis auf der Oberfläche des Matrix-Materials eine hinreichende Anreicherung von Analytmolekülen stattgefunden hat.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Analyt in Wasser oder einem Gemisch aus Wasser und Alkohol oder Acetonitril löst und Antracencarbonsäure als Ma trix-Material verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Analyt in Wasser oder einem Gemisch aus Wasser und Alkohol oder Acetonitril löst und Aminoantracen als Matrix-Ma terial verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Analyt in einem Lösungsmittel(-Gemisch) löst, in welchem das Matrix-Material gut löslich ist und den Tauchvor gang nur so lange durchführt, bis die Oberfläche des (festen) Matrix-Materials unter Anreicherung mit Analyt hinreichend an gelöst ist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Matrix-Material, welches das Laserlicht absorbiert.