DE10393486T5

DE10393486T5 - Verbesserte Abscheidung eines gelösten Analyten auf hydrophobe Oberfläche durch Desolvatisierung von organischen Lösungsmitteln

Info

Publication number: DE10393486T5
Application number: DE10393486T
Authority: DE
Inventors: Daniel B. Milford Wall
Original assignee: Waters Investments Ltd
Current assignee: Waters Technologies Corp
Priority date: 2002-10-21
Filing date: 2003-10-21
Publication date: 2005-09-01
Also published as: AU2003283007A1; JP2006504098A; GB0507025D0; GB2409273B; GB2409273A; US20050242039A1; WO2004038402A1

Abstract

Verfahren zum Abscheiden eines Analyten auf einer hydrophoben Oberfläche, das die Schritte umfasst:
Herstellen einer Analytenlösung durch Lösen des Analyten in einem Lösungsmittel, das ein Gemisch von Wasser und einem oder mehreren organischen Lösungsmittel umfasst,
Desolvatisieren der organischen Lösungsmittel aus der Analytenlösung unter Bedingungen, die ausreichen, um einen hauptsächlich wässrigen Analyten bereitzustellen, und
Abscheiden der desolvatisierten, hauptsächlich wässrigen Analytenlösung auf die hydrophobe Oberfläche.

Description

Einschluss durch Bezugnahme
Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 60/420,391, eingereicht am 21. Oktober 2002 (Anwaltsaktenzeichen WCZ-035-1), deren gesamter Inhalt hierin ausdrücklich durch eine Bezugnahme eingeschlossen ist.
Hintergrund der Erfindung
Massenspektrometrie ("MS") wird routinemäßig zum Messen des Molekulargewichts eines Probenmoleküls als auch der Fragmentierungsmerkmale einer Probe, um diese Probe zu identifizieren, verwendet. MS kann in der Gasphase erfolgen, in der eine elektrisch neutrale Probe bei niedrigem Druck durch einen Elektronenstrahl geführt wird. Der Elektronenstrahl trifft die Probe und wirft ein oder mehrere Elektronen hinaus, wonach die Probe mit einer positiven Nettoladung ionisiert ist. Die ionisierte Probe wird sodann durch ein Magnetfeld geführt und, abhängig von dem Verlauf der ionisierten Probe durch dieses Feld, wird die Masse des Moleküls bezüglich der elektrischen Ladung des Ions gemessen.
Eine weitere Technik zum Messen der Masse der Probe ist die Flugzeit ("TOF"). In TOF wird ein Probenion durch eine bekannte Spannung beschleunigt und die Zeit, die ein Probenion oder ein Fragment davon braucht, um eine bekannte Distanz zu durchwandern, wird gemessen.
Moleküle, die nicht leicht in die Gasphase gebracht werden, sind schwieriger durch MS zu analysieren. Mehrere Techniken zum Verflüchtigen von Proben mit hohem Molekulargewicht sind vorhanden. Wenn ein Probenmolekül auf einem Substrat abgeschieden wird, gilt die Probe an diesem Substrat als adsorbiert. Eine Desorption tritt auf, wenn ein auf einem Substrat adsorbiertes Molekül von dem Substrat entfernt wird. Anstelle eines Beginns mit einer Gasphasenprobe, wie in der grundlegenden MS, kann eine Desorptions-MS auf eine Probe angewendet werden, die auf einem Substrat adsorbiert ist.
Eine Desorption-MS-Technik ist die Matrix-unterstützte Laserdesorption/-ionisation ("MALDI"). Gemäß dieser Technik wird eine Probe dadurch ionisiert, dass ein Proton von einer organischen Matrix auf die Probe als Teil des Verflüchtigungsverfahrens übertragen wird. Eine Ionisation der Probe wird durch Elektronenstrahlionisation oder Protonenübertragungsionisation erreicht.
In einem typischen MALDI-Experiment wird eine Probe in eine feste, strahlungsabsorbierende organische Matrix gelöst, die sich auf gepulste Laserstrahlung verflüchtigt, wodurch die Probe mit der verflüchtigten Matrix transportiert wird. Obwohl MALDI eine weithin verwendete und leistungsstarke Technik ist, ist sie nicht im Allgemeinen für die Untersuchung von kleinen Molekülen geeignet, da die Matrix Messungen unterhalb eines m/Z-Werts, d.h. eines Verhältnisses von Masse zu Ladung, von etwa 700 beeinträchtigen kann. MALDI weist auch signifikante Begrenzungen hinsichtlich der Analyse von großen Molekülen auf, da z.B. die Matrix Addukte mit dem Probenion bilden und dadurch die Analyse beeinträchtigen kann.
Neuere MS-Techniken erlauben eine direkte Laserdesorptions-/-ionisationstechnik ohne eine Matrix. Solche Verfahren beinhalten eine Ionisation eines Analyten auf einem porösen strahlungsabsorbierenden Halbleiter durch Bestrahlen des analytenbeladenen Substrats unter vermindertem Druck. Vergleiche z.B. die US-PS 6,288,390 und die entsprechende internationale PCT-Anmeldung WO 00/54309. Gemäß solcher direkter Desorptions-MS-Verfahren sind hydrophobe Gruppen, z.B. Ethylphenylgruppen, an das poröse Halbleitersubstrat, z.B. Silizium, gebunden. Die Probe wird auf ein Substrat gegeben und sodann mit ultravioletter Strahlung, gegebenenfalls mit einer angelegten Spannung, bestrahlt. Der Vorteil solcher Verfahren besteht darin, dass die Verwendung einer Matrix nicht benötigt wird, so dass die Verfahren zugänglicher für eine Analyse von kleinen Molekülen sind.
Zusätzlich können Analyten direkt ohne eine Matrix nachgewiesen werden. Das Substrat kann chemisch oder strukturell modifiziert sein, um die Desorptions-/Ionisationsmerkmale des Substrats zu optimieren. Mehrere Beispiele für MS-Sub strate einer Desorption/Ionisation auf porösem Silizium ("DIOS") sind in Z. Shen, Anal. Chem., 73, 612–19 (2001), J. J. Thomas, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 98, 4932–37 (2001), und R. A. Kruse, Anal. Chem., 73, 3639–45 (2001), beschrieben. Die Analyse von ganzen Zellen durch DIOS-MS wurde auch gezeigt. R. A. Kruse, J. Mass Sprectrom., 36, 1317–32 (2001).
Trotz der Aussicht von DIOS-MS-Techniken ist das Verfahren durch die Anzahl von Proben, die auf ein Substrat aufgetragen werden können, begrenzt. Bei typischen Laborbedingungen umfasst eine Analytenlösung eine wesentliche Menge an organischem Lösungsmittel, z.B. eine HPLC-Fraktion, in der die chromatographische Auftrennung unter Verwendung eines gemischten organischen/wässrigen Lösungsmittelsystems erfolgte. Dies stellt ein Hauptproblem bei der DIOS-MS in der Weise dar, dass man oft wünscht, eine Probe, die große Mengen an organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Acetonitril, enthält, aufzutragen. Da DIOS-MS-Substrate hydrophob sind, wird sich eine ähnlich hydrophobe Probe, wenn sie auf das Substrat gegeben wird, ausbreiten. Da der Kontaktwinkel dieser Lösungen weniger als 90° beträgt, breitet sich die Probe über einen großen Anteil des DIOS-Chips aufgrund der Dochtwirkung aus. Dies begrenzt nicht nur die Anzahl von Proben, die auf einem Substrat gegeben werden können, sondern beeinträchtigt auch die Empfindlichkeit der MS-Analyse.
Zusammenfassung der Erfindung
Poröses Silizium, das für ein DIOS-MS-Substrat verwendet wird, ist hydrophob. Wässrige Proben funktionieren besonders gut, wenn sie für DIOS-MS verwendet werden, da die Probe, wenn sie aufgetragen wird, aufperlt und sich nicht ausbreitet, da der Kontaktwinkel der wässrigen Probe auf Silizium-DIOS-Chips mehr als 90° beträgt. Erfindungsgemäß werden die vorstehend beschriebenen Probleme im Stand der Technik dadurch überwunden, dass die organischen Lösungsmittel während einer Abscheidung von Proben auf DIOS-MS-Substraten entfernt werden. Als ein Ergebnis wird die Ausbreitungswirkung, die zu einer verminderten Empfindlichkeit als auch einer Verminderung der Anzahl von Proben, die auf einem Chip abgeschieden werden können, führt, überwunden.
Erfindungsgemäß wird die Tatsache ausgenutzt, dass typische organische Lösungsmittel, die für eine Probenabscheidung in LDI-Experimenten verwendet werden, flüchtiger sind als Wasser. Folglich werden, falls ein Analyt in einer Lösung mit organischen Lösungsmitteln und Wasser gelöst ist und sodann einer schnellen Desolvatisierung während einer Probenabscheidung unterzogen wird, die organischen Lösungsmittel schneller verdampfen als das Wasser. Der Analyt wird sodann auf eine hydrophobe Oberfläche, z.B. DIOS-MS-Chip, in einem Lösungsmittelgemisch, das hauptsächlich wässriger Natur ist und das einen Kontaktwinkel von mehr als 90° aufweist, abgeschieden. Eine Abscheidung auf die hydrophobe Oberfläche in einer wässrigen Lösung wird jegliche hydrophobe Dochtwirkungen minimieren und ermöglichen, dass der Analyt in einem signifikant kleineren Bereich fokussiert wird, was die Empfindlichkeit und die Anzahl von Proben, die in einem bestimmten Bereich der Oberfläche abgeschieden werden können, erhöht. Das erfindungsgemäße Abscheidungsverfahren weist die einzigartige Fähigkeit einer selektiven Entfernung von organischen Lösungsmitteln auf, während eine hauptsächlich wässrige Probenlösung auf die hydrophobe Oberfläche abgeschieden wird.
Folglich wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Abscheiden eines Analyten auf einer hydrophoben Oberfläche bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte eines Herstellens einer Analytenlösung durch Lösen des Analyten in einem Lösungsmittel, das ein Gemisch von Wasser und einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln umfasst, Desolvatisieren der organischen Lösungsmittel aus der Analytenlösung unter Bedingungen, die ausreichen, um eine hauptsächlich wässrige Analytenlösung bereitzustellen, und Abscheiden der desolvatisierten, hauptsächlich wässrigen Analytenlösung auf die hydrophobe Oberfläche.
Erfindungsgemäß wird auch ein Kit bereitgestellt, der einen DIOS-Chip und/oder ein Massenspektrometrieinstrument und Anweisungen für eine Verwendung davon gemäß dem vorstehend zusammengefassten erfindungsgemäßen Verfahren umfasst.
Erfindungsgemäß wird noch weiter ein Verfahren zum Herstellen einer Probe für eine massenspektrometrische Analyse durch Abscheiden eines Analyten auf eine hydrophobe Oberfläche bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte eines Herstellens einer Analytenlösung durch Lösen des Analyten in einem Lösungsmittel, das ein Gemisch von Wasser und einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln umfasst, Desolvatisieren der organischen Lösungsmittel aus der Analytenlösung unter Bedingungen, die ausreichen, um eine hauptsächlich wässrige Analytenlösung bereitzustellen, und Abscheiden der desolvatisierten, hauptsächlich wässrigen Analytenlösung auf die hydrophobe Oberfläche, wodurch die Probe für eine massenspektrofotometrische Analyse hergestellt wird.
Genaue Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine grafische Darstellung der Y-Dimension eines Materials, das auf ein DIOS-Substrat mittels der erfindungsgemäßen Verfahren abgeschieden wurde;
2A–2D sind eine Reihe von Massenspektren von der Mitte und den Kanten dieser Querspur;
3 ist ein Rasterprofil aufeinander folgender Probenwellabscheidungen von dem prep-LC-MALDI (aufeinander folgende Peaks stellen aufeinander folgende Wells dar: d.h. A2, A3, A4, etc. ... (Abstand von 4,5 mm));
4 ist eine grafische Darstellung von SIC-Peaks von Glu-fib (100 fmol/μl);
5 ist eine grafische Darstellung von SIC-Peaks von Angiotensin I (25, 50, 100, 500 und 1000 fmol/μl);
6 zeigt CapLC-MALDI-MS-Grundpeakchromatogramme eines Trypsinverdaus von 4 Proteinen;
7 ist eine zweidimensionale Kartierung der LC-MALDI-Auftrennung für das Proteingemisch von 6 bei einer Beladung von 300 fmol/Protein;
8 ist ein extrahiertes Ionenchromatogramm, das den Fokus einer Peptidabscheidung auf den DIOS-Chip zeigt;
9 ist eine Auswahl von verschiedenen XIC, was die räumliche Auftrennung von Analyten, die auf einem DIOS-Chip unter Verwendung einer LC-MALDI-Auftrennung abgeschieden wurden, darstellt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Abscheiden eines Analyten auf einer hydrophoben Oberfläche bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte eines Herstellens einer Analytenlösung durch Lösen des Analyten in einem Lösungsmittel, das ein Gemisch von Wasser und einem oder mehreren organischen Lösungsmittel umfasst, Desolvatisieren der organischen Lösungsmittel aus der Analytenlösung unter Bedingungen, die ausreichen, um eine hauptsächlich wässrige Analytenlösung bereitzustellen, und Abscheiden der desolvatisierten, hauptsächlich wässrigen Analytenlösung auf die hydrophobe Oberfläche.
Erfindungsgemäß kann der Analyt im Allgemeinen eine jegliche Laborprobe mit einem großen Bereich von Molekulargewichten, z.B. bis zu einer Million Dalton, wie eine biologische Probe, einschließlich in nicht begrenzender Weise eines Nukleotids oder eines Gemisches von Nukleotiden, eines Proteins oder eines Gemisches von Proteinen oder eines Peptids oder eines Gemisches von Peptiden, sein. Ebenfalls kann der Analyt ein synthetisches Polymer oder ein Gemisch von synthetischen Polymeren sein.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst die hydrophobe Oberfläche einen porösen Halbleiter, z.B. basierend auf Silizium, Galliumarsenid oder Galliumnitrid. In einer spezifischen Ausführungsform ist der poröse Halbleiter ein Desorption/Ionisation-auf-Silizium ("DIOS")-Chip. DIOS-Chips sind z.B. in J. Wei, Nature, 399, 243–46 (1999), G. E. Siuzdak, PCT-Anmeldung WO 00/54309, und G. E. Siuzdak, US-PS 6,288,390 , beschrieben.
Typischerweise neigen Proben, die organische Lösungsmittel enthalten, dazu, sich über einen großen Bereich auf einem DIOS-Chip auszubreiten, was zu einer schlechten Empfindlichkeit und einer Verminderung der Anzahl von Proben, die auf einem bestimmten DIOS-Chip getestet werden können, führt. Dies ist ein Ergebnis der Tatsache, dass organische Lösungsmittel dazu neigen, einen Kontaktwinkel von weniger als 90° auszubilden. Wässrige Lösungsmittel verursachen kein Ausbreiten der Probe über einen großen Bereich des DIOS-Chips.
Die erfindungsgemäßen Verfahren entfernen vorzugsweise organische Lösungsmittel eher als wässrige Lösungsmittel während einer Probenabscheidung durch Desolvatisierung. Die Begriffe "Desolvatisieren" und "Desolvatisierung" werden hierin austauschbar verwendet und sollen die Entfernung eines oder mehrerer organischer Lösungsmittel von einer Analytenlösung, die ein Gemisch aus Wasser und einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln umfasst, betreffen, so dass die Analytenlösung hauptsächlich wässrig nach einer erfindungsgemäßen Desolvatisierung ist.
Der Begriff "hauptsächlich wässrig" wie in "hauptsächlich wässrige Analytenlösung" betrifft eine Analytenlösung, die, wenn sie auf eine hydrophobe Oberfläche abgeschieden wird, keine Dochtwirkung aufweist oder sich über die Oberfläche ausbreitet, um die Analyse (z.B. massenspektrometrische Analyse) des Analyten zu beeinträchtigen (z.B. die Empfindlichkeit zu vermindern). Kurz gesagt, vermeiden die hauptsächlich wässrigen Analytenlösungen, die erfindungsgemäß desolvatisiert sind, die Probleme, die mit Verfahren einer Probenherstellung und -abscheidung des Stands der Technik verbunden sind, durch Erhöhen der Empfindlichkeit der Analyse und Erhöhen der Anzahl von Proben, die analysiert werden können.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der organische Lösungsmittelgehalt der desolvatisierten, hauptsächlich wässrigen Analytenlösung derart, dass die desolvatisierte, hauptsächlich wässrige Analytenlösung, wenn sie auf einer hydrophobe Oberfläche abgeschieden wird, einen Kontaktwinkel mit der Oberfläche von mehr als etwa 90° aufweisen wird. Der Kontaktwinkel kann unter Verwendung einer Vielzahl von Standardlabortechniken gemessen werden, wie in z.B. Physical Chemistry of Surfaces, Adamson, Arthur W., Department of Chemistry, University of Southern California, Los Angeles, CA, Interscience Publishers, eine Abteilung von John Wiley and Sons, New York, Seite 355, "measurement of contact angle", erläutert. In bestimmten Ausführungsformen reicht der Kontaktwinkel von mehr als etwa 90° bis etwa 115°. Typischerweise reicht erfindungsgemäß der organische Lösungsmittelgehalt in den desolvatisierten, hauptsächlich wässrigen Analytenlösungen von etwa 5% bis etwa 10% nach Volumen der Analytenlösung.
In einer Ausführungsform wird die Analytenlösung durch Thermosprühen, z.B. durch schnelles Infundieren der Analytenlösung durch einen beheizten Kapillarvernebler, wie demjenigen, der in K. Biemann, US-PS 4,843,243 , T. Prevost, US-PS 5,772,964 , K. Biemann, US-PS 5,770,272 beschrieben ist, bei einer Temperatur, einem Druck und einer Geschwindigkeit desolvatisiert, um eine hauptsächlich wässrige Analytenlösung bereitzustellen. Die genauen Bedingungen werden von dem spezifischen Analyten abhängen und eine Bestimmung von optimalen Bedingungen wird innerhalb des Wissens des Fachmanns liegen. Die Lösung sollte ausreichend schnell erhitzt werden, um organisches Lösungsmittel, vorzugsweise in einer reproduzierbaren Weise, zu entfernen, ohne signifikant Wasser zu entfernen oder zu bewirken, dass sich die Probe thermisch abbaut. Beispielsweise kann die Temperatur etwa 30–200°C (oder 30–150°C) betragen, der Druck kann etwa 10–60 PSI (oder 10–30 PSI) betragen und die Geschwindigkeit kann etwa 0,05–50 μl/min (oder 0,1–20 μl/min) betragen.
Die organischen Lösungsmittel werden vorzugsweise aufgrund einer Desolvatisierung während einer Abscheidung durch den beheizten Kapillarvernebler entfernt, was den in einer hauptsächlich wässrigen Lösung gelösten Analyten zurücklässt.
Proben, die auf DIOS-Chips in einer hauptsächlich wässrigen Lösung abgeschieden sind, werden dazu neigen, innerhalb eines begrenzten Bereichs des Chips zu verbleiben und sich nicht über einen großen Bereich des Chips auszubreiten, was folglich zu einer erhöhten Empfindlichkeit und erhöhten Anzahl von Proben, die auf einem DIOS-Chip gesammelt werden können, führt. Erfindungsgemäße Verfahren, die einen beheizten Kapillarvernebler verwenden, sind zum Abscheiden eines Analyten auf eine DIOS-Oberfläche mit einer Spurbreite von etwa 0,3 mm (z.B. einer Spurbreite von etwa 1 mm bis etwa 0,1 mm) fähig und können eine Steigerung des Raumfokus von mindestens dem Zweifachen im Vergleich zu einem herkömmlichen Pipettenabscheidungsverfahren auf ein 2,5-mm-Well (mehr bevorzugt etwa 2,5- bis etwa 6,5-fache Zunahme des Raumfokus) aufweisen. Folglich kann das erfindungsgemäße Verfahren z.B. zum Herstellen einer Probe für eine massenspektrometrische Analyse verwendet werden, wobei in diesem Fall Proben in einer Reihe von benachbarten Spuren oder Spots abgeschieden werden können.
Das organische Lösungsmittel, das desolvatisiert wird, kann Acetonitril, ein organischer Alkohol (z.B. Methanol, Ethanol oder Isopropanol), ein Ether (z.B. Diethylether), Tetrahydrofuran, Dichlormethan, Chloroform, Hexan, Heptan, Cyclohexan, Ethylacetat, Benzol, Toluol und Gemische davon sein.
Die Analytenlösung kann auch ein Ionenpaarmittel umfassen, z.B. diejenigen, die herkömmlicher Weise in HPLC-Lösungsmittelsystemen verwendet werden, einschließlich Ameisensäure, Essigsäure und Trifluoressigsäure.
In einer beispielhaften Ausführungsform umfasst die Analytenlösung etwa 10–70% Acetonitril, etwa 10–70% Wasser und etwa 0,1–2,0% Trifluoressigsäure.
Erfindungsgemäß wird auch ein Kit bereitgestellt, der einen DIOS-Chip und/oder ein Massenspektrometrieinstrument und Anweisungen zum Durchführen eines erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst. Ein geeignetes Massenspektrometrieinstrument für eine Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren ist das LC-MALDIprep^TM (Waters Corporation, Milford, Massachusetts).
Die erfindungsgemäßen Abscheidungsverfahren sind für eine Verwendung bei einer Analytenabscheidung von Proteinen und verdauten Proteinen für eine Vielzahl von analytischen Techniken geeignet, einschließlich Peptidmassenfingerprintanalyse. Insbesondere sind die Massenspektrendaten, die durch LC-MALDI oder LC- MALDIprep erhalten werden, für die Erfassung und Analyse von Proteinverdauauftrennungen und Peptidmassenfingerprintanalyse geeignet.
Beispiele
Die Erfindung kann durch die nachstehenden nicht begrenzenden Beispiele weiter veranschaulicht werden, die eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens beschreiben.
Beispiel 1
Standardpeptide wurden direkt in das LC-MALDIprep (Waters), worin sie durch einen beheizten Kapillarvernebler traten, infundiert (Harvard Spritzenpumpe) und wurden sodann auf den DIOS-Chip in einer Reihe von angrenzenden Spuren (mit einem Abstand von 4,5 mm) abgeschieden. Die Standardpeptide (1 pmol/μl) wurden direkt bei einer Flussrate von 10 μl/min in einer Lösung von 30% Acetonitril, 70% Wasser und 0,1% TFA infundiert. Die Desolvatisierungstemperatur betrug 55°C und das Stickstoffverneblungsgas wurde bei einem Druck von 20 PSI gehalten. Der Abstand zwischen der Düse und dem DIOS-Chip betrug 10 mm. Die Geschwindigkeit der Plattform während einer Probensammlung betrug 10 mm/min. Die Massenspektralanalyse erfolgte unter Verwendung eines Micromass MALDI^®-Instruments (Micromass UK, Ltd.). Der Laser wurde über die Y-Dimension der Spur gescannt (spep_scan_tD_d09), wodurch die Spurbreite gemessen wurde (1). Das LC-MALDIprep (Waters) ergibt ein Spray mit einem Durchmesser von 1 mm.
Die Daten zeigen, dass die Probe, die auf den DIOS-Chip gesprüht wurde, in eine enge Probenspurbreite von 1,2 mm (FWHM) fokussiert wurde (1). Die vier Massenspektren von der Mitte und den Kanten dieses Querspur-Scans sind in 2 gezeigt. Jedes Massenspektrum zeigt die Masse des infundierten Peptids als auch die x,y-Position, die anzeigt, wo auf dem DIOS-Chip der Laser abgefeuert wurde. Aus diesen Daten beträgt die Grundlinienbreite der Spur 2 mm und die FWHM-Breite der Spur beträgt 1,2 mm. Die gleiche Lösung (30% Acetonitril), die auf den DIOS-Chip ohne eine Desolvatisierung getropft wurde, breitete sich über einen wesentlich größeren Bereich aus, als es mit der versprühten Probe auftrat, aufgrund der Tatsache, dass diese Lösung einen Kontaktwinkel von weniger als 90° aufwies. Die Spurbreite von 1,2 mm zeigt, dass die Probe keine signifikante Dochtwirkung nach einer Abscheidung auf die DIOS-Oberfläche aufwies, selbst wenn sie anfangs in 30% Acetonitril gelöst wurde. Bei einer Flussrate von 10 μl/min und einer Geschwindigkeit der Plattform (Sammlungsgeschwindigkeit) von 10 mm/min wird eine Säule von 1 μl auf 1 mm an Spur gesammelt. Dieses Verfahren einer Probenabscheidung kann verwendet werden, um Spuren oder Spots einer Probe auf den DIOS-Chips zu sammeln, während die Dochtwirkungen, die typischerweise bei den DIOS-Chips während einer Probenabscheidung in Lösungen, die organisches Lösungsmittel enthalten, angetroffen werden, minimiert werden.
Beispiel 2
Die nachstehenden beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahren erfolgten unter Verwendung der nachstehenden Techniken und der nachstehenden Ausrüstung für eine Probenherstellung und -handhabung.
CapLC
Das CapLC wurde bei 3 μL/min mit einer typischen Wasser/Acetonitril/0,1% TFA-Gradientenchromatographie betrieben. Die verwendete Säule war die Symmetry C18 0,32×150 mm mit einer Partikelgröße von 5 μm.
LC-MALDIprep
Das LC-MALDIprep wurde mit der ursprünglichen Edelstahlkapillare für die LCDIOS-Arbeit und mit der neueren Quarzglaskapillare für die direkte Fusions-Raumfokussierungsarbeit betrieben. Typische Düsentemperaturen betrugen 40 bis 70°C. Typische Geschwindigkeiten der Plattform reichten von 2,5 bis 10 mm/min.
LC-MALDI-TOF/MS
Das Micromass MALDI-TOF/MS-Instrument (Waters) wurde unter Verwendung der beta-5-Version von SCN429 in MassLynx4.0 und MaldiAuto/PLGS2 für einen Peptidmassenfingerprint betrieben.
Räumliches Fokussieren
Das Standardpeptid, Glu-Fibrinopeptid B, wurde direkt auf den DIOS-Chip unter Verwendung der Spritzenpumpe infundiert. Die Spuren und Spots wurden mit dem Laser gescannt, um die Breite der Abscheidung auf der DIOS-Oberfläche zu bestimmen. Diese Breite wurde bei der Grundlinie und FWHM wiederholt gemessen, um den Grad einer räumlichen Fokussierung zu bestimmen. Die Flussrate beträgt 2 μl/min in 50% Acetonitril, 50% Wasser, 0,1% TFA und 10 mM Ammoniumcitrat, wenn nicht anders angegeben. Die Plattform wurde bei 2,5 mm/min bewegt, wenn nicht anders angegeben. Der Referenzpunkt für eine räumliche Fokussierung ist ein normales Well, das einen Durchmesser von 2,5 mm aufweist. Die Fläche dieses Wells beträgt folglich 4,91 mm².
Spurbreiten auf DIOS aus einer direkten Infusion bei 1 μl/min unter Verwendung einer Ficofrit-Kapillare (75×15 μm) betragen durchschnittlich 0,3 mm FWHM und 0,7 mm Grundlinie (Tabelle 1). Bei einer Flussrate von 1 μl/min und einer Geschwindigkeit der Plattform von 2,5 mm/min wird ein Volumen von 1 μl in eine Spurlänge von 2,5 mm abgeschieden. Der Bereich der Abscheidung beträgt folglich 0,7×2,5 mm oder 1,75 mm². Dies entspricht einer 2,8-fachen Verbesserung hinsichtlich des räumlichen Fokus gegenüber der normalen Wellfläche von 4,91 mm².
Tabelle 1. Räumlicher Fokus auf DIOS
Spotdurchmesser auf DIOS aus einer direkten Infusion bei 2 μl/min unter Verwendung einer Konusspitzenkapillare (20×20 μm) betragen 0,4 mm FWHM und 1,0 mm Grundlinie (Tabelle 1). Die Spotzeitdauer beträgt 0,5 min, so dass 1 μl auf einen Spot abgeschieden wird. Der Bereich der Spotabscheidung beträgt 0,79 mm² für eine 6,1-fache Verbesserung des räumlichen Fokus.
Quantitative DIOS
Glu-fib wurde als der interne Standard verwendet und bei 100 fmol/μl konstant gehalten. Angiotensin I wurde hinsichtlich der Konzentration über etwa zwei Größenordnungen variiert. Wiederholte Messungen erfolgten auf den SIC-Peaks und die Verhältnisse wurden zur Bewertung der quantitativen Art von DIOS mit LC-MALDIprep-Probenabscheidung verwendet.
Die Parameter, die für die Peakintegration aus der LC-MALDI-Analyse verwendet wurden, beinhalten die folgenden Werte: Glätten und ApexSpur-Peakintegration wurden ermöglicht, ApexSpur-Peak-Nachweisparameter beinhalteten ein Peak-zu-Peakgrundlinienrauschen von 7, eine Peakbreite bei 5%iger Höhe von 0,544 (Min), ein Grundlinienstartschwellenwert von 0,00 und ein Grundlinienendschwellenwert von 0,50%, und ein Chromatogrammglätten verwendete ein Mittelwertverfahren.
Die Daten waren halb quantitativ und eine weitere Arbeit ist erforderlich, um zu bestimmen, wie quantitativ die Kombination des beheizten Kapillarverneblers und des DIOS-Chips sein kann. Die nachstehende Tabelle fasst die Ergebnisse zusammen.
Tabelle 2. Zusammenfassung der quantitativen DIOS-Ergebnisse
LC-DIOS
Auftrennungen eines Gemisches von vier mit Trypsin verdauten Proteinen wurden auf der DIOS-Oberfläche unter Verwendung des erhitzten Kapillarverneblers gesammelt. Die Chromatogramme und PMF-Ergebnisse folgen.
Grundpeakintensitätschromatogramme von den LC-MALDI-Auftrennungen sind in 6 gezeigt und eine zweidimensionale Kartierung der LC-MALDI-Auftrennung für eine Beladung von 300 fmol pro Protein ist in 7 dargestellt. Die Fähigkeit von LC-DIOS, eine Vielzahl von Peptiden aus einem komplexen Gemisch aufzutrennen und nachzuweisen, ist durch den zweidimensionalen Scan, der in 7 dargestellt ist, veranschaulicht. Der Hauptanteil des Masse-zu-Ladungsverhältnises liegt unter etwa 2000 Da. Jeder Peak oder jedes extrahierte Ionenchromatogramm weist eine Breite von etwa 1,4 mm an der Grundlinie auf (8). Dies ist der gleiche XIC-Wert, der in 7 gezeigt ist. Eine Vielzahl von XIC-Spektren sind in 9 dargestellt, die die räumliche Fokussierung von Analyten veranschaulicht, die auf den DIOS-Chip aus einer LC-MALDI-Auftrennung durch die erfindungsgemäßen Abscheidungsverfahren abgeschieden wurden.
Massenspektrografische Auftrennungen wurden unter Verwendung der MaldiAuto-Software und PLGS2 analysiert, um die PMF-Ergebnisse zu betrachten. Die PMF-Ergebnisse zeigen eine gute Massengenauigkeit und, wie erwartet, eine starke Tendenz in Richtung eines Peptids mit einem niedrigeren m/z-Wert.
Einschluss durch Bezugnahme
Der gesamte Inhalt aller Patente, veröffentlichter Patentanmeldungen und anderer hierin zitierter Referenzen ist hierdurch ausdrücklich hierin in ihrer Gesamtheit durch eine Bezugnahme eingeschlossen.
Äquivalente
Der Fachmann wird zahlreiche Äquivalente zu den hierin beschriebenen spezifischen Verfahren erkennen oder fähig sein, diese unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten zu bestimmen. Solche Äquivalente werden als innerhalb des Umfangs der Erfindung liegend betrachtet und sind durch die nachstehenden Ansprüche umfasst.
ZUSAMMENFASSUNG DER BESCHREIBUNG
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Abscheiden eines interessierenden Analyten auf einer hydrophoben Oberfläche, z.B. DIOS-MS-Substraten, durch Desolvatisieren von organischen Lösungsmitteln aus der wässrigen Analytenlösung vor einer Abscheidung bereit.

Claims

Verfahren zum Abscheiden eines Analyten auf einer hydrophoben Oberfläche, das die Schritte umfasst: Herstellen einer Analytenlösung durch Lösen des Analyten in einem Lösungsmittel, das ein Gemisch von Wasser und einem oder mehreren organischen Lösungsmittel umfasst, Desolvatisieren der organischen Lösungsmittel aus der Analytenlösung unter Bedingungen, die ausreichen, um einen hauptsächlich wässrigen Analyten bereitzustellen, und Abscheiden der desolvatisierten, hauptsächlich wässrigen Analytenlösung auf die hydrophobe Oberfläche.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die desolvatisierte, hauptsächlich wässrige Analytenlösung, wenn sie auf der hydrophoben Oberfläche abgeschieden wird, einen Kontaktwinkel mit der Oberfläche von mehr als etwa 90° aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Kontaktwinkel von mehr als etwa 90° bis weniger als etwa 115° reicht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Analytenlösung auf der hydrophoben Oberfläche in einer Spur mit einer Dicke von weniger als etwa 1 μm abgeschieden wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Analytenlösung auf der hydrophoben Oberfläche in einer Spur mit einer Dicke von etwa 0,1 bis etwa 1 μm abgeschieden wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Analytenlösung auf der hydrophoben Oberfläche in einer Spur mit einer Dicke von etwa 0,3 μm abgeschieden wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die desolvatisierte, hauptsächlich wässrige Analytenlösung einen organischen Lösungsmittelgehalt von etwa 5% bis etwa 10% nach Volumen der Analytenlösung umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Analyt eine biologische Probe ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Analyt ein Protein oder ein Gemisch von Proteinen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Analyt ein Peptid oder ein Gemisch von Peptiden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Analyt ein synthetisches Polymer ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hydrophobe Oberfläche einen porösen Halbleiter umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der poröse Halbleiter auf Silizium, Galliumarsenid oder Galliumnitrid basiert.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der poröse Halbleiter ein Desorption/Ionisation-auf-Silizium (DIOS)-Chip ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acetonitril, einem organischen Alkohol, einem Ether, Tetrahydrofuran, Dichlormethan, Chloroform, Hexan, Heptan, Cyclohexan, Ethylacetat, Benzol, Toluol und Gemischen davon.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das organische Lösungsmittel Acetonitril, Diethylether, Methanol, Ethanol oder Isopropanol ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Analytenlösung ferner ein Ionenpaarmittel umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei das Ionenpaarmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ameisensäure, Essigsäure und Trifluoressigsäure.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Analytenlösung etwa 10–70% Acetonitril, etwa 10–70% Wasser und etwa 0,1–2,0% Trifluoressigsäure umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die organischen Lösungsmittel durch Thermosprühen desolvatisiert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die organischen Lösungsmittel durch schnelles Infundieren der Analytenlösung durch einen Kapillarvernebler bei einer Temperatur, einem Druck und einer Geschwindigkeit desolvatisiert werden, die ausreichen, um eine hauptsächlich wässrige Analytenlösung bereitzustellen.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Temperatur etwa 30–200°C beträgt, der Druck etwa 10–60 PSI beträgt und die Geschwindigkeit etwa 0,05–50 μl/min beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Temperatur etwa 30–150°C beträgt, der Druck etwa 10–30 PSI beträgt und die Geschwindigkeit etwa 0,1–20 μl/min beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die hauptsächlich wässrige Analytenlösung in einer Reihe von benachbarten Spuren oder Spots abgeschieden wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 21, wobei die hauptsächlich wässrige Lösung höchstens etwa 10% organisches Lösungsmittel nach Volumen aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei die Lösung höchstens etwa 5% organisches Lösungsmittel nach Volumen aufweist.
Kit, der einen DIOS-Chip oder ein Massenspektrometrieinstrument und Anweisungen für eine Verwendung davon gemäß dem Verfahren von Anspruch 1 umfasst.
Verfahren zum Herstellen einer Probe für eine massenspektrometrische Analyse durch Abscheiden eines Analyten auf einer hydrophoben Oberfläche, das die Schritte umfasst: Herstellung einer Analytenlösung durch Lösen des Analyten in einem Lösungsmittel, das ein Gemisch von Wasser und einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln umfasst, Desolvatisieren der organischen Lösungsmittel aus der Analytenlösung unter Bedingungen, die ausreichen, um einen hauptsächlich wässrigen Analyten bereitzustellen, und Abscheiden der desolvatisierten, hauptsächlich wässrigen Analytenlösung auf die hydrophobe Oberfläche, wodurch eine Probe für eine massenspektrometrische Analyse hergestellt wird.