DE4408034C1 - Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Proben aus 2D-Gel-Elektrophoreseplatten mit matrixunterstützter ionisierender Laser-Desorption - Google Patents

Description

Umfeld der Erfindung

Das Verfahren betrifft die massenspektrometrische Analyse von separierten Sub­ stanzproben auf sogenannten 2-D-Gel-Elektrophoreseplatten, wie sie insbesondere für die Proteinbestimmung verwendet werden, mit einer Ionisierung der Substanz­ proben durch matrix-unterstützte Ionisierung Laser-Desorption (englisch: MALD oder MALDI = matrix assisted laser desorption/ionization). Die Moleküle der Substanzproben werden dazu auf eine dünne, lackartige glatte Matrixschicht übertragen, die auf einem vorzugsweise metallischen Probenträger aufgebracht ist. Die Übertragung geschieht direkt oder indirekt, beispielsweise über eine PVDF- Membran als Zwischenträger, durch elektrophoretischen Transport der Moleküle. Vor der Übertragung können die Proteine einer enzymatischen Zerschneidung ihrer Aminosäureketten unterworfen werden.

Stand der Technik

Die zweidimensionale Elektrophorese stellt eine der schnellsten und elegantesten Methoden zur gleichzeitigen Trennung von Hunderten von Proteinen aus biolo­ gischen Proteingemischen dar und bietet zudem eine grobe Klassifizierung. In der Monatszeitschrift "Electrophoresis" (Verlag Chemie, Weinheim) werden in jährlichen November-Sonderausgaben (editiert durch J. E. Celis) allein Tausende von mensch­ lichen und tierischen Proteinen, die mit dieser Methode getrennt und grob klassifi­ ziert wurden, in Datenbanken zusammengefaßt. Dabei wird eine grobe Bestimmung des Molekulargewichts der Proteine aufgrund der elektrophoretischen Eigenschaften vorgenommen, die jedoch wegen unbekannter Formfaktoren um einen Faktor 2 falsch sein können. Die Molekulargewichte reichen dabei von 8 bis etwa 160 Kilodalton.

Von den im November 1993 veröffentlichten 3038 Haut-Proteinen waren 763 näher identifiziert, und nur von 176 Proteinen waren Teile der Aminosäure-Sequenz bekannt. Für die früher veröffentlichten Datenbanken gilt ähnliches. Insgesamt schätzt man allein die Anzahl menschlicher Proteine auf 50 000 bis 100 000, etwa ebensoviel, wie es, geschätzt, menschliche Gene gibt.

Es ist seit langem wünschenswert, die Proteine genauer zu bestimmen. Insbesondere würde das "Human Genome Project" leer laufen, wenn es nicht gelänge, die durch die DNA-Ketten erzeugten Eiweiße genau zu bestimmen. Die Bestimmung sollte sich nicht nur auf das genaue Molekulargewicht beziehen, sondern nach Möglichkeit auf die von DNA-Sequenzanalysen unabhängige Bestimmung der vollständigen Aminosäure-Sequenz.

Ein Zwischenschritt in der Bestimmung ist die Feststellung, ob es sich bei einem Protein um ein bereits bekanntes Protein handelt. Dieser Schritt kann heute relativ leicht vollzogen werden. In Datenbanken sind heute etwa 30 000 bis 40 000 Proteine erfaßt, mit ihren Aminosäure-Sequenzen, soweit in Teilen oder ganz bekannt. Außerdem sind dort mehr als 100 000 Proteine gespeichert, deren Aminosäure- Sequenzen rechnerisch aus DNA-Sequenzdaten gewonnen wurden. Existenz oder richtige Struktur dieser Proteine sind aber noch unbekannt.

Ein Beispiel ist die Datenbank des Europäischen Molekular-Biologischen Laborato­ riums in Heidelberg (EMBL), die auf Computer-CDs erhältlich ist.

Diese Datenbanken sind teilweise bereits rechnerisch so aufbereitet, daß sie auch die bei enzymatischer Verdauung erwartbaren Bruchstücke enthalten, etwa die Bruch­ stücke, die sich bei Anwendung von Trypsin bilden. Trypsin zerschneidet die Aminosäuren-Ketten immer an charakteristischen Stellen zwischen zwei bestimmten Aminosäuren.

Die Mischung dieser Trypsin-Bruchstücke ist nun für ein Protein außerordentlich charakteristisch. Schon aus der Kenntnis des Molekulargewichts einiger weniger Bruchstücke läßt sich ein Protein sehr sicher identifizieren. Erst unter 10¹³ Proteinen finden sich zwei voneinander verschiedene Proteine, die fünf verschiedene Trypsin- Bruchstücke mit exakt gleichen Molekulargewichten gemeinsam haben. Bei mehr als fünf bekannten Bruchstücken steigt die Sicherheit der Bestimmung exponentiell an.

Die Verdauung eines unbekannten Proteins mit dem Enzym Trypsin, und eine anschließende Messung der Molekulargewichte der Bruchstücke erlaubt es daher schnell und mit hoher Sicherheit, in der Datenbank zu prüfen, ob das Protein schon in der Datenbank erfaßt ist.

Die Messung der Molekulargewichte kann sehr schnell und einfach mit der Massen­ spektrometrie erfolgen. Die Methode der matrixunterstützten ionisierenden Laser- Desorption erlaubt heute die gleichzeitige, sehr effektive Ionisierung von Peptiden und Proteinen in Mischungen. Die Ionen können mit Flugzeit-Spektrometern, mit Ionenfallen- oder ICR-Massenspektrometern gemessen werden.

Die Unterstützung der ionisierenden Laser-Desorption großer, organischer Moleküle durch lichtabsorbierende Substanzmatrices, meist organische Säuren oder andere nicht zu große, polare organische Moleküle, ist heute bereits eine weit verbreitete Standardtechnik. Sie wird vorzugsweise für die Flugzeit-Massenspektrometrie verwendet, ist aber auch für ionenspeichernde Massenspektrometer, wie ICR oder Ionenfallen, geeignet.

Beim Beschuß mit einem gepulsten Laser wird durch Aufheizen eines kleinen Volumens der Matrixsubstanz eine Dampfwolke gebildet, die wegen der leichten Ionisierbarkeit der Moleküle und der relativ hohen Verdampfungstemperatur nach der Saha-Eggert-Gleichung einen geringen Anteil an ionisierten Molekülen enthalten muß, also ein schwaches Plasma darstellt. Die in dem Matrixmaterial eingeschlosse­ nen großen Moleküle, also in unserem Falle die Proteine, werden dabei in schonen­ der Weise mit verdampft. Durch Ionen-Molekül-Reaktionen in diesem Plasma werden dann bevorzugt die schweren Moleküle ionisiert, da deren Ionisierung energetisch günstiger ist.

Die ionisierende Laser-Desorption ist eine besonders günstige Ionisierungsmethode für Flugzeit-Massenspektrometer, da die Ionen der großen Moleküle durch den gepulsten Laser in einem sehr kurzem Zeitintervall gebildet werden, und da sich die Flugzeit-Spektrometer wegen ihres nach oben offenen Massenbereichs besonders gut für die Untersuchung von großen Molekülen eignen. Es werden dabei allgemein Laser mit einer Pulslänge von etwa 5 Nanosekunden benutzt.

Die Methode erforderte bislang eine oberflächlich sehr unregelmäßige Schicht mit einigen größeren Matrixkristallen, in die die Untersuchungssubstanz eingebettet werden mußte. Durch eine neue, in der Patentanmeldung BFA 1/94 beschriebene Methode ist es aber möglich, eine gleichmäßig dicke, glatte, lackähnliche Matrix­ schicht zu benutzen, deren Dicke bei zwei bis drei Wellenlängen des verwendeten Laserlichtes liegt, und die es erlaubt, die Analysensubstanzen erst nach Erzeugung dieser Schicht auf die Oberfläche der Matrixschicht aufzutragen.

Das Beladen dieser Matrixschicht mit Substanzmolekülen ist sehr einfach. Eine sehr verdünnte Lösung kann beispielsweise einfach als Lösungstropfen aufpipettiert werden. Eine kurze Einwirkungszeit genügt, um die Substanzmoleküle an die Matrixoberfläche fest zu binden. Die Art dieser Bindung ist noch nicht bekannt, es mag sich um oberflächliche Adsorption, um Absorption in den obersten Schichten der Matrix, oder auch um ein oberflächliches Eindringen in zwischenkristalline Bereiche handeln. Die Bindung ist jedenfalls so fest, daß sich die Substanzmoleküle in nachfolgenden Waschungen der Oberfläche nicht beseitigen lassen.

Diese neue Präparationsmethode zeigt eine ganz exzellent verbesserte Substanz­ ausbeute. Mit nur 50 Attomol eines Proteins, aufgetragen auf einen Fleck von etwa 2 Millimeter Durchmesser, können bereits gut auswertbare Spektren erhalten werden. Damit ist der Substanzverbrauch gegenüber der bisher üblichen Methode um einen Faktor Tausend verringert.

Die neue Präparationsmethode erzeugt quer über die Auftragungsfläche der Analysensubstanz hinweg eine stets sehr gleichmäßige Ionisierungsstärke.

Diese Eigenschaften - Schicht mit glatter Oberfläche, feste Adsorption der Substanz­ moleküle aus der Lösung, und eine gleichmäßige, extrem hohe Empfindlichkeit un­ abhängig vom Ort des Laserbeschusses - läßt einen so präparierten Probenträger zur idealen Unterlage für die Analyse der elektrophoretisch getrennten Proteine werden. Doch nicht nur das, gleichzeitig ist auch die Qualität der Spektren mit dieser Methode erheblich verbessert.

Das Massenauflösungsvermögen von Flugzeit-Spektrometern ist mit dieser Proben­ vorbereitung deutlich erhöht und entspricht dem Auflösungsvermögen, das von dem Spektrometer zu erwarten ist. Mit Flugzeit-Massenspektrometern, die mit energiefokussierenden Reflektoren ausgestattet sind, lassen sich Massenauflösungs­ vermögen von m/Am = 5000 erreichen.

Die Genauigkeit der Massenbestimmung wird dadurch erhöht, daß die Massen­ skalen (Funktion der Abhängigkeit der Masse von der Flugzeit) nicht mehr - wie bei bisheriger Probenbereitungstechnik - für verschieden Substanzen eines Gemisches im selben Spektrum verschieden sind.

Die Genauigkeit der Massenbestimmung wird ferner dadurch erhöht, daß sich die Massen sehr genau gemäß der theoretischen Abhängigkeit der Masse von der Flugzeit inter- oder extrapolieren lassen. Es ist - im Rahmen der überhaupt erziel­ baren Massengenauigkeit - keine Verzerrung der Massenskala mehr festzustellen. Die Probenträger mit der Matrixschicht können dabei sogar mit Referenzmaterialien zur Bestimmung der Masse vorbeladen sein. Diese "internen Referenzmaterialien" haben sehr genau bekannte Massen, aus denen sich leicht unbekannte Massen der später aufgebrachten Untersuchungssubstanzen ermitteln lassen. Bei der massen­ spektrometrischen Analyse erscheinen beide Materialien im selben Spektrum.

Die Trypsin-verdauten Proteinbruchstücke haben Molekulargewichte im Bereich von rund 500 bis 3000 atomaren Masseneinheiten. Ihr Molekulargewicht muß auf die Masseneinheit genau bestimmt werden. Durch die oben angegebenen Verbes­ serungen der Methode sind alle Voraussetzungen für eine gute Proteinanalyse erfüllt. Es bleibt nur die Frage offen, wie die Proteine aus der Elektrophoreseplatte auf die Probenträgerplatte überführt werden können.

Es läßt sich diese Methode zur Ionisierung aber nicht nur für Flugzeit-Spektrometer benutzen, sie kann auch für speichernde Massenspektrometer, wie ICR-Spektro­ meter oder Ionenfallen, mit Erfolg verwendet werden.

Mit Ionenfallen-Massenspektrometern können beispielsweise die Aminosäuren- Sequenzen auch direkt bestimmt werden. Die Ionenfallen lassen sich so betreiben, daß nur eine einzige Ionensorte (Ionen einer Masse) eingespeichert wird, etwa ein bestimmtes Trypsin-Bruchstück des originalen Proteins. Eine künstlich in der Ionenfalle herbeigeführte Fragmentierung dieses Bruchstücks liefert dann Amino­ säurenketten-Fragmente verschiedener Länge, aus denen sich nach bekannten Methoden die Sequenz bestimmen läßt. Durch Wiederholung des Verfahrens für die verschiedenen Trypsin-Bruchstücke kann man die gesamte Sequenz bestimmen, wenn man die Sequenz der Trypsin-Bruchstücke kennt. Diese läßt sich aber mit anderen Methoden feststellen, unter anderem auch wieder massenspektrometrisch.

Die Idee der MALDI-Analyse von elektrophoretisch separierten Proteinen ist nicht neu. So sind in jüngster Zeit zwei Arbeiten erschienen, die sich mit der MALD- Ionisierung von Elektro-Blot-Membranen mit nachträglichem Auftrag der Matrix­ materialien beschäftigen.

K. Strupat, M. Karas, F. Hillenkamp, C. Eckerskorn und F. Lottspeich (Anal. Chem. 66, 464, (1994)) berichten über die Anwendung der MALD-Ionisierung von Peptiden, die mit Elektrophorese von Gel-Platten auf PVDF-Membranen übertragen worden und nachträglich mit Matrixsubstanzen versehen worden waren. Die Laser- Desorption erfolgte direkt von der PVDF-Membran. Es wurden, mit verschiedenen Matrices, sowohl UV-Laserlicht (337 nm) wie auch infrarotes Licht (2,94 µm) benutzt, wobei letzteres die besseren Ergebnisse brachte. Die Ionisierung von der PVDF- Membran hat jedoch erhebliche Nachteile. Es werden im unteren Massenbereich große Mengen an nicht als Linien aufgelöste Untergrundionen erzeugt, die das Spektrum kleiner Peptide überdecken.

M. Vestling und C. Fenselau (Anal. Chem. 66, 471 (1994)) berichten über ein prak­ tisch gleiches Verfahren mit UV-Licht (337 nm), mit erstmalig durchgeführtem, zusätzlichem enzymatischen Abbau der Proteine durch Proteolyse in der PVDF- Membran. Durch bessere Probenpräparation, wahrscheinlich durch besseres Waschen, wurden hier bessere Spektren gewonnen. Diese Arbeit bietet auch eine gute Übersicht über den gegenwärtigen Stand der Technik.

Die erhaltenen Massenauflösungen sind in beiden Fällen bei weitem nicht so gut, wie sie mit Dünnschicht-Matrixfilmen erhalten werden, wenn von den Autoren auch "zufriedenstellende Genauigkeiten von 0,1%" für die Massenbestimmung angegeben wurden. Eine Genauigkeit von 0,1% reicht nicht aus, um im Massenbereich von 1000 bis 3000 atomaren Masseneinheiten die Molekularmasse zweifelsfrei zu bestimmen.

Aufgabe der Erfindung

Es ist ein Verfahren zu finden, mit dem separierte Proteine aus einer 2-D-Gel- Elektrophoreseplatte, unter Erhalt ihrer örtlichen Verteilung, auf höchstempfindliche MALDI-Probenträgerplatten überführt werden können. Dabei soll es möglich sein, eine enzymatische Spaltung der Proteine zwischenzuschalten.

Erfindungsgedanke und Erfindungserfolg

Basis der Erfindung ist die Erkenntnis, daß sich Proteine und andere Analysensub­ stanzen nachträglich auf Matrixschichten bestimmter Präparation aufbringen lassen. Sie können dann, entgegen der herrschenden Lehre, durch matrixunterstützte ionisierende Laser-Desorption ganz ausgezeichnet und mit hoher Empfindlichkeit ionisiert werden, mit Spektrenqualitäten, wie sie bisher nicht erreicht werden konnten. Bislang herrschte die Lehre, daß die Analysensubstanzen in Kristalle der Matrixsubstanz während der Auskristallisation eingebaut werden müßten, um durch Laser-Desorption ionisierbar zu werden.

Eine weitere Basis der Erfindung ist, daß sich auch mikroskopisch glatte Schichten aus der Matrixsubstanz so herstellen lassen, daß sie oberflächlich mit der Analysen­ substanz beladen werden können, und zu einer höchstempfindlichen MALDI- Ionisierung fähig sind.

Eine weitere Basis der Erfindung ist es, daß sich die Analysensubstanzen aus Lösungen, deren Lösemittel die Matrixsubstanz praktisch nicht löst, von selbst fest an die Matrix binden. Die Oberfläche der in bestimmter Weise präparierten Schicht saugt somit durch Diffusion frei bewegliche Analysenmoleküle vollständig aus der Lösung. Die Moleküle der Analysensubstanz haften fest an der Matrixschicht, und lösen sich nicht wieder in der aufgebrachten Lösung.

Eine weitere Basis der Erfindung ist die Erkenntnis, daß dieser Prozeß der Bindung an die Matrixoberfläche nicht durch anwesende Puffersalze, nicht einmal durch schwache Säuren, behindert wird.

Eine weitere Basis ist die Erkenntnis, daß sich die Matrixschichten mit den aufge­ brachten Proteinen nachträglich waschen lassen, ohne die Proteine zu verlieren. Damit können Salze, Elektrolyte und andere Beigaben der Proteinlösung von der Matrixschicht entfernt werden. Diese Waschungen sind außerordentlich wichtig, da mit ihnen die Qualität der erhaltenen Spektren steigt. Einige der Peptide erscheinen überhaupt nur nach dem Waschen, einige erscheinen ungewaschen nur als Kationen-Addukte, einige erscheinen als normal protonierte Ionen. Insgesamt ist das Auflösungsvermögen ohne Waschungen herabgesetzt. (Matrixschichten, die nach bisheriger Methode der Auskristallisation aus aufgebrachten Tröpfchen hergestellt wurden, halten Waschungen nicht stand; die kleinen Kriställchen werden dabei fortgespült.)

Die so auf die Matrixschicht aufgebrachten und gewaschenen Proteine ergeben Massenspektren von überragender Qualität. Sie sind bis zu einem Molekular­ gewichtsbereich von 3000 Dalton isotopenaufgelöst, das heißt, es lassen sich die Massensignale der einzelnen Massen des Isotopenmusters eines Moleküls vonein­ ander trennen, und es können für die einzelnen Massen genaue Massenzahlen bestimmt werden. Die Genauigkeit der Massenbestimmung liegt bei 20 ppm.

Die Empfindlichkeit der Methode ist ebenfalls überragend. Von 50 Attomol eines Peptids oder Proteins lassen sich gut vermeßbare Spektren erzeugen.

Wird das feuchte Gel der Elektrophoreseplatte in direkten Kontakt mit der glatten Matrixschicht gebracht, so werden Substanzmoleküle, die durch Diffusion die Matrixschicht erreichen, sofort an diese gebunden.

Leider sind die Moleküle aber in der Gelschicht nicht so frei beweglich, daß sie in beträchtlichem Maße diffundieren könnten. Es lassen sich daher ohne unterstützen­ de Maßnahmen nur sehr geringe Mengen der Analysensubstanzen an die Matrix­ schicht bringen.

Etwas besser wirkt der direkte Kontakt mit einer Übertrager-Membran, auf die die Proteine mit dem bekannten Verfahren des sogenannten "Elektro-Blotting", d. h. durch elektrophoretischen Transport, übertragen werden können. Aber auch hier sind die Protein-Moleküle auf der Überträger-Membran nicht frei beweglich, liegen allerdings an der Oberfläche in höherer Konzentration vor.

Der Zusatz bestimmter Chemikalien löst die Proteine vom Gel oder von der Über­ träger-Membran, macht sie besser frei beweglich und verbessert so die Anlagerung an die Matrixschicht. Für diesen Zweck kann beispielsweise Trifluor-Essigsäure in sehr verdünnter Form benutzt werden. Nachteilig ist aber hierbei, daß die Ortsauf­ lösung der Separation hierdurch beträchtlich verschlechtert wird.

Es wird daher hier insbesondere vorgeschlagen, die Protein-Moleküle durch elektro­ phoretischen Transport zur Matrixschicht zu bringen, an der sie sich dann in vorbeschriebener Weise binden. Der Transport wird durch bestimmte Elektrolyte, wie schwache Lösungen von Tris-base und Borsäure, unterstützt. Die Technik ist in der Biochemie bereits weit verbreitet, und braucht dem Fachmann nicht näher erläutert werden.

Der elektrophoretische Transport verlangt einen minimalen Stromfluß, der in der Regel von den dünnen mikrokristallinen Matrixschichten ohne Schwierigkeiten durchgelassen wird. Einige Schichten bedürfen aber der künstlichen Erhöhung der Leitfähigkeit. Diese kann durch die Einlagerung von leitenden Substanzen bewirkt werden, wobei sowohl ionische Leiter (Salze) wie auch metallische Leiter (feinste Metallpulver) verwendet werden können.

Durch die Einschaltung eines Zwischenträgers, etwa einer PVDF-Membran, lassen sich die Proteinketten auch in bekannter Weise durch Enzyme ortsfest in der Membran spalten (Proteolyse). Auch diese Technik ist dem biochemischen Fach­ mann bekannt.

Für alle diese Techniken ist das anschließende Waschen des matrixbeladenen Probenträgers von großer Bedeutung. Es können die für die elektrophoretische Trennung im Gel benötigten Salze, und die für den elektrophoretischen Transport zur Blot-Membran oder zur Matrixschicht benötigten Elektrolyte (beispielsweise Borsäure) nach dem Übertragen auf die Matrixschicht wieder abgewaschen werden, um Spektren mit der oben geschilderten überragenden Qualität zu erhalten.

Wirtschaftliche Bedeutung

Das Verfahren wird insbesondere in der Medizin größere gesundheitliche und wirt­ schaftliche Bedeutung erlangen. Es ist mit der Kombination Gel-Elektrophorese und MALDI-MS sehr schnell möglich, fehlgebildete Eiweiße aus den Zellen bestimmter Organe oder bestimmter Körperflüssigkeiten zu finden, und die Art der Fehlbildung zu bestimmen. Diese fehlgebildeten Eiweiße erscheinen auf der Gel-Elektrophorese­ platte (nach Anfärben oder anderen Methoden der Sichtbarmachung) an anderen als ihren angestammten Plätzen, und können so sehr leicht, beispielsweise mit bereits existierenden Computerprogrammen, herausgefunden werden. Mit der hier vorge­ stellten Methode ist es dann sehr schnell möglich, die Art der Fehlbildung des Eiweißes zu bestimmen.

Besonders günstige Ausführungsformen

Eine Lösung von α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure in Aceton verteilt sich beim Auf­ pipettieren auf einen sauberen, metallischen Träger praktisch augenblicklich, da ihre Oberflächenspannung verschwindend klein ist. Ein Mikroliter einer fast gesättigten Lösung genügt für etwa 4 Quadratzentimeter Oberfläche, woraus sich eine Dicke des Lösungsfilms von etwa 2,5 Mikrometer, und eine Dicke der Matrixschicht nach dem Eintrocknen von etwa 300 bis 600 Nanometer ergibt. Diese Dicke hat sich als sehr günstig erwiesen.

Verdunstet man das Lösungsmittel unter einem sauberen Luftstrom in weniger als 10 Sekunden, so erhält man eine dünne, optisch glatte, lackartige Schicht der Matrix.

Das Matrixmaterial α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure, das in Aceton besonders gut löslich ist, jedoch kaum in reinem Wasser oder in angesäuerten Methanol-Wasser- Gemischen, hat sich für Proteinanalysen besonders bewährt. Es können jedoch auch andere, dem Fachmann bekannte Matrixmaterialien oder Lösemittel mit ähnlichem Erfolg verwendet werden.

Die so hergestellten Probenträger mit dünner Matrixschicht binden Protein- und andere schwere Moleküle aus Lösungen so fest, daß sie in anschließenden Waschun­ gen mit leicht angesäuertem Wasser, aber auch anderen Waschflüssigkeiten, nicht mehr beseitigt werden können. Die Waschungen beseitigen störende Begleitsubstan­ zen, wie Puffersalze, Elektrolyte und andere Residuen der Lösung.

Es ist günstig, die vorzugsweise metallischen Probenträger vor oder nach dem Belegen mit der Matrixschicht mit einem elektrisch nicht leitfähigen Lackrand zu versehen. Dieser Rand erleichtert die spätere elektrophoretische Übertragung von Proteinen, da ein Kurzschluß mit dem metallischen Träger am Rande vermieden wird.

Die Probenträger können nun mit der glatten Matrixschicht fest auf die feuchte Gelplatte oder feuchte Übertragungsmembran gedrückt, und dort einige Minuten gehalten werden. Dieser Prozeß alleine genügt bereits, um Spektren zu erhalten. Es werden dabei pro separiertem Protein, und abhängig von der Ausgangskonzentra­ tion, etwa 5 bis 200 Attomol Substanz übertragen, wobei etwa 50 Attomol für ein relativ gutes Spektrum ausreichen.

Das Versetzen der Membranen mit einer sehr verdünnten Lösung von Trifluor- Essigsäure, die anschließend von der Matrixschicht wieder gut abgewaschen wird, erhöht die Ausbeute leicht.

Am günstigsten ist jedoch ein elektrophoretischer Transport der Proteine zu der Matrixschicht. Mit elektrophoretischem Transport können leicht Femtomol-Mengen übertragen werden. Da eine Überladung der Matrixschicht mit Proteinen dem Ionisierungsprozeß schadet, kann man das Beladen der Matrixschicht mehrmals wiederholen, ohne eine zu starke Abnahme der Konzentration in der Ausgangs­ membran zu bemerken. Es können verschiedene Probenträgerplatten mit Proteinen aus einer einzigen Gel-Separation belegt werden, entweder von verschiedenen Stellen der Gel-Platte, oder auch von derselben Stelle, da die Proteinmenge größer ist als für die Probenträgerplatte benötigt.

Bei Verwendung der Übertragungsmembran können die Proteine in an sich bekann­ ter Weise in situ durch Enzyme zerschnitten ("verdaut") werden. Dieser Vorgang wird Proteolyse genannt. Anschließend wird dann das Gemisch der Bruchstücke elektrophoretisch auf die Matrixschicht übertragen. Auch hier genügen etwa 50 bis 100 Attomol pro Bruchstück, also auch nur 50 bis 100 Attomol des Ausgangs­ proteins, für ausreichend gute Spektren, die das Molekulargewicht der Bruchstücke auf besser als eine atomare Masseneinheit ergeben.

Insbesondere kann man wegen der hohen massenspektrometrischen Empfindlichkeit mehrere Probenträgerplatten von einer Gel-Separation aus beladen. Es ist dabei möglich, einige Probenträger mit den unzerschnittenen, originalen Proteinen zu beladen, und weitere Probenträger anschließend mit enzymatisch verdauten Proteinen. Es lassen sich damit sowohl die Molekulargewichte der originalen Pro­ teine wie auch die Identität der Proteine durch die Enzym-Bruchstücke bestimmen.

Für die Spektrenaufnahme kann besonders günstig ein defokussierter Laserstrahl benutzt werden. Es lassen sich von einer Auftragung mit 50 Attomol Analysen­ substanz in aufeinanderfolgenden Laserschüssen etwa 30 bis 300 Spektren erzeugen, die gewöhnlich aufaddiert werden, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Bei einer Wiederholfrequenz des Lasers von 10 Hz dauert die gesamte Spektrenaufnahme für eine Substanz nur drei bis dreißig Sekunden. Bei höheren Konzentrationen lassen sich wesentlich kürzere Aufnahmezeiten erzielen.

Insbesondere kann man durch Verschieben des Laser-Punktes (oder durch Bewegen der Probenträgerplatte) die Oberfläche des Probenträgers mit dem Massenspektro­ meter abtasten. Die einzelnen, räumlich verteilten Proteine lassen sich dann durch ihre Spektren erkennen. Bei überlappenden Proteinflecken können mathematische Trennmethoden für die "Dekonvolution" der Spektren angewandt werden, wie sie schon für GC/MS-Techniken entwickelt worden sind.

Zweckmäßigerweise ist die Matrixschicht bereits vorher mit Referenzsubstanzen bekannter Molekularmasse belegt, um durch diese interne Referenz zu sehr genauen Molekulargewichtsbestimmungen zu kommen. Es konnte bereits mit so belegten Matrixschichten Massengenauigkeiten von etwa 20 ppm erreicht werden.

Eine oder auch mehrere Referenzsubstanzen mit bekannten Molekulargewichten können sehr einfach vor dem Aufbringen der Proben großflächig in sehr geringer Menge aufgebracht werden. Es ist auch möglich, die Referenzsubstanzen bereits der Matrixlösung beizugeben.

Die Probenträger lassen sich mit Matrixschichten und Referenzsubstanzen über viele Wochen aufheben. Guter Luftabschluß ist ratsam, da sich die sehr adsorptions­ aktiven Schichten relativ rasch mit Substanzen aus der Umgebungsluft anreichern. Eine Kühlung der Träger ist ebenfalls empfehlenswert, weil noch nicht bekannt ist, ob sich die mikrokristalline Schicht im Laufe der Zeit zu größeren Kristallen umkristallisiert.

Claims (16)

1. Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Substanzproben, die mit ein- oder zweidimensionaler Gel-Elektrophorese auf Gel-Elektrophoreseplatten separiert wurden, mit einer Ionisierung der Substanzproben nach ihrer Überführung auf Probenträgerplatten durch matrix-unterstützte ionisierende Laser-Desorption (MALDI), dadurch gekennzeichnet, daß die Probenträgerplatten mit einer optisch glatten, adsorptiven Schicht einer festen Matrixsubstanz überzogen sind, und daß die Substanzproben durch direkten Kontakt mit der feuchten Elektrophoreseplatte, oder, bei Benutzung einer Übertrager-Membran durch Kontakt mit der feuchten Übertrager-Membran, auf die Oberfläche der Matrixschicht der Probenträgerplatte übertragen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Übertragung auf die Probenträgerplatte von ausgeschnittenen Stücken der Gel-Elektrophorese­ platte oder der Überträger-Membran, die ausgewählte Substanzproben enthalten, aus erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Übertragung der Substanzproben ohne Zerschneiden der Membranen großflächig unter Erhaltung ihrer 2-dimensionalen Verteilung geschieht.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Über­ tragung der Probensubstanzen durch die Zugabe von Chemikalien, beispielsweise verdünnter Trifluor-Essigsäure, erleichtert wird.

5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sub­ stanzproben von der Elektrophoreseplatte oder der Übertrager-Membran elektro­ phoretisch zur Probenträgerplatte übertragen werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzproben von der Elektrophoreseplatte zunächst in an sich bekannter Weise elektrophoretisch auf eine Übertragungsmembran übertragen werden ("Elektro-Blotting"), und daß in einem zweiten Schritt die Substanzproben von der Übertragungsmembran zur Matrixschicht auf der Probenträgerplatte elektrophore­ tisch übertragen werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Übertragungs­ membran aus PVDF (Polyvinylidendifluorid) besteht.

8. Verfahren nach einem der bisherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Substanzproben um Proteine im weitesten Sinne handelt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure­ ketten der Proteine in einem Zwischenschritt enzymatisch zerschnitten werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Zerschneiden in der Gel-Elektrophoreseplatte erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Zerschneiden der Proteine in der Übertragungsmembran stattfindet.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9, 10, oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das enzymatische Zerschneiden durch Trypsin geschieht.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die Übertragung von Proteinen aus einer Gel-Separation portionenweise nacheinander auf mehrere Probenträgerplatten erfolgt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß nach einer oder mehreren Übertragungen von unzerschnittenen Proteinen auf Probenträgerplatten eine enzymatische Zerschneidung der zurückgeblieben Portionen der Proteine stattfindet, und anschließend die proteolytischen Bruchstücke der Proteine einmal oder mehrmals auf Trägerplatten übertragen werden.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß die Oberfläche der Probenträgerplatten durch fortlaufende Spektrennahmen an verschiedenen Stellen ein- oder zweidimensional abgetastet wird.

16. Verfahren nach einem der bisherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrixschicht der Probenträgerplatte durch Einlagerung von ionen- oder elektronenleitenden Substanzen leitend gemacht wird.